Cuestionario 8 Aislamiento Y Cuantificación 5n205c

CUESTIONARIO PRACTICA NO. 8 AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS. 1. ¿Que aplicaciones practicas tienen los métodos de cuantificación de microorganismos? La medida cuantitativa del desarrollo de los microorganismos nos permite juzgar que un conjunto de condiciones han sido buenas porque las bacterias se desarrollan rápidamente, pero la cosecha final total puede no ser tan grande como las obtenidas con otro conjunto de condiciones en las que el desarrollo de las bacterias se inicia lentamente pero se continua aumentando durante un periodo mas largo. Es importante para interpretar las diferentes respuestas del desarrollo hipotético de la misma bacteria en medios de composición diferente. 2. ¿Que técnicas se emplean comúnmente para lograr el aislamiento de bacterias y obtener cultivos puros? Podemos distinguir dos tipos, aquellos que se realizan en medios líquidos y los que se realizan en medios sólidos. a) Medio líquido: - técnica de dilución límite o diluciones en serie: si el microorganismo que se busca en un cultivo mixto se encuentra en mayor cantidad que cualquiera de los otros microorganismos, es posible obtenerlo en cultivo puro mediante una serie de diluciones en tubo, del medio de cultivo apropiado. Cuando la muestra esté muy diluida contendrá solamente la bacteria que buscamos. Es recomendable confirmar mediante el procedimiento de la siembra en placa la pureza del cultivo que se aisló de la manera descrita. b) Medio sólido: - técnica de siembra por estrías en placa: con un asa de platino se pasa una porción de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho a base de agar y se siembra en el medio por estrías. - técnica de siembra por difusión en placa (distribución del inoculo de manera homogénea por toda la placa -al azar-): se usa una varilla de cristal estéril para esparcir la muestra. Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie del agar queden las bacterias separadas unas de otras. - técnica de vertido en placa (también distribución de manera homogénea): el medio (agar) se mantiene en estado líquido para permitir que el inoculo se distribuya adecuadamente en el medio. Una vez sembrado el medio se pone en cajas de Petri, se deja solidificar y después se incuba. Como algunos microorganismos quedan atrapados entre el agar, se observarán colonias tanto en la superficie como entre el medio cuando éste solidifica. Aislamiento directo en medio selectivo y diferencial (Técnica de enriquecimiento del cultivo): el principio de esto es procurar un ambiente de cultivo diseñado (medio de

composición conocida y condiciones específicas de incubación) que puedan favorecer el desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que necesitemos pero que no sea adecuado para las demás. Técnica de aislamiento de una sola célula mediante un micromanipulador. Se aísla una sola célula utilizando este aparato 3. Mencione 5 medios de cultivo selectivos (y/o diferenciales) así como las bacterias generalmente --------- en cada uno de ellos. Medio de cultivo selectivo y/o diferencial

Bacterias que crecen

Agar Eosina-azul de metileno EMB Agar MacConkey

Enterobacteriaceae sp. Klebsiella, Eschericea coli. Serratia, Hafnia Agar selectivo para el aislamiento de Salmonellas, Shighellas y, bacterias coliformes. Enterobacteriaceae sp. Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium Shigella flexneri Proteus mirabilis Enterococcus faecalis Mycobacterium sp. Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium Mycobacterium gordonae Mycobacterium bovis

Agar Loewenstein-Jensen

4. ¿Que ventajas y desventajas encuentra entre los siguientes métodos de aislamiento: a) Por estría cruzada. Ventajas. Se puede utilizar esta técnica en lugar de placas vertidas; permite el desarrollo de las colonias puras por separado; puede o no realizarse una dilución. Desventajas. El estriado debe hacerse paciente y cuidadosamente; debe tenerse mucho cuidado de no contaminar la placa al abrir la caja petri; se debe permitir que el agar este bien endurecido antes de la siembra y al hacer las estrías no debe romperse el medio b) Por diluciones seriadas. Ventajas. Permite aislar un tipo de microorganismo de un cultivo mixto para obtener finalmente puro. Desventajas. Solamente es útil cuando la bacteria que se intenta aislar esta presente en cantidades mucho mayores que las otras con las que se encuentra mezclada. 5. Describa el método de cuantificación de la gota o de Miles y Misra. Consiste en una sobre las placas de agar algunas gotas del material. Después de incubación, se cuenta las colonias en la superficie sembrada.

Se preparan cuentagotas que den 50 gotas. Son pipetas pasteur que se pasan a través del agujero no. 59 (0,95mm) de un calibrador de alambre Starratt y que se corta exactamente por encima del orificio. Cuando se prueben, deben dar gotas de 0,02ml, es decir, 50 gotas por ml. Se permite una tolerancia de ± 2 gotas. La placa de un medio conveniente se seca muy bien antes de su empleo. Se dejan gotear al menos cinco gotas que cada dilución de la muestra sobre todo placa, desde una altura no mayor de dos centímetros (para evitar salpicaduras). Se vuelva colocar la tapa, pero no se invierten las placas hasta que las gotas estén secas. Después de incubarlas, se escogen las placas que tengan colonias aisladas en el área en la que echan unas gotas, de preferencia y los que hayan dado menos de 40 colonias por gotas (el ideal es de 10 a 20). Se cuentan las colonias de cada gota utilizando una lupa. Se divide el número total de colonias contadas por el número de gotas determinado, y se multiplica por 50 (para convertir la cifra a colonias por ml) y por la dilución emplear. Este método se apresta a una normalización arbitraria; por ejemplo, hacía en menos de 10 colonias en 5 gotas de la muestra, ésta cifra indica en que al menos de 100 colonias/ml en tal muestra. Si son numerosas (más de 40 colonias), entonces el recuento de colonias por ml es mayor de 2000. 6. Describa el fundamento básico de los siguientes instrumentos útiles para realizar una cuenta total de células en suspensión. a) Cámara de conteo. es una placa de 2-3 mm de gruesa con un área en el centro, llamada la plataforma, que se haya rodeada por algún anillo excavado, la que es 0,02 mm más baja que el resto de la placa. La parte superior de la placa está esmerilada, de forma que cuando un cubreobjetos ópticamente plano se pone sobre el centro de la depresión, la profundidad es uniforme. Sobre la plataforma ahí un área de 1 mm2 dividida en 400 pequeños cuadros, cada uno de los cuales tiene un área de 0,0025mm2. El volumen sobre cada cuadrado es de 0,02 x 0,0025mm3; esto es 0, 00005 ml. a la suspensión iba a ser contada se le añaden unas gotas de formalina. Se coloca una asa de la suspensión sobre el área cuadrículas y se pone en cubreobjetos. Si el cubreobjetos se aplican correctamente, aparecerán entre las dos superficie óptica planas círculos concéntricos coloreados llamados anillos de Newton. Se dejan sedimentar las bacterias durante 5 minutos. Se examina bajo objetivo de 0,4mm, con luz reducida, si es posible que en contraste de fase o en campo oscuro. Se cuentan las bacterias en 50-10 cuadros escogidos al azar, de forma que la cifra total contada sea de 500 aproximadamente. Se divide ésta cifra por el número de cuadros contados. Se multiplica por 20 000000 y por el factor de la dilución original para obtener el número de bacterias por ml. Se repite dos veces más y se halla la media de los tres recuentos. b) Nefelómetro. Instrumento para medir partículas suspendidas en un líquido. Esto lo hace empleando una fotocelda colocada en un ángulo de 90° con respecto a una fuente luminosa. La densidad de partículas es entonces una función de la luz reflejada por las partículas a la fotocelda. Cuanta más luz se refleje en una determinada densidad de partículas depende de las propiedades de las partículas como su forma, color y reflectividad. Estableciendo a una correlación de trabajo entre turbidez y sólidos suspendidos (que más útil, pero generalmente una más difícil de cuantificación de partículas) debe ser establecido independientemente para cada situación. La unidad de

turbidez para un nefelómetro calibrado se llama Unidad de Turbidez Nefelométrica, NTU ó UTN. c) Contador Coulter (Coulter Counter). El instrumento emplea un sistema de medición no óptico que provee un rango de medición que excede las 6000 células individuales por segundo con un intervalo de conteo de 15 segundos. Una suspensión de células sanguíneas es pasada a través de un pequeño orificio simultáneamente con una corriente eléctrica. Las células sanguíneas individuales pasando a través del orificio producen un cambio de resistencia en el orificio el cual está determinado por el tamaño de la célula. El sistema cuenta las células individuales y provee distribución de tamaños. El número de células contadas por muestra es aproximadamente 100 veces mayor que los recuentos microscópicos, reduciendo el error estadístico aproximadamente 10 veces.

El número de pulsos eléctricos indica la cantidad de partículas que pasan a través de la apertura y el tamaño de los pulsos es proporcional al volumen de las partículas. Los contadores COULTER realizan este recuento por triplicado para eritrocitos, leucocitos y plaquetas 7. Describa el fundamento básico de las siguientes técnicas útiles para realizar la cuenta viable de células bacterianas en suspensión. a) Tinción vital. Son tinciones que se utilizan para preparados en fresco, es decir, sobre microorganismos que serán observados vivos. Los colorantes utilizados no matan al microorganismo ya que se concentra en el soma de los mismos sin afectar la viabilidad. los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ej: azul de metileno, cristal violeta y safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Ej: la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se

combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Ej: negro Sudán. b) Filtración. Los líquidos que contienen las bacterias se hacen pasar a través de un filtro que retienen los gérmenes. Se deja después que el filtro absorba un medio de cultivo y se incuba, pudiendo contarse las colonias que se desarrollen. Lo aparatos portafiltros están hechos de metal o de vidrio y se componen de un embudo inferior, que llevan una plataforma de cartón comprimido rodeado de un anillo de goma de silicona. Los filtros Francisco derivados de ester de celulosa poroso, de unos 120μm de grueso. Los poros de las caras superiores tienen un diámetro de 0,5-1,0μm, agrandándose a 3-5μm en la cara inferior. De esta forma, las bacterias quedan detenidas en la parte superior, pero el medio de cultivo puede llegar fácilmente a ella por capilaridad. En la superficie de cada filtro hay marcada una cuadrícula para facilitar el recuento. c) Método de diluciones seriadas. Si el microorganismo que se busca en un cultivo mixto se encuentra en mayor cantidad que cualquiera de los otros microorganismos, es posible obtener lo en cultivo puro mediante una serie de diluciones en tubo, del medio de cultivo apropiado. Cuando la nuestra es que muy diluida contendrá solamente la bacteria que se busca. Es recomendable confirmar mediante el procedimiento de la siembra en placa la pureza del cultivo que se aisló de la manera descrita. 8. Indique como se prepara de manera general un tubo para trabajar la escala de McFarland. Método de preparación del 0,5 estándar de McFarland Reactivos: 1% Cloruro de Bario (BaCl2) anhídrido 1% Ácido sulfúrico (H2SO4) puro y frío Método de Preparación: 1. Añadir 0,5 mL de 1% BaCl2 a 99,5 mL de 1% de H2SO4. 2. Revuelva para mantener en suspensión. 3. Mezclar completamente ante de proceder al siguiente paso. 4. Distribuya 5 mL de la solución de McFarland en tubos de diámetros similares. Se sugiere usar los mismos tubos que se utilizan rutinariamente para ajustar la densidad de las suspensiones antes de la inoculación. 5. Cuando estos estándares están en suspensión completa, la turbidez equivale a un cultivo que contiene 1,5 x 108 células. 6. Los tubos que contienen la solución de 0.5 McFarland se deben guardar en un lugar oscuro, a temperatura ambiente. 9. ¿Como se realiza la cuantificación de hongos y bacterias filamentosas? | Se puede emplear el medio de cultivo desarrollado por Schaufus para el recuento de hongos y levaduras en productos azucarados y otras muestras, por la técnica de filtración por membrana.

Siembra - Filtrar la muestra a analizar. El volumen que se filtra depende de la probable contaminación de la muestra. - Embeber la almohadilla con el caldo m-Recuento de Hongos y Levaduras hasta la saturación (la cantidad de medio de cultivo depende del grado de absorción de la misma). - Apoyar la membrana filtrante sobre la almohadilla embebida con el medio de cultivo. - Incubar las placas a 30 °C durante 72 horas. El recuento debe hacerse en aquellas placas que contengan entre 20 y 200 UFC. Un conteo inferior escapa a los límites de error del método. La concentración microbiana debe expresarse como el número de Hongos y Levaduras presentes en 100 ml de la muestra. Recuento de hongos y levaduras = N° de colonias X 100 ml de muestra filtrada