Produccion De Enzimas Microbianas 345o38

PRODUCCION DE ENZIMAS MICROBIANAS CONTENIDO: 1. SISTEMA DE CULTIVO CELULAR POR LOTE O CONTÍNUO 2. CINÉTICA DE CULTIVO 3. CINÉTICA DE FORMACIÓN DE PRODUCTOS MICROBIANOS CÁLCULO DE RENDIMIENTO Y PODUCTIVIDAD 4. TRASNDERENCIA DE OXIGENO EN FERMENTAIONES.

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MICROORGANISMOS COMO FACTORÍAS DE PRODUCCIÓN DE ENZIMAS Las enzimas se pueden obtener de tres fuentes, tanto de origen animal, vegetal como microbiano (levaduras, hongo y bacterias): la elección de una u otra fuente depende de varias factores como son la estabilidad, especificidad de sustrato, temperatura y pH óptimo, coste, inocuidad, abundancias… Sin embargo la producción de enzimas a partir de microorganismos presenta ciertas ventajas económicas y técnicas, ya que permite su producción a gran escala con un rendimiento predecible, hay una disponibilidad continua y no hace falta diseccionar animales, por no olvidar que como hay gran versatilidad de microorganismos se puede obtener un gran número de enzimas diferentes [1,2]. Además hoy en día gracias a la ingeniería genética se pueden desarrollar mutaciones en el metabolismo de los microorganismos para que estos produzcan más cantidad de enzima. El primer paso para la producción de enzimas es la elección del microorganismo adecuado, lo cual dependerá de las características de la enzima a producir. Una vez elegido el microorganismo, se le deja crecer en condiciones adecuadas de pH, temperatura y aireación. A continuación se debe extraer la enzima, lo cual depende de si la enzima es extracelular, intracelular o periplasmática (ver figura). De manera que si es extracelular no hay que romper ninguna membrana, pero si es intracelular hay que romper tanto la membrana externa como la interna, y si es periplasmática sólo la membrana externa. Para estos dos últimos casos existen diferentes métodos de rotura celular tanto químicos (con disolventes orgánicos, detergente, choque osmótico) como físicos (sonicación, cizalla líquida o sólida, congelación y descongelación) [1,3].

Una vez extraída la enzima, esta se aísla, es decir se eliminan todos los ácidos nucleicos que han sido liberados al medio tras la rotura celular, y partículas sólidas como fragmentos de membrana y células parcialmente rotas. Después se concentra y enriquece y por último se purifica. La producción de enzimas microbianas a nivel industrial se lleva a cabo por 2 métodos: a) Fermentación en superficie (método Koji): solo para obtener enzimas extracelulares b) Cultivo sumergido: se lleva a cabo en grandes fermentadores o biorreactores que controlan perfectamente las condiciones de cultivo [1,4]. En la actualidad se producen gran cantidad de enzimas microbianas utilizadas en múltiples áreas: industria alimentaria, textil, farmacéutica y papelera.

Referencias [1] J. D. Bu’lock; B. Kristiansen (1991) “Biotecnología básica”. Editorial Acriba, S.A. [2] M. García, R. Quintero, A. López-Munguía (2002) “Biotecnología alimentaria”. Editorial Limusa. Pp. 577-582. [3] S.M. Robert; N.J. Turner; A.J. Willetts; M.K. Turner (1995) “Introduction to Biocatalysis using enzymes and microorganisms”. Cambridge University Press. [4] K. Aunstrup, O. Andresen, E.O. Falch, T.K. Nilsen (1979) “Production of microbial enzymes in Microbial Tecnology”.Vol.1. Eds. Peppler, H.J., Pelman D. Academic Press, Nueva York.

1. SISTEMA DE CULTIVO CELULAR POR LOTE O CONTÍNUO

Cultivos celulares Las células constituyen sistemas de producción muy versátiles y altamente especializados. Sin embargo, para expresar plenamente sus potencialidades, su cultivo requiere de condiciones ambientales y nutricionales muy definidas, tomando en cuenta tanto los factores fisiológicos como los de ingeniería y operación. En esta área se estudia la interrelación entre las condiciones de cultivo y la respuesta fisiológica de la célula, a través del diseño de estrategias optimizadas de cultivo, basadas en la mejora del medio, elección de la modalidad de cultivo (cultivo por lote, cultivo por lote alimentado, cultivo continuo) y disposición de las células (libres o inmovilizadas), para la producción de enzimas, proteínas y metabolitos, tanto primarios como secundarios. Para ello se emplean principalmente células microbianas como bacterias, levaduras y hongos filamentosos, que pueden ser cepas nativas como de colección, mutantes y recombinantes. En los últimos años se han incorporado cultivos de células animales recombinantes para la producción de biofármacos, siendo la EIB pionera a nivel nacional en la investigación en este campo. Nuestra Escuela a partir de 1974 ha desarrollado diversos proyectos de investigación en aspectos relacionados con la fisiología y cinética de los microorganismos lixiviantes, la biolixiviación de minerales de baja ley, de relaves y de concentrados de flotación y el uso de biorreactores con agitación mecánica y neumática. En la actualidad se trabaja en la biooxidación de minerales y concentrados refractarios de oro en reactores. Esta tecnología, implementada a gran escala en Australia, Sudáfrica, Ghana y Brasil, permite una mejor recuperación del oro por el proceso de cianuración, cuando el metal se encuentra recubierto de una película de sulfuros insolubles. Se ha cuantificado el efecto de la adición de CO2, la velocidad de transferencia de oxígeno, el efecto de la concentración de mineral en la pulpa, la aireación y la agitación, tanto en la calidad de la suspensión como en la velocidad de biooxidación. También se estudia la operación continua y la configuración de reactores más adecuada. http://www.pucv.cl/uuaa/postgrados-ingenieria-bioquimica/cultivoscelulares/2016-04-08/100920.html

https://w3.ual.es/~jfernand/ProcMicro70801207/tema-1--generalidades/1-5-modos-de-cultivo.html

https://books.google.com.pe/books?id=2ctdvBnTa18C&pg=PA582&lpg=P A582&dq=CIN%C3%89TICA+DE+CULTIVO+en+ENZIMAS+MICROBIANAS&s ource=bl&ots=_rx51eyxye&sig=bQaVRm9q7NlYz1uLTF01pPO0AQ&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiQwNKgg4bYAhVMxCYKHcK HDYoQ6AEIZzAO#v=onepage&q&f=false

2. CINÉTICA DE CULTIVO

 Definición de crecimiento Incremento en el número de células microbianas en una población, ya que las técnicas actuales no permiten el estudio de células individuales

 Procesos implicados en el crecimiento 1. 2. 3. 4. 5.

Ingreso de los nutrientes básicos a la célula. Transformación de estos compuestos en energía. Replicación del material genético. Incremento en tamaño y masa de la célula. División de la célula en dos células hija, cada una conteniendo una copia del genoma y otros componentesvitales

CINÉTICA DE CULTIVO

 Describe el crecimiento y la formación de productos, es decir: Actividad de células en crecimiento, Actividad de células en reposo. Muchos productos de los cultivos microbianos de interés comercial se producen después que el crecimiento ha cesado. Es importante conocer la cinética de los cultivos microbianos porque es necesario poder predecir cómo va a evolucionar un cultivo, cómo va a ir consumiéndose el substrato y cómo se va a ir acumulando el producto de una fermentación.  Patrones de crecimiento de diferentes tipos de microorganismos 1. PATRÓN DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS Las bacterias se dividen por fisión binaria

Figura 1. Reproducción por fisión binaria de bacterias

El tiempo que le lleva a una nueva célula dividirse se llama “tiempo de generación” (Tiempo de duplicación), así se le llamará también al tiempo que tarda en dividirse la población bajo condiciones dadas de crecimiento, (medio, temperatura, pH, etc.). Cada especie bacteriana tiene un tiempo de generación determinado genéticamente, se realiza entre 15 y 60 min.

Cinética de crecimiento de cultivo en lote (batch): Cultivo realizado en un sistema cerrado: volumen fijo de nutrientes cuya composición se ve alterada en forma continua como resultado del consumo de estos a causa del crecimiento microbiano y la producción de metabolitos. A lo largo del cultivo no se añaden nutrientes, solamente: o o o

Oxígeno, el cual se añade en forma de aire Antiespumantes Ácidos o bases para controlar el pH

Después de la inoculación de la solución nutritiva estéril con microorganismos y su cultivo en condiciones fisiológicas se observan cuatro fases típicas de crecimiento. Curva de crecimiento.

Fase lag, de latencia o inducción. Es cuando las células se transfieren de un medio a otro y no existe inicialmente aumento en el número de células, aunque la masa microbiana puede cambiar. Es un período de ajuste al nuevo ambiente. Puede ser larga o corta dependiendo de muchos factores: Inoculo o o o o

Estado fisiológico Fase de crecimiento Tamaño Tipo de microorganismos

Composición del medio en el que se inocula o Condiciones fisicoquímicas del medio a)

Fase Lag aparente: Es la que se observa con inóculos pequeño  Cinética de la fase lag    

(dX/dt) = 0 X = Concentración de células (biomasa) t = Tiempo X = X0



X0 = Biomasa inicial

b) Fase exponencial, logarítmica o trofofase. Fase en la que las células se han adaptado, se realiza la reacción en cadena de duplicación de las células. Trofos= que se alimenta. Es la fase en la que se producen los metabolitos primarios.(Etanol, Ácidos orgánicos (acético, cítrico), Proteínas (fosfatasa, proteasas, amilasas, proteínas recombinantes-insulina, etc.), Biomasa (Transformaciones de metabolitos intermedios).

Descripción matemática basica de la trofofase. El crecimiento puede ser descrito cuantitativamente en función de la duplicación del número de células por unidad de tiempo.

Otras velocidades usadas para describir el patrón de crecimiento microbiano:

 Velocidad volumétrica (de crecimiento, de consumo de sustrato y de formación de producto).

 Velocidad específica de consumo de sustrato (de formación de producto)

Las ecuaciones anteriores describen perfectamente la duplicación del número de células de bacterias y levaduras que presentan crecimiento por división celular. Los tiempos de duplicación oscilan entre 15 a 20 o incluso hasta 60 min para bacterias y de 45 a 90 o hasta 120 minutos para levaduras.

2. Patrón de crecimiento de actinomicetos, hongos y virus En este caso lo que se considera es la duplicación de la biomasa o del material genético por unidad de tiempo.

Aplicabilidad del modelo matemático del crecimiento microbiano y constante específica de crecimiento explicados: Es aplicable a la trofofase, fase exponencial o logarítmica de la curva de crecimiento. La constante especifica de la velocidad de crecimiento microbiano (μ) se utiliza para caracterizar el comportamiento de una población microbiana. Su valor depende de las condiciones ambientales en que se encuentra el microorganismo. Existe una gran dependencia de la fuente de carbono y energía tanto en calidad como en cantidad.

FACTORES FÍSICOS Y QUÍMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO. 1.- Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si estudiamos la variación de la velocidad de crecimiento en función de la temperatura de cultivo, podemos observar una temperatura mínima por debajo de la que no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura óptima a la que la velocidad es máxima. Por encima de esta temperatura óptima, la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.

El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento generalizado de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la temperatura. Se denomina coeficiente de temperatura a la relación entre el incremento de la velocidad de reacción y el de temperatura. En términos generales, la velocidad de las reacciones bioquímicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10ºC la temperatura a la que tienen lugar. La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reducción de la velocidad de crecimiento por la reducción de la velocidad de reacción y al cambio de estado de los lípidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalización de las proteínas y a las alteraciones producidas en las membranas lipídicas a esas temperaturas. Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular se enlentece y las células paran de crecer; aunque no tienen porqué morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la óptima, se produce la muerte celular rápidamente y las células no pueden recuperar su capacidad de división si baja posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por frío. Hay varios tipos de microorganismos en función de sus temperaturas de crecimiento mínima, máxima y óptima.

Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Por tanto, se les puede considerar como psicrófilos facultativos. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 - 8ºC) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 ºC). Los microorganismos capaces de producir infecciones son los mesófilos y algunos psicrótrofos ya que sus temperaturas óptimas de crecimiento coinciden con las corporales. sin embargo, tanto mesófilos como psicrófilos, psicrótrofos y termófilos pueden producir toxinas causantes de intoxicaciones alimentarias. 2.- Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la humedad relativa (HR).

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metabólicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones químicas con el agua presente en una disolución saturada de sal común (NaCl) donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la solvatación de los iones de la sal disuelta. En este último caso, la actividad de agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detención del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prácticamente ilimitada. La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mínimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los siguientes: bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw >0.80. Como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (mucho más secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razón se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almíbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias. En función de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halófilos y xerófilos según toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente. La reducción de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. La utilización de almíbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano.

3.- pH: Es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo sólo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplásmica. El pH interno en la mayoría de los microorganismo está en el rango de 6.0 a 7.0. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, también, distintos. Hay microorganismos acidófilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalófilos que toleran pH=10.0 Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros microorganismos competidores. Así, por ejemplo, las bacterias lácticas que producen

grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y las lácticas se convierten en la población dominante. La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico, acético, láctico) por ciertas bacterias. En este sentido, hay que tener en cuenta que la acción bactericida de estos ácidos orgánicos de cadena corta es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que producen. Esto es, los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por sí mismos. El efecto letal del pH ácido sobre los microorganismos tiene aplicación en la conservación de alimentos acidificándolos. De esta forma, la adición de ácido acético en forma de vinagre permite la conservación de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo) y la producción de ácidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo).

4.- Potencial redox: nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar electrones, esto es: sus características oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque no el único, es la concentración de oxígeno [O2]. Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para que se produzca el crecimiento. En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo. Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entéricas, o como Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lácticas) o cuando muere en presencia de oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios). Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxígeno (anaerobios) que, sin embargo, llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de electrones que actúa como oxidante ambiental. Por ejemplo, las bacterias que "respiran" nitratos (NO3 -), sulfatos (SO4 2-) u otros compuestos orgánicos oxidados (respiración anaerobia). Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de oxígeno, no son capaces de

utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermentativo (las bacterias lácticas que son anaerobias aerotolerantes, por ejemplo). Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo. Esto es: en presencia de oxígeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia, fermentativo. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el de los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen respirando. En el curso de ciertas reacciones metabólicas redox se forman compuestos altamente reactivos (radicales libres, formas superóxido) que pueden dañar las proteínas, membranas y ácidos nucleicos produciendo la muerte de las células. Las células se defienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes: Superóxido dismutasa (SOD) y catalasa. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno. La detección de estas enzimas tiene valor taxonómico.

CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO CONTINUO.

En un cultivo continuo se mantienen los microorganismos en crecimiento constante porque se añade de forma constante medio de cultivo fresco (que aporta nuevos nutrientes) y se elimina cultivo (medio usado con sus microorganismos correspondientes) a la misma velocidad con objeto de mantener el volumen total del cultivo constante. Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que estén creciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente productos de interés (biomasa, metabolitos secundarios, etc.). Este tipo de cultivo es también importante en los estudios de fisiología y de ecología microbiana. En la naturaleza un ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjunto de procesos microbianos intestinales de todos los animales. En un cultivo continuo se pretende mantener un ambiente constante durante todo el tiempo de cultivo. Esto es imposible en un cultivo estanco en el que los nutrientes se van consumiendo progresivamente y el medio se va cargando de productos de desecho. QUIMIOSTATO El tipo más frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilución (D) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos parámetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuación:

donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por consiguiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el número de volúmenes de reactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor por unidad de tiempo. Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de substrato está dentro del reactor. Tanto la tasa de crecimiento μ como el nivel de población microbiana están relacionados con el valor de D.

A velocidades de D muy bajas, pequeños incrementos de la velocidad de dilución producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan más nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento (μ) según lo indicado en la ecuación de Monod (ecuación 13). La velocidad de crecimiento aumenta (μ aumenta y τ disminuye) cuando la energía aportada por los nutrientes entrantes supera la energía de mantenimiento de los microorganismos del cultivo. A valores bajos de D la concentración de nutriente limitante (S) en el efluente es baja porque es consumido casi completamente por los microorganismos del cultivo que alcanzan unas poblaciones de gran tamaño creciendo a una tasa (μ) baja porque se encuentran en condiciones de limitación de nutrientes (S μmax, el microorganismo no es capaz de crecer lo suficiente

como para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y, por consiguiente S alcanza un valor máximo (el nutriente limitante no es consumido en el cultivo y la concentración del substrato en el efluente es igual a la del substrato en el medio inicial) y la tasa de crecimiento de microorganismos (μ) dentro del cultivo se hace nula (el cultivo desaparece). La evolución de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuación siguiente:

Por consiguiente, si μ > D hay un incremento positivo de la población en el quimiostato, cuando μ = D el tamaño de la población se mantendrá estable (equilibrio) y si μ < D la población disminuirá como consecuencia de la dilución de las bacterias. En el steady-state, como (dN/dt) = 0, μ = D como se había explicado anteriormente. Habida cuenta de que en el estado estacionario D = μ, la ecuación de Monod puede reformularse en los siguientes términos

donde Sr es la concentración de nutriente limitante en el efluente del cultivo continuo. Despejando de la ecuación 16 el valor de Sr en función de los demás, se obtiene la ecuación siguiente:

que permite calcular cómo varía la concentración del nutriente limitante en el efluente en función de la tasa de dilución D. Si llamamos SR a la concentración de nutriente limitante que entra en el fermentador y Sr la concentración de este nutriente en el efluente; considerando que el substrato consumido en el fermentador (SR-Sr) es transformado en biomasa durante el estado estacionario (Ñ) con un rendimiento Ys, podemos calcular la producción de biomasa en el fermentador con las siguiente ecuaciones

Estas ecuaciones nos permiten modular la cantidad de biomasa producida o la cantidad de substrato consumido regulando la tasa de dilución del fermentador.

PRODUCCION DE ENZIMAS MICROBIANAS CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS PROCESOS DE FERMENTACION PARA LA PRODUCCION DE ENZIMAS MICROBIANAS La ingeniería y diseño de los procesos de fermentación ha sido ampliamente estudiada y existen diversos textos donde estos aspectos pueden ser consultados.

CINÉTICA DE PRODUCCION DE ENZIMAS

OPERACIONES DE RECUPERACIÓN

ALGUNOS EJEMPLOS DE PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ENZIMAS MIBROBIANAS AMILASAS El almidón, polímero de glucosa, es después de la celulosa el polisacárido más abundante en la naturaleza y materia prima para una gran diversidad de productos de la industria alimentaria. Existen diversas enzimas involucradas en su transformación y constituyen probablemente el sector de mayor desarrollo en los últimos 15 años en lo que a tecnología enzimática para el sector alimentario se refiere. A continuación, se describen las principales características de las amilasas de origen microbiano. α-amilasa La α-amilasa, endo-amilasa o α1 los enlaces α1

4 D-glucan 4 glucano hidrolasa. Hidroliza al azar

4 del almidón gelatinizado, provocando una drástica disminución de

viscosidad (licuefacción) y generando una distribución de productos de bajo peso molecular. Produce igualemente las α-dextrinas, considerando que no puede hidrolizar los enlaces α1

6 de la amilopectina.

Son producidas principalmente por bacterias y hongos y pueden ser clasificadas por su actividad: licuefacción o sacarificación. En el segundo caso se llegan a producir cantidades importantes de azúcares (glucosa, maltosa y maltitriosa), mientras que en el primero se desdobla el almidón, disminuyendo rápidamente la viscosidad, formando maltohexosa como producto más pequeño. En general, las α-amilasas bacterianas son de mayor resistencia a la temperatura que las fungales. El genero Bacillus es la fuente bacteriana de mayor importancia destacando por su importancia comercial dos de ellos: B. amyloliquefaciens y B. licheniformis. La enzima del primero fue la primera en aparecer en el mercado, mientras que la α-amilasa de B. licheniformis es actualmente la más empleada por su alta termoestabilidad. La mayor parte de las α-amilasas son metaloenzimas que requieren calcio, al menos un átomo por molécula de enzima y hasta 10 en el caso de la enzima de A. aryzae. En el caso de las enzimas bacterianas, la producción durante durante la fermentación es lenta en la fase logarítmica pero la secreción de enzima se acelera antes de llegar a la fase

estacionaria, continuando cuando el microorganismo ha dejado de crecer y al inicio de la esporulación. Un medio adecuado de producción podría ser 5% de almidón, 0.56% NH4NO3, 0.28% nitrato de sodio, 0.13% KH2PO4, 0.05%MgSO4, 7H2O, 0.01% CaCl2, 2H2O, 0.05% peptona y 0.2% extracto de levadura. La fermentación dura menos de dos días. La α-amilasa A. aryzae es de importancia comercial, pues pertenece a las enzimas de sacarificación: es maltogénica, pues produce altas cantidades de maltosa. Un medio adecuado de producción, podría ser: 8% almidón, 1.2% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.1% MgSO4, 0.05% KCl, 0.003% FeSO4, 0.08% Mg(NO3)2, 0.05%Mg(H2PO4)2, trazas de zinc y 2% extracto de malta. La fermentación dura de 2 a 3 días. En ambos casos parecer ser que el pH de fermentación juega un papel de suma importancia. Un cambio hacia el lado alcalino durante el cultivo debe producirse. Por otro lado, la temperatura de fermentación depende de la cepa empleada. La producción de amilasas parece ser regulada por varios genes, habiéndose obtenido mutantes 250 veces más potentes que la cepa silvestre después de 5 pasos de mutación. Β-amilasa La α-amilasa es una exoenzima que libera maltosa a partir del extremo no reductor de amilosa y amilopectina. Dado que no tiene actividad hacia enlaces α1

6, tambien se

obtienen como producto dextrinas. Aunque se encuentra, al igual que la β-amilasa, ampliamente distribuida en vegetales (granos malteados).

PECTINASAS Por pectinasas se denomina a un complejo de enzimas que se clasifican de acuerdo con el sustrato (pectina o ácido péctico), del tipo de reacción (hidólisis o transeliminación) y del mecanismo (endo o exo), incluyéndose además a la pectina esterasa. Los productos comerciales provienen generalmente de Aspergillus niger, dado que de la gran variedad de microorganismos que producen enzimas pécticas, es que el mayor número de éstas produce:

una

endo

y

una

exo

poligalacturonasa,

además

de

una

endo

polimetilgalacturonasa y una endo pectin liasa. Esto permite una mayor efectividad en la

degradación de pectina. Algunos productores japoneses emplean igualmente cepas de Sclerotina libertiana y Coniothyrium diplodiella. La enzima es inducible por pectina, y las condiciones de aireación juegan un papel importante en la proporción de enzimas producidas al final del proceso. DEXTRANASAS Las dextranasas son producidas fundamentalmente para ingenios azucareros, en los que la contaminación con dextranas producidas por Leuconostoc mesenteroides requiere de un tratamiento enzimático. Se obtienen de cepas de Penicillum funicilosum, P. lilaceum y Chaetomium gracilae, requiriendo de dextranas como inductor. Existe una gran variedad de enzimas reportadas en la literatura con actividad hacia diversos tipos de dextrana, ay que las enzimas comerciales sólo presentan alta actividad hacia enlaces α1

6, pero existen dextranas con alto contenido de enlaces α1

3 y/o α1

2.

INVERTASA Las invertasas pueden ser β-fructofuranosidasas o α-glucosidasas. Solo las invertasas de S. cerevisiae y S. carlsbergensis (sinónimo: S. pastorianus y S. uvarum) (βfructofuranosidas) son producidas industrialmente. La levadura se crece en melazas (la sacarosa es inductor) y sulfato o fosfato de amonio. La sacarosa es adicionada gradualmente durante la fermentación con el fin de reducir la represión catabólica. Dado que la enzima se encuentra asociada a la pared celular, existen dos tipos de productos: aquellos que consisten de preparaciones trituradas de levadura y productos en los cuales la enzima es soluble, al ser liberada de la pared mediante un proceso de autolisis en presencia de cloroformo o tolueno. OTRAS ENZIMAS MICROBIANAS  Naringinasa La naringinasa es una enzima comercial producida de Aspergillus niger, principalmente en Japón, siendo empleada en el tratamiento de jugos de toronja para eliminar el sabor amargo asociado con la presencia de naringina. La fermentación se lleva en sustratos (salvado, soya, etc.) a los que se adiciona cáscara del cítrico. El proceso de recuperación debe eliminar las actividades pectinolíticas que resultarían nocivas en el tratamiento del jugo, lo que se logra con tratamientos con urea. Se han propuesto otros microorganismos

con muy baja actividad pectinolítica: A. saitoi, Cochliobolus miyabeanus y Rhizoctonia solanii.  Ciclodextrina glucosil transferasa Estas enzimas permiten obtener ciclodextrinas, tambien conocidas como dextrinas Shardinger, a partir de hidrolizados de almidón (8-12 DE). Aunque existen tres tipos de ciclodextrinas (G6, G7 Y G8) conocidas como alfa, beta y gama, respectivamente, parece ser una sola enzima la responsable de la síntesis. Las cepas de Bacillus empleadas en la producción de la enzima permiten obtener: 74% de β con B. megaterium, 73% de β con B. circulans, 57% de α con B. stearothermophilus y 80% B. macerans. Por ingeniería genética se ha clonado el gene de B. macerans en B. subtiilis. Este es otro caso de enzimas microbianas no comerciales, producidas por las empresas que manufacturan ciclodextrinas.

 Isomaltulosa sintetasa Esta enzima se ha empleado en la producción de isomaltulosa como intermediario en la síntesis del edulcorante conocido como palatinita, empleando células completas de Serratia plymuthica, Protaminobacter rubrum o Erwinia rhapontici. La isomaltulosa es posteriormente hidrogenada con catalizadores de níquel. Actualmente la isomaltulosa ha adquirido un mercado por sí misma, dada su gran similitud tecnológica con la sacarosa, con un poder edulcorante netamente inferior.  Diacetil reductasa Esta enzima permite transformar el diacetilo (2,3-butanodiona) en 2,3 butilen glicol. El diacetilo, responsable del sabor de la mantequilla, es indeseable en la cerveza, donde se produce como subproducto de la fermentación alcohólica. Se puede emplear para producir esta enzima Aerobacter aerogenes.

 Acil tanino hidrolasa Esta enzima se conoce como tanasa y se emplea para la producción de té instantáneo. Es producida industrialmente por Aspergillus niger.

 α-galactosidasa Esta enzima se puede emplear para hidrolizar la estaquiosa y obtener así rafinosa y galactosa, y posteriormente para hidrolizar la rafinosa en galactosa y sacarosa. La estaquiosa es un tetrasacárido responsable de problemas de flatulencia en algunas semillas oleaginosas como la soja, mientras que la rafinosa es importante en la producción de azúcar de remolacha, ya que afecta negativamente al proceso de cristalización de la sacarosa.

Esta

enzima

se

produce

microorganismo Mortierella vinacea.

de

forma

industrial

a

partir

del