Inyectores Hplc d162w

Inyectores y columnas para HPLC Evaluación de calidad de los medicamentos Equipo 5 Flores De La Cruz Edgar Francisco Hernández Guillermo Fátima Jiménez Vásquez Eduardo Rojas Salgado José Luis Profesor: Francisco López Naranjo

Los componentes básicos de un cromatógrafo liquido son: Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de eluyente) Dispositivo de inyección Conducciones y conexiones Detector y registrador columna

Sistemas de inyección • Este método es de gran importancia, un mal sistema de inyección puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatográfica que deterioren su eficacia.

Un inyector ideal debe cumplir con las siguientes características: Introducir la muestra en la columna como una banda lo más estrecha posible Ser de fácil manejo Ser capaz de trabajar a presiones elevadas

• Existen dos tipos de inyectores manuales:

Inyectores de jeringa

Inyectores de válvula

Inyecciones de jeringa

Ventajas

Desventajas

Facilidad de construcción

Falta de reproducibilidad

Permite sacar todo el partido a la eficacia ofrecida por la columna

Presión de tamaño limitada Dificultad de manejo

Inyectores de válvula

Columnas de HPLC SON DE : Acero inoxidable ( aunque también pueden ser de polímeros o vidrio).

COLUMNA

La columna cromatografía es el elemento fundamental de un HPLC, puesto que es donde se produce la velocidad diferencial de los solutos que permite su separación; por lo tanto, resulta fundamental una correcta elección de la columna adecuada para cada separación , ya que con una columna inadecuada o de mala calidad no se obtendrán buenos resultados aunque se disponga del mejor instrumental.

 Tubos de acero inoxidable  Miden entre 5 y 30 cm

 Tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10 μm

 Diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm

 En general se trabaja a temperatura ambiente la temperatura constante mejora el cromatograma (horno)

 Se encuentra la fase estacionaria (sílice, alumina, etc)

Columnas analíticas

Las columnas más utilizadas:

1.-10 a 15 cm de largo 2.- 4.6 mm de diámetro interno 3.-empacadas con partículas de 5 µm

PRECOLUMNA • Para aumentar la vida de la columna analítica • Se coloca delante una precolumna que elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes •

Además, en cromatografía líquido-líquido, la precolumna sirve para saturar la fase móvil con la fase estacionaria y así minimizar las pérdidas de ésta en la columna analítica

•

La composición del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es por lo común mayor para minimizar la caída de presión

precolumnas • Se utilizan dos tipos de precolumnas: 1.-Se utiliza una precolumna entre el reservorio de fase móvil y el inyector. -acondiciona la fase móvil -El disolvente se disuelve parcialmente en el empacamiento de sílice -asegura que la fase móvil se sature con ácido silícico antes de entrar a la columna analítica

2.- precolumna de protección

- posicionada entre el inyector y la columna analítica. - es una columna corta empacada con una fase estacionaria similar a la de la columna analítica. - previene que impurezas como los compuestos altamente retenidos y la materia particulada alcancen y contaminen a la columna analítica. - sirve para incrementar la vida media de la columna analítica

1.- la columna contiene una fase estacionaria, en su mayoría de sílice que puede realizar ciertas funciones como: -superficie absorbente: los grupos activos de la superficie de la sílice o también llamados grupos silanol, son responsables de la separación.

-actuación como substrato microporoso: la sílice permite la selección de moléculas en función de su tamaño

TIPOS DE COLUMNA

REVERSA

PARTICION

NORMAL

ABSORCIÓN INTERCAMBIO IONICO EXCLUSION AFINIDAD

COMPOSICION DE FASE MOVIL DIFERENTE

TIPOS DE RELLENO DE LA COLUMNA El relleno puede ser de dos tipos de partículas porosas o pediculares Los rellenos de partículas porosas para HPLC están formados por micro partículas porosas con diámetros entre 3 y 10 μm y con la menor dispersión posible para un tamaño determinado. La sílice es el material más comúnmente empleado para este tipo de columnas, debido a que se pueden producir partículas con diámetros muy uniformes El relleno pedicular consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos diámetros característicos de 30 a 40 μm. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada de sílice. El relleno pedicular se utiliza ampliamente en pre columnas y no para columnas analíticas

Partículas porosas

TAMAÑO DE PARTICULA: 3-10 µm Tienen un recubrimiento com películas orgánicas unidas física o quimicamente

Peculiar: Puedes ser de vidiro o polímeros: - no porosas e incluyen un diámetro entre 30 y 40 μm Por lo que generalmente incluyen polietileno y polipropileno. Comerciales: -Polystylene (copolímero de estireno-divinilbenceno) -polimetacrilato -Polyhydroxymethacrylate -alcohol polivinílico 

Otros:

Columna HPLC de Partición: • Fase normal: -se trabaja con fase estacionaria polar y fase móvil no polar -se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar

• Fase reversa: Cuando se emplea una fase estacionaria no polar y fase móvil polar.

HPLC NORMAL

FASE ESTACIONARIA(P OLAR) sílice o alúmina ( absorbentes de sílice esférico

FASE ANALITOS (POLAR) MOVIL(APOLAR) Hexano , cloroformo, cianos y aminos. acetato de etilo, methylene chloride, etc.

Relleno/empaquetado:

• útiles para la retención y la separación de hidratos -relleno solido absorbente de sílice o alúmina de carbono. -La fase estacionaria tiene un tamaño de partícula entre 3 y 10 μm. Aunque comúnmente es de 3 a 5 μm -forma esférica -tamaño de poro se mide en A°

HPLC FASE REVERSA En esta técnica una mezcla de agua/solvente orgánico es comúnmente usada como fase móvil, y un sólido de área de superficie altamente no polar es empleado como fase estacionaria. La última es usualmente un empaque de alcanos adheridas a sílice, por ejemplo, con grupos alquilo de 8 o 18 carbonos cubriendo la superficie de sílice. RPC (reverse phase chromatography) es actualmente el método más popular de cromatografía en líquidos; mas del 70 % de todas las separaciones por HPLC son llevadas a cabo por este método. Sirve para analizar compuestos tanto iónicos como no iónicos

HPLC INVERSA/ REVERSA FASE ESTACIONARIA (APOLAR) -Cadenas hidrocarbonadas o grupos fenilo -sílice tratada con otros grupos funcionales como el octadecilo, cianilo, fenilo, butilo entre otros.

FASE MOVIL( POLAR) Agua y acetonitrilo, en donde el agua es utilizado en grandes proporciones con un modificador orgánico que completa la composición del eluyente

ANALITOS (APOLAR) para compuestos como dimetilsililo, fenilsililo, octametilsililo, etc.

las aplicaciones de los métodos de fase inversa se utilizan para preservativos alimentarios, herbicidas y azúcares.

Relleno/empaquetado: -Relleno es liquido y de dos tipos, uno es una matriz de gel de sílice con cadenas alquilo unidos químicamente y el otro es base de resina. ( la segunda se utiliza en caso de que el pH de la primera no es apropiado. -cuanto mas larga es la cadena alquilo mayor es la fuerza de retención. -el tamaño de fase estacionaria con un poro de 30 nm. - Forma esférica - Tamaño de partícula es de 5μm y 6 para en ocasiones hasta 10 nm

HPLC ADSORCIÓN: FASE ESTACIONA RIA

FASE MOVIL

Silica al 90% y disolvente alumina al 10% apolar (nhexano) unido a otro más activo (acetona, cloruro de metilo, etc.)

ANALITO S para compuestos como dimetilsililo, fenilsililo, octametilsilil o, etc.

• separación de compuestos orgánicos neutros (mezclas). • para compuestos no polares con masas inferiores a 5000.

-Se utiliza para moléculas no ionizantes o no solubles en agua. -su fase estacionaria es la superficie de un sólido finamente dividido

Columna HPLC de exclusión/permeación de gel -Se basa en la diferencia de tamaños de moléculas a separar

FASE ESTACIONARIA

FASE MOVIL

ANALITOS

La fase estacionaria es un liquido o partículas nanoporosas (geles de dextrano y sílice). -largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa

Agua, cloroform o, alcoholes ,hexano, cloroform oe isopropan ol

separación de proteínas. Separación de compuestos biológicos como proteínas y péptidos. polímeros

HPLC intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico es un método que permite la separación de moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador iónico, y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil, la cual suele ser una disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas generalmente en forma de buffer. Los iones de ésta compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria.

Columna de intercambio iónico

Intercambiadores iónicos Un intercambiador iónico es, por lo general, un polímero que tiene grupos cargados unidos. INTERCAMBIADORES ANIÓNICOS:

INTERCAMBIADOR CATIÓNICO:

Son portadores de grupos con cargas positivas que unen aniones de forma reversible. Si el grupo cargado es positivo, es un intercambiador de aniones. Los intercambiadores débilmente básicos más corrientes son los grupos aminos alifáticos o aromáticos

Son portadores de grupos con carga negativa que unen cationes de modo reversible. Un grupo típico que se utiliza en los intercambiadores de cationes es el grupo sulfónico, SO-3. Si se une un H+ al grupo, se dice que el intercambiador se encuentra en forma ácida y puede, por ejemplo, intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca+2

FASE ESTACIONARIA

FASE MOVIL

arcillas y las ceolitas, así como resinas solución sintéticas. amortiguadora de pH Contienen grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones)

ANALITOS analizadores para aminoácidos, fármacos y sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azúcares y preparaciones farmacéuticas.