Técnicas De Aislamiento Y Medios De Cultivo Para Hongos 68r1f

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOS Introducción Un hongo es en general, un organismo eucarionte heterótrofo unicelular, pluricelular o multicelular cuyas células se distinguen por tener una pared celular con el polisacárido quitina. Los hongos constituyen un grupo muy amplio de organismos y suelen clasificarse en 2 reinos. Los llamados hongos “verdaderos” son aquellos que constituyen el reino Fungi y que tienen las características antes descritas, otros hongos se clasifican entre los protoctistas y tienen características especiales. Entre los hongos “verdaderos” podemos distinguir tres grandes grupos según su morfología; a saber: -Hongos filamentosos -Levaduras -Setas

Aunque esta clasificación no tiene valor taxonómico resulta práctica para agrupar distintos tipos de hongos por sus características afines. Los hongos filamentosos están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se caracterizan por presentar como unidad estructural unos filamentos formados por una o más células llamados hifas, que al reunirse dan lugar a un conglomerado de nombre micelio. Por su parte las levaduras son hongos unicelulares de células ovales o cilíndricas normalmente. Tanto los hongos filamentosos como las levaduras son microscópicos, pero al formar colonias grandes (las cuales en un cultivo descienden de una sola célula) pueden apreciarse la simple vista. Las setas por su parte son hongos filamentosos que forman cuerpos fructíferos macroscópicos. Los hongos filamentosos, setas incluidas, se consideran organismos talofíticos porque tienen un nivel de organización más sencillo que los tejidos, pero más complejo que las colonias, en la que sus células se agrupan sin diferenciarse, pero algunas de ellas si se diferencian, especializándose para la reproducción, otros organismos talofíticos son las algas. Los hongos revisten gran interés científico puesto que muchos de ellos producen o participan en la producción de muchas substancias y bienes útiles al hombre, aunque muchos son también importantes agentes infecciosos del hombre.

Aislamiento de hongos filamentosos y levaduras: Medios de cultivo Existen muchos medios de cultivo que propician el crecimiento de los hongos. En general su pH oscila alrededor de 5,4. Este pH es muy adecuado una vez que se ha aislado el hongo, sin embargo, para los aislamientos primarios deben utilizarse medios de cultivo con un pH menor para favorecer el crecimiento de los hongos por sobre el de las bacterias, un pH de 3,5 resulta en general adecuado. Algunos medios propicios para el desarrollo de hongos son:

Las muestras: Para los estudios de hongos se toman muestras que se preparan para su estudio según diversos métodos por lo general el material blando se agita de forma continua, durante 2 minutos, o más, en un matraz con perlas de vidrio, o en una licuadora durante 30 segundos, o en un homogeneizador durante 1 minuto, empleando como diluyente una solución de peptona al 0,1% p/v. El material duro se muele en un molinillo de granos u otros dispositivos adecuados; es común usar solución fisiológica, solución reguladora de fosfatos o agua destilada para permitir la homogenización de la muestra. En los productos secos, o concentrados, debe evitarse el choque osmótico. Para lo cual fin, se diluyen con una solución de sacarosa o glucosa al 20% p/v. Si se trata de productos salados se emplea un diluyente con 5% p/v de NaCl. Cuando la muestra tiene gran cantidad de azúcares y es muy ácida, debe diluirse (1+1) con solución de peptona al 0,1% p/v y ajustar el pH a 3,5 - 4,0, aunque el tratamiento específico de la muestra dependerá únicamente de los ensayos a realizar.

Aislamiento: Cuando lo que se busca es aislar hongos filamentosos, el pH de los medios comerciales (≥5,4) se puede reducir adicionando ácido tartárico al 10% (1 mL por cada 100 mL de medio de cultivo ya estéril y a 50 ºC). Los medios no deben calentarse luego de esta acidificación pues provocaría la hidrólisis del agar y por lo tanto la pérdida de su capacidad para gelificar. Si se desea favorecer el aislamiento de levaduras se debe alcanzar el pH óptimo mediante adición de ácido clorhídrico o ácido fosfórico, no con ácidos orgánicos pues muchos inhiben el crecimiento de las levaduras. Se procede de igual forma a como se explicó para los hongos filamentosos. Sea cual sea el microorganismo que se desea cultivar se suelen hacer diluciones decimales en agua (a veces en otros agentes como solución salina) de la muestra de interés para luego tomar un mL. de la dilución correspondiente y mezclarlo con el medio de cultivo elegido. Para luego incubarlo a 28 ºC durante 5 días. Aunque tales condiciones de incubación son las más comúnmente sugeridas, de acuerdo a las condiciones del medio, a las características ambientales del lugar de origen del hongo y la técnica utilizada,

se pueden seguir otras recomendaciones, como el colocar las placas dentro de una bolsa de plástico acompañada de un recipiente con agua para evitar la desecación, durante 3 a 7 días a 28 °C en las regiones subtropicales; a 30 °C en las tropicales, y a 22 °C en las templadas.

EN TUBO O EN PLACA Las placas de medio de cultivo con hongos, a diferencia de aquellas donde se siembran bacterias, no se invierten (salvo en contadas excepciones). Tras el tiempo de incubación las placas se observan y se analizan los hongos y levaduras que han crecido en las mismas para luego tomar muestras aisladas de una sola colonia que pueden resembrarse en nuevas placas con medio de cultivo. Se deben de descartar para su estudio aquellas placas que tengan más de 200 colonias, puesto que de estas placas el aislamiento se hace muy difícil y poco certero. Tras incubar las placas con las diluciones de hongos y habiendo contado el número de colonias en estas se puede proceder a establecer cultivos puros como se señaló ya resembrándolas en nuevas placas con medios de cultivo. Un cultivo puro de levaduras se obtiene dispersando el material tomado de la colonia a estudiar, mediante estrías sucesivas sobre la placa de medio. En cambio, un cultivo puro de hongos filamentosos se obtiene por repique de un pequeño manojo de hifas o grumo de esporas en varios puntos de una placa de medio selectivo. En algunos casos esta técnica no es satisfactoria y entonces conviene hacer una dispersión de esporas sobre la superficie de agar estéril. Se toman las esporas del hongo en el cultivo primario y luego se ponen sobre la placa de agar estéril. Por lo general es necesario resembrar sucesivamente los hongos de un cultivo puro, para garantizar que efectivamente solo haya un tipo de hongos en este.

Técnicas de enriquecimiento: En ocasiones es preciso potenciar, o amplificar, la presencia de hongos en una muestra, previo a su aislamiento. En esos casos resultan adecuadas las técnicas de enriquecimiento. El primer paso consiste en incorporar la muestra en un medio líquido que contenga extracto de carne o extracto de levadura y su pH sea 3,7. A continuación se incuba de 24 a 72 horas a temperaturas entre 25 º y 30 ºC, y del crecimiento obtenido se hacen siembras en medios sólidos. Este método sin embargo no permite a diferencia de la siembra directa en medios sólidos, conocer la proporción real en que se encuentra lo buscado en la muestra. Si se desea aislar levaduras, a partir de muestras muy contaminadas con hongos filamentosos, el desarrollo de estos últimos se puede restringir por varios métodos como la exclusión de aire que se logra añadiendo una capa de parafina líquida estéril sobre la superficie del medio de cultivo, una vez

realizada la adición de la muestra. Esta capa debe tener un grosor de 1 cm. Se incuba como se explicó previamente, hasta obtener un crecimiento adecuado. También puede añadirse la muestra al medio en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. (ej. 10 g de muestra en 90 mL. de medio). Tras lo cual, los matraces se agitan durante un tiempo adecuado (24-72 horas) a las temperaturas ya señaladas. Los hongos filamentosos, en estas condiciones, no generan esporas, sus micelios se agregan en forma de esferas y se ven superados en multiplicación por las levaduras presentes, que se distribuyen de forma homogénea en el medio de cultivo. En general se prefieren los medios de cultivos sólidos ya que posibilitan la observación de las colonias (caracteres macroscópicos). Sin embargo, para el estudio de hongos acuáticos el aislamiento debe iniciarse en medios líquidos para lograr una aproximación a su hábitat.