Coloracion Papanicolau 1f294e

COLORACIÓN DE PAPANICOLAOU ( PAP)

PRINCIPALES OBJETIVOS DE LA TINCIÓN DE MATERIAL CITOLÓGICO. • Visualización óptima de las células. • Diferenciación de los diferentes constituyentes Celulares. • Adecuado análisis y evaluación específica de la Estructura nuclear. • Análisis citoplasmático.

Principio Y Ventaja Del Método De Tinción De Papanicolaou

• La tinción de Papanicolaou es un método de tinción policromático( dado que puede teñir compuestos ácidos o básicos presentes en una célula) que consta de una tinción nuclear y un contraste citoplasmático la cual tiene como ventaja:

 Una buena definición del detalle nuclear, evidenciando el patrón de cromatina de las células.

Un

aspecto transparente de los citoplasmas y una diferenciación celular, que permite apreciar grados de maduración celular y actividad metabólica.

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La tinción de Papanicolaou tiene cuatros pasos principales:

•Fijación (realizada al momento de tomar la muestra). • Tinción del núcleo con la hematoxilina. •Tinción del citoplasma con orange g y ea. • Aclaramiento.

La tinción de Papanicolaou usa tres colorantes:

Hematoxilina de harris Que tiñe selectivamente los núcleos

Og 6 ( Orange) Tiñen los citoplasmas

EA 50 ( Eosina alcohol) Tiñen los citoplasmas

Los pasos de la tinción están entremezclados con soluciones que hidratan, deshidratan y enjuagan las células Tinción.: Es importante señalar que éste es un procedimiento que tiene variaciones e incluso preferencias personales en la coloración

Enjuague: El se realiza con agua corriente y/o agua destilada, pero siempre hay que verificar que el pH del agua se encuentre entre 6.5 y 7.

Hidratación: La hidratación antes del colorante de hematoxilina puede ser: Gradual usando alcohol en concentraciones decrecientes 80-70-50 % Abrupta, sumergiendo el material celular desde altas concentraciones de alcohol y al agua directamente

Tinción del núcleo. la hematoxilina es un colorante natural que tiene una afinidad por la cromatina y tiñe el núcleo Existen dos métodos para teñir el núcleo:

• Método progresivo. Se tiñe el núcleo con la intensidad de color deseada. • Método regresivo. Se sobre-tiñe con hematoxilina no acidificada, luego se remueve el exceso de tinción con ácido clorhídrico diluido.

• Después de la hematoxilina, las laminillas se lavan en agua.

Tinción del citoplasma.

• Orange g 6 ( o g6 ), es una tinción monocromática que colorea la

queratina de un naranja brillante y penetra rápidamente al citoplasma.

• Ea 50 ( eosina alcohol ) , es una tinción policroma compuesta de eosina, verde luz y café ( en la formula original ) tiñe el citoplasma de las células escamosas cianofílas y eosinofílas, nucléolos y cilios.

Aclaramiento. Es el paso final de la tinción y produce transparencia celular. Se suele usar xilol como solución aclaradora

•Montaje de laminas: es una unión entre el porta objeto y

cubre objeto, mediante una sustancia, con el fin de obtener una muestra cubierta y protegida contra el secado y arrugamiento del material celular y sellada para evitar la oxidación de la muestra

• Existen dos opciones como medio de montaje: el bálsamo de Canadá y la resina sintética

Preparación y manejo de la batería de tinción Batería de tinción: Es un conjunto ordenado de cubetas con reactivos y colorantes en las cuales se procesan las muestras en forma secuencial para ser teñidas. Disponer o preparar los reactivos y colorantes depende de cada laboratorio

Resultado

• Los

núcleos se tiñen de azul a violeta , mientras que el citoplasma muestra varios tonos de azul, naranja, rosa o rojo

Citoplasma basófilo Citoplasma acidofiló Citoplasma queratinizados Eritrocitos

Verde azulado

Núcleos

Azul a violeta

Rosa Rosa a naranja rojo

Cuidados a los colorantes

•Se deberán tener los siguientes cuidados:

1. Verificar que las soluciones estén rotuladas indicando: A. Fecha de preparación. B. Nombre de la solución. C. Titulación. D. Concentración. E. Requisitos para almacenar. F. Advertencias para su manejo. G. Fecha de vencimiento

• 2. Conservar los colorantes en:

A. Envases oscuros B. Bien tapados porque son sensibles a la luz. C. Se oxidan a temperatura ambiente. D. Almacenar las soluciones inflamables en un área aprobada anti-fuego. E. No manejar los colorantes cerca de estufas o fuentes oxidantes. F. Almacenar las soluciones de tinción entre 15°C Y 25°C. Después de abrir el frasco si es almacenado entre 15°C y 25°C es utilizable hasta la fecha de caducidad indicada

• 3 La batería de tinción se cambiara:

• A. Cada 2000 laminas teñidas.

• B. Cada 6 U 8 semanas

3. BATERÍA DE TINCIÓN: La batería de tinción se cambiara: A. Cada 2000 laminas teñidas. B. Cada 6 U 8 semanas

A. Preparar una batería de tinción exclusiva para las muestras de examen de papanicolaou. B. Rotular las cubetas. C. Los colorantes se deben filtrar inmediatamente antes de llenar las cubetas, usando un embudo y papel filtro. D. La batería de tinción requiere estar bajo campana de extracción de gases. E. La batería de tinción debe encontrarse en una sala con buena ventilación. 5. Si el laboratorio procesa muestras no ginecológicas, estás deben teñirse en una batería diferente, pera prevenir el riesgo de contaminación cruzada.

MANTENIMIENTO DE LOS COLORANTES Mantenimiento general.

Filtrar los colorantes cada 8 días. Limpiar las cajas de todo residuo de colorante Controlar diariamente el nivel de las soluciones de la batería de tinción. Rellenar las cubetas si falta solución.

 Tapar las cubetas con soluciones y colorantes

cuando no se usen y el mayor tiempo posible cuando estén en uso, para evitar evaporación

Mantenimiento específico.

En la hematoxilina, se debe retirar la capa

de aspecto metálico que se forma sobre el colorante

 El orange g y ea deben ser remplazados cada semana.

Tinción de las muestras

• 1.-Poner las láminas en los carros de tinción, ordenadas y todas en la misma posición. El técnico debe trabajar con guantes.

• 2.-Se especifica el procedimiento detallado de tinción con el método regresivo para tinción nuclear • Se recomienda que cada laboratorio mantenga por escrito su procedimiento de tinción en un lugar visible de la sala de procesamiento de tinción

• Eliminación del fijador. • Para iniciar el proceso de tinción nuclear es necesario eliminar el fijador de las laminillas, que usualmente

es en base a polietilenglicol. Para ello se realiza un lavado con agua destilada o sumergiendo las láminas en etanol al 95%, seguido por un lavado con agua destilada.

• Evitar problemas con los alcoholes o colorantes. • Los carros de tinción deben ser completamente escurridos entre una y otra cubeta para evitar la dilución de los colorantes o la alteración de los alcoholes, sin llegar al secado del frotis

• Tiempos de inmersión. • Cada inmersión del carro de tinción con laminas en las cubetas de soluciones o colorantes debe durar 1 0 2 segundos y se efectúa suavemente sin llegar a tocar la base de la cubeta, para que no se desprendan las células.

• Intentar

mantener las cubetas tapadas el mayor tiempo posible durante el proceso de tinción.

•

Las láminas teñidas se deben mantener en una cubeta con xilol hasta el momento del montaje.

•

Asear cuidadosamente los materiales ocupados y la superficie de trabajo una vez terminada la tinción de un conjunto de láminas.

• Lavarse cuidadosamente las manos.

Montaje de las láminas • Todo

el procedimiento de montaje de las láminas debe realizarse bajo campana de extracción de gases si se usan medios de montaje con solventes

• Tomar, bajo la campana de extracción de gases, la laminilla teñida y retirarla de la canastilla. Revisar que esté seca la parte posterior de la muestra, antes de iniciar el montaje. Utilizar un medio de montaje de preferencia de secado rápido. Aplicar una gota de resina sobre el portaobjetos y colocar sobre éste el cubreobjetos. Retirar el excedente de resina y colocarla sobre la charola ordenadamente. Asear cuidadosamente todos los implementos usados para procesar muestras Puede ocurrir contaminación cruzada durante el montaje si el gotario o la pipeta usada para aplicar el medio de montaje toca las células de una muestra y después de otra muestra.

Problemas Más Frecuentes En Coloración

Coloración nuclear muy pálida puede deberse a: • Extendidos que se desecaron antes de ser fijados.

• Fijador con aerosol mal agitado antes de usar o aplicado muy cerca o muy lejos del extendido.

• Deficiente remoción del fijador de los extendidos. •Hematoxilina contaminada con fijador, esto reduce su capacidad de penetrar al núcleo.

• Tiempo insuficiente de inmersión en la hematoxilina. •Hematoxilina diluida con agua debido a que las

láminas no fueron bien

escurridas.

• Hematoxilina poco madura. •Tinción antigua, sobre usada o usada por un tiempo mayor del recomendado. •Lavado en agua corriente con mucho cloro (muy ácida) o por tiempo excesivo

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Coloración nuclear oscura puede deberse a:

• Células sobre teñidas en extendidos irregulares, con áreas gruesas y delgadas. • Extendidos hemorrágicos o proteínicos hacen que el ph cambie y haya mayor afinidad por la hematoxilina (se pueden lavar previamente con solución salina balanceada).

• Muestra sobre teñida en la Hematoxilina de Harris, por tiempo excesivo de colorante.

• Exceso de tinción no removido por los enjuagues posteriores a la hematoxilina. • Láminas fijadas en alcohol de mayor concentración.

Coloración citoplasmática pálida:

•

Exceso en el tiempo de inmersión en alcohol después de orange G y EA 50.

Déficit en el contraste del citoplasma:

• Colorantes sobre usados. • Extendidos sumergidos por menos tiempo del recomendado en los colorantes Orange g y ea 50. Citoplasma demasiado verde, azul o rosado:

• Debe revisarse el colorante EA 50, puede tener un exceso de colorante verde u otra variación.

Citoplasma rojizo o rosado sin diferenciación:

• • •

Extendido seco antes de ser fijado. Bacterias cocáceas Colorante sobre usado.

Citoplasma gris o púrpura:

• Exceso

de tinción de hematoxilina o inadecuada remoción del exceso de la misma.

Lámina irregularmente teñida:

• • •

Fijador con aerosol mal agitado antes de usar. Fijación irregular. Deficiente remoción del polietilenglicol del fijador.

•

El nivel de los colorantes está por debajo del recomendado.

• • • •

Sumersión inadecuada o insuficiente. Falta de agitado durante coloración . lavado de láminas insuficiente. Láminas no correctamente separadas unas de otras. Grosor irregular de la muestra