Dna Fingerprint 242b20

Escola Secundária Dr. Solano de Abreu Ano Lectivo: 2008/2009 Disciplina: Biologia e Geologia

Joana Braga Gomes Tavares, nº7 do 12ºA

DNA Fingerprint Existem várias técnicas de obtenção das impressões digitais genéticas, entre as quais a de RFLP (Restriction Lenght Polymorphism), a mais utilizada, e ainda a de PCR (Polymerase Chain Reaction), que graças à alta sensibilidade e espeficidade é possível analisar um fio de cabelo com bulbo ou caspas eliminadas do couro cabeludo. A técnica de Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição baseia-se no princípio que a sequência nucleotídica da molécula de DNA é exclusiva de cada indivíduo, excepto no caso dos gémeos verdadeiros, esta técnica permite estabelecer relações de parentesco entre diferentes indivíduos. A RFLP foi desenvolvida por Alec Jeffreys na Inglaterra, no inicio dos anos 80, apesar de apresentar as suas desvantagens, os marcadores requerem grandes quantidades de DNA relativamente puro, sondas específicas de DNA e marcação por radioatividade no sistema de detecção, actualmente a RFLP tem sido vista como um meio para chegar as identidades de criminosos, apurar a paternidade de crianças e muito mais.

O Processo da técnica de RFLP Materias que podem ser colectados: Origem animal: 

Sangue;

 Secreções, como esperma;

Origem vegetal: 

Folhas;



Saliva;



Caule;



Urina;



Raiz;

 Tecidos moles;



Semente;

 Pêlos com folículos;



Pólen;



Pétalas e outros;



Caspa;



Dentes;

 Ossos e outros.

O material mais utilizado é o sangue. O DNA é retirado dos glóbulos brancos, devido aos glóbulos vermelhos humanos não possuírem núcleo.

1ºo – Extracção e purificação do DNA

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DNA Fingerprint Torna-se difícil obter o DNA de uma amostra caso esta seja escassa, esteja degradada ou ainda contaminada. O DNA é purificado através da utilização de métodos químicos (ex: fenol, chelex, etc.)

2ºo (facultativo) - Processo de PCR No caso de a amostra de DNA ser inferior ao necessário para realizar a sua análise, a reacção de polimerização em cadeia permite obter cópias de uma parte do material genético em quantidade suficiente.

3ºo – DNA é submetido a enzimas de restrição específicas Esta o baseia-se na existência de padrões repetitivos no DNA denominados de DNA minissatélites ou ainda de VNTR’s (Variable Number of Tandem Repeats). Os VNTRs exibem uma enorme variabilidade e sendo constituídos de até centenas de pares de bases repetidos sequencialmente. Por locus, cada sonda hibridiza com dois segmentos de DNA, correspondentes aos alelos materno e paterno de cada indivíduo. Os cientistas seleccionam determinadas enzimas de restrição, que dividem o DNA nestes segmentos de restrição cujas dimensões, composição em nucleótidos e localização variam muito de pessoa para pessoa e reflectem as diferenças entre os alelos dos vários loci.

4ºo – Electroforese Diferentes fragmentos de DNA movimentam-se de modo diferente quando submetidos a electroforese. Esta técnica, também denominada separação electroforética, baseia-se na migração de moléculas carregadas por aplicação de um campo eléctrico. Este processo é frequentemente usado para separar e algumas vezes purificar macromoléculas, especialmente proteínas e ácidos nucleicos, com base no seu tamanho, peso molecular, carga eléctrica ou conformação.

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A electroforece de DNA é realizada em gel de agarose. Prepara-se o gel de agarose que é imerso numa tina de electroforese com uma solução-tampão que estabelece a condução eléctrica com a fonte de alimentação. Uma vez aplicadas as amostras de DNA e o padrão de pesos moleculares nos poços, inicia-se a electroforese. A aplicação do campo eléctrico é efectuada através de 2 eléctrodos situados paralelamente à fileira de poços. Quando sujeitos a este campo eléctrico, os ácidos nucleicos migram em direcção ao pólo positivo, uma vez que apresentam carga negativa. A agarose funciona como uma rede cujos poros deixam ar mais facilmente as moléculas de menor tamanho, que vão, portanto, migrar mais do que as de maiores dimensões. A migração de um fragmento de DNA na forma circular, como um plasmídeo não digerido, é diferente da migração do mesmo plasmídeo sob a forma linear (após digestão com uma enzima de restrição). Por outro lado, moléculas com uma configuração mais compacta migram mais rapidamente do que moléculas com uma conformação

molecular

mais

distendida.

A electroforese em gel é frequentemente utilizada para estimar o tamanho de fragmentos de ácidos nucleicos. Através da comparação da distância percorrida pelos fragmentos com a percorrida por fragmentos de peso molecular conhecido (padrões de peso molecular) é possível inferir sobre o peso molecular de cada fragmento da amostra a analisar.

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5º o – método de Southern blot Desnaturação Terminada a separação electroforética, o gel deve ser tratado com uma solução alcalina (geralmente contendo hidróxido de sódio) para promover a desnaturação da dupla fita do DNA, separando-a em simples fitas.

Transferência do DNA para uma membrana Uma membrana de nitrocelulose ou nylon é posta sobre o gel. Uma pressão é aplicada uniformemente sobre o gel, ou recorrendo-se à sucção, ou pondo-se sobre a membrana uma pilha de toalhas de papel com um peso em cima. Isto leva a que o DNA e do gel para a membrana, aonde ele adere-se.

A membrana é então aquecida, no caso de ser de nitrocelulose, ou é exposta a radiação ultravioleta, no caso de a membrana ser de nylon, de modo a ligar o DNA permanentemente à membrana.

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Tratamento com a sonda A membrana é agora tratada com uma sonda hibridizadora - que é uma molécula de DNA isolada cuja sequência é conhecida e é idêntica, ou então complementar, aquela sequência a qual se quer determinar a presença ou não na amostra (como as duas fitas da dupla hélice do DNA são complementares uma a outra, tanto faz escolher uma sonda que seja idêntica ou complementar à sequência procurada). A sonda de DNA é marcada de tal forma que permita ser detectada a sua presença, essa marcação é normalmente feita incorporando-se a ela átomos radioativos ou ligando-se a ela corantes fluorescentes ou cromogênicos (substâncias incolores que produzem cor ao interagirem com um determinado meio). Essa sonda irá parear com qualquer sequência de DNA complementar a ela. Portanto se a sequencia procurada não estiver presente na amostra não haverá o pareamento. Então o excesso de sonda é lavado da membrana, e toda a sonda não hibridizada será removida. Depois disso, a presença ou não da sonda na membrana (e as posições onde ela está presente) é revelada por uma auto-radiografia em um filme de raio-x, ou pelo aparecimento de uma cor caso a marcação cromogênica tenha sido usada.

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Aplicações do DNA Fingerprint Análise forense A dactiloscopia genética é uma técnica utilizada na ciência forense onde se analisam as diferenças entre os DNA minissatélites, já referidos, provenientes de material biológico deixado num local (sangue, cabelo, esperma, etc.). A hipótese de dois indivíduos sem qualquer relação de parentesco possuírem exactamente os mesmos minissatélites é muito remota, sendo assim a dactiloscopia do DNA constitui um teste viável. Os padrões de bandas de DNA obtidos por indivíduos diferentes podem ser comparados e as diferenças são facilmente detectadas e as pessoas distinguidas. Isto permite a identificação de cadáveres e a identificação de criminosos, incluindo violadores. Contudo, na análise dos suspeitos de um crime, por exemplo, é de ter em conta se estes têm irmãos gémeos verdadeiros, uma vez que, através das impressões digitais genéticas, não se podem distinguir dois gémeos monozigóticos, pois os padrões de banda são os mesmos visto possuírem igual material genético.

Determinação de paternidade Como cada indivíduo herda a disposição dos seus nucleótidos dos seus pais, comparando os padrões de banda de um indivíduo com os dos alegados progenitores, podemse obter probabilidades de parentesco que nos levem a excluir a paternidade ou a confirmá-la com um elevado grau de certeza. Se os dois padrões forem suficientemente semelhantes (tendo em conta que só metade do DNA é herdado de cada progenitor), então a paternidade confirma-se.

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Diagnóstico de doenças Esta tecnologia pode ser usada para prever a nossa saúde futura. Pode ser utilizada para localizar os genes de doenças hereditárias. Se um padrão particular de DNA aparece repetidamente em diferentes doentes, os cientistas podem verificar qual o gene ou genes, ou pelo menos qual pedaço de DNA ou quais os pedaços de DNA, que poderão estar envolvidos. Como o conhecimento dos genes envolvidos na susceptibilidade a uma doença dá pistas sobre fisiologia subjacente à doença, o DNA fingerprinting auxilia no desenvolvimento de terapias. Também pode ser usado no período pré-natal para detectar possíveis anomalias hereditárias, como a distrofia muscular ou a doença de Huntington, de forma a que possa ser disponibilizado aconselhamento médico e possam ser adoptadas as devidas precauções.

Diagnóstico molecular É possível fazer o rastreamento de mutações não caracterizadas e ainda a análise da eficiência de transplante de medula, afim de se verificar o quimerismo. Também permite fazer o ensaio de mutações conhecidas

como o caso de

acondrosplasia, a forma mais comum de displasia, responsável pelo fenótipo que caracteriza o anão acondroplásico.

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 http://www.ufv.br/dbg/trab2002/GMOL/GMOL006.htm

 http://www.portalmedico.org.br/revista/bio2v5/odnacomounica.htm  http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel  http://www.icb.ufmg.br/big/genmed/southblot.html  http://www.biologia-ap.no.comunidades.net/index.php?pagina=1288163696

 DIAS DA SILVA, Amparo; SANTOS, Maria Ermelinda; MESQUITA, Almira Fernandes; BALDAIA; Ludovina; FÉLIX, José Mário. Terra, Universo de Vida – Biologia 12ºano PORTO: Porto Editora. Páginas 138 - 141

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