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14. DUPLICACIÓN DEL ADN S. Signorelli y J. Monza Revisado por la Dra. Ana Ramón, Sección Biología Molecular, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias, UdelaR. 1. La duplicación del ADN es semiconservativa La duplicación del ADN, que ocurre de manera similar en procariotas y eucariotas, consiste en la síntesis de una molécula igual a la que le dio origen. Debido a esto, como las células duplican su ADN antes de cada división, las hijas tienen el mismo contenido de ADN y la misma información. Una excepción a esto son los gametos que contienen la mitad de ADN respecto a la célula madre. • En la duplicación del ADN cada hebra actúa como molde para la síntesis de una hebra nueva. Como se muestra en la figura 1, cada hebra madre (molde) queda junto a una hebra hija (nueva): la duplicación es semiconservativa. • Meselson y Stahl, usando bases marcadas con 15 N, demostraron cómo se asocian las hebras después de la duplicación (Fig. 1). 2. Secuencia de eventos durante la duplicación La descripción de la duplicación del ADN se centrará en el modelo bacteriano, que como proceso general es el mismo al que ocurre en eucariotas. La secuencia de eventos que terminan con la duplicación del ADN se describe en los cuatro puntos que siguen. 2.1 Reconocimiento del o los orígenes de replicación • La duplicación comienza en muchos sitios del cromosoma eucariota, o en un único sitio en el cromosoma bacteriano. Estos sitios, que se denominan orígenes de duplicación (oriC) están pautados por secuencias específicas de bases. • En Escherichia coli el origen de duplicación tiene unas 245 pb cuya secuencia es reconocida por una proteína (DNAa). Otra proteína con actividad Helicasa (DNAb) separa las hebras y se forma una burbuja de duplicación (Fig. 2).

Figura 1. Duplicación semiconservativa del ADN: experimento de Meselson y Stahl. A. El ADN pesado tiene las bases de ambas hebras con 15N (isótopo pesado) y el ADN liviano con 14N (isótopo liviano). El ADN con 15N se puede separar del ADN con 14N por ultracentrifugación, porque el ADN pesado ocupa una posición inferior respecto al liviano. B. Si se parte de bacterias con ADN pesado, y se las crece en un medio con 14N las hebras hijas serán livianas. Cada hebra hija se asocia con la hebra madre y el ADN es semipesado: la duplicación es semiconservativa. La otra posibilidad, que se asocien las dos hebras hijas y las dos hebras madres, no ocurre.

• En cada burbuja hay dos horquillas de duplicación: la síntesis de ADN se da en dos direcciones. En la figura 2 se representa la formación de la burbuja de duplicación en un cromosoma procariota y se indican las horquillas de duplicación. • A partir de un oriC se replica una unidad funcional que se denomina replicón. En bacterias, que tienen un solo oriC, todo el genoma es un replicón. En el genoma humano se estiman entre 10.000 y 100.000 oriC, por lo que habría hasta 100.000 replicones.

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actúan las Topoisomerasas, enzimas que hidrolizan una o ambas hebras de ADN permitiendo el giro de la molécula y la eliminación del superenrrollamiento (Fig. 2).

Figura 2. Origen de duplicación en un cromosoma procariota. En el origen de duplicación se forma la burbuja de duplicación y se generan dos horquillas, una para cada lado: la síntesis de ADN avanza en sentidos opuestos.

2.2 Separación de las hebras de ADN • La separación de las hebras ocurre por acción de la enzima Helicasa, que rompe los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias. Como consecuencia se forman dos horquillas de replicación, una en cada lado del bucle (Fig. 2), pero para facilitar la descripción se analizará lo que ocurre en una de ellas. • Para separar a las hebras, la Helicasa se desplaza a lo largo del ADN, para lo que utiliza energía de la hidrólisis del ATP. • Al separar a las dos hebras se genera un superenrollamiento en el ADN “por adelante” de la Helicasa. Para disminuir la tensión generada

• Las hebras se mantienen momentáneamente separadas, como monohebra, por la participación de proteínas SSB (single stranded DNA binding proteins), también llamadas estabilizadoras de monohebra. Estas proteínas interaccionan con el ADN y mantienen separadas a las hebras para que puedan actuar como molde. + Observe que las hebras de ADN no se separan ni se mantienen como monohebra espontáneamente, para ello participa una enzima y proteínas específicas. 2.3 Síntesis del ARN cebador • La ADN pol requiere de un fragmento de polinucleótido con un -OH 3´ libre para comenzar a polimerizar los dNTP (Fig. 3). Este fragmento es el cebador, y tiene entre 10 y 60 nucleótidos. • El cebador es ARN, que se sintetiza por una ARN pol, la Primasa, que condensa a los ribonucleótidos trifosfato ATP, CTP, GTP y UTP, colectivamente denominados NTP (Fig. 3 y 4).

Figura 3. Duplicación del ADN. A. Cebador. El ARN cebador se sintetiza por adición de NTP por acción de la Primasa. Al extremo OH 3´ libre del cebador se unen los dNTP por acción de la ADN pol. B. Síntesis del ADN. La Helicasa rompe los puentes de hidrógeno entre las bases, las SSB estabilizan las hebras simples y la Topoisomerasa hidroliza el ADN y permite eliminar el superenrollamiento. El crecimiento de la hebra continua (superior) acompaña el sentido de apertura de las hebras. La hebra discontinua (inferior), crece en sentido opuesto y en fragmentos (fragmentos de Okasaki). La Primasa sintetiza al cebador, al que se adicionan dNTPs por acción de la ADN pol III. El cebador es remplazado por ADN por acción de la ADN pol I. La Ligasa une los fragmentos de ADN de la hebra discontinua.

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• Al extremo -OH 3´ libre del cebador la ADN pol adiciona el primer dNTP y continua adicionándolos al extremo -OH 3´ del ADN creciente: el ADN crece en sentido 5´a 3´ (Fig. 2 y 3).

+ Observe que la Primasa polimeriza NTP a partir de un ADN molde, sin necesidad de cebador.

2.4 Síntesis de ADN • La polimerización de dNTP catalizada por la ADN pol está dirigida por una hebra molde de ADN, según los apareamientos de Watson y Crick: A-T y C-G. En la figura 4 se muestra la adición de un dNTP a una hebra creciente de ADN, frente a la hebra molde.

Okasaki (Fig. 3 y 5), que en procariotas tienen entre 100 y 400 pb y en eucariotas entre 1000 y 2000 pb. • Los cebadores son eliminados y sustituidos por ADN por la ADN pol I, que hidroliza al ARN: cada ribonucleótido es removido es sustituido por un desoxi ribonucleótido (Fig. 4). • Cuando se sustituye el ARN por ADN quedan uno tras otro dos fragmentos nuevos de ADN, que la enzima Ligasa une a través de un enlace 5´- 3´ (Fig. 3 y 5).

• En eucariotas hay varias ADN pol. Los tipos I y III están relacionadas a la duplicación del ADN cromosómico. La ADN pol II participa en la reparación del ADN y la ADN pol IV en la síntesis de ADN mitocondrial. • La velocidad de duplicación del ADN es del orden 50 nucleótidos por segundo en eucariotas y hasta 1000 nucleótidos por segundo en procariotas. • La ADN pol I tiene una velocidad baja, de unos 10 - 20 nucleótidos por segundo y se suelta después de polimerizar menos de 30 nucleótidos, lo que enlentece el proceso. En esta enzima la procesividad, que hace referencia a la cantidad de nucleótidos que polimeriza sin desprenderse del molde, es baja. • El ADN molde se lee desde el extremo 3´al 5´en cada hebra. Como estas son antiparalelas, una crece en el mismo sentido en el que se abre la doble hebra y la otra lo hace en sentido opuesto (Fig. 3). Esto lleva a que la hebra que se sintetiza en el mismo sentido en que se abre el ADN se haga de manera continua. La hebra que va en sentido opuesto debe sintetizarse en fragmentos, a medida que la doble hebra se abre y se genera una región de hebra simple para ser leída. • Los fragmentos compuestos por ARN cebador seguido de ADN se denominan fragmentos de

Figura 4. Incorporación de un dNTP al extremo 3´ -OH de una cadena en crecimiento. La ADN pol tiene como sustrato a los dNTP y la dirección en que se lee la hebra molde es de 3´a 5´.

+ Observe que: • El ADN se sintetiza por acción de las ADN pol, que catalizan la condensación de dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y la ARN pol que cataliza la condensación de NTP (ATP, CTP, GTP y UTP) para formar el cebador. • Debido a la complementariedad de bases, las moléculas de ADN hijas son iguales a la madre, de manera que la información genética es la misma: esto constituye la base de la herencia.

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3. Las ADN pol I y III tienen capacidad de corregir errores Las distintas macromoléculas que forman parte de las células sufren cambios en su estructura química por acción de diferentes agentes que las modifican, o como consecuencia de su propia inestabilidad. Las moléculas dañadas son reemplazadas por nuevas, lo que evita los problemas funcionales que pueden derivar del daño. En el caso del ADN esto es diferente, porque este debe conservar la información de manera estable para transmitirla de célula a célula. Esto se logra a través de un mecanismo de síntesis preciso en sí mismo y que cuenta con enzimas ADN pol capaces de corregir errores “de copia”. • La incorporación de un nucleótido incorrecto en la nueva hebra de ADN ocurre a razón de uno cada 104-105 nucleótidos incorporados. Sin embargo como las ADN pol I y III corrigen errores, al finalizar la duplicación sólo queda un nucleótido incorrecto cada 109-1010 incorporados. • Las ADN pol I y III tienen actividad exonucleasa 3´a 5´, que consiste en hidrolizar varios nucleótidos hacia el extremo 5´ de la hebra nueva. Esto es equivalente a “ir hacia atrás” respecto a la síntesis. • En la figura 5 se representa el mecanismo de corrección de un error durante la duplicación. Como las bases no se aparean correctamente el nucleótido queda separado de la base de la otra hebra, que no es la complementaria. La subunidad ε de la ADN pol III hidroliza en sentido 3´a 5´ y vuelve a polimerizar dNTP sobre el ADN molde, corrigiendo así el error.

Figura 5. Actividad correctora de la ADN pol. A. La flecha indica el sentido de avance de la polimerasa. B. Cuando ocurre un error, la subunidad ε de la ADN pol con actividad exonucleasa 3´ a 5´ hidroliza varios nucléotidos “hacia atrás” (5´).

+ Observe que la capacidad de las ADN pol de corregir errores durante la duplicación asegura que las hebras de ADN duplicado sean iguales a las madres.

Al finalizar la preparación del tema será capaz de: 1. Explicar el concepto de duplicación semiconservativa. 2. Relacionar la duplicación del ADN con la multiplicación celular. 3. Describir la síntesis de ADN a partir de la hebra continua y discontinua. 4. Reconocer la importancia de la capacidad de corregir errores de las ADN pol.