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MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA PRÁCTICA 7.

FIJACIÓN SIMBIÓTICA DEL NITRÓGENO ATMOSFÉRICO

I. INTRODUCCIÓN La mayor reserva de nitrógeno se encuentra en la atmosfera; según Tisdale y Nelson citados por Castillo (2003) con aproximadamente un 78% y según, la FAO el aire contiene un 80% de nitrógeno, lo que equivale a más o menos 6,400 Kg. del elemento sobre una hectárea. El nitrógeno es un elemento esencial para todos los seres vivos, además de ser un componente especifico de las proteínas, está presente en la mayor parte de las combinaciones orgánicas de las plantas y es totalmente volátil por calcinación. Los mayores contenidos de nitrógeno en las plantas se encuentran en los tejidos jóvenes y a medida que la planta avanza en edad o etapa fenológica, la proporción de celulosa aumenta y el porcentaje de nitrógeno disminuye y se eleva la relación C/N. Las hojas suelen concentrar el nitrógeno, pero su valor disminuye durante la floración. En la planta, el nitrógeno se encuentra en forma orgánica en moléculas importantes como las purinas, pirimidinas, porfinas, vitaminas, alcaloides y enzimas; y, en formas inorgánicas como compuestos amónicos, nitritos y nitratos. Al inicio de este siglo, los depósitos naturales de nitratos en Chile fueron las fuentes principales de nitrógeno fijado disponible para la agricultura. En 1983, Sir William Crookes, advirtió de que los depósitos estaban agotándose lo que estimulo a la producción de fertilizantes nitrogenados a través de medios industriales los cuales se sintetizan a través del proceso de Haber-Bosch que consiste en la síntesis directa del amoniaco a partir del hidrogeno y nitrógeno atmosférico, reacción que demanda de altas tasas de temperaturas y presiones así como de una fuente de H2. Ahora, tres cuartos de siglo después a través de los expertos se conoce que el gas natural y el petróleo necesarios para la producción de fertilizantes se están agotando. Por lo anterior, se requiere de otra alternativa para el suministro de nitrógeno agrícola para el futuro y entonces tomar ventaja de la fijación biológica del nitrógeno a través de la simbiosis Rhizobium-leguminosa. De acuerdo a Alfredo Echegaray Alemán, el nitrógeno es de gran importancia para todas las formas de vida que se desarrollan en el planeta tierra ya que se considera un elemento biogénico que constituye un elemento esencial de los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, purinas, pirimidinas, alcaloides y vitaminas. II. OBJETIVOS  Explicar los métodos existentes de transformación de nitrógeno molecular en nitrógeno usado por las plantas  Analizar de forma individual y grupal la dinámica del nitrógeno en el suelo  Aplicar en un agroecosistema en particular, el efecto sobre el rendimiento de la simbiosis entre la bacteria Rhizobium y plantas leguminosas en asocio con otras plantas de interés agrícola

Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Agronomía, Protección de Plantas, 2016.

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III. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

3.1 Fijación simbiótica de nitrógeno De acuerdo con Viviana Chiocco (2016), las plantas superiores no han podido realizar durante su evolución la capacidad de sintetizar el complejo enzimático nitrogenasa y de fijar nitrógeno atmosférico (N2). Sin embargo, varias plantas han desarrollado la estrategia de asociarse simbióticamente con organismos procariontes capaces de fijar N2. Según Ginés Navarro (2,000) y Castillo, V (2003), la transformación del nitrógeno molecular atmosférico en nitrógeno utilizable potencialmente por las plantas en el suelo, se realiza principalmente a través de tres procesos: 1) Por oxidación y pasar a la forma de óxidos, por acción de las descargas eléctricas y luego ser trasladados por las lluvias y depositado en el suelo como acido nitroso o nítrico en pequeñas cantidades. 2) Industrial, que según Atlas y Barta fue de 30 millones de toneladas por año (1975); 100 millones de toneladas para el año 2000 y se calcula aumentara aproximadamente a 200 millones de toneladas para el año 2025, a través del proceso de Haber-Bosch y, 3) Fijación biológica, que puede ser no simbiótica a través de microorganismos de vida libre que rodean la rizosfera y simbiótica por medio de un conjunto de reacciones gracias a las cuales los organismos vivos Rhizobium y leguminosas integran el nitrógeno molecular en sus estructuras como componente de diversos compuestos, para luego fijarlo al suelo y que se calcula que es de 135 millones de toneladas por año. Todos los suelos contienen en su estructura una pequeña cantidad de nitrógeno en forma de compuestos relativamente simples, como aminoácidos, sales amónicas y nitratos de los cuales solo de las sales amónicas y los nitratos es de donde las plantas obtienen su nitrógeno de forma natural. Pero en los suelos cultivados el nitrógeno puede aparecer por la adición que el hombre realiza a través de los fertilizantes nitrogenados obtenidos sintéticamente a partir de nitrógeno atmosférico o mediante la adición de residuos orgánicos de diversa procedencia. El nitrógeno total presente en los suelos cultivados puede variar entre los límites entre 0.01 y 0.5%, aunque lo más frecuente es que se encuentre en un promedio de 0.1%. El nitrógeno orgánico se encuentra como proteínas, aminoácidos libres, aminoazúcares y otras sustancias complejas no identificadas. Mientras que el nitrógeno inorgánico del suelo incluye las formas: NH4+, NO3-, NO2-, N2O y NO las cuales son asimilables por las plantas. El nitrógeno presente en suelos cultivables procede diferentes materiales como restos de cultivos, abonos verdes, estiércol, fertilizantes comerciales y nitritos aportados por lluvias, así como por la fijación del nitrógeno atmosférico realizada por ciertos microorganismos. 3.2 Dinámica del nitrógeno del suelo Esta dinámica está altamente influenciada por tres procesos, en donde cada uno de ellos depende, a su vez, de un conjunto de secuencias íntimamente ligadas entre sí. La distribución de los procesos se resume así: Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Agronomía, Protección de Plantas, 2016.

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a) Ganancia del nitrógeno del suelo

 Fijación del nitrógeno atmosférico por microorganismos que viven libremente en el suelo (Clostridium, Azotobacter y Amylobacter)  Fijación del nitrógeno atmosférico por Rhizobium u otras bacterias simbióticas  Aportes por el agua de lluvia  Aporte en fertilizantes, estiércol y plantas verdes b) Transformaciones del nitrógeno en el suelo  Aminificación, o degradación bioquímica de las proteínas y otros compuestos complejos nitrogenados en aminoácidos y aminas  Amonificación, o transformación bioquímica de los aminoácidos y aminas en amoniaco  Nitrificación, u oxidación bioquímica del amoniaco en acido nítrico  Síntesis proteicas de los microorganismos del suelo, a partir de los compuestos que se originan en el transcurso de los anteriores procesos c) Pérdidas de nitrógeno en el suelo      

Desnitrificación, o reducción bioquímica de los nitratos bajo condiciones anaeróbicas Reacciones químicas de los nitritos bajo condiciones aeróbicas Volatilización del amoniaco, principalmente en suelos alcalinos, cálidos y húmedos Lixiviación de los nitratos Asimilación de los nitratos por las plantas superiores Fijación del amonio por las arcillas y en suelos con alto contenido de materia orgánica

3.3 La enzima Nitrogenasa y su bioquímica de fijación La molécula base en la fijación biológica del nitrógeno es la enzima nitrogenasa, la cual se logro aislar por primera vez en 1960 a partir de Clostridium pastorianum en los Estados Unidos. Actualmente ya se ha obtenido nitrogenasa de un gran número de microorganismos, incluido Rhizobium. Esta enzima está formada por dos coproteínas distintas y complejas siendo la primera la dinitrogenasa (proteína que contiene Molibdeno y Hierro) y la segunda la dinitrogenasa reductasa (proteína que solo contiene hierro) y que a su vez ninguna se activa sin la presencia de la otra. Es de importancia saber que la vida media de la enzima en o con el aire (oxigeno) es muy corta. Una de las características de la enzima es que para poder actuar necesita de trifosfato de adenosina (ATP), el cual es hidrolizado en difosfato de adenosina (ADP) con producción de energía. Esta energía producto del metabolismo de la glucosa obtenida en la fotosíntesis, es utilizada para el rompimiento del triple enlace existente entre átomos de nitrógeno, además la enzima requiere la presencia de Mg+2 que se cree actúa como puente de unión entre el componente II y el ATP. Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Agronomía, Protección de Plantas, 2016.

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En la actualidad se conoce que la reacción química completa de la fijación del nitrógeno que se realiza en una célula viva es la misma que la del proceso Haber-Bosch, ya que primero debe romperse el triple enlace de la molécula de N2, para después unirse los tres átomos de hidrógeno a cada átomo de nitrógeno. En el proceso de Haber-Bosch, el hidrogeno se presenta en forma de gas molecular; mientras que en la mayoría de bacterias fijadoras de nitrógeno se extrae de moléculas orgánicas como la glucosa, que es el principal azúcar producido en la fotosíntesis. Los átomos de hidrógeno son transferidos de la glucosa al nitrógeno a través de una red de moléculas intermedias. 3.4 Características de un organismo para fijar nitrógeno  Que la nitrogenasa represente de 1-2% de la proteína total de la célula en una bacteria, la enzima posee una alta demanda de hierro (Fe) y también requiere azufre (S) y molibdeno (Mo) adicional. Cuando las bacterias fijadoras de nitrógeno se encuentran en ambientes carentes de Mo, es obvio que no producirán nitrogenasa activa.  El requerimiento de energía es de 12 a 24 moléculas de ATP para cada nitrógeno fijado, impuesto energético adicional del organismo 3.5 Nódulos y su función Los nódulos son los encargados de crear un ambiente adecuado para los rizobios que consiste en la resistencia a la desecación y competencia con otras bacterias del suelo, además los rizobios se rodean con leghemogoblina (Fuchsman et al., 1976) y se benefician con los productos de la fotosíntesis, en consecuencia el nitrógeno fijado se elimina de los nódulos una vez realizada la fijación. Según Bergersen y Briggs, 1958, las células de Rhizobium en el nódulo están encerradas por membranas derivadas de la planta 3.6 Simbiosis Rhizobium-Leguminosas (Fabáceas) y Lectinas Para María José Valarini, citada por Itamar y Lucio (1998); un gran número de plantas dicotiledóneas con diferentes familias, establecen asociaciones simbióticas especificas con bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico (N2). Las asociaciones mas estudiadas incluyen aquellas entre plantas de la familia Fabaceae (Leguminosas) y bacterias gram negativas de la familia Rhizobiaceae. Además de Rhizobium; Bradyrhizobium y Azorhizobium también son capaces de inducir a la formación de nódulos en raíces de plantas de la familia Fabaceae. Algunas especies de Rhizobium nodulan en una leguminosa especifica (Fred et al., 1932). Ejemplos: Rhizobium japonicum infecta a la soya; R. meliloti especifico para la alfalfa y R. trifolii nodula en tréboles. Las leguminosas específicas poseen proteínas propias de sus semillas -las Lectinas-. Según hallazagos de Bohlool y Schmidt, 1974; Dazzo y Hubbell, 1975; Wolpert y Albersheim, 1976; la lectina de las semillas de soya que se encuentra también en la punta de los pelos radiculares -sitio inicial de la infección- (Dazzo y Brill, 1977) se enlazaran con la mayoría de las cepas de R. japonicum. Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Agronomía, Protección de Plantas, 2016.

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Las Fabaceae (lelguminosas) no son las únicas plantas que pueden obtener todo su nitrógeno de las bacterias simbióticas que fijan N2, otros pequeños árboles y arbustos leñosos presentes en nuestro país que nodulan incluyen a especies como Alnus (Aliso,) y Casuarina (Bond, 1974), aquí los organismos responsables de la formación de nódulos y la fijación de N2, parece ser Frankia que tienen como característica la no formación de leghemogoblina en los nódulos. IV. METODOLOGÍA  Identificar a nivel de campo un asocio de una leguminosa de interés con una bacteria fijadora de nitrógeno atmosférico a través de la presencia de nódulos  A nivel de laboratorio aislar en cultivo puro la bacteria encontrada en la simbiosis  A nivel de campo, sembrar a través de semilla una planta de leguminosa inoculada con Rhizobium como asocio; luego a través del tiempo observar y discutir resultados V. TAREA Según grupos organizados por afinidad, presentar en tubo a su auxiliar de laboratorio el cultivo puro de la bacteria fijadora de nitrógeno aislada e identificada según material proporcionado en el laboratorio VI. BIBLIOGRAFÍA 1. Carlson, Peter S. 1990. Biología de la productividad de los cultivos. 1ª. Edición. Traducción: Mercedes de la Garza Curcho. AGT Editor, S.A. México, D.F. 413 p. 2. Castillo Diaz, V.H. 2003. Aporte de nitrógeno al suelo por tres leguminosas nativas, en el ambiente de invernadero. Tesis Ingeniero Agrónomo, Guatemala, Universidad de San Carlos. 55 p. 3. Chiocco, Viviana Mónica. 2016. Guía de Microbiología Agrícola y Ambiental. Universidad de Buenos Aires, Facultad de Agronomía. (en línea) Argentina. Consultado 17 de mayo 2016. Disponible en https://sites.google.com/a/agro.uba.ar/microbiologia-agricola-y-ambiental/ 4. Ferrera Cerrato, Ronal; Alarcon, Alejandro. 2001. La microbiología del suelo en la agricultura sostenible. (en línea) Ciencia Ergo Sum 8 (2) 175-183. Consultado 18 mayo 2016. Disponible en https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=10402108 5. Ferrera Cerrato, Ronal; Pérez Moreno, Jesús. 1995. Agromicrobiología: Elemento útil en la agricultura sustentable. Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas, Montecillo, Estado de México. 233 p. 6. Molina Llarden, Mario. 1957. Microbiología de suelos y técnicas fitopatológica. Editorial Universitaria. Imprenta Universitaria de la Universidad de San Carlos de Guatemala. 287 p. 7. Navarro Blaya, Simon; Navarro García, Ginés. 2000. Química Agrícola: El suelo y los elementos químicos esenciales para la vida vegetal sostenible. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid, España. 488 p. 8. Soares de Melo, Itamar.; Lúcio de Azevedo, J. 1998. Ecología microbiana. 1ª. Edición. Jaguariúna: Embrapa-CNPMA. SP. Brasil. 488p. Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Agronomía, Protección de Plantas, 2016.

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