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PCR (reacción en cadena de la polimerasa) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR Polymerase Chain Reaction) es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo consiste en obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular.  En teoría basta partir de una única copia del ADN original (también llamado molde o templado). Su utilidad se basa en que luego de la amplificación resulta mucho más fácil estudiar un determinado fragmento de ADN. 

Estos usos derivados de la amplificación llevaron a que se transforme en una técnica ampliamente utilizada. La PCR es una técnica común y en muchos casos indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica debido a su gran variedad de aplicaciones biomédicas.  La técnica de PCR se basa en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se utilizan ciclos (repeticiones) con altas y bajas temperaturas alternadamente. 

Descripción General 

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Para hacer copias de un gen hay que conocer las regiones que lo delimitan y contar con su secuencia. Los oligonucleótidos de iniciación determinan los límites de la región amplificada. Normalmente, la reacción se lleva a cabo con una DNA polimerasa de Thermus aquaticus, una bacteria termofílica. Por ello, la enzima es capaz de soportar las altas temperaturas de la reacción. El nombre del enzima es Taq. La velocidad de síntesis de las nuevas cadenas es de 1Kb por minuto aproximadamente. La síntesis es seguida de una etapa de desnaturalización, de 1 minuto a 93ºC, y anillamiento de los primers durante otro minuto, de acuerdo a su Tm. Al finalizar la reacción (20-35 ciclos) se observa un enriquecimiento de los fragmentos copiados entre los dos primers. El análisis de fragmentos se hace por electroforesis en gel de agarosa, y tición del DNA con bromuro de etidio.

Diseño de oligonucleótidos iniciadores “primers” 

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Los primers tienen que ser complementarios a la secuencia a amplificar. Deben de hibridarse exactamente. Si no, no hay amplificación, o tiene lugar una aamplificación inespecífica. La longitud del primer determina la especificidad. Un primer de 8 nucleótidos se anillará en 1/65536pb. En el genoma humano, hay 3000000 pb, luego puede anillarse en 46000 sitios distintos. Un primer de 18 nucleótidos se unirá en 1/17179869184pb. O sea, en un solo sitio. Los primers no pueden ser todo lo largos que se quiera, porque esto afecta a la velocidad de hibridación y la eficiencia del proceso. En consecuencia, los primers nunca exceden 30 nucleótidos.

Pasos a seguir: Inicialización: este paso se realiza para desnaturalizar el ADN, y consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-95°C, que se mantiene durante 5-9 minutos. 2. Desnaturalización: en primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de GC que tenga la hebra, como también del largo de la misma. 3. Annealing / Alineamiento / Unión del primer: a continuación se producirá la hibridación del primer, es decir, el primer se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65°C permitiendo así el alineamiento. La temperatura óptima de annealing es específica para cada primer; y depende de los puentes de hidrógeno que se forman entre las cadenas de ADN (unión ADN primer-ADN molde). Temperaturas altas de annealing impedirán la unión del primer al ADN molde; y temperaturas bajas llevarán a una unión inespecífica. 1.

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Extensión / Elongación de la cadena: actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del primer como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTPs complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-P de los dNTPs con el grupo 3'-HO del final de la hebra de ADN creciente. Para la Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad está, comúnmente, en 72 °C. El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. La Taq polimerasa, en su temperatura óptima, polimerizará 1000 bases/minuto. Los pasos 2,3,4 se repiten unas 25-35 veces Elongación Final: etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 72°C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente amplificado.

En 1983 Kary Mullis da a conocer esta técnica y en 1993 recibió el Premio Nobel de Química por este descubrimiento

Es un proceso cíclico (cada ciclo consta de 3 pasos) 94ºC desnaturalización (separación de las dos hebras de ADN) 50ºC Anillamiento de "cebadores"

72ºC copia de cada una de las hebras de ADN por la ADN polimerasa

35 ciclos

236= 68 billones de copias

Reactivos necesarios para PCR: Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.  MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa dNTP’s (Deoxinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP. -La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb. -Generalmente, se usa una concentración de 200M de cada uno. 

Reactivos necesarios para PCR: 

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Cebadores “primers”: Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentración de 1MDNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud. El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng. Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción. (actualmente diferentes variantes de la Taq polimerasa)

Cálculo de la temperatura  Cada

ciclo de PCR implica trés saltos de temperatura:  La desnaturalización, a 94ºC  La hibridación de los primers, que depende de la longitud y composición de los mismos.  La extensión, que ocurre óptimamente a 74ºC para Taq.

Temperatura de Hibridación Es el factor mas determinante en la hibridación. A temperaturas demasiado altas, no tiene lugar. Temperaturas demasiado bajas, tienden a favorecer hibridaciones inespecíficas, alterando la especificidad de la reacción.  La temperatura óptima tiene que ser lo suficientemente baja para permitir la hibridación específica entre el primer y su ´secuencia complementaria, pero lo suficiéntemente alta, como para impedir hibridaciones no específicas.  Esta temperatura puede calcularse en base a la temperatura de fusión (melting temperature) o Tm del híbrido. 

Cálculo de la Tm  La

Tm

se puede obtener experimentalmente, pero es mas habitualmente calculada en base a la siguiente ecuación:  Tm= (4x[G+C])+(2x[A+T])ºC  Donde G,C,A y T es el número de nucleótidos de cada tipo en el primer.

Temperatura de Hibridación  La

temperatura de hibridación estará, por tanto, 1-2ºC por debajo de la Tm (del primer con menor Tm)  Es importante tener en cuenta que la PCR requiere el uso de dos primers, y que ambos deben de tener una temperatura de hibridación semejante. De lo contrario, la reacción no procederá normalmente !

VARIANTES DE PCR  RT-PCR : detección de mRNA  PCR-RFLP: polimorfismo genético  RAPDs : amplificación con random primers - polimorfismo

 PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de otra previamente amplificada  PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea

 Inverted PCR: para conocer secuencias flanqueadoras  Long PCR : amplificación de fragmentos grandes 10 -20 kb.

APLICACIONES DE PCR  INVESTIGACION BÁSICA Diagnóstico clínico  Monitoreo y Evaluación de terapia

 Detección de cepas resistentes a antibióticos  Detección de mutaciones puntuales  Polimorfismo genético  Filiación humana  Medicina Forense

 Pedigrí animal Control de calidad