Determinación De Proteínas Por El Método De Lowry Y Bradford 3q711f

Determinación de proteínas por el método de Lowry y Bradford.

Los métodos colorimétricos para identificar proteínas presentan algunas desventajas al utilizar la misma proteína como patrón para obtener los valores reales debido a las condiciones como son: la interacción de los reactivos, la descomposición de los reactivos, el tiempo y la temperatura. El método de Lowry y Bradford son métodos de alta sensibilidad la cual es buena cuando se miden concentraciones muy bajas. El más usado es el método de Bradford por su rapidez y su facilidad al momento de usar. Método de Bradford. Presenta poca sensibilidad donde la proteína reacciona con el azul de coomassie G-250, que existe en dos formas azul y naranja. La proteína se une con el azul de coomassie obteniéndose un color azul. Los aminoácidos principales que se unen al colorante son histidina, lisina, tirosina, triptófano y fenilalanina obteniéndose una absorbancia entre 465 a 595 nm. Esta reacción es bastante rápida y fácil de manejar. Método de Lowry. Se requieren condiciones alcalinas para que el Cu 2+ al momento de reaccionar con los enlaces peptídicos de la proteína se reduzca a Cu +, formando un compuesto colorido azul. El Cu + con los reactivos de aminoácidos reacciona con el reactivo de Felin (para reducirlo) dando un color más azulado. El nuevo reactivo es muy inestable inicialmente, se va reduciendo lentamente hasta formar azul de molibdeno/ tungsteno. El espectro de absorción presenta barias longitudes de onda debido a que se encuentran presentes otras sustancias dando un margen entre 500 y 700 nm.

Método de Lowry. Objetivo.    

Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico. Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry. Conocer el efecto de sustancias no proteínicas en el desarrollo de color. Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas.

Método experimental. Curva de calibración: 1) adicionar albumina y los reactivos de acuerdo a las tablas 2) Dejar desarrollar el color durante 30 min y leer en el espectrofotómetro a 590 nm 3) Registrar la absorbancia obtenida. Análisis estadístico: 1) Preparar 10 tubos con las mismas condiciones del tubo 3 de cada método 2) Dejar desarrollar color durante 30 min y leer en el espectrofotómetro a 590 nm. Efecto de sustancias no proteínicas en el método de Lowry: 1) Preparar 5 tubos con las mismas condiciones del tubo 3. 2) Se adiciona 0.1 ml de las primeras 5 sustancias interferentes de la tabla y se lee en el espectrofotómetro. Resultados. Elaboración de la curva de calibración. Tabla 1. Curva de calibración de albumina. Método de Lowry Tubo No.

Cantidad de proteína ( µg)

1 2 3 4 5

25 50 75 100 125

Serie A

Serie B

590nm

590 nm

0.067 0.127 0.177 0.242 0.292

0.07 0.123 0.188 0.244 0.276

a) Calcule y escriba los valores de la pendiente, ordenada al origen y el coeficiente de correlación y su interpretación para la curva de calibración. Y=A+BX A= 0.0159 B= 0.002196

R=0.9965

Curva de calibración de la albumina a 590 nm 0.35 0.3 0.25 0.2 Absorbancia 0.15

Serie B

0.1

serie A

0.05 0 20

40

60

80

100

120

cantidad de proteina (µg)

Se puede observar que la pendiente es positiva, por lo tanto las rectas tendrán pendiente positiva lo que indica que a mayor concentración mayor absorbancia. El coeficiente de correlación es muy cercano a 1, por lo tanto el grado de relación entre las absorbancias obtenida es cercano.

b) ¿Cumple la ley de Bouger y Beer? ¿Entre que límites de cantidad de proteína? Si ya que la absorbancia es proporcional a la concentración de proteína. Entre 25 y 125 µg c) a partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma, obtenga la expresión matemática para calcular la cantidad de proteína. Y= A+BX

Y −A B

donde Y= la absorbancia obtenida y X= la cantidad de proteína en µg. X=

Y −0.0159 0.002196

Tubo No.

A590

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.192 0.2 0.211 0.184 0.187 0.187 0.208 0.195 0.197 0.219

Cantidad de proteína (µg) 80.19 83.83 88.84 76.74 77.91 77.91 87.47 81.55 82.46 92.48

Análisis estadístico. Tabla 2. Replicas para el análisis estadístico. Ejemplo de cálculos. X=

0.192−0.0159 0.002196

= 80.19

X=

X=

0.200−0.0159 =83.83 0.002196

X=

(80.19+83.83+ 88.84+76.74+77.91+77.91+87.47+ 81.55+82.46+92.48) = 82.93 10

S= 5.227 S2=S

S 2= (5.227)2

%C.V=

+ -

μ= X

S X t .S √n

%C.V=

5.227 82.93

S2= 27.32 X100

%C.V= 6.30

+ -

μ= X

donde t con 10 datos a 95% = 2.262

t .S √n

μ= 82.93

2.262 x 5.227 √ 10

+ -

79.79.1911 a 86.6689 Tabla 3. Resultados de análisis estadístico.

X

S

S2

% C.V.

82.73

5.227

27.32

6.30

µ

79.191186.6689

Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en el método de Lowry

Tubo No.

Sustancia

1

Tris 1 M, pH 7.0

2 3 4 5

A590

0.18 9 Glicerol al 1 % 0.22 0 Detergente comercial al 1% 0.16 7 Dodecil sulfato de sodio(SDS) 0.20 al 1 % 7 Ácido tricloroacetico(TCA) 0.17 8

Cantidad de proteína (µg) 78.82

Tipo de interferenc ia.

92.94

+

68.80

-

87.02

+

73.81

-

-

μ=

Se observa que el tris, el detergente comercial y el ácido tricloroacetico son interferentes negativos porque hay una disminución de la concentración de la proteína, mientras que el glicerol y el SDS aumentan la concentración de proteína por lo que son interferentes positivos. Discusión. La curva de calibración nos permite encontrar la concentración de albumina a partir de la absorbancia obtenida. Se puede observar que la ley de Bouguer y Beer se cumple pues la concentración es proporcional a la absorbancia. Los datos obtenidos por el analista fueron precisos pero no exactos, pues en la curva de calibración a una concentración de 20 microgramos hay una dispersión en los datos, esto se puede deber a errores del analista y errores de los instrumentos, pero el índice de correlación es alto, lo que indica que hay una relación cercana entre los datos obtenidos. En el análisis estadístico las concentraciones obtenidas a partir de la ecuación de la recta, demuestran que la desviación estándar es baja por lo que hay poca dispersión en los en datos. El glicerol y el SDS presentan interferencias + , esto se puede deber a que las sustancias tengan propiedades similares a la proteína, por lo que la absorbancia será mayor y en consecuencia se leerá mayor concentración de proteína. El glicerol, el detergente y el TCA son interferentes negativos, esto se puede deber a la reacción de las sustancias con la albumina, disminuyendo la absorbancia.

Conclusión. La curva de calibración permite obtener la concentración de albumina y demostrar que si se cumple la ley Bouguer y Beer. Las sustancias interferentes producen un aumento o disminución en la lectura de la absorbancia, obteniéndose una mayor o menor concentración de proteína. El método de Lowry es un método preciso, fácil de manejar y requiere de demasiado tiempo para cada reacción. Método de Bradford. Objetivo.   

Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico. Determinar el efecto de algunas sustancias no proteicas que pueden interferir en el método. Determinar si hay diferencias estadísticamente significativas en la precisión y exactitud el método de Lowry.



Analizar las ventajas y desventajas de este método, con respecto a otros métodos para la determinación cuantitativa de proteínas.

Método experimental. Curva de calibración: 1) adicionar albumina y los reactivos de acuerdo a las tablas 2) Dejar desarrollar el color durante 10 min y leer en el espectrofotómetro a 595 nm 3) Registrar la absorbancia obtenida. Análisis estadístico: 1) Preparar 10 tubos con las mismas condiciones del tubo 3 de cada método 2) Dejar desarrollar color durante 10 min y leer en el espectrofotómetro a 595nm. Efecto de sustancias no proteínicas en el método de Bradford: 1) Preparar 5 tubos con las mismas condiciones del tubo 3. 2) Se adiciona 0.1 ml de las primeras 5 sustancias interferentes de la tabla y se lee en el espectrofotómetro a 595 nm.

Resultados. Elaboración de la curva de calibración. Tabla 5. Curva de calibración de albumina. Método de Bradford

Tubo No. 1 2 3 4 5

Cantidad de proteína ( µg) 25 50 75 100 125

Serie A

Serie B

0.362 0.574 0.594 0.615 0.645

0.381 0.541 0.525 0.597 0.693

Consideraciones. Se eliminaron los tubos 2 y 3 por estar muy dispersión y tener una mayor R.

Curva de calibracion de albumina 0.8 0.6

Serie A

Absorbancia a 595 nm 0.4 0.2

serie B

0 0 50 100150 Cantidad de proteina (µg

a) calcule y escriba los valores de la pendiente, la ordenada al origen y el coeficiente de correlación, diga cómo se interpretan para la curva de calibración ajustada. B=3.01X10 -3

A= 0.298

R= 0.9916

La pendiente es positiva, por tanto las líneas tendrán tendencia positiva, pero para que el índice de correlación fuera alto se requirió eliminar los puntos que se salían de la gráfica. b) ¿cumple la curva la ley de Bouger y Beer? ¿Entre que límites de cantidad de proteína? Si porque al presentar tendencia positiva indica que la concentración es proporcional a la absorbancia. c) a partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma, obtenga la expresión matemática para calcular la cantidad de proteína. Y= A+BX

Y −A B

donde Y= la absorbancia obtenida y X= la cantidad de proteína en µg. X=

Y −0.298 3.01 x 10−3

Análisis estadístico. Tabla 6. Replica para el análisis estadístico. Cantidad de Ejemplo de cálculos. Tubo No. A595 proteína (µg) 0.580−0.298 1 0.580 93.68 X= 3.01 x 10−3 =93.68 2 0.720 140.19 3 0.761 153.82 4 0.598 99.66 0.720−0.298 X= 5 0.601 100.66 3.01 x 10−3 = 140.19 6 0.641 113.95 7 0.627 109.30 8 0.642 114.28 9 0.616 105.64 10 0.593 98.006

X=

(93.68+140.19+153.82+99.66+ 100.66+113.95+109.30+114.28 +105.64+98.006) X= = 112.92 10

√

S=

112.92 9

S= 19.44

S2=S

S 2= (19.44)2

%C.V=

S X

μ= X+-

t .S √n

%C.V=

S2= 378.22

19.44 X 100 112.92

%C.V= 17.21

μ= X+-

donde t con 10 datos a 95% = 2.262

t .S √n

μ= 112.92+-

2.262 x 19.44 √10

μ= 99.02 a 126.82 Tabla 3. Resultados de análisis estadístico.

X

S

S2

% C.V.

112.92

19.44

378.22

17.21

µ 99.02-126.82

Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteicas que interfieren en el método de Bradford.

Tubo No.

sustancia

1

Tris 1 M, pH 7.0

2 3 4 5

A595

0.69 0 Glicerol al 1 % 0.69 5 Detergente comercial al 1% 0.55 0 Dodecil sulfato de sodio(SDS) 0.59 al 1 % 0 Ácido tricloroacetico(TCA) 0.70 0

Cantidad de proteína (µg) 128.59

Tipo de interferenc ia.

131.89

+

74.12

-

97.00

-

133.54

+

+

Ejemplo de cálculos. X=

0.690−0.298 3.01 x 10−3 = 128.59

Las interferencias + se pueden deber a que algunas propiedades físicas del interferente sean similares al de la muestra estudiada y por tanto de un aumento en la concentración. La

interferencia negativa se puede deber a que la sustancia interferente disminuya o elimina partes del componente en estudio reduciendo la concentración de la muestra. Comparación de los métodos para la determinación de proteínas. Los métodos de Bradford, Lowry y 230 son métodos sensibles, sencillos, rápidos, pero presentan variaciones sobre la proteína (menos 230 nm). El método de Bradford presenta pocas interferencias, Lowry presenta muchas y 230 nm solo con DNA y RNA. El método 280 no es tan sensible como los métodos anteriores, requieren de mucho tiempo de reacción, es relativamente sencillo y si presenta variación sobre la proteína. Discusión. La curva de calibración obtenida indica que la ley de Bouguer y Beer se cumple ya que la

concentración es directamente proporcional a la concentración. Los datos eliminados (75 y 50 microgramos) producían una dispersión en los datos, esto se debe a los errores del analista y a los del material ya que el espectrofotómetro variaba en las lecturas de la misma muestra, se ocuparon diferentes celdas lo cual daba diferentes lecturas por ser distinto material el que se usó. El índice de correlación obtenido fue .9916. Esto indica que no hay mucha dispersión en los datos analizados. la pendiente es positiva y alta, esto demuestra que el método de Bradford es un método muy sensible ya que cambios en la concentración producirán grandes aumentos en la absorbancia La desviación estándar obtenida indica que los datos de la replicas se encuentran muy separados, de nuevo esto se debe a que fue otro analista que preparo las muestras, problemas con el espectrofotómetro, se ocuparon diferentes celdas, el tiempo de la reacción. En general el método de Bradford presenta pocas interferencias. Tris, glicerol y TCA son interferencias positivas por tener propiedades semejantes con la albumina, dando un aumento en la absorbancia y en la concentración. El detergente y el SDS son interferencias negativas por la reacción que tiene con la albumina disminuyendo la absorbancia y la concentración de proteína. Conclusiones. La curva de calibración cumple la ley de Bouguer y Beer por ser la concentración directamente proporcional a la absorbancia. El método de Bradford es un método que requiere poco tiempo, es fácil de manejar y bastante sensible. Las sustancias interferentes producen un aumento o disminución en la absorbancia aumentando la concentración de albumina.

Tabla No.9 Pruebas para establecer diferencias en exactitud y precisión. X referenc ia 80.19 83.83 88.84 76.74 77.91 77.91 87.47 81.55 82.46 92.48

X prueba 93.68 140.19 153.82 99.66 100.66 113.95 109.3 114.28 105.64 98.006

Di

(Di-D)2

13.49 56.36 64.98 22.92 22.75 36.04 21.88 32.73 23.18 5.526

271.59 696.43 1225,70 49.92 52.12 36.84 65.44 7.61 46.10 597.50

Cálculos: ´ 299.79 =29.97 D= 10

Di= Xprueba - Xreferencia Di= 93.68-80-19 Di= 13.49

´ Di− D )2 = (13.49-29.97)2= 271.59 ¿

SD=

√

2

∑ ( D ¡−D ) n−1

SD=

√

3049.25 9

2

∑ ( D¡−D ) =3049.25

SD=18.40

Prueba de t de Student:

√ 10 ´ √n Tcalculada: D x SD T calculada: 29.97 x 18.40 Tcalculada=5.15 Ttablas: 2.262 Tc

Tt

hay diferencia estadísticamente significativa en los métodos en exactitud.

es mayor a

Prueba de F: Fcalculada =

378.22 =13.84 27.32

Ftablas = 4.03

378.22= S2 de Bradford.

27.32= S2 de Lowry.

Ft < Fc Si existe diferencia significativa entre los métodos en precisión. Discusión final. En la comparación entre los métodos de Bradford y Lowry para identificar proteínas se observa que el método de Bradford es más sensible pues tiene una mayor pendiente que Lowry. Teóricamente el método de Bradford es más eficiente, pero se presentaron más errores que en el método de Lowry. En el método de Bradford La desviación estándar en fue mayor, es decir tenia mayor separación entre los datos analizados, se tuvieron que eliminar 2 puntos para ajustar la línea y requirió de menos tiempo. El método de Lowry presenta menos sensibilidad pero los datos analizados no tienen tanta dispersión entre ellos, la desviación estándar fue mucho menor, no se eliminó ningún punto para ajustar la línea y requirió de mucho tiempo. Como ya se mencionó todas las variaciones se deben a errores durante el análisis como; dos analistas, problemas en el espectrofotómetro, se ocuparon diferentes celdas, los tiempos no se midieron de manera correcta, etc. Las pruebas de precisión y exactitud demuestras que existe diferencia entre ambos métodos. Conclusión final. El método de Bradford y Lowry son métodos sensibles para identificar proteínas que cumplen con la ley de Bouguer y Beer. La concentración es directamente proporcional a la absorbancia. La prueba de T y F demuestran que si hay diferencia estadísticamente significativa entre ambos métodos. Referencias. https://books.google.com.mx/books? id=R3Hn3NMt0zsC&pg=PA57&dq=metodo+de+lowry&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiR5Y GnwKrLAhUKnoMKHXlaD1cQ6AEIKzAD#v=onepage&q=metodo%20de %20lowry&f=false. https://books.google.com.mx/books? id=hrd7v5YNo1UC&pg=PA157&dq=metodo+de+lowry&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiR5 YGnwKrLAhUKnoMKHXlaD1cQ6AEIOzAG#v=onepage&q=metodo%20de %20bradford&f=false https://books.google.com.mx/books? id=p2BmCezyycsC&pg=PA52&dq=metodo+de+bradford+en+proteinas&hl=es&sa=X&v ed=0ahUKEwjfz-GTz6rLAhUCuoMKHRiTAi4Q6AEIHjAB#v=onepage&q=metodo%20de %20bradford%20en%20proteinas&f=false

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Nombre: Ochoa Poblano Apolinar Rafael. Laboratorio de métodos de análisis II

Determinación de proteínas por el método de Lowry y Bradford.

Grupo: 4IM1

Sección: 2

Profesor: Fernando Hernández Derramadero.

Fecha de Entrega: 9 de Marzo de 2016.