Makalah Fitokimia Isolasi Kumarin 371h6n

BAB I PENDAHULUAN A. Tujuan Praktikum 1. Mahasiswa mampu melakukan isolasi senyawa Kumarin dari Tanaman Kemuning (Murraya paniculata (L.) Jack.) 2. Mahasiswa memahami tahapan-tahapan isolasi senyawa Kumarin dari Tanaman Kemuning (Murraya paniculata (L.) Jack.) B. Tinjauan Pustaka 1. Tanaman Kemuning (Murraya paniculata (L.) Jack.) a. Tinjauan Botani Tanaman Kemuning (Murraya paniculata (L.) Jack.) 1) Klasifikasi tanaman kemuning adalah sebagai berikut : Kingdom Divisi Subdivisi Kelas Ordo Famili Genus Spesies (Backer & Bakhuizen, 1965)

: Plantae : Spermatophyta : Angiospermae : Dicotyledonae : Sapindales : Rutaceae : Murraya : Murraya paniculata (L.) Jack.

Nama Daerah Kemuning (Sunda); Kemuning , Kemuning (Jawa); Kajeni, kenapkemuning, kemonign (Bali); Kamoneng (Madura); Kemuning (Madano, Makasar); Kamoni (Baro); Palopo (Bugis; dan eseki, tanasa,Kamone, Kamoni (Maluku) 2) Morfologi Kemuning merupakan semak atau pohon rendah, tidak berduri, tajuk

membulat,

tidak rapat,

tingginya

3-7 m.

Kemuning

mempunyai batang pokok bengkok, permukaan batangnya beralur-alur, kulit kehitaman, rantingnya kecil, abu-abu muda, berambut halus dan gundul. Kemuning mempunyai daun dengan duduk daun tersebar, majemuk menyirip gasal, anak daun 2-8, kebanyakan 4-7, remasan tidak berbau busuk, anak daunnya berbentuk elip memanjang atau bulat telur terbalik, ujung meruncing pendek, pangkal runcing, miring, tepi rata atau beringgit tidak jelas,3-10 x 1,5-5 cm. Kemuning mempunyai bunga tunggal atau susunan bunga majemuk cymes, berbilangan 5, 1-8.

1

Kelopak bunganya 5, dengan tinggi 2-2,5 mm. Bunga kemuning mempunyai mahkota dengan panjang daun mahkota 6-27 x 4-10 mm, bentuknya memanjang bulat telur terbalik, runcing, tua berwarna putih. Bunga ini mempunyai benang sari berjumlah 10, mengelilingi cincin yang lebih panjang atau pendek, ukurannya tidak sama, tangkai sarinya gundul, berbentuk paku, kepala sari subbasifixed, elip dan tumpul. Mempunyai putik dengan bakal buah 2 ruang, 1-2 bakal biji, tangkai putiknya panjang, mudah gugur dan kepala putiknya bentuk kepala. Mempunyai buah buni, membulat, bulat telur sampai bulat memanjang, gundul, merah mengkilat. Bijinya berjumlah 1-2, gundul atau berambut tipe tomentos (Backer & Bakhuizen, 1965). b. Tinjauan Kimia Tanaman Kemuning (Murraya paniculata (L.) Jack.) Daun

kemuning

mengandung

cadinene,

methyl-anthranilate,

bisabolene, β-caryophyllene, geraniol, carene-3, eugenol, citronellol, methyl-salicylate, s-guaiazulene, osthole, paniculatin, tannin, dan kumarin. Kulit batang mengandung mexotioin, 5-7-dimethoxy-8 (2,3dihydroxyisopentyl) mengandung

kumarin.

scopoletin,

dan

Sedangkan buahnya

bunga mengandung

kemuning semi-α-

carotenone. Daun kemuning mengandung senyawa golongan triterpenoid, kumarin (isomeranzin, muranganon asetat, murayatin, murangatin, meranzin hidrat, febalosin dan muranganon) dan metil kafeat. Senyawa kumarin lainnya yaitu murmeranzin dan muralonginal. Minyak atsiri dari daun kemuning mengandung £-siklositral, metil salisilat, trans-nerolidol, £cubeben, (-)-kubenol dan isogermakren (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2010). Struktur Kimia Kumarin

Sifat fisis dari senyawa kumarin sebagai berikut : 1) Kristal berbentuk jarum tidak berwarna 2

2) 3) 4) 5) 6) 7)

Titik leleh 67°-69° C Titik didih 297°-299° C Mulai menyublim pada suhu 100°C Larut 0,25 g/100ml pada suhu 25° C Larut 47,00g/100ml etanol 70% pada suhu 40°C Kristal berbentuk orthorombik atau rectangular

Sifat kimia dari senyawa kumarin diantaranya : 1) Sifat kelarutan kumarin sangat bervariasi, ada yang larut dalam pelarut polar, ada yang sedikit larut dalam pelarut polar dan ada pula yang larut dalam pelarut non polar 2) Peleburan kumarin dengan NaOH menghasilkan asam asetat dan salisilat 3) Nitrasi membentuk 6-nitrokumarin dan 8-nitrokumarin 4) Sulfonasi dibawah penangas air memberikan kumarin 6-asam sulfonat dan pada suhu 150°C memberikan 3,6-asam disulfonat 5) Halogenasi dalam kloroform pada suhu ruang dengan bromida menghasilkan kumarin 3,4-dibromida atau 3,6 dibromokumarin 6) Reduksi dengan almalgam natrium menghasilkan asam metilotat 7) Kumarin sulit dioksidasi dan stabil dalam asam kumarin 8) Cahaya radiasi atau radiasi ulltraviolet mengubah kumarin menjadi suatu dimer (titik lelehnya 263°C)

c. Tinjauan Famakologis Tanaman Kemuning (Murraya paniculata (L.) Jack.) Pemberian secara oral ekstrak kemuning dengan dosis 100, 200 dan 400 mg/kg BB selama 14 hari bisa mereduksi level glukosa darah, kolesterol dan trigliserida serta kadar lemak secara signifikan (Gautama et al., 2012). Pada pemberian ekstrak etanolik daun kemuning dengan dosis 315 mg/kg BB tikus setelah pemberian selama 15, 45 dan 90 hari, mampu menurunkan kadar kolesterol darah tikus sebesar 15,34-25,75%. Aorta tikus juga mengalami penurunan timbunan lemak setelah pemberian ekstrak etanolik daun kemuning pada hari ke 90 (Pramono et al, 2004). Infusa daun kemuning dengan dosis 30 mg/10g BB mencit albino pada percobaan analgesik mempunyai potensi analgesik mendekato asetosal 52 mg/kg BB. Ekstrak etanol 80% daun kemuning dosis 500 mg per oral dapat menghambat 66,67% intensitas geliat pada mencit yang diinduksi

3

nyeri menggunakan asam asetat 0,7% (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2010). Dalam farmakologi Cina dan pengobatan tradisional lain disebutkan bahawa tanaman ini memiliki sifat, rasa pedas, pahit, hangat. Masuk median jantung, lever dan paru-paru. Pemati rasa, penenang, antiradang, menghilangkan bengkak, anti rematik, melancarkan peredaran darah, anti-tiroida.

2. Penapisan Fitokimia a. Kumarin Sebanyak 2 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalamtabung reaksi (volume 20 ml), ditambahkan 10 ml kloroform, kemudian dipasang corong (yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air) pada mulut tabung dan dipanaskan 20 menit di atas penangas air lalu didinginkan, dan disaring dengan kertas saring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap sampai kering, ke dalam residu ditambahkan 10 ml air panas dan didinginkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 0,5 ml larutan ammonia 10%. Fluoresensi hijau atau biru yang terbentu di bawah lampu ultraviolet dengan panjang gelombang 366 nm menunjukkan adanya senyawa golongan kumarin. b. Alkaloid 1) simplisia dimasukkan kedalam mortir bersih, 2) ditambahkan 5 ml amoniak 25%, 3) campuran kemudian digerus,lalu ditambahkan 20 ml kloroform dan gerus kembali dengan kuat, 4) campuran disaring kemudian diambil fitrat larutan organik dasebagai larutan A, 5) sebagai fitrat A dimasukkan

kedalam

tabung

reaksi

lalu

ditambahkan asam klorida 10% v/v. Lalu fraksi air dipisahkan sebagai fitrat B, 6) larutan A ditetes pada kertas saring lalu disemprotkan dengan pereaksi dragendorf,terbentuk warna merah atau jingga pada kertas saring menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid, 7) larutan B dibagi menjadi 2 bagian dalam tabung reaksi,tabung pertama ditambahkan pereaksi dragendorf

4

c. Senyawa Polifenolat Simplisia atau bahan uji lain ditempatkan pada tabung reaksi lalu ditambahkan air secukupnya, lalu dipanaskan diatas penangkas air dan disaring. Kepada filtrate ditambahkan larutan pereaksi besi (III) klorida dan timbulnya warna hijau atau biru-hijau, merah ungu, biruhitam hingga hitam menandakan positif fenolat atau timbul endapan coklat menandakan adanya polifenoat. d. Flavonoid 1) 1 gram simplisia ditempatkan dalam gelas kimia, kemudian ditambahkan 100 ml air panas dan didihkan selama 10 menit. 2) Campuran disaring, filtrate ditampung sebagai LARUTAN C yang nantinya akan digunakan untuk pemeriksaan golongan senyawa flavonoid, saponin, dan kuinon. 3) 5 ml larutan C dimasukan kedalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat. 4) Kepada campuran ditambahkan amilalkohol, dikocok dengan kuat lalu dibiarkan sampai terjadi pemisahan. Terbentuknya warna dalam lapisan amilalkohol menunjukan adanya golongan senyawa flavonoid. e. Saponin 1) Diambil 5 ml larutan C, lalu dimasukan kedalam tabung reaksi dan kocok secara vertical selama 10 detik. 2) Dibiarkan selama 10 menit. Terbentuknya busa 1 cm yang stabil di dalam tabung reaksi menunjukan adanya golongan senyawa saponin. Dan busa tersebut masih bertahan (tidak hilang) setelah ditambahkan beberapa tetes asam klorida. f.

Kuinon 1) 5 ml larutan C dimasukan kedalam tabung reaksi. 2) Ditambahkan beberapa tetes larutan Natrium Hidroksida 1 N. terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukan adanya golongan senyawa kuinon.

g. Tannin 1) 1 gram simplisia ditambahkan 100 ml air panas, kemudian dididihkan selama 15 menit.

5

2) Campuran didinginkan, kemudian saring dan filtrate dibagi menjadi 3 bagian dalam tabung reaksi. 3) Kedalam filtrate pertama ditambahkan larutan besi(III)klorida 1%. Terbentuknya warna biru tua kehijauan menunjukan adanya golongan senyawa tannin. 4) Kedalam filtrate kedua ditambahkan

larutan

gelatin

1

%.

Terbentuknya endapan putih menunjukan keberadaan senyawa tannin. 5) Kedalam filtrate ketiga ditambahkan 15 ml pereaksi Stiasny, lalu panaskan dengan penangkas. Terbentuknya endapan merah muda menunjukan adanya tannin katekat. 6) Hasil uji filtrate ketiga disaring. Filtrate dijenuhkan dengan penambahan natrium asetat, kemudian ditambahkan beberapa tetes larutan besi(III)klorida 1%. Terbentuknya warna biru tinta menunjukan adanya tannin galat. Pembuatan

pereaksi

stiasny

:

2

bagian

formaldehid

30%

dicampurkan dengan 1 bagian asam klorida pekat. h. Monoterpena dan Sesquiterpena Simplisia atau bahan uji lain digerus dengan eter lalu disaring. Filtrate ditempatkan dalam cawan penguap dan dibiarkan menguap sampai kering, lalu ditambahkan larutan vanillin 10% dalam asam sulfat pekat dan timbulnya warna-warna menandakan positif senyawa mono dan seskuiterpen. i.

Triterpenoid dan Steroid Simplisia atau bahan uji lain digerus dengan eter lalu disaring. Filtrate ditempatkan dalam cawan penguap dan dibiarkan menguap sampai kering, lalu ditambahkan larutan pereaksi Liebermann Burchard dan terjadinya

warna

merah-ungu

menandakan

positif

triterpenoid,

sedangkan bila warna hijau-biru menunjukan positif steroid. Pembuatan peraksi Liebermann Burchard : 1 ml asam asetat anhidrat dicampur dengan 1 ml kloroform, lalu didinginkan pada suhu 0°C, lalu ditambahkan 1 tetes asam sulfat pekat.

3. Ekstraksi

6

a. Pengertian Ekstraksi Ekstraksi atau penyarian adalah proses penyarian atau menarik komponen yang berada dalam campuran (simplisia) secara selektif denganpelarut yang sesuai. Komponen yang terdapat dalam simplisia akan

larut

berdasarkan

koefisien

partisi

(koefisien

distribusi)

komponen tersebut dalam pelarut yang di gunakan. Istilah-istilah berikut ini umumnya digunakan dalam teknik ekstraksi: 1) Bahan ekstraksi : Campuran bahan yang akan diekstraksi 2) Pelarut (media ekstraksi) : Cairan yang digunakan untuk melangsungkan ekstraksi 3) Ekstrak : Bahan yang dipisahkan dari bahan ekstraksi 4) Larutan ekstrak :Pelarut setelah proses pengambilan ekstrak 5) Rafinat (residu ekstraksi): Bahan ekstraksi setelah diambil ekstraknya 6) Ekstraktor: Alat ekstraksi 7) Ekstraksi padat-cair: Ekstraksi dari bahan yang padat 8) Ekstraksi cair-cair (ekstraksi dengan pelarut = solvent extraction): Ekstraksi dari bahan ekstraksi yang cair. Pada ekstraksi tidak terjadi pemisahan segera dari bahan-bahan yang akan

diperoleh

pengumpulan

(ekstrak), ekstrak

melainkan

dalam

mula-mula

pelarut.

Ekstraksi

hanya akan

terjadi lebih

menguntungkan jika dilaksanakan dalam jumlah tahap yang banyak. Setiap tahap menggunakan pelarut yang sedikit. Kerugiannya adalah konsentrasi larutan ekstrak makin lama makin rendah, dan jumlah total pelarut yang dibutuhkan menjadi besar, sehingga untuk mendapatkan pelarut kembali biayanya menjadi mahal. Semakin kecil partikel dari bahan ekstraksi, semakin pendek jalan yang harus ditempuh pada perpindahan massa dengan cara difusi, sehingga semakin rendah tahanannya. Pada ekstraksi bahan padat, tahanan semakin besar jika kapiler-kapiler bahan padat semakin halus dan jika ekstrak semakin terbungkus di dalam sel (misalnya pada bahanbahan alami). Pemisahan ini dilakukan berdasarkan sifat fisika kimia untuk dari molekul seperti: 1) Kecendrungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)

7

2) Kecendrungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (absorpsi/penjerapan) 3) Kecendrungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian). b. Tujuan Ekstraksi Tujuan dari ekstraksi adalah untuk menarik semua komponen kimia yang terdapat dalam sampel. Beberapa tujuan ekstraksi ditentukan dalam beberapa keadaan : 1) Senyawa kimia telah diketahui identitasnya untuk diekstraksi dari tumbuhan. Dalam kasus ini, prosedur yang telah di publikasikan dapat

diikuti

dan

dibuat

modifikasi

yang

sesuai

untuk

mengembangkan proses atau menyesuaikan dengan kebutuhan pemakai. 2) Bahan diperiksa untuk menentukan kelompok senyawa kimia tertentu, misalnya terpenoid, alkaloid, flavonoid atau saponin, meskipun struktur kimia sebetulnya atau kromatografi yang sesuai dengan kelompok senyawa tersebut. 3) Sifat senyawa yang akan diisolasi belum ditentukan sebelumnya dengan cara apapun.Situasi ini (umunya dalam program skiring) dapat timbul jika tujuannya adalah untuk menguji organisme, baik yang dipilih secara acak atau didasarkan pada penggunaan tradisional untuk mengetahui adanya senyawa dengan aktivitas biologi khusus. c. Faktor yang Mempengaruhi Ekstraksi Faktor yang banyak mempengaruhi kecepatan penyarian atau proses ekstraksi adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan – lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat yang ada dalam bahan. Simplisia ada yang lunak seperti rimpang, daun, bunga dan ada yang keras seperti biji, kulit kayu, kulit akar. Simplisisa yang lunak mudah ditembus oleh cairan penyari,karena itun pada penyarian tidak perlu di tumbuk sampai halus. Sebaliknya pada simplisia yang keras, perlu dihaluskan terlebih dahulu sebelum dilakukan penyarian. Penyarian disamping memperhatikan sifat fisik simplisia dan sifat zat aktifnya, harus memperhatikan zat- zat yang sering terdapat dalam simplisia se[erti protein, karbohidrat, lemak dan gula. Proses penyarian dapat 8

dipisahkan menjadi pembuatan serbuk, pembasahan, penyarian dan pemekatan. d. Metode ekstraksi Ekstraksi dapat dilakukan dengan cara panas dan cara dingin. Ekstraksi cara panas (cara refluk,soxhlet dan lain-lain) dilakukan jika komponen(senyawa)

yang

akan

diektraksi

tahan

panas(termostabil).Sedangkan untuk ekstraksi dengan cara dingin (maserasi, perkolasi) digunakan inyuk mengekstraksi komponen yang tidak tahan panas (termolabil). Ekstraksi cara dingin juga digunakan untuk simplisia yang belum diketahui komponennya, sehingga belum diketahu kestabilan komponennya. 1) Maserasi Maserasi adalah penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk sampel ke dalam cairan penyari yang sesuai selama tiga hari pada temperature kamar terlindung dari cahaya, cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel. Isis sel akan larut karena adanya perbedaaan konsentrasi antara larutan dalam sel dengan di luar sel.Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari denga n konsentrasi rendah(proses difusi). Peristiwa tersebut berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selama proses maserasi dilakukan pengadukan dan penggantian cairan penyari setiap hari. Endapan yang diperoleh dipisahkan dan filtratnya dipekatkan. 2. Perkolasi Perkolasi adalah penyarian zak aktif ayang dilakukan dengan cara serbuk sampel dimaserasi selama 3 jam. Kemudian sampel dipisahkan kedalam bejana silindar yang bagian bawahnya diberi sekat berpori, cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui sampel tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif dalam sel-sel sampel yang dilalui sampai keadaan jenuh. Gerakan ke bawah disebabkan karena gravitasi, kohesi dan berat cairan di ats dikurangi gaya kapiler yang menahan gerakan ke bawah. Perkolat yang diperoleh di kumpulkan, lalu dipekatkan. 3. Soxhletasi

9

Soxhletasi adalah penarikan komponen kimia yang dilakukan dalam selongsong yang telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa, cairan penyari dipanaskan dalam labu alas bulat sehingga menguap dan dikondensasikan oleh kondensator bola menjadi molekul-molekul.Cairan penyari yang jatuh ke dalam klonsong menyari zat aktif di dalam sampel dan jika cairan penyari telah sampai permukaan sifon, seluruh cairan akan turun kembali ke labu alas bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi. Ekstraksi empurna ditandai bila cairan di sifon tidak berwarna, tidak nampak noda jika di KLT atau sirkulasi telah mencapai 20-25 kali. Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan. 4. Refluks Merupakan penarikan komponen kimia yang diakukan dengan cara sampel dimasukan dalam labu alas bulat bersama-sama dengan cairan penyari lalu dipanaskan.Uap-uap cairan penyari akan berkondensasi pada kondensor bila menjadi molekulmolekul cairan penyari yang akan tutun kembali menuju labu alas bulat, akan menyari kembali sampel yang berada pada labu alas bulat.

Demikian

seterusnya

berlangsung

secara

berkesinambungan sampai penyarian sempurna. Penggantian penyari dilakukan sebanyak 3x setiap 3-4 jam. Filtrat yang diperolah lalau dipekatkan. 5. Destilasi Uap Air Penyarian minyak menguap dengam cara sampel dan air ditempatkan dalam labu berbeda. Air dipanaskan dan akan menguap, uap air akan masuk kedalam labu sampel sambil mengektraksi minyak menguap yang terdapat dalam sampel, uap air dan minyak menguap yang telah terekstraksimenuju kondensor dan akan terkondensasi, lalu akan melewati pipa alonga, campuran air dan minyak menguap akan masuk ke dalam corong pisah dan akan memisah antara air dan minyak menguap. 6. Rotavapor Pemisahan ekstrak dari cairan penyari dengan pemanasan yang dipercepat oleh putaran labu alas bulat, cairan penyari dapat menguap 5-10ᵒC di bawah titik didih pelarutnya disebabkan

10

adanya penurunan tekanan. Dengan bantuan pompa vakum, uapa larutan penyari akan menguap naik ke kondensor dan mengalami kondensasi menjadi molekul-molekul cairan pelarut murni yang ditampung dalam labu alas bulat. e. Pelarut Pemilihan pelarut pada umumnya dipengaruhi oleh faktor-faktor berikut ini : 1) Selektivitas Pelarut hanya boleh melarutkan ekstrak yang diinginkan, bukan komponen-komponen lain dari bahan ekstraksi. 2) Kelarutan Pelarut sedapat mungkin memiliki kemampuan melarutkan ekstrak yang besar. 3) Kemampuan tidak saling bercampur Pada ekstraksi cair-cair pelarut tidak boleh (atau hanya secara terbatas) larut dalam bahan ekstraksi. 4) Reaktifitas Pada umumnya pelarut tidak boleh menyebabkan perubahan secara

kimia

pada

komponen-komponen

bahan

ekstraksi.Sebaliknya dalm hal-hal tertentu diperlukan adanya reaksi kimia)misalnya pembentukan garam) untuk mendapatkan selektivitasa yang tinggi. 5) Titik Didih Karena ekstrak dan pelarut biasanya harus dipisahkan dengan cara pemanasan destilasi atai rektifikasi, maka titik didih kedua bahan tidak boleh terlalu dekat, dan keduanya tidak membentuk azetrop. Syarat pelarut antara lain : 1) Murah 2) tersedia dalam jumlah yang besar 3) tidak beracun 4) tidak dapat terbakar 5) tidak korosif 6) stabil secara kimia dan termis

4. Pemekatan Ekstrak Pemekatan didefinisikan sebagai peningkatan komposisi senyawa terlarut (Solute) dalam pelarutnya dengan metode evoporasi atau vaporasi tanpa

11

mengubahnya menjadi produk kering, meskipun hasil akhir dari proses pemekatan dapat berupa ekstrak dengan viscositas tinggi. Parameter yang mempengaruhi proses pemekatan meliputi jumlah larutan yang

akan dipekatkan dan kstabilan dari zat terlarut. jika

perkirakan zat terlarut yang dikehendaki bersifat termostabil maka pemekatan dapat dilakukan padsa tekanan biasa atau dibawah vakum. zat yang bersifat termostabil harus dipekatkan dengan suhu yang diperkirakan tidak akan mendregadasi zat tersebut. penigkatan tekanan dapat dilakukan agar suhu yang diperlukan untuk menguapkan pelarut dapat diturunkan. Pemekatan dapat dilakukan dengan menggunakan alat rotary evaporator. Rotary evaporator menggunakan prinsip vakum destilasi. Prinsip utama alat ini terletak pada penurunan tekanan sehingga pelarut dapat menguap pada suhu dibawah titik didihnya. rotary evaporator ini lebih di sukai karena mampu menguapkan pelarut dibawah titik didih sehingga zat yang terlarut dalam pelarut tidak rusak oleh suhu tinggi.

5. Fraksinasi Fraksinasi yang dilakukan untuk memisahkan komponen dalam ekstrak berdasarkan kepolaran sehingga setelah diperoleh frksi proses isolasi suatu senyawa dapat dilakukan dengan lebih mudah. Fraksinasi dapat dilakukan dengan metode ekstraksi cair-cair dan kromatografi. Kromatografi adalah teknik pemisahan zat-zat campuran berdasarkan perbedaan migrasi komponen-komponen tersebut dari fase diam oleh fase gerak. Pemisahan ini dilakukan berdasarkan sifat fisika kimia dari molekul. Metode kromatografi yang biasanya digunakan untuk fraksinasi ekstrak adalah Kromatografi Kolom Klasik(KK), Kromatografi Cair Vakum (KCV), Kromatografi Cair Tekanan Menengah (MPLC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Hasil yang diperoleh dari fraksinasi adalah fraksi. a. Kromatografi Kolom

12

Komponen tunggal ditahan pada fase diam berupa adsorben karena telah terikat ketika eluen dialirkan, maka senyawa aliran melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang

berbeda-beda

dalam

melawati

kolom.

Selama

proses

berlangsung akan didapatkan beberapa fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan mengujinya

mengandung fraksi

hasil

senyawa kromatografi

yang kolom

berbeda. dapat

Untuk diamati

menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati lebih lanjut menggunakan KLT. Fraksi dapat diamati lebih lanjut menggunakan spektroskopi. b. Kromatografi Cair Vakum (KCV) Cara kerja KCV ini yaitu kolom kromatografi dikemas kering atau biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum ditentukan pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lai. Kolom dipisah sampai kering dan siap dipakai.

c. Ekstraksi Cair-Cair Pemisahan zat-zat terlarut antara dua cairan yang tidak saling mencampur antara lain menggunakan alat corong pisah. Ada suatu jenis pemisahan lainnya dimana pada satu fase dapat berulang-ulang dikontakkan dengan fase yang lain, misalnya ekstraksi berulang-ulang suatu larutan dalam pelarut air dan pelarut organik, dalam hal ini digunakan suatu alat yaitu ekstraktor sokshlet. Metode sokshlet merupakan metode ekstraksi dari padatan dengan solvent (pelarut) cair secara kontinu. Alatnya dinamakan sokshlet (ekstraktor sokshlet) yang digunakan untuk ekstraksi kontinu dari sejumlah kecil bahan. Ekstraksi cair-cair (liquid extraction, solvent extraction): solute dipisahkan dari cairan pembawa (diluen) menggunakan solven cair. Campuran diluen dan solven ini adalah heterogen ( immiscible, tidak saling campur), jika dipisahkan terdapat 2 fase, yaitu fase diluen

13

(rafinat) dan fase solven (ekstrak). Perbedaan konsentrasi solute di dalam suatu fasadengan konsentrasi pada keadaan setimbang merupakan pendorong terjadinya pelarutan (pelepasan) solute dari larutanyang ada. Gaya dorong (driving force) yang menyebabkan terjadinya proses ekstraksi dapatditentukan dengan mengukur jarak system dari kondisi setimbang. Fase rafinat = fase residu, berisi diluen dan sisa solut. Fase ekstrak = fase yang berisi solut dan solven Proses fraksinasi ekstrak secara ekstraksi cair-cair dilakukan berdasarkan koefisien partisi senyawa diantara dua pelarut yang digunakan dengan syarat pelarut pertama tidak saling bercampur. Pada

suatupustaka

koefisien

partisi

dinyatakan

berdasarkan

perbandingan konsentrasi senyawa dalam rafinat dan ekstraktan, sedangkan pada pustaka lain berdasarkan konsentrasi senyawa pada fase atas dan fase bawah.

6. Pemantauan Ekstrak dan Fraksi menggunakan KLT Pemantauan ekstrak dilakukan untuk mengetahui komponen yang ada dalam ekstrak. pematauan ekstrak dilakukan denga metode diantaranya Kromatografi lapis Tipis (KLT) dan atau Kromatografi kertas. Proses/ mekanisme yang terjadi pada KLT adalah adsorpsi, sedangkan pada Kromatogarfi kertas adalah partisi. penyanggayang dapat digunakan pada KLT adalah kaca, palstik dan aluminium. Fase diam/ penyerapan yang digunakan pada KLT Silica Gel, alumina, kielselgur dan selulosa. Penjerap yang paling banyak digunakan pada KLT adalah Silica Gel. Penyangga yang diguanakan pada kromatografi kertas untuk analitik adalah kertas whatman No. 1 yang berperan sebagai fase diam pada kromatografikertas pada lapisan tipis cairan yang ada penyangga. Fase gerak yang diguanakan

ada kromatografi kertas antara lain BAW,

Forestal, dan asm asetat dengan berbagai konsentrasi.

14

Fase gerak atau pengembang yang digunakan bergantung kepada kepolaran komponen yang dipisahkan, pengembang dapat berupa pelarut berupa campuran atau tunggal dua pelarut atau lebih. Kromatografi lapis tipis umumnya digunakan untuk senyawa yang kurang polar , sedangkan kromatografi kertas digunakan untuk komponen yang polar. Sebagai panduan untuk melihat bercak yang akan di amati/diisolai digunakan penampak bercak sinar lampu UV panjang gelombang 254 nm dan 365nm atau dapat diguanakan penampak bercak semprot umum atau universal (H2so4 10 % dalam methanol) atau dapat pula diguanakan peneampak bercak spesifik untuk golongan senyaewa tertentu fecl3 10% untuk senyawa fenol, Alcl3 5% dalam methanol untuuk yang lainnya.

7. Isolasi Pemurnian

adalah

pencemarnya

atau

suatu

proses

memurnikan

pemisahan suatu

sejumlah

campuran

zat

larutan

dari untuk

mendapatkan zat-zat yang murni. Subfraksi yang diperoleh dari fraksinasi dan masih mengandung dua atau lebih komponen dapat dimurnikan dengan berbagai metode pemurnian. Setelah diperoleh satu komponen, maka dapat dilakukan uji kemurnian isolat yang dilakukan dalam beberapa tahap uji. Pemurnian dapat dilakukanj diantaranya dengan metode rekistralisasi, pengendapan, sublimasi, kromatografi lapis tipis preparative, kromatografi kertas preparatif dan metode lainnya. a. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Salah satu metode pemisahan yang memerlukan biaya yang paling murah

dan

memakai

peralatan

paling

dasar

yaitu

KLT

preparatif.Walaupun KLT dapat memisahkan bahan dalam jumlah gram, sebagian besar besar pemakaiannya hanya dalam jumlah milligram.KLT preparatif bersama-sama dengan kromatografi kolom

15

terbuka, masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahan alam,terutama dari laboratorium yang tidak lengkap dengan cara pemisahan modern. 1) Penyerap Berbagai penelitian telah dilakukan untuk memeriksa pengaruh dari ketebalan penyerap terhadap kualitas dari pemisahan. Ketebalan yang banyak dipakai adalah 0,5-2 mm.Ukuran plat kromatografi biasanya 20x20 cm atau 20x40 cm.Pembatasan ketebalan ukuran lapisan dan plat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT preparatif.Penyerap paling umum ialah silica gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofilik untuk pembuatan lapisan tanpa retak dianjurkan memakai penyerap niaga yang tersedia.Ukuran partikel dan porinya kurang lebih sama dengan ukuran tingkat mikro KLT. Plat KLT preparatif dapat dibuat sendiri atau dibeli dengan sudah terlapisi penyerap(biasanya disebut plat siap pakai atau plat pralapis).Keuntungan membuat plat sendiri ialah bahwa ketebalan dan sususnan lapisan dapat kita atur sendiri.Pembuatan lapisan penyerap yang diperlukan dapat dikerjakan dengan memakai salah satu dari alat penyaput niaga yang bnyak jenisnya, misalnya dari

camay,

desaga

dan

sebagainya.Petunjuk

pemakaian

penyerap biasanya terdapat pada kemasan penyerap yang bersangkutan 2) Penotolan Cuplikan Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLT preparatif.Pelarut yang baik adalah pelarut dari heksana,diklorometana,etil

asetat,

karena

jika

tidak

terjadi

pelebaran pita.Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10%.Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin Karena pemisahan bergantung dari lebar pita.Penotolan dapat dilakukan dengan tangan(pipa kapiler) tetapi lebih baik dengan penotolan otomatis(camay,desaga,dsb).Untuk pita yang terlalu lebar, dapat dilakukan dengan cara pengembang pelarut polar sampai kira-kira 16

2 cm di atas tempat totolan.Kemudian dikeringkan dan dielusi dengan pelarut yang diinginkan.Plat pelapis khusus dengan daerah pemekatan dapat dibeli. b. Isolasi Senyawa yang Sudah Terpisah Kebanyakan

penyerap

KLT

preparatif

mengandung

indicator

flouosensi yang membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap UV. Akan tetapi beberapa indicator menimbulkan masalh bereaksi dengan asam, kadang-kadang asam asetat. Untuk senyawa yang tidak menyerap UV ada beberapa pilihan: 1) Menyemprot dengan air (misalnya saponin) 2) Menutup plat dengan sepotong kaca lalu menyemprot salah satu sisi dengan pereaksi 3) Menambahkan senyawa pembanding Pita yang kedudukannya telah diketahui lalu dikerok dari plat dengan spatula atau pengerok berbentuk tabung yang disambungkan ke pengumpul vakum.Cara terakhir tidak dapat dilakukan untuk senywa yang peka karean penyerap yang mengandung mengandung senyawa yang sudah murni apabila terus menerus terkena aliran udara dan resiko terkena otooksidasi selalu ada.Cara mengumpulkan manapun yang dipakai, senyawa harus diekstraksi dari penyerap dengan pelarut yang paling kurang polar yang mungkin(sekitar 5 ml pelarut untuk 1 gram penyerap).Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penyerap maka makin besar kemungkinan penguraian.Ekstrak disaring melalui “frit” kaca berpori 0,2-0.45 nm.

8. Uji Kemurnian Kromatografi lapis tipis (KLT), yang dikenal juga denga nama Thin Layer Chromatography atau TLC adalah salah satu alat pemisah dan alat uji senyawa kimia secara kualitatif dan kuantitatif (Moffat, 1986). Senyawa yang dapat diuji berupa senyawa tunggal maupun campuran dari produk pabrik, hasil sintetis, isolasi dari hewan percobaan, maupun dari tanaman

17

dan

mikroorganisme.

penggunaannya,

murah

Alat

ini

dan

merupakan

selektif,

alat

walaupun

yang

mudah

sekarang

telah

dikembangkan. Pengembangan KLT meliputi perkembangan teknologi karena alat pembuat lapisan tipis, jenis fase diam, alat penotol, alat pelacak bercak sudah dapat dilakukan secara otomatis. a. KLT 2 Dimensi Merupakan salah satu metode untuk mengetahui kemurnian suatu senyawa dari hasil isolate, yang dimaa bertujuan untuk meningkatkan resoles sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama karena nilai Rf juga hampir sama sebagaimana asam-asam amino. Salah satu aplikasi untuk mengetahui kemurnian senyawa hasil isolat dengan metode ini yaitu dengan

mengelusi

noda

pada

2

arah

yang

berbeda

dan

menggunakan eluen yang berbeda, isolat dikatakan murni apabila noda yang dinampakkan adalah tunggal. Selain itu 2 sistem fase gerak yag sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan, sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda. KLT dua arah adalah cara yang memungkinkan pemakaian lapisan fase diam yang luas untuk memisahkan campuran yang banyak mengandung komponen. Selain itu, dua system pelarut yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada campuran tertentu, jadi

memungkinkan

pemisahan

campuran

yang

mengandung

komponen yang kepolarannya sangat berbeda. Ekstrak ditotolkan dan dielusi seperti pada KLT nominal kemudian diputar 90 derajat untuk pengembangan kedua. Penyerap umum yang digunakan adalah silica gel, aluminium oksida, kiselgur, selulosa dan turunannya, poliamida, dan lain-lain. Silica gel adalah penyerap umum yang banyak digunakan karena mempunyai daya pemisahan yang baik, hal ini telah diseleksi oleh stahl untuk pertama kali 1958. Salah satu aplikasi untuk mengetahui kemurnian senyawa hasil isolate dengan metode ini yaitu dengan mengelusi noda pada 2 arah yang berbeda dan menggunakan eluen yang berbeda. Isolate dikatakan murni apabila noda yang dimampatkan adalah tunggal. 18

b. Multi Eluen Multieluen merupakan penggunaaneluen atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit dengan berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda. Prinsipnya “like dissolve like” yag dapat digunakan untuk pemilihan pelarut dalam menentukan jenis senyawa kimia yang mungkin terekstraksi dan organisme. Dimana pelarut non polar akan mengekstraksi senyawa-senyawa non-polar serta dapat juga digunakan untuk menganalisis kemurnian suatu isolat/senyawa kimia yang diperoleh dari hasil isolasi da bahan alam. KLT multieluen adalah penggunaan eluen atau fase gerak yang memungkinkan

pemisahan

analit

dengan

berdasarkan

tingkat

polaritas yang berbeda. Dalam multieluen, setelah pengembang tunggal naik, kromatografi diagkat dari chamber dan dikeringkan, biasanya selama 5-10 menit. Kromatografi tersebut kemudian dielusi lagi dalam eluen segar dari pelarut yang sama dalam arah yang sama untuk jarak yang sama. Proses ini, yang dapat diulang berkali-kali, meningkatkan resolusi komponen dengan nilai Rf bawah 0,5. Beberapa pengembang dilakukan dengan pelarut yang berbeda dalam arah sama, masing-masing yang menjalankan jarak yang sama atau berbeda, disebut elusi bertahap. Sebuah fase kurang polar dapat digunakan pertama, diikuti oleh fase yang lebih polar atau sebaliknya. Pemindahan material non-polar kebagian atas lapisan, meninggalkan zat terlarut polar terganggu darimana dia berasal. Setelah kering, zat terlarut polar, dipisahkan oleh pengembang dengan eluen. Multieluen adalah untuk mendapatkan resolusi yang baik dari hasil KLT. Memfokuskan zona pemisahan multieluen, cocok digunakan untuk sampel yang memiliki noda dengan nilai Rf dibawah 0,5. Sampel disentrifuge terlebih dahulu dengan menggunakan methanol pro analisis sebab untuk menjamin kemurnian senyawa. Sebab, methanol pro analisis merupakan pelarut yang khusus digunakan untuk analisis dan bebas dari pengotor. Berbeda dengan methanol teknis yang bisa saja mengandung pengotor seperti plastisizer dari wadah yang digunakan untuk menampung pelarut. Agar seluruh area lempeng dapat digunakan sehingga senyawa yang masih menumpuk dalam satu noda, dapat terelusi kembali melalui sisi lempeng yang lain. 19

BAB II METODOLOGI PENELITIAN A. Langkah Umum Simplisia

Penapisan Ekstraksi EkstrakFraksinasi Isolasi/Pemurnian Fraksi Pemurnian Isolat Uji kemurnian Uji identitas /Karakterisasi Identitas isolat B. Alat, Bahan & Cara Kerja 1. Penapisan Fitokimia Alat: -

Bahan ; Mortir dan Stamper  Simplisia Daun Kemuning Tabung reaksi dan rak  Ammonia 25%  Kloroform tabung  Pereaksi dragendroff, Beaker Glass Corong Pisah bouchardat Gelas Ukur  Pereaksi asam silikowlframat Pipet Tetes  Pereaksi mayer, asam Kaca Arloji fosfomolibdat

a. Alkaloid 2 gram sampel Ditambah ammonia 25% (Digerus) Ditambah kloroform (Digerus)

20

1) Diteteskan dikertas saring ditambah dragendroff 2) ECC dengan HCl 10% 20 kali - Fase kloroform Fase Air

-

(+) Dragendroff Merah

(+) Mayer Putih

Dimasukkan 2 gram sampel kedalam beaker gelas + 100 ml aquadest Kemudian dididihkan selama 5 menit Disaring, diambil filtrate b. Flavonoid 5 ml sampel + serbuk Mg + 2 ml HCl Dikocok dengan 10 ml amil alkohol Positif (+) kuning Jingga c. Kuinon 5 ml sampel + Larutan NaOH 1 N untuk penegasan + Larutan gelatin 1%

d. Tanin 5 ml sampel + Larutan FeCl3 1% untuk penegasan + Larutan gelatin + Pereaksi steassny e. Saponin 5 ml sampel Dikocok 10 menit terbentuk busa Ditetesi HCl 2N 1 tetes f.

Steroid/Triterpenoid Simplisia 1 gram + 20 ml eter maserasi Diuapkan + asam asetat anhidrat + H2SO4 (+) Terbentuk warna hijau/ungu/ biru

2. Ekstraksi Metode Maserasi 21

Alat: -

Beaker glass 500 ml Selopan Batang Pengaduk

Bahan ; - Simplisia daun Kemuning -

yang sudah di keringkan Ethanol 96% Kertas Saring

Siapkan alat maserasi Timbang simplisia kemuning Masukan simplisia(250 gram daun kemuning) ke dalam alat maserasi Biarkan selama 24 jam Tampung ekstrak di penampung kemudian ulangi ekstraksi hingga didapat ekstraks cair uang tidak berwarna(proses diulangi 3x) Ekstrak cair disatukan lalu dipekatkan dengan rotary evaporator Hitung rendemen ekstrak 3. Pemekatan dan Pemantauan Ekstrak Alat: - Sinar UV 254nm dan 365 nm - Plat KLT - Bejana KLT - Kertas Whatman - Pipa Kapiler - Penggaris Besi - Rotary Evaporator

Bahan ; - Ekstrak/Fraksi - Pembanding/standar Kumarin - Pelarut (Ethanol) - NaOH 10% dalam Methanol - H2SO4 10% dalam Methanol - N-Hexana - Etil Asetat

a. Pemekatan Ekstrak Sample atau ekstrak cair yang ingin di uapkan di masukan kedalam labu alas bulat dengan volume 2/3 bagian dari volume labu alas bulat yang digunakan. ↓ kemudian waterbath di panaskan sesuai dengan suhu pelarut yang digunakan. ↓ setelah suhu tercapai, labu alas bulat yang telah terisi sample atau ekstrak cair di pasang dengan kuat pada ujung toror yang menghubungkan dengan kodensor. ↓

22

aliran air pendingin dan pompa vakum di jalankan, kemudian tombol rotor diputar dengan kecepatan tertentu (5-8 putaran). ↓ Proses penguapan ini dilakukan hingga memperoleh ekstrak yang ditandai dengen terbentuknya gelembung- gelembung udara yang pecah pada permukaan ekstrak atau jika sudah tidak ada lagi pelarut yang menetes pada alas bulat penampung. ↓ Setelah proses penguapan selesai, Rotary Evaporator di hentikan dengan cara terlebih dahulu dilakukan pemutaran tombol rotor ke arah nol ( menghentikan putaran rotor ) dan temperatur pada watherbath di nol kan. ↓ Pompa vakum di nol kan, kemudian pompa labu alas bulat di keluarkan setelah sebelumnya kran mengetur tekanan pada ujung kondensor di buka b. Pemantauan Ekstrak siapkan bejana KLT (chamber) lapisi bejana dengan kertas saring siapkan eluen/ fase gerak /pengembang (n-Hexana: Etil Asetat 7:3 ) masukkan eluen dalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana penuh dengan uap eluen ekstrak kental dilarutkan dalam beberapa ml pelarut, sampai dipeloreh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer totolkan botol ekstrak biarkan mengering (pelarut menguap) masukkan pelat di totolkan kedalam bejana (perlahan:tinggi permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah daripada totolan bercak, jangan sampel terendam oleh pengembang) biarkan eluen/ fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir plat angkat plat, biarkan plat mengering (pelarut menguap) Lihat warna bercak secara visual atau dibawah lampu uv, untuk kumarin berflouresensi dan di semprot dengan penampak bercak

23

NAOH 5% dalam etanol atau penampak bercak universal H2SO4 10%dalam Methanol. 4. Fraksinasi Alat: -

Bahan ; - Ekstrak/Fraksi - Pelarut (aquadest) - Kertas saring - Kapas bebas lemak

Beaker glass 250 ml Batang pengaduk Hot Plate Corong

a. Pengendapan Klorofil Ekstrak dilarutkan dengan air \ kemudian didihkan

Saring dengan kertas saring Residu dianggap sebagai klorofil Ambil filtratnya sebagai kumarin.

b. Ekstraksi Cair-Cair Alat:  

Bahan ;  Ekstrak pekat  Pelarut 1 / Ekstraktan (n-

Corong pisah Pipet tetes

24



Hexana) Pelarut

 

Rafinat (Methanol) Kertas Saring Kapas bebas lemak

ekstrak

kental/

Ekstrak Pekat

Ekstrak Cair

Ekstraksi dengan pelarut non polar n-Hexana 25 ml

Fraksi Methanolair

Fraksi n-Hexana

Ekstraksi dengan 5. Pemantauan Fraksi 25 ml etil asetat Alat: Bahan ; - Sinar UV 254nm dan 365 - Ekstrak dari 3 fraksi (metannol, -

nm Plat KLT Fraksi Metanol-air Bejana KLT Pipa Kapiler Penggaris Besi Pensil

-

etil asetat, n-hexane) Pembanding/standar Kumarin Fraksi etil asetat Endapan Klorofil Pelarut (Ethanol) NaOH 10% dalam Methanol H2SO4 10% dalam Methanol N-Hexana Etil Asetat

Disisapkan fraksi – fraksi yang akan dipantau Disiapkan bejana KLT Disiapkan eluen/fase gerak, dimasukkaan dalam chamber, tutup rapat Totol fraksi yang di uji menggunakan pipa kapiler biarkan totolan mengering

25

Masukkan plat yang telah ditotolkan kedalam bejana Biarkan fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir plat Angkat plat, keringkan Lihat warna bercak secara vissual pada lampu UV, jika bercak tidak terlihat semprot dengan penmpak bercak spesifik NAOH 10% dalm methanol atau universal H2SO4 10% dalam methanol.

6. Fraksinasi 2 (Sub Fraksi) Alat:  Seperangkat alat   

Bahan ;  Hasil Fraksinasi 1 (Fraksi)

Kromatografi Kolom Klasik Vial Pipet Tetes Batang Pengaduk



Pekat Eluen (n-Heksan:etil asetat



3:2) Kapas Bebas Lemak Serbuk Silika Gel

Disiapkan botol vial 30 ml

Timbang ekstrak 3g kental larutkan dalam sedikit eluen/pelarut.

Timbang silica gel H 15,7 gram, masukkan ke sebagian eluen, lumpuran adsorben. Sumbat ujung kolom dengan kapas bebas lemak Masukkan eluen ke kolom, biarkan kran terbuka. Hingga eluen turun. Masukkan lumpuran adsorben ke kolom sampai diperoleh adsorben padat. 26

Turunkan eluen ad lapisan tipis permukaan eluen di atas permukaan adsorben. Tutup kran Masukkan larutan ekstrak di atas permukaan adsorben Buka kran, eluen akan turun. Eluen di atas permukaan adsorben jangan kering Tampung fraksi-fraksi pada botol vial Fraksi-fraksi diperhatikan dan ditimbang Lakukan pemantauan fraksi dengan KLT 7. Pemantauan Fraksi 2 Alat: - Sinar UV 254nm dan 365 -

nm Plat KLT Bejana KLT Penggaris Besi Pipa kapiler

Bahan ; - Fraksi Methanol - Pembanding/standar Kumarin - Fase gerak (Toluene : Etil -

asetat 3: 2) Penampak

-

NaOH 10%dalam Methanol Penampak bercak universal

-

H2SO4 10% dalam methanol Kertas Saring

Bercak

Spesifik

Disiapkan fraksi – fraksi yang akan dipantau 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29 Disiapkan bejana KLT Disiapkan eluen/fase gerak Toluen : Etil asetat 3:2, dimasukkaan dalam chamber, tutup rapat

27

Totol fraksi yang di uji menggunakan pipa kapiler biarkan totolan mengering Masukkan plat yang telah ditotolkan kedalam bejana Biarkan fase gerak naik sampai sekitar 2 cm sebelum pinggir plat Angkat plat, keringkan Lihat warna bercak secara vissual pada lampu UV, jika bercak tidak terlihat semprot dengan penmpak beercak spesifik NAOH 10% dalm methanol atau universal H2SO4 10% dalam methanol. 8. Pemurnian Alat:  Plat KLT preparatif  Bejana KLT  Penampak bercak sinar UV  Pipa kapiler  Botol penyemprot  Alat pengerok  Vial

Bahan ;  Pelarut (n-heksan : etil asetat 

6:4) Kertas saring

Siapkan chamber(bejana KLT),Lapisi bejana dengan kertas saring Masukan eluen yang sudah disiapkan ke dalam bejana, tutup rapat dan biarkan bejana jenuh Sejumlah subfraksi kental dilarutkan dalam beberapa ml pelarut,sampai diperoleh ekstrak yang tidak terlalau kental dan tidak terlalu pekat Totolkan dengan pipa kapiler pada plat KLT preparatif secara tidak terputus(tebal pita maks. 5 mm), biarkan mongering Masukan plat yang sudah ditiotolkan dalam bejana,pelarut harus lebih rendah dari totolan pada plat KLT Biarkan eluen naik hingga batas bejana Angkat plat biarkan mongering 28

Fraksi-fraksi diperhatikan dan ditimbang

Lihat warna pita dibawah UV.Jika pita tidak berwarna atau berfloruosensi di bawah UV,semprot salah satu pinggir plat dengan penampak bercak universal asal sulfat 1-% dalam methanol (pada saat menyemprot bagian pinggir, tutup bagian tengah) Kerok pita senyawa yang diisolasi,kumpulkan pada wadah Masukan pelarut ke dalam wadah yang berisi kerokan pita,diaduk sehingga senyawa yang akan diisolasi larut sedangkan serbuk silica tidak larut Saring dengan kertas saring,sehingga silica tertahan di kertas saring Ulangi penyaringan berkali-kali hingga tidak terdapat partikel silica gel dalam larutan senyawa 9. Uji Kemurnian Alat: - Sinar UV 254nm dan 365 -

a.

nm Plat KLT Bejana KLT Penggaris Besi Pipa kapiler

Bahan ; - Fraksi Methanol - Pembanding/standar Kumarin - Fase gerak Rf Bawah (n-

Hexana : Etil 7 : 3) Fase gerak Rf tengah (Toluene

-

: Etil asetat 3:2) Fase gerak Rf atas (Etil asetat:

-

Methanol 9:1) Penampak Bercak

-

NaOH 10%dalam Methanol Penampak bercak universal

-

H2SO4 10% dalam methanol Kertas Saring

Spesifik

KLT Pengembangan Tunggal siapkan bejana (chamber), lapisi dengan kertas saring siapkan plat KLT dengan ukuran 1,5x5 cm siapkan eluen/fase gerak ke 1 (pelarut tunggal/campuran) masukkan eluen 1 kedalam bejana dan tutup rapat. Biarkan bejana jenuh dengan uap eluen

29

sejumlah isolat dilarutkan dalam beberapa ml pelarut, sampai diperoleh larutan yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer totolkan pada plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler sebanyak dua totolan pada satu plat KLT biarkan totolan mengering masukkan plat KLT yang sudah ditotolkan kedalam bejana (tinggi permukaan eluen dalam bejana harus lebih rendah daripada totolan bercak) biarkan eluen/fase gerak naik hingga batas atas dari penanda lempeng KLT (kurang lebih 0,5-1 cm) angkat plat KLT, biarkan pelarut menguap lihat warna bercak secara visual atau dibawah lampu UV. Jika bercak tidak berwarna atau berfluorosensi dibawah lampu UV, bagi plat menjadi 2 bagian (masing-masing terdapat 1 totolan) masing-masing plat semprot dengan penampak bercak NaOH 5% dan H2SO4 10% lihat warna bercak dibawah sinar UV 366 nm lakukan lagi hal yang sama dengan menggunakan plat yang baru dan menggunakan 2 eluen berbeda yang telah disiapkan isolate kemungkinan murni jika bercak pada ketiga macam eluen hanya menunjukkan 1 bercak b. KLT 2 Dimensi Sejumlah isolate dilarutkan dalam beberapa ml pelarut sampai diperoleh larutan yang tidak terlalu kental dan tidak terlalu encer Totolkan larutan pada plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler Biarkan totolan mengering (pelarut menguap) Masukkan plat kedalam bejana (tinggi eluen harus berada dibawah totolan pada plat KLT) Biarkan eluen/fase gerak naik hingga batas atas yang sudah diberi tanda pada plat KLT, sekitar 0,5 cm

30

Angkat plat KLT, biarkan mengering (pelarut menguap) Lihat warna bercak secara visual kemudian dilihat dibawah lampu UV Kemudian putar plat 90 derajat (tegak lurus) Lakukan hal yang sama dengan menggunakan plat KLT yang sama dengan eluen ke 2 (eluen ke 2 lebih polar daripada eluen 1, bisa diganti komposisi atau diganti pelarut lain) Jika bercak tidak berwarna atau berfluorosensi dibawah lampu UV, semprot dengan penampak bercak universal H2SO4 10% dalam methanol, lalu lihat dibawah lampu UV Isolate kemungkinan murni jika kromatogram pada kedua macam eluen fase gerak hanya menunjukkan 1 bercak

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Pengamatan 1. Penapisan Fitokimia Penapisan Fitokimia Senyawa Alkaloid Flavonoid Kuinon Tanin Saponin Steroid/Triterpenoid Keterangan : (-) = Negatif (+) = Positif

Hasil Untuk Simplisia Daun Kemuning (+) (+) (-) (+) (+) (+)

31

NO 1.

Senyawa Alkaloid

Percobaan Sampel (+) ammonia 25% (+)

Hasil (-) Terbentuk 2 fase

diklormetan Diteteskan kekertas saring ECC HCl 10% Fase Air

bening dan agar

- (+) dragendroff - (+) Mayer 2.

3.

Flavonoid

Kuinon

Sampel 5 ml (+)serbuk Mg (+)

(+) Terbentuk warna

2 ml HCl Dikocok dengan amil alcohol

kuning pada lapisan

Sampel 5 ml(+) larutan NaOH

alasnya. (-) T.A.P warna

1N (+) larutan gelatin 1%

(Harusnya warna

4.

Tanin

Sampel 5 ml (+) larutan FeCl3

merah) (-) T.A.P dan tidak

5.

Saponin

1% (+) larutan gelatin 1% Sampel 5 ml, dikocok 10 menit

ada endapan (+) Ada busa sedikit

6.

Steroid

(+) HCl 2N, 1 tetes 1 gram sampel (+) 20 ml eter Maserasi 2 jam, disaring 5 ml Filtrat dalam cawan, diuapkan

(+) warna Hijau Pekat

(+) Pereaksi LB : -

7.

Kumarin

2 tetes asam asetat

anhidrat - 1 tetes H2SO4 Sampel terbentuknya

(+) Flouresensi Biru

didalam tabung reaksi (+) aqudest ditutup kertas saring ditetesi NaOH saring

kertas

UV 366 nm

2. Ekstraksi Dari hasil praktikum yang telah dilakukan yaitu ekstraksi daun kemuning didapatkan ekstrak berupa maserat yang berasal dari maserai daun kemuning dengan pelarut etanol. 3. Pemekatan Ekstraksi a. Harga RF pada visualisasi UV 254 - Sampel

32

 Bercak 1 Rf : 2,9 cm/4 cm =0,725  Bercak 2 Rf :0,9 cm/4 cm = 0,225 - Baku Pembanding  Barcak 1 Rf : 1 cm/4cm= 0,25  Bercak 2 Rf: 0,4cm/4cm = 0,1 b. Rendemen Ekstrak Berat Simplisa = 100 gram Berat ekstrak = 3 gram %Rendemen = Ekstrak Pekat/Berat Simplisia x 100% % Rendemen = 3 g/100 g x 100% =3% 4. Fraksinasi Dari hasil Fraksiasi dengan ECC didapat kan 3 fraksi yaitu fraksi methanolair,etil asetat dan n-heksan. 5. Pemantauan Fraksi Fase Diam : Silika gel GF 254 Fase Gerak : Toluene : Etil asetat (3:2) a. Harga RF pada visualisasi UV 254 RF Ekstrak =

2.6 cm 5 cm

=0,52 cm

RF Ekstrak =

2.6 cm 5 cm

=0,52 cm

RF Ekstrak =

2.6 cm 5 cm

=0,52 cm

6. Sub Fraksi (Fraksinasi 2) Fase Diam : Silika Gel Tinggi Kolom Diameter Kolom

= π xr2xt = 3,14 x 0,52 x 20cm = 15,7 cm3 ~ 15,7 g = 20 cm = 1 cm

7. Pemantauan Sub Fraksi (Fraksi 2) Eluen : Toluen:Etil asetat (3:2) Fase diam : Silika gel Fase Gerak : Toluen:Etil asetat (3:2) Penampak bercak spesifik : NaOH 5% a.

Nilai Rf

=

Rf standar Plat

Jarak yang ditempu h sampel Jarak yang ditempu h eluen I

=

3 cm 5,8 cm

= 0,51

33

Rf fraksi 4

=

3 cm 5,8 cm

= 0,51 b.

Rf standar Plat II

=

3 cm 7 cm

= 0,42 Rf fraksi 5

=

3 cm 7 cm

= 0,42 8. Pemurnian a.Perhitungan nilai Rf fraksi 5 jarak yang ditempuh subtansi Rf = jarak yang ditempuh eluen Fase diam Fase gerak

= : :

Penampak bercak

:

4.5 cm/8 cm =0,52 (pita tengah) silika gel toluene :etil asetat 6 : 4 NaOH 5 % UV 366 nm (floruosensi biru)

9. Uji Kemurnian

Plat KLT Rf dibawah Plat KLT Rf ditengah -

Pelarut untuk harga Rf dibawah n-heksan : etil asetat (7:3) Harga Rf =

-

0,5 4,1

=0,12

Pelarut untuk harga Rf ditengah toluene : etil asetat (6:4) Harga Rf =

-

Plat KLT Rf diatas

2,5 4

=0,625

Pelarut untuk harga Rf diatas etil asetat : methanol (9:1) Harga Rf =

0,5 4,1

=0,8125

34

B. Pembahasan 1. Penapisan Fitokimia Pada praktikum kali ini mengenai penapisan fitokimia atau skrinning fitokimia untuk simplisia daun kemuning. Dimana salah satu pendekatan untuk penelitian tumbuhan obat adalah penapisan senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman. Penapisan fitokimia atau skrinning fitokimia dilakukan untuk mengetahui adanya golongan senyawa yang terdapat dalam suatu sampel (simplisia, ekstrak, fraksi, subfraksi dan isolat) yang meliputi pemeriksaan golongan alkaloid, flavonoid, kuinon tanin, saponin dan steroid/triterpenoid. Hal ini dilakukan sebagai informasi awal dalam mengetahui senyawa kimia apa saja yang mempunyai aktivitas biologi dari suatu tanaman. Tanaman yang digunakan dalam penapisan fitokimia ini adalah daun kemuning (Murraya paniculata ). Daun kemuning merupakan salah satu tumbuhan obat-obatan dan banyak digunakan baik dalam bentuk tunggal maupun

campuran

dengan

bahan

kimianya.

Beberapa

literatur

menyatakan bahwa kandungan kimia dalam daun kemuning adalah alkaloid, flavonoid, tanin dan steroid. Selain itu, daun kemuning juga mengandung senyawa kumarin, kuinon dan saponin. Untuk pemeriksaan golongan alkaloid, daun kemuning memberikan hasil yang positif. Hal ini sesuai dengan literatur yang menyebutkan bahwa tanaman daun kemuning mengandung senyawa alkaloid. Hasil yang didapat sesuai karena telah sesuai atau sama dengan literatur dengan apa yang telah dipraktikumkan. Sehingga hasilnya didapatkan positif mengandung alkaloid. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan senyawa flavonoid, kuinon, tanin, saponin dan steroid/triterpenoid. Sebelum dilakukan pemeriksaan, simplisia

dibuat

(mendidihkan

dalam

bentuk

ekstrak

dengan

cara

merebus

selama 5 menit) 2 gram sampel simplisia yang

ditambahkan dengan 100 ml aquadest, kemudian disaring dan diambil filtratnya sebanyak 5 ml untuk masing-masing pemeriksaan. Dari pemeriksaan senyawa flavonoid, saponin, tanin, steroid/triterpenoid tanaman daun kemuning memberikan hasil yang positif (+). Hal ini sesuai 35

dengan teori yang ada/literatur yang ada. Tetapi untuk kandungan senyawa kuinon tanaman daun kemuning ini memberikan hasil yang negatif (-) sehingga dari tanaman daun kemuning yang digunakan dalam praktikum ini mempunyai kandungan senyawa kimia alkaloid, flavonoid, tanin, steroid/triterpenoid dan saponin. a. Saponin Adanya saponin ditandai dengan timbulnya busa setelah pengocokan dengan akuades panas dan busa konstan selama 15 menit. Busa tersebut terbentuk karena adanya gelembung-gelembung udara yang terjebak dalam larutan. Saponin merupakan zat yang memiliki senyawa aktif permukaan dan bersifat seperti sabun sehingga pengenalannya dapat dilakukan dengan mudah. Berikut reaksinya :

Saponin merupakan komponen lipida polar yang bersifat ampifilik (memiliki gugus hidrofilik dan gugus hidrofobik). Di dalam sistem cair, lipida cair secara spontan terdispersi membentuk misel dengan ekor filik yang bersinggungan dengan medium cair. Misel tersebut dapat mengandung ribuan molekul lipida. Lipida cair membentuk suatu lapisan dengan ketebalan satu molekul yaitu lapisan tunggal. Pada sistem tersebut, ekor hidrokarbon terbuka sehingga terhindar dari air dan lapisan hidrofilik memanjang ke air yang bersifat polar, sistem inilah yang disebut dengan busa. b. Flavonoid Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil. Oleh karena itu, umumnya flavonoid larut dalam pelarut polar seperti metanol. Metanol berfungsi sebagai pembebas flavonoid dari bentuk garamnya, kemudian ditambahkan asam sulfat 2N, asam sulfat berfungsi untuk protonasi flavonoid sehingga terbentuk

garam

flavonoid.

36

Setelah

itu

ditambahkan

bubuk

magnesium. Hasil positif ditunjukkan dengan larutan berubah warna menjadi orange. Reaksi yang terjadi dapat dilihat dari reaksi berikut:

c. Alkaloid Uji alkaloid bertujuan untuk mengetahui apakah pada simplisia kemuning

mengandung

golongan

senyawa

alkaloid.

Alkaloid

merupakan senyawa nitrogen heterosiklik vyang bersifat polar, sedikitnya mengandung sebuah N dalam cincin. Kemuning yang sudah dihaluskan dilarutkan dalam ammonia, yang bertujuan untuk melarutkan senyawa alkaloid agar dapat terpisah dari simplisia. Alkaloid yang bersifat polar akan larut dalam amonia yang juga bersifat polar. Hal ini sesuai dengan prinsip “like dissolve like”. Amonia digunakan sebagai pelarut karena amonia mangandung atom N dimana alkaloid juga mengandung atom N sehingga kelarutannnya menjadi lebih besar. Selain itu, amonia juga berfungsi untuk memutus ikatan glikosida pada alkaloid. Ikatan glikosida adalah ikatan karbon dioksida (1 karbon dalam atom) dimana 1 karbon terikat pada 2 gugus OR dan cara pemutusan ikatan glikosida adalah dengan penambahan ammonia dimana H dari NH3 akan masuk menggantikan R pada OR Kloroform berfungsi untuk melarutkan ikatan glikosida yang terputus akibat penambahan ammonia. Prinsip yang mendasari adalah “like dissolve like”. Karena sifat kloroform yang semipolar, selain bisa melarutkan senyawa polar kloroform juga bisa melarutkan senyawa non polar seperti glikosida. Penyaringan digunakan untuk memisahkan filtrat yang mengandung alkaloid dari residunya. Filtrat yang diperoleh kemudian ditambah

37

dengan HCl yang bertujuan unttuk membentuk garam ammonium R3NH+Cl-. Reaksi yang terjadi : R3N + HCl R3NH+ClAlkaloid garam ammonia (Fessenden, 1999) Penambaahan HCl dilakukan dengan proses ekstraksi agar alkaloid dapat terdistribusi secara optimal dalam larutan HCl yang bersifat polar. Ekstraksi dilakukan sebanyak 2 kali agar alkaloid terdistribusi sepenuhnya pada HCl. Pada proses ekstraksi diperoleh 2 lapisan, lapisan atas merupakan lapisan HCl dengan senyawa organik bersifat polar (alkaloid) dan lapisan bawah merupakan kloroform. Lapisan kloroform berada dibawah karena memiliki berat jenis (yaitu 1,484 g/mL) lebih besar dari pada HCl (yaitu 1,268 gmL) (Markham, 1988) Adanya kandungan alkaloid ditandai dengan adanya endapan. Hal ini terjadi karena senyawa alkaloid mengandung atom nitrogen yang memiliki

pasangan

disumbangkan

pada

elektron atom

bebas. logam

Elektron berat

bebas

ini

akan

membentuk senyawa

kompleks dengan gugus yang mengandung atom nitrogen sebagai ligannya. Senyawa kompleks ini tidak larut (mengendap) dan memberikan warna sesuai dengan pereaksi yang digunakan. Dengan pereaksi Dragendorff akan terbentuk endapan jingga dan dengan pereaksi Meyer akan terbentuk endapan kuning. Reaksi yang terjadi yaitu : 1) Uji dengan Pereaksi Meyer

2) Uji dengan Pereaksi Dragendroff

38

Dari percobaan yang dilakukan, baik uji dengan pereaksi Meyer maupun pereaksi Dragendroff alkaloid positif ada pada sampel. Hal ini ditandadi dengna timbulnya endapan warna kuning pada pereaksi Meyer dan endapan berwarna jingga pada pereaksi Dragendroff. d. Tanin Uji tanin bertujuan untuk adanya tanin dalam simplisia kemuning. Tanin merupakan senyawa yang mengandung gugus hidroksi (turunan benzena) yang dapat larut dalam air karena adanya ikatan hidrogen antara gugus hidroksil yang dimiliki tanin dengan molekul air. Oleh karena itu penentuan tanin pada kemuning dilakukan dengan penambahan air pada kemuning kemudian didihkan. Tanin yang bersifat polar akan larut dalam air yang bersifat polar, hal ini sesuai dengan prinsip “like dissolve like”. Kelarutan tanin yang tinggi terjadi dalam keadaan panas karena alasan inilah maka dilakukan proses pendidihan agar tanin yang terlarut semakin banyak. Selain itu proses pendidihan juga berfungsi untuk memecah ikatan-ikatan pada tanin sehingga dihasilkan bentuk monomer-monomer tanin bebas. Kemudian dilakukan pendinginan untuk mengendapkan senyawa-senyawa pengotor yang tidak larut pada suhu rendah, misalnya saponin. Selanjutnya

adalah

penyaringan

yang

bertujuan

untuk

memisahkan tanin dari simplisia dan senyawa lain yang terkandung

didalamnya

seperti

alkaloid,

Larutan/filttrat dibagi menjadi 3 bagian.

39

steroid,

flavonoid.

Filtrat pertama ditambahkan FeCl3 1%. Penambahan FeCl3 berfungsi sebagai sumber atom pusat, dimana tanin merupakan ligan yang membutuhkan atom pusat untuk membentuk kompleks yang stabil, sehingga terbentuklah kompleks antara atom pusat Fe3+ dengan ligan tanin. Uji positif yaitu terbentuk larutan berwarna cokelat kehitaman. Reaksi yang terjadi : O

O

H

+

Fe

2+

+

Fe3+

H+

N

N

Kompleks warna (cokelat kehitaman) (Markham, 1988) e. Kuinon Uji kuinon bertujuan untuk mengetahui adanya kuinon dalam simplisia kemuning. Kuinon merupakan senyawa berwarna dan mempunyai kromofor dasar seperti kromofor pada benzakuionon yang terdiri dari 2 gugus karbonil yang berkonjugaasi dengan R ikatan rangkap karbon. Penentuan

adanya

kuinon

dilakukan

dengan

mendidihkan

kemuning dalam air. Pendidihan berfungsi untuk memperbesar kelarutan kuinon dalam air. Selanjutnya dilakukan pendinginan pada temperatur kamar yang bertujuan untuk mengendapkan pengotor (misalnya alkaloid, saponin dan kuinon) yang tidak larut pada suhu rendah. Setelah itu larutan disaring untuk memisahkan residu kemuning dari filtrat yang diperkirakan terdapat kuinon. Filtrat hasil penyaringan ditambahkan NaOH. Penambahan NaOH berfungsi untuk mendeprotonasi gugus fenol pada kuinon sehingga terbentuk ion enolat. Ion enolat tersebut akan mampu mengadakan resonansi antar elektron pada ikatan rangkap π, karena terjadinya resonansi ini ion enolat dapat menyerap cahaya tertentu dan memantulkan warna.

40

Reaksi pembentukan enolat: OH

Na+

O

+

NaOH

+

Fenol pada kuinon

H 2O

ion f enolat terkonjugasi

(Fessenden, 1999) Uji positif terhadap keberadaan kuinon yaitu jika larutan memberikan warna merah. pada percobaan ini menghasilkan uji negatif, karena tidak menghasilkan larutan berwarna merah. Hal ini menunjukan bahwa didalam daun kemuning tidak mengandung senyawa kuinon, padahal mengandung senyawa kuinon (negatif palsu) f.

Steroid/Triterpenoid Uji steroid/triterpenoid bertujuan untuk mengetahui adanya kandungan steroid/triterpenoid pada simplisia kemuning. Tahap pertama yang dilakukan adalah maserasi terhadap kemuning halus ke dalam eter selama 1 jam. Maserasi merupakan proses perendaman

selama

beberapa

waktu

agar

zat

(steroid/triterpenoid) yang terkandung dalam simplisia kemuning dapat keluar atau terekstrak. Maserasi dilakukan selama 1 jam karena waktu 1 jam adalah waktu yang optimum untuk mengeluarkan

atau

mengekstrak

steroid/triterpenoid

yang

terkandung dalam simplisia. Pelarut yang digunakan adalah eter yang bersifat nonpolar karena steroid merupakan senyawa organik yang memiliki sifat nonpolar sehingga steroid dapat larut dalam pelarut nonpolar seperti eter. Larutan yang telah dimaserasi kemudian disaring dengan tujuan untuk memisahkan residu kemuning dari filtrat. Filtrat yang diperoleh

kemudian

diuapkan.

Penguapan

berfungsi

untuk

menghilangkan pelarut eter yang tersisa pada filtrat. Residu yang diperoleh dari penguapan kemudian ditambah dengan asam

41

asetat anhidrat dimana asam asetat anhidrat akan bereaksi dengan steroid melalui reaksi asetilasi menghasilkan kompleks asetil steroid. Reaksi yang terjadi : O CH 3

Gugus steroid

OH

C

+

CH 3

O

- CH3COOH

O

Steroid

C

O

C

senyawa kompleks O

CH3

asetil steroid

(Fessenden, 1999) Penambahan

H2SO4

pekat

bertujuan

untuk

mendekstruksi

kompleks asetil steroid. H2SO4 pekat lebih bersifat reaktif jika bereaksi dengan steroid dibandingkan dengan asam asetat anhidrat. Hal ini dikarenakan kemampuan H2SO4 yang lebih mudah masuk mengatasi efek sterik yang besar dari molekul steroid sehingga senyawa kompleks yang dihasilkan lebih stabil dari kompleks asetil steroid. Uji positif terhadap steroid adalah jika terbentuk larutan berwarna biru. Sedangkan uji positif terhadap triterpenoid adalah jika terbentuk kristal/endapan

berwarna merah kecoklatan.Pada

percobaan ini menghasilkan warna hijau pekat. g. Kumarin Uji senyawa kumarin dilakukan mengikuti cara felgi (1960) dengan memasukan sampel ke dalam tabung reaksi, kemudian tabung reaksi dipanasan dan mulut tabung rekasi ditutup dengan kertas saring yang dibasahi dengan NaOH 10%. Biarkan pemanasan berlangsung selama 10 menit. Kemudian dilihat warna fluoresensi dengan lampu UV 365nm. Adanya senyawa kumarin ditandai dengan fluoresensi biru terang dan hasil pengujian menunjukan positif kumarin Tujuan dilakukan praktikum ini adalah untuk mengetahui cara identifikasi senyawa fitokimia dari tumbuhan pada praktikum ini dilakukan dengan skrinning fitokimia yang bertujuan untuk identifikasi awal pada senyawa kimia yang terkandung dalam tumbuhan.

42

Metabolit primer adalah hasil dari metabolisme primer berupa senyawa makromolekul seperti protein, polisakarida, lemak, asam nukleat dan sebagainya. Sedangkan metabolit sekunder adalah hasil dari metabolisme sekunder berupa senyawa makromolekul seperti alkaloid, saponin, tanin, steroid dan lain-lain. Adanya hasil positif yang menunjukkan kandungan kimia pada tanaman tersebut adalah sama atau telah sesuai dengan literatur, jika menunjukkan hasil yang negatif mungkin dikarenakan tidak adanya memang kandungan kimia pada tanaman tersebut atau mungkin pada saat praktikum prosedurnya ada yang salah atau kurang telitinya praktikan. Disarankan agar dalam praktikum, praktikan lebih berhati-hati dan teliti dalam melakukannya agar didapatkan hasil yang maksimal dan yang diinginkan.

2. Ekstraksi Untuk praktikum ini dilakukan ekstraksi daunkemuning yang dilakukan dengan maserasi. Ekstraksi dilakukan dengan cara merendam simpilisai sebanyak 100 gram dengan etanol. Dalam tinjauan oustaka lama dari perendaman berlangsung 3 hari namun karena leterbatasan waktu maka perendaman hnaya dilakukan selama 4 jam praktikum. Simplisia sebelumnya dipotong halus agar memperluas permukaan dari daun kemuning agar terbasahi dengan maksimal. Etanol sebagai pelarut akan masuk ke dalam sel daun melalui dinding sel, kemudian isi sel akan larut karena perbedaaan konsentrasi antara di dalam sel dan di luar sel sehingga terjadi kesetimbangan konsentrasi antara bagian dalam sel dan luar sel.Pelarut yang digunakan adalah etanol. Pemilihan pelarut karena merupakan pelarut universal yang dapat melarutkan senyawa yang diinginkan yaitu kumarin yang bersifat larut dalam pelarut polar dan ada sebagian yang larut dalm pelarut non polar. Setelah proses maserasi selesai, rendaman disaring dengan kain batis hingga didapat ekstrak yang sudah terpisah dari daun.Kemudian ekstrak yang didapat digunakan untuk proses selanjutnya. 3. Pemekatan Dan Pemantauan Ekstrak

43

Pada pratikum kali ini dilakukan pemekatan dan pematauan ekstrak . Pemekatan ekstrak bertujuan untuk mendapatkan ekstrak kental dan menghilangkan pelarut, sehingga yang didapatkan hanya ekstrak yang mengandung senyawa dari tanaman saja tanpa adanya pelarut pemantauan ekstrak adalah metode yang digunakan untuk memantau ada tidaknya metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak dau kemuning. Proses pemekatan ekstrak menggunakan alat rotary evaporator, mesin rotary evaporator adalah mesing yang biasa di pakai

untuk mengurangi kadar air

suatu bahan berbentuk cair. Prinsip kerja dari mesin ini adalah tanpa pemanasan langsung, suhu bisa diatur sesuai keinginan. penggunaan suhu rendah akan menjaga nutrisi/gizi produk tidak hilang atau rusak. mesin evaporator

ini

menggunakan

double

jacket,

sehingga

panas

tidak

berhubungan langsung denga produk melainkan melalui perantara (medium ) air. Adapun tujuan dari pemekatan yauitu meningkatkan kadar zat aktif dalam volume yang kecil, mempermudah proses pembuatan dan menghilangkan sisa pelarut. Pemantauan ekstrak dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis. Kromatografi lapis tipis adalah satu cara analisis yang digunakan untuk memisahkan komponen secara cepat berdasarkan prinsip adsorpsi. emtode ini sangat sesuai untuk analisis kualitatif campuran dalam segala mikro kromatografi ini menggunakan lempeng alumunium yang dilapisi dengan adsorben berupa serbuk halus yangserba rat pada lempeng dengan ketebalan 0.1-0,25 mm. Pada praktikum yang dilakukan ekstrak dilakukan dengan etanol, Pada saat penotolan dilakukan setipis mungkin agar pemisahan berjalan sempurna. Plat KLT diberi batas dengan pensil yang setinggi 1 cm dari bagian bawah dan 0,5 dari bagian atas. Pemberian batas dilakukan agar proses elusi berkjalan baik karena tidak terpengaruh ekstrak yang tercelup dalam eluen dan perhitungan RF dapat dipantau dengan baik. Eluen terlebih dahulu dijenuhkan sebelum dimasukkan plat KLT dengan cara memasukkan kertas saring ke dalam chamber dan di tutup. Kertas saring yang dimasukkan ke dalam chamber adalah sebagai penanda bahwa eluen memenuhi dinding chamber sebagai proses elusi akan berjalan dengan baik. 44

Pada saat penjenuhan, Chamber ditutup karena apabila dibiarkan terbuka fase gerak habis menguap, karena eluan bersifat volatile. Pada percobaan ini eluen yang digunakan adalah N-Heksan : Etil Asetat (4:1. pada pemantauan ekstrak dengan eluen diatas, didapat 2 bercak pada sampel dan 2 bercak pada pembanding. Bercak ini ditunjukkan

dengan

bercak berflouresensi biru yang terliaht pada sinar uv 254 dan 365. Untuk sampel bercak yang ditimbulkan menghasilkan harga Rf= 0,225 dan 0,725. Sedangkan pembanding bercak yang dihasilkan dengan harga RF = 0,1 dan 0,25. Nilai Rf yang baik adalah pada rentang 0,2-0,8. Dari hasil yang didapatkan harga RF pada sampel baik karena berada pada rentang 0,2-0,8. Dari literature yang ada untuk senyawa kumarin memiliki harga RFf= 0,41. Namun pada percobaan yang dilakukan tidak ditemukan bercak dengan harga Rf – 0,41. Hail ini dapat terjadi karna beberapa faktor yaitu antara lain penggunaan eluen yang kurang tepat perbandingannya, kesalahan pada saat melakukan prosedur, penotolan yang kurang baik, dan ketidaktelitian praktikan dalam menentukan titik bercak yang ada. 4. Fraksinasi Fraksinasi adalah pemisahan senyawa –senyawa berdasarkan tingkat kepolaran . jumlah dan senyawa yang dapat dipisahkan menjadi fraksi-fraksi berbeda-beda tergantung pada jenis tumbuhan.fraksinasi kali ini adalah dengan corong pemisah yaitu metode ekstraksi cair-cair. Ekstraksi Cair-cair merupakan metode pemisahan zat-zat terlarut antara dua cairan yang tidak saling mencampur antara lain menggunakan alat corong pisah. Ada suatu jenis pemisahan lainnya dimana pada satu fase dapat berulang-ulang dikontakkan dengan fase yang lain dan pelaru tersebut tidk saling bercampur. Pada ekstraksi kali ini ekstrak kental dilarutkan pada pelarut campuran methanol-air kemudian ditambahkan dengan 25 ml pelarut non polar yaitu nHexana dilakukan penggojokan buka kran bawah dalam posisi kran disamping untuk mengurangi tekanan uap didalam corong pemisah. kemudian diamkan dalam keadaan vertical selama beberapa menit sampai kdua fase benar-benar terpisah dan tek saling bercampur. Keluarkan fase methanol-air yang dibawah, sampai tanda pemisah dengan n-hexana,

45

setelah itu keluarkan lagi n-hexana. Fase methanol-air dimasukkan lagi dalam corong pemisah lakuakn ekstraksi dengan n-Hexana sebanyak 3 kali. Setelah itu lakukan ekstraksi pada pelarut semi polar yaitu etil asetat 25 ml yang dilakukan sebanyak 3 kali.lakuakan pemisahan pada fraksi etil asetat dan methanol-air dengan cara yang sma pada n-Hexana. Fraksi Metanol air akan selalu berada dibawah atau keluar lebih dahulu karena memiliki bobot jenis yang lebih besar dari n-hexana dan etil asetat, atau jika ingin mengetahui fraksi apa yang kita milikiadalah dengan cara meneteskan air pada saat proses pemisahan jika bercampur berarti fase tersebut adalah air, begitu juga dengan pelarut lain. Fraksinasi yang kita lakukan disebut dengan fraksinasi bertingkat dimana fraksinasi atau proses pemisahan dilakuakn dengan cara mengurutkan kepolaran dari senyawa dari senyawa non-polar,semi polar, da senyawa polar.sehingga hasil yang didapatkan nanti ada tiga fraksi yang selanjutnya akan di lakukan pemantauan pada tiap-tiap fraksi. 5. Pemantauan Fraksi Pada praktikum kali ini dilakukan pemantauan fraksi hasil dari kromatografi kolom klasik. Pemantauan fraksi dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis tujuan dari pemantauan fraksi adalah apakah fraksi yang dihasilkan pada Ekstraksi cair-cair manakah yang mengandung senyawa kumarin serta melihat apakah proses fraksinasi dapat memisahkan senyawa kumarin dari campuran sesuai dengan yang diinginkan. Pemantauan

fraksi

dilakukan

menggunakan

kromatografi

lapis

tipis.

Kromatografi lapis tipis adalah suatu alat proses pemisahan senyawa kimia secara kualitatif senyawa uji dapat berupa senyawa tunggal maupun campuran, hasil sintetis, isolasi dan hewan percobaan maupun tumbuhan atau ikroorganisme. Kromatografi lapis tipis prinsip kerjanya adalah adsorbsi (menyerap pada permukaan) yang betindak sebagai adsorben adalah adalah fase stasioner atau fase diam. Adsorben yang sering dipakai adalah silica gel GF yang mamou berfluorosensi pada lampu uv biasanya digunakan UV 254 nm atau 366 nm.bila fase diam telah ditentukan maka fase gerak dapat ditentukan berdasarkan kepolaran yang diinginkan. Pemantauan kali ini dilakukan pada 5 fraksi 3 fraksi berasal dari proses ekstraksi cair-cair yaitu fraksi n-hexan, etil asetat, methanol-air dan dua 46

lainnya adalah klorofil hasil pengendapan klorofil dan satunya merupakan ekstrak baku pembanding kumarin. Kelima fraksi ini analisa dengan KLT untuk melihat pada fraksi manakah yang mengandung kumarin.berdasarkan literature kumarin adalah senyawa yang bersifat semi polar dugaan sementara

kumarin

berada

pada

fraksi

etil

asetat.

Pemantauan

menggunakan fase diam silica gel GF 254 dan fase gerak toluene : etil asetat 3 : 2. Silica gel merupakan fase diam yang akan mengikat senyawa polar sedangkan campuran toluene dan etil asetat merupakan fase gerak yang sem polar kearah non polar maka diharapkan senyawa kumarin dapat tertahan pada silica gel pada tengah plat sehingga dapat di lihat keberadaannya dan terpisah dari ampurannya yang bersifat polar atau non polar. 6. Sub Fraksi (Fraksinasi 2) Pada praktikum ini dilakukan praktikum tentang Fraksinasi 2. Fraksinasi adalah suatu proses pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan tingkat kepolaran. Menurut literature dalam melakukan fraksinasi digunakan 2 metode yaitu dengan menggunakan corong pisah an kromatografi kolom. Tetapi pada praktikum ini digunakan metode Kromatografi Kolom Klasik (KK). Proses/mekanisme yang terjadi pada kromatografi kolom klasik adalah adsorpsi, desorpsi, elusi dan gravitasi. Pada fraksinasi dengan menggunakan Kromatografi Kolom digunakan serangkaian alat kromatografi Kolom. Fase diam yang digunakan adalah silika gel serbuk dan eluen yang digunakan adalah perbandingan dari n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan 6:4. Dari hasil fraksinasi pertama didapatkan fraksi kumarin yang lebih banyak ditraik oleh etil asetat. Sehingga fraksi etil asetat dari fraksinasi pertama tersebut digunakan untuk praktikum kali ini yaitu fraksinasi 2(kedua). Terdapat dua metode untuk membuat kolom yaitu metode kering dan metode basah. Tetapi pada praktikum ini digunakan atau dibuat dengan cara metode basah. Pada metode basah, disiapkan bubur dengan cara mencampurkan eluen pada serbuk fase diam dan dimasukkan secara hati-hati pada kolom. Lalu, untuk sampling disiapkan dengan metode kering dengan cara ekstrak dari fraksi etil asetat digerus dengan silika gel yang digunakan untuk fase diam dan ditabur diatas fase diam pada kolom. Hasil dari perhitungan v= πr r 2 t, sedangkan serat silika pada sampling adalah 1/20 silika gel dari fase diam, 47

lalu eluen dialirkan dan selalu dilakukan penambahan eluen agar fase diam tidak kering. Disiapkan pula 30 vial yang telah ditimbang dan ditara volume sebanyak 5ml lalu diberi tanda pada masing-masing vial. 30 vial tersebut digunakan utnuk menampung fraksi hasil dari kromatografi kolom yang selanjutnya akan dilakukan pemantauan fraksinya. Hal yang perlu diperhatikan pada saat penyiapan alat kromatografi kolom adalah, sebelumnya kolom harus ditutup bagian ujung bawahnya dengan kapas bebas lemak. Fungsi dari kapas bebas lemak ini adalah untuk menutup lubang kolom agar aliran gel yang akan dimasukkan tidak dapat keluar dan akan tertahan tetap menjadi fase diamnya. Alasan harus menggunakan kapas yang bebas lemak adalah agar pada saat proses ekstraksi bahan tidak terganggu oleh lemak yang mungkin akan ikut terlarut oleh eluen yang melewati fase diamnya. Pada praktikum ini, kolom yang digunakan adalah sebuah tabung dengan diameter 5-50 mm dan tinggi 20 cm. Eluen atau fase gerak yang digunakan adalah n-heksan:etil asetat dengan perbandingan (6:4) dan diharapan faktor retensi senyawa berkisar antara 0,2-0,3 agar meminimalisasi penggunaan waktu dan jumlah eluen melewati kolom dan agar pemisahan dapat terjadi secara efektif. Digunakan fase gerak n-heksan:etil asetat 6:4 adalah dengan alasan telah digunakan pada proses fraksinasi pertama dan dari hasil pemantauannya memberikan hasil cukup baik sehingga dipilih lagi fase gerak tersebut untuk proses fraksinasi kedua, sedangkan fase diam yang digunakan adalah uatu absorben yaitu silika gel yang berbentuk serbuk microporus untuk meningkatkan luas permukaan. 7. Pemantauan Sub Fraksi (Fraksinasi 2) Pada praktikum fitokimia kali ini dilakuakn praktikum tentang Pemantauan Fraksi 2. Adapun tujuan dari pemantauan fraksi adalah untuk mengetahui komponen yang ada dalam fraksi. Prinsip dari pemantauan fraksi adalah pergerakan

senyawa

yang

diadsorpsi

secara

partisi

menggunakan

kromatografi berdasarkan perbedaan kepolaran. Fraksi untuk pemantauan fraksi ini adalah merupakan hasil fraksi dari pemisahan secara kromatografi kolom pada praktikum sebelumnya. Dari

48

hasil fraksinasi tersebut didapatkan 30 fraksi yang masing-masing ditampung dalam vial sebanyak 5 ml fraksi. Pemantauan fraksi yang akan dilakukan pada raktikum ini adalah dengan menggunakan metode

Kromatografi Lapis Tipis. Teknik kromatografi

membutuhkan zat terlarut terdistribusi di antara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam) dan yang lainnya bergerak (fase gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lainnya. Umumnya zat terlarut dibawa melewati media peisahan oleh cairan atau gas yang disebut eluen. Fase diam dapat bertindak sebagai penjerap atau dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. Langkah pertama yang harus dilakukan adalah menyiapkan fase diam dan fase gerak. Pada percobaan ini fase diam yang digunakan adalah silika gel dengan ukuran 10 x 8 cm. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah pelarut Toluen:etil asetat dengan perbandingan 3:2 sebanyak 15 menit. Selanjutnya dilakukan penjenuhan fase gerak (eluen). Tujuan penjenuhan fase gerak adalah agar proses elusi akan berjalan dengan baik dan merata. Sambil menunggu pelarut jenuh didalam chamber, maka dilakukan penotolan fraksi pada plat KLT yang telah disiapkan. Dari 30 fraksi yang didapat, pemantauan fraksi dibagi menjadi 2. Pemantauan pertama dilakukan pada fraksi ganjil yaitu 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29. Setelah pelarut jenuh dan semua fraksi telah ditotolkan pada plat KLT, maka plat KLT dimasukkan ke dalam chamber. Dibiarkan hingga fase gerak (eluen) membawa fraksi naik ke atas silika gel berdasarkan tingkat kepolaran masing-masing senyawa yang terdapat pada sampel. Pada penotolan pada plat KLT selain 15 fraksi tersebut, ditotolkan pula fraksi ekstrak etil asetat dengan ekstrak awal daun Kemuning. Setelah selesai, diamati silika gel dan dipantau dibawah lampu UV 254nm dan 366nm. Diamati penmpakan bercaknya. Dari hasil yang terlihat menunjukkan bahwa hasil pemisahan tidak baik karena flouresensi biru yang ditunjukkan berada dibawah yaitu sangat dekat dengan tempat penotolan awal.

49

Langkah selanjutnya untuk lebih memastikan hasil pemisahan maka dilakukan penyemprotan pada plat KLT dengan penampa bercak spesifik yaitu NaOH 5% dan setelah itu dilihat lagi penampakan bercak dibawah lampu UV 254nm dan 366nm. Dari hasil penampakan bercak terlihat bahwa bercak dengan flouresensi biru yang merupakan kumarin terlihat jelas ada di fraksi ke 5 dan fraksi ekstrak daun kemuning. Hal tersebut menunjukkan bahwa kumarin dari ekstrak etil asetat telah ditarik oleh pelarut etil asetat, sehingga pada pemantauannya senyawa kumarin teridentifikasi. Nilai Rf yang didapatkan adalah 0,42. Selanjutnya, untuk pemantauan fraksi genap dilanjutkan oleh kelompok selanjutnya yaitu fraksi genap 2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30 dilakukan dengan prosedur yang sama seperti pada pemanatauan fraksi ganjil. Didapatkan hasil bahwa senyawa kumarin terdapat pada fraksi ke 4 dilihat dengan adanya flouresensi biru. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa senyawa kumarin tedapat pada fraksi e 4 dan 5 yang berarti bahwa pemisahan atau pemantauan fraksi dengan Kromatografi Kolom berhasil, karena sangat mungkin bila senyawa kumarin berada pada fraksi yang berdekatan. 8. Pemurnian Pada praktikum kali ini dilakukan oemurnian dengan metode KLT preparatif.Tujuan

dari

praktikum

ini

adalh

untuk

mengetahui

tujuan

pemurnian,mampu menjelaskan mekanisme yang terjadi pada proses pemisahan KLt preparative sehingga mampu melakukan pemurnian. Langkah pertama yang dilakukan yaitu melakukan orientasi eluen(pengembang) yang akan dipilih untuk pemurnian.Disiapkan terlebih dahulu KLT(plat) berukuran 10x1 cm kemudian diuapkan dengan eluen toluene:etil asetat (6:4) sebanyak 10 ml.Pengembang ini dipilih karena pada pemantauan fraksi diperoleh Rf=0,52 pada fraksi ke 5 dan fraksi ekstraks standar. Untuk memastikan eluen bernilai Rf=0,52 maka dilakukan elusi lagi dengan menggunkan 1 fraksi saja yaitu fraksi 5.Setelah dilakukan uji orientasi maka diperleh nilai Rf=0,52.Maka dipilih nilai Rf pengembang yang memiliki nilai Rf=0,52 sehingga berada di tengah lempeng,sehingga dapat diamati pita yang akan terbentuk pada pemurnian. Sebelumnya pernah dilakukan uji KLt dengan eluen n-heksan:etil asetat (6:4) berada dibawah, lalu diperoleh nilai

50

Rf=),2.Oleh karena itu perlu dilakukan orientasi lagi untuk eluen yang memberikan Rf diatas (0,7-0,8) untuk uji kemurnian selanjutnya dengan metode pengembang eluen tunggal dan metode KLT 2 dimensi. KLT preparatif dapat digunakan untuk memisahkan bahan alam dalam jumlah kecil namun sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah miligram.Seperti halnya KTL secara umum,KLt preparatif juga melibatkan fase diam dan fase gerak.Dimana fase diamnya adalah serbuk plat KLT dengan ukura ketebalan yang bervariasi.Pada percobaan pemurnian kali ini, tidak menggunakan KLT preparatif tapi hnaya menggunakan KLT biasa dikarenakan jumlah sampel yang sangat sedikit.Namun prinsip pengerjaannya sama yaitu fase diamnya silika gel dan eluen yang digunakan toluene:etil asetat (6:4).Prinsipnya sama dengan senyawa yang diadsorpsi secara partisi menggunakan kromatografi berdasarkan perbedaan kepolaran. Setelah ditotolkan pada plat KLT, sampel dilarutkan terlebih dahulu dala sedikit pelarut, pelarut yang digunakan adalah mudah menguap misalnya etanol, karena jika dilakukan dengan pelarut yang tidak mudah menguap maka akanterjadi pelebaran pita. Konsentrasi sampel juga sebaiknya hanya 5-10%.Sampel yang ditotolkan harus berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga tergantung pada lebarnya pita. Lempeng tipis kemudian disiapkan dan chamber dijenuhkan terlebih dahulu dengan eluennya dengan menutup bagian atas chamber.Hal ini dilakukan untuk menyakinkan bahwa kondisi chamber

telah jenuh oleh uap

etanol.Kondisi jenuh dengan uap mencegah penguapan pelarut.Cuplikan (fraksi 5) yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salat satu plat lapisan dasar yang sebelumnya telah digaris pensil dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi 2 pita biru yang berflouresensi pada UV 254 nm dan 366 nm.Pita yang didapat pada praktikum adalah dengan Rf 0,52 setelah disemprot dengan NaOH 5%. Setelah

kedudukan

pita

diketahui

dan

diberi

tanda,kemudian

plat

dikerok.Kemudain dimasukan kedalam vial lalu dielusi dengan pelarut polar(etanol). Ini berguna untuk memisahkan campuran kumarin dengan silika gel.Harus diperhatikan bahwa makin lama senyawa kontak dengan

51

adsorben maka makin besar kemungkinan senyawa tersebut mengalami penguraian. Selanjutnya ekstrak yang diperoleh disaring menggunakan corong yang didalamnya telah disumbat dengan kapas bebas lemak kemjudian filtrate ditambahakan etanol dengan disaring sesekali dibilas pada dinding vial dan dinding corong.Kemudian ditutup dengan selofan dan diberi lubang agar cairan pelarut menguap lalu hasil pemurnian ini disimpan untuk dilakukan uji kemurnian pada praktikum selanjutnya. Proses isolasi KLT terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-kompenen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen oleh adanya daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama.Maka komponen bergerak dengan kecepatan berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan. Pada pengujian KLT, penampak bercak yang digunakan adalah penampak bercak sepsifik untuk kumarin yaitu NaOH 5%.Pada pemurnian,penampak bercak hanya disemprotkan pada pinggiran plat dan bagian tengah plat ditutup kertas.Karena bagian tengah adalah bagian yang akan dikerok jadi harus bebas dari kontaminasi NaOH. Senyawa kumarin bereaksi dengan NaOH dan akan terlepas gugus laktonnya dan berikatan dengan logan Na.Sehingga terbentuk senyawa yang akan berflourosensi biru bla diamati dengan lampu UV yang penampak bercak ini spesifik untuk keberadaan kumarin pada isolat. 9. Uji Kemurnian Pada praktikum kali ini dilakukan uji kemurnian dari isolat yang telah dilakukan pemurnian (isolasi) menggunakan metode KLT preparative. Metode uji kemurnian yang dilakukan kali ini adalah pemurnian dengan metode KLT pengembangan

tunggal.

KLT

pengembangan

tunggal

adalah

untuk

mendapatkan resolusi yang baik dari hasil KLT. Memfokuskan zona pemisahan dengan eluen yang berbeda sehingga mendapatkan nilai Rf yang berada dibawah, tengah dan atas. Pertama-tama, dilakukan dahulu orientasi eluen agar bisa mendapatkan hasil bercak dengan harga Rf yang berada dibawah, tengah, dan atas. memilih eluen pengembang kromatografi lapis tipis (KLT) juga merupakan faktor yang berpengaruh besar, karena hanya beberapa kasus solvent pengembang yang 52

hanya terdiri dari satu komponen saja. Pada umumnya campuran larutan pengembang KLT (solvent system) bisa sampai enam komponen dengan perbandingan tertentu. Campuran larutan/eluen pengembang KLT ini berfungsi untuk; melarutkan campuran bahan, mengangkut bahan untuk dipisahkan pada lapisan fase diam (sorben), memberikan nilai hRf senyawa yang terpisah, dan memberikan selektivitas yang memadai untuk campuran bahan untuk dipisahkan. Adapun syarat eluen KLT (mobile phase) antara lain; kemurnian yang memadai, stabilitas yang memadai, viskositas rendah, partisi/pemisahan linier, tekanan uap sedang , serta daya toksik yang serendah mungkin. Dalam pelaksanaannya, yang paling sulit dilakukan adalah bagaimana memilih solvent system/fase gerak yang cocok agar komponen senyawa terpisah baik. Cara memilih fase gerak KLT bisa dilakukan sendiri dengan orientasi dari beberapa komponen pelarut dan perbandingan. Namun demikian untuk mendapat hasil yang memuaskan juga butuh waktu lama. Optimasi fase gerak KLT ini bisa juga sesuai mengambil dari literatur. Apabila dari

literatur

belum

cocok

pemisahan

senyawanya,

bisa

dirubah

rasio/perbandingan solvennya. Namun terkadang juga dari literature masih menuliskan sistem pelarut pengembang yang sangat beracun atau karsinogenik, misalnya benzene. Jika menggunakan komponen pengembang seperti ini perlu diperhatikan alat safety bagi pengguna. Setelah dilakukan beberapa kali orientasi eluen, maka didapatkan eluen dengan berbagai nilai Rf bawah, tengah dan atas. Eluen untuk mendapatkan nilai Rf yang dibawah adalah n-heksan : etil asetat (7:3), ditengah toluene : etil asetat (6:4), diatas etil asetat : methanol (9:1). Pertama-tama, setelah eluen dibuat, masukkan eluen kedalam chamber, lalu tutup chamber dengan dilapisi kertas saring didalamnya agar kondisi didalam chamber terjenuhkan oleh uap pelarut (eluen). Kondisi jenuh dalam chamber dengan uap mencegah penguapan pelarut. Setelah chamber jenuh, maka bisa dimulai untuk elusi KLT dengan eluen yang sesuai. Plat KLT yang digunakan untuk elusi berukuran 1,5x5 cm dan disiapkan 3 buah plat KLT, masing-masing KLT digunakan untuk tiap-tiap eluen berbeda

53

yang telah disediakan. Diberi tanda pada masing-masing ujung plat KLT dengan jarak 0,5 cm dari ujung plat KLT. Tiap satu plat KLT diberikan totolan isolat sebanyak 2 totolan. Kemudian dilihat dibawah lampu sinar UV untuk melihat konsentrasi isolat, jika belum terlihat bercak isolat, maka tambahkan lagi totolan diatas 2 totolan sebelumnya, hingga didapatkan totolan isolat yang mencukupi untuk dielusi. Masukkan plat KLT kedalam chamber lalu tutup chamber. Batas totolan harus diperhatikan untuk berada diatas eluen, jangan sampai eluen membasahi totolan isolat. Tunggu hingga eluen naik sampai tanda batas atas plat KLT. Ambil plat, kemudian dikeringkan hingga eluen menguap. Pemisahan terjadi selama

perambatan

kapiler.

Karena

pelarut

bergerak

lambat

pada

lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berwarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna. Dikarenakan hasil dari isolat kemungkinan adalah senyawa murni, sehingga bercak yang didapatkan diharapkan hanya mendapat satu bercak. Dari hasil praktikum, bercak tidak terlihat secara visual sehingga perlu dilihat dibawah sinar lampu UV. Ketika dilihat dibawah UV 366nm, didapatkan satu bercak yang berfluorosensi biru yang diduga adalah senyawa kumarin. Untuk memastikan kembali, maka plat KLT yang ditotolkan 2 totolan tadi dibagi dua, sehingga masing-masing bagian terdapat 1 totolan isolat. Salah satu plat yang sudah dipotong tersebut disemprot dengan penampak bercak universal H2SO4 10% lalu dipanaskan dan plat yang satunya disemprot dengan penampak bercak spesifik untuk kumarin, yaitu NaOH 5%. Kemudian dilihat dibawah sinar UV dan jika isolat telah murni, yaitu tidak mengandung senyawa lain ataupun pengotor, maka bercak yang muncul pada plat KLT hanya didapatkan satu bercak. Dengan hasil bercak yang berada diatas, ditengah maupun dibawah kita dapat mengetahui senyawa-senyawa yang tidak diinginkan yang mungkin akan menimbulkan bercak diatas ataupun dibawah dari bercak kumarin berdasarkan dari kepolarannya. Sehingga, jika hanya didapatan satu bercak pada 3 plat KLT yang telah dielusi dengan 3 macam eluen berbeda tersebut, isolat dapat dikatakan murni. Dari hasil praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa isolat yang didapat terlah murni hanya mengandung senyawa kumarin. Dengan

54

masing-masing harga Rf sebagai berikut; eluen n-heksan : etil asetat (7:3) harga Rf 0,12 ; eluen toluene : etil asetat (6:4) harga Rf adalah 0,625 ; dan eluen etil asetat : methanol (9:1) harga Rf adalah 0,8125.

BAB IV KESIMPULAN 1. Isolasi senyawa Kumarin dari Tanaman Kemuning (Murraya paniculata (L.) Jack.) yang telah dilakukan menghasilkan isolat yang murni mengandung kumarin. 2. Tahapan-tahapan isolasi senyawa Kumarin dari Tanaman Kemuning (Murraya paniculata (L.) Jack.) yang telah dilakukan meliputi : a. Penapisan Fitokimia 1) Penapisan fitokimia bertujuan untuk mengetahui kandungan senywa metabolit sekunder yang terkandung dalam suatu tanaman seperti alkaloida, saponin, tannin, kumarin, dan flavonoid 2) Tahap-tahap dari penapisan fitokimia adalah

dengan

cara

mereaksikan dengan suatu pereaksi kimia yang dapat menghasilkan hasil yang spesifik. 3) Reaksi yang berlangsung pada penapisan fitokimia berdasarkan pada reaksi spesifik suatu zat dengan pereaksi kimia sehingga dapat diketahui senyawa metabolit sekunder yang terkandung didalamnya. 4) Tanaman daun kemuning (Murraya paniculata) yang digunakan memberikan hasil yang positif untuk alkaloid, saponin, tanin, kumarin dan flavonoid. 5) Tanaman daun kemuning (Murraya paniculata) yang digunakan memberikan hasil yang negatif untuk senyawa kuinon. b. Ekstraksi 1) Proses yang terjadi pada maserasia dalah proses difusi.Larutan yang masuk ke dalam sel akan memiliki konsentrasi tinggi dan akan menuju keluar sel hingga terjadi kesetimbanagn.

55

2) Metode ekstraksi dipilih berdasarkan pertimbangan dari sifat fisik simplisia dan sifat zat aktif yang akan diekstraksi. 3) Pelarut dipilih berdasarkan kelarutan dari zat aktif yang terkandung dalam simplisia. 4) Ekstraksi daun kemuning dilakukan dengan cara maserasi yaitu dengan merendam selama 3 hari dengan pelarut berupa etanol dan diganti tiap 24 jam. c. Pemekatan Dan Pemantauan Ekstrak Pada praktikum yang dilakukan didapat kesimpulan bahwa pada proses pemekatan

alat

rotary evavorator. Tujuan

dari pemekatan

yaitu

meningkatkan kadar zat aktif dalam volume yang kecil, mempermudah proses proses pembuatan dan menghilangkan sisa pelarut. Pemantauan ekstrak menggunakan metode kromatografi lapis tipis. Bercak yang muncul ada 2 bercak pada sampel dan 2 bercak pada pembanding, dimana pada sampel (Rf= 0,225 dan 0,725) sedangkan pembanding (Rf= 0,1 dan 0,25). dari data yang ada menunjukkan nilai Rf pada sampel baik karena berada pada rentang 0,2-0,8. d. Fraksinasi 1) Fraksinasi

adalah

berdasarkan

suatu

tingkat

proses

pemisahan

senyawa-senyawa

kepolaran.

Fraksinasi

bertujuan

untuk

memisahkan senyawa yang terkandung dalam ekstrak berdasar kepolaran. Metode fraksinasi dilakukan dengan 2 cara, yaitu kromatografi dan ekstraksi cair-cair. Pada praktikum dilakukan dengan metode ekstraksi cair-cair (ECC) 2) Proses ECC terjadi karena proses pemisahan zat terlarut didalam 2 macam zat pelarut yang tidak saling bercampur berdasarkan keofisien partisi.

Partisi

adalah

proses

pemisahan

untuk

memperoleh

komponen zat terlarut dari campurannya dalam padatan dengan menggunakan pelarut yang sesuai. e. Pemantauan Fraksi 1) Pemantaua fraksi yang dilakukan pada praktikum dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis. Prinsip dari KLT adalah adsorbs dan elusi. 2) Dalam pemantauan KLT, ada yang disebut penampak bercak umum yaitu H2SO4 10% dan untuk pemantauan kumarin, penampak bercak yang spesifik untuk kumarin adalah disemprot dengan NaOH 5%.

56

Pada praktikum didapatkan intensitas kandungan kumarin yang terbanyak adalah berada pada fraksi etil asetat dengan nilai Rf 0,52. f.

Subfraksi (Fraksinasi 2) Proses fraksinasi 2(kedua) kali ini dilakukan dengan metode kolom kroatograi dan pemisahan fraksinya didasarkan pada volume eluen yang ditampung.

g. Pemantauan Subfraksi Dari hasil pemantaan fraksi dengan menggunakan KLT, fase gerak toluene:etil asetat (3:2) dan fase diam silika gel GF 245 nm dapat disimpulkan bahwa fraksi yang mengandung senyawa kumarin adalah fraksi pada vial nomor 4 dan 5. h. Pemurnian 1) Pemurnian dilakukan untuk memurnikan isolate atau mendapatkan hasil senyawa kumarin yang murni 2) Metode pemurnian yang digunakan pada praktikum ini adalah KLT preparative 3) Berdasarkan proses pemurnian yang telah dilakukan didapat hasil pita kumarin yang berflorousensi di lampu UV 366 nm dengan nilai Rf 0,52. i.

Uji Kemurnian 1) Tujuan dari uji kemurnian adalah untuk memastikan bahwa hasil dari pemurnian (isolasi) yaitu isolat yang telah murni (tidak mengandung senyawa yang tidak diinginkan baik pengotor ataupun senyawa lain yang terkandung dalam tanaman yang diisolasi tersebut) 2) Uji kemurnian yang telah dilakukan pada praktikum

adalah

menggunakan metode KLT pengembangan tunggal. Metode ini dilakukan secara KLT berdasarkan prinsip kepolaran senyawa dengan menggunakan 3 macam eluen yang berbeda sehingga didapatkan nilai Rf yang berbeda (bercak diatas, ditengah, dan dibawah). Dengan hasil bercak yang berada diatas, ditengah maupun dibawah kita dapat mengetahui bahwa didalam isolat tidak terdapat lagi kandungan senyawa lain yang kepolarannya berada di bawah maupun diatas dari kumarin, dan hasil isolat dapat dikatakan murni.

57

DAFTAR PUSTAKA Adifa, M., dkk., 1999. Isolasi Kumarin dari Daun Kemuning (Murraya paniculata L.Jack), Jurusan Kimia FMPA Universitas Andalas, Padang. AgroMedia, Redaksi. 2008. Buku Pintar Tanaman Obat 431 Jenis Tanaman Penggempur Aneka Sakit. Jakarta : Agromedia Pustaka. Alegantina,S. dan Isnawati, A., 2010, Identifikasi Penetapan Kadar Senyawa Kumarin dalam Ekstrak Metanol Artemisia Annua L., secara Kromatografi Lapis Tipis- Densiometri. Pusat Penelitian dan Pengembangan Biomedis, Jakarat Amiruddin, A. 1965. Kimia inti dan Radiokimia. Bandung: Jajaran Kimia.

58

Aziz dkk., 2010. The Malaysian Journal of Analytical Sciences, Vol 14 No 1 (2010) Coumarins From Murraya Paniculata (Rutaceae), The Malaysian Journal of Analytical Science, Malaysia. Brady, James E. 1999. Kimia untuk Universitas: Asas dan Struktur. Jakarta: Binarupa Aksara. Dalimartha, Setiawan. 2008. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid I. Jakarta : Trubus Agriwidya. DepKes RI.2008. Farmakope Herbal. Jilid I. DepKes RI: Jakarta. Ditjen POM. 1977, Materia Medika Indonesia jilid I, DepartemenKesehatan Republik Indonesia, Jakarta ___________. 1986. Sediaan Galenik. DepKes RI: Jakarta. Djamil, R. Iwang S. Dan Komar R. 1998. Telaah Fitokimia dan Uji Hayati Pendahuluan Ulva Fasciata Deliele. Bandung : ITB. Djamil, dkk., 2009, Penapisan Fitokimia, Uji BSLT, dan Uji Antioksidan Ekstrak Metanol beberapa Spesies Papilionaceae. Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jogjakarta. Erniwati. 2005. Isolasi Kumarin Dari Daun Kayu Racun (Rhinacantus nasutus). [Tesis].Prodi Kimia Program Pascasarjana Universitas Andalas. Padang. Fessenden, 2003. Kimia Organik. Jakarta: Erlangga. Gibbons, S., 2006, An Introduction to Planar Chromatography dalam Sarker, S. D., Latif, Z., and Gray, A.. I. (Eds.), Natural Product Isolation, 2nd Ed.,, Humana Press, New Jersey. Gritter, 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung: ITB. Gunawan,dkk. 2004. Ilmu Obat Alam. Jakarta: Penebar Swadaya. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Terbitan 2, terjemahan Pawinata K. dan Soediro I., ITB, Bandung. Hardjono, S. 1991. Kromatografi. Yogyakarta : Liberty __________. 1996. Sintesis Bahan Alam. Yogyakarta: UGM Press.

59

Hembing, Prof. 2000. Ensiklopedia Milenium Tumbuhan Berkhasiat Obat Indonesia. Jakarta: Prestasi Insan Indonesia. Herbert. 1995. The Biosynthesis of Secondary Metabolites. London: Chapman and Hall. Hostett Menn.K,dkk. 2006. Cara Kromatografi Preparatif. Bandung: ITB. Isnawati, A.,dkk. 2008. Isolasi dan identifikasi Senyawa Kumarin dari Tanaman Artemisia Annua L., 2008, Media Litbang Kesehatan Volume XVIII. Khopkar, SM. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI. Press. Markham. 1988. Cara Identifikasi Flavonoid. Bandung: ITB. Munson, James.W. 2010. Analisis Farmasi. Surabaya: Airlangga University. Rahman,Abdul. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Yogyakarta: Graha Ilmu. Sabarwati, S. H. 2006. Petunjuk Praktikum Kimia organik II. Kendari : FMIPA. Sudjadi.1994. Metode Pemisahan. Yogyakarta: Kanisius.

Suryati dkk, 2014, Isolasi dan Karakterisasi senyawa Kumarin dari Ekstrak EtilAsetat Daun Tabat Barito (Ficus deltoideus Jack), jurnal Kimia UNAND Volume 3 Nomor 3. Indonesia

Tim Ruby Biologi Farmasi. 2015. Metode Pemisahan Bahan Alam. Bandung: STFB. Underwood. 2011. Analisa Kimia Kuantitatif edisi ke-6. Jakarta: Erlangga. Wagner. H. 1984. Plant Drug Analysis a Thin Layer Chromatography Atlas.Springer-Verlag. Wijaya.H.M. Hembing.1992. Tanaman Obat Berkhasiat di Indonesia. Jakarta.

60

61