Pengujian Ha Hi 3x4065

Koasistensi Bidang Laboratorium Diagnostik

LAPORAN KASUS MANDIRI VIROLOGI

DIAGNOSA AVIAN INFLUENZA DENGAN UJI SEROLOGI (HA/HI)

OLEH : ANDI FUTRI FEBRIANI O 121 16 003

PROGRAM PENDIDIKAN PROFESI DOKTER HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS HASANUDDIN 2017

1. Signalement Nama Pemilik

: Hj. Dullah

Jenis Hewan/Spesies : Ayam Ras/Breed

: Broiler

Umur

: 21 hari

Berat Badan

: ± 700 gram

2. ANAMNESA Adapun anamnesa dari pemilik ternak ayam broiler ialah : 

Populasi 1500 ekor ayam broiler



Ayam telah di vaksin pada umur 4 hari



Ayam tampak kurus



Bulu kusam dan rontok



Memakai alas kandang dari sekam



DOC didapatkan dari MB202 yang merupakan mitra dari peternak.

3. ALUR DIAGNOSA Anamnesa

Gejala klinis

Pengambilan serum

Interpretasi hasil

Pengujian serologis (HA-HI)

Pemeriksaan serologis dapat digunakan untuk mengetahui adanya pembentukan antibodi terhadap virus avian influenza tipe A, yang dapat diamati pada hari ke-7 sampai ke-10 pasca infeksi. Uji serologi yang sering digunakan adalah uji hemaglutinasi inhibisi (HI) untuk mengetahui adanya antibodi terhadap hemaglutinin (H) (Tabbu., 2000).

4. TINJAUAN PUSTAKA Avian Influenza merupakan penyakit yang disebabkan oleh virus spesifik, yang termasuk ke dalam family orthomyxovirus, dan genus influenza virus A. Avian influenza tersebut memiliki tiga tipe yaitu virus influenza tipe A, B dan C, dan hanya virus influenza tipe A yang dapat menginfeksi unggas. Diagnosis dari penyakit tersebut yaitu dapat dilakukan isolasi atau deteksi dan karakterisasi dari fragmen dan genome virus tersebut. Unggas yang terinfeksi oleh virus ini dapat menyebar secara luas, dan memiliki gejala klinis yang bervariasi dan tergantung dari host, strain atau jenis virus, dosis virus, status kekebalan tubuh hewan, infeksi sekunder dan kondisi lingkungan (OIE, 2015). Avian influenza adalah suatu penyakit viral pada unggas, terutama kalkun dan burung liar, yang bersifat oleh adanya gangguan pernapasan, depresi dan penurunan konsumsi pakan dan minum, penurunan produksi telur dan penurunan daya tetas telur ayam bibit. Virus ini merupakan virus RNA dan mempunyai aktifitas hemaglutinin dan neuraminidase. Setiap tipe dari virus influenza ditentukan oleh struktur antigen protein nuklei dan matriks antigen, yang saling berhubungan erat di antara virus influenza tertentu (Tabbu, 2000).

Etiologi Penyakit avian influenza disebakan oleh Virus family orthomyxoviruses genus virus influenza tipe A dan merupakan virus single strand RNA, outer layer virus dilapisi dengan membrane lipid dari sel glikoprotein. Avian influenza virus memiliki tipe antigen yang berbeda yang ditandai dengan nukleoprotein antigen homolog dan matriks protein internal dan dibagi menjadi 3 tipe yaitu tipe A, B dan C. Diklasifikasikan berdasarkan subtype 16 hemaglutinin (H1-H16) dan 9 neurominidase (N1-N9). Kebanyakan virus AI (H1-16 subtipe) adalah patogenisitas rendah, tetapi beberapa virus H5 dan H7 AI sangat patogen untuk ayam, kalkun, dan unggas domestik gallinaceous terkait (Somsak, 2008). Virus AI tipe A tersusun atas 8 segmen gen yang memberikan 10 sandi protein, yaitu polymerase basic-2 (PB2), polymerase basic-1 (PB1), polymerase acidic (PA), hemaglutinin (HA), nukleoprotein (NP), neuraminidase (NA), matrix (M) dan non-struktural (NS). Masing-masing segmen memberikan satu macam

sandi protein, kecuali segmen M memberikan sandi protein M1 dan M2, serta segmen NS memberikan sandi protein NS1 dan NS2. Berat molekul protein berturut-turut adalah: 87, 96, 85, 77, 50-60, 48-63, 24, 15, 26, dan 12 kDa. Protein HA dan NA merupakan protein terpenting di dalam menimbulkan respons imun dan sebagai penentu subtype virus AI (Direktorat Bina Kesehatan Hewan, 2003).

Gambar 1. Virus avian influenza Patogenesis Patogenesitas merupakan suatu interaksi antara hospes dan virus, maka suatu virus influenza yang bersifat patogenik terhadap satu spesies unggas belum tentu bersifat patogenik untuk spesies yang lainnya. Target jaringan atau organ suatu virus mungkin mempengaruhi tingkat patogenesitasnya. Unggas yang terinfeksi oleh virus tersebut dapat melalui aerosol, feses, konjuntiva dan kontak langsung, setelah menginfeksi virus tersebut bereplilkasi pada sistem pernapasan dan traktus digestivus. Tipe highly pathogenic avian influenza atau (HPAI) akan berpenetrasi pada lapisan submukosa dan bereplikasi pada endothelia sel sinusoid. Setelah virus dilepaskan oleh sel, maka virus akan menyebar melalui system kardiovaskular dan system lymphatic menuju ke berbagai organ misalnya otak, kulit. Kejadian tersebut dapat menimbulkan gejala klinis dan kematian jika hewan yang terinfeksi mengalami kegagalan dan kerusakan organ dalam. Virus AI dapat

bertahan hidup pada jaringan, feses hewan yang terinfeksi serta pada air dan lingkungan. Virus dapat diinkatifasi pada suhu 560 C selama 3 jam dan pada suhu 600 C selama 30 menit. Virus juga dapat diinaktivasi oleh pemberian sodium dodecyl sulphate, lipid solvents, β - propiolactone, formalin dan iodine (Somsak, 2008). Berdasarkan tingkat patogenisitasnya, virus Avian Influenza dibedakan dalam dua bentuk yaitu, bentuk Low Pathogenic Avian Influenza (LPAI)/bentuk ringan dan Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI)/akut. LPAI dapat menimbulkan penyakit yang bersifat asimptomatik dan ringan yang terbatas pada gangguan saluran pernapasan dan reproduksi yang menyebabkan penurunan produksi telur, serta tingkat mortalitas rendah pada unggas. Berbeda dengan virus HPAI yang dapat menimbulkan penyakit multisistemik dengan tingkat morbiditas dan mortalitas yang tinggi mencapai 100% (Zanella, 2013). Cara penularan; Di alam, yang bertindak sebagai reservoir utama virus AI adalah unggas air antara lain itik liar, dalam tubuhnya ditemukan semua subtipe yang ada dan dapat bersembunyi pada saluran pernapasan dan saluran pencernaan dan menyebar ke unggas lain melalui inhalasi. Penyebaran flu burung dapat melalui induk semang, virus dapat menginfeksi segala jenis unggas, sumber penularan terutama pada waktu unggas air yang bermigrasi dan tingkat patogennya tergantung dari subtipe virus, spesies unggas dan faktor lingkungan. Penularan avian influenza dapat terjadi melalui kontak langsung antara ayam sakit dengan ayam yang peka. Ayam yang terinfeksi mengeluarkan virus dari saluran pernapasan konjungtiva dan feses (Nazaruddin, 2008).

Gejala Klinis Low Pathogenicity Avian Influenza Viruses Virus LPAI biasanya menghasilkan gejala pernapasan seperti bersin, batuk, discharge pada mata dan hidung, serta sinus infraorbital bengkak pada unggas. Lesi pada saluran pernapasan, adanya peradangan pada trakea dan paruparu. Penurunan produksi telur. Beberapa ekor ayam kadang mengalami gagal ginjal akut dan deposisi urat visceral (visceral gout). Morbiditas dan mortalitas

biasanya rendah jika tidak disertai dengan infeksi bakteri atau virus sekunder atau diperburuk oleh kondisi lingkungan. Infeksi sporadis oleh subtipe virus LPAI dapat terjadi, tetapi H9N2 LPAI adalah umum pada unggas di Asia, Timur Tengah, dan Afrika Utara (Swayne, 2017). High Pathogenicity Avian Influenza Viruses Unggas yang terinfeksi oleh virus HPAI, biasanya mengalami kerusakan yang bersifat multisistemik, dengan tingkat mortalitas dan morbiditas tinggi (Hooper & Selleck, 1998; Swayne & Pantin-Jackwood, 2006; Swayne, 2007). Tanda-tanda klinis yang dapat terlihat adalah jengger, pial, kelopak mata, telapak kaki dan perut yang tidak ditumbuhi bulu terlihat berwarna biru keunguan. Adanya perdarahan pada kaki berupa bintik-bintik merah (ptekhie) atau biasa disebut kerokan kaki. Keluarnya cairan dari mata dan hidung, pembengkakan pada muka dan kepala, diare, batuk, bersin dan ngorok. Nafsu makan menurun, penurunan produksi telur, kerabang telur lembek. Adanya gangguan syaraf, tortikolis, lumpuh dan gemetaran dan kematian terjadi dengan cepat. Unggas yang mengalami kematian cepat akibat virus tersebut, tidak menampakkan adanya gejala klinis yang spesifik dibandingkan dengan unggas yang tingkat infeksinya masih rendah dan masih dapat bertahan (Direktorat bina kesehatan hewan, 2003). Diagnosa Uji Hemaglutinasi/Teknik Mikrotiter Prosedur uji hemaglutinasi teknik mikrotiter plat V. Suspensi virus diencerkan berseri kelipatan dua dalam larutan PBS pada setiap sumuran plat mikro 96 sumuran. Ke dalam setiap sumuran kemudian ditambahkan suspensi sel darah merah 1%. Setelah digoyang-goyang selama 30 detik, terjadinya hemaglutinasi diamati pada setiap sumuran. Titer HA virus AI dinyatakan sebagai antilog pengenceran tertinggi virus yang masih mampu menghemaglutinasi sel darah merah 1% secara sempurna (OIE, 2015). Uji hambatan hemaglutinasi dilakukan berdasarkan prosedur baku dari OIE tahun 2009 dengan dua kali ulangan. Serum antivirus AI diencerkan berkelipatan dua dengan larutan PBS pada sumuran plat mikro 96 sumuran. Ke dalam setiap sumuran kemudian ditambahkan suspensi virus AI 4 HA unit dan dibiarkan pada suhu kamar selama 1 jam. Setalah digoyanggoyang selama 30

detik, adanya hambatan hemaglutinasi diamati pada setiap sumuran. Titer HI dinyatakan sebagai antilog pengenceran tertinggi serum yang masih mampu menghambat virus untuk menghemaglutinasi sel darah merah secara sempurna. Adanya hambatan hemaglutinasi oleh serum antivirus AI standar terhadap isolat virus menunjukkan bahwa sampel yang diperiksa positif AI (OIE, 2015).

5. MATERI METODE Materi Alat yang digunakan yaitu 1. Microplate 96 lubang dasar V 2. single channel pipet 5-40 μl, single channel pipet 40-200 μl, multichannel pipet 5-50 μl, multichannel pipet 50-300 μl 3. Mikroshaker 4. Tip 5. Freezer 6. spoit 3 cc 7. Erlenmeyer 8. Tabung ependorff 9. Cool box 10. Pinset dan gunting. Bahan yang digunakan yaitu: 1. Bahan Kimia: Larutan PBS pH 7.2 – 7.4 2. Bahan Biologis: Sampel serum ayam, virus standar/antigen, suspensi RBC 1% ayam normal, serum kontrol positif, serum kontrol negatif. Metode Hemaglutination HA Test 1.

Siapkan mikroplate (8 x 12 lubang).

2.

Isikan PBS ke semua lubang yang masing-masing 0,025 ml. (Baris #A)

3.

Ambil antigen AI sebanyak 0,025 ml, lalu isikan ke lubang kolom #1

4.

Encerkan antigen tersebut dengan cara mengocok 5-10 kali dari lubang kolom #1 sampai lubang kolom #11.

5.

Isikan PBS sebanyak 0,025 ml ke semua lubang (kolom #1 sampai kolom #12)

6.

Isikan 0,025 ml RBC ayam normal 1% ke semua lubang

7.

Kocok mikroplate tersebut dengan menggunakan micro shaker selama ± 30 detik

8.

Biarkan mikroplate tersebut dalam suhu ruangan sampai lubang kontrol negatif (#12) RBC-nya mengendap sempurna ( ±40 menit suhu kamar atau 60 menit pada suhu 3oC)

Hasil Pembacaan Hasil :

Gambar 2. Hasil Uji HA Penentuan 4 HA unit Lubang yang menampakkan aglutinasi RBC dianggap positif HA pada saat dilakukan pembacaan dengan cara memiringkan mikroplate kira-kira 45 derajat, maka didapatkan interpretasi hasil yang menunjukkan bahwa antigen tersebut dapat digunakan untuk uji HI karena memiliki kemampuan yang baik untuk mengaglutinasi sel darah merah, maka 4 HA unit antigen tersebut 29 sama dengan 512. Jadi, 512 : 4 = 128, maka untuk 4 HA sama dengan 128. Haemmaglutination Inhibition (HI) Test 1.

Siapkan mikroplate dan isi semua lubang dengan PBS masing-masing 0,025 ml.

2.

Ambil serum dengan menggunakan multichannel pipette dan tempatkan dikolom lubang #1 (baris #A s/d di baris #H), lubang kolom #12 sebagai kontrol negatif

3.

Encerkan serum tersebut dari kolom #1 sampai dengan lubang kolom #11, lalu dibuang

4.

Tambahkan kesemua lubang Antigen 4 HAU sebanyak 0,025 ml kecuali lubang kolom #12 ditambah dengan PBS 0,025 ml.

5.

Kocok dengan menggunakan micro shaker selama ± 30 detik, lalu diamkan di suhu ruangan selama ± 30 menit

6.

Tambahkan RBC ayam normal 1% sebanyak 0,025 ml kesemua lubang

7.

Kocok kembali plate tersebut dengan mikroshaker selama ± 30 detik, lalu diamkan disuhu ruangan selama ± 30 menit atau sampai lubang pada kontrol negatifnya mengendap sempurna.

Hasil Pembacaan:

Gambar 3. Pembacaan Hasil HI

Gambar 4. Hasil Uji HI

Setelah dilakukan pengujian HI maka dilakukan pembacaan dengan cara memperhatikan lubang plate yang menampakkan endapan sempurna. Hasil interpretasi dari pengujian HI yaitu : -

Serum ayam pertama

=

25

-

Serum ayam kedua

=

25

-

Serum ayam ketiga

=

26

-

Serum ayam keempat =

26

-

Serum ayam kelima

=

26

-

Serum ayam keenam =

25

-

Serum ayam ketujuh

26

-

Serum ayam kedelapan =

=

26

Hasil interpretasi dari uji HI maka ditemukan hasil seropositif pada 8 sampel serum ayam yang dilakukan pengujian. OIE menyatakan bahwa :  Titer HI > 4 log 2 (>16) = seropositif  Titer HI < 4 log 2 (<16) = seronegatif  RBC seperti pada lubang kontrol negatif dianggap positif dan dihitung sesuai dengan banyaknya lubang yang positif tersebut. Hemaglutinasi inhibisi adalah teknik pengujian sederhana yang digunakan untuk melihat titer antibody setelah dilakukan vaksinasi atau adanya infeksi alam virus avian influenza, adanya antibody terhadap virus tersebut dianggap mampu untuk melindungi unggas ataupun jenis hewan yang peka terhadap infeksi virus influenza (Zambon, 1997). Pada pengujian HI, dapat dilihat kemampuan dari antibody untuk menghambat antigen yang memiliki aktifitas HA untuk berikatan dengan eritrosit. Hemaglutinasi inhibisi digunakan untuk mendeteksi tingkat antibody yang terkandung dalam serum untuk virus avian influenza. Pengujian tesebut kurang sensitive apabila digunakan deteksi antibody pada manusia, karena antibody tersebut hanya merespon hemaglutinin pada unggas. Titer antibody tersebut dapat meningkat apabila unggas telah divaksin atau adanya infeksi alam oleh virus avian influenza. Virus avian influenza akan berikatan dengan reseptor asam sialic acid yang mengandung N-acetylneuraminic. Dengan bantuan enzimatik maka dapat meningkatkan kemampuan virus avian influenza untuk dapat berikatan dengan eritrosit, sehingga untuk mendeteksi antibody virus pada uji HI memiliki sensitivitas yang baik. Virus avian influenza memiliki reseptor yang spesifik dan memiliki kemampuan untuk mengalutinasi eritrosit dari masingmasing spesies hewan. Tingkat efisiensi dari hemaglutinin (HA) untuk berikatan tergantung dari jenis molekul reseptor asam sialic dengan oligosakarida. (Zambon, 2003). HI test (uji hemaglutinasi inhibisi) telah menjadi metode yang tepat dalam mendeteksi kehadiran antibodi spesifik dalam serum yang terinfeksi atau dari individu yang sembuh/pulih dari sakit.

Gambar 1. (Acharya, 2014) (Anonim, 2014) Beberapa virus tertentu mampu mengaglutinasi eritrosit. Kemampuan ini sebagai contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh antibodi tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada sel darah merah dan permukaan sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi tampak. Enzim virus neuraminidase memecah ikatan antara virus dan sel, dan melepas keduanya ke dalam larutan. Partikel virus influenza memiliki protein amplop disebut hemagglutinin, atau HA, yang mengikat reseptor asam sialic pada sel. Virus ini juga akan mengikat eritrosit (sel darah merah), menyebabkan pembentukan endapan. Properti ini disebut hemaglutinasi, dan merupakan dasar dari alat tes cepat untuk menentukan kadar virus influenza yang hadir dalam sampel (Acharya, 2014). Virion dari beberapa keluarga virus berikatan dengan sel darah merah (RBC) dan menyebabkan hemaglutinasi. Prinsip serologis dari hemaglutinasi inhibisi yaitu antibodi menghambat proses hemaglutinasi dari virus. Bila antibodi spesifik dan virus dicampur sebelum ditambah eritrosit, hemaglutinasi akan terhambat. Virus-virus Avian dapat mengaglutinasi eritrosit, termasuk didalamnya NDV (Newcastle Disease Virus), Virus influenza dan virus Adenovirus. Hambatan dari aglutinasi oleh antibodi spesifik merupakan dasar dari uji HA dan HI cepat pada kaca benda. Uji HA lambat digunakan untuk mengetahui titer virus,

kemampuan virus dalam menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit. Titer virus dapat diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada nomor tertinggi (end point) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal itu ditandai dengan adanya agregat-agregat di dasar sumuran (Yudhi, 2009). Uji HA digunakan untuk mendeteksi virus yang memiliki hemaglutinin. Hemaglutinin ini dapat mengaglutinasi eritrosit beberapa spesies hewan, salah satunya adalah eritrosit unggas. Kegunaan lainnya dari uji HA adalah sebagai dasar untuk menentukan titer virus. 6. PENCEGAHAN DAN PENGOBATAN -

Pencegahan Tindakan pencegahan lain yang dapat dilakukan adalah mencegah kontak

antara unggas dengan burung liar atau unggas liar, depopulasi atau pemusnahan terbatas di daerah tertular, pengendalian limbah peternakan unggas, surveilans dan penelusuran, pengisian kandang kembali atau peremajaan, penerapan kebersihan kandang, penempatan satu umur dalam peternakan, manajemen flock all-in/allout, penyemprotan dengan desinfektan terhadap kandang sebelum pemasukan unggas atau ayam baru, penerapan stamping out atau pemusnahan menyeluruh di daerah tertular baru dalam menangani wabah HPAI untuk menghindari resiko terjadinya penularan kepada manusia, karena bersifat zoonosis, peningkatan kesadaran masyarakat, serta monitoring dan evaluasi (Nazaruddin., 2008). -

Pengobatan Avian influenza tidak dapat diobati, pemberian antibiotik/antibakteri

hanya untuk mengobati infeksi sekunder oleh bakteri atau mycoplasma. Pengobatan if dengan multivitamin perlu juga dilakukan untuk proses rehabilitasi jaringan yang rusak (Tabbu., 2000).

DAFTAR PUSTAKA Acharya, Tankeshwar. 2014. Hemagglutination Inhibition Test (HAI): Principle, Procedure,

Result

and

Interpretations.

https://microbeonline.com/hemagglutination-inhibition-test-hai-principleprocedure-result-interpretations/ diakses tanggal 24 Februari 2017. Direktorat Bina Kesehatan Hewan, 1993. Pedoman Pengendalian Penyakit Hewan Menular. Hooper, P. & Selleck, P. (1998). Pathology of low and high virulent influenza virus infections. In D.E. Swayne & R. D. Slemons (Eds.), Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza of the US Animal Health Association (pp. 134_141). Richmond, VA, USA. OIE Terrestrial Manual, 2008. Avian Mycoplasmosis Chapter 2.3.5 Radji, M. 2006. Avian Influenza A (H5N1) : Patogenesis, Pencegahan dan Penyebaran Pada Manusia. Majalah Ilmu Kefarmasian. 3(2):55-65 Swayne, D.E. (2007). Understanding the complex pathobiology of high pathogenicity avian influenza viruses in birds. Avian Diseases, 51, 242_249. Tabbu, C. R. 2000. Penyakit Ayam dan Penanggulangannya. Penyakit Bakterial, Mikal, dan Viral Volume 1. Penerbit Kanisius, Yogyakarta Zanella, Antonio. 2013. Poultry Disease Manual Characteristics and control of Infections. Zambon MC. 1997. Laboratory diagnosis of influenza. In: Nicholson KG, Webster RG, Hay AJ, editors. Textbook of influenza. Oxford: Blackwell. p 291–312.

LAMPIRAN Materi dan Metode Uji HA-HI:

Materi dan Metode uji HA-HI:

Gambar 1. Sampel serum

Gambar 3. Persiapan alat dan bahan

Gambar 5. Pemberian antigen

Gambar 2. Antigen

Gambar 4. Pemberian PBS

Gambar 6. Pemberian RBC

Gambar 7. Hasil uji HA

Gambar 8. Pemberian serum

Gambar 9. Pengenceran serum

Gambar 10. Antigen 4 Ha unit

Gambar 11. Inkubasi 40c

Gambar 12. Pembacaan hasil HI