Freemartinismo Em Bovinos 94r3u

ARTIGO DE REVISÃO

R E V I S TA P O R T U G U E S A DE

CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

Freemartinismo em bovinos: revisão de literatura Freemartins in cattle: a review Jaci de Almeida1, Osvaldo A. Resende2 1 Centro Universitário de Barra Mansa (UBM) Rua vereador Pinho de carvalho, 267, Barra Mansa, RJ, Brasil, CEP 27330-550 2 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA/Agrobiologia – Seropédica) Rodovia BR 465 km 7, Seropédica, RJ, Brasil, CEP 23890-000

Resumo: O freemartinismo é a mais freqüente forma de intersexualidade encontrada nos bovinos, sendo resultante da anastomose dos vasos sanguíneos placentários, que conduzem a uma circulação comum entre os embriões, permitindo que a diferenciação sexual do macho, anterior a da fêmea, interfira com o desenvolvimento normal do trato reprodutivo desta. As fêmeas freemartin podem apresentar clitóris hipertrofiado, presença de pêlos longos na vulva, vagina mais curta, em fundo cego, sendo em algumas regiões do Brasil chamada de vaca "maninha", apresentando características de machos (pescoço e espáduas musculosos), ausência de cérvix, ovários poucos desenvolvidos ou ausentes, pouco desenvolvimento do sistema mamário, vestígios de gônadas masculinas e hipoplasia dos ductos de Muller, sendo considerada infértil (em mais de 90% das ocorrências). Assim, esta síndrome é fator limitante tanto para o sistema reprodutivo, quanto para o produtivo em ambos os sexos, pois causa prejuízos econômicos para os pecuaristas. Considerando a importância desta patologia, bem como a falta de informações sobre a situação atual da mesma, esta revisão foi realizada com o objetivo de obter dados sobre a prevalência, incidência, sintomatologia, sinais clínicos, métodos de diagnóstico, que possibilitem esclarecer dúvidas dos proprietários e profissionais de campo. Palavras-chave: Avaliação clínica, Freemartin, bovinos Summary: Freemartins are the most frequent form of intersexuality found in cattle, and results from the anastomosis of placental vessels, leading to a common circulation between embryos, allowing the male sexual differentiation, prior to the female's, to interfere with the normal development of her reproductive tract. Freemartin females may have hypertrophied clitoris, presence of long hairs on the vulva, shorter and blind vagina, presenting characteristics of males (muscular neck and shoulders), absence of cervix, atrophied or absent ovaries, undeveloped mammary system, traces of male gonads and Mullerian duct hypoplasia, being considered infertile (more than 90% of the cases). Thus, this syndrome is a limiting factor for both the reproductive system and for production, because it causes economic losses for cattle farmers. Considering the importance of this disease, and the lack of information about its current state, this review was undertaken in order to obtain data on the prevalence, incidence, symptoms, clinical signs and diagnostic methods enabling clarify questions from owners and professionals about freemartism. *Correspondência: [email protected] Tel: +(55) 21 2682 1049

Keywords: Clinical evaluation, Freemartin, cattle

Introdução O termo freemartin é utilizado para designar uma vaca ou novilha estéril, mas por extensão, aplica-se a uma fêmea concebida em uma gestação múltipla heterossexual. Como consequência desta gestação, em mais de 90% das ocasiões, se estabelece uma anastomose vascular coriônica entre as placentas dos fetos gêmeos por volta dos 30 aos 40 dias de gestação, ocorrendo antes do dimorfismo sexual. Isto origina uma circulação fetal comum de células (quimerismo hematopoiético) e substâncias plasmáticas como hormônios (Ayala-Valdovinos et al., 2000), levando a fêmea a um estado intersexual onde os genitais externos preferencialmente são femininos na aparência e o grau de afecção dos genitais internos é muito variavel, tendo como características a hipoplasia gonadal, regressão dos condutos de Müller, masculinização das glândulas e estimulação dos condutos de Wolff (Tran, 1977). O freemartinismo não pode ser prevenido, porém, pode ser diagnosticado por vários métodos, que variam desde exames simples das membranas da placenta até a avaliação do cariótipo. Em alguns casos, o gêmeo masculino pode ter sido abortado em uma fase inicial da gestação (antes do quadragésimo dia de gestação). Neste caso, não haverá nenhuma evidência de freemartinismo. Muitos pecuaristas criam normalmente as fêmeas nascidas da gestação de gêmeos de sexos diferentes, justamente por não saber que a maioria das fêmeas nascidas nestes casos é estéril. Considerando a importância desta patologia, bem como a falta de informações sobre a situação atual, a presente revisão foi desenvolvida com o objetivo de obter informações sobre os aspectos de prevalência, incidência, etiologia, sintomatologia e diagnóstico, possibilitando esclarecer dúvidas existentes, reduzindo os prejuízos econômicos na pecuária de corte e leite. 133

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Revisão bibliográfica O termo freemartismo diz respeito a uma forma de intersexualidade conhecida há séculos, sendo primeira descrição anatômica documentada no final do século XVIII (Hafez e Hafez, 2004). A ocorrência de anormalidades na diferenciação sexual tem sido descrita em muitas outras espécies, tais como eqüinos, ovinos, suínos e humanos (Basrur et al., 1970; Campbell, 2004; Grunert et al., 2005; Payan-Carreira et al., 2008). Segundo Nascimento e Santos (2003) há três aspectos para a diferenciação sexual no desenvolvimento embrionário e fetal: sexo cromossômico, sexo gonadal e sexo fenotípico. Aberrações na diferenciação podem ocorrer em qualquer desses três estágios, levando ao que é conhecido como intersexualidade. No entanto, o sexo cromossômico é determinado no momento da fertilização, quando o oócito X é fertilizado por um espermatozóide que possui o cromossomo X ou Y (ZentenoRuiz et al., 2001). Na seqüência é determinado o sexo gonadal, no qual o gene SRY (Sex Determining Region in chromosome Y), localizado no cromossomo Y, é responsável pela diferenciação da gônada masculina. Se o indivíduo é do sexo genético XX e não possui o gene SRY, a gônada se diferencia em ovário. Já o sexo fenotípico se desenvolve de forma ativa no macho, estimulado pela testosterona produzida pelas gônadas diferenciadas (Nascimento e Santos, 2003). Na ausência dos hormônios masculinos, ou se os tecidos não respondem a eles, a tendência iva é de diferenciação em genitália externa feminina. A disposição natural é que qualquer feto desenvolva uma genitália externa e conformação corporal femininas na ausência dos efeitos masculinizantes dos andrógenos (Howden, 2004). Grunert et al. (2005) afirmam que a intersexualidade, no entanto, é considerada uma alteração no desenvolvimento orgânico do animal, que se contrapõe às características determinadas pelo sexo genético (cromossômico), levando o mesmo indivíduo a apresentar características marcantes dos dois sexos. Por outro lado, outras alterações do desenvolvimento do aparelho reprodutor ocorrem durante a vida embrionária e podem ser decorrentes de malformações das estruturas primitivas do aparelho reprodutor, as quais se desenvolvem ou sofrem regressão. Segundo Ayala-Valdovinos et al. (2000, 2011), a síndrome freemartinismo não é herdável, ao contrário da propensão em gerar gêmeos, cuja incidência varia entre as raças bovinas (Simental 2,4 a 4,6%, Holstein Friesian 0,5 a 4,2% e Charolesa 2,5 a 3,2%), sendo a maioria dos partos gemelares dizigóticos (gêmeos não idênticos) e somente 2 a 10% monozigóticos (gêmeos idênticos). Por outro lado, Marcum (1974), avaliando 22949 partos em gado Zebu, encontrou somente 50 (0,22%) nascimentos de gêmeos. Segundo o autor, os partos gemelares são menos freqüentes nas raças zebuínas (B. taurus indicus) que em gado de origem 134

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européia (B. taurus taurus). Grunert et al. (2005) afirmam ser a freqüência de partos gemelares em bovinos de 0,3 a 0,9% ao ano, dos quais 95% são dizigotos, destes 45% são heterossexuais e potenciais geradores de animais freemartin. Já Potter e Blackshaw (1980) afirmam que a freqüência da "Sindrome Freemartin" é estimada em 92% dos partos gemelares heterossexuais (macho x fêmea) de bovinos. Esta síndrome também pode ser observada em nascimento singular de fêmea, devido à morte fetal precoce e reabsorção do gêmeo macho no útero depois do estabelecimento da anastomose vascular. Entretanto, Smith et al. (1977) relataram um caso de uma novilha fértil nascida gêmea de um macho, com a comunicação vascular entre os gêmeos ocorrida no útero, como evidenciado pela presença de XX e XY células no sangue, sendo que a fertilidade da novilha quimérica pode ser atribuível ao estabelecimento de anastomoses vasculares das membranas fetais após o período crítico na diferenciação gonadal no feto fêmea. Também têm sido descritos nascimentos de novilhas subférteis, em grupos e simples, com o trato reprodutivo interno normal, das quais algumas eram quimeras XX/XY (Wijeratne et al., 1977).

Fisiologia do freemartinismo Para que ocorra o freemartismo em bovinos, são indispensáveis algumas condições. Primeiro que haja liberação de dois oócitos, sendo um deles fecundado por espermatozóide X e o outro fecundado por espermatozóide Y, gerando gêmeos dizigóticos; segundo a implantação de heterosexos (XX e XY) no útero; e por último que se produza fusão placentária durante a gestação precoce, levando a anastomose de vasos sanguíneos cório-alantóideos, entre os embriões (Figura 1), culminando com a modificação na organogênese feminina (Grunert et al., 2005). Ainda segundo Grunert et al. (2005), a anastomose dos vasos cório-alantóideos e a fusão da circulação

Figura 1 - Anastomose vascular placentária de fetos bovinos. Fonte: Robert A. Foster, Departamento de Patologia, Faculdade de Veterinária de Ontario, Universidade de Guelph – Apud. AyalaValdovinos et al. (2011).

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das membranas fetais permitem o intercâmbio de várias substâncias, mas principalmente de andrógenos de origem testicular, de células (hemácias e leucócitos) e do TDF (fator de diferenciação testicular). Pela agem de células XX e XY há possibilidade do aparecimento de quimeras cromossômicas (XX/XY) e pela agem de substâncias ou hormônios inibidores da evolução e diferenciação dos ductos de Müller (fator inibidor dos ductos de Müller - MIF), produzidas pelas células de Sertoli, como também pela agem do fator de diferenciação testicular (TDF), também inibidor do desenvolvimento diferenciação dos dutos de Müller (Grunert et al., 2005). Já a modificação na organogênese do sistema genital da fêmea, deve-se ao desenvolvimento mais precoce dos testículos relativamente aos ovários. A testosterona produzida pelas células de Leydig, da gônada do feto macho, sob ação da enzima 5 α-redutase, transforma-se em dihidrotestosterona, responsável pelo desenvolvimento da genitália externa. As outras subs-tâncias já mencionadas (fator inibidor dos ductos de Müller e fator de diferenciação testicular) inibirão a evolução dos órgãos originários do paramesonefro (ductos de Müller), ovidutos, útero, cérvix e vagina (Marcum, 1974).

Etiologia A etiologia do freemartin foi originalmente descrita por Keller e Tandler (1916) e Lillie (1916; 1917) apud (Grunert et al., 2005). Os nascimentos gemelares são naturalmente pouco freqüentes, segundo Grunert e Birgel (1982), sendo resultado de dois mecanismos diferentes: os heterozigóticos oriundos de dois ovócitos no mesmo estro e fecundados por dois espermatozóides diferentes, variando sua freqüência segundo as raças (Menissier e Frebling, 1974); e os monozigóticos, que são produtos de divisão natural de um embrião. Na vaca, a gestação gemelar se desenvolve normalmente até o parto, sendo que o índice de nascimento normal pode ar dos 20% (Derivaux e Ectors, 1984). Várias teorias constituíram a base do conhecimento do freemartinismo. Na teoria hormonal, destacam-se as trocas recíprocas de componentes celulares e humorais do sangue, pela fusão da circulação sanguínea, conseqüente à anastomose dos vasos das membranas cório-alantoidianas de fetos heterossexuais. Sugere-se que o MIF, hormônio produzido pelas células de Sertoli, seja o principal responsável pelo freemartinismo, juntamente com a testosterona produzida pelas células de Leydig (Brace et al., 2008). Nos estágios iniciais do desenvolvimento dos mamíferos, os fetos de ambos os sexos apresentam dois pares de ductos: mesonéfricos ou de Wolff e os paramesonéfricos ou de Müller. No macho, os ductos de Wolff se desenvolvem em epidídimo, vasos defe-

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rentes e glândulas vesiculares sob a influência de andrógenos testiculares, e nas fêmeas, os ductos de Müller resultam no desenvolvimento do útero, das tubas uterinas, da cérvix e da vagina anterior (Rey et al., 2003). O MIF produzido pelos testículos do macho bloqueia o desenvolvimento dos ductos de Müller na fêmea de gêmeos heterossexuais (Cabianca et al., 2007), causando anomalias no trato reprodutivo. Além disso, as gônadas do indivíduo freemartin altamente masculinizado parecem também produzir MIF em alguns casos, mantendo altas concentrações desse hormônio no plasma sanguíneo (Rota et al., 2002). Ainda não está claro quando a produção de MIF pelo freemartin se inicia e qual a concentração sérica desse hormônio que influencia a organogênese do trato reprodutivo durante a vida fetal (Cabianca et al., 2007). Na teoria celular, fala-se da anastomose dos vasos cório-alantóideos ocorrerem antes da migração dos gonócitos para a crista genital do embrião, havendo a possibilidade de eles arem do macho para a fêmea. Sendo que a presença de células XY na crista genital primitiva do embrião fêmea determinaria o freemartinismo (Ohno et al., 1962). Ohno (1962) descreve a teoria do antígeno H-Y (presente na membrana de espermatozóides portadores de cromossomo Y), baseando-se no fato do desenvolvimento dos órgãos do sistema genital masculino depender da presença do cromossomo Y no blastema gonadal, pois seus genes codificariam o antígeno H-Y (Ag H-Y). Segundo o autor, esse antígeno dissemina-se pela fusão da circulação sanguínea, ocupando receptores específicos da membrana das células XX da gônada feminina, sendo responsável pela produção do quimerismo XX/XY. Estes aparecem em alto número no sistema hematopoiético desde os estágios iniciais da vida fetal (Niku et al., 2007). As quimeras sanguíneas, como também são chamados os gêmeos bovinos heterossexuais (Niku et al., 2007), apresentam duas ou mais populações de células geneticamente distintas derivadas de mais de um zigoto em um único indivíduo (Hafez e Hafez, 2004). Segundo Iannuzzi et al. (2005) é importante ressaltar que uma quimera sanguínea é totalmente diferente de uma quimera celular, porque são independentes. Portanto, podem acontecer isoladamente ou não. O quimerismo celular ocorre no início da divisão celular, durante a metáfase. Já o quimerismo sanguíneo ou freemartinismo, o de interesse nesta revisão, ocorre entre a segunda e terceira semana de vida embrionária. Já a teoria do TDF, abordada por Grunert et al. (2005), estabeleceu que o gene SRY, presente no cromossomo Y, produz o fator responsável pela diferenciação do blastema gonadal, transformando a gônada indiferenciada em testículo. Como o desenvolvimento das gônadas do feto macho é mais precoce do que o observado na fêmea, há possibilidade que as 135

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transferências e as ações do gene SRY e do TDF sejam responsáveis pela alteração do desenvolvimento do sistema genital do feto feminino, caracterizando a hipoplasia de alguns órgãos e masculinização de outros.

Sinais clínicos do freemartinismo bovino O quadro clínico do freemartismo adulto caracteriza-se inicialmente segundo Grunert et al. (2005), por alterações da constituição, que torna-se masculinizada (maior desenvolvimento das porções craniais do organismo, como pescoço curto e grosso, cabeça pesada e tórax mais desenvolvido), semelhante àqueles típicos de machos (animal freemartin montando outras fêmeas), bom estado de carne, com maior massa muscular e acúmulo de gordura. A troca de sangue entre os gêmeos bovinos heterossexuais resulta em vários níveis de masculinização do trato reprodutivo da fêmea (Padula, 2005). Grunert et al. (2005) apresentam, ainda como sinais clínicos, a vulva pequena com pêlos longos na comissura ventral (Figura 2), possibilidade da formação de pseudoprepúcio, hipertrofia do clitóris nos casos máximos de masculinização. Também pode ser observado em

freemartin, o desenvolvimento de uma formação hiperplásica na vagina (Figura 3). Não se deve esquecer que o macho quimérico proveniente de parto gemelar heterossexual apresenta diminuição da fertilidade e uma menor concentração e motilidade espermáticas, o que tem sido relacionado com a diminuição da atividade dos túbulos seminíferos, causada possivelmente por transmissão da linhagem de células germinativas XX provenientes de sua irmã gêmea (Rejduch et al., 2000). No entanto, Padula (2005) afirma que o feto macho desenvolve-se normalmente e sua fertilidade pode não ser afetada.

Alterações anátomo-patológicas As alterações anátomo-patológicas, macro e microscópicas, caracterizam no freemartismo a masculinização do aparelho genital, apresentando as seguintes características: ovários de tamanho pequeno ou constituem-se verdadeiros cordões, assemelhando-se aos túbulos seminíferos e, nos graus extremos de masculinização, transformam-se em um resquício de gônada masculina, com epidídimos e canais deferentes atrofiados. Excepcionalmente, essas gônadas podem ter uma situação extra inguinal e subcutânea, sendo então a formação de ovariotestis (Grunert et al., 2005). Nos demais constituintes do aparelho reprodutor pode-se observar clitóris hipertrofiado, presença de pêlos longos na vulva, vagina mais curta, em fundo cego, ausência de cérvix, vestígios de gônadas masculinas e hipoplasia dos ductos de Müller (Brace et al., 2008). Já o sistema de condutos de Wolff estimulado, caracteriza-se pela presença do epidídimo, plexo pampiniforme, condutos deferentes, ampolas e glândulas vesiculares hipoplásicas (Grunert et al., 2005).

Diagnóstico Figura 2 - Bezerra freemartin com vulva pequena e pêlos longos na comissura ventral.

A detecção precoce de fêmea freemartin é importante para o manejo do rebanho, principalmente quando se trata de animais de produção, onde a alta incidência de infertilidade acarreta sérios problemas econômicos. Para Grunert et al. (2005), o diagnóstico do freemartismo baseia-se na demonstração da ambivalência sexual e ocorrência do quimerismo XX/XY. Existem várias técnicas tradicionalmente empregadas para o diagnóstico de freemartismo, entre elas citam-se:

Ultrassonografia e sexagem fetal

Figura 3 - Formação hiperplásica na vagina em bezerra freemartin.

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Nos bovinos, o exame é realizado pelo método bidimensional de imagem ultrassonográfica em tempo real (Modo-B), por via retal, utilizando sonda transdutora múltipla, emissora de sinais sonoros de alta

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freqüência ou ultrassom, propagados pelos tecidos. Estes sinais refletem-se como ecos sendo captados pelo transdutor e convertidos em imagem em duas dimensões, exibidas no monitor. A intensidade de retorno produz vários graus de brilho e variam conforme a natureza da estrutura tissular gerando as imagens (Hansen e Delsaux, 1987). Segundo Rajamahendran et al. (1994), o transdutor de baixa freqüência produz grande penetração tecidual com pouca resolução e o de alta freqüência tem menor incidência e melhor definição. O exame de órgãos reprodutivos de bovinos e visualização fetal é normalmente realizado com sondas de 5 MHz. Muller e Wittkowski (1986) foram os primeiros pesquisadores a visualizarem por ultrassonografia, características sexuais fetais em bovinos. Basearam-se no desenvolvimento do escroto no macho e da glândula mamária na fêmea. Estes parâmetros permitiram a determinação sexual em 94% dos casos examinados, entre os dias 70 e 120 de gestação. Segundo Beal et al. (1992), o sexo pode ser diagnosticado com acurácia aos 60 dias de prenhez. A evidenciação do macho é mais facilitada pela presença da bolsa testicular. O tubérculo genital, em bovinos, é a estrutura embrionária que dará origem ao pênis no macho e ao clitóris na fêmea, descrito ultrassonograficamente, como estrutura dupla de lóbulos ovalados, hiperecogênica, em ambos os sexos (Curran, 1992; Stroud, 1996). A sua localização relativa constitui outro método para a sexagem fetal, pois, migra da sua posição inicial, na região inguinal (entre os membros pélvicos), para próximo do úraco (ventralmente) no macho (Figura 4) e para a região do períneo, próximo a inserção da cauda na fêmea (Figura 5), de acordo com Beal et al. (1992) e Curran (1992). O período ideal para diagnóstico é entre 55 e 60 (Curran e Ginther, 1991), 59 e 68 (Curran, 1992), 55 e 70 para vacas grandes ou idosas e entre 60 e 80 dias de gestação para raças pequenas ou vacas novas (Beal et al., 1992). O diagnóstico pode ser impreciso ou impossível de ser realizado antes dos 60 ou após os 100 dias de prenhez (Rajamahendran et al., 1994; Stroud, 1996). Segundo Curran (1992), a acurácia é de 100 % quando se obtém uma boa imagem das estruturas, o que ocorre em 67 % das sexagens a campo. A determinação do sexo apresenta-se trabalhosa após 70 dias de prenhez em bovinos, pois o feto torna-se grande e o corno grávido poderá projetar-se precocemente para a cavidade abdominal, principalmente em raças de grande porte e vacas idosas, dificultando o posicionamento do transdutor. A identificação fica prejudicada sem a retração do útero, que somado a manipulação com a sonda poderia comprometer a gestação (Beal et al., 1992). No exame clínico reprodutivo a ultra-sonografia tem sido largamente usada comercialmente no Brasil,

Figura 4 - Sexagem fetal de um macho bovino através da ultrassonografia

Figura 5 - Sexagem fetal de uma fêmea bovina através da ultrassonografia

para diagnóstico de gestação e sexagem fetal, nos programas de IATF. Na maioria dos casos as gestações gemelares são diagnosticadas, e na bovinocultura leiteira a sexagem de gêmeos é vantajosa, uma vez que permite a interrupção seletiva de gestações não desejadas, como as que envolvem fetos macho e fêmea, originando freemartin (Rajamahendran et al., 1994).

Exame clínico Alguns sinais clínicos são característicos dos órgãos genitais de animais freemartin. No entanto, outras vezes, a aparência dos órgãos genitais externos de uma bezerra recém-nascida é normal. Assim, a anamnese somada ao exame físico no recém-nascido e novilhas, permite identificar o animal portador de freemartismo. O exame físico dos recém-nascidos e animais jovens, nos quais não há possibilidade de realizar a palpação retal, faz-se mediante a introdução de um tubo de ensaio (150x10 mm) no vestíbulo vaginal. A vagina de uma bezerra sadia, permite uma penetração com uma variação de 12 a 14 cm (Figura 6) e, no 137

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freemartin, consegue-se introduzir apenas 4 a 5 cm do tubo (Figura 7). Na inspeção por vaginoscopia nos animais intersexuados, evidencia-se o fundo cego cranial da vagina e a ausência do óstio vaginal do cérvix. Na palpação em freemartin adulto, permite-se a detecção de gônada indiferenciada e de tamanho reduzido, a ausência das trompas uterinas, agenesia ou hipoplasia do corpo e cornos uterinos, percepção de segmentos tubulares (condutos de Müller e de Wolff) e glândulas vesiculares rudimentares (Grunert et al., 2005). Além disso, o animal adulto apresenta inicialmente um histórico de falha reprodutiva, com ausência de comportamento estral ou falha na concepção na presença do macho (Padula, 2005). Peretti et al. (2008) afirmam que em mais de 80% dos casos, os animais normais e freemartin podem ser diferenciados com base nos achados de um exame clínico mediante palpação retal.

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eritrócitos procedentes de dois tipos de células precursoras, cada uma com diferentes antígenos de superfície. Este intercâmbio sanguíneo durante o desenvolvimento embrionário precoce gera tolerância imunológica (James e Dove, 1996). Entretanto, não há produção de anticorpos contra as células do irmão gêmeo, seus antígenos de superfície podem ser detectados por provas hemolíticas utilizando marcadores de grupos sanguíneos específicos. Estas provas, porém, só podem ser realizadas depois que os portadores atingirem um mês de idade, pois a maturação antigênica de glóbulos vermelhos até este momento pode não estar completa (Long, 1979). Análises citogenética, molecular e de FISH (fluorescente in situ hibridização)

Este método de diagnóstico, apesar de pouco utilizado, é possível devido à anastomose vascular ocorrida entre os gêmeos, havendo populações de

Segundo Padula (2005) e Brace et al. (2008), o diagnóstico citogenético para o freemartinismo normalmente é realizado por meio da cariotipagem de linfócitos periféricos e outros tecidos ou por estudos de PCR (reação em cadeia da polimerase). A alteração é identificada pela presença de ambos os pares de cromossomos sexuais "XX/XY" (Camargo e Robayo, 2005). A avaliação citogenética pela cariotipagem dos linfócitos permite a detecção de quimerismo XX/XY, com 93% de segurança no diagnóstico do freemartismo dos bovinos (Grunert et al., 2005). A PCR é indubitavelmente a técnica mais sensível para a detecção de quimerismo, quando comparada à cariotipagem (Padula, 2005), pois permite que a seqüência específica do cromossomo Y seja detectada de forma rápida e fácil (Satoh et al., 1997). Existem outras técnicas que são utilizadas para diagnóstico do freemartinismo, como FISH, análise de grupo sanguíneo, além de técnicas mais simples, que podem ser realizadas a campo, como tratamentos com gonadotrofinas e outros hormônios (Padula, 2005). A importância da realização dessas análises citogenéticas está no fato de que só assim é possível fazer o diagnóstico diferencial para outras intersexualidades

Figura 6 - Teste do tubo de ensaio em bezerra sadia com vagina de 12 a 14 cm

Figura 7 - Teste do tubo de ensaio em bezerra freemartin com vagina de 4 a 5 cm

Prova de tolerância a homo-enxerto Quando existe anastomose vascular entre os gêmeos em uma gestação heterossexual, estes tendem a trocar células sanguíneas (quimerismo hematopoiético). Neste caso de parto gemelar entre macho e fêmea nos bovinos, este quimerismo permite o diagnóstico do freemartismo da fêmea, já que ambos apresentam os mesmos antígenos de superfície, e portanto, serão altamente tolerantes ao transplante de pele dos cogêmeos. Entretanto, a prova de tolerância a homo-enxerto é complicada, pois nem sempre o gêmeo do sexo masculino esta disponível para a prova de laboratório (Ayala-Valdovinos et al, 2000).

Prova sorológica

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que apresentam as mesmas características clínicas, como, por exemplo, o intersexo diplóide/triplóide "XX/XXY" (Meinecke et al., 2007). O diagnóstico precoce desta alteração evita que animais sejam criados até a puberdade para que, apenas neste momento, seja percebida a esterilidade (Kanagawa e Basrur, 1968).

Diagnóstico diferencial Grunert et al. (2005) referem que em algumas situações é necessário fazer o diagnóstico diferencial entre freemartinismo e hipoplasia grave ou aplasia dos ductos paramesonéfricos, pois, no freemartin, observa-se a constante presença das glândulas vesiculares, o que não ocorre nos casos de aplasia ou hipoplasia. Ainda segundo o autor, a diferenciação será perfeita quando se associa o exame clínico à determinação do cariótipo do animal ou quando é realizada a avaliação do DNA genômico dos cromossomos sexuais.

Prognóstico O prognóstico em relação à vida do freemartin é bom, pois os animais se desenvolvem, adequadamente, e podem ser utilizados quando for conveniente para produção de carne de vitela ou submetido a sistema de engorda (Grunert et al., 2005). No tocante a função reprodutiva, o prognóstico é mau, pois esses animais são estéreis (Jainudeen e Hafez, 2004; Iannuzzi et al., 2005; Di Meo et al., 2008). Na literatura existem poucos relatos de vacas férteis cogemelares com um macho e com quimerismo de cromossomos sexuais (Eldridge e Blazak, 1977; Smith et al., 1977). Segundo Smith et al. (1977) há possibilidade de que a anastomose vascular e a conseqüente agem de células sanguíneas, entre os gêmeos heterossexuais bovinos, culminem com um quimerismo hematopoiético, mas não resulte invariavelmente em esterilidade da bezerra, já que a futura gônada feminina pode ser sensível ao efeito de virilização por um curto período durante a gestação, sendo que em alguns casos a anastomose das membranas fetais poderia ocorrer depois da migração das células germinais e provavelmente depois do período crítico de diferenciação do ovário fetal. No tocante ao valor pecuniário, Grunert et al. (2005) ressaltam que os freemartins são animais extremamente desvalorizados comercialmente, sendo que na venda não retornariam ao criador, nem o valor do peso do animal em carne e, assim, o prognóstico é ruim.

Tratamento Não existe qualquer possibilidade de tratamento curativo, sendo recomendável que os animais sejam eliminados (Basrur e Basrur, 2004; Grunert et al., 2005).

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Freemartinismo citado na literatura Em trabalho avaliando 134 búfalos de rio (13 touros jovens, 119 fêmeas de com problemas reprodutivos e dois machos gêmeos), através de exames clínicos e citogenéticos, Di Meo et al. (2008) observaram que as fêmeas apresentavam conformação do corpo e genitália externa normais, porém algumas com sérios problemas nos órgãos sexuais internos. Sendo que das fêmeas e os dois machos gêmeos (121 animais), com problemas reprodutivos, 25 (20,7%) animais apresentaram cromossomos sexuais anormais e todas as fêmeas eram estéreis devido a problemas nos ductos sexuais internos. Ayala-Valdovinos et al. (2007) ao estudarem 20 fêmeas bovinas da espécie B. taurus taurus procedentes de partos múltiplos heterossexuais, identificaram 19 (95%) de bovinos freemartin através da análise citogenética e molecular (PCR), ressaltando a alta freqüência desta síndrome reportada na literatura. Dos animais estudados 15 bezerras não mostraram anormalidades externas aparentes da diferenciação sexual. Porém, três novilhas apresentaram características freemartin, como vagina curta cranialmente, cega com ausência de cérvix, uma com vulva com clitóris hipertrofiado e uma com tufo de pêlos na comissura vulvar inferior. Após sacrifício destes animais observou-se trato reprodutor hipoplásico sem gônadas diferenciadas. Um animal produto do cruzamento entre Holandês x Simental, mantido até os 18 meses de idade, apresentou anormalidades de diferenciação sexual como prepúcio não bem diferenciado com orifício externo funcional, uma estrutura peniana de implantação posterior e ventral ao ânus, e duas estruturas cutâneas representando bolsas escrotais não bem diferenciadas. Após os dezoito meses, ao ser sacrificado, observou-se na análise anatomopatológica deste animal testículos hipoplásicos intra-abdominais com epidídimo e condutos deferentes, glândulas vesiculares próstata e um pênis hipoplásico. Ao estudarem bovinos que apresentaram quimerismo sanguíneo, Niku et al. (2007) concluíram que por haver a mistura de sangue entre os fetos por volta dos 30-35 dias de gestação, a composição do sangue de ambos os gêmeos, macho e fêmea, seria a mesma. Ao aplicarem o método do Y-ISH (Y-chromosome-specific in situ hybridization), técnica extremamente específica e sensível para detecção do cromossomo Y, em fêmeas freemartin, o resultado foi positivo quando utilizada amostra de sangue e negativo quando usado qualquer outro tipo de tecido para extração de ADN, ou seja, presença e ausência do cromossomo Y, respectivamente. Portanto, o sistema hematopoiético freemartin é fortemente quimérico já a partir de fases iniciais do desenvolvimento fetal, antes mesmo do início da anastomose vascular funcional. Desta forma, em casos de quimerismo sanguíneo em animais, somente as fêmeas apresentam dois perfis genéticos. 139

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Uma pesquisa realizada por Iannuzzi et al. (2005) envolvendo 42 búfalos (40 fêmeas e dois machos gêmeos de fêmeas) de rio fenotipicamente com problemas reprodutivos, encontrou-se 10 animais freemartin (oito fêmeas e dois machos). Os dois machos apresentaram conformação de corpo e pênis normais, mas um deles desenvolveu significante redução de um dos testículos. Entre as oito fêmeas, seis apresentaram a formação do corpo, vagina e clitóris normais e as outras duas mostraram o trato genital de conformação de macho (pélvis fechada), apresentando fenótipo de macho. Outras observações clínicas foram: ovários pequenos ou não detectáveis, atrofia dos ductos de Müller e dos canais internos da vagina e vagina fechada com ausência dos canais internos. Os autores concluíram que todas as fêmeas freemartin eram estéreis e que, ao serem descartadas, obteriam economia de tempo e dinheiro nas propriedades. Rejduch et al. (2000) trabalhando com touros, encontraram dois animais nascidos de gestações gemelares que apresentaram espermatogônias, indicando a presença de quimerismo XY/XX. Sendo que a freqüência de espermatogônias XX nos testículos dos touros avaliados não mostrou correlação com o número de células XX no sangue. O volume do ejaculado não foi afetado, enquanto a concentração e motilidade espermáticas foram menores, quando comparados a touros com cariótipo normal. Com esta evidência é sugerido que as células XX nos testículos foram células germinativas primordiais da fêmea (Ohno, 1969). Esta condição, em alguns casos, está associada com mudanças na morfologia, motilidade e viabilidade dos espermatozóides e com defeitos no acrossoma ou, às vezes, com aspermia (Vieira et al., 2011). Duas hipóteses foram propostas para tentar explicar o que pode acontecer quando ocorre o intercâmbio de células primordiais entre gêmeos. A primeira delas refere que as células germinais XX nos testículos dos touros podem levar ao excesso de produção de espermatozóide X e, por conseguinte à elevação do número de filhas nascidas. A segunda hipótese seria que as células germinais XX no testículo do touro gêmeo não poderiam ser viáveis, e a sua degeneração levaria à reduzida fertilidade do touro (Long, 1979).

Conclusões Ainda existe uma grande incidência de partos gemelares dizigóticos, originando freemartinismo nos rebanhos leiteiros, que na grande maioria das vezes não são catalogados. Somados à falta de conhecimento de muitos pecuaristas, e ao maior desenvolvimento em relação às demais fêmeas do rebanho, as fêmeas freemartin comumente são mantidas nas propriedades. O problema tem aumentado principalmente em 140

fazendas que fazem o uso da aplicação de eCG (gonadotrofina coriônica eqüína) ou FSH (hormônio folículo estimulante) nos protocolos de IATF (Inseminação Artificial em Tempo Fixo) para incrementar os resultados da técnica. E mesmo havendo relato na literatura de animais provenientes de parto gemelar dizigótico, sem comprometimento no desenvolvimento, a maioria dos trabalhos atesta a infertilidade, sendo indicada a eliminação dos mesmos da reprodução. Neste contexto, o diagnóstico precoce de gestações gemelares heterossexuais, através da ultrassonografia, torna-se importante na pecuária leiteira, para evitar a criação animais inférteis, e conseqüentemente economizando alimento, mão-de-obra e maximização do espaço físico da propriedade pelo descarte de animais freemartins.

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