Pruebas Treponémicas Y No Treponémicas 6df3v

UADY FACULTAD DE QUÍMICA Campus de Ciencias De la Salud

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN FACULTAD DE QUÍMICA

CURSO DE VERANO 2013

BACTERIOLOGÍA

Pruebas treponémicas y no treponémicas Elaborado por DAVID POOT PECH

Docente M. en C. Claribel Huchin Chan

FECHA DE ENTREGA

MÉRIDA, YUCATÁN A VIERNES 21 DE JUNIO DE 2013

1. Pruebas serológicas La sífilis se diagnostica en la mayor parte de los pacientes mediante las pruebas serológicas.

Se

utilizan

dos

tipos

generales

de

pruebas,

las

pruebas

biológicamente inespecíficas (no treponémicas) y las pruebas treponémicas específicas.1 Las pruebas no treponémicas se emplean para la detección selectiva porque se realizan con rapidez y son poco costosas. La positividad de una de estas pruebas se confirma con una prueba treponémica.1

Estos grupos son complementarios, no mutuamente excluyentes. Las pruebas no treponémicas son muy útiles como estudios de cribado. Las pruebas treponémicas deben reservarse como estudios confirmatorios cuando una prueba no treponémica es positiva o cuando la sospecha clínica de sífilis es alta, a pesar de que una prueba no treponémica sea no reactiva.2

2. Pruebas serológicas inespecíficas con antígeno de cardiolipina Las pruebas no treponémicas determinan los anticuerpos de IgG e IgM (anticuerpos reagínicos) desarrollados frente a los lípidos que se liberan de las células dañadas durante la fase precoz de la enfermedad. El antígeno que se usa para las pruebas no treponémicas es la cardiolipina, la cual se obtiene del corazón de las vacas. Las pruebas que se usan con frecuencia son la prueba Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) y la prueba de rapid plasmid reagin (RPR).1 Ambas pruebas consiste en una reacción entre un antígeno de lecitina, colesterol y cardiolipina purificada que se mezcla con el suero y/o diluciones del mismo. La presencia de anticuerpos antirreaginas produce una aglutinación de partículas, esta deben observarse al microscopio.3 Ambas pruebas se pueden efectuar de forma rápida, aunque se debe inactivar el complemento en el suero 30 minutos antes de que se pueda realizar la prueba del VDRL, esta prueba solo puede utilizarse para analizar el líquido cefalorraquídeo de los pacientes con sospecha de neurosífilis. Otras pruebas no treponémicas utilizan la reagina sérica no

2

calentada (USR) y la prueba de suero no calentada con rojo de toluidina (TRUST).1 2.1.

VDRL (Venereal Disease Research Laboratory)

2.1.1. Fudamento Es una reacción de floculación, donde el antígeno utilizado está compuesto por colesterol, lecitina y cardiolipina. Esta prueba no treponémica mide anticuerpos antilipídicos; IgG e IgM, los cuales son formados por el huésped en respuesta al material lipídico liberado de las células huésped dañadas en la infección por TP y material lipídico de la superficie celular treponémica. Tiene gran sensibilidad y baja especificidad, utiliza controles para su sofisticación (véase Cuadro 1).4 2.1.2. Metodología para VDRL5 a) Reacción cualitativa (detección). 1. Obtener suero o plasma para utilizarse fresco o descomplementado. 2. Dejar que el látex VDRL alcance la temperatura ambiente. 3. Agitar frasco antes de su empleo y durante el reparto utilizar el cuentagotas para repartir el látex retirarlo del frasco y tapar. 4. En la repartición dejar caer la gota en forma vertical. 5. Agitar seis minutos en el agitador. 6. Leer inmediatamente al microscopio.5 Cuadro 1. Controles para la prueba cualitativa VDRL. Reacción cualitativa (detección ) Depositar en una placa de Kline Suero o plasma Control positivo suero Suero fisiológico Látex VDRL (con contador de gotas calibrado)

Pozuelo No. 1

Pozuelo No. 2

Pozuelo No. 3

Testigo antígeno

Control positivo titulado

3 a 24 sueros o plasmas pacientes 30 µL 1 gota

30 µL 1 gota

30 µL 1 gota

b) Reacción cuantitativa preparar varias disoluciones con el suero de control positivo titulado o los sueros de pacientes, con solución salina isotónica (de 1:2 hasta 1:128). Realizar la reacción con cada una de estas disoluciones (como en la reacción cualitativa).5

3

2.1.3. Interpretación de resultados La formación de cúmulos de las partículas de látex (en masas véase Figura 1) se considera una reacción positiva, reportándose como Reactiva. Es una prueba negativa o no reactiva, si se observan las partículas de látex repartidas uniformemente.5

Figura 1. Prueba VDRL: las reacciones en esta prueba se evalúan microscópicamente. (A) Suero no reactivo. Las partículas de antígeno VDRL se encuentran dispersas de forma uniforme, sin agruparse. (B) Suero reactivo: las partículas de antígeno VDRL están fuertemente aglutinadas por este suero sifilítico. Las partículas aisladas se agrupan en cúmulos y grandes grumos. 100 x.

2.2.

2

RPR (Prueba rápida de reagina plasmática)

2.2.1. Fundamento Es una suspension estabilizada que contiene cardiolipina, lecitina y colesterol. a la cual se le ha adicionado particulas de carbon.6 La prueba RPR es rápido, barato, y fácil de usar. Es excepcionalmente útil en la detección. Al igual que su contraparte no treponémico mayor, la VDRL, que puede ser cuantificada. Estas pruebas son muy sensibles, es decir, hay pocos falsos negativos, excepto como se discute a continuación.7

2.2.2. Equipos, materiales y reactivos Aguja calibre 20 descartable, sin bisel, tratada con silíconas, frasco de plástico para distribuir antígeno. De 3,89 g, tarjetas RPR recubiertas de plástico con diez círculos, de aproximadamente 18 mm de diámetro cada uno, dispositivos plásticos desechables (Dispenstir®). para distribución-agitación, que libera 50 µL.2

4



Placa rotatoria mecánica, de velocidad tija o regulable a 100 ± 2 rpm, que describa un círculo de 1,8 cm de diámetro en el plano horizontal.



Cubierta humectante para la placa rotatoria.



Lámpara incandescente de alta intensidad.



Dispositivo de seguridad para pipetear, con puntas descartables de 50 µL.



Recipientes para residuos y desinfectantes.



Guantes de látex desechables. anteojos de seguridad y ropa protectora.



Suspensión de antígeno RPR (una variante del antígeno para VDRL): combinación estabilizada de cardiolipina al 0,003%, lecitina al 0,020-0,022%, colesterol al 0,09%. cloruro de colina al 10%, EDTA 0.0125M, carbón al 0,1875%, Na2HP04 0,1 M,2



KH,P04 0,01 M, timerosal al 0,1% y agua destilada.



Muestras de suero control: sueros liofilizados sobre una tarjeta reactivo (R), de reacción mínima (MR) y no reactivo (N).



Solución fisiológica al 0.9% como diluyente. 2.2.3. Métodos para la detención de RPR 2.2.3.1.

Método cualitativo

1. Perforar el inserto del frasco y colocar la aguja calibrada.5 2. Mezclar perfectamente el frasco del antígeno por agitación ligera antes de cada determinación. 3. Con el tubo gotero colocar en un círculo de la tarjeta una gota del suero o plasma del paciente, extendiendo la gota en el área de reacción, con la parte posterior del tubo gotero o de polietileno. 4. Con el frasco gotero en posición vertical y con la aguja hacia abajo agregar una gota de antígeno a la gota colocada en el paso 3. No mezclar las dos gotas5 5. Mantener la tarjeta en rotación por 8 minutos a 100 rpm. 6. Al término de la rotación interpretar los resultados en un periodo de 1 minuto.5 2.2.3.2.

Interpretación de resultados

Reactivo: aparición de partículas de carbón aglutinado.

5

No reactivo: presencia de una suspensión homogénea de color gris, en ocasiones aparece el botón central, o algunas partículas de carbón migran al borde del círculo, permaneciendo la suspensión homogénea en ambos casos el resultado se reporta como negativo o no reactivo.5

2.2.3.3.

Método cuantitativo

Pruebas cuantitativas RPR se reportan como "no reactivo" o "reactivo" en diluciones de 1:01, 1:02, 1:04, 1:08, 1:16, 1:32, 1:64, etc Si bien gran confianza puede ser colocado en las pruebas RPR o VDRL, recuerde que los pacientes con sífilis primaria activa infecciosa con frecuencia tienen VDRL no reactivo y las pruebas de RPR (véase Figura 2).7

Figura 2. Reacciones de RPR pruebas cualitativas y cuantitativas.

2.3.

Reacción en suero no calentado. USR (Unheated Serum Reagin)

2.3.1. Principios de la prueba La USR es una prueba microscópica, no-treponémica y de floculación en placa. El antígeno de USR detectara anticuerpos (reaginas) antilipoidales en muestras de suero de personas con otras condiciones agudas y crónicas.

6

La prueba de microfloculación USR usa una suspensión de antígeno de VDRL modificado que contiene cloruro de colina, la cual incrementa la reactividad del anticuerpo en suero no calentado. Semejante a la VDRL, la prueba se lee microscópicamente y es rápido y fácil de hacer. Sin embargo, a diferencia de la VDRL, la suspensión antigénica de la USR no debe ser preparada o descartada diariamente.4

2.3.2. Materiales 2.3.2.1.

Reactivos

1. Suspensión antigénica USR. Una combinación estabilizada de cardiolipina, colesterol y lecitina en una solución resuspendida de EDTA, cloruro de colina, fosfato y timerosal. La suspensión antigénica se guarda a 2 – 8 °C. Suspensiones no abiertas son estables al menos por 1 año desde la fecha de manufactura o hasta la fecha de expiración.2 2. Alcohol, Etanol 95% 3. Acetona 2 2.3.2.2.

Preparados

1. Muestras de suero control. Reactivo (R), débil reactivo (D) y no reactivo (NR). 2. Solución salina 0,9%. Agregar 0,9 g de cloruro de sodio seco (ACS) a 100 ml de agua destilada. 2.3.4. Procedimientos 2.3.4.1.

Prueba Cualitativa

1. Las pruebas de floculación en placa para sífilis, son afectadas por la temperatura. Para obtener resultados confiables y reproducibles, la suspensión antigénica de USR, los controles y la muestra a analizar deben estar a temperatura ambiente (23 – 29 °C) cuando se realiza la prueba.2 2. Colocar con una pipeta automática 50 µl de suero no calentado en un anillo de parafina o cerámica de la placa. No usar placas de vidrio con concavidades, pocillos o anillos de vidrio.

7

3. Resuspender suavemente la suspensión de antígeno de USR. 4. Sostener la aguja dispensadora de la suspensión antigénica y la jeringa en posición vertical, dispensar varias gotas para eliminar el aire de la aguja; luego agregar exactamente 1 gota (22 µl) de suspensión antigénica a cada círculo conteniendo suero. 5. Colocar la placa sobre el rotador mecánico. Rotar la placa por 4 minutos a 180 ± 2 rpm. Cuando se realiza la prueba en un clima seco, cubrir las placas con un cobertor humidificante durante la rotación para prevenir la evaporación excesiva. 6. Inmediatamente después de la rotación, sacar la placa del rotador y leer los resultados. 7. Realizar la prueba cuantitativa en todas las muestra de suero que produzcan un resultado reactivo, débil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba cualitativa.2 2.3.4.1.1. Lectura e informe de los resultados cualitativos 

Leer las reacciones usando un microscopio equipado con ocular de 10X y objetivo de 10X.



Informar los resultados de la siguiente manera (véase cuadro 2):2 Cuadro 2. Interpretación de resultados pruebas USR

Lectura Grumos grandes o medianos Grumos pequeños Sin grumos o muy ligera rugosidad 2.3.4.2.

Informe Reactivo (R) Débil reactivo (D) No reactivo (NR)

Prueba Cuantitativa

Diluir hasta un título de punto final todas las muestras que produzcan resultados reactivo, débil reactivo o no reactivo rugoso en la prueba cualitativa. Analizar la muestra de suero no diluida y diluida 1:2, 1:4 y 1:8. Se pueden realizar en una sola placa las pruebas cuantitativas hasta diluciones 1:8 de tres muestras de suero (véase Figura 3 y Cuadro 3 para la interpretación del resultado).4, 6

8

Figura 3. Prueba cuantitativa parea USR Cuadro 3. Informe de los resultados cuantitativos en suero Suero no diluido (1:1)

Resultado en diluciones del suero

4,6

Inforeme

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

R

D

N

N

N

N

Reactivo, no diluido (1 dil)

R

R

D

N

N

N

Reactivo, 2 dils

R

R

R

D

N

N

Reactivo, 4 dils

D

D

R

R

D

N

Reactivo, 8 dils

N (rugoso)

D

R

R

R

N

Reactivo, 16 dils

D

N

N

N

N

N

Débil Reactivo, 1 dil

A continuación se reporta en el Cuadro 4, la sensibilidad de las pruebas no treponémicas en los diferentes estadios de la enfermedad de sífilis. Cuadro 4. Sensibilidad y Especificidad de las Pruebas No-Treponémicas Sensibilidad (%) por estadio de sífilis no tratada (rango) Prueba

Primaria

VDRL

78 (74-87)

RPR

86 (77-99)

USR

80 (72-88)

TRUST

85 (77-86)

Secundaria

100

Especificidad No-sífilis %

Latente

Tardía

96 (88-100)

71 (34-94)

98 (96-99)

98 (95-100)

73

98 (93-99)

95 (88-100)

-

99

98 (95-100)

-

(rango)

99 98-99)

3. Pruebas serológicas específicas con antígeno treponémico 3.1.

Prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes

(FTA-ABS)

9

La prueba treponémica más empleada era la prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS) la cual es una prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos. Las células de T. pallidum inmovilizadas en el portaobjetos se utilizan como antígeno. El portaobjetos se recubre de suero del paciente, que se ha mezclado con un extracto de treponemas no patógeno. A continuación se añaden antibióticos antihumanos marcados con fluoresceína con el propósito de detectar la presencia de anticuerpos específicos en dicho suero.1

3.1.1. Materiales y equipo

Estufa de incubación de 35 a 37 °C, baño de agua regulable a 56 °C, dispositivo de seguridad para pipetas. micropipeteadores graduables de 10 a 200 µL, Ansa bacteriológica estándar de platino de 2 mm calibre 26, papel absorbente, soporte para portaobjetos con cámara húmeda y toallas de papel, placas de coloración, de vidrio o plástico, con soporte para portaobjetos desmontable, portaobjetos de 2,5 x 7,5 cm, con un extremo mate, de 1 mm de espesor, con dos círculos grabados, de 1 cm de diámetro interno, cubreobjetos, tubos de ensayo (12 x 75 mm) y gradillas, recipientes para descartar el material y desinfectantes, guantes de látex descartables, anteojos de seguridad y ropa protectora, microscopio de fluorescencia equipado para microscopia con fluoresceína, agitadora B.2

3.1.2. Reactivos Comerciales 

Antígeno de T. pallidum: una suspensión de T. pallidum (cepa Nichols) obtenida en tejido testicular de conejo y lavada con solución salina tamponada. para eliminar las globulinas de conejo.2



Suero anti-IgG humana marcado con FITC.2



Absorbente: preparado de cultivos de treponemas de Reiter no patógenos, habitualmente sin el agregado de conservantes. A menudo se venden fraccionados en cantidades de 5 mL y liofilizados, aunque también se venden en estado líquido.

10



Suero control reactivo: una mezcla de muestras de suero humano obtenidas de dadores sifilíticos que son reactivos 4+. Se utilizan para preparar sueros control 4+ y controles mínimamente reactivos 1+. El control 1+ muestra el grado mínimo de fluorescencia informado como reactivo y se utiliza como estándar de lectura.



Suero control inespecífico: una mezcla de sueros obtenida de individuos no sifilíticos. Sin agregado de conservantes. Este control muestra una reactividad inespecífica > 2+ en una dilución 1:5 en buffer de fosfatos (PBS) y casi no se tiñe cuando se diluye 1:5 en absorbente.



Aceite: aceite de inmersión de baja fluorescencia, no secante, tipo A, Cargille 1248.



Acetona: reactivo grado ACS.2

3.1.3. Reactivos preparados 

PBS, pH 7,2.2



Tween 80 (polisorbato 80) al 2% en PBS. Calentar los reactivos en baño María a 56 °C. Agregar a 49 mL de PBS esteril 1 mL de Tween 80, medido desde el extremo de una pipeta, lavando la pipeta con la mezcla. Controlar el pH y llevarlo a 7,2 con NaOH 1 N. Desechar si se forma un precipitado o el pH cambia.



Medio de montaje: agregar una parte de PBS a 9 partes de glicerina (reactivo proanálisis).



Agua destilada.

3.2.

Preparación de los reactivos de la prueba

3.2.1. Antígeno de T. pallidum 

Rehidratar el antígeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante.2



Los frascos ampolla abiertos, conservados a 2 a 8 °C, son estables durante una semana.2



Para preparar los portaobjetos, mezclar completamente la suspensión del antígeno en una agitadora durante 10 segundos. Determinar por microscopia de fondo oscuro que los treponemas estén adecuadamente dispersos antes de realizar los frotis para la prueba FTA-ABS.

11



Limpiar los portaobjetos con una gasa limpia para eliminar las panículas de polvo. Limpiar los portaobjetos por vibración sónica o frotándolos con alcohol si los treponemas no se ven con claridad después de la coloración.



Preparar frotis muy delgados de T. pallidum dentro de cada circulo mediante un ansa de alambre de 2 mm. Colocar el antígeno contenido en un ansa dentro de dos círculos de 1 cm. Dejar secar al aire al menos durante 15 minutos.



Fijar los portaobjetos en acetona durante 10 minutos y secar al aire. No fijar más de 60 portaobjetos con 200 mL de acetona.



Conservar los frotis fijados con acetona a - 20 °C. No descongelar y congelar nuevamente los frotis.



Conservar los frascos ampolla de antígeno no abiertos a 2 a 8 °C. El antígeno no abierto es estable hasta la fecha de vencimiento. 2

3.2.2. Titulación de la anti-IgG humana 

Rehidratar el conjugado de acuerdo con las instrucciones. Si esta turbio, centrifugarlo a 500 g durante 10 minutos. Fraccionar en alícuotas pequeñas y conservar a -2 0 °C. No congelar nuevamente el conjugado descongelado; conservarlo a 2 a 8°C.2



Preparar diluciones 4+ y 1+ del suero reactivo de control, para determinar la dilución de trabajo del conjugado.



Correr el patrón control con una referencia o un conjugado conocido.2

3.3.

TINCION INESPECIFICA SUERO REACTIVO 4+ y 1+

3.3.1. Adsorbente 

Rehidratar el material liofilizado con agua destilada esteril o de acuerdo con las

instrucciones del fabricante. El absorbente

rehidratado puede

conservarse a 2 a 8 ºC o a -2 0 ºC. Puede utilizarse todo el tiempo que se desee mientras la reactividad obtenida sea aceptable y el producto no este contaminado.2 3.3.2. Suero problema

12



Seguir las medidas de seguridad recomendadas para la manipulacion de sueros humanos.2



Calentar el suero problema y el suero control a 56 °C durante 30 minutos, antes de realizar la prueba.



El día de la prueba recalentar el suero problema durante 10 minutos a 56 °C.2

3.3.3. Suero control 

Rehidratar el suero de acuerdo con las instrucciones del fabricante.2



Fraccionar en alícuotas de 0,25 mL y conservar a -2 0 °C durante todo el tiempo en que la reactividad sea aceptable.



Preparar los siguientes controles para cada determinación: o Suero control reactivo (R) 4+: un suero sifilítico que muestre fluorescencia 4+ en una prueba sin absorción y fluorescencia solo levemente reducida en la prueba absorbida. Para producir suero no absorbido, agregar 50 µL de suero control reactivo a un tubo que contenga 200 µL de PBS y mezclar bien. Para producir suero absorbido, transferir 50 µL del suero control reactivo a un tubo con 200 µL de absorbente y mezclar bien. o Suero control mínimamente reactivo (MR). Es una dilución en PBS del suero control reactivo, que del mínimo grado de fluorescencia (1+) considerada reactiva. o Suero control inespecífico (NS): un suero no sifilítico que muestre fluorescencia >2+ en la prueba no absorbida. Para producir el suero no absorbido, transferir 50 µL del suero control inespecífico a un tubo que contenga 200 µL de PBS y mezclar bien. Para producir el suero absorbido, transferir 50 µL del suero control inespecífico a un tubo con 200 |iL de absorbente y mezclar bien. o Los controles para tinción inespecífica de los conjugados consisten en un frotis de antígeno cubierto con 30 µL de PBS en lugar de suero y un frotis de antígeno cubierto con 30 µL de absorbente en lugar de suero.2

13

3.4. 

Prueba FTA-ABS

Identificar los portaobjetos preparados antes con antígeno numerándolos en el extremo mate.2



Numerar cada tubo y portaobjetos para que se correspondan con el suero problema y el suero control por utilizar.



Preparar diluciones del suero control reactivo (4+), mínimamente reactivo (1+) y control inespecífico en absorbente o PBS de acuerdo con las instrucciones.



Pipetear 200 µL de absorbente en un tubo de ensayo para cada suero problema.



Agregar 50 µL de suero problema calentado al tubo correspondiente y mezclar ocho veces.



Cubrir los frotis de antígeno que corresponda con 30 µL de las diluciones suero control reactivo (4+), mínimamente reactivo (1+) y control inespecífico.



Cubrir los frotis de antígeno que corresponda con 30 µL de PBS y 30 µL. de absorbente para los controles a y b de tinción inespecífica. Los controles deben mostrar el siguiente patrón:



Cubrir los frotis de antígeno que correspondan con 30 µL de las diluciones del suero problema.



Evitar la evaporación colocando los portaobjetos en cámara húmeda e incubar a 35 a 37 °C durante 30 minutos.



Al finalizar la incubación realizar los siguientes lavados:2 o Colocar los portaobjetos en los soportes para tinción y lavar 5 segundos con PBS corriente. o Colocar durante 5 minutos los portaobjetos en cubetas de coloración que contengan PBS. o Agitar los portaobjetos sumergiéndolos y retirándolos del PBS al menos 30 veces. o Repetir los dos pasos anteriores con PBS nuevo.

14

o Lavar los portaobjetos durante 5 segundos con agua destilada corriente y secar en forma suave con papel absorbente.



Diluir la anti-IgG humana marcada con FITC hasta su título de trabajo en PBS con 2% de Tween 80 y colocar aproximadamente 30 µL de conjugado diluido sobre cada frotis.



Repetir la incubación y los lavados de los portaobjetos.



Montar los portaobjetos de inmediato, colocando una pequeña gota de medio de montaje y un cubreobjetos sobre cada frotis.



Colocar los portaobjetos en una habitación oscura y leer antes de transcurridas 4 horas.



Controlar los frotis por microscopia de fondo oscuro, utilizando primero la lámpara de tungsteno, para verificar la presencia de treponemas en el frotis, luego leer la fluorescencia FITC (prueba).



Utilizando el portaobjetos de control mínimamente reactivo (1+) como estándar de lectura, registrar la intensidad de fluorescencia de los treponemas:



Informar los resultados de la siguiente forma (véase Cuadro 5 y Figura 4):2 Cuadro 5. Sistema de informe para la prueba FTA-ABS

Lectura inicial de la prueba Lectura de repetición Informe 4+ Reactivo 3+ Reactivo 2+ Reactivo 1+ Reactivo Mínimamente reactivo* 1+ ˃1+ 1+ 1+ No reactivo ˂1+ ˂1+ No reactivo N No reactivo Fluorcencia atípica observada** Fluorescencia en rosario *En ausencia de signos de infección treponémica, este resultado de la prueba debe considerarse dudoso. Debe obtenerse una segunda muestra 1 a 2 semanas después de la muestra inicial y enviarla al laboratorio para realizar pruebas serológicas. **La fluorescencia en rosario ha sido observada en pacientes con lupus eritematoso sistémico activo o con otras enfermedades autoinmunitarias.

15

Figura 4. Treponema pallidum. Este control de la prueba FTA-ABS muestra tinción 4+ de las espiroquetas. Se observan la forma helicoidal y las espirales firmemente enrolladas en algunas de las celulas bacterianas. Esta microfotografía es una preparación con inmunofluorescencia indirecta de T. pallidum que utiliza antiglobulina humana conjugada con fluoresceína (aumento original. 600x).

2

4. Otras pruebas treponémicas Otra de estas pruebas es la Treponema pallidum haemaglutination assay (TPHA) la cual consiste en un test de aglutinación indirecto para la determinación de anticuerpos T. pallidum en el suero/plasma humano. Una prueba de estas es la TPI (Treponema pallidum immobilizatiton) sin embargo, esta prueba ya es obsoleta debido a su baja sensibilidad en la sífilis primaria.

2

La Reacción de inmovilización del T. pallidum (TPI o prueba de Nelson): esta es una prueba costosa, de ejecución muy delicada, que ya ha sido prácticamente sustituida por la FTA-ABS, a pesar de ser la más específica. Se ha considerado prueba de referencia en casos dudosos y consiste en la demostración de la inmovilización de T. pallidum vivos móviles por los anticuerpos específicos en el suero del paciente, después de la segunda semana de la infección. Se mezclan diluciones del suero del paciente con complemento y T. pallidum vivos y activamente móviles, extraídos de chancros testiculares de conejo. La reacción se lee en el microscopio de campo oscuro y se considera positiva cuando se produce la inmovilización de más del 50 % de los treponemas presentes. En suero normal, el movimiento activo continúa. Esta prueba es difícil de realizar, requiere treponemas vivos y en la actualidad rara vez se practica.8

16

Reacción de hemaglutinación pasiva (HAP) (TPHA) y microhemaglutinación Treponema pallidum (MHA-TP): estas pruebas son de reciente introducción; la MHATP se ha utilizado para la determinación de anticuerpos específicos antitreponémicos. Se basa en la sensibilización de hematíes formalinizados de pavo o de carnero, con un lisado de T. pallidum. La adición de un suero positivo provoca la aglutinación de los hematíes. Es una prueba muy sensible, pero menos específica que la FTA-ABS, es muy simple y de bajo costo, por lo que su uso se está generalizando. Esta prueba se hace positiva un poco más tarde, en la evaluación de la infección; es confirmatoria para el diagnóstico de la sífilis, con la excepción de la fase primaria de la enfermedad. Se han empleado ensayos que usan la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para la demostración del ADN de T. pallidum en muestras clínicas, pero el papel del PCR en laboratorio clínico necesita aún ser determinado.8

4.1.

Prueba rápida para determinación de sífilis en sangre total

Las pruebas rápidas para

la determinación de

sífilis son

un ensayo

inmunocromatográfico en fase sólida para detección cualitativa de anticuerpos tipo IgG, IgM e IgA contra Treponema pallidum.4 Los tipos de muestra con que se ha estandarizado este método son sangre, suero y plasma, otros fluidos no son recomendados para realizar esta prueba. Las muestras que son obtenidas prematuramente durante el periodo de infección, pueden tener niveles no detectables de anticuerpos. Si se obtiene un resultado negativo y la clínica del paciente es sospechosa, se debe repetir la prueba después de un tiempo según criterio médico.4

4.1.1. Procedimiento 

Rotular el dispositivo de prueba rápida con el nombre o número del paciente.4



Limpiar la zona de punción con algodón impregnado en alcohol, secar con un algodón seco y limpio.

17



Presionar el dedo seleccionado para hacer llenado capilar.



Puncionar con la lanceta la parte lateral de la yema del dedo.



Con la pipeta plástica o tubo capilar tomar la cantidad de sangre necesaria para la prueba.



Adicionar la cantidad requerida de sangre según la técnica utilizada dentro del pozo de muestra.



Agregar las gotas necesarias de diluyente (de acuerdo a la técnica utilizada) dentro del pozo de muestra .En este paso se debe esperar a que se absorba cada gota de diluyente antes de agregar la siguiente.

Interpretar la prueba dentro del tiempo señalado en la técnica.4

4.1.2. INTERPRETACIÓN • En la ventana de resultados aparecerá una banda de color en la línea de control señalada con la letra C, lo que indica que la prueba está funcionando adecuadamente. •

En la ventana de resultados, en la línea señalada con la letra T aparece el resultado del paciente:

Negativo: Solamente aparece la banda de color en el control C. 4 Positivo: Aparecen dos bandas de color, la banda control C y la banda test T. 4 Inválido: Cuando no aparece ninguna banda de color en la línea de control C, se debe repetir la prueba con un dispositivo de prueba nuevo. A continuación en el Cuadro 6, se resumen las diferencias de las pruebas de serología treponémicas y no treponémicas. Cuadro 6. Diferencias entre las pruebas treponémicas y no treponémicas.

Características

Pruebas no treponémicas

Pruebas treponémicas





  

VDRL (Venereal Disease Research Laboratories). RPR (rapid plasma reagin). USR (Unheated serum reagin). TRUST (Toluidine red unheated serum test).

18

  

6

TP-PA (Treponema pallidum particle agglutination) MHA-TP (microhaemagglutination assay for antibodies to Treponema pallidum). FTA-ABS (fluorescent treponemal antibody absorption) EIA (Nontreponemal enzyme immunoassays).



Costos

 Baja especificidad.  Subjetividad. Bajos

MHA-TP (microhaemagglutination assay for antibodies to Treponema pallidum).  Pruebas rapidas  No sirven para seguimiento.  Algunas requieren instrumental y personal calificado.  Las pruebas treponémicas suelen permanecer positivas para toda la vida, por lo que no permiten distinguir entre sífilis activa y pasada.  La cuantificación de las pruebas Treponémicas no es fiable.  Permanece positiva de por  vida. Altos

Complejidad

Baja

Variables

Ventajas

 

Desventajas

Ampliamente difundidas y disponibles. Permiten seguimiento al poderse valorar la respuesta al tratamiento y diagnosticar infecciones recurrentes de sífilis.

5. Listado de referencias 1- Murray, P.; Rosenthal, K.; Pfaller, M. Micribiología médica. 6ª Edición. Editorial Elsevier, Barcelona, 2009, pp 409 2- Winn, W.; Allen, S.; Janda, W.; Koneman, E.; Procop, G.; Schrekenberger, P.; Woods, G. Koneman diagnóstico microbiológico: texto y atlas en color. 6ª edición, Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires, 2008, pp 1082; 1461-5. 3- Basualdo J. Torres R. Microbiología Biomédica. Editorial Atlante S.R.L. Buenos Aires, 2006, pp. 491. 4- Malbrán, C.G. Manual de técnicas y procedimiento para el diagnóstico de sífilis. Centro Nacional de Referencia en Enfermedades de Transmisión Sexual. INEI-ANLIS, Argentina, 2010; pp 1-37. 5- Garibay, A. Manual de prácticas de Inmunología. Editorial UniSon, Hermosillo, Sonora, 2006; pp 75-82 6- xx. Trejos, S.; Zambrano, J. Manual para el diagnóstico de sífilis. Instituto nacional de salud. 2011. pp. 5, 23. 7- Texas department of state health service. Interpretation of Serological Tests for Syphilis. HIV-STD testing locations in Texas FACTS, 2005, 1-4.

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8- Llop, A.; Valdés-Depena, M.; Zuazo, J. Microbiología y parasitología médicas. Tomo 1, CIP editorial Ciencias Médicas, La Habana, 2001, pp 394, 395.

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