Cuantificacion Por Hplc.pdf 70261

Cuantificación en CG y HPLC •

Los detectores dan una respuesta que es proporcional a la cantidad de sustancia (m):

•

El coeficiente de proporcionalidad a es característico de cada sustancia pero no es posible predecirlo en forma sencilla

Respuesta = a  m

Como el componente atraviesa el detector en un período de tiempo, la respuesta debe ser evaluada en todo ese período

Área de la señal

Si el coeficiente a es igual para varios compuestos podemos determinar su proporción relativa en una mezcla

A1/A2 = m1/m / 2

1

2

3

Esto dependerá del tipo de detector y la similitud entre los compuestos

En cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama, las diferencias de respuesta pueden ser muy grandes mezcla de solventes conteniendo 1,5 mg/ml de cada uno

Chromatography Today, 2012, 52-56

Diferencias mucho mayores pueden darse en cromatografía líquida con detector UV-visible donde algunos componentes pueden tener respuesta nula y otros respuesta alta a una dada longitud de onda.

1

El factor de respuesta ( f ) es la inversa del coeficiente a y corresponde a la cantidad de sustancia por unidad de área

En el caso más general cada componente tendrá un factor de respuesta característico

m1/m2 = f1A1/f2A2 1

2

3

Para conocer la relación entre los componentes debo conocer los factores de respuesta individuales fi

Los factores de respuesta los determino experimentalmente midiendo el área de la señal producida por una cantidad conocida ((Mi) de cada componente p

f1 = M1/A1 , etc. 1

2

3

Esto requiere tener patrones de referencia de pureza conocida de cada componente

Solvente

f (CG-FID)

metanol

0,151

isopropanol

0,234

acetato de etilo

0,196

cloroformo

0,039

tolueno

0,490

MTBE

0,303

acetonitrilo

0,212

Métodos de cuantificación Método del estándar externo:

M1 = C1 x (Vol de inyección)

1) inyecto una masa conocida M1 del componente a cuantificar (solución de calibrado de concentración C1) 1

2) mido el área de la señal (A1) y calculo el factor:

f1 = M1/A1

A’1

3) inyecto la muestra problema y mido p a el área de la señal del componente cuantificar

1

4) usando el factor calculo la masa del componente en la muestra inyectada y/o la concentración

m1 = f1A’1

Si el volumen de inyección es igual:

C’1 = m1/(Vol de inyección) C’1 = C1A’1/A1

2

Ventajas •

Sencillo de implementar

Desventajas •

Requiere volúmenes de inyección precisos y reproducibles

•

Requiere una gran estabilidad en el tiempo del sistema cromatográfico (flujos, ancho de picos, etc.)

•

Si se pasan varias muestras, debe inyectarse la solución de calibración periodicamente (por ejemplo cada 3 o 5 muestras) para verificar que el sistema está estable

•

El método es susceptible a errores introducidos al hacer diluciones, etc.

Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del componente, debe verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de calibración) y/o inyectar cantidad de estándar externo acorde a cada muestra

Método del estándar interno 1) Se agrega una cantidad igual del estándar (SI) a la solución de calibrado y a las muestras de modo de tener la misma concentración del estándar

ASI

A1

2) inyecto la solución de calibrado (concentración conocida C1 del componente a cuantificar) SI

3) mido el área de las señales del componente a cuantificar (A1) y del SI y calculo el factor de respuesta relativo:

1

(F1CSI) = C1ASI/A1

F1 = C1ASI/CSIA1

A’1

A’SI 4) inyecto la muestra problema (que contiene una cantidad conocida de SI) y mido el área de la señal del componente a cuantificar y del SI SI

5) usando el factor F calculo la concentración del componente en la muestra inyectada C’1

1

C’1 = F1CSIA’1/A’SI

3

Ventajas •

Es independiente del volumen de inyección

•

No requiere precisión en la preparación de la solución de SI ni conocer su pureza, solo agregar la misma cantidad a muestras y solución de calibrado

•

Es independiente de los errores por diluciones una vez agregado el SI

•

E independiente Es i d di t de d variaciones i i en ell flujo fl j o en las l condiciones di i de d corrida id

Desventajas •

Requiere disponer de una sustancia (el SI) que no se superponga con ninguno de los componentes de la muestra y que sea eluida en las mismas condiciones

•

La preparación de muestras y soluciones de calibrado es más laboriosa

Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del componente, debe verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de calibración) y/o utilizar soluciones calibradoras diferentes (de concentraciones similares a las muestras)

Los métodos de estándar externo y estándar interno son de aplicación general Sin embargo debe tenerse cuidado con ciertos tipos de detectores que pueden tener mucha variabilidad de respuesta incluso dentro de una misma corrida, y respuesta no lineal, como por ejemplo los detectores selectivos de masa

En el caso de CG o HPLC acoplados a espectrómetros de masa, los cromatogramas de corriente iónica total no son adecuados para cuantificar La solución más conveniente es usar la misma sustancia como estándar interno

4

En la práctica se usa como estándar interno la misma sustancia deuterada

Se agrega a la muestra una cantidad conocida de la sustancia a determinar (X) deuterada

TIC

El cromatograma de corriente iónica total muestra todos los componentes y un único pico para XH y XD X

El cromatograma de los iones de m/z = M solo mostrará algunos componentes

AX

M

X-H X Hn

El cromatograma de los iones de m/z = M+n mostrará al componente X con n 1H reemplazados por 2H al mismo tiempo de retención que puede usarse como SI

ASI

M+n

X-Dn

Como el componente a determinar y el SI son iguales y son detectados en el mismo momento (al mismo tiempo de retención) la determinación no se afecta por la variabilidad del detector.

En RMN cada grupo de núcleos idénticos dará una señal de complejidad variable pero inequivocamente asignable

•

el área de cada señal es directamente proporcional a la magnetización de l núcleos los ú l que la l producen d

•

en un espectro RMN las áreas relativas de las distintas señales dependen solo del número de núcleos que les dan origen

•

existe una relación sencilla y exacta entre las áreas relativas de distintas señales en un mismo espectro

•

las áreas relativas son independientes de la concentración y se corresponden con la fracción molar de cada grupo de núcleos

5

Experimentos posibles Cuantificación relativa de componentes similar a un CG pero el factor de respuesta es conocido en forma exacta nx: moles del componente x Nx: Nº de núcleos de x que contribuyen a la señal Ix

La fracción molar de un componente en una mezcla puede determinarse en forma directa, si se requiere %P/P se deben conocer las masas molares. RMN es el método más usado para la determinación relativa de isómeros, diasterómeros y enanteómeros (usando solventes o complejantes quirales), en ese caso no hace falta conocer la masa molar Cuantificación absoluta de componentes La forma más simple es agregar un estándar (gravimetría) a una masa conocida de cualquier mezcla: se obtienen resultados absolutos RMN es un método primario de medición relativo Un método primario de medición es un método con la más alta calidad metrológica cuya operación puede ser descripta y entendida en forma completa, para el cual puede escribirse un análisis completo de incertidumbre en términos de unidades SI y cuyos resultados son aceptados sin referencia a un estándar de la cantidad que se está midiendo

Determinación de grado de etoxilación de lauril alcohol etoxilado

0,88 1,26 1,57

3,55-3,80

3,44

CH3((CH2)9CH2CH2O ((CH2CH2O))n -11-CH2CH2OH

AHC

AOX (4n+2)H

23H

4n  2 23

n  5,75 



A OX AHC

A OX  0,5 A HC

6

n  5,75 

un patrón de referencia

A OX  0,5 A HC

AOX (4n+2)H

n = 8,1

AHC

0,88 1,26 1,57

23H

3,44

3,55-3,80

CH 3(CH 2)9CH2CH2O (CH2CH2O)n -1-CH2CH2OH

n  5,75 

una muestra desconocida

A OX  0,5 A HC

AOX (4n+2)H

n = 8,9

AHC

0,88 1,26 1,57

3,55-3,80

23H

3,44

CH 3(CH 2)9CH2CH2O (CH2CH2O)n -1-CH2CH2OH

7

6,624 H

CN C C CO2 CH2CH3

H 7,061

0.847

1.022

1.388 1.374 1.360

1.624

1.814

1,374 (t)

3.600

4.373 4.358 4.344 4.330

6.624

7.061

4,351 (c)

VP12185 Current Data Parameters NAME U06-110801 EXPNO 1 PROCNO 1 F2 - Acquisition Parameters Date_ 2006-08-17 Time 12.53 INSTRUM Avance 500 PROBHD 5 mm PABBI 1H/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT CDCl3 NS 32 DS 2 SWH 7500.000 Hz FIDRES 0.114441 Hz AQ 4.3691168 sec RG 4 DW 66.667 usec DE 6.00 usec TE 296.5 K D1 1.00000000 sec TD0 1 ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 1H P1 7.00 usec PL1 0.00 dB SFO1 500.1327507 MHz

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

0.25

3.03

0.16

0.13

0.30

1.98

1.00

0.00 0.01

0.01

1.00

F2 - Processing parameters SI 32768 SF 500.1300063 MHz WDW EM SSB 0 LB 0.30 Hz GB 0 PC 1.00

1.5

1.0

0.5

0.0

ppm

espectro RMN 1H 500 MHz de adhesivo de base cianoacrilato (“la gotita”)

6,624

6,72

OH

CN

H

C C H

2x(AreaH1 + AreaH2)xMCN

1,374 (t)

OH

satélites de 13C (0,56%)

6.721

7.062

7,061 4,351 (c)

5600 x AreaHQxMHQ

ppm Hidroquinona =

CO2 CH2CH3

6.624

H

4.5

7.10

7.05

7.00

6.95

6.85

4.0

6.80

6.75

3.5

3.0

2.5

2.0

0.992

0.004

0.006 6.90

6.70

6.65

1.5

6.60

ppm

6.55

1.0

0.848

7.15

1.022

7.20

1.389 1.375 1.361

7.25

1.620

7.30

1.815

7.35

3.601

7.40 4.374 4.359 4.345 4.331

7.45

0.005

1.000

determinación de contenido de hidroquinona en adhesivo de base cianoacrilato ((“la la gotita”)

ppm

8

Muestra + SI diluida con D2O

En RMN también podemos usar el método de estándar interno (similar al usado en CG o HPLC)

En este ejemplo usamos RMN 13C No es necesario separar los componentes, ya que la información en un espectro RMN permite diferenciarlos e identificarlos Solución de calibración

No debemos preocuparnos por condiciones especiales de medición porque, como en GC y HPLC, el factor de respuesta se refiere al estándar interno

Pero en RMN la cuantificación se hace respecto a los núcleos sin importar en que molécula están, ya que su respuesta relativa (área) es independiente de ésta

• La sustancia usada como referencia y nuestra muestra no tienen porqué ser la misma patrones de referencia de cada analito a • No necesitamos p cuantificar • No se requiere la separación previa de los componentes ¿Que condiciones debe cumplir la sustancia de referencia? • contener al menos un núcleo igual al de la muestra (1H, 13C, 31P, 19F, 29Si, etc.) • ser soluble en el mismo solvente q que la muestra • no dar señales próximas a las de la muestra • preferentemente dar una única señal (no imprescindible) • obtenerse comercialmente con alto grado de pureza y título confiable • ser estable, no volátil y preferentemente sólida

9

Algunos patrones de referencia comunmente usados en QNMR:

núcleos

solventes

dimetilsulfona

1H, 13C

agua, orgánicos

1,3,5-trioxano

1H, 13C

orgánicos

acetato de sodio anhidro

1H, 13C

agua

fosfato de sodio dodecahidrato

31P

agua

trifenilfosfato

31P

orgánicos

trifluoroacetato de etilo

19F

orgánicos

ortosilicato de etilo

29Si

orgánicos

2.8933 2.8687

3.4534

Espectro RMN 1H (500 MHz) de glifosato solvente: D2O - piridina-d5 (7:1)

HOD D DO2C CH2 N CH2 PO3D2

piridina-d4 8.0

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

(ppm)

10

2.8687

2.8933

3.4534

el 1,12% de las moléculas tienen13C

Impureza

DO2C

J 1H-31P

D CH2 N CH2 PO3D2

13

J 1H-13C

D DO2C CH2 N

satélite 13C

satélite 13C (0,56%)

3.75

3.70

13CH 2

PO3D2

J 1H-13C

3.65

3.60

3.55

3.50

3.45

3.40

3.35

3.30

3.25

3.20 (ppm)

3.15

3.10

3.05

3.00

2.95

2.90

2.85

2.80

2.75

2.70

2.65

1.6315

2.9247 2.9006

3.4939

agregando acetato de sodio:

Muestra: Pur-2 C¾digo interno: U04-190803

CH3COOGroup Peak 1

N-CH2PO3H2

N CH2COON-CH

Start (ppm/Hz)

End (ppm/Hz)

3.89 1944.4

3.24 1621.0

Area

Area %

2.4174E+005

100.00

1

3.89 1944.4

3.24 1621.0

2.4156E+005

2

3.41 1706.4

3.37 1687.8

1.8026E+002

0.07

3.16 1579.1

2.65 1326.6

2.4170E+005

100.00

3.16 1579.1

2.65 1326.6

2.4170E+005

100.00

1.86

930.1

1.35

673.4

1.1128E+005

100.00

1.86

930.1

1.35

673.4

1.1128E+005

100.00

2 1 3 1

99.93

Area(glifosato) moles(glifosato) = moles(estándar) x

Hestándar x

Area(estándar)

Hglifosato

moles(glifosato) x M(glifosato) %glifosato = W(muestra)

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

(ppm)

La concentración no interviene! Los errores volumétricos no influyen en el resultado

11

2.5659

2.8350 2.8104

2.9438 2.9197

3.0740 3.0499

3.3955

3.5003

Glifosato técnico del mercado local

HO2C CH2 NH HO2C CH2 IDA

HO2C CH2 CH3

N CH2 PO3H2

H2O3P CH2

NMG CH3

NH

N

H2O3P CH2 IMPA + satélite 13C

NMG

CH2 PO3H2

CH3

MAMPA

satélite 13C

CH3 CH2 PO3H2

N

no ident.

H MAMPA

H2NCH2 PO3H2

glicina g

AMPA NMG

satélite 13C

3.60

3.50

3.40

3.30

3.20

3.10 (ppm)

3.00

2.90

2.80

2.70

2.60

2.50

2.40

HO2C CH2

Otro glifosato local

N CH2 PO3H2 NMG

2.8483 2.8273 2.8232 2.8028

2.9293 2.9052

3.1156 3.0924 3.0669 3.0432

3.3064

3.3847

3.4990

3.7235

3.9015 3.8788

4.4015

CH3

2.5559

3.70

no ident.

HO2C CH 2 NH HO2C CH 2

HO2C CH2 N

CH3 N

CH2 PO3H2

CH2 PO3H2

H

HO2C CH2

MAMPA

glicina

PMIDA Satélite 13C + IMPA

Satélite 13C

no ident. PMIDA N-óxido

4.5

4.4

4.3

4.2

4.1

H2NCH2 PO3H2 AMPA

PMIDA

4.0

3.9

3.8

3.7

3.6

3.5

3.4

3.3

3.2

3.1

3.0

2.9

2.8

2.7

2.6

2.5

2

(ppm)

12

En una muestra grado técnico podemos además cuantificar las impurezas (respecto al acetato o al glifosato) *** Current Data Parameters *** Group Peak

Start (ppm/Hz)

End (ppm/Hz)

Area

Area %

3.83 1917.6

3.26 1630.4

2.1654E+005

100.00

1 2 3

3.76 1879.4

3.69 1845.0

2.0670E+003

0.95

3.83 1917.6

3.31 1655.3

2.1347E+005

98.58

:

qseq

3.39 1697.4

3.37 1684.0

5.3871E+002

0.25

4

INSTRUM :

AM-500

3.31 1655.3

3.26 1630.4

4.7055E+002

0.22

NS

:

1.80

900.3

1.45

724.7

1.1127E+005

100.00

O1

:

8177.00 Hz

1.80

900.3

1.45

724.7

1.1127E+005

100.00

O2

:

7700.00 Hz

SW

:

14.9213 ppm

TD

:

TE

:

NAME

: GLIFOSATO

LOTE 10-04

8

65536

1.6234

AQ_mod

2.9235 2.8993

3.7208

1

: U04-120703 A

*** Acquisition Parameters ***

3.3820

2

PROCNO

3.4968

1

303 K

ULSE

: 10.500 usec acetato (3H) SFREQ : 500.1354210 MHz

glifosato (2H)

*** Processing Parameters *** LB

:

SI

:

SR

:

6700.07 Hz

AQ_time

:

4.3908880 sec

NUCLEUS :

0.20 Hz 32768

H

SOLVENT : D2O (+piridina-d)

DDATE

:

2004/J l/26 2004/Jul/26

PMIDA (4H)

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

(ppm)

Si queremos integrales con error menor al 1,1% debemos adoptar un criterio uniforme respecto a las señales satélite Podemos incluir los satélites siempre o excluirlos siempre en la integración de las señales de un espectro La superposición con otras señales dificulta incluirlos Líneas muy anchas en la base dificulta excluirlos

Una alternativa es eliminar el acoplamiento 1H-13C. Esto tiene varias ventajas adicionales: Desaparece el ensanchamiento de la base de las líneas al eliminar los acoplamientos 1H-13C a 2 y 3 enlaces Se elimina el error de integración provocado por superposición de señales con satélites de señales vecinas Se pueden identificar con mayor facilidad impurezas en concentraciones menores al 1%

13

Sin desacople de 13C

Con desacople GARP-1

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

3.8

1.4

3.6

3.4

3.2

3.0

1.6411

2.9407 2.9164

3.5052

1.6315

2.9247 2.9006

3.4939

temperatura regulada a 303 K

2.8

2.6 (ppm)

(ppm)

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

2.9941

7.9684

8.9619

10.5103

12.4288

También es posible usar RMN 31P

HO2C CH2 N CH2 PO3H2 H2 glifosato HO2C CH2 N CH2 PO3H2 HO2C CH2 + CH2 PO3H2 N HO2C CH2 OHO2C CH2

H 2NCH 2 PO3H 2

fosfato

29

28

27

26

25

24

23

22

21

20

19

18

17

16

15

14 (ppm)

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

-1

14

Espectro RMN 31P (202 MHz) de metamidofos técnico solvente metanol, sin efecto Overha Nuclear, escala vertical x20,

O

P NH2

H3CO

SCH3

- 18 . 00

- 10 . 78 - 10 . 90

1. 64 1.5 8 1 .44

1 2 .74 10 .96 1 0.8 5 10 .7 7 10 .72 10 .6 7 9 .7 7 9 .36 9.3 3

2 2.2 7 21 .9 3 2 0.2 7 20 .15 1 9 .46 1 9.4 2 1 9.3 5 1 9.2 5 19 .18

25 .7 3 2 5 .54

30 .9 3 3 0.4 5 30 .38 29 .1

3 2.3 5

3 7.3 4

39 .16

Podemos hacer una cuantificación absoluta agregando un estándar interno:

O O P O 3

P NH2

H3CO

SCH3

AreaMTD

40

1.0 00

AreaTPPO

1.2 05

MolesMTD = MolesTPPO ×

35

30

25

20

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

ppm

15

1.9 30 1 .91 3

1 .25 1 1 .20 1

2.0 7 7

1 .02

título 98,1% (por CG 98,1%)

1 .0 2

2 .98 5

6.3 7 5

6 .70 7 6 .69 0

7 .41 1 7 .39 4 7.3 7 8 7.3 77 7 .36 1 7 .1 67 7 .14 2 7.0 4 0 7 .02 4

cuantificación de deltametrina estándar de referencia: dimetilsulfona (CH3)2SO2

DMSO2

Br O

Br

7.5

O

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

6.1 1

H

18 .53

1.0 2

7.0

CN

1 .0 0

3.0 9

1.0 3 2 .06

3. 07

O

1.5

1.0

0.5

ppm

cuantificación de cipermetrina (mezcla de 4 diasterómeros) estándar de referencia: dimetilsulfona (CH3)2SO2

título 93,1%

DMSO2

Group Peak

Start (ppm/Hz)

1

End (ppm/Hz)

6.46 3230.5

Area

Area %

6.09 3045.8 1.4219E+009

100.00 64.90

1

6.46 3230.5

6.20 3100.2 9.2275E+008

2

6.20 3100.2

6.09 3045.8 4.9830E 4.9830E+008 008

3

6.14 3070.7

6.09 3047.6 8.3154E+005

0.06

5.69 2844.5

5.57 2783.8 3.9989E+008

100.00

1

5.68 2842.2

5.66 2828.4 6.5241E+005

0.16

2

5.69 2844.5

5.57 2783.8 3.9819E+008

99.58

3

5.59 2793.4

5.57 2784.4 1.0422E+006

0.26

2

3

2.9817

U08-130301

5.6476 5.6313 5.6257 5.6094

6.1930 6.1787 6.1756 6.1613

Estándar de cipermetrina Lote 080125P1

35.05

3.22 1611.0

2.79 1393.0 1.3766E+010

100.00

1

3.22 1611.0

2.79 1393.0 1.3759E+010

99.95

2

2.92 1460.9

2.79 1396.6 6.8632E+006

0.05

Cl O

Cl H

O CN

O

desacople GARP centrado a 100 ppm regulación de temperatura a 303 K 6.4

6.2

6.0

5.8

5.6

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6 (ppm)

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

16

análisis de excipientes en un producto farmacéutico Polietilenglicol (PEG 400) 1% propilenglicol 0,4% Alcohol polivinílico 2% agua

H(O CH2CH2

)nOH

CH2OH

 3,52-3,65 (

CH2OH CH3

)n

CHCH2

 1,030 1 030

 1,30-2,10

OH

Verificación soluciones acuosas de cada excipiente conteniendo 1mg/ml de dimetilsulfona Medición producto farmacéutico conteniendo 1 mg/ml de dimetilsulfona

Llenado de ceros a 128K ventana exponencial; LB: 0,30 Hz Corrección de fase y de línea de base automática con ajuste fino manual Referencia: 10% D2O Integración de señales manual,

Tabla de datos: 32K Ancho espectral: 0 - 4,1 ppm Tiempo de adquisición: 7,99 seg Tiempo de repetición: 8,99 seg Angulo de pulso: 30º Temperatura 297 K Número de espectros acumulados (NS): 16 Equilibración (DS): 2

DMSO2 H(O CH2CH2

Alcohol polivinílico PHE 03904

1,87

U09-010403

Group Peak 1

End (ppm/Hz)

Area

CH2OH

3.50 1751.1 5.2618E+010 100.00

1

3.67 1833.3

3.50 1751.1 5.2618E+010 100.00

3.09 1544.1

2.96 1482.3 2.0914E+010 100.00

1

3.09 1544.1

2.96 1482.3 2.0914E+010 100.00

3

2.20 1099.6

1.19

596.7 1.4652E+011 100.00

2.20 1099.6

1.19

596.7 1.4652E+011 100.00

1.10

551.5

0.87

435.0 5.9783E+010 100.00

1

1.10

550.9

1.05

527.4 1.7317E+008

0.29

2

1.10

551.5

0.87

435.0 5.9319E+010

99.22

3

1.00

498.0

0.87

435.6 2.9107E+008

0.49

1 4

CH3

Area %

3.67 1833.3

2

)nOH

Start (ppm/Hz)

CH2OH 1.0375 1.0246

0,36 1.6024 1.5900 1.5452

0,90

PEG 400 (n = 8 o 9)

2.0018 1.9846

3.0382

3.3524 3.3388 3.3293 3.3157

3.6379 3.6293 3.6195 3.6009 3.5973 3.5453 3.5354 3.5268 3.4516 3.4435 3.4284 3.4203

3.8784

3.9342

%P/V Propilenglicol

(

CHCH2

)n

OH

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4 (ppm)

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

17

Algunas fuentes de error intrínsecas a métodos cromatográficos y RMN cuantitativo fuente de error

RMN

HPLC / GC

diferente factor de respuesta entre sustancia a cuantificar y estándar d referencia de f i

Para núcleos distintos de 1H, medir espectros sin NOE Medir T1 previamente y usar tiempos de repetición > 9T1

usar como estándar de ref. un patrón de título conocido de la sustancia a cuantificar (no siempre disponible)

título incorrecto o dudoso del estándar de referencia

Cambiar por otro estándar (otro proveedor u otra sustancia de referencia), determinar título contra otro estándar diferente

Buscar otro proveedor del mismo estándar (no siempre posible)

superposición de pico de sustancia a cuantificar con una impureza desconocida

Hacer el cálculo con más de una señal de la muestra o con más de un núcleo presente en la muestra Utilizar RMN 2D homo o heteronuclear para confirmar pureza de pico

Cambio de condiciones (columna, solvente, temperaturas) Acoplar a espectrometría de masa y determinar el espectro en distintas partes del mismo pico (no siempre posible en HPLC) Acoplar a RMN (solo para HPLC)

Detector contaminado, sangrado de columnas, picos fantasmas

--------No se aplica----------

Cambiar/acondicionar columna limpiar detector, inyector, etc.

RMN cuantitativo (QNMR) Ventajas • No requiere estándares del compuesto principal ni de las impurezas • No requiere separar el compuesto principal ni las impurezas • Puede identificar y cuantificar impurezas nuevas o inesperadas • En general no hay impurezas “invisibles” • Es simple, preciso y económico • No es destructivo (la muestra una vez preparada puede reanalizarse) • No hay desgaste o deterioro de columnas, etc.

Desventajas • Se requieren espectrómetros de RMN de alto campo que son costosos (20 a 30 veces el precio de un GC o HPLC) •

La operación de los espectrómetros requiere personal especialmente entrenado y con buenos conocimientos de la teoría del método

•

El mantenimiento de los espectrómetros requiere insumos cuyo consumo es permanente e independiente del uso (helio y nitrógeno líquidos)

18

Selección de bibliografía de RMN cuantitativo U. Holzgrabe et al, J. Pharm. Biomed. Anal., 1998, 17, 557-616 (review) G. F. Pauli, Phytochem. Anal., 2001, 12, 28-42 (review) R. J. Wells et al, J. Agric. Food. Chem., 2002, 50, 3366-3374 T. S. Al-Deen et al, Anal. Chim. Acta, 2002, 474, 125-135 T. S. Al-Deen, et al, Accred. Qual. Assur., 2004, 9, 55–63 R J R. J. Wells et al al, Accred. Accred Q Qual. al Ass Assur., r 2004, 2004 9, 9 450–456 450 456 G. F. Pauli et al, J. Nat. Prod., 2005, 68, 133-149 (review) G. F. Pauli et al, J. Nat. Prod., 2007, 70, 589-595 NMR Spectroscopy in Pharmaceutical Analysis 2008, Elsevier

19