Cromatografia Bidimensional.pdf 3t3y3x

INSITITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Camacho Bravo Dulce Argelia Sección 5, 5QM2

SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS POR CORMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA INTRODUCCIÓN Cuando se desean separar los componentes de una mezcla compleja generalmente no se logra con una cromatografía unidimensional, ya que con ésta no se separarían totalmente los componentes y sería necesario realizar varios cromatogramas; esto se soluciona realizando una cromatografía bidimensional en placa. En esta técnica, se realiza el cromatograma como en el unidimensional, es decir, se coloca la mezcla a separar sobre la placa, luego de secar, ese borde del papel se sumerge en una mezcla de solventes que contiene componentes acuosos y orgánicos. Además el papel debe estar en o con los vapores del solvente en equilibrio. El solvente moja al papel por capilaridad debido a su naturaleza fibrosa. El componente acuoso del solvente se une a la celulosa del papel y forma con éste una fase estacionaria de tipo gel. El componente orgánico del solvente continúa migrando, lo que constituye la fase móvil. Las velocidades de migración de las distintas sustancias que se quieren separar están gobernadas por sus solubilidades relativas en la fase estacionaria polar y la fase móvil no polar. En un solo paso del proceso de separación cada soluto se distribuye entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente de partición, una constante de equilibrio definida como:

Por lo tanto, las moléculas se separan de acuerdo con sus polaridades, de manera que las no polares se mueven más rápido que las polares. Luego de que el solvente migró a una distancia adecuada, se retira el cromatograma del solvente y se seca. En caso de ser incoloros, los materiales separados pueden detectarse por características como su radiactividad, fluorescencia etc. o puede rociarse el cromatograma con una solución que forme un producto coloreado al reaccionar con la sustancia investigada. Pero a diferencia de la unidimensional en la cromatografía bidimensional la muestra se aplica en una esquina de la placa y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel. Luego de que el cromatograma está completo y el papel se secó, la placa se rota 90° y se realiza una cromatografía paralela al segundo borde utilizando otro sistema de solventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad característica en un sistema de solventes determinado, la segunda cromatografía debería incrementar en grado sustancial la separación de la mezcla en sus componentes.

OBJETIVOS

  

Separar los aminoácidos presentes en jugo de jitomate por cromatografía bidimensional en capa fina. Identificar los aminoácidos separados por comparación de sus valores de Rf con los de soluciones tipo de aminoácidos. Comparar el grado de resolución de la cromatografía bidimensional, con la de la unidimensional.

DIAGRAMA DE FLUJO (anexado en la siguiente página) RESULTADOS 1.- Representación esquemática de los cromatogramas.

Figura 1. Cromatograma unidimensional 1°fase

Figura 2. Cromatograma unidimensional 2°fase

Figura 3. Cromatograma bidimensional tipo

Figura 4. Cromatograma bidimensional problema

2.- Calculo de los valores de Rf Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las dos fases móviles. Aminoácido

Arginina Lisina Glicina Prolina Ác.glutámico Histidina Treonina Tirosina Metionina Fenilalanina

Frente del soluto 1.5 1.9 4.4 4.5 5.3 5.5 5.6 5.9 6.3 6.7

1° fase móvil Frente del disolvente 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7

Rf 0.19 0.24 0.57 0.58 0.68 0.71 0.72 0.76 0.81 0.87

Frente del soluto 1 0.7 2 2 2.5 0.8 2.4 4.3 4.1 4.6

2° fase móvil Frente del disolvente 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3

Rf 0.13 0.09 0.27 0.27 0.34 0.11 0.32 0.6 0.56 0.63

Tabla 2. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases móviles. No. de mancha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Frente del soluto 1.6 1.9 3.9 4.3 4.8 5.3 5.6 5.7 6 6.7

1° fase móvil Frente del disolvente 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

Rf 0.2 0.23 0.48 0.53 0.6 0.66 0.7 0.71 0.75 0.83

Frente del soluto 1.7 0.8 1.9 2.1 2.4 2.5 2.7 4.5 4.2 4.9

2° fase móvil Frente del disolvente 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3

Rf

Aminoácido correspondiente

0.23 0.11 0.26 0.28 0.32 0.34 0.37 0.62 0.57 0.67

Arginina Lisina Glicina Prolina Histidina Ác. glutámico Treonina Tirosina Metionina Fenilalanina

Tabla 3. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las dos fases móviles. No. de mancha 1 2 3 4 5 6 7

Frente del soluto 1.7 3.6 3.6 5.3 6 6.5 6.6

1° fase móvil Frente del disolvente 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9

Rf 0.21 0.45 0.45 0.67 0.75 0.82 0.83

Frente del soluto 0.9 1.8 2.5 2.5 3.3 3.9 4.7

2° fase móvil Frente del disolvente 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2

Rf 0.12 0.25 0.34 0.34 0.45 0.54 0.65

Tabla 4. Cromatograma bidimensional problema (IV) desarrollado en las 2 fases móviles. No. de mancha 1 2 3 4 5 6 7

Rf creciente en la 1° fase móvil 0.21 0.45 0.45 0.67 0.75 0.82 0.83

Rf en la 2° fase móvil

Aminoácido correspondiente

0.12 0.25 0.34 0.34 0.45 0.54 0.65

Lisina Glicina Prolina Ácido glutámico Treonina Metionina Fenilalanina

DISCUSIÓN Lo primero que se realizó después de la parte experimental, es el cálculo del Rf en los cromatogramas unidimensionales de ambas fases( Figuras 1 y 2), en los cuales el aminoácido es conocido, así que estos valores los tomamos como referencia para determinar de qué aminoácido se trata en el cromatograma bidimensional tipo ( Figura 3); al comparar las tablas 1 y 2 nos muestra que algunos valores fueron bastante cercanos y por tanto la identificación fue sencilla, tenemos por ejemplo los casos de la arginina, lisina, tirosina, metionina etc., pero si observamos el caso de la histidina, los Rf no son muy parecidos, así que este aminoácido se determinó así por descarte, esto se pudo dar por una mala preparación del cromatograma al agregar los µl de ese aminoácido, o incluso un desarrollo no adecuado, pero esta opción se descarta porque los demás valores no están tan alejados. Por otra parte, ya con nuestro cromatograma bidimensional tipo establecido pasamos a la identificación de los aminoácidos del jitomate, que fue la fruta que elegimos; en la Tabla 3 podemos observar los valores de Rf obtenidos de las manchas que se desarrollaron de la muestra en ambas fases, al comparar esta tabla con la tabla 2, podemos hacer una identificación aproximada de los aminoácidos, ya que en realidad con estos resultados no podemos decir con certeza los componentes, tal vez para esto es necesario hacer mínimo 2 réplicas de la cromatografía bidimensional o hacer otras pruebas. Entonces se comparan los valores del cromatograma bidimensional tipo y del problema, se observa que en la mayoría de los casos los valores son cercanos como por ejemplo el de la lisina que tiene un Rf 1° fase de 0.23 y de 2° fase 0.11 en la tabla tipo y en el problema 1° fase 0.21 y 2° fase 0.12, de hecho son cercanos en todos a excepción de la Prolina que son los valores más alejados 1° fase 0.53 y 2° fase 0.28 en la tabla tipo, ahora 1° fase 0.45 y 2° fase 0.34 en la tabla problema; a pesar de esto siguen siendo los valores más aproximados para prolina. Cabe destacar que los valores de la muestra van a depender del contenido de los aminoácidos del jitomate, que a su vez es dependiente de la maduración del mismo y de la especie, se sabe que durante la maduración, los aminoácidos libres totales permanecen relativamente constantes, pero la concentración de ácido glutámico, que es el predominante en el jitomate maduro aumenta, mientras el ácido glutámico disminuye; en cuanto a la serina y treonina éstos alcanzan un máximo antes de la completa madurez y los aminoácidos restantantes disminuyen. 2 Aunque estos datos no son de tanta utilidad puesto que no cuantificamos concentración de aminoácidos. CONCLUSIONES Separamos los aminoácidos del jitomate utilizando las técnicas de cromatografía unidimensional y cromatografía bidimensional en capa fina, los cuales nos proporcionan los valores de Rf que al compararlos entre sí nos permiten la identificación de los aminoácidos. Así mismo concluyo que la mejor opción tanto para la separación, como la

identificación es el método de la cromatografía bidimensional ya que tiene una mayor resolución y confiabilidad al ser desarrollado el mismo cromatograma en ambas fases. PREGUNTAS EXTRA 1.- Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo empleado como problema Aminoácido Ácido glutámico Ácido aspártico Leucina Lisina Alanina Fenilalanina Treonina

Cantidad 314 mg 113 mg 28 mg 27 mg 24 mg 22 mg 21 mg

Aminoácido Prolina Glicina Metionina Tirosina Serina

Cantidad 15mg 17 mg 7 mg 11 mg 26 mg

En nuestros resultados experimentales observamos la presencia de los siguientes aminoácidos: lisina, glicina, prolina, ác. glutámico, treonina, metionina y fenilalanina; todas éstas están presentes en el jitomate según lo reportado en la literatura, ya sea en mayor proporción como el ácido glutámico, lisina etc. o en menor como la Metionina, entre otros aminoácidos que no utilizamos en la práctica.

2.- Escriba la reacción completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminoácido.

Ninhidrina

Aminoácido

Aldehído

3.- ¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Si es posible, debido a que sea cual sea la primera, las moléculas se separan por su solubilidad de acuerdo a la mezcla de la fase móvil y en la dirección que se desarrolle el cromatograma. 4.- Indique las posibles fuentes de erro de esta técnica   

Mala preparación del cromatograma al colocar las muestras. Al desarrollar la cromatografía es importante la dirección en la que se colocará el cromatograma, sobre todo para no repetir la dirección ya desarrollada, sino no habrá una separación real de los componentes. Preparación deficiente de las fases móviles.

BIBLIOGRAFIA 1. Voet, D., Voet, J. Bioquímica, 3° edición, Editorial Médica Panamericana, 2006; págs. 150-151. 2. Nuez, F. El cultivo del tomate, Grupo Mundi Prensa, 2005, págs.. 80-82 3. http://alimentos.org.es/aminoacidos-tomate