Viroses Da Videira, Sint - Diagnose, Controle 1s5b5q

VIROSES DA VIDEIRA - SINTOMATOLOGIA

- DIAGNOSE

- COMTRÔLE

Gilmar B. Kuhn Embrapa Uva e Vinho

• Os vírus são patógenos veiculados na muda, estaca ou gema, internamente nas células e tecidos. • Na muda, estaca ou gema dificilmente se constada a presença de sintomas o que impossibilita a diagnose visual.

• As viroses não tem controle no vinhedo, portanto é imprescindível utilizar mudas ou material de propagação sadio.

DOENÇAS CAUSADAS POR VÍRUS

1- Complexo do enrolamento da folha da videira - 9 virus associados a doença

2- Complexo rugoso da videira -Intumescimento dos ramos -Caneluras em Kober 5BB -Caneluras em Rupestris du Lot -Caneluras em LN-33

DOENÇAS CAUSADAS POR VÍRUS

3- Degeneração da videira -Virus da degenerescência -Virus do mosaico do Arabis -Strawberry Latent RingSpot Virus • Na Europa -Tomato Black Ring Virus (TRBV) -Raspberry Ring Spot Virus (RRSV) -Grapevine Chrome Mosaic Birus (GCMV) -Grapevine Bulgarian Latent Virus - GBLV

4- Necrose das nervuras da videira 5- Mancha das nervuras da videira

PRINCIPAIS PROBLEMAS CAUSADOS PELOS VIRUS 1-transmissão pelo material vegetativo (mudas, est., gemas) 2-transmissão por vetores (nematoides, cochonilhas)

3-efeitos sobre a muda -diminui o enraizamento -prejudica a soldadura do enxerto 4-perdas na produção (até 80%)

5-efeito na qualidade da uva

-maturação incompleta -teor de açúcar menor (20 - 30%) 6-redução da vida útil do vinhedo (30 - 40 %)

7-morte de mudas (1 - 3 anos) 8-morte precoce de plantas adultas (6 - 8 anos) 9-efeito na qualidade do vinho

-menor teor alcoólico (15%) -menor intensidade de cor (20%)

INCIDÊNCIA DE VIRUS NOS CLONES EM SELEÇÃO EM REGIÕES DO SUL E CENTRO DA ITALIA

(2449 clones testados - 89 cvs - 274 propriedades)

Região

N° clones testados

Infectado(%)

Infecção 1 ou 2 virus até 6 virus

Sul Puglia Calabria Ischia Basilicata Campania

946 801 45 27 24

96,8 98,6 97,8 92,6 100,0

57,3 51,8 63,9 72,0 69,8

42,7 48,2 36,1 28,0 30,4

Centro Abruzzo Marche

345 261

85,2 78,5

61,4 81,6

38,8 18,4

Savino, V. et all, 2001(Situazione Sanitaria della vite in Italia Centro-Meridionale)

DOENÇA DO ENROLAMENTO DA FOLHA DA VIDEIRA AGENTE CAUSAL: Complexo de 9 virus

(GLRaV-1; GLRaV-2;.....GLRaV-9) OCORRÊNCIA: Todos os países vitícolas

Brasil ( Rs, Sc, Pr, Sp, Mg, Ba, Pe) TRANSMISSÃO NO VINHEDO:

• Cochonilha “algodonosa”.....9spp - Europa

• Cochonilha “carapaça”..........3spp - Europa

SINTOMAS DA DOENÇA DO ENROLAMENTO DA FOLHA Vitis vinifera cv. Cabernet Franc

ENROLAMENTO DA FOLHA DA VIDEIRA Vitis vinifera cv. Cabernet Franc

Sintomas no verão/outono

ENROLAMENTO DA FOLHA DA VIDEIRA

Doente

Sadia

Vitis vinifera cv. Cabernet Franc (muda de 2 anos)

ENROLAMENTO DA FOLHA DA VIDEIRA Vitis vinifera cv. Semillon

XX A

Sintoma no fim do ciclo vegetativo “Outono”

DOENÇA DO ENROLAMENTO DA FOLHA DA VIDEIRA Vitis vinifera cv. Cabernet Franc

Planta doente

Planta sadia PRIMAVERA

ENROLAMENTO DA FOLHA DA VIDEIRA Vitis vinifera cv. Cabernet Franc

Planta doente Planta sadia VERÃO (maturação da uva)

ENROLAMENTO DA FOLHA DA VIDEIRA Vitis vinifera cv. Cabernet Franc

Planta doente

Planta sadia

INVERNO (dormência)

ENROLAMENTO DA FOLHA DA VIDEIRA

V.vinifera

Vinhedo na região da serra gaucha VERÃO

ENROLAMENTO DA FOLHA Incidência em Vitis vinifera tinta no R.G.S.*

Município Bento Gonçalves

Vinhedos (nº) 9 5 5 9 1

Cultivar

Plantas Obs. c/s(%) C. Franc 7.881 96,1 Bonarda 3.850 100,0 Merlot 4.350 91,9 Barbera 7.000 99,8 Sangiovese 1.000 94,8

Garibaldi

6

C. Franc

3.830

99,5

Farroupilha

4 1

C. Franc Merlot

3.500 500

99,4 100,0

31.911

98,0

TOTAL *1979/1983

40

INCIDÊNCIA DE VÍRUS EM VINHEDOS DE SÃO PAULO KUNIYUKI & COSTA/1987 (IAC)

VIROSE

PRODUTORAS (28 CVS)a

PORTA-ENXERTOS (15 cvs.)b

Enrolamento da folha

908 (78%) 709

176 (33%) 58

Mosaico das nervuras

806 (56%) 482

188 (18%) 34

Fendilhamento cortical

781 (9,6%) 75

168 (2%) 4

a) Amostras de vinhedos comerciais e coleções do IAC b) Amostras de Estações Experimentais do IAC

INCIDÊNCIA DE VIRUS NOS CLONES EM SELEÇÃO EM REGIÕES DO SUL E CENTRO DA ITALIA (2449 clones testados - 89 cvs - 274 propriedades) Infecção(%) - teste ELISA

Região

Nº clones avaliados

total

LR-3

LR1

GVA

GVB

GFLV

GFkV

Sul Puglia Calabria Ischia Basilicata Campania

946 801 45 27 24

96,8 98,6 97,8 92,6 100,0

79,0

17,4

35,4

13,4

29,6

52,3

81,8

16,6

49,7

3,8

19,0

75,1

54,6

11,4

47,7

27,3

52,3

52,0

12,0

20,0

16,0

52,0

54,2

12,5

10,7

8,3

37,5

Centro Abruzzo Marche

345 261

85,2 78,5

57,5 17,4

46,6 63,3

60,4

49,3 1,4

14,0

Savino, V. et all, 2001(Situazione Sanitaria della vite in Italia Centro-Meridionale)

26,1

PREJUIZOS CAUSADOS PELO ENROLAMENTO DA FOLHA RIO GRANDE DO SUL (cv. Cabernet Franc ¹)

planta c/ Infecção Pl. sadia

média

forte

114

91(20%)

56(51%)

14,9(22%)

7,2(62%)

CACHOS (Nº)

PRODUÇÃO (kg/pl.) 19,2 AÇÚCAR (g/L) PODA (kg/pl.) 1- Média de 30 plantas

175,2 3,4

164,0(6,4%) 149,2(15%) 2,2(35%)

1,2(64%)

ENROLAMENTO DA FOLHA DA VIDEIRA Vitis vinifera cv. Cabernet Franc

Produção de cinco plantas

Produção de cinco plantas

Infec. média

sadia

Inf.media

Inf.forte

PREJUIZOS CAUSADOS PELO ENROLAMENTO DA FOLHA NOVA ZELÂNDIA (média 4 anos) O.Linden/1970

CULTIVAR

PRODUÇÃO (kg/planta)

MISSION

SADIA DOENTE PERDAS

BACCO 22A

SADIA 11,6 DOENTE PERDAS 42%

AÇÚCAR (ºbailling) 10,4 3,3 68% 14,3 6,7 14%

14,9 11,4 23%

12,4

PREJUIZOS CAUSADOS PELO ENROLAMENTO DA FOLHA FRANÇA (média: 4anos) Legin/1972 CULTIVAR

CHARDONNAY

PINOT NOIR

PRODUÇÃO (kg/planta) SADIA DOENTE PERDAS

1,60 0,80 51%

SADIA DOENTE PERDAS

1,26 0,49 62%

AÇÚCAR (Babo) 11,0

9,5 15% 9,6 8,6

10%

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO DA VIDEIRA

AGENTE CAUSAL: 4 virus

1-virus do intumescimento dos ramos 2-virus das caneluras em Kober 5BB 3-virus das caneluras em Rupestris du lot 4-virus das caneluras em LN-33 OCORRÊNCIA: Todos países vitícolas

Brasil: Rs,Sc,Pr,Sp,Pe TRANSMISSÃO NO VINHEDO: (Cochonilhas) -Intumescimento dos ramos - 4 Spp (algodonosas) -Caneluras em Kober 5BB - 4 Spp (algodonosas e 1 carapaça)

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO vírus das caneluras no tronco

“Caneluras” tronco com a casca

“ Caneluras” tronco sem a casca

1

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO Caneluras no tronco

Produtora

Porta-enxerto

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO

Sadio

doente

doente

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO caneluras no tronco

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO Vírus do intumescimento dos ramos Corte transversal

sadio

doente

Vitis labrusca cv. Isabel

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO Vírus do intumescimento dos ramos

Vitis labrusca cv. Isabel Maturação incompleta da uva

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO Vírus do intumescimento dos ramos

braço morto ramos vivos

folhas doentes

Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon, após a poda/planta (8 anos)

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO Vírus do intumescimento dos ramos

2

1 1) Plantas de cabernet sauvignon infectada.

2) Cv. Indicadora infectada.

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO Vírus do intumescimento dos ramos

“Muda de um ano” Sintomas na região da enxertia

“Tecido corticento” Inserção do ramo do ano

DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO Incidência do vírus do intumescimento dos ramos*

pl. testadas / pl.infectadas (n°)

(%)

16 cvs. Viníferas

60/39

(65)

5 cvs. Porta-enxertos

43/11

(25,6)

2 cvs. Americanas 10 cvs. Viníferas (mudas) (c/engrossamento na enxertia) *Região da Serra/Rs

135/46

(34)

51/51

(100)

INCIDÊNCIA DE VIRUS NOS CLONES EM SELEÇÃO EM REGIÕES DO SUL E CENTRO DA ITALIA (2449 clones testados - 89 cvs - 274 propriedades) Infecção(%) - teste ELISA

Região

Nº clones avaliados

total

LR-3

LR1

GVA

GVB

GFLV

GFkV

Sul Puglia Calabria Ischia Basilicata Campania

946 801 45 27 24

96,8 98,6 97,8 92,6 100,0

79,0

17,4

35,4

13,4

29,6

52,3

81,8

16,6

49,7

3,8

19,0

75,1

54,6

11,4

47,7

27,3

52,3

52,0

12,0

20,0

16,0

52,0

54,2

12,5

10,7

8,3

37,5

Centro Abruzzo Marche

345 261

85,2 78,5

57,5 17,4

46,6 63,3

60,4

49,3 1,4

14,0

Savino, V. et all, 2001(Situazione Sanitaria della vite in Italia Centro-Meridionale)

26,1

DOENÇA DA DEGENERAÇÃO DA VIDEIRA

AGENTE CAUSAL: -Virus da degenerescência -Virus do mosaico do Arabis -Strawberry Latent RingSpot Virus •Na Europa -Tomato Black Ring Virus (TRBV) -Raspberry Ring Spot Virus (RRSV) -Grapevine Chrome Mosaic Birus (GCMV) -Grapevine Bulgarian Latent Virus - GBLV OCORRÊNCIA: Todos os países viticolas. Brasil: Rs, Sc, Sp, Pr, Pe. TRANSMISSÃO NO VINHEDO: Nematoides. -Vírus da Degenerescência da videira: 2 spp -Vírus do mosaico do Arabis: 3 spp.

DOENÇA DA DEGENERAÇÃO DA VIDEIRA Porta-enxerto “Rupestris Du Lot

Deformação da folha

DOENÇA DA DEGENERAÇÃO DA VIDEIRA

Folha sadia

Folha com virus

DOENÇA DA DEGENERAÇÃO DA VIDEIRA

Mosaico amarelo

Faixa nas nervuras

DOENÇA DA DEGENERAÇÃO DA VIDEIRA

Achatamento e bifurcação no ramo (seta)

DOENÇA DA DEGENERAÇÃO DA VIDEIRA

Achatamento, bifurcação, nó duplo

DOENÇA DA DEGENERAÇÃO DA VIDEIRA

Formação de bagoinhas

INCIDÊNCIA DE VIRUS EM CLONES EM SELEÇÃO NAS REGIÕES DO SUL E CENTRO DA ITALIA (Avaliados 2449 clones de 89 cultivares em 274 propriedades)

Infecção(%) - teste ELISA

Região

Nº clones avaliados

total

LR-3

LR1

GVA

GVB

GFLV

GFkV

Sul Puglia Calabria Ischia Basilicata Campania

946 801 45 27 24

96,8 98,6 97,8 92,6 100,0

79,0

17,4

35,4

13,4

29,6

52,3

81,8

16,6

49,7

3,8

19,0

75,1

54,6

11,4

47,7

27,3

52,3

52,0

12,0

20,0

16,0

52,0

54,2

12,5

10,7

8,3

37,5

Centro Abruzzo Marche

345 261

85,2 78,5

57,5 17,4

46,6 63,3

60,4

49,3 1,4

14,0

Savino, V. et all, 2001(Situazione Sanitaria della vite in Italia Centro-Meridionale)

26,1

DOENÇA DA NECROSE DAS NERVURAS

AGENTE CAUSAL:

-Vírus da necrose das nervuras

OCORRÊNCIA:

-Todos países viticolas -Brasil: Rs, Sc, Pr, Sp, Mg, Pe, Ba

TRANSMISSÃO NO VINHEDO:

-Desconhecida.

DOENÇA DA NECROSE DAS NERVURAS “ Porta-enxerto R 110”

Folhas com necrose nas nervuras “Vírus latente nas cvs. comerciais”

DOENÇA DA NECROSE DAS NERVURAS “Porta enxerto Richter 110”

Detalhe da necrose das nervuras

DOENÇA DA MANCHA NAS NERVURAS DA VIDEIRA

AGENTE CAUSAL: -Vírus da mancha nas nervuras

OCORRÊNCIA:

-Todos países viticolas -Brasil: RS, SC, PR, SP, MG, PE

TRNSMISSÃO NO VINHEDO: ?

DOENÇA DA MANCHA DAS NERVURAS

Porta-enxerto Vitis Rupestris du Lot

Detalhe das manchas translúcidas junto as nervuras “Vírus latente nas cvs. comerciais”

INCIDÊNCIA DE VIRUS NOS CLONES EM SELEÇÃO EM REGIÕES DO SUL E CENTRO DA ITALIA (2449 clones testados - 89 cvs - 274 propriedades) Infecção(%) - teste ELISA

Região

Nº clones avaliados

total

LR-3

LR1

GVA

GVB

GFLV

GFkV

Sul Puglia Calabria Ischia Basilicata Campania

946 801 45 27 24

96,8 98,6 97,8 92,6 100,0

79,0

17,4

35,4

13,4

29,6

52,3

81,8

16,6

49,7

3,8

19,0

75,1

54,6

11,4

47,7

27,3

52,3

52,0

12,0

20,0

16,0

52,0

54,2

12,5

10,7

8,3

37,5

Centro Abruzzo Marche

345 261

85,2 78,5

57,5 17,4

46,6 63,3

60,4

49,3 1,4

14,0

Savino, V. et all, 2001(Situazione Sanitaria della vite in Italia Centro-Meridionale)

26,1

DOENÇAS CAUSADAS POR FITOPLASMA(Amarelo da videira) FLAVESCENCE DORÉE

AGENTE CAUSAL: - Fitoplasma - grupo taxionomico 16SrV

- membro tipo:(Elm Yellows, EY) OCORRÊNCIA:

- França, Espanha e Italia (presença do vetor)

DISSEMINAÇÃO:

- Material vegetativo (muda, estaca) - Cigarrinha fam. Cicadellidae Scaphoideus titanus - Tipicamente epidemica

HOSPEDEIROS:

- Somente a Videira.

Em regra ocorrem em baixa concentração e com distribuição irregular nos tecidos da planta.

FLAVESCENCE DORÉE

Principais sintomas • Amarelamento (cv. Branca) ou avermelhamento (cv. Tinta), em toda ou parte da folha delimitada pelas nervuras;

• Enrolamento da folha para baixo com maior ou menor intensidade conforme a cultivar; • Dessecamento da baga evoluindo para o cacho;

• Lignificação irregular dos ramos.

DOENÇAS CSADAS POR VIRÓIDE SALPICADO AMARELO AGENTE CAUSAL: Grapevine Yellow Speckle Viroid 1 e 2. Pequenasmoleculas com 367 e 363 infectivas de RNA, sem camada proteica. OCORRÊNCIA: Nos diversos paises viticolas

DISSEMINAÇÃO: Material propagativo (mudas,

estacas, gemas) e semente. Também a por inoculação mecânica. SINTOMAS: Em geral a doença é latente. Os sintomas (manchas salpicadas de coloração amarela ouro) se evidenciam melhor em regiões de clima quente.

DOENÇA BACTERIANA DA VIDEIRA

MAL-DE-PIERCE

AGENTE CAUSAL: Xylella fastidiosa OCORRÊNCIA:

USA, México, Costa Rica, Chile e Venezuela.

HOSPEDEIROS:

Alfafa e Amendoeira e diversas espécies de gramas, ervas, arbustos e arvores.

DISSEMINAÇÃO:

Material vegetativo (mudas, estacas) Vetores-Cigarrinhas que se alimentam no xilema

MAL- DE- PIERCE “Xylella fastidiosa”

PREJUÍZOS:

- Queda de produção. - Definhamento e morte das plantas num período de um a cinco anos.

CUIDADOS:

- Utilizar material vegetativo e mudas sadias. - Não trazer material de propagação de regiões ou países onde ocorre a doença. - Na dúvida fazer imersão do material em água quente ( 50° por 20’) ou (45° por 45’).

MAL-DE-PIERCE “Xylella fastidiosa”

A

B

A- Folhas com escaldadura B- Ramos com maturação irregular

MAL-DE-PIERCE “Xylella fastidiosa” Queda da lâmina

pecíolo

- Queda prematura da lâmina foliar . - Permanência do pecíolo

(Foto: J.Andris)

MAL-DE-PIERCE “Xylella fastidiosa”

- Murcha do cacho

(Foto: A.Yen)

CONTROLE DE DOENÇAS TRANSMISSÍVEIS PELO MATERIAL VEGETATIVO (VIRUS, VIRÓIDE, FITOPLASMA, BACTÉRIA, FUNGO)

(massal/clonal) - autenticidade varietal - ausência de sintomas - vigor e produtividade

SELEÇÃO NO CAMPO

PLANTAS SELECIONADAS - TESTES

SorologiaSorologiaELISA ELISA

Enxertia verde

Enxertia mesa

Inoculação mecânica

POSITIVO

RESULTADOS “TESTES”

NEGATIVO

(planta doente)

Termoterapia 38°C- (30-90d)

PLANTA SADIA

planta Sadia

Cultivo in vitro

testes

Material básico “conservação - isolado”

Telado

c.vegetação

In vitro

MULTIPLICAÇÃO DE MATRIZES IN VITRO

(originadas do material básico) Cultivo in vitro - laboratório)

Saída do laboratório - Câmara úmida

MULTIPLICAÇÃO DE MATRIZES

Aclimatação T°(20-25ºC) casa de vegetação

Transplante das matrizes para telado

BLOCOS DE PLANTAS BÁSICAS “livre de doenças” Casa de vegetação

Telado-estufins Multiplicação in vitro - verde

Matrizes/ telado

viveiristas

MATRI ZES

MUDAS CERTIFICADS

produtores

MATRIZES DE CULTIVARES PRODUTORAS (Formadas por enxertia de mesa)

MATRIZEIRO DE PORTA-ENXERTOS (origem para muda certificada)

Matrizes - telado

ÁREA DE MATRIZES SADIAS

Fase de coleta de material para produção de mudas INVERNO(junho/julho)

DIAGNOSE, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VIRUS

Testes disponíveis no laboratório de Virologia da Embrapa Uva e Vinho

• Biológicos • Serológicos • Moleculares

Inoculação Enxertia verde

Inoculação Enxertia mesa

Inoculação mecânica

Sorologia ELISA

Molecular PCR

VIDEIRAS INDICADORAS USADAS NA DIAGNOSE DAS DOENÇAS

Doença • Degeneração da Videira

Cultivar Indicadora V.rupestris cv. St. George

• Manchas foliares (Fleck..)

V.rupestris cv. St. George

• Enrolamento da folha

C.Franc, C.Sauvignon, Merlot, Barbera, Pinot Noir,

• Caneluras no tronco - Kober Sem grooving - Rupestris stem pitting - LN33 stem grooving

Kober 5BB V. rupestris cv. du Lot LN33

• Intumescimento dos ramos

LN33

• Necrose das nervuras •Enação LN33

R110 LN33

•Flavescence dorada (fitoplasma) •Legno nero Baco (fitoplasma)

Baco 22A(Noah x Folle Blanche) Chardonnay

DIAGNOSE DA DOENÇA DO ENROLAMENTO DA FOLHA DA VIDEIRA

Teste ELISA

GLRaV-1*....................S GLRaV-2*....................S GLRaV-3*....................S GLRaV-4..................... N GLRaV-5..................... S GLRaV-6......................N GLRaV-7......................S GLRAV-8......................N GLRAV-9......................N *Virus conhecidos no Brasil

PCR

S N S N N N N N N

BIOLÓGICO

S S S S S S S S S

DIAGNOSE DA DOENÇA DO COMPLEXO RUGOSO DA VIDEIRA

Teste ELISA

PCR

1-Intumescimento dos ramos.................... S

S

BIOLÓGICO

S

(Grapevine virus B - GVB)

2-Caneluras do tronco do Kober 5BB....... S

S

S

S

S

N

S

(Grapevine virus A - GVA)

3-Caneluras no tronco de Rupestris......... N (Grapevine rupestris stem pitting associated virus - GRSPaV)

4-Caneluras no tronco de LN33.................

N

DIAGNOSE DA DOENÇA DA DEGENERAÇÃO DA VIDEIRA

Teste ELISA

PCR

BIOLOGICO

•Degenerescência da videira

S

S

S

•Mosaico do Arabis

S

N

S

•Mancha anular do tomateiro

S

N

S

(Tomato ringspot virus, TomRSV)

•Mancha anular do morangeuiro (Strawberry Latent Ringspot virus - SLRSV)

•Mancha anular da frambroeza (Raspberry Ringspot Virus -RRSV)

•Grapevine Chrome Mosaic Virus (GCMV) •Grapevine Bulgarian Latent Virus (GBLV)

DIAGNOSE DA DOENÇA DAS MANCHA DAS NERVURAS E VÍRUS ASSOCIADOS

Teste Virus

•Mancha das nervuras da videira (Grapevine fleck virus - GFkV)

•Virus da cv. Redglobe (Grapevine Redglobe virus)

•Grapevine Asteroid Mosaic associated Virus (GAMaV) •Grapevine Rupestris Vein Feathering Virus (GRVFV)

ELISA

S

PCR

N

BIOLÓGICO

S

DIAGNOSE DE OUTRAS DOENÇAS INFECCIOSAS DA VIDEIRA

Teste ELISA

PCR

BIOLOGICA

• Necrose das nervuras da videira

N

N

S

• Flavescence dorée (fitoplasma)

S

S

S

• Mal de Pierce (bactéria)

S

N

N

(Xilella fastidiosa)

• Manchas amarelas(viróide) (grapevine Yellow Speckle Viroid - GYSVd-1 e 2)

Eletroforese (sPAGE)

VANTAGENS: - rapidez (1 a 2 dias) - alta sensibilidade - versatilidade/praticidade (analisa até 96 amostras por placa)

DESVANTAGENS: - custo relativamente alto (antissoro importado) - exige que na amostragem sejam observados o estádio fenológico da planta

EXECUÇÃO DO TESTE ELISA DIRETO

1 Adição do anticorpo

3 Adição do conjugado

2 Adição do extrato vegetal

4 Revelação

Leitura do ELISA = Avaliação quantitativa amostra infectada: no mínimo 2x a leitura da amostra sadia

PARTÍCULAS VIRAIS - POSSIBILIDADES DE ESTUDO: 1. Ácido nucléico (RNA/DNA): interior da partícula  técnicas moleculares (PCR, estudo de homologia de nucleotídeos) 2. Proteína capsidial: exterior da partícula  técnicas sorológicas (ELISA)

FIG. Micrografia eletrônica mostrando partículas virais de Grapevine virus B (GVB) em extrato foliar de hospedeira herbácea. NICKEL, O; FAJARDO, T.V.M.; ARAGÃO, F.J.L.; CHAGAS, C.M. & KUHN, G. Fitopatologia Brasileira 27(3): 279-284. 2002.

Amostra a ser analisada  Extração de RNA total (vegetal + viral)  Baixíssima concentração do RNA viral (impossível visualização direta em gel)  “Multiplicação” do RNA/DNA viral pela técnica de PCR  Alta concentração do DNA viral (possível visualização em gel)

PCR gera: Fragmento de DNA do vírus do enrolamento da folha da videira 3 (GLRaV-3) SEQUENCIAMENTO DO FRAGMENTO GERADO 1 ACCGGATTGACGTGGGTGATGAGCTTCGATGCTTATAACCGGATAACTGGCAGAATTACT 60 T G L T W V M S F D A Y N R I T G R I T 61 GCCAGTGCAGATCCTGCATACACCCTATCAGTCCCACATTGGCTTATCCATCATAAGTTG 120 A S A D P A Y T L S V P H W L I H H K L 121 GGCACGTTTTCATGTGAGATTGATTACGGAGAGTTGTGTGGCCACGCCATGTGGTTTAAG 180 G T F S C E I D Y G E L C G H A M W F K 181 TCCACGACTTTTGAATCTCCAAGGCTACATTTCACGTGTTTAACGGGCAACAACAAAGAG 240 S T T F E S P R L H F T C L T G N N K E 241 CTAGCGGCAGACTGGCAAGCTGTCGTAGAACTGTATGCCGAATTGGAAGAGGCCACTACT 300 L A A D W Q A V V E L Y A E L E E A T T

FIG. Gel de agarose, podendo-se observar o DNA do GLRaV-3

301 TTCTTGGGAAACCAACTTTGG 321 F L G N Q L W

TABELA . Identidade da seqüência de nucleotídeos do gene da polimerase viral entre o isolado de GLRaV-3 do Rio Grande do Sul e outros vírus do mesmo gênero (Closterovirus). GÊNERO

CÓDIGO NO GENBANK

GENE VIRAL

IDENTIDADE (%)

Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3)

Closterovirus

AF037268

RNA polimerase dependente de RNA

95,6 (66/69)

Pineapple mealybug wilt-associated virus 2 (PMWaV-2)

Closterovirus

AF283103

RNA polimerase dependente de RNA

57,0 (15/26)

Sugar beet yellows virus (SBYV)

Closterovirus

S28710

RNA polimerase dependente de RNA

56,0 (14/25)

VÍRUS

FAJARDO, T.V.M., KUHN, G.B., EIRAS, M. & NICKEL, O. Detecção de closterovirus em videira e caracterização parcial de um isolado do Grapevine leafroll-associated virus 3. Fitopatologia Brasileira 27(1): 58-64. 2002.

Estudo da proteína capsidial do vírus Eletroforese: separação em gel  determinação do “peso molecular”  tratamento das proteínas separadas com anticorpo contra o vírus  reconhecimento anticorpo/proteína viral (técnica de western blot)

FIG. Proteína capsidial do GFLV (54 kDa) em gel (seta)