Guia De Practica Bioquimica 2013-ii 4z675

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS BÁSICAS

ASIGNATURA

:

BIOQUÍMICA GUÍA DE PRÁCTICA

SEGUNDO AÑO II Semestre Lima - Perú 2013

1

PRACTICAS DE LABORATORIO Nº1: INSTRUMENTACIÓN, CENTRIFUGACION Y ESPECTROFOTOMETRIA 1.- CENTRIFUGACIÓN

P

rocedimiento por el cual se aplica la FUERZA CENTRÍFUGA para separar partículas que se encuentran en suspensión en un medio líquido. El incremento de la fuerza centrifuga condicionará que las partículas migren alejándose del eje de rotación de la centrifuga. El proceso migratorio de las partículas se denomina sedimentación y la velocidad con que sedimentan es proporcional a la fuerza centrifuga expresada como incrementos de la gravedad (G). La constante gravitatoria es proporcional a la velocidad de giro del rotor – soporte del medio que se centrifuga – y del radio del mismo. El radio del rotor de la centrifuga depende si ésta es del tipo ángulo fijo o flotante. En el primer caso es un promedio entre el radio mínimo y el máximo, y en el segundo es la distancia entre fondo del tubo y el eje.

La velocidad de la sedimentación se altera por la fuerza centrífuga, pero además por la forma de las partículas, y por la viscosidad del medio líquido que las suspende. También depende de la temperatura en cuanto ésta altere la viscosidad del medio o de las cargas eléctricas de las partículas. Los equipos que permiten la centrifugación se llaman centrífugas y constan de un motor con controles, que mueven un rotor que

2

sostiene los tubos de centrifugación. Los rotores son de dos clases, de ángulo fijo y flotante, tal como se ve más arriba. La mayoría de la centrífugas de laboratorio alcanzan las 5000 rpm, aunque algunas alcanzan los 16 000 rpm. Algunas centrífugas tienen refrigeración lo que permite separar partículas biológicamente activas tales como factores de coagulación, enzimas, etc. Las ultracentrífugas son centrífugas con vacío, refrigeración y velocidades de más de 500 000 x g. Permiten la separación de los componentes tisulares, tal como se aprecia en el cuadro adjunto y poder estudiar cada uno de ellos a partir del homogenizado de un tejido cualquiera. Para evaluar con certeza la capacidad de una centrífuga para separar los componentes celulares debemos manejar gravedades en lugar de revoluciones por minuto, por lo que frecuentemente usamos el nomograma de Dole y Cotziar que presentamos a continuación. Suspender el tejido al 10% Homogenizar en Potter E.

Centrifugar a 600g x 10´ Sedimento: núcleos, restos celulares Centrifugar el sobrenadante a 4000g x 15´ Sedimento: mitocondrias Centrifugar el sobrenadante a 16 500g x 15´ Sedimento: lisosomas Centrifugar el sobrenadante a 100 000g x 40´ Sedimento: microsomas Sobrenadante: citosol

3

TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN 1.

2.

Diferencial: separa de acuerdo a las diferentes velocidades de sedimentación de distintas partículas. La usamos en la clínica para separar sedimentos de orina, o componentes del plasma. Zonal: usando una gradiente de densidad lograda con un soluto denso, la más usada la sacarosa, las moléculas sedimentan de acuerdo a su coeficiente de sedimentación. La sacarosa densa evita que las bandas se mezclen.

La gradientes pueden ser discontinuas – preparadas mediante la colocación de soluciones de diversa densidad una sobre otra- y continuas – preparada mediante un equipo de mezcla de soluciones, que va incrementando la densidad progresivamente.

4

TUBOS DE CENTRIFUGACIÓN: NOMOGRAMA DE CALCULO VELOCIDAD Y RADIO DE CABEZAL DE CENTRÍFUGA Existen tubos de centrífuga de diversa composición: 1. Policarbonato: vidrio transparente, autoclavable y resistente a los ácidos y bases de baja dilución. 2. Borosilicato: vidrio muy resistente a químicos de alta concentración . 3. Polietileno: plástico muy resistente a los químicos, pero sensible a la temperatura. 4. Propileno: plástico bastante resistente a la temperatura – autoclavable- y resistente a casi todos los químicos. PORTATUBOS Son de plástico o de metal y poco resistente a ácidos y bases fuertes. Deben ser conservados muy limpios. 2.- COLORIMETRÍA Es el análisis de la concentración de una muestra por el color que presenta. Todos hemos tenido la experiencia de valorar la concentración de sustancias coloreadas en solución, por observación directa, una taza de café o té, un vaso de refresco, son apreciados de esa manera. El examen se funda en la mayor o menor absorción de luz de acuerdo al mayor número de moléculas y tonalidad dependerá de la capacidad de absorber una u otra longitud de onda de luz, específicamente. La fotocolorimetría manipula las variables de este fenómeno controlando la luz incidente proveniente de un foco luminoso y su pureza, de modo tal que sólo incida aquella luz que es específicamente absorbida por la partícula que medimos. 450nm 540nm 640nm

Rayos X 1nm a 1pm

Rayos γ < 1pm

Ultravioleta: 400nm a 1nm

Microondas: 25um a 1mm

Infrarrojo: 750nm a 25 um

Ondas de radio > 1mm

5

Los cuerpos luminosos como el sol o las lámparas eléctricas emiten un gran espectro electromagnético que comprende amplias longitudes de onda, de las cuales muy pocas corresponden al espectro visible. En el cuadro anterior se aprecian todas las radiaciones electromagnéticas conocidas. Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores complementarios) Esta luz reflejada es la que observamos como color propio del cuerpo coloreado. No interesa particularmente los colores que absorbe la solución que queremos medir. La selectividad de absorción que queremos medir. La selectividad de absorción de una partícula por una longitud de onda se basa en el hecho de que cada longitud de onda de luz corresponde a un distinto nivel de energía, y para excitar los electrones de cada partícula necesitamos un particular nivel de energía. Si consideramos que cada molécula absorbe luz de acuerdo a la concentración en que se encuentre dentro de la solución, a mayor absorción de luz y menor luz trasmitida. Estos factores están considerados en la ley de Lambert y Beer. Longitud de onda 400-435 435-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-595 595-610 610-750

Color violeta azul verde-azul azul-verde verde amarillo-verde amarillo-verde anaranjado rojo

Colores complementarios amarillo-verde amarillo-verde anaranjado rojo purpura violeta azul verde-azul azul-verde

Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores complementarios). Esta luz reflejada es la que observamos como color propio del cuerpo coloreado. Interesa particularmente 6

los colores que absorben la solución que queremos medir. La selectividad de absorción de una partícula por una longitud de onda se basa en que cada longitud de onda de luz corresponde a un distinto nivel de energía y para excitar los electrones de cada partícula se necesita un particular nivel de energía. Sí consideramos que cada molécula absorbe luz de acuerdo a la concentración en que se encuentre dentro de la solución, a mayor concentración de sustancia, mayor absorción de luz y menor luz trasmitida. Estos factores están considerados en la Ley de Lambert y Beer, que es la siguiente:

Log Io/It = e.l.c Donde: Io = Luz incidente, It = Luz transmitida, C = concentración, L = longitud de paso, e = constante. 3.- FOTOCOLORIMETRIA – ESPECTROFOTOMETRIA La fotocolorimetría es la medida de la luz absorbida por una solución mediante un aparato que es un fotocolorímetro. El equipo consta de una fuente de luz artificial, un monocromador que separa exclusivamente luz de una sola longitud de onda (la que sea preferente para la medida), un recipiente o tubo de vidrio (que alberga la solución a medir), una célula fotoeléctrica que transforma la luz trasmitida en corriente eléctrica y una unidad de medida de la corriente eléctrica o galvanómetro.

Luz Incidente Io

Luz trasmitida It

La calificación de colorímetro o espectrofotómetro depende del monocromador, sí éste es un filtro tendremos un fotocolorímetro, pero si es un prisma, o cualquier aditamento que proporcione luz de diversas longitudes de onda tendremos un espectrofotómetro.

7

Fuente de luz blanca

Muestra: Absorción

Monocromador

Galvanómetro

Celda

Los fotocolorímetros y los espectrofotómetros reportan sus resultados bajo dos formas: absorbancia o luz absorbida por las partícula de la solución y transmitancia a o luz transmitida luego de atravesar el tubo con la solución. La transmitancia se expresa en valores numéricos entre 0 y 100%, es decir que una solución que no tiene particular trasmitirá el 100% y una perfectamente opaca el 0%. La absorbancia, también llamada densidad óptica DO, se expresa en valores semilogarítmicos entre 0 y 2 correspondiendo el 0 a aquella solución que no tiene partículas y por lo tanto no absorbe la luz. Para encontrar la concentración de una solución problema, debemos comparar su lectura frente a un blanco – agua destilada o reactivos sin modificarse – con la lectura de un patrón o solución estándar bajo las mismas condiciones. Una solución estándar es generalmente una que contiene el problema con una concentración perfectamente medida en el laboratorio. CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UN PROBLEMA

Para hallar la concentración de una muestra problema tenemos dos procedimientos: 1. 2.

Factor de Calibración Curvas de calibración

Factor de calibración: es la concentración de sustancia que corresponde a una unidad de medida, generalmente 0,001 de absorbancia.

8

Se obtiene Factor de calibración:

concentración del patrón Lectura del patrón (en absorbancia)

Esta fórmula deriva de la densidad óptica o absorbancia del problema: DOP= eP lP Si el coeficiente de extinción (e) es el mismo en ambos casos y el diámetro del tubo de lectura(l) es el mismo, la única diferencia está en la concentración. Luego: DOst

CS

= DOp Despejando la concentración del problema , obtenemos la siguiente formula: cs

=Dp x -------Dost Concentración del problema = Densidad Óptica del Problema X Factor de calibración La curva de calibración consiste en la obtención de las lecturas de absorción 0 de % de trasmitancia que corresponde a una secuencia creciente de concentraciones, estas son graficadas en un papel milimétrico si se trata de absorbancia o densidad óptica y de papel semilogarítmico si se trata de % de transmitancia. 4.- POTENCIOMETRÍA La potenciometría es el procedimiento de elección para la medida del pH. El pH en una expresión numérica que corresponde al logaritmo de la inversa de la concentración de iones H+. La potenciometría se basa en la diferencia de potencial (voltaje) entre dos electrodos, el de medida y el de referencia, ambos sumergidos en la solución y bajo condiciones de equilibrio. El instrumento consta de un ELECTRODO DE REFERENCIA que se mantiene constante durante la medida, un ELECTRODO DE MEDIDA que varia de acuerdo a la concentración de hidrógeno de la solución y un dispositivo o potenciómetro que mide la 9

diferencia de potencial. El electrodo de referencia puede ser de dos clase: de calomel, mercurio metálico y cloruro mercurioso y de plata plata y cloruro de plata. El potencial de ese electrodo depende de la solución de cloruro de potasio en que está sumergido internamente. El electrodo de medida, es también llamado electrodo de vidrio, está constituido por un tubo de vidrio cuyo extremo es particularmente selectivo al paso de iones hidrógeno. En su interior hay ácido clorhídrico HCl 0,1 M y un alambre de plata, cloruro de plata,

Batería

0V

AAg.Aa HclgCl.HCl.Vidrio

1V

Solución Problem a.

KCl.Hg2Cl2.Hg

En el potenciómetro, un voltaje variable se opone al de la celda de medida. Un galvanómetro actúa como detector del punto nulo para indicar que es igual al voltaje opuesto de la celda de medida. Conectando la celda desconocida al circuito se produce un desnivel de voltaje que debe corregirse hasta alcanzar el punto nulo. La magnitud de la corrección puede leerse como fuerza electromotriz o como pH directamente. En la práctica se ha usado los electrodos de pH para medir la concentración de otros iones. Los electrodos tienen una membrana adicional que sólo es selectiva al paso de determinado electrolito, sodio, potasio, calcio son medidos bajo esta manera con facilidad. También existe el electrodo de CO 2 que deja pasar moléculas se este gas las que modifican el pH y por lo tanto son medidas con el electrodo de vidrio de pH.

5.- ESPECTROFOTOMETRIA

10

EXPERIMENTO.- Preparación de una curva de calibración: el experimento consiste en preparar tubos de concentración creciente de un colorante y leerlos al fotocolorímetro o al espectrofotómetro, llevando a cero (0) el aparato con agua destilada. Construir una gráfica usando papel milimetrado para las lecturas hechas en DO (densidad óptica) o papel semilogarítmicos para las lecturas hechas en % transmitancia. Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al esquema y leer las soluciones al espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda. Practicar esta lectura tanto en DO como en % de transmitancia. Construir dos curvas de calibración, una en papel milimetrado y otra en papel semilogarítmico. Contenido

Tubo Nº 2 3 4 4 6 8 6 4 2

1 2 8

mL Azul metileno al (5 mg/Ml) mL Agua destilada Concentración (mg/mL)

%T

5 10 0 A (A=2-logT%)

Desconocido 1 Desconocido 2 Experimento: Efecto del pH 100 80 60

t u d p n ió c a rm o F %

40 20 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12

pH

COMENTARIO ………………………………………………………………………

11

……………………………………………………………………… ……………………………………………………………………… ……………………………………………………………………… ……………………………………………………………………… ………………………………………………………………………... Usando los valores obtenidos en % de trasmitancia, grafique usando el papel semilogarítmico de esta página.

% T (540 nm)

100 80 60 40 20 0 0

1

2

3

4

5

6

7

Concentración (mg/mL) COMENTARIO …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………….

Firma del alumno

Firma del profesor

NOTA Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO Nº2: POTENCIOMETRIA EXPERIMENTO: Titulación de un ácido débil con una base fuerte. 12

Se trata de determinar el pH de un grupo de tubos con varios niveles de titulación de ácido acético con hidróxido de sodio. Cuando se titula un ácido débil con una base fuerte se produce un aumento de pH inicialmente rápido para luego hacerse lento, dentro de ciertos márgenes y al final se alcaliniza rápidamente. La identificación del cambio de pH en cierto período de la titulación, se debe a la formación transitoria de una combinación de ácido débil y la sal correspondiente. En el caso del experimento será la combinación de ácido acético y acetato de sodio y son los componentes ordinarios de una solución amortiguadora o solución buffer.Para la experiencia preparar 11 tubos de acuerdo al siguiente esquema: Tubo No

mL acético 0,1 N mL NaOH 0,1 N mL agua destilada 1 5,0 0,0 5,0 2 5,0 0,5 4,5 3 5,0 1,0 4,0 4 5,0 1,5 3,5 5 5,0 2,0 3,0 6 5,0 2,5 2,5 7 5,0 3,0 2,0 8 5,0 3,5 1,5 9 5,0 4,0 1,0 10 5,0 4,5 0,5 11 5,0 5,0 0,0 14 Leer13 los tubos en el potenciómetro y graficar los resultados 12 11 10 9 H p

8 7 6 5 4

NOTA

3 Fecha2 Hora 1 0 PRACTICAS DE6 LABORATORIO Nº3 4 5 7 8 9 10

11

12

CINÉTICA ENZIMÁTICA: EFECTO DEL Ph y LA TEMPERATURA Volumen (mL)

13

Las enzimas son proteínas que aceleran las reacciones químicas hasta su punto de equilibrio. La ecuación general de las enzimas es: E + S

ES C’

E+P C››

La actividad enzimática se manifiesta y mide por: Desaparición de sustrato Formación de producto Modificación de cofactor Muchos factores modifican la actividad enzimática: pH Temperatura Concentración de sustrato Concentración de enzima Tiempo de incubación En nuestra práctica observamos el efecto de la pepsina sobre la albúmina del huevo. La actividad enzimática se apreciará por la pérdida de la turbidez proteica. EXPERIMENTO.- Efecto del pH El pH actúa sobre los grupos ionizados que pertenecen a los centros activos de las enzimas. Los grupos que pierden la ionización pierden la capacidad de interaccionar con el sustrato. Cada enzima tiene un pH óptimo de trabajo. Preparar cinco tubos con: TUBO Nº 1 Ph 1,0 mL albúmina 5,0 mL HCL 1N 2,0 mL CO3Na2 0,0 mL agua destilada 0,0

2 1,5 5,0 0,5 0,0 1,5

3 6,0 5,0 0,0 0,0 2,0

4 9,5 5,0 0,0 0,5 1,5

5 11 5,0 0,0 2,0 0,0

Preincubar los cinco tubos más un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1% a 37ºC por 5 minutos. Luego añadir rápidamente 3 14

mL de la pepsina preincubada a cada uno de los tubos 1–5. Mezclar e incubar a 37ºC por 10 min. Observar la diferencia o leerla en fotocolorímetro con filtro azul (420 nm). EXPERIMENTO: Efecto de la temperatura. Todo aumento de temperatura incrementa la actividad enzimática por aumento de la energía de activación. Pero paralelamente se va produciendo una desnaturalización parcial de la enzima que la inactiva. Preparar cinco tubos con: TUBO Nº 1 mL albúmina mL HCL 1N mL agua destilada

2

3

4

5

5,0 0,5 3,5

5,0 0,5 3,5

5,0 0,5 3,5

5,0 0,5 3,5

7

8

9

10

1,0

1,0

1,0

1,0

5,0 0,5 3,5

Preparar otros cinco tubos con: TUBO Nº 6 mL pepsina 1%

1,0

Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura: TUBO Nº 1y6 2y7 3y8 4y9 5 10 Temperatura

O ºC

Amb.

37 ºC

70 ºC

37 ºC

100 ºC

Agregar los respectivos tubo Nº 6 al Nº 10 a los que hay que incubar a las temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 – 5.

Experimento: Efecto de la temperatura

Experimento: Efecto del pH % Formación producto

% Formación producto

100 80 60 40 20 0

100 80 60 40 20 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 pH

0

20

40

60

80

Temperatura (ºC) 15

100

Comentario: ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… Firma del alumno

Comentario: ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… Firma del profesor

NOTA Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO Nº4 CINETICA ENZIMATICA: EFECTO CONCENTRACION, ENZIMA Y SUSTRATO EXPERIMENTO. -Efecto de la concentración de la enzima Aunque las enzimas no se destruyen ni con las reacciones, el aumento de ellas en la cubeta de reacción incrementa la velocidad. Preparar 5 tubos con: TUBO Nº

1

2

3

4

5

mL albúmina

5,0

5,0

5.0

5,0

5,0

mL HCL 1N

0,5

0,5

0.5

0,5

0,5

mL agua destilada

1,5

2,5

3.5

4,0

4,5

mL pepsina

0,0

0,0

0.0

0,0

0,0

4

5

0.5

0,1

Incubar los 5 tubos a 37ºC por 5 minutos y enseguida añadir: TUBO Nº 1 2 3 mL pepsina incubada

3,0

2,0

1,0

16

Incubar por cinco minutos a 37ºC. Observar al fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul), contra una lectura de agua.

EXPERIMENTO.-Efecto de la concentración del sustrato Si es una reacción enzimática incrementamos progresivamente la concentración del sustrato, aumentará la velocidad enzimática (velocidad inicial) hasta un punto en que la velocidad llega a una meseta plana que no modifica aunque sigamos aumentando el sustrato, habremos saturado la enzima. Preparar 6 tubos con: TUBO Nº

1

2

3

4

5

6

mL albúmina

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

mL HCL 1N

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

mL agua destilada

7,0

6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

mL pepsina 1%

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

0,0

Leer a 420 nm (filtro azul). Anotar los resultados: incubar a 37ºC. Colocar 0,5 mL que pepsina pre-dirigida. Incubar por otros 5 minutos a 37ºC. Leer al fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Restar la segunda lectura de la primera. Graficar y comentar los resultados.

Experimento: Efecto de la concentración de sustrato % Formación producto

% Formación producto

Experimento: Efecto de la concentración de enzima 100 80 60 40 20 0 0

2

4

6

8

10

Concentración enzima (mg/mL)

12

100 80 60 40 20 0 0

1

2

3

4

5

Concentración de sustrato 17

6

Comentario: ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… …………………………………………………

Comentario: ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… ………………………………………………… …………………………………………………

Firma del alumno Firma del profesor

NOTA Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO Nº5 DIGESTIÓN DE CARBOHIDRATOS El carbohidratos más importante en la alimentación es la glucosa, la cual ingerimos bajo la forma de disacáridos (maltosa, sacarosa y lactosa) o de almidón, polisacáridos formado por muchas moléculas de glucosa. El almidón es el constituyente esencial de cereales, leguminosa, tubérculos y raíces. La digestión del almidón se produce en el intestino delgado gracias a la presencia de enzimas digestivas producidas por las glándulas salivares, el páncreas y la pared intestinal. Estas enzimas son: La alfa amilasa salivar La alfa amilasa pancreática La amilo 1,6 glucosidasa de la pared intestinal Las alfa amilasas son enzimas que actúan a pH neutro y en presencia de iones cloro. Rompen los enlaces amilo 1,4 dando como resultado oligosacáridos y glucosa. Existe dos formas de evaluar la actividad enzimática de la amilasa: Por desaparición de sustrato: forma como desaparece el almidón el que se aprecia por la reacción del lugol. 18

Por formación de producto: forma como aparecen carbohidratos reductores (glucosa) en el medio, los que se aprecian por reducción del cobre. En nuestra práctica evaluaremos la actividad enzimática de la amilasa sobre el almidón mediante la reacción del remanente de almidón frente al yodo a mayor decoloración, mayor actividad enzimática. EXPERIMENTO.- Digestión del almidón por la amilasa salivar. Para la experiencia preparar cuatro tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema. TUBO

1

2

3

4

ml almidón 1%

2

2

2

2

ml Buffer fosfato pH 6,6

1

1

1

0

ml HCL 0,3N

0

0

0

3,4

ml Suero fisiológico

3

2,4

0

0

ml Agua destilada

0

0

2,4

0

0,6

0,6

Colocar en baño de María a 37ºC por 5 minutos. Agregar: ml solución de saliva 0 0,6 Colocar en baño de maría a 37ºC por 20 minutos

Pasado este tiempo tomar 0,5ml de cada tubo y preparar cuatro tubos más de acuerdo al esquema

TUBO

1

2

3

4

ml digestión tubo 1

0, 5

0

0

0

ml digestión tubo 2

0

0,5

0

0

ml digestión tubo 3

0

0

0,5

0

ml digestión tubo 4

0

0

0

0,5

ml HCL 0,05N

5

5

5

5

0,5

0,5

0,5

0,5

ml Solución yodada

Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolorímetro con filtro rojo (660nm)

INFORME DE LA PRÁCTICA

19

Nombre: Grupo :

Fecha:

Experimento.- Digestión del almidón por la amilasa salivar

1.05 0.90

Abs

0.75 0.60 0.45 0.30 0.15 0.00 Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

COMENTARIO: ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………. Firma del alumno

Firma del profesor

NOTA Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO Nº6: ABSORCIÓN DE CARBOHIDRATOS

20

Después de la digestión de los carbohidratos por efecto de amilasas salivar y pancreática, amilo 1,6 glucosidasa, y disacarasas tenemos como resultado monosacáridos: glucosa, fructosa, galactosa, que deberán ser absorbidos por la mucosa intestinal para su ingreso a la circulación sanguínea. Los carbohidratos se absorben en el yeyuno mediante dos mecanismos, la simple difusión favorecida por la gradiente de concentración y el transporte activo, aún contra la gradiente. El orden de facilidad en la absorción es de galactosa glucosa: ribosa. El borde en cepillo de las células intestinales tiene varios sistemas trasportadores. Un transportador de glucosa dependiente del sodio (SLGT1) se enlaza tanto a la glucosa como al sodio en sitios separados aumentando el tenor de sodio intracelular. La energía necesaria para este transporte se obtiene de la hidrólisis del ATP vinculado a una bomba de sodio que intercambia sodio con potasio

También participa un transportador facilitador independiente del sodio llamado GLUT 5. La hidrólisis de los polisacáridos, oligosacáridos y disacáridos es muy rápida por lo que usualmente los procedimientos de absorción se saturan con rapidez. EXPERIMENTO.-Absorción de la glucosa por el intestino de la rata

21

1. Se usan ratas con 24 a 36 horas de ayuno. Se les anestesia con eter bajo una campana de vidrio. Abrirles el abdomen y se retira una porción de 5 cm de intestino, de modo que no puede mesenterio adherido. 2. Se lava la luz intestinal varias veces mediante una jeringa con solución Ringer Fosfato pH 7,4 Mediante el uso de una baqueta de vidrio se empuja un extremo del intestino dentro del mismo buscando evertir la porción mucosa hacia fuera. Mantener el intestino en solución Ringer Fosfato pH 7,4 a temperatura ambiente. 3. Cerrar un extremo del intestino con hilo y dejar otra ligadura suelta en el otro extremo del intestino. 4. Introducir en el saco intestinal formato 2 ml de solución Ringer Fosfato pH 7,4 con 0,2% de glucosa. Cerrar la ligadura suelta y revisar que no haya pérdida de líquido. 5. Introducir el saco lleno en un tubo con 2 ml solución Ringer Fosfato pH 7,4 con glucosa 0,2% Incubar a 37ºC por 30 minutos. Pasado del tiempo sacar el saquito, secarlo por fuera con papel de filtro. Cortarlo con tijera y vaciar el contenido en u tubo de ensayo. 6. Diluir 1:10 con agua destilada, tanto el contenido del saquito, como el del tubo que lo recibió durante la incubación. Luego proceder a preparar 4 tubos de acuerdo al siguiente esquema . TUBO

1

2

3

4

ml reactivo para glucosa

2

2

2

2

μl agua destilada

50

0

0

0

μl patrón 20 mg/dL

0

50

0

0

μl solución diluida intra saco

0

0

50

0

μl solución diluida extra saco

0

0

0

50

Incubar a 37ºC por 10 minutos. Enfriar y leer en el fotocolorímetro a 520nm. Usando el tubo 1 como blanco COMENTARIO: ……………………………………………………. Firma del alumno

Firma del profesor

NOTA Fecha Hora PRACTICAS DE LABORATORIO Nº7: GLICÓLISIS

22

La vía metabólica más importante para la glucosa es la vía glicolítica o de Embden Meyehof. Esta presente, naturalmente, en todos los tejidos y es responsable del aprovechamiento energético de la glucosa y aún de otros carbohidratos. Tiene dos formas de manifestarse: la forma anaeróbica cuando la concentración de oxígeno es baja, produce ácido pirúvico y ácido láctico, y genera escasamente dos moléculas de ATP, tal como se aprecia en la siguiente fórmula global. GLUCOSA + 2ADP + Pi

2 lactato + 2ATP + 2H2O

Cuando la glicólisis transcurre en presencia abundante de oxígeno, tiene como producto final el ácido pirúvico, el cual se transforma en acétil CoA mediante el proceso de decarboxilación oxidativa, en ingresa al Ciclo de Krebs donde produce 38 moléculas de ATP.

EXPERIMENTO.- Glicólisis.

23

La glicólisis anaeróbica (parcialmente) se demuestra por el aumento de compuestos ácidos (pirúvico y láctico) en el tubo de reacción. Para el efecto preparar cuatro tubos de acuerdo al esquema.

TUBO

1

2

3

4

ml solución de Potter pH 7,4

2,5

2,5

2,5

2,5

ml Glucosa 0,1 m

0,5

0,5

0,5

0,5

ml NAD 10m g/ml

0,2

0,0

0,2

0,2

ml ATP 5m g/ml

0,2

0,2

0

0,2

ml Nicotinamida 0,4m

0,1

0,1

0,1

0,1

ml Yodoacetato 0,1m

0

0

0

0,1

0,3

0

ml Agua destilada

0,1 0,3 Colocar en baño de maría 37ºC por 5 minutos Gotas de rojo de fenol ml homogenizado de hígado

Ii

Ii

ii

Ii

0,5

0,5

0,5

0,5

Tapar e incubar 1 hora a 37ºC Titular cada tubo con NaOH 0,01N hasta el color original

COMENTARIO: ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………….

Firma del alumno

Firma del profesor

NOTA Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO Nº8: RESPIRACIÓN TISULAR 24

La respiración tisular es el proceso por el cual se aprovecha la energía almacenada en los nutrientes (glucosa, ácidos grasos, aminoácidos) a través del Acétil CoA, mediante procesos de oxidación. Durante el proceso de oxidación del Acil Coa se forman equivalentes reductores en forma de hidrógeno o electrones que ingresan a la cadena respiratoria, localizada en las mitocondrias y genera muchas moléculas de ATP. Como puede apreciarse en el esquema adjunto hay tres fuentes de generación de electrones que producen 3 moléculas de ATP, el isocitrato, el cetoglutarato y el malato y una que sólo proporciona dos ATP que es el succinato, debido a que ingresa al ciclo de Krebs a nivel de la Coenzima Q y no del NAD como las otras. El punto final del transporte de los electrones por la cadena respiratoria es el oxígeno. Dos átomos de hidrógeno se unen a ½ molécula de oxígeno para forma una molécula de agua. El proceso oxidativo de los nutrientes se puede seguir por el consumo de oxígeno. EXPERIMENTO: Respiración Tisular El experimento estudia la respiración tisular mediante la manometría. Un manómetro es un instrumento que mide los cambios en la presión de los gases. Esta basado en el principio de vasos comunicantes, si colocamos un líquido en dos recipientes que se comunican entre sí, ambas ramas serán iguales siempre que sobre ellas exista la misma presión sobre una de ellas disminuye los niveles de líquido se desigualan. Los

25

equipos que usaremos serán iguales o semejantes a los que se observan en el gráfico, es decir constan de un ambiente cerrado para la reacción, un medio de absorción de CO 2 que puede combinar Preparar dos frascos de acuerdo al siguiente esquema: FRASCO Nº

1

ml Solución de Potter pH 7,4

3

ml Succinato de potasio 0,5m

0,3

ml Agua destilada

0,7

ml Homogenizado

0,5

Cerrar bien los frascos. Incubar a temperatura ambiente. Medir cada 2 minutos la modificación del nivel del manómetro. Prepara un gráfico de consumo de oxígeno vs tiempo. Consumo de oxígeno en el tiempo

0.4 (cm3)

Volumen O2 consumido

0.5

0.3 0.2 0.1 0 0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20

Tiempo (Minutos)

Comentario: …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… Firma del alumno

Firma del profesor

NOTA 26

Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO Nº9: COLESTEROL DE LAS FRACCIONES LIPOPROTEÍCAS Las proteínas son lípidos complejos resultado de unir la grasa con proteínas. Los lípidos sanguíneos se encuentran bajo esta forma y divididos en cuatro tipos de lipoproteína: Alfa lipoproteína (HDL) ricas en proteínas y fosfolípidos Pre –beta lipoproteínas (VLDL): ricas en triglicérido Beta lipoproteínas (LDL): ricas en colesterol Quilomicrones (Q): ricos en triglicéridos dietéticos

Toda las lipoproteínas tienen colesterol, triglicéridos, fosfolípidos y proteínas, pero en distinta concentración relativa. El colesterol es la grasa que genera la arterioescleroris al depositarse en las paredes de los vasos sanguíneos. El colesterol de las betalipoproteínas está en actitud de depositarse en los vasos constituye la mayor parte del colesterol sanguíneo. El colesterol de las alfa lipoproteínas (HDL) es aquel que está siendo retirado de los vasos, por lo que su presencia es beneficiosa. Para investigar el colesterol de las alfa lipoproteínas usamos un reactivo precipitante (fosfotúngstico-cloruro de calcio) que precipita

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a las betas y prebetalipoproteínas dejando en solución a las alfa, sobre las que se realiza la reacción de color típica del colesterol.

EXPERIMENTO: Dosaje colesterol total y colesterol HDL en sangre. Se toma una muestra de sangre del paciente en ayuno de por lo menos 24 horas. La sangre se coloca en tubo limpio sin anticoagulante. Preparar un tubo al que se le coloca: 1ml de suero límpido 0.1 ml de reactivo precipitante HDL o II gotas Agitar y dejar en reposo por minutos al ambiente Centrifugar a 3 000 por 10 minutos separar el sobrenadante. Preparar cuatro tubos límpidos y colocar: TUBO Nº ml Suero límpido ml Sobrenadente anterior ml Patrón de colesterol ml Agua destilada ml Reactivo de color

1

2

3

4

0,02

0

0

0

0

0,02

0

0

0

0

0,02

0

0

0

0

0,02

2

2

2

2

Agitar: Incubar por 15 minutos a 37ºC. Leer al fotocolorímetro a 520 mu los tubos 1,2 y 3, llevando a cero con el blanco (tubo4) Cálculos 200

Colesterol mg/dl= -------- X D.O.(1 ó 2)

28

D.O (3)

EXPERIMENTO : Dosaje de triglicéridos Preparar tres tubos con: TUBO Nº ml Suero ml Patrón de triglicéridos ml Reactivo de color

1

2

3

0

0,02

0

0

0

0,02

2

2

2

Agitar, incubar a 37ºC por 15 minutos

Leer al fotocolorímetro a 520 nm los tubos 2 y 3 llevando a “O” con el tubo 1

Conc. Patrón

Triglicéridos mg/dl = ------- x D.O.(2) D.O (3)

INFORME DE LA PRÁCTICA : RIESGO CORONARIO Nombre: ............................................................................................................. ............................................................................................................. ............................................................................................................. .......................................................................................... Experimento: Dosaje de colesterol total y colesterol HDL en sangre Patrón: Lectura: Concentración: Factor de Calibración: 29

Colesterol total:

PRACTICAS DE LABORATORIO Nº10: LIPIDOS: ELECTROFORESIS DE PROTEINAS La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) sobre la base de su tamaño molecular y carga eléctrica. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas son moléculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de aminoácidos (fundamentalmente ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e histidina). Para la separación se usa un gel de agarosa, poliacrilamida o acetato de celulosa. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por el papel, por la que las pequeñas se moverán mejor y rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida. En resumen, puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga eléctrica 2) su tamaño 3) la intensidad del campo eléctrico y 4) la temperatura del medio. Las proteínas están compuestas de aminoácidos que poseen grupos ionizables (principalmente -COO -y -NH3+), pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer eléctricamente neutras según la proporción de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. En suero humano la composición normal es: • Proteína total: 6,4 a 8,3 g/dL • Albúmina: 3,5 a 5,0 g/dL • Alfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dL • Alfa-2 globulina: 0,6 a 1,0 g/dL • Beta globulina: 0,7 a 1,2 g/dL • Gammaglobulina: 0,7 a 1,6 g/dL

30

ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA Se usa para la separación y caracterización de proteínas y otras moléculas. El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de adsorción mínimas, por lo que se evita la formación de colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Otras ventajas son: 1) La separación es muy rápida 2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeñas 3) Las tiras pueden hacerse transparentes 4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados 5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos MATERIAL Y REACTIVOS Material - Tiras de acetato de celulosa (“Cellogel”) - Papel de filtro para secar las tiras de acetato - Cubeta de electroforesis - Aplicador - Fuente de electroforesis Reactivos -Tampón Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH=8,6 -Solución de tinción: 0.1% (p/v) ponceau S stain en ácido acético 1% -Solución de lavado: ácido acético 1% -Suero PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Electroforesis: - Humedecer en tampón las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su uso, para su equilibrado. - Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie - penetrable quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha - Depositar la muestra de suero en la tira de acetato de celulosa, en el extremo próximo al cátodo. - Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 100 voltios durante 60 minutos. Revelado:

31

- Finalizada la separación, depositar las tiras en una cubeta con solución de tinción, de modo que queden cubiertas por el líquido, durante 10 minutos. - Lavar las tiras en solución de distinción hasta que se observen bien las bandas de proteína (rojo) sobre un fondo blanco. TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS Dibujar el patrón de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de proteínas séricas, indicando la posición de ánodo y cátodo así como el punto de aplicación de la muestra. Identificar las proteínas que corresponden a cada banda y justificar el orden. Comentario: ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… Firma del alumno profesor

Firma

del

NOTA Fecha Hora

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PRACTICAS DE LABORATORIO Nº11: TRANSAMINACIÓN Una de las reacciones generales de los aminoácidos es la transaminación o trasporte de un grupo amino de un aminoácido a un cetoácido, trasformado al primero en cetoácido y al segundo en aminoácido. Esta transformación posibilita la formación de carbohidratos a partir de aminoácidos, esto es el fenómeno de la neoglucogénesis. LA ecuación general de estas reacciones es: R=CH-COOH + R-C-COOG Nh2

O

R-C-COOH+R-CH-COOH O

NH2

En el caso de nuestro experimento la transaminasa que estudiaremos es la transaminasa glutámico pirúvica que transforma el alfa cetoglutárico (cetoácido) en glutámico (aminoácido) y a la alanina (animoácido) en perúvico (cetoácido). Esa enzima que es particularmente rica en el tejido hepático es un excelente herramienta de estudio clínico de ese órgano, en problemas como la hepatitis o la cirrosis hepática. El procedimiento de análisis se llevará a cabo mediante la cromatografía en capa fina.

PROCEDIMIENTO CROMATOGRÁFICOS

33

La cromatografía es un procedimiento de análisis por el cual una mezcla de moléculas es separada en sus componentes mediante el uso de una fase estacionaria y una móvil. La fase estacionaria o soporte da nombre al tipo de cromatografía: papel, columna, capa fina y la fase móvil es líquida o gaseosa. La separación de componentes se produce por el fenómeno de partición por solventes, esto es ante una mezcla de líquidos no miscible entre sí, algunos componentes tendrán mayor posibilidad de localizarse en uno u otro componente, aquellos que se localicen en el componente más lejano del soporte migraran más y aquellos cercanos serán adsorbidos por el soporte. Existen una forma identificatoria de medir la migración de las moléculas analizadas y es el Rf. Este valor corresponde a la relación entre los cm migrados por la molécula y aquellos migrados por el medio móvil. EXPERIMENTO: cromatografía

Demostración

de

transaminación

por

Preparar 4 tubos de acuerdo la esquema: TUBO Nº ml cetoglutarato 0,2 M ml alanina 0,2M ml piruvato 0,2M ml glutamato 0,2M ml arsenito 0,1M ml Enzima activa ml Enzima inactiva

1

2

3

4

0,3

0,3

0

0

0,3

0,3

0

0

0

0

0,3

0,3

0

0

0.,3

0,3

0,4

0,4

0,4

0,4

0

1

0

1

0

1 =----------------0 RF

a

1

b

b

a a 34

Incubar todos los tubos por 45 minutos a 37ºC. Retirar los tubos del baño de María y agregar 6ml de alcohol etílico a cada tubo. Agitar y esperar por dos minutos. Centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografía. Cromatografía Marcar a 3 cm del borde una línea suave con un lápiz, tratando de no dañar la sílica gel. Marcar en esa línea seis puntos separados por 2 cm cada uno. Colocar en cada punto cinco gotas del respectivo sobrenadante y en las dos últimas 5 gotas de alanina y cinco de glutamato respectivamente. Dejar secar Colocar la cromatoplaca en una cámara de cromatografía con una mezcla de propanol: agua en la proporción de 8: Dejar correr hasta que el nivel líquido le falte 1 cm para llegar al extremo de la placa. Marcar el nivel al que alcanzó el líquido con un lápiz y dejar secar. Aplicar con un spray una solución de ninhidrina al 0,1% e butanol. Colocar a la estufa por 10 minutos. Marcar las manchas obtenidas . Obtener el Rf de cada mancha mediante la fórmula: Distancia de origen al punto medio de la mancha

Rf: Distancia de origen al nivel máximo del solvente

Comentario: …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………….

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NOTA Fecha Hora

35

PRACTICAS DE LABORATORIO Nº12: EVALUACIÓN NUTRICIONAL Experimento .- Manejo de Tablas de Composición de Alimentos La forma más exacta de evaluar la ingesta de nutrientes por un sujeto es a través del cálculo de la ingesta alimentaria, bien documentada y exacta y mediante las Tablas de Composición de Alimentos. En la presente práctica analizaremos: 1. Las necesidades calóricas de un sujeto: tomando en cuenta, peso y trabajo. Así conocemos que una persona gasta como Metabolismo Basal 1 kcaloría /kg. Peso/hora. A ello añadimos aproximadamente un 50% por trabajo de mediana intensidad. 2. Las necesidades proteícas de un sujeto: tomado su peso, aceptamos una necesidad de 1g/kg de peso/día( en condiciones mínimas 0,5/kg peso/día). 3. Las necesidades de nutrientes (proteína, carbohidratos y grasa) de un día al azar. Con ello podemos establecer su ingesta calórica y proteíca y por lo tanto su déficit o adecuación. Para el efecto usaremos la siguiente Tabla de Composición de Alimentos resumida.

TABLA DE COMPOSICIÓN DE ALIMENTOS g/100g de alimento Alimento Atún (conserva) Bacalao (seco) Calamar Camarón Carne (cerdo)

Proteína 29,0 81,8 16,4 17,3 15,0

Lípido 4,8 2,8 0,9 0,2 15,1

Carbohidratos 0,0 0,0 0,0 2,5 0,0

36

Carne (Pavo) Carne (pollo) Carne (pulpa) Carne Seca Chicharrones Cojinova Corvina Hígado Huevo (total) Jamón del País Jamón Inglés Leche fresca Lenguado Merluza Pejerrey Queso Fresco Queso mantecoso Tocino Trucha

Alimento Arroz (seco) Arveja (verde) Avena Bizcocho Camote Fideos Frejol negro Frejol soya Frejol tarhui Galletas (soda) Galletas (Vainilla) Garbanzo

Alimento Lentejas Maíz (cancha)

20,1 18,2 21,3 48,1 11,3 20,2 19,9 19,5 12,8 15,9 25,8 2,9 19.0 19,3 18,7 16,0 25,8 9,1 18,2

Proteína 6,5 8,3 10,6 8,8 1,2 8,7 21,2 33,4 40,9 9,4 6,0 19,1

Proteína 22,8 6,7

20,2 10,2 1,6 9,4 61,4 0,7 0,9 6,6 11,8 26,6 20,5 3,3 0,5 0,8 1,2 10,3 20,2 65,0 1,0

Lípido 0,7 0,7 0,9 6,9 0,2 0,3 1,7 16,4 13,4 14,7 12,7 5,1

Lípido 1,2 2,7

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,6 1,0 0,0 0,0 7,0 0,0 0,0 0,0 3,7 7,4 1,6 0,0

Carbohidratos 78,1 24,2 68,5 64,4 27,1 78,3 53,3 35,5 27,3 67,9 75,0 61,4

Carbohidratos 59,4 79,8

37

Maíz (choclo) Maní Nuez Olluco Pallares Pan (s) Papa blanca Papa Seca Quinua Yuca Aceitunas Blanquillo Cebolla Coco Col Coliflor Lechuga Nabo Pepina Rabanitos Tomate Zanahoria Zapallo

Alimento Aceite Azucar Chocolate Cocoa Gelatina(seca)* Limón Maizena Margarina Naranja Palta Papaya Platano isla Uva negra

3,3 28.8 13,7 0,8 19,9 9,2 2,1 8,3 11,9 0,8 1,2 0,6 0,9 3,8 1,4 2,0 1,4 0,8 0,5 0,8 0,8 0,6 0,7

Proteína 0,0 0,0 2.0 9,0 85,6 0.5 8,0 0,6 1.2 1,7 0,4 0,8 0,3

0,8 46,9 67,2 0,1 1,1 0,3 0,3 0,5 4,7 0,2 33,2 0,1 0,1 18,9 0,0 0,6 0,2 0,2 0,1 0,0 0,2 0,4 0,2

Lípido 100 0,0 30,0 19,0 0,1 0,0 3,0 81 0,0 12,6 0,1 0,2 0,1

27,8 18,1 13,2 14,2 61,8 68,2 22,4 73,2 67,6 39.3 6,8 17,1 7,4 19,7 5.2 5,8 3,3 5,2 2,7 3,1 4,0 9,5 6,4

Carbohidratos 0,0 99,5 60,0 31,0 0,0 11,2 74,0 0,4 11,2 6,5 8,3 23,8 17,9

* Se usan al 3-4g%

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GASTOS DE ENERGIA DE ACUERDO A ACTIVIDAD Y SEXO ACTIVIDAD Durmiendo Muy Ligera: manejo de auto, laboratorio, mecanografía, coser y planchar Ligera: caminar, carpintería, mecanica, lavado de ropa Moderada: fregar pisos, ciclismo, tenis, baile Pesada: albañil, natación, fútbol, básquetbol.

Firma del alumno

MUJER : Kcal /kg/hora 1,1 2,0

HOMBRE : Kcal /k Kg/hora 1,0 – 1,2 ,91,2 – 2.5 1,1-

3,9

2,5-4,9

2,0-

5,9

5,0-7,4

4,0-

10,0

7,5-12,0

6,0-

Firma del profesor

NOTA Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO Nº13: LABORATORIO DE LIQUIDOS CORPORALES. Examen de orina. Examen Fisico-Quimico EXAMEN FISICO- QUÍMICO El análisis de orina de rutina incluye pruebas químicas para pH, proteínas, glucosa, cetonas y sangre oculta. Algunos laboratorios también incluyen pruebas de bilirrubina, urobilinógeno y nitrito, según el tipo de tira reactiva que utilice. Desde la introducción de tiras reactivas simples y múltiples, cintas de prueba y tabletas, el examen químico de la orina se ha convertido en un procedimiento sensible y rápido. Actualmente es posible analizar hasta nueve pruebas diferentes en menos de 60 segundos. Existen dos marcas básicas de tiras reactivas y cada una posee tiras reactivas con posibilidad de medir desde una hasta nueve reacciones diferentes.

39

La compañía Bayer fabrica el producto Multistix y la Boehringer Mannheim Corporation (BMC) fabrica el Combur-10. ambas tiras miden pH, proteínas, glucosa, cetonas, sangre oculta, bilirrubina, urobilinógeno, nitritos, leucocitos y gravedad específica. Pero ¿qué es una tira reactiva? Esencialmente, es una banda angosta de plástico con pequeños tacos adheridos. Cada taco contiene reactivos para una reacción diferente, lo que permite la determinación simultánea de varias pruebas. Un requerimiento crítico es que las reacciones de las tiras sean leídas en el momento prescrito después de haber sido sumergidas en la muestra, luego deben ser comparadas cuidadosamente con la carta de colores proporcionada por el fabricante. Con el objeto de obtener resultados exactos y confiables con las tiras reactivas, deben tomarse ciertas precauciones para ayudar a mantener la reactividad de los reactivos. Las tiras no deben estar expuestas en medios húmedos, a la luz directa del sol, al calor ni a sustancias volátiles, debiendo ser almacenadas en su envase original. Dicho envase no debe ser guardado en el refrigerador no ser expuestos a temperaturas superiores a 30ºC. Estos envases contienen un desecante, pero aun así las tiras no deben quedar expuestas a la humedad. Sacar sólo la cantidad de tiras necesarias por vez y luego cerrar herméticamente el envase. Si los bloques de color de la tira no se parecen a los bloques "negativos" de la carta de colores, si ha pasado la fecha de vencimiento impresa en el envase, las tiras deben ser descartadas. Si la muestra de orina fue refrigerada debe dejarse que alcance la temperatura ambiente antes de efectuar las pruebas. El procedimiento para usar las tiras reactivas es el siguiente: • Sumergir completamente las áreas de prueba de la tira en orina fresca, bien mezclada y sin centrifugar y retirar la tira en forma inmediata. Debe tenerse cuidado de no tocar las áreas reactivas. • Eliminar el exceso de orina de la tira tocando con el borde de éste el frasco que contiene la muestra. Las tiras deben sostenerse en posición horizontal. • En el tiempo determinado comparar las áreas reactivas con la correspondiente carta de colores del envase, la lectura deben hacerse con buena iluminación para lograr una comparación exacta del color. Al mismo tiempo que se introducen mejoras en las características de las tiras reactivas pueden modificarse las indicaciones para su uso. Esto puede significar una diferencia en los tiempos o en los reactivos utilizados; por eso es importante seguir siempre las últimas indicaciones del fabricante. Aún con el amplio uso de estos rápidos y convenientes procedimientos de análisis, sigue siendo necesario comprender los principios básicos de las pruebas, así como la técnica correcta en que deben de usarse. A continuación se mencionarán brevemente los principios en que se basan dichos estudios, con las tiras reactivas. pH En las tiras reactivas utilizan dos indicadores, el rojo de metilo y el azul de bromotimol, que cubren la escala de pH entre 5 y 8,5 o 9. Los colores van del anaranjado al amarillo y del verde al azul. Los resultados pueden informarse en unidades enteras o bien valores intermedios (media unidad). Si se necesita una lectura más precisa, pueden hacerse las mediciones utilizando un potenciómetro con electrodo de vidrio. El momento de lectura del pH no es un elemento crítico; sin embargo, es recomendable que el pH sea leído en forma inmediata ya que de este modo se evitarán lecturas erróneas por rebosamiento (run-over). PROTEÍNAS Este método colorimétrico se basa en el concepto conocido como "error proteico de los indicadores", un fenómeno que se caracteriza por que el punto de cambio de color de algunos indicadores de pH es diferente en presencia de proteínas. Por lo general el indicador cambia del amarillo al azul (o verde) entre pH 3 y pH 4, pero en presencia de proteína el cambio de color se produce entre el pH 2 y el pH 3. en consecuencia, en presencia de proteína se produce un "error" en el comportamiento del indicador. El indicador que se utiliza en el Multistix es el azul de tetrabromofenol 3’, 3’’, 5’, 5’’tetrabromofenolsulfonftaleína, y el indicador del Combur-10 es el 3’, 3’’, 5’ 5’’-tetraclorofenol-3, 4, 5, 6tetrabromofenolsulfonftaleína. En el área reactiva se agrega un amortiguador ácido para mantener un pH constante de 3, que en ausencia de proteinuria de un color amarillo. La aparición de color verde o azul indica la presencia de proteína con el Multistix; en el Combur-10, el color cambia al verde, la intensidad del color es proporcional a la cantidad de proteína presente. El tiempo de lectura en el Multistix no es un factor crítico, y puede leerse en forma inmediata. Para obtener una lectura semicuantitativa en el Combur-10, efectuar la lectura a los 60 segundos (seguir las últimas indicaciones del fabricante) el color del área reactiva debe compararse cuidadosamente con la carta de colores proporcionada. Los resultados por lo general pueden informarse como negativos o hasta 3+ o 4+. Las dos marcas de tiras reactivas poseen diferentes áreas blanco, de modo que no son clínicamente intercambiables. Los valores de las diferentes lecturas se muestran en la tabla 2.

40

Tabla 2. Valores de proteínas en diferentes tiras reactivas Multistix Combur-10 Trazas

5-20 mg/dL

6-20 mg/dL

1+

30 mg/dL

30 mg/dL

2+

100 mg/dL

100 mg/dL

3+

300 mg/dL

500 mg/dL

4+ Mas de 2,000 mg/dL GLUCOSA Con tiras reactivas impregnadas con la enzima glucosa oxidasa puede detectarse sólo glucosa. Estas tiras utilizan las dos reacciones enzimáticas secuenciales siguientes: Glucosa + O2 GLUCOSA OXIDASA ácido glucónico H2O2 + cromógeno PEROXODASA cromógeno oxidado + H2O El cromógeno que se utiliza varía con las diferentes tiras reactivas. CETONAS El Multistix contiene reactivos el nitroprusiato de sodio y un amortiguador alcalino. La reacción con el ácido diacético de la orina forma un color castaño. Esta tira no reacciona con acetona ni con el b -hidroxibutírico. El Multistix se lee a los 15 segundos y permite detectar niveles de ácido diacético hasta de 5-10 mg/dL. El cambio de color es de rosado ante a castaño, y la reacción se informa como: negativa, trazas, cantidad moderada, gran cantidad, o como 5, 15, 40, 80 o 160 mg/dL. Con el Multistix pueden ocurrir resultados positivos falsos (trazas o menos) en los casos en que la muestra de orina sea muy pigmentada o cuando posee grandes cantidades de metabolitos de la levodopa. Algunas muestras con elevada densidad y pH pueden dar reacciones positivas falsas (trazas, 5 mg/dL). Debido a la especificidad del nuevo Multistix para determinación del ácido diacético, el reactivo para cetonas no da resultados positivos con controles que tienen acetona. El Cumbur-10 contiene los siguientes reactivos: nitroferrocianuro sódico, glicina y un amortiguador alcalino. El nitroferrocianuro de sodio y glicina reaccionan con el ácido diacético y con la acetona en medio alcalino formando un complejo color violeta. Esta tira reactiva es más sensible al ácido acético que la acetona; no permite detectar ácido b -hidroxibutírico. El Combur-10 se lee a los 60 segundos y permite detectar niveles de ácido diacético de 5-10 mg/dL y de acetona de 40-70 mg/dL. El color cambia desde el beige al violeta, y la reacción se gradúa de la siguiente forma: negativa, 1+ (5-40 mg/dL), 2+ (40-100 mg/dL), o 3+ (>100 mg/dL). SANGRE OCULTA El procedimiento de detección de sangre oculta con tiras se basa en la actividad tipo peroxidasa de la hemoglobina y de la mioglobina, que catalizan la oxidación de un indicador por la acción de un peróxido orgánico. En el Multistix el indicador es el 3, 3’, 5, 5’-tetrametilbencidina y el peróxido orgánico. En el Multistix el indicador es el 3, 3’, 5, 5’-tetrametilbencidina y el peróxido de hidroperóxido de cumeno. El Combur-10 utiliza el indicador tetrametilbencidina y el peróxido es el 2,5-dimetil-2, 5-dihidroperoxihexano. Ambas marcas de tiras reactivas permiten la detección de eritrocitos intactos, así como la hemoglobina libre y mioglobina. Los hematíes intactos de la orina se hemolizan al ar con el taco reactivo. La hemoglobina liberada reacciona con el reactivo dando puntos verdes sobre un fondo amarillo o anaranjado. Entonces, la presencia de hematíes intactos da una reacción de color verde punteado, mientras que la de hemoglobina libre y la mioglobina dan una coloración uniforma de color verde o del verde al azul oscuro. El Multistix se lee a los 25 segundos, y el color cambia del anaranjado al azul oscuro pasando por el verde. Por lo general permite detectar 5 a 15 hematíes intactos por microlitro o bien 0,0015 a 0,0060 mg/dL de hemoglobina libre. Los resultados se informan en una escala que va desde trazas hasta 3+ o gran cantidad. El Combur-10 se lee a los 60 segundos y el color cambia del amarillo al verde. La concentración más baja que puede detectarse es de unos 5 hematíes intactos/m L, o la cantidad de hemoglobina libre equivalente a 20 hematíes/m L. BILIRRUBINA Y UROBILINÓGENO Las tiras reactivas se basan en la reacción de acoplamiento de una sal de diazonio con la bilirrubina en un medio ácido. Difieren, sin embargo, en la sal de diazonio utilizada y en el color que aparece.

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El Multistix contiene la sal 2, 4-dicloro-anilina diazonio, se lee a los 20 segundos y el color varía del ocre a diferentes tonos de canela (tostado) o púrpura. Se miden así 0,2- 0,5 mg/dL de bilirrubina. El Combur-10 contiene 2,6-dicloro-benceno-diazonio-tetrafluorborato, se lee a los 30-60 segundos, y el color cambia del rosado al rojo-violeta según la concentración de bilirrubina. La prueba permite detectar concentraciones de 0,5 mg/dL de bilirrubina. Los resultados con ambos tipos de tiras pueden informarse como 1+, 2+, 3+ o cantidad pequeña (débil), moderada o grande (fuerte). Para obtener resultados exactos el color de la tira debe ser comparado cuidadosamente con el de la carta de colores. NITRITO En el Multistix, en el medio ácido del área reactiva el nitrito reacciona con el ácido p-arsanílico formando un compuesto de diazonio. Este compuesto se une luego con la 1, 2, 3, 4-tetrahidro-benzo (h) quinolina-3ol produciendo un color rosado. La tira se lee a los 40 segundos. Cualquier grado de color rosa uniforme debe interpretarse como prueba de nitrito positiva y sugiere la presencia de 10 5 o mas organismos por mL. De orina. El desarrollo de color rosa no debe considerarse como prueba positiva. Si el color rosado uniforme es débil es mejor verlo colocando la tira sobre el fondo blanco. En el Combur-10, una amina aromática, la sulfanilamida, reacciona con nitrito en presencia de un amortiguador ácido produciendo una sal de diazonio. Esta sal de diazonio se une luego con la 3-hidroxi-1, 2, 3, 4-tetrahidroxibenzo-(h)-quinolina, formando un colorante azóico. La intensidad del color rojo refleja la concentración del nitrito presente, pero no constituye un índice de la gravedad de la infección. La prueba se lee a los 30 segundos, y el color cambia del blanco al rojo pasando por el rosa pálido.

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Practica N° 13 Urianalisis Objetivo • Realizar los procedimientos generales del urianalisis Materiales • Muestras de orina • Tiras reactivas para análisis de orina • Tubos de ensayo • Centrifuga • Laminas portaobjeto • Laminas cubre objeto • Microscopio binocular • Guantes descartables • Tips descartables • Pipeta automática Procedimientos 1. Colóquese los guantes 2. Observe los aspectos físicos de las muestras seleccionadas por el profesor: Color, Aspecto; anote los resultados en la tabla adjunta 3. Tome una tira reactiva y sumerja la zona de análisis dentro de cada muestra por un lapso de 10 a 15 segundos 4. Retire la tira reactiva con cuidado, elimine el exceso y compare el color de cada uno de los parámetros contra el cuadro de valores correspondiente. Anote los resultados en la tabla adjunta 5. Elimine la tira en la bolsa de bioseguridad correspondiente URIANALISIS Aspecto físico Color Aspecto Densidad Evaluación Química

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PRACTICAS DE LABORATORIO Nº14: LABORATORIO DE INVESTIGACION Exposición de Equipamiento del Laboratorio de Investigación, metodos empleados.

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