Genes Ix- Benjamin Lewin b10c

obre sf mismas forma una he lice duplex con un s urco men o r ( -12 A de ancho) y un s urco may or (-22 A de ancbo). como puede observarse en el modelo a escala de Ja . La helice duplex cs dex tr6gira, es decir, que gira en Ia dirccci6n de las rnanecillas del

5'

o~-o 1)

() l --

~

H2 ~

Nucle6tido

0

o-?"o I

Esque1eto de _ azucar-fosfato

0

H2

Enlaces fosfodiester 5'-3'

Una cadena polinucleotidica esta formada por una serie de enlaces azucar-fosfato 5'-3' que forman un esqueleto con las bases promirentes.

Puentes de hidr6geno

DNA ,

H

3'

5,

I

Y::Jjo

H~C o H-~ fr - H· I'A~ N 1

w·J

N

-N

°

H J-H ~i:~r ·~.~

- p-; ·='

fienen cargas negativas

0~·~

N~ A.-l]'.J ·H -~ TrH

Esquelelo de

azocar·fosfato

Los losfatos

}:::.

M

/r"'.__

~NJ~: ~. )::N 3

0 - H- N

H

S

'H '

El Interior es hidr6fobo

La helice duplex mantiene un grosor constante porque las purinas siempre enfrentan a Ia pirimidinas en los pares de bases complementarios A-T y G-C. La secuencia que se ilustra en la figura es T-A, C-G. A-T. G-C. 1.6 El DNA es una helice duplex

7

reloj observada a lo largo del eje helicoidal. Estas caracterisricas represeman el modelo aceptado para lo que se conoce como forma B del DNA. Es importante percatarse de que Ia forma B representa un promedio, no una estructura especificada con toda precision, pues Ia estructura del DNA puede cambiar localrnente. Si tiene mas pares de bases por vuclla se dice que esta sobregirada, de lo comrario, sera laxa. La torci6n local puede ser afectada porIa con forrnacion global de Ia helice duplex del DNA en el espacio o por la union de proteinas eo siLios especfficos.

Ill Azucar

Base

Fosfato

Los pares de bases planos yacen perpendicularmente al esqueleto de azucar-fosfato.

Las dos cadenas del DNA fo rman una helice duplex. Fotografia ~ Photodisc.

8

CAPITULO 1 Los genes son DNA

La duplicaci6n del DNA es semiconservadora

Conceptos principales • En el experimento de Meselson-Stahl se utiliz6 marcaje de densidad para demostrar que la cadena polinucleotidica individual es La unidad del DNA que se conserva durante la duplicaci6n. • Cada cadena de un DNA duplex (o DNA duplohelicoidal. DNA de doble cadena o DNA de doble banda) hace las veces de molde para sintetizar una cadena hija. • Las secuencias de las cadenas hijas dependen del apareamiento complementario de las bases con las cadenas progenitoras separadas.

Es crucial que el material genetico se reproduzca con exactitud. Las dos cad.enas polinucleotidicas estan unidas solo por puemes de hidr6geno, de mo,do que pueden separarse sin neces.idad de romper en laces covalemes. La especificidad del apareamien to de bases sugiere que cada una de las cadenas progenitoras separadas puede hacer las veces de cade na molde para Ia sfntesis de una cadena hija complememaria. En la se represema el principia de que una nueva cadena hija es ensam blada eo cada cadena progeoitOra . La secuerJcia de la cadena hija es dictada por la cadena progenitora; una A en la cadena progenitora ocasiona la co toeacion de una Ten la cadena hija, en tanto que una G progenitora provoca la incorporaci6n de una C hija, y as! sucesivameme. En la parte superior de la Figura l.ll se muestra un duplex progenitor (no replicado) formado por las dos cad en as progenitoras originales. La parte inferior muesrra las dos duplex hijas que estan siendo producidas por el apareamiento cornplememario de bases. Cada una de las duplex hijas es i.dentica en secuencia original y contiene una cadena progenitora y una cadena recientemente sinteLizada. La

DNA progen1tor Duplicaci6n en medio ~e densldad

..

Generaci6n 1

'00\YNU--< WJ\'ilWI HiBRIDO

HfBRIOO

~

\ / \.IV

PESADO \YI~

LIGERO

~

HiBRIDO

Analisis de densidad

-

~NNI LIGERO

--< VNM/

HfBRIDO

- - ' -· Ligero - - - • · Hibrido Pesado

Generaci6n 2

-- · -· Llgero Hlbridc -- - -· Pesado

-

--

L1gero · - - Hibrido · · - •· Pesado

La duplicaci6n del DNA es semiconservadora.

Cadena hija /

\ Cadena hija

El apareamiento de bases proporciona el meca~;'llo

necesario para Ia duplicaci6n del DNA.

. 7'1lctura del DNA porta Ia infonnad6n necesaria para :-peruar su secuencia. Las consecuendas de este modo de dupticaci6n ... tlustran en Ia . El duplex progenitor ;: replica para for mar dos duplex hijos, cada uno de s cuales esta formado por una cadena progenitora una cadena hija (de sintesis rcciente) . La unidad - 4- se conserva de una generaci6n a Ia siouienre es una de ·: . fc'S cadenas individuales que forman el duplex proge-.,r. Este comportamiemo se conoce como dupli:ad6n semiconservad ora. En la Pigura 1.12 se ilustra una predicci6n de -- e modelo. Si eJ DNA progenitOr porra un mar• .:! e de densidad "pesada" porquc eJ organismo ha "' cultivado en un medio que COJ1tiene un is6topo - _ecuad o (como 15N) (N del T: en otras bibliogra::s aparece como N1s, el resto de los marcadores - ~ ncionados en este capitulo tambien aparecen con 'lUmero despues de la letra p. ej., pn y S' 5 ), sus enas pueden ser distinguidas de las sintetizadas :mdo el organismo es u-ansferido a un rnedio que - ~:enga is6ropos "ligeros" normales. El DNA progenitor consiste en un dltplex de dos - ; en as pesadas (rajas). Despues de una generaci6n credmienro en media ligero, eJ DNA dl'tplex es t rido" en cuamo densidad, o sea que esta forma"'':'r una cadena progenirora pesada {roja) y por ~ cadena hija ligera (azul) . Despues deJa segunda eraci6n, las dos cadenas de cada d(tplex hibrido :an sarado. Cada una adquicre a una pareja =>3 de tal forma que Ia mitad de los DNA d-Ltplex

siguen siendo hfbridos y la otra mitad es complerameme ligera (ambas cadcnas son azules). Las cadenas individuates de estos duplex son completamente pesadas o complecamente ligeras. Este patron se confirm6 experimemalmenre en Ia prueba de Meselson-Stahl en 1958, que sigui6 a Ia duplicaci6n semiconservadora del D.XA a traves de u-es generaclones de crecimiemo de E. coli. Cuando el DNA fue extrafdo de las bacrerias y su densidad se midi6 por cenrrifugaci6n, el DNII. form6 bandas correspondienres a su dcnsidad, pesada en las progenitoras, hibrida en la primera generaci6n, y mitad hibrida y mirad ligera en Ia segtmda generad6n.

Ill

Las cadenas del DNA se separan en La horquilla de duplicaci6n

Conceptos plincipales • La duplicaci6n del DNA es llevada a. cabo por un complejo de enzimas que separan las cadenas progenitoras y sintetizan las cadenas hijas. • La horquilla de duplicaci6n es el punto en que se separan las cadenas progenitoras. • las enzimas que sintetizan el DNA se llaman DNA polimerasas; las enzimas que sintetizan el RNA se conocen como RNA polimerasas. • Las nucleasas son enzimas que degradan a los acidos nucleicos; incluyen DNAsas y RNAsas, y pueden dividirse en endonucleasas y en exonucleasas.

La duplicaci6n cxige Ia separaci6n de las dos cadenas de un duplex progenitor; sin embargo, el rompimiento de Ia estructura es nansitorio, y se reviene conforme se forma e l duplex hijo. En algun mo1.8 Las cadenas del DNA se separan en la horquilla de duplicaci6n

9

J

l"' J

Moleculas de DNA replicada:f

DNA progenitor

Horquilla de dupllcacion

La horquilla de duplicacion es Ia region del DNA en La cual hay una transici6n del duplex progenitor desenroltado a los duplex hijos recientemente replicados.

Enlace roto

I

Una endonucleasa divide a un enlace en un acido nucleico. En este ejemplo se muestra una enzima que ataca a una cadena de un DNA duplex.

.

':

do sintetizada. Las enzimas se nombran segun el tipo de cadena que sintetizan: las DNA polimerasas sintetizan DNA. las RNA polimerasa s, RNA. La degradacion de los acidos n udeicos tambien requiere de enzimas espedficas: las dcsoxirribonuclea sas (DNAsas) degradan alDNA y las ribonucleasas (R NAsas) degradan al RNA. l.as nucleasas se incluyen en las clases generales de exonuclcas as y endonucleasas: • Las endonucleasas conan enlaces inclividuales en e/ interior de las moleculas de DNA y de RNA y generan fragmentos discreros. Algunas DNAsas dividen am bas cadenas de un DNA duplex en el sirio diana, miemras que otras dividen solo una de eiJas. Las endonucleasas partidpan en reacciones de corte, como se observa en la • Las exonucleasas eliminan los residuos, uno a uno. a partir del exLremo de Ia molecula, y generan mononucle6tidos. Siempre actuan en una sola cadena de acido nudeico, y cada exonudeasa avanz.a en una clirecci6n especifica, es decir, empieza en un exu·emo 5' o 3' para dirigirse h.ada el orro . .Esr
...._.. VVVV~\/ Una exonucleasa elimina bases, una a la vez, dividiendo el ultimo enlace de una Cadena polinucleotidica.

Ill

La informacion genetica puede ser proporcionada por el DNA o el RNA

Conceptos principales • Los genes celulares son DNA, pero los virus y Los viroides pueden tener genomas de RNA.

memo, s6lo un tramo pequefio del DNA duplex se separa en tadenas individuales. La estructura helicoidal de una molecula de DNA dedicada a Ia cluplicaci6n se ilustra en Ia . La region no rep licada es el duplex progenitor que se abre hacia Ia region replicada, donde se han formado los dos duplex bijos. La estructura helicoidal doble se rompe en la union entre las dos regiones, llamada horquilla de d upUcad6n. La duplicaci6n implica el movimiemo de l.a horquilla de duplicaci6n a lo largo del DNA progenitor, de modo que hay un desenrollamiento continuo de las cadenas progenitoras y un enrollamienro de los duplex hijos. La sfntesis de acidos nucleicos es caralizada por enzimas especificas, las cuales reconocen el molde y emprenden Ia La rea de catalizar Ia adicion de subunidades a Ia cadena polinudemfdica que esta sien10

CAPiTULO 1 Los genes son DNA

• El DNA se convierte en RNA por transcripcion, y el RNA puede convertirse en DNA por transcripci6n inversa. • La traducci6n del RNA a prote1na es unidireccional.

El dogma central define el paradigma de Ia biologfa molecular. Los genes se perpenian como secuencias de acido (1 ucleic:o. si bien actuan al ser expresados en forma de proteinas. La duplicaci6n es responsable de Ia hercncia de la informacion genetica. La transcripci6n y Ia Lraduccion son responsables de Ia conversion de una forma a otra. En la se Uustran las funciones de Ia duplicaci6n, Ia transcrlpci6n y La traducci6n desde la perspectiva del dogma central: • r..a perpetuaci6n del iicido nucleico suele implicar a/ DNA o el RNA como el materialgenetico. Las celulas utilizan unicamente DNA, en tanto que algunos viws usan RNA, y Ia dupUca-

-

crt \YJ\Y/

DN A

~·

Duplicaci6n

..........

Molde de doble cadena ~

T ra nscri pci6n inversa

RNA

......... ..

'{j\:{j~ ~

~

"\?~~

Cadena antigua

}

Cacenas nuevas Cadena antlgua

La duplicaci6n genera dos duplex hijos. cada uno de los cuales conliene una cadena progenltora y una cadena fabricada recientemente

Duplicaci6n

Molde de cadena Individual

VV\--+ 'JJWR{

'/VV

~ Proteins

El dogma central manifiesta que la informa:lon del acido nucleico puede ser perpetuada o transferida, s;n embargo la transferencia de la informaci6n a protcinas es -·reversible.

La cadena progenitors individual es utilizada para sintetizar una cadena complementaria

-+ VV\

La cadena complementaria es utlllzada para sintetlzar una copia de Ia cadena progenltora

Los acidos nucleicos. tanto los de doble cadena como los de cadena individual, se replican por la sintesis de cadenas complemcntarias reg ida por las reg las del apareamiento de bases.

d6n del RNA vfrico ocurre en Ia celula iofectada.

• l,a expresi6n de In infornwci6n genetica ce/ular suele ser unidireccional. La transcripci6n del DNA genera molecuJas de RNA que tlnicamente pueden scr utilizadas ona vez para generar secucncias de protefuas; en general no pueden recupcrar~c para usarlas como fuente de informacion genetica. La traducci6n del RNA a proteina siempre es irreversible. Esros mecanismos son igualmente efectivos ara la informacion gt>n<'1ica celu Jar de procario:as o eucariotas y para Ja informacion transpon ada ""'::lr los vi rus. Los genomas de 1o emiconservadora. Los :en omas vfricos de doblc cadena, sean de DNA o ~'\A, tambien se replican utili7ando como molde ..35 cadcnas individuales del diiplex para simetizar ~s: las cadenas complemenrarias. Los virus con genumas de una sola cadena la _ ~zan como moltk para sintetizar una cadena .:-"lDplemenraria, Ia cual. a su vez, es utilizada para

sintetizar a su cornplemenro. que, por :.upue~ro. es idenrtco a Ia cadena original inidal. La duplicaci6n puede implicar Ia £ormaci6n de intermediaries estables de doble cadena o utilizar
ci6n inversn petntile que una secuencia de RNA sea recuperada y utilizada 1:01110 in[ormaci611 genetica . La existencia dr Ia d uplicad6n del RNA y de Ia transcripci6n inversa cc;tab lece el principio general de que Ia informacion en cualquier tipo de secuencia de dcido nucleico puede convertirse en e/ otro ripo. Sin embargo. en el cur~o normal de los hechos, la celula depende de los procesos de duplicaci6n, uanscripci6n y rraducci6n del D t A. o obstante. alguna vez Ia in[ormaci6n de un RNA celular se conviene en DNA y se insena en cl genoma (evemo posiblemente mediado por un virus RNA). Aunque Ia transcripci6n inversa no participa en las operacioncs regulares de Ia celula, Uega a ser un mecanisme potencialmente imponame cuando se analiza Ia evoluci6n del genoma .

1.9 La informacion genetica puede ser proporcionada por el DNA o el RNA

11

J ..1

~

Moleculas de DNA repllcadas

I

DNA progenitor

Horquilla de duplicaci6n

La horquilla de duplicaci6n es la regi6n del DNA en la cual hay una transicion del duplex progenitor desenrollado a los duplex hijas recientemente replicados.

Enlace

l

roto

Una endonucleasa divide a un enlace en un acido nucleico. En este ejemplo se muestra una enzima que ataca a una cadena de un DNA duplex.

do sintetizada. Las enzimas se nombran segun el tipo de cadena que sh1tetizan: las DNA polimerasas sinterizan DNA. las R NA po limerasas, RNA. La degradaci6n de los acidos nucleicos tambien requiere de enzi:rnas especificas: las desoxir ri b o n ucleasas (DNAsas) degradan al DNAy las ribonuclea sas (RNAsa s) degradan al RNA. Las nudeasas se induyen en las clases generales de ex o nuclea sas y endo nudeasas: • Las endonudeasas cmtan enJaces individuales en el imerior de las moleculas de DNA y de RNA y generan fragmentos cliscretos. Algunas DNAsas d.ividen ambas cadenas de un DNA duplex en el s.itio diana, mientras que otras dividen solo una de elias. Las endonudeasas participan en reacdones de cone, como se observa en Ia • Las exonucleasas eliminan Los residues, uno a uno, a partir del extremo de la molecula, y gcneran mononude6tidos. Siempre actuan en una sola cadena de acido nucleico, y cada exonucleasa avanza en una direcci6n especifica, es decir, empieza en un extreme 5' o 3' para dirigirse hacia el otro. Estan involucradas en reacdones de ajuste, como se rnuestra en Ja

Dl Una exonucleasa elirnina bases, una a Ia vez, dividiendo el ultimo enlace de una cadena palinucleotidica.

La informacion genetica puede ser proporcionada por el DNA o el RNA

Conceptos principales

memo, solo un tramo pequeno del DNA duplex se sara en cadenas individuates. La estruclllra he licoida l de una molecu la de DNA dedicada a la duplicacion se ilustra en la . La region no replicada es el dttplex progenitor que se abre hacia Ia region repJicada, donde se han Eormado los dos dttplex h.ijos. La estructu.ra helicoidal doble se rompe en la union entre las dos regiones, llamada h orqu illa d e duplica cion. La duplicaci6n implica el movimiemo de la horqui· Ua de duplicaci6n a lo largo del DNA progenitor, de modo que hay tm desenrol1amienro continuo de las cadenas progenitoras y un emollamiemo de los duplex hijos. La s!nresis de acidos nucleicos es catalizada por enzimas especfficas, las cuales reconocen el molde y emprenden la tarea de catalizar la adid6n de subunidades a Ia cadena polinucleotfd.ica que esta sien10

CAPITULO

1

los genes son DNA

• Los genes celulares son DNA, pero Los virus y los viraides pueden tener genomas de RNA. • El DNA se convierte en RNA par transcripci6n, y el RNA puede convertirse en DNA par transcripcion inversa. • La traducci6n del RNA a proteina es unidireccional.

El d ogma cen t ral define el paradigma de la biologla m olecular. Los genes se perpetuan como secuencias de addo nucleico, si bien actuan al ser expresados en forma de protefnas. La duplicaci6n es responsable de la herencia de La infom1ad6n genetica. La transcripci6n y Ia traducci6n son responsables de Ia conversion de una forma a otra. En Ia se il.ustran las funciones de la duplicaci6n, la uanscripd6n y Ia tTaducci6n desde Ia perspectiva del dogma central: • La perpetuaci6n del acido nucleico suele implicar al DNA o el RNA como el materia.! genefico. Las celulas utilizan unicamente DNA. en tanto que algunos virus usan RNA, y Ia duplica-

Duplicaci6n

@

Transcripci6n inversa RNA

-<

Molde de doble cadena

\ i J \ 1 / DNA ....C.• . . . . . . ....

...........

~

~ ' r~·~

V

..

V ~~

}

Cadena antigua Cadenas nllevas Cadena antigua

La duplicaci6n genera dos duplex hijos, cada uno de los cuales contiene una cadena progenitora y una cadena fabticada recientemente

Duplicaci6n

Molde de cadena individual

VV\--+~

~ Protefna

(IVV -+VV\ El dogma central manifiesta que la informa::-6n del acido nucleico puede ser perpetuada o transferida, :'.., embargo la transferencia de la i nformacion a proteinas es ,.eversible.

La cadena progenitors individual La cadena complementaria es es utllizada para sintetizar una utilizada para sintetlzar una copja cadena complementaria de Ia cadena progenitors Los acidos nucleicos, tanto los de doble Cadena como los de cadena individual, se replican por la sintesis de cadenas complementarias regida por las reg las del apareamiento de bases.

cion del RNA vfrico ocurre en la celula in feclada .

• La expresi6n de Ia informacion genetica celular suele ser unidireccionaL. La transcripci6n del DNA genera moleculas de RNA que tlnicamente pueden ser utilizadas otra vez para generar secuencias de proreinas; en general no pueden recuperarse para usarlas como fuente de informacion genetica. La traducci6n del RNA a protelna siempre es irreversible. Es tos mecan ismos son igualmeme efectivos ;;ra la informaci6n genetica celular de procario.:s o eucariotas y para la informacion transportada •r los virus. Los genomas de wdos los organismos ''OS estan fo rmados por DNA duplex . Los virus - seen genomas de DNA o RNA, y de cada tipo hay : emplos de doble cadena (ds, double sh·anded) ode .:.adena unica (ss, single stranded) . Los detalles del -::ecanlsmo de replicad6n del acido nucleico varfan ;:me los diferenles sist emas vfricos, pero el princide duplicaci6n por sinresis de cadenas comple,emarias sigue siendo el mlsmo, segun se ilustra ..... la Los genomas celulares reproducen el DNA por ::.mecanisme de dLtplicaci6n serniconservadora. Los _::nomas viricos de doble cadena, sean de DNA o - ·_-\, tambien se replican u tilizando com o molde .=s cadenas individuales del d{tplex para sintetizar : las cadenas complementarias. Los virus con genomas de una sola cadena la -~an como molde para simetizar una cadena :np lementaria, Ia cuaL a su vez, es utiJizada para

sintetizar a su complememo, que, por supuesto, es ictemico a la cadena original inicial. La duplicaci6n puede implicar la fo rma ci6n de interrnedjarios eslables de doble Cadena 0 Uli lizaT acidO nucleico de doble cadena s61o como una Iase transitorla. La resrricci6n de la transferencia unidirecciona l de DNA a RNA noes absolura, ha sido superada por los retroviru s, cuyos genomas estan formados por molecuJas de RNA de una sola cadena. Durante el ciclo infeccioso, el RNA se conviene eo una cadena unica de DNA por el proceso de t ranscripci6n inversa: dicha cadena. a su vez. es convertida en un D A de doble banda . Este DNA dt\plex se convierLe en pane del genoma de Ia celula y es heredado como cualq uier otro gen, de manera que Ia transcrip-

ci671 in versa permite que una secuencia de RNA sea recu perada y utilizada como informacion genetica . La ex istencia de la duplicaci6n del RNA y de !a mmscripci6n inversa establece el p ri ocipio general de qu e Ia informacion en cualquier tipo de secuencia de acido nucleiw puede convertirse en el otro tipo. Sin embargo, en el curso normal de los hechos, Ia celula depende de los procesos de duplicaci6n, Lranscripd6n y traducci6n del DNA. No obstante, alguna vez Ia informacion de un RNA celular se conviene en D NA y se insena en el genoma (evento posiblemente mediado por un virus RNA). Aunque Ia transoipci6n inversa no partidpa en las operaciones regulares de la celula, llega a ser un mecanisme potendalmente impon:ante cuando se analiza la evoluci6n del genoma.

1.9 La informacion genetica puede ser proporcionada por el DNA o el RNA

11

I

Genoma Organismos Plantas Mamlferos Gusanos Moscas Hongos Bacterias Mlcoplasma Virus DNAds Vaccinia Papova (SV40) Fago T4

~

1·

1

li.~

:"'

Numero de genes

Pares de bases

<50 000 30 000 14 000 12 000 6000 2--4 000 500

<10 11 109 - 108 1.6 x 108 1.3 X 107 <107 <106 -3

-200

VirusDNAss Parvovirus Fago fX174

1,5

5 000 5 387

V1rus RNAds Reovirus

22

23000

Virus RNAss Corona virus Influenza TMV Fago MS2 STN V Vlroides PSTV RNA

-6

4 1

20 000 13500 6400 3569 1 300

0

359

7 12 4

La cantidad de acido nucleico del genoma varia

en un rango enorme. ds, doble cadena; ss, cadena unica.

Los mismo::. principios se aplican a la perpetua cion de la informacion gcnetica tanto en los genemas enormes de plantas o anfibios como en los genomas diminutos del micoplasma y en la inforrnaci6ngenetica alin mas peCJueila de los virus de DNA o RNA. Eo la se resumen algunos ejemplos de la gama de Lipos y tamanoc; de los genomas. En toda Ia gama de organismos, cuyo comenido total de genomas varia en un range superior a las 100 000 veces. prevalece un principia comun:

el DN.4 codifica a codas las proref11as que la(s) dlula(s) del otganismo debe(n) sintetizar, y las proteinas, a su vez (directa o indirectamenre), propordonan las furzciones necesarias para Ia superv1vencia. Mediante un principia sirniJa r se describe Ia funci6n de la informacion gen<:!rica de los virus, ya sea de DNA o RNA: el acido

nucleico codifica a fa(s) proceina(s) necesan'a(s) para empaquetar a! ge11oma y rambiin para malquier funci6n adicional a las proporcionadas porIa cilula Jwspedadora necesaria para la reproduccion del virus duraure su ciclo infeccioso. (El virus mas pequef:i.o, el virus sacelite de la necrosis del tabaco [STNV, satellite tobacco necrosis vinzs], no puede replicarse de forma independieme, requiere de Ia presencia simulumea de un virus Hcooperadorl(, el virus de la necrosis del tabaco [TNV. tobacco necrosis virusj, que por sf mismo es un virus normalrnente infeccioso.)

12


Los acidos nucleicos se hibridan por apareamiento de bases

X

187 000 5 226 165 000

<300

1111

Conceptos principales • El calentamiento provoca que las dos cadenas de un DNA duplex se separen.

La T,.. es el punto media del rango de temperatura de desnaturalizacion . • Las cadenas complementarias imicas pueden renaturalizarse cuando se reduce la temperatura. • Puede haber desnaturalizaci6n y renaturalizaci6n/ hibridaci6n con combinaciones de DN A-DNA, DNARNA o RNA-RNA, y pueden ser int ermoleculares o intramoleculares. • La capacidad de dos preparaciones de acido nucleico de una sola cadena para hibridarse demuestra su complementadedad.

Una propiedad dave de la helice duplex es su capaddad para separar las dos caden as sin aiectar los enlaces covalentes; esto hace posible d!cha separa cion, y que se reform en en condidones fisiologicas a la veloctdad necesaria (muy rapida) para mamener las funciones gcneticas. La especificidad del proceso depende ctel apareamiento complementario de las bases.

El concepto de apareamiento de las bases es ftmdamental para lodos los procesos relacionados can los addos nucleicos. La separaci6n de los pares de bases es un aspecro cr-ucial de la funcion de una molicula de doble cadena, mientras que Ia capacidad para formar pares de bases lo es pam la actividad de un QC/dO nucleico de cadena unica. Eo Ia se muestra que el apareamiento de bases perrn.ite que los acidos nudeicos complementarios de cadena (mica [ormen una esrructura duplex. • Una region duplex intramolecu lar puede formarse per apareamiemo de las bases enne dos secuencias complementarias que forman pane de una molecula de cadena unlca. • Una molecula de Cadena unica pu ede aparearse a naves de las bases con una molecula de Cadena unica, complementaria e independiente. para formar un duplex inccrmolecular. La formaci6n de dominies duplex a partir de atidos n ucleicos de cadeoa un.ica esmas imponante para el RNA, pero rambien existe un DNA decadena unica (en forma de genomas viricos). El apareamiento de las bases entre cadenas complementarias unicas e independientes no esta restringido a cornbinaciones DNA-DNA o RNA-RNA, rambien puede ocun·ir entre una molecula de DNA y una de R!'lA.

:

o\

I \ rA"JIX".IX')f

JV.,V/\.'1(. ' \.~

!(

Desnaturalizac16n)

-:areamiento ..amolecular ~RNA

RNA - pareamiento -·ermolecular entre .,..oh~culas cortas oargas de RNA

DNA de doble cadena

VVVV' / VVV

DNA de cadena individual

RNA largo RNA corto

~tVJvl~ ....__ _ _ _..-i Renaturalizaci6n

Et apareamiento de bases ocurre en los DNA _ ::x e incluso en las interacciones intermoleculares e intra-

... ::ulares del RNA (o del DNA) de cadena individual. La carencia de enlaces covalentes entre cadenas :r.plemenrarias permire manipular al DNA in vitro. uerzas no covalentes que estabilizan ala helice '"'lex se intermmpen por calcmamiento o exposir:. a concentraciones bajas de sales. Las dos cadeJe Ia heUet' duplex se separan complerameme ~do se rompen todos los puemes de hidrogeno _c las unen . El proce~o de ~eparacion de cadenas se llama desnaturaJizaci6n o (coloquialmeme) jiJSion. (EI ~no ~dcsnaturalizaci6n" tambien se unliza para cribir Ia perd.ida de 1a estructura auu!mica de una • :elna; es un termino general que implica que Ia - nformad6n natural de una macromolecula se ha ~.msformml o.)

La desnatUralizad6n del DNA se presema en un limitado de temperatura y da Iugar a cambios rprendemes en muchas de sus propiedades fisicas. ::: pun to mcd io del rango de temperatura en que las -denas del DNA se saran sc conoce como tempe·:ura de fusi6u (Tm, melting temperahrre), Ia cual dee ndC' de la proporci6n de pares de bases G-C. Como •.1da uno de estos pares riene tres puentes de hidr6: e no, es mas estable que un par de bases formado ~ r A-T, el cua l so lo cucma condos de dichos puenes. Entre mas pares de G-C contenga cl DNA. mayor d a Ia cantidad de cnergia necesaria para separar las .:.adenas. En solucion y en condiciones fisiol6gicas, ... n DNA con IJ.O% de pueores G- C. valor tipico de los ::-enomas de los mamiferos. se desnaruraliza a una Tm .:t)roximada de 87°C, de rnodo que el D lA duplex es estable a Ia temperatura de Ia celu la. La dc!>llaLUralitaci6n del DNA es revers!ble en .. ' Ddiciones apropiadas. La capaLidad de las dos ~adenas complementarias separadas para volver a rmar una helice d(•plex se llama renaturalizad 6n, Ia cual depende del apareamiento especffico :e las base~ entre las cadenas complememarias. En a se observa que la reacci6n tiene Iugar ~ngo

Las cadenas individuates de DNA desnaturalizadas pueden renaturalizarse para forma r una estructura duplex.

en dos etapas. Primero, las cadenas individuates de DNA que estan en Ia 5oluci6n se encuentran por

casualidad; si sus secuencias son complcmcmarias, aparearan sus base'> para generar una region cona de heUce duplex. Posteriormenle, dicha region se exLiende a Io largo de Ia molecula como una cremallera para fo rmar una molecula duplex larga. La renaturalizaci6n de Ia helice duplex restaura las propiedade!> originates perdidas con la desnaturalizad6n del DNA. La renaturalizaci6n describe Ia reacd6n entre dos secuencias complementarias separadas por desnaruraliz,1d6n . Sin embargo. Ia tecnica puede ampliarse para permitir que cualesquiera dos secuencias complementarias de acidos nucleicos reaccionen entre sf para formar una esrructura dup lex. A este proceso se lc llama asociaci6n, si bien Ia reacd6n se describe de forma mas gene raJ como h.ibridaci6n cuando panicipan acidos nucleicos de diferentes orfgenes, como sucede cuando una praraci6n es DNA y la orra, RNA. La capacidad de dos preparaciones de ticidos

mtcleicos parn hibridc~rye demuestra con precisi611 su complememariedad. pues s6Jo las secue11czas complementarias puedtm fonnar una esmrctura cillplex. El principia de Ia reacci6n de Ia hibridaci6n es poner freme a frente dos preparadones de addos nucleicos de cadena individual y despues caJcular Ia camidad de materia de doble cadena que se forma . En Ia se ilusrra un procedim.ienro por el cual ~c desnaturaliLa una preparaci6n de DNA y se adsorben en un filtro las cadenas unitarias. Posteriormente se anade una segunda preparaci6n de DNA (ode R ·A) desnaturalizado. El fihro es tratado de tal forma que la segunda preparad6n se adsorba solo si puede formar pares de bases con el DNA adsorbido en un principio. Usualmem c Ia segunda 1.10 Los acidos nucleicos se hibridan por apareamiento de bases

13

L"!Kc>:!•lil11i iiillH•]{i~Hilll

1

I

'-r'\.f.'\.~ .

~ Se desnaturaliza el DNA y se adsorbe en un flltro

Se desnaturaliza et DNA en soluci6n

~

~

' ()/::' \

'--

I

Se sumerge el filtro

en Ia soluci6n

~

-J2 Se determina el DNA unido al filtro

~

'

~) La hibridaci6n en filtro establece si La soluci6n de DNA (o RNA) desnaturalizado contiene secuendas complernentarias a las cadenas inmovilizadas en el filtro.

prarad6n se marca radioactivam eme, de manera que se pueda med ir Ia reacci6n como Ia cantidad de marcador radioactive retenido por el t1lrro. La extension de Ia hibridaci6n entre dos acidos nucleicos de cadena individual depende de su complemen Lariedad. No es necesario que dos secuencias sean perfectamente complementarias para hibridarse . Si estan esrrechamenre rclacionadas, pero no son ictemicas, se forma Lm duplex imperfecto en el cua l el apaream iento de bases se interrumpe en las posiciones en que las cadenas iodividuales no co rresponden.

1111

Las mutaciones cambian la secuencia del DNA

Conceptos principales • Todas las mutadones consisten en cambios en la secuenda del DNA. Las mutaciones pueden ser espontaneas o inducidas por mutagenos.

Las mmaciones proporcionan evidencias determinamcs cle que el DNA es el material genetico. Cuando un cambio en Ia secuencia del DNA provoca una rnodificad6n en la secuencia de una protefna, se puede conduir que el DNA cod ifica a did1a prorefna. Ade14


mas, un cambio en el fe.notipo del o rganismo puede permirir que se idenrifique la funci6n de Ia protclna. La existen cia de oumerosas mutacion e~ en un geo pennite que se comparen nurnerosas variantes de una proteina, y mediante un anal\sis detallado se identificanin las regiones de la proLefna responsables de una funci6n enzim;itica ode otras funciones. Toclos los organismos experimentan cierto n umero de mutaciones como resultado de las operaciones celulares nm·males o de las interacciones aleatorias con el arnbien re a las cuales se Jes llama mutacione s espon taneas; la velocidad ala que se producen es caracterfstica del organismo especifico, yen ocasiones se le llama nivel de Jondo. Las m utadones son <:venros raros y, por supuesto, las que daiian a un gen son descarrad.as con la evoluci6n, de modo que es dilicil obtener grandes cantida des de murantes espontaneos pa ra estudiarlos en laspo blaciones naturales. La incidencia de las mutaciones suele incrementarse mediante tratarniemos con ciertos compuestos; se les llama mutagenos, y los cambios que provocan se conoceo com o mutacion es inducidas. La mayorfa de los mutagenos actC1an directamente en virtud de su capaddad para modificar una base especifica del DNA o paraincorporarse en el acido nucleico. La efecl ividad de un murageno se juzga por Ia medida en que incrementa Ia tasa de mutaciones respecto del nivel de fondo. Utilizando mutagenos se pueden inducir numerosos cam bios en un gen. Las mutaciones espomaneas que desactivan el funcionamiento de un gen rienen Iugar en los bacteri6fagos y en las bacteri.as a una tasa relativamente constante de 3 a 4 x 1 0"3 por gen oma, por gcne raci6n . Dada Ia gran variaci6n e n el tama6o de los genomas emre bacteri6fagos y bacterias, esra tasa corresponde a amplias diferencias en el 1itmo de las mu [aciones por par de bases, lo cu al sugiere que Ia t.asa global de mu raci6n ha estado sujeta a fuerzas sclectivas, qu e han equilibrado los efectos tl ocivos de Ia mayorfa de las mutaciones respecto de los favorab les de a lgunas mutaciones. Esta conclusion se refuerza por la observaci6n de que una arqueobacteria que vive en condiciones adversas de altas temperaturas y acidez (que supuestamenle daiian el DNA) no muestra una tasa elevada de mutaciones, de hed1o la tasa de mutaci6n global apenas es menor al rango p romedjo. Ert Ia se muestra que en las bacterias, Ia rasa de muraciones cor responde a - l o ~ evemos por locus por generaci6n, o a una tasa promedio de cambio por par de bases de 10·'1 a 10· 10 por generacion. La rasa en pares de bases individuates varfa considerablemen le, en un rango de J 0 000 veces. No hay un catculo precise de Ia tasa de muraciones en

H

~

H

'i~N.._H /

--(

0

H-

).....,NY>;

0 J.w>-N H-N

CualqUier par de bases. 1 en 10'-1 0' 0 generaclones

~TCGGAC TTACCGGTTA

1J

'Jill

G Acido nitrosuo

\

II

- AGCCTGAATG GC CAA T. ...

Cualquier gen. 1 en 1()5-10• generac1ones

~

CITOSINA

~r

'\

\

(

C

Tasa de mutaci6n

~'

O"plloa~

~'H

_.....N'l(~ 0 URACILO

)

0

~

,...N")(N'

U

0

H

tclon ~ ~mutante

El genoma,

1 en 300 generac1ones

C

A

'\:.(J\Jr;\.ljW)' tipo sllvestre G

Un par de bases muta a una tasa de 10·9 a l0-10 ;eneraci6n, un gen de 1 000 pares de bases mula a una lasa ~ -!0~ por generacion, en lanlo que un genoma bacteriano - _:;; a una tasa de 3 x 10·\ por generaci6n.

- _.:ariotas. aunque en general se piensa que hasra :to pumo es similar a Ia de las baaerlas. calculada :-locus y por generaci6n.

Las mutaciones pueden afectar a pares de bases individuales o a secuencias mas largas [ooceptos principales Una mutaci6n puntual modifica a un solo par de bases. Las mutaciones puntuales pueden ser provocadas por la conversion qu1mica de una base en otra o por errores durante la duplicaci6n. Una transici6n remplaza un par de bases G-C con un par de bases A-T, o viceversa. Una transversion remplaza una purina con una pirimidina, por ejemplo, A-T a T-A. Las inserciones son el tipo mas comun de mutacion, son resultado del movimiento de elementos transponibles.

:: alquicr par de bases del DNA puede mutar. Una mutaci6n puntua l cambia solo un par de bases, y :-aede c;er provocada por rlos Lipos de evemos: • La modificad6n qUJmica del DNA convierre directamente una base en otra diferente. • Un mal fundonamiento durante Ia duplicaci6n del DNA provoca Ia inserci6n de tma base cquivoci'lda en una cadena polinudeotidica duramc Ia sfmesis del DNA.

las mulaciones pueden ser i nducidas por modificaci6n qui mica de una ba!.e.

Las mutaciones pumuales pueden ser de dos tipos, dependiendo de Ia naluraleza del cambio cuando una base es sustituida por otra: • La clase mas comun es Ia tra n sici6n, que consistc en Ia susLituci6n de una pirimidina porIa Oira. o de una purina por la orra, en cuyo caso. un par G-C C'S remplazado por un par A-T, o viceversa. • La clase mcno~ comun es la t ransversion. en Ia cual una purina es remplazada por una pirimidina o virevcrsa, de tal forma que un par A-T se conviene en T-A o en C-G. Los crenos del acido nirro!>o constituyen un ejemplo clasico de transici6n por Ia conve rsion qufmica de una base en otra. En la se muestra quC' cl acido nitro~o !leva a cetbo una ctesaminaci6n oxidativa que convierte a Ia ci tosina en uracilo. En cJ ciclo de· duplicacion que sigue a Ia transici6n, el Use aparea con una A, y no con Ia G. con Ia cualla C o riginal se habria apareado. De esta manera, cl par C-G <'S remplazado por un parT-A cuando Ia A se aparea con Ia Ten el siguicnte ciclo de duplicaci6n. (EI acido nitroso rambien desamina a la adenina. provoca ndo Ia transici6n iuver!>a de A-TaG-C.) Las n·ansiciones t.ambien son provocadas por aparea mie nto e rr6 me o d e bases. cuando parejas inusuaJec; se aparean desaflando Ia restricci6n usual de los pnres de Watson y Crick. En general. el apareamiemo err6neo de bases e) una aberraci6n, resultado de la incorporaci6n en el D~A de una base anormal que Lienc propicdade~ antbiguas de apareamiemo. En Ia se ntueo;tra el ejemplo del bromourarilo (BrdU), molecula analoga ala rimina

1.12 Las mutaciones pueden afectar a pares de bases individuates o a secuencias mas largas

15

'

t

'il

•

!cli• •

•.

. ilti~

~----

El BrdU se aparea con Ia A en Ia dupllcaci6n

1 t

Br

HC~~0 - ••

~I N ./Y ' H

~ II Azucar 0

H,N.... H

A N~G-tt 11 ~CH HC~Nc-.tf

"'·

Par BrdU-A El cambio ceto-enol permite que el

Azucar

BrdU se aparee con Ia G

~r

Hc(cy.)~ /N~N,H,/

Cambio ceto-enol

Azlicar 0

9

Br

H ~c'c;OH /N, /~

Azl!car

9

0

I

El BrdU se aparea ... con Ia G en Ia duplicaci6n

Par BrdU-G

Azucar

Se pueden inducir mutaciones at incorporar analogos de bases en el DNA.

que <:t.>nlielte Utt aromo de I.Jromina en Iugar del grupo metilo de la timina. El BrdU se incorpora al DNA en Iugar de Ia timina. No obstante, sus propiedades de apareamien LO son amblguas porque eJ atomo de bromina perm ire que se realice 1m cambia en el cual !a base moclifica su esrructura, de una [orma ceto (=0) a unct forma enol (-OR). Esta 1iltima puede aparearse con Ia guanina. lo cual conduce a Ia susLit uci6n del par original A-T por un par G-C. El apareamienro err6neo puede ocurrir durante la incorporaci6n original de la base o en un dclo subsiguieme de duplicaci6n. La Lransici6n es indu cida con dena probabilidad en cada ciclo de duplicaci6n, de modo que Ia h1corporaci6n de BrdU tiene efecms con Lin uos en Ia secuencia del DNA. Durante mucho tiempo se pens6 que las mulaciones runruales eran Ia vfa principal de cambia 16

CAPiTULO 1 Los genes son DNA

en gene~ individuates, pero ahara sabemos que las inse rciones de fragmenros de material adicional son muy frecuentes. La fuente del material insertado yace en los elementos transponibles, que son secuencias de DNA susceptibles de carnbiar de ll1gar (vease Capfrulo 21, Transposones, y Capitulo 22, Rerrovirus y retroposones). Normalmente, una inserci6n supri.me la actividad de un gen, y donde han ocurrido dichas inserciones, despues pueden producine deleciones de una parte o todo el malerial insenado, y h.asta de los dominies adyacentes. Una diferencia significativa entre las mutadones puntuales y las inserciones/deleciones es que la rrecuencia de las prirneras puede incremenLarsc por los mutagenos, mientras que Ja inddencia de los cambios provocados por elementos LTaosponibles no se ve a[ectada. Sin embargo, las inserdones y deleciones tambien pueden ser producto de mecanismos, por <'it'mplo, los que implican errores cornetidos dmante la duplicaci6n o la recombinad6n, aunque probablemcnte sean menos comunes. Por ona parte, una clase de muragenos, las acridinas, dan lugar a inserdones y deledones (muy pequefias).

liD

Los efectos de las mutaciones pueden ser revertidos


• Las mutaciones directas desactivan a un gen, en tanto que inversas (o revertientes) revierten sus efectos. • Las inserciones pueden revertir por delecion del material insert-ado, pero las deleciones no pueden reverti rse. • La supresi6n ocurre cuando una mutaci6n de un segundo gen anula el efecto de la mutaci6n del primero.

En la se muestra que el a.lsJ.amiento de los revertientes es una caxacterfstica imponante que distingue las mutaciones punruales y las inserciones de las deledones: • Una nmtaci6n puntual puede revertirse al resraurar la secuencia original o al adquirir una mutacl6n compensadora en alguna otra parte del gen. • Una inserci6n de material adicional puede ser revertida por deleci6n del material insertado. • Una deleci6n de una parte de un gen no puede revenirse. Lasmutadones que desactivan a un gen son llamadas mutadones d.irectas, y sus efectos son reverrid.os por mutaciones inve rsas, las cuales son de dos cipos, reversion verdadera y reversion supresora imragenica.

~ ~

ATCGGACTIACCGGTIA TAGCCTGAATGGCCAAT Mutacion puntual ATCGGACOACCGGTIA TAGCCTGAGTGGCCAAT Reversion

l

ATCGGACTTACCGGTTA TAGCCTGAATGGCCAAT ATCGGACTIACCGGTIA TAGCCTGAATGGCCAAT lnsercion ATCGGACTTXXXXXACCGGTIA TAG CCTGAAYYYYYTGGCCAAT Reversion por delecion

I t

ATCGG ACTTACCGGTIA TAGCCTGAATGGCCAAT ATCGGACTIACCGGTTA TAGCCTGAATGGCCAAT

ATCGGACGGTTA TAGCCTGCCAAT Reversion lmposible

las mutaciones puntuales y las inserciones pue ~ den ser revertidas, pero las deleciones son irreversibles.

Una reversion exacta cic Ia muraci6n original sc llama reversion verdad era, de tal manera que si un par A-T ha sido rcmplat.ado por un par G-C, otra m utaci6n que restiruya cl par A-T regenerara cxactamenre Ia secuencia de ripo silvesu·e. El segundo tipo de mutaci6n inversa, Ia rever~ i 6 n supresora in tragenica , puede rener Iugar en otro sitio del gen, y sus efectos cornpensan a Ia primera mutaci6n. Por ejemplo, un cambio de aminoacido en una protefna purdc abolir Ia fun ct6n del gen. pcro una segunda alteraci6n puede compensar pur la primera y restaurar Ia acrividad dr Ia protefna. Una mutaci6n direaa resu lta de cualquier cam bia que desaclive un gen, mientras que tma mutaci6n in versa debe restaurar Ia funci6n de una prorefna daiiada por una mutad6n direcla en particular. de modo que Las demandas de una mutaci6n inversa son mucho mas especlticas que las de una muracion directa. En proporci6n, la rasa de rerromutacion es mcnor que Ia de mutaci6n directa, normalmente por un factor de -10 veces.

Las muraciones rambien puedcn ocurrir en otros genes para contrarrestar los efecros de una mmacion en el gen original. efecto que se conoce como su presi6n . Se llama supresor a! locus en que una murad6n suprime cl efecw de una mutaci6n en otro.

liD

Las mutaciones se concentran en pu ntos calientes

Concepto principal • La frecuencia de las mutaciones en cualquier par de bases en particular depende de una fluctuaci6n estadistica, excepto en los puntos calientes, en los cualcs la frecuencia se incrementa cuando menos en un orden de magnitud.

Ha!>la ahora se han descriro las mutaciont:s en lunci6n de los cambios individuates en la secuencia del DNA que influyen en Ia aetividad de la unidad genetica en !a cual ocurn.: u. Cuando se ar~alizan las muraciones desde Ia pero;pectiv.1 de la desactivacion del gen, la mayorla de los genes de una especie muestran rasas mas o menos similares de mutaci6n respeno de su rnmai'io, lo cual sugicre que el gen puede ser considerado como un objetivo de la muraci6n, y que un daiio en cualquiera de sus panes puede abolir su funci6n, por consiguiente, la susceptibilidad a Ia mutacion es aproximadameme proporcionaJ al tamai'io del gen. Pero considerando los sirios de mutaci6n de Ia sccuencia del DNA. (.lOdes los pares de bases de un gen c;on igualmeme suscepribles o algunos son mas propenc;oc; que otros a sufrir muraciones? (.Que sucede cuando se aisla un numero importante de muraciones ;ndc:ndiemes del mismo gen? Se obtienen numerosos muta11tes, cada uno de los cuales e~ resultado de un evcnto mutadonal individuaL Posteriormenre se determina el sitio de cada murad6n _ La rnayorfa de las mutadones ra dican1n en sirios diferemes, :>i bien algunas estaran en Ia misma posicion. Dos mu1aciones aisladas de manera indendieme en el mismo sitio pueden constituir exaetamenre eJ mismo cambia en el DNA (en cuyo caso el mismo evemo muracional ha sucedido en mas de una ocasi6n) . o pucclen constituir cambios diferentes (en cada par de bases son posiL>Ies rres muraciones pu n.tuales diferemes). En el hisrograma de la se rnuestra Ia frecuenda con la cual se encuentran muracione!> en cada par de bases del gen /acl de E. coli. La probabilidad estadfstica de que ocu rra mas de una muraci6n en un sitio particular se derermina por cinctica de impacros aleatorios (como se observa en 1. -4 Las mutaciones se concent,·an en puntos calientes

17

Cltosina

H

/Y )

-

50

_

.._......,.... . .L -________.

100 150 200 250 300 bp Distancia a lo largo del gen

Uracilo

fjf'

Ia distribuci6n de Poisson). Por lo ramo, algunos sirios adquiriran una, dos o Lres mutacion.es, mient.ras que on·os no obrendrau ninguna. Algunos sitios adquieren muchas mas muraciones de tas esperadas en una distribuci6n aleatorla; pucden presen tar 10 e incluso 100 veces mas muraciones que las predichas por los impactos aleatorios. Estos sitios se llaman puntos calie ntes. En los pumos calientes pueden ocunir murado nes espontaneas, y mutagenos diferentes pueden rener diferentes puntos caliemes.

Numerosos puntos calientes son resultado de bases modificadas Concepto principal • Una causa comlin de puntas calientes es la base modificada 5-metilcitosina, la cual sufre desaminaci6n espontanea y se convierte en timina.

Una causa imponanre de mutaci6n espontanea rc sulra de la p resencia de una base inusual en el DNA. Ademas de las cua tro bases que se insertan en este cuando es sintetizado, en ocasiones se pueden observar bases modificadas cu yo nombre refleja su origen; son producidas al modificarse quimi.camente W1a de las cuatro bases ya presemes en el DNA. La base modificada mas com(m es la 5-metilcirosina, generada por una enzima metilasa que agrega lll1 grupo mctilo a cienos residuos de citosina en sitios especillcos del DNA. Los sitios que contienen 5-metilcitosina proporcionan puntos ca lientespara que se desarrollenmutadones punruales espomaneas en E. coli. En cada caso, la mmaci6n adquiere Ia forma de una Lransici6n de G-C a A-T. Las cepas de E. coli incapaces de metilar la citosina carecen de pumos calientes. La raz6n de Ia existencia de los pumos calientes es que las bases de citosina sufren desaminaci6n 18


0

,...NyN,

•

Las mutaciones espontaneas ocurren a lo largo del gen loci de la bacteria E. coli. pero estan concentradas en un punto caliente.

~

II

H

0

La desaminaci6n de La citosina produce uracilo, y lade 5-metilcitosina, timina.

espomanea con frecuencia considerable. En esta reacci6n, el grupo amino es remplazado por un grupo ceto. Recuerdese que !a desaminaci6n de Ia dtosina genera uracilo (vease Figura 1.23). Enla se compara esta reacci6n con la desaminacion de 5-metilcirosina, en donde Ia desaminaci6n genera tim ina. El efecto en el DNA es la generaci6n de pares de bases G-Uy G-T, respectivamente, donde hay un apareamiento err6neo entre parejas. Todos Los organismos cuentan con sistemas de reparaci6n que corrigen pares de base apareados err6neamente eliminando y remplazando tma de las bases. La operaci6n de esws sistemas determina si los pares apareados err6neamente, como G-U y G-T, resultan en mutadones. En la se muesrra que las consecuencias de Ia desaminacion son diferentes para Ia 5-metildlOsina y para ta citosina. La desaminaci6n (poco frecuente) de la 5-metilcirosina provoca una mutaci6n, en tanto que Ia desaminadon de Ia drosina mas comun no tiene este efecto porque los sistemas de reparaci6n son mucho mas etectivos para reconocer G-U que G-T. La B. coli cont.iene una enzima, t,HacUo-DNAglucosidasa, que elimina los residues de uracilo del DNA (vease Ia secci6n 20.5, La inversion de bases es utilizada por las metilasas y las glucosilasas). Esta acci6n deja sln aparear LU1 residue de G, y posteriormente "un sistema de reparaci6n" inserta una base C para aparearlo. El resultado final de estas reacciones es La restauraci6n de Ia secuencia original del DNA. Este sistema protege al DNA de las consecuencias de la desaminaci6n espomanea de la citosina (pero no es lo suficientememe activo como para prevenir los efectos del alto nivel de desami.naci6n provocado por el acido nitroso; vease la Figura 1.23). N6rese que Ia desaminad6n de la 5-merilcitosina produce ti.mina, lo cual da Iugar a un par de bases a.pareadas err6ncameote, G-T. Si d apareamiento

cMe

c

'-.Q\.0\..VNO\N G

G

Desam1naci6n ox1dativa La T remplaza a Ia Me· C I El U rempla ;~:a a Ia C

t

T

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VI'\O\JO\O\N G

!

T

G

Ellminaci6n del uracilo

~u G G

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T

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citosina

C

"V~ G G Duplicaci6n

c

~

c

~ G G T

y

C

VJ\.0\.DtW\N

A Ia T se aparea con Ia A

Mutacl6n

G

I

Sin mutaciCin

La desaminaci6n de la 5-medl<.itosina produce timina (por Lransiciones de C-G a --A), en Lanlo que la desaminaci6n de La citosina produce uracilo (que suele ser eliminado y posteriormente remplazado por citosina). err6neo nose corrige ames del sjguien te ciclo de duplicaci6n. resuha una mutaci6n. En Ia siguiente duplicaci6n, las bases del apareamicnto err6neo enrre G y T se separan y posteriormen te se aparean con nuevas parejas para produtir un pc1r G-C de tipo silvesrre y ttn par A-T mutanle. La desaminnci6n de la 5-merilcito!;ina es Ia cau sa mas com t'm de Ia producci6n de pares err6neos de G-T en el DNA. Los sistemas de reparaci6n que actlian en dichos pares tienden a rcmplazar T por C (en vez de In alternativa de remplaza.r G par A). lo cual ayuda a reducir Ia tasa de mutad6n (vease la seccion 20. 7, Control de Ia direcd6n de Ia reparacion del apareamiento erroneo). No obstante, estos sistemas no son tan e(ecrivos como Ja remod6n de U de los pares err6neos G-U, de modo que Ia desarn.inaci6n de la 5-metildtosina provoca mutadones con mucha mayor frccuencia que Ia desaminad6n de Ia citosina. La 5-mcrilcitosina tambien nea puntas calienrcs en el Di A de eucariotas. fen6meno comun en dinucle6tidos G concentrados en regiones denominadas islas G (vease Ia secd6n 24.19. Los islotes G son dianas rcguladoras). Si bien Ia 5 metilcirosJna represema -1 "Ia de las bases del DNA huma no. los sitios qur.: conuenen Ia base moctifica-

da representan - 30% de las mutaciones puntuales; esto hare del esrado de la 5-metildrosina un factor dererminante de mutaci6n muy imponanre en la5 celulas animates. Los efectos de Ia eliminaci6n de la enzima del raton MBD4, glucosilasa susceptLble de eliminar T (o U ) de pare~ c1 r6neo~ con G. subrayan .a importanda de los sistemas de reparaci6n para reducir la tasa Je mmaciones: el resulrado es una tasa de mutaci6n tres ve ce~ rna yor en lo~ siuos G. (La raz6n de qHe el erecto no sea mayor es que Ia MBD4 constimye solo uno de los numerosos sisremas que incidcn en lm pares crr6neos G-T; es de irnaginar que Ia eliminaci6n de todos los sistemas incrementara m~cbo m~s l.:~ tasa de mlllad6n.) La opcraci6n de cs1os sislemas proyecra una luz interesame en el uso de !aT en el DNA respecro de !aU end RKA que quiza se rdilcione con la neces idad de cstabilirlarl de- Ia :.crut.:ncia del DNA; d uso de T significa que cualquier desaminaci6n de C se detecta de inmedimo debido a que genera una base (U) que suelc estar auseme del DNA, lo cuaJ incrementa en gran meciida Ia eficiencia con que pueden fw1cionar los sistemas de reparaci6n (comparados con Ia situaci6n en q ue tienen que derectar apareamiemos err6neos G-T, los cuale:. tambien pueden ser produddos por situaciones en que Ia eliminaci6n de: la T no serfa Ia respue~1a apropiada). Asimismo, el enlace fosfodiester del esqueleto es mas labil cuando Ia ba~e es U.

1m Algunos agentes hereditarios so n ext remadamente pequeiios Concepto principal

• Algunos agentes hereditarlos muy pequeiios no codifican protelnas, pero constan de RNA o de proteinas que tienen propiedades hereditarias. Los v iroides son agentes infecciosos que producen enfermeclades en plantas superiores; son molecu Jas circulares de RNA muy pequeiias. A diferenda de los virus. en los cuales el agente infecdoso es un v iri6n, genoma encapsulado en una cubiena de protefna, el RNA 111roule es el age1zte infeccioso. El viroide esta lormado unicameme por RNA, cuyas bases estan extensamcnte apareadas pero de forma imperfecra. de modo que forman una barra caracterfstica, como Ia ilustrada en Ia . Las mutacione'> que imerfieren con la esrructura de esra bana reducen su capacidad infecciosa. Un RNA viroide consiste en una especic molecular individual que se replica de ±orma aut6noma en celulas infecradas y cuya secuencia se perperua

1.16 Algunos agentes hereditarios son extremadamente pequenos

19

El RNA del PSTV es una molecula circular que forma una estructura extensa de doble cadena interrum pida por numerosos lazos inteliores. La forma leve difiere de la grave en tres sitios.

fielmeme en sus descendiemes. Los viroides pueden clasificarse en numerosos grupos. Un viroide dado se identiflca con un grupo porIa similiwd de su secuencia con Ia de otros del grupo. Por ejemplo, cuairo viroides Telacionados con el del ruberculo ahusado de la papa (PSTV, potato spindle tuber viroid), muestran similil udes de secuencia del 70 a! 83 par ciento. Los diierentes aislamiemos de una cepa de un viroitlc en particu lar pueden vadar emre ellos, y el cambia puede afectar al fenotipo de c~lulas infectadas. Par ejemplo, las cepas Teves y severas de PSTV difieren por u·es susrituciones de nucle6tidos. Los viroides se asemejan a los virus en que sus genomas de acido nucleico son heredables porque cumplen con todos los requisites de la informacion genetica. aunque los vhoides, llan1ados en ocasiones pat6genos subviricos, difieren de los virus en estructura y fund6n. El RNA viroide no parece ser traducido a protefnas, por lo tanto no puede codificar por sl mismo las funciones necesarias para su supervivencia, fen6meno que genera dos inrerrogantes: l Como se replica el RNA viroide? (.Como afecta a l fenoripo de la celula de la planta infecrada? La d uplicaci6n debe ser realizada por enzimas de Ia celula hospedadora, subvertidas de su funci6n norn1al. La heredabilidad de Ia secuencia del viroide indica que el RNA vi.roide proporciona el molde. Presumiblemente, los viroides son patogenicos porque interfieren con los procesos celulares normales, quiza de forma relativameme alea taria, por ejemplo, secuestrando una enzima esencial para su propia dLtplicad6n o interfiriendo con la produccion de rnoh~culas uecesarias de RNA celu lar, o bien, pueden componarse como moleculas reguladoras anormales con efectos panicu lares en la expresi6n de genes individuates. Un agente aun menos comun es la encefalopatia espongiforme de ovejas y cabras (sera20

CAPITULO 1 Los gene-s son DNA

pie}, enfermedad neurol6gica degenerativa de ovejas y cabras que se reladona con kuru y sfndrome de Cl·eutzfeldt-Jakob, enfermedades bumanas que afectan Ia funci6n cerebral. El agente infeccioso del scrapie no contiene dcido nucleico. Este ageme extraordinario llamado pri6n (agente infecdoso proteinaceo) es una glicoprotefna hidr6(oba de 28 kD, o PrP, codifi cada por un gen celular (conservado entre los mamiferos) que se expresa en el cerebra normal. La proteina existe en dos formas, e l producto que se encuentra en el cerebro normal conoddo como PrJX, que es completamente degradado por proteasas. La proteina encontrada en los cerebros infectados se conoce como PrPsc: yes extremadamente resistente ala degradaci6n por proteasas. La PrP' se convierte en PrP" por una modificaci6n o cambio con-[ormational que confiere resistencia a las proteasas y que a tin no ha sido descrita por completo. Como ageute infeccioso del scrapie, el PrPsc debe modificar de alguna man era Ia sfntesis de su contraparle celular nonnal, de tal foTma que, de ser inocuo se tome en infeccioso (vease la secci6n 3 1.12, Los priones provocan enfennedades en los mamlferos) . Los ratones que carecen del gen PrP no pueden ser in (ectados para que en ellos se desarrolle scrapie, lo cual demuestra que el PrP es esencial para el desarrollo de la enfermedad.

111

Resumen

Mediante dos experimemos clasicos se demostr6 que el DNA es el material genetico. El DNA aislado de una cepa de la bacteria Pneumococcus puede con [erir propiedades de dicha cepa a otra. Ademas, el DNA es el unico compon ente heredado por la progenie de los fagos progenitores . El DNA puede u tilizarse para transierir nuevas propiedades a ceLulas euca ri otas.

El DNA es una helice duplex formada por cade -

.as amiparaldas en las cualPs los nucle6Lidos estan ..nidos por enlaces fosfodiesrer S'a ·3'. El esquelero .. nna Ja parte exterior; las bases de purina y de piri·:udina estan apiladas en el interior fom1ando pares. ~n los cualcs Ia A c:. compkmemaria de laT. y la G, - ~ Ia C. Las cadcnas se separan y recurren al apa · earnicmo complcrneutario de bases para ensamblar .~Jenas ltijas siguiendo un patron de duplicaci6n cmicomervadora. El apareamienro complemcma.• • de bases tambien se utiliza para transcribir un ?,SA que rrescnta una sola cadena de un DNA "'plex. Uo fragmenro de DNA puede codificar a una :orefna. El c6uigo genelico describe Ia relaci6n en -e Ia secuencia de l DNA y 1.:1 secuencia de Ia protei-...3. Solo una de las dos caclenas del DNA cocliGca a " a protdna. Un codon esLa formado por rres nu~.e6 tidos que representan lm so lo amino
cos formados (micamenre por moleculas circulares pequenas rle RKA. sin cubiena protecrora. El RNA no coclifica prorefnas; se desconoce su forma de perpetuaci6n y de paragenesis. El scrapie es un agenre prmeinico il1.feccioso.

Referencias

1D

rntroduccion

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IIJ

Et DNA es una helice duplex

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las mutaciones cambian La secuencia del DNA

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IIIJ

l as mutaciones pueden afectar a pares de bases individuates o a secuencias mas largas

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22


Numerosos puntos calientes son resuttado de bases modificadas

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1111

Algunos agentes hereditarios son extremadamente pequenos

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Los genes codifican proteinas

-~

ESQUEMA DEL CAPITULO • La recombinaci6n se debe a un rompimiento y una reu nion que tienen Iuga r a traves de un intermediario de DNA hibrido.

Introducci6n Un gen codifi ca a un solo polipeptido

El c6digo genetico se lee en tripletes

• La hip6tesis de un gen : una cntima resume las bases de ta genetica moderna: que un gen es un frag mento de DNA que codifica a una sola cadena poli peptidica. • La mayo ria de las mutar.iones deterioran Ia funci6n del gen en el cual se producen.

• El c6digo genetico se lee en tripletes de nucle6tidos denominados codones. Los lripletes no estan superpuestos y se teen a partir de un ;~unto fljo de inicio. • Las mulaciones que insertan o eliminan bases individuates provocan un cambia en los grupos de tripletes despues del sitio de la mutaci6n. • Las combinaciones de mutaciones que insertan o eliminan tres bases (o muttiplos de tres). insertan 0 eliminan aminoacidos. pero no cambian Ia lectura de los tripletes mas alL\ del ultimo sitio de mutaci6n.

Las mutaciones que se presentan en el mismo gen no se pueden complementar Una mutaci6n en un gen afecta s6lo a la proteina codificada por Ia copia mutante deLgen y no a las prote!nas codificadas por algun otro alelo. • La incapacidad de dos mutaciones para complementarse (producir un fenotipo silvestre cuando se presentan en configuraci6n trans en un heterocigoto) significa que forman parte del mismo gen.

.U Las mutaciones pueden provocar perdida o ganancia de funci6n • las mulaciones recesivas son provocadas por perdida de fund6n del producto proteinico. • Las mulaciones dominantes son resultado de una ganancia de funci6n. • La cvaluad6n de la esencialidad de un gen requiere de una mutad6n nula (que elimine por wmpleto su funci6n). • Las mutaciones silenciosas no tienen ningun efecto porque el cambia de base no allera la secuencia ni la cantidad di
Un locus puede tener numerosos alelos mutantes diferentes • La existencia de varios alelos permite ocorrencia de heterocigotos con cualquier combination en pares de alelos.

_..

Un locus puede tener mas de un alelo de tipo silvestre • Un locus puede tener una distribuci6n polim6rfica de alelos sin un alelo individual que pueda ser considerado como el unico de lipo silvestre.

U. La recombinaci6n ocurre por el intercambio ftsico de DNA • La recombination es resultado del entrecruzamiento que ocurre en los quiasmas e involucra a dos de las cuatro cromalidas.

Cada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles •

HI!J

u~ualmente solo un marco de lectura es traducido y los otros oos son btoqueatlos por senates frecuentes de termination .

Los genes procari6ticos son colineales con sus prote1nas • Un gen procari6tico es un fragmenlo constante de 3N nucle6tido5 que codilica a N aminoacidos. • El gen. el RNAm y La proteina son lodos colineales.

Iiiii Numerosos procesos son necesarios para expresar el producto proteinico de un gen • Un gen prc>cari6tico se expresa por lranscripci6n en RNArn y posterior111ente por Lraducci6n del RNAm en una proteina. • En las eucariolas, un ge11 puede contener regiones internas no representada~ en Ia proteina. • Las regiones internas son eliminadas del transcrito de RNA par el corte y empalme de este para dar origen a un RNAm colineal respecto del producto protelnico. • Cada RNAm esta rormado por una region lfder 5' no traducida, una regi6n codificadora y una region posterior 3' no traducida.

gg Las proteinas actuan en trans, pero los sitios del DNA, en cis • Todos los produc.os de los genes (RNA o proteinas) actiian en trans; pueden actua• en cualquier copia de un gen en la celula. • Las mulaciones de actJaci6n en ds iden:ifican a las secuendas de DNA que son el objetivo de reconocimiento de los procluclos de actuaci6n en trans. No se expresan como RNA ni como protelnas, y afectan solo al fragmento contiguo de DNA.

DO Resumen 23

Ill

Introducci6n

El gen es la unidad funcional de Ia herencia que constiluye una secuencia del genoma cuya funct6n es dar origen a un producro discreto (ya sea una prorefna o un RNA): su comportamier:no bas ico fue definido pur Mendel hace mas de un siglo. Resu rnido en sus dos !eyes, el gen fue reconocido como un "factor de particulas" que se transmi1e sin cambios del progenitOr a su progenie. Un gen puede exislir en formas altemas que se conocen como alel.os. En los organismos diploides, los cuales tienen dos conjumos de cromosomas, ·una copia de cada uno de eUos se hereda de cada progenitor, mismo comportarniento exhibido par los genes. Una de las dos copias de cada gen es el alelo patemo (beredado del padre), el orro es el materno (heredado de lamadrq . La equ.ivalencia condujo al descubrlmiemo de que, de hecho, los nomosomas porran a los genes. Gada cromosoma consistc en una esrructura lineal de genes. Cada gen reside en una localizaci6 t1 particular del cromosoma. La localizaci6n se conoce de manera mas fonnal como locus. Los aleJos de un

Un cromosoma es una mohkula de DNA muy larga

El cromosoma contlene numerosos genes

gen son las diferentes forrnas que se encuentran <.:n su locus. La clave para comprencle r Ia organizad6n de los genes en los cromosomas fue el descubrimiento del ligamiemo gcoetico, o tendencia de los genes de un mismo cromosoma a mantenerse juntos en Ia progenie, en Iugar de ordeuarse de manera independlente, como pronostican las leyes de Mendel. Una vez que se introdujo la untdad de recombinaci6n (reordenamientu) como medida de vinculacion, fue posible consrruir mapas genelicos. La resoluci6n del mapa de recombinaci6n de una eucariota superior esta restringjda por lo reducido de la progenie que puede obtenerse de cada cruza. La recombinaci6n es tan poco frecuente eone puntas cercanos, que se observa rara vez entre muraciones dileremes del mismo gen. Por ello, en los mapas de Ugamiento dasico de las eucariotas se puede colocar a los genes en orden, pero no es posible determinar las reladones en un gen. Al cambiar a un sistema microbiano en el cual se puede obtener una progenie muy numerosa de cada cruza genetica, los investigadores pudieron demostrax que la recombinad6n ocurre dentro de los genes y que sigue las mismas regla.s que se dedujeron previame11te para La recombinaci6n entl'e genes. En un gen, las m uLaciones pueden estar organizadas de forma lineal, con lo cual se demuestra que el gen mismo posec la mi.sma construcci6n li11eal que el ordenamiemo de genes en un cromosoma., de modo que el mapa genetico es lineal en los loci yenn·e esws: esta rormado por una secuencia continua demro de la cual residen los genes. Esta condusi6n condujo naturalmenre a Ia perspectiva moderna que se resume en la . en la. cual se considera que el material genetico de un cromosoma est<3 formado par una mol<~cula ininterrumpida de DNA que representa a numerosos genes.

~~

Ill Cada gen es parte de una secuencla continua de DNA

t Vll

lnicio del gen

Conceptos principales • La hip6tesis de un gen : una enzima resume las bases de La genetica moderna: que un gen es un fragmento de DNA que codifica a una sola cadena polipeptidica.

Final del gen

CATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTOACAATGC GTATATTCCAGrCCATCCTAGTCAAOOAGGAGTG ACG Cada cromosoma tiene una sola molecula larga de DNA dentro de la cual se encuentran las secuencias de genes individuates.

24

Un gen codifica a un solo polipeptido

CAPiTULO 2 Los genes codifica n prote1nas

• La mayoria de las mutaciones deterioran la funci6n del gen en el cual se producen.

Mediante el primer imento sistematico de relacionar a los gen.es con las enzimas se demostr6 que cada e tapa de Ia ruta metab61ica es catalizada por una sola enzima y que puede ser bloqueada par mutadones e n t ill gen diferente. Esto condujo a la hip6tesis de ltn gen:

11na enzima. Cada paso melab61ko cs caLalizado por tma enzima C)pccffic.:J cuya producd6n es responsabilidad de un solo gen. Una mutad6n en el gen altera Ia actividad de Ia protel11a de Ia cual es responsable. Para incluir a las proteinas formadas por mas de una subunidad. es necesario modificar Ia hip6tesis. Si las subunidades son todas iguales. Ia protefna es un homomuJtime ro. y eS1a represenrada por un solo gen. Silas subunidades son di£eremes, Ia protefna es un hete romuJtime ro. Expresada como una regla mas general aplicable a cualquier protefna hornomultimerica, Ia hip6tesis de un gen : una enzima se manifiesta con mayor prectsi6n como un gen : una cadena polipeptfdica. Identificar que protclna representa a un ge>n l'n pa nku lar [JUede ser tardudo jLa mutaci6n que dio Iugar a los chfcharos rugosos mmantes de Mendel no se idenrifl c6 sino hasta 1990, como una aJteraci6n que inactiva al gen que codifica a una enzima ramificadora del almid6n! Es imponantr recorclar que u n gen no produce directamente una prorelna. Como se mostr6 previamente en la Figura 1.2, un gen codifica a un RN/\, que a su ve7 put<.k codi5car a una prottfna. Lamayor pane de los genes codifica a las proteinas. pero algunos codifican molcrulas de RNA que 110 producen prordnas. Oicbas rnoleculas de R A pueden ser componentes estructurales del aparato responsable deJa si!ltcsis de protelna!>, o bien, regular Ia expresi6n genetica. m principia basico consiste en que el gen es una secuencia de D 'A que especifica la secuencia de un producro independiente. El proceso

Homoclgoto de tipo sllvestre

Heterocigoto de tlpo silvestre/mutante

Homocigoto mutante

Ambos alelos producen proteinas activas

Un alelo (dominante) produce una proteina activa

Ninguno de los alelos produce proteinas

~~

t

tipo silvestre

t1po Silvestre

~

t

tipo Silvestre

mutante

mutante

mutante

Fenotipo silvestre

Fenotipo mutante

1 ~~ Fenotipo Stlvestre

Los genes codifican protefnas; la dominanc.ia se explica por las propiedades de las protein as mutantes. Un alelo recesivo no contribuye al fen olipo debido a que no produce ninguna protelna (o produce una protelna que no es funcional).

tle la expresi6n de los genes puede terminar en un producto que sera RNA o protelna . Una mutaci6n cs un evento aleatoric respecro de la esrrucrura del gen en el cual es muy probable que se dane, o incluso quest> suprirna, la funci6n del gen. Casi LOdas las muraciones que afecran el fundonamiemo de un gen son recesivas: representan ause11Cla

de fimri6n, pues a/gC/1 millant£' I.e le Ita impedido produdr s11 protefna usual. En Ia se ilustra la relad6n entre alelos de tipo recec;ivo y alelos de lipo silvestre. Cuando un hererocigoto comiene un aJelo de tipo silvestre y un alelo de tipo mutame, este ultimo e~ susceptible de rq~ir Ia producci6n de la enzima. y por lo tanto, es dorninante. (ESIO implica que el unico alelo de tipo Silvestre produn~ una cantidad adecuada de protefna. Cuando esw es falso, la menor cantidad producida por tln alcJo, comparada con la de dos alelos, resulta en el fenOLipo intcrmedio de un alelo parcia lmente dornln.ante en un heterocigoto .)

Dl

Las mutaciones que se presentan en el mismo gen no se pueden complementar

Conceptos principales • Una mutacion en un gen afecta s61o a Ia protelna codificada por la copia mutante del gen y no a las proteinas codificadas por algun otro alelo. • La incapacidad de dos mutaciones para complementarse (produc.ir un fenotipo silvestre cuando se presentan en configurac.i6n trans en un heterocigoto) significa que forman parte del mismo gen .

<.C6mo determinamos si dos mutadones QLie prvvo· can un fenotipo similar se encuentran en el mismo gen? Si en c l mapil estiln muy cerca. pueden ser ale los. Pero unnbien podrfan represcmar mutaciones de dos genes dJferentes cuyas protdnas esran implicadas en la mismil funci6n. La prue ba de complementaci6n pcrmite determinar si dos mutaciones yacen en cl rnisrnu gen v en genes diferemes. La prueba consisre en h.1cer un heterocigoto para las dos mutaciones (aparrando a progenirores homodg6ticos para cada mutaci6n). Si las mutaciones se encuentran en el mismo gen. los genotipos progcnitores pueden represenLarse como: ml m2 - Ym l m2

El primer progenitor proporciona un alelo mu Lantc 111 1 y cl segundo. un alelo m 2, por lo tanto. el hererocigotO rendra la constitllci6n:

~ JJlJ

2.3 Las mutaciones que se presentan en cl mismo gen no se pueden complementar

25

Nose observa ningun geu de tipo silvesu-e, por lo tanto. el heterodgoto tiene un fenolipo mutame. Si Ia mutaci6n yace en gt>nes diterentes, los genoripos progenitores pueden rrcsemarse como: ml+ +m1 m I + Y +m 2 Cada cromosoma Liene w1a copia tipo silvestre de ul\ geu (representada por el signa mas) y una copia mutanre del otro. de modo que Ia constituci6n del heterocigoto sera: m l+ +m2

en Ia cual los dos progcnitores han proporcionado una copia de tipo silvestre de cada gen . E) beterocigoto riene e! fenotipo silvesrre, cle modo que se dice que los dos genes se complementan. La prueba de Ia complememaci6n se describe mas ampliameme en Ia . La basica consisre en Ia comparaci6n que se muesrra en la parte superior de Ia figura. Si dos mutaciones se encuentran en el mismo gen. se observa una diferencia en los fenotipos de Ia configuraci6n trans y de Ia configw·aci6n.cis. La configuraci6n h·ans es murante. pues cada alelo tiene una mmaci611 (diferente). Sin embargo. la configurad6n cis es de tipo silvestre. debido a que un alelo tiene dos mutaciones y el ou·o, ninguna. En Ia parte inferior de Ia figura se muestra que silas dos muL.lciones se encuemran en genes dife1·emes.

MUTACIONES EN EL MISMO GEN

configuracf6n trans

~

mutante 1

tJ ,f ,f f f l

j ,j j 4

Sin comptementacl6n Fenotipo mutante

mutante 2

configuraei6n cis

~

t .t •I•/ J ,; ,; f ,f l 1

mutanle 1

~ t

Comptementaci6n (fenotiposilvestre) Una copia de cad a gen es de tipo sihtestre tlpo silvestre

V\/vV .f •I •I V

l

Un gen es de tipo si!vest~e Fenottpo Silvestre

lipositvestre

(contiguraci6n trans)

~ t

tiposilveslre

~

l

V V V V

~ ~ mutante2

CAPITULO 2 los genes codifican proteinas

Conceptos principales • Las mutaciones recesivas son provocadas por perdida de funci6n del producto proteinico. Las mutaciones dominantes son resultado de una ganancia de funci6n. • La evaluaci6n de la esencialidad de un gen requiere de una mutaci6n nula (que elimine par completo su funci6n). • Las mutaciones silenciosas no tienen ningun efecto porque el cambio de base no altera Ia secuencia ni la cantidad de proteina, o porque el cambia de la secuencia de Ia proteina no tiene ningun efecto. • Las mutaciones rezumantes (o hipomorfas) afectan a La fu nci6n del producto del gen, pero no se observan en el fenotipo porque queda actividad sunciente.

mutantedobte

El cistr6n se define mediante la prueba de complementaci6n. Los genes estan representados por espirales; los asteriscos rojos identifican a los sitios de mutaci6n. 26

Las mutaciones pueden provocar perdida o ganancia de funci6n

Los diversos efectos posibles de las mutaciones

~ ~

MUTACIONES EN GENES DtFERENTES

siemprc se observara un fenotipo silvestre. Siempre hay un alelo de tipo silves1re y un alelo mutame de cada gen. y la configuracion no Liene fmportanda. La incapaddad para complementar significa que dos mutaciones son parte de Ia misma unidad genetica . Se dice que las mutadones que oo se complernenLan forman parLe del mismo grupo de complementaci6n. Otro rerrnino ULilizado para desajbir a la un.idad definida por la prueba de complementaci6n es cistr6n. que significa lo m ismo que gen. Rasicamente esros tres l<5nninos desctiben a un fragmemo de DNA que funcioua como una unidad que danUugar a un RNA o un producto protdnico. Las propiedades del gen respeao de la complernemacion se explican por el hecho de que este produao es una molecula unica que se comporta como una unidad fuucional.

en un gen sc resumen en Ia Cuando un gen ha sido identificado, en principia se puede llegar a conocer su funcion productendo un organismo mutante que carezca compleramente deJ gen. Una mutaci6n que elimina por complete Ia funci6n Je un gen, -norma 1mente porque el gen ha sido eliminatlo, se llama mutaci6n nula, y si e l geo cs esencial. Ia mutaci6n n ula es leLa!. Para deterrn.inar el efect.o ctel gen en el fenotipo. es iundamental caracterizar a unmutante nulo. Cuando unn mutaci6n no afecta al fenotipo. siempre cabe la posibilidad de que se trale de una muta<.:ion rez umante, es decir, se produce una cantidad suficiente de producto activo para que cumpla con su funci6n, aunque la aclividad se reduce cuantitatlvamente o es cualitativamenle di[erente del tipo silvestre. Sin embargo, si una mutaci6n nula no atecta al fenotipo, se puede concluir con toda segul·idad que La fundon del gen no es necesaria.

El gen de tipo sllvestre codlflca a una proteina

VJ\DVM/

~

~

Una mulacl6n silenciosa no afecta a Ia protefna

VJ\0'\0\U

l

~

Una mutacl6n nula no produce prote(nas

'\.~/

..J..

Una mutaci6n punlual puede dailar Ia lunci6n

VM.AO\U

~

~

Una mutaci6n puntual puede crear una nueva funci6n

\IJ\.Y.J\DW

~

~

las mutaciones que no afectan a La secuencia o a La funci6n de la proteina son siLenciosas, en tanto que las mutadones que eLiminan toda La actividad de la proteina son nulas. Las mulaciones puntuales que provocan perdida de la funci6n son recesivas, a diferencia de las que provocan gananda de La func.i6n, que son dominantes.

las mutadones nulas, u otras mutaciones que impiden Ia ft~nci6n del gen (pero que no necesariamente Ia eliminan por completo) se denominan mutaciones d e p e rdida de f unci6n (O amorfas). Una muraci6n de perdida de funci6n es recesiva (como en e l ejemplo de Ia Figura 2.2). En ocasiones, una mutaci6n tiene el efecto opuesto y provoca que una prorefna adquiera una nueva funci6n; dicho cambio cs conocido como mutaci6n de ganancia de fu n ci6n , Ia cual es dominame. No todas las m u tacione~ del DNA provocan camhios de1ecrables en el fenolipo; aquellas sin un efecto aparen tc se conoceu como mutaciones silenciosas, las cualcs pueden ser de dos tipos; tmo de ellos implica cambios de bases en el DNA que no provocan njngun cambio en el aminoacido de la protefna correspondicntc. en ramo que el segundo. cambia aJ aminoaddo, pero el remplazo en Ia proreina no afccta a ~u actividad; a estas sustitudones se les llama n cutra les.

Un locus puede tener numerosos alelos mutantes diferentes Concepto principal

• La existencia de alelos mUltiples permite que los heterocigotos representen cualquier combinad6n en pares de alelos.

Si sc produce una mutaci6n recesiva por cada cambio que irnpide la producd6n de una protefna activa en u n gen, debe haber gran numero de dichas mutaciones en cualquier gen. Numerosos remplazos de antinoaddos pueden cambiar Ia estrucrura de Ia proteina lo suficiente como para impedir su funcion. Las diferentcs varianres del mismo gen se llaman a lelos multipl es. y su cxistencia permite Ia a·eacion de un heterocigoro entre alelos mmantes. La relaci6n entre estos alclo~ multiples asume diversas formas. En el caso mas sencillo. un gen de lipo sUvesrre codifica ,1 un producm protefnico funcional. El alelo murame, o los aJelos mutames. coclifica(n) proreinas que no son funcionales. Sin embargo. con (recuenda se prescman casos en que una serie de alelos muranres tiene fenmipos cUieremes. Por ejemplo. Ia funci6n de ripo silvesne del locus blanco de Ia Drosophila mrlnnogaster es necesaria para cl desarrollo del color rojo normal de los ojos. El locus recibc su nomlm: segtm eJ efecto de mutadones (nulas) extremas, las cuales provocan que Ia mosca tenga ojo~ blancos en homocigotos mutantes. Para describir a los alelos mutantes y a los de tipo silvest rr, cl genotipo silvesue se indica mediante un superindice "masH (+) dcspues del nombre dellocus (11,. es el alelo silvestre para los ojos [rojos] de Ia D. mela11ognster). En algunos casas se utiliza el sfmbolo - para describir el alelo de tipo silvesue, y solo los alelos mutante!> se indican con el nombre del locus. Una forma completamente defeetuosa del gen (o ausenda de fcnotipo) ~uele indicarse mewanre un superinclice Hmenos" (-). Para poder distinguir emre una variedad de alelos murames con efectos diferemes, pueden urilizarse otros supcrfnclices. como w' o w•. El alelo w• es dominanre respecro de cualquiera otTo en los hetcroc.igows. Hay muchos alelos mmantcs diferemes; una mues1ra (pequena) se ilustra en Ia . Si bien algunos alelos carecen de color de ojos. m.uch os otros prodncen alg(m colo r. de modo que cada uno de estos alelos mucantes representan1 tma mutaci6n diferenre del gen, Ia cual no elimina por complero su fttnci6n, sino que deja una actividad residual que produce un fenotipo caracrer1stico. En un horoodgoto. esws alelos son denorninados por el color de lm ojos. (La mayorfa de los alelos w afecran Ia camidad de pigmento del ojo. Lo!> ejemplos de Ia figura estan organizados [mas o menos] en orden descendcme de amridad de color. pero orros. como el ww, afectan el patron en el cual es depositado.) Cuando cxisten muchos alelos. uo animal puede ser un heterocigoto que porte dos alelos mutantes diferentes, y su tenoripo dependera de la naruraleza de Ia acrividad resiJual de cada alelo. En principia. Ia relaci6n entre dos alelos rn u tantes no difiere de la que se observa entre los alelos mutantes y los de 2.5 Un locus puede tener numerosos alelos mutant es diferentes

27

l!El·Alelo

Fenotipo del hornocigoto ojos rojos (fenotipo silvestre) sangre cereza garnuza mlel albaricoque eosina marfil cascara de limon (amarillo lirn6n) moteado, el color varfa blanco (sin color)

~·

GaiNAccx1

............... .....

... ... ... .

2

FucaT

genA

Deleci6n 4 carnbios de aminoacidos

2

i antigeno 0

Fuco:1

gen B

VNLNJ\1// transferasa B

Gala.I

:

Un locus puede tener mas de un alelo de tipo silvestre

Concepto principal • Un locus puede tener una distribuci6n polim6rfica de alelos sin un alelo individual que pueda ser considerado como el unico de ti po silvestre.

~

• • • • .. • • • • • .. • • ~ antrgeno B ~ai~ 1 -R

tipo silvestre : un alelo puede ser dominanle, puede haber dominancia parcial, o codominancia.

Ill

t

transferasa A

VJVI\.VN/

Gal~ t -R

. Ellocus w tiene una serie extensa de alelos cuyos fenotipos van del color de tipo silvestre ( rojo) a la ausencia total de pigmento.

J. aai~ 1 -R

antfgenoA

i

Fuccx1 Fenollpo

Genotipo

Actjvidad

0

00

A B

AOoAA BOo BB

AB

AB

Ninguna N-Ac-gal transfarasa Gal transferasa GaiN-Ac-Gal-transferasa

Ellocus del grupo sanguineo ABO codi fica a la galactosiltransferasa cuya especificidad determina el grupo sanguineo.

transferasa correspondientc crea el antigeno A o el No netesariameme hay un solo tipo de alelo silves-

tre en un locus espedfico. por ejemplo, el control del sistema del grupo sangufneo. La falra de funcion es representada por el tipo nulo, o grupo 0. No obstante, los alelos fundonales A y B proporcionan actividades codominantes emre sf y dorni.names respecto del grupo 0. Las bases de esta relaci6n se ilustran en la El antfgeno 0 (o H) se genera en todos los inclividuos, y consiste de uo grupo carbohidrato particular que se agrega a las protefnas. Ellocus ABO codifica a una enzima galactosil-transferasa que agrega otTO grupo de azlitar al ant.fgeno 0. La especificidad de esta enzima determina el grupo sangillneo. El alelo A da Iugar a una enzima que utiliza el cofactor UDP- Nacetilgalactosa y crea el amfgeno A. El alelo B produce una enzima que miliza el cofacror UDP-galactosa y crea el antfgeno B. Las versiones A y B de la protefna transferasa difieren en cuarro aminoacidos que presumiblememe afectan su reconocimiento del tipo de cofactor. El alelo 0 riene una mutaci6n (delecion pequena} que elimina Ia actividad. de modo que en el antfgeno 0 no hay modificaciones. Esto explica porque los alelos A y B son dominanres en los helerocigotos AO y BO: la acrividad 28

CAPITULO 2 Los genes codifican prote1nas

B. Los alelos A y B son codominames en los heterocigoros AB debido a que am bas actividades transferasa estan expresadas. El homocigoro 00 es nulo y no tlenc ninguna actividad, por lo tanto, ca1·ece de ambos antigeuos. Ni A ni B pueden ser considerados unicameme como de tipo silvestre porque representan actividades alternativas, mas que perdida 0 ganancia de funci6n. Una situaci6n como esta, en Ia que hay tnultiples alelos fundonales en una poblaci6n, se describe como polimorfi.smo (vease la secci6n 4.3, Los genomas individuates muesrran una variaci6n extensa).

Ill

La recombinaci6n ocurre por intercambio ftsico de DNA

Conceptos plincipales • La recombinaci6n es resultado del entrecruzamiento en los quiasmas e involucra a dos de las cuatro cromatidas. • La recombinaci6n ocurre por rompimiento y reunion, que tienen Lugar a traves de un intermediario de DNA hlbrido.

_., bivalente c:cntiene 4 cromatidas. 2 de cada progenitor

~quiasma

as provocado por :1trecruzamiento entre dos :~e las cromat1das

a a

A

B

A~ t=

a a

b

~B

b

Recomb1naci6n lntermedia

:Jos cromosomas s1guen siendo :lS progenitores (AB y ab ). _os cromosomas recomblnantes ~~~~~g ::ontienen material de cada orogenitor y tlenen nuevas aa ~~=g combinaciones geneticas (Ab y aB) .

La formaci6n del quiasrna es responsable de Ia :·oducci6n de recombinantes.

La recombinaci6n gcncLica describe ]a generad6n J e comblnactones nuevas de alelos en cada gene:acion de organismos diploides. Las dos copias de cada cromosoma pueden LC'IJcr diferemes alelos en algunos loci. lntercambiando las partes couesponjjentes en1 re los aomosomas, se pueden generar cromosomas recombinameo; diferentes de los cromosomas progenitores. La recombinaci6n resulta de un imercambio fi)ico de material cromos6mico, fen6meno visible en el entrecruzam.iento que ocurre durante Ia meiosis (ctivisi6n espedalizada por La que se producen las celulas germinates haploidt:s). l.a meiosis empieza con una celula que ha duplicado sus cromosomas, de tal forma que posce cuatro copias de cada uno. En las primeras etapas de Ia meiosis, esas cuatro copias cstan intimamente reladonadas (en sinapsis) en una emuctura Uamada bivalente . En esta etapa, cada unidad Cl'Oll)OSOIUiCa Se denomina cromatida.los intercambios en pa res de material ocurren entre crom
Recomblnantes

La recombinaci6n implica el apareamiento entre las caderas complementalias de dos duplex de DNA progenitores.

La complementariedad de las dos cadenas de DNA cs cscncial para el proceso de recombinaci6n. Cada una de las cromatidas que se muestran en Ia Figura 2.7 consiHe en un largui'simo duplex de DNA. Para que estas se rompao y reconecten sin perdida de material, se requiere de un mecanisme que reconozca exactarneme las posiciones correspendiemes, lo cual sucede gracias al apareamiente complemenrario de bases. La recombinaci6n implica un proceso en el cual las cadenas indi vidua les de Ia regi6n de entrecruzamienro intercambian parejas. En Ia se muestra que cste cvento da Iugar a un Cragmenlo de DNA hibrido, en el cual Ia cadena individual de un duplex se aparea con su complemente provenieme del otro duplex. Por supuesto, el mecanisme involucra otras etapas (las cadenas deben romperse y resellarse) que se analizanin en detalle en el Capitulo 20, Sistemas de rarad6n, pero Ia caracterfstica crucial que hace posible la recombinadon exacra es Ia complemcma riedad de las cadenas de DNA. La figura muestra solo algunas etapas de Ia reacci6n. pero podemos observar que en Ia recombinacion intcrmedia se forma un fragmemo de D A lubrido cuando una sola cadena cruza de un duplex a orro. Cada recombiname esta formado par un duplex de DNA progeniror del lado izquierdo, el cual esta conectado por un fragmemo de DNA hfbrido al orro duplex progenitor dellado derecho. Cada duplex de 2.7 La recombinaci6n ocurre por intercambio fisico de DNA

29

DNA corresponde a una de las cromatidas impllcadas en el proceso de recombinaci6n de Ia Figura 2. 7. La formaci6n del DNA hfhrido exige que las secuencias de los duplex recombinames se encuenuen lo su6cientememe cerca como para lograr e l apareamjento entre las cadenas cumplernentaria~ . Sino hay diferencias entre los dos genomas progenitores en estn region, Ia forma cion de DNA hibrido sera perfecta. Sin embargo, la reacci6n pt lede ser tolerada aun cuando haya diferendas diminm as. en cuyo caso, el DNA hfbrido riene puntos de apareamiento err6neo, en los cuales una base de una cadena confroma a una bac;c cle Ia (.lrra cadena que no es complelllenta ria , La correcci611 de d.ichos en-ores de apareamiemo es otra caracteristica tlt> Ja recombinad6n genetica (vease Capitulo 20, Sistemas de reparaci6n).

El c6digo genetico se lee en tri pletes Conceptos principales • El c6digo genetico se lee en tripletes de nucle6tidos denom in ados codones. • Los tripletes no estan superpuestos y se teen a partir de un punto fijo de inido. "' Las mutaciones que insertan o eliminan bases individuates provocan un cambia en Los grupos de tripletes despues del sitio de la mutacion. • Las combinaciones de mutaciones que lnsertan o eliminan a tres bases en conjunto (o en multiplos de t res} insertan o eliminan aminoacidos, pero no cambian la lectura de los tripletes mas allii del ultimo si Lio de mutaci6n. Cada gen representa una cadena prOLeinica espedfica. El concepro de que cada proteina esta fonnada por una serie de aminoaddos en particular. da ra de Ia caracterizaci6n de Sanger de la insulina, de Ia decada de 1950. El descubrimiemo de que un gen esra formade por DNA clio Iugar a la interroganre de c6mo una secuencia de nucJe6Lidus del DNA represenLa una secuencia de ami.no;kidos en las prme(nas. Una caracterisrica clave de Ia csr runura gene~;aJ del DNA es que es independieme de Ia secuenda partiCIIfar de los nuclc6tidos que Ia componm. La secuenda de nucle6tidos del DNA es imponanre no por su es1ruc-1ura per se. sino porque codijica a Ia secuenc-ia de aminoacidos que Ct)nstiLUye a l polipeptido correspondiente_ T.a re lad6n entre una secuencia de ON A y la secuencia de la protefna corrcspondit'ure se denomina c6digo ge netico. La esLructu ra y Ia actividad enzimatica de las proteinas se deben a su secuencia ptimaria de ami noacidos, que al ser ckterminada en cada una, el gen puede transportar roda la informacion necesaria para especificar una cadena polipeprfdica aaj-

30

CAPiTULO 2 Los genes codifican proteinas

va_ De e~ta manera, un solo tipo de estmctura - el gen-es susceptible de represenrarse a sf mismo en innumerables formas de polipeptidos. En conjunto, los diversos producto5 l)rotelnicos de una c€1ula asumen las actividades cataliticas y eslrucluraks responsables de esrablecer su fenotipo. Obviamente. ad.emas de las secuendas que co difican a las protclna~, cl DNA rambien contiene ciertas sccuencias cuya funcion es ser reconocidas por moleculas reguladoras, 11sualruente protefuas. En eSle ca~o. la funci6n del DNA es de[erm.inada tlirectamente por su secuencia, no a traves de Lm. codigo inLerrnediaJ·io. Ambos tipos de region, los genes expresados como proteinas y las secuencias reconocidas como tales, consrituyco la informacion gene tita. :01 codigo genetico es descifrado pnr 1111 rncc-anismo complejo qu~.· inrerptera las secuenclas de los addos nucleicos. el cual es esendal si Ia in1orrnacion rransponada en el DNA tiene que tener algun significado. En U t ~a region dada, s61o una de las dos cadenas de DNA codifica a 1111a protelna, po-r lo tanto, el c6dign gen~ l i\o se represen ta como una secuenda de bases (mas q ue como pares de bases). El c6digo genelico se lee <::n grupos de tres nude6Lidos. ca d<:~ uno de los cua!es represema a un amino;kido; cada secuencia de tres n ucle6'tidos se denomina cod o n . Un gen inclllye una serie de coJones que se lee de forma secuencial ciesde u n punLOde pardda de UJ1 extrerno hasta un pun10 final, en <:'1 orro exttemo. Escrita en Ia direccion convencional s· a 3', la secuencia de nucle6tidos dt' Ia cadena de DNA que codifica a Ia proLe(na corresponde ala secuencia de aminmicidos de la protefna escrita de terminal N hasta terminal C. Bl c6digo generico se lee en tripletes no superpues-

ros a partir de un punta ftjo de inicio: • No SUJ1erpuesros implica que cada codon esta formado por tres nucle6tidos y q11e los

cod ones sucesi vos est an, reprt'Semados por

trinucleotidos sucesivos. • El uso de u n pull to ji.jo de hzicinci6n significa qoe el ensamblaje de una protefna debe comenzar en un exrrerno y avaozar hacia el otro, cle 111anera que las diferentes panes de Ia secuenda coclificadora no puedan ser Jeidas de 111anera indcndicntc. La naruraleza del codigo pronostica que dos tipos de lTIUtadones tend.nill efectos cliferentes. Si una secuenda en panicu lar se lee de forma S{'cuendal como: UUU AAA GGG CCC (n>dones) aa 1 aa2 aa3 aa4 (anunoacidos) emonces una mutaci6n puntual atectara solo a un amino
UUU /\1\X GGG CCC

aal aa5 aa3 aa4 porque solo el segundo codon ha sufrido cambios. Sin embargo. ww muwc16n que inserta o elimma una sola base rambiart! a los grupos de tripletes de toda La secuencia subsiguieme. Un cambia de este tipo se llama d esp la zamiento d el m arco d e le ctura. Una inserd6n puede asumir Ia siguiente forma: UUU AAX AGG GCC C aal aa5 aa6 aa7 Dcbido a ctue Ia nueva secuencia de tripletes cs compJetamcnte difereme a Ia antigua,la secuencia completa de aminoacidos de Ia proreina se modilica a panir del sitio de Ia mutacion, de modo que es probable que Ia f1md6n de Ia prOLe[na se pierda por complete. Las muraciones de cambio de l marco de lt:ctura son inducidas por las acridinas, compuestos que se unen al DNA y que distorsionan Ia esu ucrura de la doble hcli cc, provocando la incorporaci6n de bases adicionalcs o Ia om isi6n cle bases durante el proceso de replicaci6n. Cada evenro mutagenico provocado por una acridina resulta en Ia adicion o eliminad6n de un solo par de bases. Si se produce un mutante de acridina por, digamos, Ia adicion de un nucle6tido, este debe regresar al tipo silveme por Ia de1eci6n de dicho nudeorido. Sin embargo Ia reversion tambien puede ser provocada pOl deleci6n de una base difereme en tm sitio cercano al primcro. La!\ comhinacione~ de dichas

Tipo silvestre ·--, GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU GCU -

./

Ala

Ala

Ala

Ala Ala

Ala

Ala

Ala

""---

lnserci6n A GCU GCU AGC UGC UGC UGC UGC UGqtr

J

Ala Ala Ser Cys Cys Cys Cys Cys Deleci6n

G

::=J GCU GCU GCU GCU GCU CUG CUG CUG( Ala

Ala

Ala

Ala Ala Leu Leu Leu

mutaciones proporcionan evidencias reveladoras referemes a Ia naturaleza del c6digo genetico. E:n Ia se ilustran las propiedades de las mutaciones de cambio del marco de lectura. Una inserci6n o una delecion cambta Ia secuencia completa de la proreina despues del sitio de la mutadon. pero Ia combinaci6n de una inserd6nytma deledon hace que el c6digo :.e lea de forma incorrena so_o emre los dos sitios de mutaci6n; Ia lectura correcta se resrablecc dcspues del segundo sirio. En 1961, media me el anali..,i~ genetico de las m uradones por acridina en Ia region rll del fago T6 se dernustr6 que todas las mmaciones podrian ser dasLficadas en uno de dos grupo:. descriros como(+) o (- ). Cada ripo de mutaci6n provoca por sf m isma un cambiu en el marco de lectura: el tipo (+) por actici6n de una base y el tipo (-) por deleci6n de una base. La!> cornbinadones de ml1Lantes dobles de los tipos (++) y (- -) sigucn rnos1rd ndo un comportamiento mutanre, pero las combi nactone~ de los tiros (+ - ) o (- +) se suprjmen una a la otra . En este caso. Ia segunda mmad6n sc dc~crii.Je cot no s upresora d eJ carobio en el m arco d e Ject ura de la primcra mulacion. ('En el conrexto de este trabajo. la palabra "supresor" se miliza en un scntido inmual porque Ia segunda muraci6n esta en el mismo gen que Ia primcra.) Ec;ws resultados muestran que el c6ctigo genetico debe c;er leido como una 'iecuencia establedda por el punro de inidad6n, de modo que las adiciones o las deleciones se compensan mumamente, rniemras que las adiciones o las delccione!l dobles siguen siendo mutames. De cualquier forma. estos haJlazgos no revclan cuantos nude6tidos constituyen cada codon. Cuando se consuuyen mutames triples, solo las combinaciones {+++ ) y (-- -) muestran el fenotipo silvestre, mientras que Jas otras siguen siendo m utames. Si se considera que trcs actidones o tres dekciuncs correspondeD respectivamente a Ia adicion o Ia omisi6n global de un soJo amin ockido, esro implica que el c6digo se l ~e en u·ipletes. Enrre los dos sitios de mulacion hay una secuencia incorrecLa de aminoc.kidos, mit'ntras que a cada !ado de Jos sitios de muraci6n las secucncias siguen siendo de ripo silvestre, como se indica en Ia Figura 2.9.

Mutante doble A G ~:=J GCU GCU AGC UGC UGC UCU GCU GCU~ Ala

Ala Ser Cys Cys

Ser Ala Ala

Mutante triple A A A GCU GCA UGC UGC AUG CAU GCU GCUI

_J

Ala

Ala Cys Cys Mel His

Secuencia de llpo Silvestre

Ala

Ala

Secuencia mutanle

Las mutaciones de cambia del marco de lectura muestran que el c6digo genetico se tee en tripletes desde un punto fijo de inicio.

Cada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles Concepto principal En general. solo un marco de tectura es traduddo, los otros dos son bloqueados por senates frecuentes de terminaci6n.

Si el c6digo genetico se lee en tripletes no S"uperpuestos. son 1res las form as posibks de nadudr cualquier 2.5 Cada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles

31

secuencia de nucleoridos en protefnas, dependiendo del puma de iniciad6n; a dichas secuencias se les llama marcos de lectura. Para Ia secuencia ACGACGACGACGACGACG

l.os ue-; marcos de lectura posibles son ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA GACGACGACGACGACGACGAC

Utl lllarro de lectw·a que consta exdusivamente de tripleres que representan a aminoaddos, se llama marco de lecrura abierto u OR.F (open rertdingframe). Una secuencia que se traduce en una protelna tiene un marco de lecwra que empieza con un codon de imciaci 6n especial (AUG) y que posteriormente se extiende a traves de una serie de tripletes que representan a aminoaddos, basta tenninar en uno de los tre:; tipos de codones de terminaci6n (vease el Capitulo 7, Bl RNA mcnsajero). Cuall(io un marco de lectura no pucde ser tra ducido en protdna po ,·que con frecuencia se preseman codones de terminacion, se dice que esta bloqueado. Si una secuencia est loqueada <·n los tres marcos de lecrura. no puede tener Ia funci6n de codificar a una protefna. Cuando se obtiene la secuencia de una rrgi<'in de DNA de funci6n desconocida, se analiza cada marco de lectura posible para determinar si esla abierto o bloqueado. Normalmente, no mas de uno de los rres marcos de lecmra posibles esta abiertn en un solo fragmc:nto de DNA. En la se muesLra el ejemplo de una secuencia que puede leerse en solo u n ma reo de lectura debido a que los marcos de lectura alternaLivos estan bloqueados por codones de te1minaci6n frecuenres. Es poco probable que por casuali dad exista un marco de lectura largo y abierto; sino se tradujera en una proteina, no habrfa presion selectiva para evitar Ia acumulaci6n de codones de rerminaci6n, de modo que la identificad6n de- un rnaxco de lectura largo y abierto se considera como evidencia en prililera lnstancia de que Ia secuenda se traduce en protefna en dicho marco. Un ORF para el cualno se ha idemificado un producto pxotefnico suele denominarse marco de leCLura no iclemificado ( URf,

unidentified reading [mme).

Un marco de tectura abierto empieza con AUG y continua en tripletes hasta un codon de terminacion. Los marcos de lectura bloqucados pueden ser interrumpidos con frecuencia par codones de terminacion. 32


Los genes procari6ticos son colineales con sus prote1nas Conceptos principales • Un gen procariotico es un fragmento constante de 3N nucle6tidos que codifica aN aminoacidos. • El gen, el RNA111 y la protein a son todos colineales.

Cornparando la secuenda de nucleotidos de un gcn con la secuencia tie amino;kidos de una protelna, podemos delenninar directameme si el gen y Ia protefna son colinea les; esto es, si la secuencta de nucle6tidos del gen corresponde exactamente a la secuencia rle aminoacidos de la protefna. En las bacterias y sus virus hay una equivalencia exacra, cada gen contiene un fragmento continuo de DNA cuya lo11gitud es directa:mente proporcional alnumero de aminoacidos de la prorefna QL1e representa. Es necesario un gen de 3N pares de bases (l>p, base pairs) para codificar w1a proteioa deN aminoacidos, de .1cuerdo con el c6digo gc•ne1 ico. Laequivalencia del gen bacreriano )' su produclo signifka que un mapa ffsico <1e DNA correspondera exactamente a un mapa de aminoacidos de Ia protetna. <.Que tan bien se acoplan estos mapas con tl mapa de recombinaci6n? El paralelis.mo del gen y Ia protefna se investig6 origiualmeme en el gen de la u-ipt6fano simetasa de E. coli. La distanda genetica se valoro a traves del porcentaje de recombinaclon entre muLaciones, en tamo que la distancia de la protefna se midi6 por medio del nlimero de aminoacidos que separaban a se comparan los sitios de rempla7.o. En Ia ambos mapas. El orden de siete sitios de mutad6n es eJ mismo que e l orde11 de los sitios corresporldkntes a los remplazos de aminoacidos, y las distancias de recombinad6n son relativamente similares a las clistandas reales de Ia prmefna. El mapa de recombinaci6n amplfa las distancias entre r~\gunas mutadones, pero por lo demas, la distorsi6n del mapa Je recombinaci6n es escasa, respecto del mapa fisico. El mapa de recombinadon haec ver dos pun LOs generales acerca de Ia organizaci6n del gen. Mltta· clones diferemes pueden provocar que un aminoaddo de t.ipo silvestre sea rempla?.ado par sust1tutos diferentes. Si dos de estas mutaciones no pueden recombinarse, deben involucrar mutaciones puntuales diferentes en la misma posici6n del DNA. Si las mmaciones pueden sepa rarse en el mapa genedco, pero afectan al mismo aminoacido en el mapa superior (las lfneas comunicantes convergen en la figura), deben implicar a mutaciones pttntuales en vosidoues cliferenLes que afectan al mismo aminoacido debido a que la unidad de recombinaci6n ge-

Glt Gli Glu

Protelna de tipo Silvestre

Ser

Mapa de aminoacido\ de Ia prote na

El DNA esta formado por dos cadenas apareadas por medio de bases cadena superior 5' ATGCCGTIAGACCGTIAGCGGACCTGAC 3' TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG cadena inferior Slntesis de RNA

!

~AUGCCGUUAGACCGUUAGCGGACCUGAC3

•- Distancla entre mutaciones

Protefna mutante

I

Mutaciones diferentes en Ia misma poslci6n

El RNA tiene Ia misma secuencia que Ia cadena superior de DNA; es complementaria a Ia cadena inferior de DNA

~

El RNA se sinteti7a utilizando una cadena de DNA como molde para el apareamiento complementario de las bases.

Cis

1 Las mutaciones pueden estar separadas, pero afectan a Ia misma posici6n

El mapa de recombinaci6n del gen de La triptofclno sintetasa corresponde a La secuencia de aminoacidos de La proteina.

netica (en rcalidad I bp) es mas pequena que La unidad que codifica al aminoaddo (en realidad 3 bp).

1111

Numerosos procesos son necesarios para expresar el producto prote1nico de un gen

Conceptos principales • Un gen procari6tico se expresa por transcripci6n en RNAm y posteriormente por traducci6n del RNAm en una protelna. • En las eucariotas. un gen puede contener regiones internas no representadas en Ia proteina. • Las regiones internas son eliminadas del transcrito de RNA por el corte y empalme de este para dar origen a un RNAm colineal respecto del producto proteinico. • Cada RNAm esta formado por una regi6n lider 5' no traducida. una region codificadora y una region posterior 3' no traducida.

AJ comparar un gen y una protefna se trata s61o con Ia secuencia de DNA ubicada enrre los pumos correspondicntcs a lo~ cxtremos de La protefna. Sin embargo, un gen no se traduce directameme a una proLdna, sc expresa mediante Ia producci6n de lin RNA mensajero (RNA.m, messenger RNA). que es un acido nucleico inrermedio urHizado, efectiva-

meme, para sintetizar protefna (como se observa en detalle en eJ C
2.11 Numerosos procesos son necesarios para expresar el producto proteTn ico de un gen

33

.. EXON 1

Region lrder

Remolque V 3 ' RNA

s· v

EXON 2

DNA \LJ\.~\:~/

t . .-_.

L-------~--------~

La longitud del RNA define a Ia region del gen

t

N ~ C Prote ina

NUCLEO

La proteina define a Ia region cod1ficadora

3'

El gen puede ser mas largo que la secuencia que codifica a la proteina.

Transctipci6n ANAl

5'

v. /\

3'

Ribosoma

DNA

( ( Traducci6n )

RNA

CITOPLASMA

Traducci6n

~

~ Prote fna

El ribosoma traduce al RNAm

En las bacterias, La transcripci6n y la traducci6n ocurren en el mismo compartimiento.

.En la se ilustra esta situaci6n, en la cual se considera que el geo comprende un fragmento conrinuo de DNA necesario para prod ucir una proteina en particular; induye la secuencia codificadora para dicha proteina, pero rambh~n seClleneias a ambos !ados de Ia region codificadora. Una bacteria esta formada por un solo compartlmiento. de modo que la transcripci6n y la traducci6n ocurren en el mismo Iugar. como se ilustra en Ia . En las eucariotas. Ia transcripci6n tiene Iugar en el nucleo, no obstante, el producto de RNA debe ser transpor1ado aJ citoplasma para ser traducido. En los genes mas simples de las eucariotas (igual que en las bacterias), el RNA transcrito es de hecho el RNAm. Sin embargo, para los genes mas complejos, el rranscriro inmediato del gen es el pre-RNAm , que requiere de cierto procesa ntiento para generar al RNAm maduro. Las etapas basicas de la expresi6n geni<.:a de una eucariota se bosquejan en Ia Este proceso resu1La en 34


La expresi6n de un gen es un proceso que sucede en multiples etapas.

una separad6n espacial entre Ia transcripci6n (en el nucleo) y Ia lTaducci6n (en el citoplasma). La etapa mas importante del procesam.iento es e] cort e y empalme del RNA . Numerosos genes de las eucariotas (y casi todos los de las eucariotas superiores) contienen regiones internas que no codi6can proLemas. En el proceso de cone y empalme se eliminan estas regiones del pre-RNAm para generar un RNA con un marco de Lectura abierto y continuo (vease la Figura 3.1 ). Otros eventos procesadores que ocunen en esta etapa implican Ia modificaci6n de los extremes 5' y 3' del pre-RNAm (vease la Figura 7.16). La traducd6n tiene lugar mediante un complejo mecanisme que incluye ramo proteinas como componemes de RNA. La "maquina" que se encarga del proceso es e.I ri.bosoma, un gran complejo que induye algunas moleculas exrensas de RNA (RNA ribos6mico, o RNAr) y numerosas protd.nas pequefias. El proceso por el cual se reconoce que aminoaddo corresponde a un triplete de nucle6tidos en particular implica un RNA de transferencia imerrned io (o RNAL); hay cuando menos una especie de RNAt para cada aminoaddo. Numerosas protefnas acccsoJias estan impllcadas. La traducci6n se describe en el Capitulo 7, EL RNA

mensajcro, pcro cons.iderese por ahora que los ribosomas son las grcmdes estructuras que se mueven a lo largo del RNAm en Ia Figura 2.14. El punto importante de esta etapa es gut: el proceso deJa expresi6n genica implica al RNA no solo como sustrato esendal, tambien como proveedor de componentes para e! mecanisme . Los componentes RNAr y RNAt son codificados por genes y generados por el [Jroceso de rransCiipcion (como eJ RNAm, excepto que no hay una etapa de naducd6n subsiguiente) .

f1D

Las prote1nas actuan en trans, pero los sitios del DNA, en cis

Conceptos principales • Todos los productos de los genes (RNA o proteinas) actuan en trans; pueden actuar en cualquier copia de un gen de la celula. • Las mutaciones de actuacion en cis identifican a las secuencias de DNA que son el objetivo de reconocimient o de los productos de actuacion en trans. No se expresan como RNA ni como proteinas, y afectan solo al fragmento contiguo de DNA.

Una etapa clave para la definicion del gen [ue el descubrimienw de que todas sus partes deben estar presemes en un fragmemo contiguo de DNA. En Ia terminologfa ge.netica, se dice que la configuration de los sitios Jocalizados en el mismo DNA esta en cis, mientras gue de Ia configuraci6n de los localizados en dos molecu las diferentes de DNA, se dice que esta en trans, de modo que clos mutaciones pueden presemarse en cis (en el mismo DNA) o en trans (en moleculas cliferentes de DNA). La prueba de complernentad6n recurre a este concepto para derermioar si dos muractones estan en el mismo gen (vease Ia Figura 2.3 deJa Seccion 2.3. Las mutaciones que se presenta n en el mismo gen nose pueden complemenlar), y ahora podemos ampliar el concepto de Ia diferenda entre los e[ectos cis y tmns de Ia definicion de la region codificadora de un gen a Ia descripci6n de Ia lntera cci6n entre los elementos reguladores y tm gen. Su[Jongamos que la capacidad de un gen para ser expresado depende de una proteina que se une al DNA cerca de Ia region codi.ficadora. En el ejem· plo representado en la , el RNAm puede scr sintetizado s6lo cuando Ia proteina estc1 unida al DNA, pero sup6ngase que en Ja secuencia del DNA en Ja cual se u ne esra proteina ocune una mutaci6n y Ia protefna ya no reconoce a l DNA: el DNA ya no podrfa expresane. Por /o tanto, un gm puede ser desadivado tanto par una mutaci6n en un sitio de control, como por una mutaci6n en una region codificadora. Las mutaciones no pueden

Q \ '

\.

La proteinase une al sitio de control

Si\~Uol

Region cQdificadora {INA

~

Dos tipos de secuencias de DNA

l

El RNA se sintetiza

RNA los sitos de control del DNA proporcionan sitios de union para protefnas; las regiones codi ficadoras se expresan a traves de la sintesis de RNA.

Ambos alelos sintetlzan RNA en ellipo sllvestre

La mutaci6n en el sltlo de control afecta s61o al DNA contiguo

NO HAY SfNTESIS DE RNA MEDIADA POR EL ALELO 1

I

La sintesis de RNA continua a partir del alelo 2 ~

Un sitio de actuacion en cis controla at DNA adyacente, pero no influye en el otro alelo.

distinguirse genelicameme porque ambos tienen Ia propicdad de acruar s6lo en l
trans, pero los sitios del DNA, en cis

35

La proterna mutante no puede unirse a ninguno de los alelos

NO HAY SfNTESIS DE RNA A PARTIR DEL ALELO 1

D -Proteina mutante

Una mutacion de actuacion en trans de una proteina afecta a los dos alelos del gen que controla.

para e>.presarse. Una mutaci6n que acn:ia exclusivamente afectando las propiedades de la secuenda contigua del DNA se denomina de actu acion en cis. El componatnlento de Ia mutaci6n de actuaci6n en ci.~ q1Je se muesna en Ia Figura 2.17 se puede comparar con el resulrado de una mutacion en el gen que codifica a la protefna regu ladora. En Ia se muestra que La auscncia de proteina reguladora eviLara que ambos alelos se expresen; se dice que una mmacl6n de este tipo es de actuad6n en trans. Revirtlendo el argumento, se sabe que si una mutaci6n es de actuaci6n eu trans, su efecto debera ser ejerddo a n·aves de alglin producLo difusible (tipicamente una protefna) que actue en multiples dianas en una celula. Sin embargo, si unamutaci6n es de actuaci6n en cis, su funci6n a[ectara clirectamente a las propiedades del DNA contiguo, lo cua l signi5ca que nose expresa en Ia forma de RNA ode una protefna.

llli

Resumen

Un cromosoma es un fragrnento inimerrumpido de DNA duplex que contiene nu merosos genes. Cada

36

CAPiTU LO 2 Los genes codifican prote1nas

gen (o cistr6n) se transcribe en un procl.ucto de RNA, el cual a su vez es traduddo en una secuenda polipeptfdica si el gen cod ifica a una proteina. Se dice que un RNA o un producto pro1efnico de un gen son de actuaci6n en trans. Un gen se define mediame ]a prueba de complemen taci6n como una unidad de un fragmcmo individual de DNA. Se dice que un sitio del DNA que regula la actividad de un gen adyaceme es de acruaci6n en ds. Cuando un gen codiGca a una protefna, Ia re laci6n entre Ia secuencia de DNA y Ia sccuencia de Ia protefna depende del c6digo generico. Solo una de las dos cadenas de DNA codiJ1ca a una protefna. Un codon esta formado por tres nude6tidos que representan un solo aminoacido. Una secuencia codificadora de DNA consiste en una serie de coclones, los cuales son lefdos desde u n punto lijo de inicio. En general. solo uno de los tres marcos de lectura posibles puede ser traducido en proteinas. Un gen puede tencr multiples alelos; los recesivos son provocados por mutaciones de perdida de funci6n que interfieren con la funci6n de Ia protelna. Un alelo nulo tiene perdlda total de la funcion. Los alelos dominantes son provocados por mutaciones de ganancia de funci6n que crean una nueva propiedad en la proreina.

Referencias El codigo genetico se lee en tripletes Revisiones Roth. J. R. ( t 974) . 'Frameshifr mutations. Annu. Rl.'v. Gene/. 8, 319-346.

A1ticulos de investigaci6n Benzer, S. and Champe, S.P. (196 1). Ambivalent rll rnurams of phage T4. Proc. Nat/. A cad. Sci. USA 4 7, 403-416. Crick, F.H..C., Baro.ett, L., Brenner, S., and Watts -Tobin, R. J. ( 1961). General nature of the genetic code (or proteins. Nature 192. 1227- 1232.

Los genes procari6ticos son colineales con sus proteinas Articulos de investigacion Yanofsky, C., Drapeau, G.R., Guest, J.R., and Carlton, B.C. ( 1967), The complete amino acid sequence of the tryptophan synthetase A protein (subunit) and its colinear relationship with the genetic maJ.l of 1J1e A gene. Proc Natl. A cad. Sci. USA 57, 2966- 2968. Yanofsky, c. e t al. ( 1964). On lhe colincarity or gene structure and protein strucrure. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA, 51, 266-272.

El gen interrumpido ESQUEMA DEL CAPITULO ) -

Introducci6n Un gen interrumpido esta forrnado por intrones y exones

-

• El us o de codones alternatives de iniciacion o de terminacion permite que se produzcan dos proteinas cuando una es equivalente a un fragmento de la otra. • Se pueden producir secuencias no homologas de proteinas a partir de la misma secuencia de DNA cuando esta es leida en marcos de lectura diferentes por dos genes (superpuestos). • Las proteinas homologas que difieren por la prese ncia o ausencia de ciertas regiones se deben a un corte y empalme diferencial (alternative) en el cual se incluyen o excluyen ciertos exones, ya sea por la inclusion o exclusion de exones especificos o al optar por exones alternatives .

• Los intrones se eliminan mediante el proceso de corte y empalme de RNA, el cual ocurre solo en configuracion cis en una molecula individual de RNA. • Solo las mutaciones que ocu rren en los exones pueden influir en La secuencia de las proteinas; sin embargo, las mutaciones de los intrones pueden afectar el procesamiento del RNA y, por lo tanto, evitar la produccion de proteinas

-

Las endonucleasas de restricci6n son una herramienta esencial en el mapeo del DNA • Las endonucleasas de restriccion pueden utilizarse para dividir al DNA en fragmentos definidos. • Un mapa se genera utilizando las superposiciones de los fragmentos generados por diferentes enzimas de restriccion.

. 0 (C6mo evolucionaron los genes interrumpidos?

La organizaci6n de los genes interrumpidos puede conservarse

.a

.a

• Los intrones suelen detectarse por la presencia de regiones adicionales al comparar los genes con sus productos de RNA mediante mapeo de restriccion o par microscopia electronica, sin embargo, la definicion defi nitiva se basa en la comparacion de secuencias. • Los intrones normalmente conservan su posicion respecto de genes homologos cuando se comparan organismos diferentes. Las longitudes de los intrones correspondientes pueden variar mucho. • Normalmente los intrones no codifican proteinas.

.a

DI!J

Algunos exones pueden equipararse con funciones proteinicas

Los de una familia de genes tienen una organizaci6n comCtn • Se supone que una caracteristica comun de una agrupacion de genes identifica una propiedad que antecede a la separacion durante la evolucion. • La forma comun de organizacion de todos los genes de globina, tres exones y dos intrones, sugiere que descienden de un solo gen ancestral.

La distribuci6n de tamaiios de los genes es amplia • La mayoria de los genes de las levaduras son continuos, no asi los de las eucariotas superiores. • Los exones suelen ser cortos y codificar menos de 100 aminoacidos. • Los intrones son cortos en las eucariotas inferiores, pero en las superiores pueden llegar a tener varias decenas de kb (kilobases) de longitud. • La longitud total de un gen se determina principalmente por sus intrones.

• La interrogante principal al respecto es si los genes se originaron como secuencias interrumpidas por intrones o si originalmente eran moleculas ininterrumpidas. • Probablemente la forma original de la mayoria de los genes codificadores de proteinas fue la inte rrumpida, si bien en un principia los genes interrumpidos que codifican al RNA pudieron haber sido moleculas ininterrumpidas. • Una clase especial de intrones es movil y puede insertarse en los genes.

• Lo que sugiere que los exones fueron las unidades basicas de la evolucion y que los primeros genes fueron interrumpidos en lo siguiente: • La estructura genica es igual entre genes de especies muy distantes. • Muchos exones pueden ser equiparados con secuencias codificadoras de proteinas que tienen funciones especificas. • En genes diferentes se encuentran exones relacionados.

Las secuencias de los exo nes se mantienen, no as\ las de los intrones • La comparacion entre genes relacionados de diferentes especies muestra que las secuencias de los exones correspondientes usualmente se conservan, pero la relacion entre secuencias de intrones noes tan buena. • Los intrones evolucionan mucho mas rapidamente que los exones debido a la falta de presion selectiva para producir una proteina con una secuencia util.

Algunas secuencias de DNA codifican a mas de una proteina

1111 (Se encuentra toda la informacion genetica contenida en el DNA? • La definicion del gen se ha invertido, de "un gen : una proteina" a "una proteina : un gen". • La informacion sabre la posicion tambien es importante en el desarrollo.

og

Resumen 37

ID

Int roducci6 n

La forma mas sencilla de un gen es un fragmento de DNA colineal con su producto protefnico. Los genes bacterianos casi siempre son de este tipo, una secuencia codificadora continua de 3N pares de bases representa una proteina de N aminoacidos. Sin embargo, en las eucariotas, un gen puede incluir secuencias adicionales en Ia region codificadora, las cuales interrumpen a Ia secuencia que representa a Ia protefna. Estas secuencias se eliminan del producto de RNA durante Ia expresion del gen, con lo cual se genera un RNAm que incluye una secuencia de nucleotidos que corresponde exactamente al producto proteinico, de acuerdo con las reglas del codigo genetico. Las secuencias de DNA que forman un gen interrumpido se dividen en las dos categorias descritas en Ia • Los exones son las secuencias representadas en el RNA maduro. Por definicion, un gen comienza y termina con exones que corresponden a los extremos 5' y 3' del RNA. • Los intrones son secuencias interpuestas que se eliminan cuando el transcrito primario es procesado para dar Iugar al RNA maduro. Las secuencias de exones siguen el mismo orden en el gen y el RNA, sin embargo, un gen interrumpido es mas largo que su producto final de RNA debido a Ia presencia de los intrones.

La expresion de los genes interrumpidos requiere de un paso adicional que no es necesario en los continuos. El DNA de un gen interrumpido origina una copia de RNA (un transcrito) que representa exactamente ala secuencia del genoma. Sin embargo, este RNA solo es un precursor, no puede utilizarse para producir protefnas; de ben eliminarse primero los intrones del RNA para dar Iugar a un RNA mensajero formado solamente por una serie de exones. Este proceso se conoce como coney empalme (vease Ia seccion 2.11, Para expresar el producto proteinico de un gen son necesarios numerosos procesos) e implica precisamente la delecion de un intron del transcrito primario y el empalme de los extremos del RNA en ambos !ados para formar una molecula con enlaces covalentes intactos (vease Capitulo 26, Corte, empalme y procesamiento del RNA). El gen comprende la region del genoma localizada entre los puntas correspondientes a las bases terminates 5' y 3' del RNAm maduro . Se sabe que la transcripcion se inicia en el extremo 5' del RNAm y que suele ir mas alia del extremo 3', formado por division del RNA (vease Ia seccion 26.19, Los extremos 3' de los RNAm son formados por division y poliadenilacion). Se considera que el gen incluye las regiones reguladoras de ambos !ados, las cuales son necesarias para iniciar y (en ocasiones) terminar la expresion genica.

ID

Un gen i nterrumpido esta formado por intrones y exones

Conceptos principales E XO N 1 DNA

EXON 3 INTRON

pre-RNAm

~

Sfntesis de RNA

~

~ Por corte y em pal me se eliminan los intrones

•

Los intrones son eliminados por el proceso de corte y empalme del RNA, el cual ocurre s6lo en configuraci6n cis en una molecula individual de RNA.

• S6lo las mutaciones ocurridas en los exones pueden afectar la secuencia de las proteinas, pero las que se presentan en los intrones suelen incidir en el procesamiento del RNA y, por lo tanto, evitar la producci6n de proteinas.

RNAm

~

Sfntesis protefnica

Protefna

La longitud del RNA precursor (no RNAm) define Ia region del gen

En el gen estan separadas las regiones codificadoras individuales t Los genes interrumpidos se expresan a traves de un precursor del RNA . Los intrones se eliminan cuando se cortan y empalman los exones. El RNAm tiene s6lo las secuencias de los exones.

38

CAPITULO 3 El gen interrumpido

(.Como cambia la existencia de los intrones nuestra vision del gen? Despues del corte y empalme, los exones siempre se unen en el orden que ocupan en el DNA, de modo de conservar Ia colinealidad del gen y Ia proteina entre cada exon y las partes correspondientes de la cadena proteinica. En Ia J .1 .. se muestra que, en el gen, el arden de las mutaciones sigue siendo el mismo que el de los remplazos de aminoacidos en Ia proteina. Sin embargo, las distancias en el gen no corresponden en absoluto a las distancias en Ia proteina. Como se observa en un mapa de recombinacion, las distancias geneticas no

DNA gen6mico Ex6n 1

lntr6n 1

Ex6n 2 B

lntr6n 2

Ex6n 3

c

A-B

B-C

RNAm Ex6n 1

A-B

Ex6n 2

Ex6n 3

B-C

En el RNAm los exones permanecen en el mismo arden que en el DNA, pero las distancias a lo largo del gen no corresponden a las distancias a lo largo del RNAm o de los productos prote\nicos. La distancia de A a B en el gen es mas corta que de B a C; sin embargo, la distancia de A a B en el RNAm (y en la prote\na) es mayor que de B a C.

tienen relacion con las observadas entre los puntos correspondientes de la protefna. La longitud del gen depende de la longitud del RNA inicial (precursor) y no de la longitud del RNA mensajero (RNAm). Todos los exones estan representados en la misma molecula de RNA, y su empalme ocurre solo como reaccion intramolecular. Usualrnente los exones provenientes de moleculas dzferentes de RNA no se unen, por lo tanto, el mecanismo excluye cualquier empalme de secuencias que representen alelos diferentes. Las mutaciones localizadas en exones diferentes de un gen no pueden complementarse, asf, siguen siendo definidas como del mismo grupo de complementacion. Las mutaciones que afectan directamente a la secuencia de una protefna deben localizarse en los exones. ;_ Cuclles son los efectos de las m utaciones en los intrones? Estos ultimos no forman parte del RNA mensajero, por lo tanto, las mutaciones ocurridas en ellos no pueden afectar directamente ala estructura de la protefna, pero sf evitar la produccion del RNA mensajero, por ejemplo, inhibiendo el corte y empalme de los exones. Una mutaci6n de este tipo actua solo en el alelo que la porta, de modo que no es susceptible de complementar cualquiera otra mutacion en ese alelo y forma parte del mismo grupo de complementacion que los exones. Las mutaciones que afectan al corte y empalrne en general son nocivas; la mayorfa sustituye a una sola base en la union entre intrones y exones, y pueden hacer que un ex6n sea eliminado del producto, que se incluya a un intron o que los cortes y empalmes sucedan en sitios aberrantes. El resultado mas comun es la introducci6n de un codon de terminaci6n, el cual resulta en el truncamiento de la secuencia protefnica. Aproximadamente ell5% de las mutaciones puntuales que provocan enfermedades humanas son ocasionadas por interrupci6n del corte y empalme. Los genes de las eucariotas no necesariamente estan interrumpidos, algunos corresponden de

manera directa al producto protefnico, igual que los genes procarioticos. En las levaduras, la mayoria de los genes son continuos, en tanto que en las eucariotas superiores casi todos son interrumpidos, y los intrones suelen ser mucho mas largos que los exones, lo cual da Iugar a genes notablemente mas largos que sus regiones codificadoras.

Ill

Las endonucleasas de restricci6n son una herramienta esencial para el mapeo del DNA

Conceptos principales • Las endonucleasas de restricci6n pueden utilizarse para dividir al DNA en fragmentos definidos. • Un mapa puede ser generado utilizando las superposiciones entre los fragmentos generados por diferentes enzimas de restricci6n.

La caracterizaci6n de los genes eucari6ticos fue posible gracias al desarrollo de tecnicas para mapear ffsicamente el DNA, tecnicas que pueden aplicarse al RNA (de una sola cadena) haciendo una copia de DNA (de doble cadena) del RNA. Se puede obtener un mapa ffsico de cualquier molecula de DNA rompiendola en puntos definidos cuya distancia puede ser determinada con precision. La capacidad de las endonucleasas de restricci6n de reconocer como objetivos de corte a secuencias cortas de DNA de doble cadena permite cortes especificos. Cada enzima de restricci6n tiene una diana espedfica en el duplex de DNA, usualmente una secuencia especffica de cuatro o seis pares de bases. La enzima corta el DNA en cada punto en que se presenta su secuencia diana. Las diferentes enzimas de restricci6n tienen secuencias diana cliferentes, y actualmente se dispone de un amplio ran go de estas actividades (obtenidas de una amplia variedad de bacterias).

3.3 Las endonucleasas de restricci6n so n una herramienta esencial para el mapeo del DNA

39

A B

t;;i!iii!iiiiii!!!!!i Dividir con endonucleasa de restricci6n

1

Hacer electroforesis y comparar con el

1

DNA control

2100 1400 1000 500

••.. .• . •.

2000 1500 1000

· ·· ·· · l:J 5oo

1 000 200

B

A

1900

600

800

500

L Un mapa de restriccion es una secuencia lineal de sitios separados por distancias definidas en el DNA. En el mapa se identifican los sitios divididos por las enzimas A y B, segun se definen los fragmentos individuates producidos por las digestiones dobles e individuates.

gina! tal como se muestra en Ia t ... 4 . En el mapa aparecen las posiciones en que las enzimas de restricci6n especfficas cortan el DNA; las distancias entre los sitios de corte se miden en pares de bases, de modo que el DNA se divide en una serie de regiones de longitudes definidas que yacen entre sitios reconocidos par las enzimas de restricci6n . Una caracteristica importante es que se puede obtener un mapa de restricci6n de cualquier secuencia de DNA, a pesar de que se hayan identificado mutacioms en ella. o de hecho, que se conozca, o no, algo de su funci6n.

El control consiste Tamaiios de los fragmentos comparados en fragmentos de tamaiio conocido con el control l Los fragmentos generados al dividi r al DNA con una endonucleasa de restriccion pueden ser separados en fun cion del tamaiio.

A

----~~ -~----.-.

Ill

La organizaci6n de los genes interrumpidos puede conservarse


Un mapa de restricci6n representa una secuencia lineal de los sitios en los cuales enzimas de restricci6n especfficas encuentran a sus secuencias diana. En dichos mapas, las distancias cortas se miden directamente en pares de bases (bp, base pairs), en tanto que las mas largas se expresan en kilobases (kb), que corresponden a pares de kilobases (10 3 ) en el DNA o a kilobases en el RNA. En el ambito de los cromosomas, un mapa se describe en pares de mega bases ( l Mb = l 0 6 bp). Cuando se corta una molecula de DNA con una enzima de restricci6n adecuada, se divide en distintos fragmentos, que pueden ser separados en funci6n de su tamafio por electroforesis en gel, como se muestra en la ( . El DNA dividido se coloca sobre un gel fabricado con agarosa o poliacrilamida . Cuando se pasa corriente electrica a traves del geL cada fragmento se mueve hacia abajo a una velocidad inversamente proporcional allogaritmo de su peso molecular, movimiento que produce una serie de bandas, cada una de las cuales corresponde a un fragmento de un tamafi.o espedfico que disminuye el gel. Analizando los fragmentos de restricci6n del DNA es posible crear un mapa de la molecula ori40


• Los intrones pueden ser detectados por la presencia de regiones adicionales cuando los genes son comparados con sus productos de RNA por mapeo de restriccion o por microscopia electronica, sin embargo, la ultima definicion se basa en la comparacion de secuencias. • Los intrones normalmente conservan su posicion respecto de genes hom6logos cuando se comparan organismos diferentes. Las longitudes de los intrones correspondientes pueden variar mucho. • Los intrones usualmente no codifican proteinas.

Cuando un gen es continuo, el mapa de restricci6n de su DNA corresponde exactamente a! mapa de su RNAm. Cuando un gen posee un intr6n, el m apa de cada extrema corresponde al mapa de cada extrema de la secuencia mensajera. Sin embargo, en el gen, los mapas difieren porque las regiones adicionales no estan representadas en el mensaje. Cada una de dichas regiones corresponde a un intr6n. En el ejemplo de la - se comparan los mapas de restricci6n del gen de Ia ~ -globina y del RNAm. Hay dos intrones, cada uno de los cuales contiene una serie de sitios de restricci6n que estan ausentes en

DNA gen6mico Ex6n 1

. . ..

• Sitios divididos por las enzimas de restricci6n

lntr6n 1

•

Ex6n 2

lntr6n 2

Ex6n 3

-

DNAc El mapa de DNAc corresponde a ex6n1 + ex6n2 + ex6n3 del mapa gen6mico

La comparaci6n de los mapas de restricci6n del DNAc y del DNA gen6mico de la ~-globina del raton muestra que el gen tiene dos intrones que no estan en el DNAc. Los exones pueden ser alineados exactamente entre el DNAc y el gen.

lntr6n

Ex6n

Bloqueado Bloqueado Secuencia del gen

I

I

Ex6n Bloqueado

I

Un intr6n es una secuencia presente en el gen pero no en el RNAm (mostrado aqui de acuerdo con la secuencia del DNAc). El marco de lectura esta indicado por los bloques alternos, abiertos y sombreados; n6tese que los tres marcos de lectura posibles estan bloqueados por codones de terminaci6n en el intr6n .

el DNAc. El patron de los sitios de restricci6n de los exones es el mismo en el DNAc yen el gen. En ultima instancia, la comparaci6n de las secuencias nucleotfdicas de la secuencia genomica y Ia RNAm define precisamente a los intrones . Como se indica en la '" , en general los intrones carecen de un marco de lectura abierto. Al eliminar los intrones, en la secuencia del RNAm se crea un marco de lectura intacto. Las estructuras de los genes eucari6ticos muestran amplias variaciones. Algunos genes son continuos, de tal manera que la secuencia gen6mica es colineal a la del RNAm. La mayorfa de los genes eucariontes superiores son interrumpidos, pero los intrones varian enormemente tanto en numero como en tamafio. Todas las clases de genes pueden ser interrumpidas, los genes nucleares que codifican protefnas, los nucleolares que codifican RNAr, y los que codifican RNAt. Tambien en los genes mitocondriales se encuentran interrupciones, a sf como en las eucariotas inferiores y los genes de los cloroplastos. Los genes interrumpidos no parecen ser excluidos de

ninguna clase de eucariotas y se han encontrado en bacterias y en bacteri6fagos, aunque son extremadamente raros en genomas procarioticos. Algunos genes interrumpidos cuentan solo con un intron, o con unos cuantos, de los cuales, los genes de Ia globina constituyen un ejemplo muy estudiado (vease la secci6n 3 .l 0, La organizacion de los de una familia de genes es comun) Los dos tipos generales de genes de globina, a y ~. comparten un tipo comun de estructura, y la coherencia de su organizaci6n en los mamfferos es evidente a partir de la estructura del gen "generico" de Ia globina, Ia cual se resume en Ia 1 Las interrupciones ocurren en posiciones homologas (respecto de Ia secuencia codificadora) en todos los genes de la globina activos, conocidos, incluidos los mamiferos, aves y ranas. El primer intron siempre es bastante corto y el segundo suele ser mas largo, pero Ia longitud en sf puede variar. La mayorfa de las variaciones en cuanto a longitud total entre los diferentes genes de Ia globina resulta de la variacion en el segundo intron. En el raton, el segundo intron del gen de la a-globina tiene una longitud de solo

3.4 La organizaci6n de los genes interrumpidos puede conservarse

0

41

573-904 lntr6n2 Longitud 142-145 de los exones ~

216-255

Contenido UTR 5' + codificadores 1-30

~

Codificadores 105 -extrema + UTR 3'

Aminoacidos 31-104

' Todos los genes funcionales de globina tienen una estructura interrumpida con tres exones. Las longitudes indicadas en la figura aplican a los genes de La globina-~ de los mamiferos.

11J

Las secuencias de Los exones se mantienen, no as1 las de Los intrones

Conceptos pri nci pales

2

0

5

6 Exones

4 5

3

10

15 kb

20

25

30

Los genes de la DHFR de los mamiferos tienen la misma organizaci6n relativa de exones mas bien cortos e intrones muy largos, pero varia ampliamente en las longitudes de los intrones.

150 bp, por lo tanto, la longitud total del gen es de 850 bp, respecto del gen mayor de Ia ~-globina, en el cual, los 585 bp del intr6n resultan en un gen cuya longitud total es de 1382 bp. La variaci6n en la longitud de los genes es mucho mayor que el rango de longitudes de los RNAm (el de la cx-globina tiene 585 bases y el de Ia ~-globina, 620 bases). El ejemplo de Ia DHFR, un gen un tanto mas grande, se muestra en la . Dicho gen (dihidrofolato reductasa) de los mamiferos esta organizado en seis exones que corresponden al RNArn de 2 000 bases con una longitud mucho mayor de DNA debido a que los intrones son muy largos. En tres mamiferos, los exones son esenci.almente iguales y las posici.ones relativas de los intrones no cambian, a diferencia de la longitud de cada intr6n; no obstante, el resultado de Ia variaci6n en la longitud del gen es de 25 a 31 kb. Los genes de Ia globina y de la DHFR son ejemplos de un fen6meno general: los genes relacionados por evoluci6n tienen organizaciones relacionadas con el mantenimiento de Ia posicion de los intrones (a! menos de algunos de ellos). Las variaciones en Ia longitud de los genes son determinadas principalmente por la longitud de los intrones. 42


• La comparaci6n de genes relacionados de diferentes especies muestra que las secuencias de los exones correspondientes usualmente se conservan, pero las secuencias de los intrones estan mucho menos relacionadas. • Los intrones evolucionan mucho mas rapidamente que los exones por la falta de presion selectiva para producir una proteina con una secuencia util.

cUn gen estructural es unico en su genoma? La respuesta puede ser ambigua. La longitud completa del gen es unica, pero con frecuencia sus exones estan relacionados con los exones de otros genes. Como regla general, cuando dos genes estan relacionados, Ia relaci6n entre sus exones es mas cercana que la relaci6n entre sus intrones. En un caso extrema, los exones de dos genes pueden codificar a la misma secuencia protefnica, mientras que los intrones pueden ser diferentes, lo cual implica que ambos genes fueron originados por una duplicaci6n de algun gen ancestral comun. Posteriormente, se acumularon diferencias entre una y otra copia, pero en los exones se vieron restringidas porIa necesidad de codificar funciones protefnicas. Como se vera mas adelante, al analizar Ia evoluci6n del gen, los exones pueden ser considerados como las unidades basicas ensambladas en varias combinaciones. Un gen puede tener algunos exones relacionados con los exones de otro gen, pero otros pueden no tener relaci6n. En general, los intrones no tienen ninguna relaci6n en dichos casos, pueden surgir por duplicaci6n y translocaci6n de exones individuates. La relaci6n entre dos genes puede representarse como una comparad6n de matriz de puntos, como en Ia . Un punto indica Ia posicion de Ia misma

5'

Ex6n

Globina Ex6n

~

mayor Ex6n

3'

5'

Ex6n r1

'

6~ Ex6n I2 E Cll

c B 0

a /

3'

r

Las secuencias de los genes de la globina ~may" y de la globina ~menor del raton estan 1ntimamente relacionadas en las regiones codificadoras, pero difieren en las regiones flanqueantes yen el intr6n largo. Datos proporcionados por Philip Leder, Harvard Medical School.

secuencia en cada gen. Si dos secuencias son identicas, los puntas forman una linea en angulo de 45°. La linea es interrumpida por regiones no similares y se desplaza de forma lateral o vertical por deleciones o inserciones en una secuencia respecto de Ia otra. Cuando se comparan los dos genes de la globina~ del raton, dicha lfnea abarca los tres exones y el intron pequefio para luego desvanecerse en las regiones flanqu eantes y el intron largo; es un patron tipico en el cuallas secuencias codificadoras estan bien relacionadas y Ia relacion puede ir mas alia de las fronteras de los exones; sin embargo, el patron se pierde en los intrones mas largos y en las regiones de ambos !ados del gen. El grado total de divergencia entre dos exones depende de las diferencias entre las protefnas, provocadas principalmente por sustituciones de bases . En las regiones traducidas, los exones se ven restringidos por la necesidad de codificar secuencias de aminoacidos, de modo que su potencial de cambia de secuencia es limitado. Muchos de los cambios no afectan el significado de los codones porque se cambia un codon por otro que representa a! mismo aminoacido. Los cambios ocurren con mayor libertad en las regiones no traducidas (las cuales corresponden allfder 5' y a! remolque 3' del RNAm). En los intrones correspondientes, el patron dedivergencia implica cambios tanto de tamafio (por de leciones e inserciones) como sustituciones de bases.

Los intrones evolucionan mucho mas rapidamente que los exones. Cuando se compara un gen en diferentes especies, en ocasiones, los exones son homologos, pero los intrones han cambiado tanto, que no se reconocen las secuencias correspondientes. Las mutaciones ocurren a la misma velocidad en exones e intrones, pero son eliminadas mas eficientemente de los exones por seleccion adversa. Sin embargo, en ausencia de restricciones impuestas por una fun cion codificadora, un intron es susceptible de acumular libremente sustituciones puntuales y otros cambios, los cuales implican que el intron no tenga una funcion regida por una secuencia especffica; al'm nose sabe si su presencia es necesaria para Ia funcion del gen.

111 La distribuci6n de tamanos de los genes es amplia Conceptos principales • La mayoria de los genes de las levaduras son continuos, no as\ los de las eucariotas superiores. • Los exones suelen ser cortos y codificar menos de 100 ami noacidos. • Los intrones son cortos en las eucariotas inferiores, pero en las superiores pueden llegar a tener varias decenas de kb ( ki lobases) de longitud. • La longitud total de un gen se determina principalmente por sus intrones.

En La se muestra La organizaci6n global de los genes en las levaduras, los insectos y los mamfferos. En Saccharomyces cerevisiae, Ia gran mayorfa de los genes (>96%) son continuos, y los que tienen exones suelen mantenerse razonablemente compactos; virtualmente ninguno de sus genes tiene mas de cuatro exones. En insectos y mamiferos sucede lo contrario, solo algunos genes tienen secuencias codificadoras ininterrumpidas (6% en los mamfferos). Los genes de los insectos tienden a presentar un nl'1mero bastame reducido de exones, en general menos de l 0. Los genes de los mamfferos estan divididos en mas fracciones y algunas tienen varias decenas de exones. Aproximadamente el 50% de los genes de los mamfferos tienen > l 0 intrones. AI examinar las consecuencias de este tipo de organizaci6n para el tamafio total del gen, en Ia se observa que entre las levaduras y las eucariotas superiores hay una diferencia notable. La longitud del gen promedio de una levadura es de 1.4 kb, y en muy pocos es superior a los 5 kb. Sin embargo, la predominancia de genes interrumpidos 3.6 La distribuci6n de tamafios de los genes es amplia

43

... . S. cerevisiae

Q)

·ro

c

D. melanogaster

(!)

<:' 0

(L

Mamfferos

1 2

3 4

5

6 7 8 9 10

12

14

16

18

20 <40

>60

Numero de exones

La mayoria de los genes de las levaduras son continuos, pero en las moscas y los mamiferos, casi todos son interrumpidos. (Los genes continuos tienen un solo ex6n y se suman en la columna de la extrema izquierda.)

S. cerevisiae

50 40 30 20 10

5 4

3

Q)

~

0

Cl..

2

D. melanogaster

·ro 50 c Q)

en las eucariotas superiores significa que el gen puede ser mucho mas largo que Ia unidad que codifica una protefna. Relativamente pocos genes de mosca o de mamifero presentan una longitud inferior a 2 kb, yen muchos casos es de entre 5 kb y 100 kb. El gen humano promedio tiene 27 kb de largo (vease Ia Figura 5.11). El cambio de genes en buena parte continuos a genes en gran medida interrumpidos ocurre en las eucariotas inferiores. En los hongos (excepto las levaduras), Ia mayorfa de los genes son interrumpidos, pero tienen un numero relativamente pequefi.o de exones (<6) y son bastante cortos (<5 kb). El cambia a genes largos tiene Iugar en las eucariotas superiores, y los genes se hacen significativamente mas largos en los insectos. Con este incremento en Ia longitud del gen, se pierde !a relaci6n entre el tamafi.o del genoma y la complejidad de los organismos (vease la Figura 4. 5) . Conforme se incrementa el tamafio del genarna, Ia tendencia es a intrones mas largos, mientras que los exones siguen siendo bastante pequefios. En la 3 1' se observa que los exones que codifican a los fragmentos de una protefna tienden a ser bastante pequefios, de modo que en las eucariotas superiores, el ex6n promedio codifica a -50 aminoacidos y la distribuci6n general encaja bien

1

40 30 20 10

6 (/)

5

Q)

c 4 0 X

Q)

50 40 30 20 10

t'-

3 2

6 <0.5 <1

<2 <5 <10 <25 <50<100>100

Tamafio de los genes

(kb)

Los genes de las levaduras son cortos, pero los de las moscas y los mamiferos tiene una distribuci6n dispersa que se extienden a longitudes muy amplias.

5 4

3 2

100

300

500

700

900

Longitud de los exones en nucle6tidos Los exones que codifican proteinas usualmente son cortos.

44


con Ia idea de que los genes han evolucionado por la adicion lenta de unidades que codifican a dominios pequefios e individuates de protefnas (vease la seccion 3.8, .:_Como evolucionaron los genes interrumpidos?). No hay una diferencia significativa en el tamafio de los exones de tipos diferentes de eucariotas superiores, aunque la distribucion es mas compacta en los vertebrados en que hay pocos exones cuya longitud rebase los 200 bp. En las levaduras, hay algunos exones mas largos que representan a genes continuos en los cuales la secuencia codificadora esta intacta. Los exones que codifican a regiones 5' y 3' no traducidas tienden a ser mas largos que los que codifican protefnas. La muestra que el tamafio de los intrones varia ampliamente. En los gusanos y las moscas, el intron promedio noes mucho mas largo que los exones. En el primer caso no hay intrones muy largos, sin embargo las moscas contienen una proporcion significativa de ellos. En los vertebrados, Ia distribucion de tamafio es mucho mas amplia, desde aproximadamente la misma longitud que los exones (<200 bp) hasta longitudes medidas en decenas de kb, incluso 50 a 60 kb en casos extremos. Los genes muy largos son resultado de intrones muy largos, no de secuencias codificadoras de productos de gran longitud. No hay una correlacion

15 )<

0

Mosca

10 5 20 15 10 5 5

10

15

20

25

30

Longitud de los intrones en kb 1

Los intrones varian de muy cortos a muy largos.

entre el tamafio del gen y el tamafio del RNAm en las eucariotas superiores, tampoco una buena correlacion entre el tamafio del gen y el nl!mero de exones, de modo que el tamafio de un gen depende principalmente de las longitudes de cada uno de sus intrones. En los mamiferos, los insectos y las aves, Ia longitud del gen "promedio" es de aproximadamente cinco veces la de su RNAm.

Ill

Algunas secuencias de DNA codifican a mas de una protefna

Conceptos principales • El uso de codones alternativos de iniciacion o de terminacion permite que se produzcan dos proteinas cuando una es equivalente a un fragmento de la otra. • Se pueden producir secuencias no homologas de proteinas a partir de la misma secuencia de DNA cuando esta es leida en marcos de lectura diferentes por dos genes (superpuestos). • Las proteinas homologas que difieren por la presencia o ausencia de ciertas regiones se deben a un corte y empalme diferencial (alternativo) en el cual se incluyen o excluyen ciertos exones, ya sea por la inclusion o exclusion de exones especificos o al optar por exones alternativos.

La mayorfa de los genes consta de una secuencia de DNA dedicada l!nicamente a codificar a una protefna (aunque el gen puede incluir regiones no codificadoras en cualquier extremo e intrones en Ia region codificadora), aunque en algunos casos una sola secuencia de DNA codifica a mas de una protefna. Los genes superpuestos se presentan en una situacion relativamente sencilla en Ia cual un gen es parte del otro. La primera m.itad de un gen (o la segunda) es utilizada de manera independiente para especificar una protefna que representa a la primera mitad (o a la segunda) de Ia proteina especificada por el gen completo. Esta relacion se ilustra en la . El resultado finales muy similar a una division parcial del producto proteinico para generar formas tanto de tamafio parcial como de tamafio total. Dos genes pueden superponerse de manera mas sutil cuando la misma secuencia de DNA es compartida por dos proteinas no hom6logas, situacion que se presenta cuando Ia m.isma secuencia de DNA se traduce en mas de un marco de lectura. En los genes celulares, una secuencia de DNA suele leerse solo en uno de los tres marcos de lectura potenciales. Sin embargo, en algunos genes vfricos y mitocondriales hay superposici6n entre dos genes adyacentes que 3. 7 Algunas secuencias de DNA codifican a mas de una protein a

45

Protefna de tamafio total

I

t Exones W

Un RNAm tiene el ex6n a.

z

X

Protefna de tamafio parcial

I

Un RNAm tiene el ex6n

W

~~~~mm~~~~~~~~m~mmmmmmmmmmmmmmmmm~,~~~~~c~~~ ·

portnpletes

t.. . riantes

a

~

l

X

~

Z

1 , El corte y empalme alt ernative genera las vay ~ de la troponina T.

INICIO alterno

I • " A partir de un solo gen se pueden formar dos proteinas que inician (o terminan) su expresi6n en puntos diferentes.

INICIO

Codones utilizados para Ia protefna 2

Dos genes pueden compartir La misma secuencia leyendo el DNA en diferentes marcos de lectura .

se leen en marcos de lectura diferentes, situacion ilustrada en la 1 • - . La distancia de Ia superposicion es por lo general relativamente corta, de tal forma que la mayor parte de la secuencia que representa a la protefna conserva una funcion codificadora unica . En algunos genes, los patrones alternativos de la expresi6n genica crean cambios en la ruta utilizada para conectar los exones. Un solo gen puede generar diversos productos de RNAm diferentes en cuanto a contenido de exones, y la diferencia pu ede ser que ciertos exones son opcionales, es decir, pueden ser incluidos o desempalmados. Asimismo, puede haber exones que se excluyan mutuamente, se incluye uno u otro, pero no ambos. Las formas alternas producen protefnas en las cuales una parte es comun y la otra es diferen te . En algunos casos, los medios alternos de expresion no afectan a la secuencia de la protefna, por ejemplo, los que inciden en ellider 5' no trad u ci 46

CAPITULO 3 El gen i nterrumpido

do o en el remolque 3' no traducido pueden tener consecuencias reguladoras, pero se crea Ia misma protefna. En otros casos, un exon es sustituido por otro, como se indica en la En este ejemplo, las protefnas produddas por los dos RNAm contienen secuencias que se superponen extensamente pero que son diferentes en la region alterna de corte y empalme. La mitad 3' del gen de Ia troponina T del musculo de Ia rata contiene cinco exones, pero solo cuatro se utilizan para constituir un RNAm individual y tres, WXZ, son los mismos en ambos patrones de expresi6n. No obstante, en uno de estos, el exon a es empalmado entre X y Z y en el otro se utiliza el ex6n ~, de modo que las formas a y ~ de la troponina T difieren en la secuencia de aminoacidos presente entre las secuencias W y Z, dependiendo del ex6n alterno utilizado, a o ~; cualquiera de ellos puede usarse para formar un RNAm individual, pero ambos no pueden estar en el mismo. En la I " 7 es un ejemplo en el cual el empalme alternativo provoca Ia inclusion de un ex6n en algunos RNAm, mientras que lo deja fuera de otros. A partir del gen se forma un solo tipo de transcrito, pero este puede ser empalmado en cualquiera de las dos formas. En la primera ruta, se desempalman dos intrones y los tres exones se unen en tre sf, en tanto que en la segunda, el segu ndo ex6n no es reconocido, de tal forma que un solo intr6n largo es desempalmado. Este intron esta formado por el intron l + el exon 2 + el intr6n 2. En efecto, el ex6n 2 ha sido tratado en esta ruta como parte del intr6n individual. Estas ru tas producen dos protefnas iguales en los extremos, pero una tiene una secu encia adicional en la mitad, por lo tanto, la region del DNA codifica a mas de una protefna. (Otros tipos de combinaciones producidas por empalme a lternativo se analizan en Ia secci6n 26.12,

Ex6n 3

l

IJVb'J - 'H Sfntesis de RNA

S61o los intrones son desempalmados 3'

5'

3' RNAm

N

Los tres exones estan en Ia protefna larga Los intrones + ex6n 2 son desempalmados 3'

5'

3' RNAm

5'

En Ia protefna coria s61o estan ex6n 1 + ex6n 3 El corte y empalme alternative utiliza el mismo pre-RNAm para generar moleculas de RNA con combinaciones diferentes de exones.

El empalme alternativo involucra el uso diferencial de uniones de empalme.) En ocasiones dos rutas operan simultaneamente, en cuyo caso, cierta porci6n de RNA es empalmada en cada ruta, y en otras, las rutas son alternativas expresadas en condiciones diferentes, una en un tipo de celula y otra en otro. Asf pues, el empalme alternativo o (diferencial) puede generar protefnas con secuencias superpuestas de un solo fragmento de DNA. Es curiosa que el genoma eucari6tico superior sea extremadamente espacioso y tenga genes grandes que con frecuencia estan muy dispersos y que a! mismo tiempo forme multiples productos a partir de un locus individual. El empalme alternativo expande el numero de protefnas relativo al numero de genes por -15% en las moscas y en los gusanos, pero tiene efectos mucho mayores en el hombre, en el cual, -60% de los genes puede tener formas alternas de expresi6n (vease la Secci6n 5.5, El genoma humano tiene menos genes que los esperados). Aproximadamente el 80% de los eventos de empalme alternativo resultan en cambios de la secuencia proteinica.

Ill

(C6m o evolucion aron los genes i nterrum pidos?

Conceptos principales • La interrogante principal al respecto es si los genes se originaron como secuencias interrumpidas por intrones o si originalmente eran moleculas ininterrumpidas. • Probablemente la forma original de la mayoria de los genes codificadores de proteinas fue la interrumpida, si bien en un principia los genes interrumpidos que codifican al RNA pudieron haber sido moleculas ininterrumpidas. • Una clase especial de intrones es m6vil y puede insertarse en los genes.

La estructura ampliamente interrumpida de los genes de las eucariotas sugiere una imagen similar a un mar de intrones (casi todos unicos en secuencia, pero no exclusivamente), en el que las islas de exones (en ocasiones muy cortos) estan esparcidas en archipielagos individuales que representan a los genes. ,_;, Cual era la forma original de los genes que actualmente estan interrumpidos? 3.8 (C6mo evolucionaron los genes interrumpidos?

47

• En el modelo de los "intrones ancestrales" se propone que los intrones siempre han formado parte del gen. Los genes se originaron como estructuras interrumpidas, y los que carecen de intrones los han perdido en el curso de la evoluci6n. • En el modelo de los "intrones adquiridos" se propone que las unidades ancestrales codificadoras de protefnas estaban formadas por secuencias continuas de DNA y que los intrones fueron insertados posteriormente. Para poner a prueba los modelos se debe preguntar si Ia diferencia entre los genes eucari6ticos y los procari6ticos puede ser explicada por la adquisici6n de intrones en el primer caso o por Ia perdida de los mismos en el segundo. El modelo de los "intrones ancestrales" sugiere que Ia estructura de mosaico de los genes es un remanente del antiguo enfoque de Ia reconstruccion de estos para crear nuevas protefnas. Supongase que una celula ancestral tenia cierto numero de secuencias codificadoras de proteinas separadas: es probable que un aspecto de su evolucion haya sido Ia reorganizaci6n y yuxtaposicion de unidades polipeptfdicas diferentes para crear nu evas protefnas. Si Ia unidad codificadora de protefnas debe ser una serie continua de codones, cada reconstrucci6n requerira de una recombinacion precisa de DNA para colocar an1bas unidades codificadoras de proteinas en registro, extremo con extremo, en el mismo marco de lectura. Ademas, si esta combinacion noes exito-

sa, Ia celula ha sufrido algun daiio porIa perdida de las unidades originales codificadoras de proteinas. Si en una recombinacion aproximada del DNA se pudiera colocar a las dos unidades codificadoras de protefnas en la misma unidad de transcripcion, se podrfan probar patrones de corte y empalme en el nivel del RNA para combinar las dos proteinas en una sola cadena polipeptfdica. Si estas combinaciones no tienen exito, las unidades originales de codificacion de protefnas siguen disponibles para pruebas posteriores. Dicho enfoque permite esencialmente que Ia celula intente deleciones controladas en el RNA sin sufrir Ia posible inestabilidad dafiina de aplicar el procedimiento a! DNA. Este argumento se apoya en el hecho de que podemos encontrar exones relacionados en genes diferentes, como si el gen hubiera sido ensamblado mezclando y apareando exones (vease Ia seccion 3.9, Algunos exones pueden eq uipararse con funciones protefnicas). En Ia _ se ilustra lo que sucede cuando en el genoma una secuencia aleatoria que incluye a exon es translocada a una nueva posicion. Los exones son muy pequefios respecto de los intrones, de modo que es probable encontrar el exon dentro de un intr6n. Para el corte y empalme solo se necesitan las secuencias de las uniones entre exon e intron, de modo que es probable que el exon sea flanqueado por zonas de union 3' y 5' funcionales, respectivamente. Las zonas de union son reconocidas en pares, por lo tanto, es probable que la zona de union 5' del intron original interactue con Ia

Los intrones son mucho mas largos que los exones Zona de union 5'

Zona de union 3'

.1-::exorr

. I

exon intion

~ intron

intion

La secuencia que incluye a un ex6n se transloca a un sitio diana aleatoric intr6n

ex6n

intron

~

.~

L

intion

intion

RNA

l

intion

~ intr6n

Un ex6n rodeado de secuencias flanqueantes, translocado en el interior de un intr6n, puede ser empalmado en el producto de RNA.

48


zona de union 3' introducida por el exon nuevo, y no con su compafiero original. De forma simi lar, Ia zona de union 5' del nuevo exon interactuara con Ia zona de union 3' del intron original. El resultado es la insercion del nuevo exon en el producto de RNA entre los dos exones originales. Siempre y cuando el nuevo exon se encuentre en el mismo marco de lectura que los exones originales, se producira una nueva secuencia protefnica . Este tipo de evento pudo haber generado nuevas combinaciones de exones durante Ia evolucion. Notese que su principia es imitado por la tecnica de captura de exones que se utiliza para identificar a los exones funcionales (vease Ia Figura 4 .11). En ocasiones se encuentran formas alternas de genes de RNAr y RNAt, con y sin intrones. En el caso de los RNAt, en los cuales todas las moleculas estan conformadas porIa misma estructura general, parece poco probable qu e Ia evolucion haya reunido a las dos regiones del gen, despues de todo, las diferentes regiones participan en el apareamiento de bases que da importancia a Ia estructura, de modo que, en este caso, los intrones debieron haber sido insertados en genes continu os. Los genomas de los organelos proporcionan algunas conexiones notables entre el mundo de las procariotas y el de las eucariotas. Hay m uchas similitudes generales entre las mitocondrias o los cloroplastos y las bacterias, por ello, parece probable que los organelos se originaron en una endosimbiosis en Ia cual un prototipo bacterian o ancestral fue insertado en el citoplasma eucariotico. Sin embargo, a diferencia de las similitudes con Ia bacteria, por ejemplo, como se conserva en Ia sfn tesis protefnica o del RNA, algunos genes de organelos poseen inu·ones y por lo tanto se asemejan a los genes nucleares e ucarioticos. En muchos gen es de los cloroplastos se encuentran intrones, incluidos algunos homologos de los genes de Ia E. coli, io cual su giere que el evento endosimbiotico ocurrio antes de que la linea pro cari6tica perdiera los intrones. Si se encuentra u n gen adecuado, serfa posible rastrear ellinaje genico h asta al periodo en que ocurrio Ia endosimbiosis. El genoma mitocondrial es u n caso particularmente sorprendente. Los genes de las mitocondrias de las levaduras y de los mamfferos codifican protefnas mitocondriales virtualmente identicas, pese a una diferencia considerable en Ia organizacion genica. Los genomas mitocon driales de los vertebrados son muy pequefios, con una organizaci6n de genes ·continuos extremadamente compacta, mientras que los genomas mitocondria les de las levaduras son mas grandes y tienen algunos genes complejos interrumpidos (. Cual es Ia forma ancestral? Los in-

trones mitocondriales de las levaduras (y algunos otros intrones) pueden tener como propiedad Ia movilidad, son secuencias autonomas que pueden desempalmarse del RNA e insertar capias de DNA en cua lquier otra parte, lo cual sugiere que podrfan haber surgido por inserciones en el genoma (vease Ia seccion 27.5, Algunos intrones del grupo I codifican a en donucleasas que promueven la movilidad y Ia 27 .6, Los intrones del grupo II pueden codificar protefnas multifuncionales).

Ill

Algunos exones pueden equipararse con funciones prote1nicas

Conceptos principales • Lo que sugiere que los exones fueron las unidades basicas de la evoluci6n y que los primeros genes fueron interrumpidos en lo siguiente: • La estructura genica es igual entre genes de especies muy distantes. • Muchos exones pueden ser equiparados con secuencias codificadoras de prote\nas que tienen funcio nes espec\ficas. • En genes diferentes se encuentran exones relacionados.

Silas protefnas actuales evolucionaron a! combinar protefnas ancestrales que originalmente fueron independientes, es probable que Ia acrecion de unidades haya ocurrido de manera secuencial en algun periodo, agregandose un exon a Ia vez (.ES posible ver las diferentes funciones por las que estos genes fu eron incrustados en sus estructuras presentes? En otras palabras, (_podemos equiparar funciones especfficas de protefnas actuales con determinados exones? En algunos casos hay una clara relaci6n entre las estructuras del gen y de Ia protefn a; el ejemplo por excelencia es el de las protefnas inmunoglobulinas, las cuales son codificadas por genes en los cuales cada exon corresponde exactamente a un dom.i nio funcional conocido de la protefna. En Ia se compara la estructura de una inmunoglobulina con su gen. Una inmunoglobulina es un tetramero formado por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas unidas para formar una protefna con numerosos dominios distintos. Las cadenas ligeras y las pesadas difieren en cuanto a estructura, y hay numerosos tipos de cadenas pesadas, y cada tipo es expresado desde un gen cuya serie de exones corresponde a los dominios estructurales de la protefna. 3.9 Algunos exones pueden equiparse con funciones proteinicas

49

. . .. .

ex6n L

ex6n V-J

-

.

ex6n C

Cadena ligera Uder

Variable

Constante Bisagra Constante 2 Constante 3

Dominios proteinicos

Cadena pesada

ex6n L

ex6nV-D-J

ex6n C1

ex6n bisagra

ex6n C2

ex6n C3

r Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de La inmunoglobulina son codificadas por genes cuyas estructuras (en sus formas expresadas) corresponden a los distintos dominios de La proteina. Cada dominio proteinico corresponde a un ex6n; los intrones van numerados del 1 al 5. En muchos casos, algunos de los exones de un gen pueden identificarse con funciones espedficas. En proteinas secretoras, el primer ex6n, que codifica ala region terminal N del polipeptido, con frecuencia espedfica ala secuencia sefial implicada en lasecrecion membranosa, por ejemplo en la insulina. La perspectiva de que los exones son las unidades basicas funcionales de los genes esta respaldada por casas en que dos genes pueden tener exones relacionados entre sf, mientras que otros se encuentran solo en uno de los genes. En la seresume la relacion entre el receptor de la lipoproteina de baja densidad (LD L, plasma low density lipoprotein) y otras proteinas. En el centro del gen receptor de la LDL se encuentra una serie de exones relacionados con los exones del gen para el precursor del factor de crecimiento epidermico (EGF, epidermal growth factor). En Ia region terminal N de Ia proteina, una serie de exones codifica a una secuencia relacionada con la protefna sangufnea del factor del complemento C9, de modo que el gen del receptor de la LDL se creo ensamblando m6dulos para sus diversas funciones. Estos modulos tambien son utilizados en combinaciones diferentes en otras protefnas. Los exones tienden a ser bastante pequefios (vease Ia Figura 4.11), aproximadamente del tamafio del polipeptido mas pequefio susceptible de asumir una estructura plegada estable (-20 a 40 residuos). Quiza las protefnas fueron ensambladas originalmente a partir de modulos mas bien pequefios. Cada modulo no necesariamente debe corresponder a una funcion actual, varios podrian haberse combinado para generar una funci6n. El numero de exones de 50


. -.. Receptor de LDL Homolog fa del complemento C9

Homologfa del precursor del EGF

Precursor del EGF El gen del receptor de La LDL esta formado por 18 exones, algunos de los cuales estan relacionados con los exones del precursor del EGF y otros con el gen del complemento sanguineo C9. Los triangulos marcan las posiciones de los i ntrones.

un gen tiende a incrementarse con la longitud de su proteina, lo cual concuerda con Ia perspectiva de que las protefnas adquieren multiples funciones agregando sucesivamente los modulos apropiados. Esta idea explicaria otra caracteristica de la estructura de las proteinas. Aparentemente los sitios representados en las fronteras exon-intr6n con frecuencia se localizan en la superficie de una protefna. Conforme se agregan modulos a una proteina, las conexiones, cuando menos las de los modulos agregados mas recientemente, su·elen tener Ia tendencia a localizarse en Ia superficie.

Ell

Los de una familia de genes tienen una organizaci6n comun

,

.

•

•

•

I

•

I

::

•

•

.

.

Dominio de union al grupo hemo

I

Glob ina

Conceptos principales • Se supone que una caracteristica comun de una agrupaci6n de genes identifica una propiedad que antecede a la separaci6n durante la evoluci6n. • La forma comun de organizaci6n de todos los genes de globina, tres exones y dos intrones, sugiere que descienden de un solo gen ancestral.

Muchos de los genes de un genoma eucariotico superior estan relacionados con otros del mismo genoma. Una familia de genes puede definirse como un grupo de genes que codifican a proteinas identicas o relacionadas; Ia familia se origina a! duplicarse un gen. Inicialmente, las dos copias son identicas, pero despues divergen, conforme se acumulan mutaciones en elias. Las duplicaciones posteriores y la divergencia hacen aun mas extensa Ia familia. Los genes de Ia globina son un ejemplo de una familia que puede dividirse en dos subfamilias (globina a y globina ~), aunque todos sus tienen la misma estructura basica y la misma funcion. El concepto puede ampliarse mas cuando se encuentran genes relacionados de forma mas distante pero cuyo ancestro comun aun puede reconocerse; en este caso, se considera que un grupo de farnilias de genes forma una superfamilia. Las globinas a y ~. y otras dos protefnas relacionadas con elias, constituyen un caso fascinante de conservacion evolutiva. La mioglobina es una proteina monomerica que se liga a! oxfgeno, esta presente en los animales y su secuencia de aminoacidos sugiere un origen comCm (aunque antiguo) con las subunidades de la globina. Las leghemoglobinas son proteinas que se unen al oxfgeno y que se encuentran en las legumbres; igual que la rnioglobina, son monomericas. Ademas, tambien comparten un origen comun con las otras protefnas de union al grupo hemo. Juntas, las globinas, la mioglobina y la leghemoglobina constituyen la superfamilia de la globina, grupo de familias de genes descendientes de algun ancestro (distante) comun. Los genes de Ia globina a y de la globina ~ tienen tres exones (vease la Figura 3.7). Los dos intrones estan en posiciones constantes respecto de la secuencia codificadora. El exon central representa al dominio de union al grupo hemo de la cadena de globina. En el genoma humano, la mioglobina esta representada por un solo gen cuya estructura es esencialmente la rnisma que lade los genes de la globina, de modo que Ia estructura de tres exones antecede

lntr6n extra

Leghemogloblna

I

El dominio esta dividido La estructura de los exones de los genes de globina corresponde a la funci6n prote1nica, pero la leghemoglobina tiene un intr6n extra en el dominio central.

ala evolucion de las funciones separadas de la mioglobina y de la globina. Los genes de la leghemoglobina contienen tres intrones, de los cuales, el primero y el ultimo se presentan en puntos de Ia secuencia codificadora homologos a las localizaciones de los dos intrones de los genes de globina. Esta notable similitud sugiere un origen extremadamente antiguo de las proteinas de union al grupo hemo en forma de un gen dividido, como se ilustra en Ia El intron central de Ia leghemoglobina separa dos ex ones que juntos codifican a Ia secuencia correspondiente al exon central individual de Ia globina 2,Pudo el exon central del gen de Ia globina haber sido derivado de una fusion de dos exones centrales del gen ancestral? (, 0 es el ex on individual centralia forma ancestraL en este caso, un intron que debio haber sido insertado en el al inicio de la evolucion de la planta? Los casos en que la estructura de genes homologos difiere, podrian proporcionar informacion acerca de su evolucion, por ejemplo, Ia insulina. Los mamfferos y las aves tienen solo un gen para codificar insulina, excepto los roedores, que tienen dos. En la se ilustran las estructuras de estos genes. El principia que se utiliza para comparar la organizacion de genes relacionados en especies diferentes consiste en que una caracterfstica connAn identifica a una estructura que precedi6 a la separaci6n evolutiva de las dos especies. En los pollos, el gen unico de Ia insulina tiene dos intrones; uno de los dos genes de la rata tiene la misma estructura. La estructura comun implica que el gen ancestral de la insulina tenia dos intrones, sin embargo, el segundo gen de las ratas tiene solo uno, de modo que debe haber evolucionado por una duplicacion genica en los roedares seguida de la elirninacion precisa de un intron de una de las copias. La organizacion de algunos genes muestra discrepancias considerables entre especies, en cuyo

3.10 Los de una familia de genes tienen una organizaci6n comun

51

caso, la eliminacion o insercion de intrones durante Ia evolucion debio haber sido intensa. Un caso bien caracterizado son los genes de la actina. El tfpico gen de la actina tiene un lider no traducido de < 100 bases, una region codificadora de -1200 bases y un remolque de -200 bases. La mayoria de los genes de Ia actina son interrumpidos; las posiciones de los intrones pueden alinearse de acuerdo con Ia secuenda codificadora (excepto por un unico intron que en ocasiones se encuentra en ellfder) . En la se observa que el patron de interrupciones de casi todos los genes de la actina es diferente, y agrupando a todos los genes, los intrones ocurren en 19 sitios diferentes. Sin embargo, ningun gen tiene mas de seis intrones, algunos solo tienen uno y uno de ellos es completamente continuo (,Como surgio esta situacion? Si suponemos que el gen primordial de la actina era interrumpido,

y que todos los genes de la actina estan relacionados con el por perdida de intrones, en cada rama evolutiva se han perdido intrones diferentes. Probablemente algunos se han perdido por completo, de modo que el gen primordial pudo bien haber tenido 20 o mas. La alternativa es suponer que un proceso de insercion de intrones continuo de manera independiente en las diferentes lineas de evolucion. En ultima instancia, Ia relacion entre las localizaciones de los intrones en diferentes especies puede utilizarse para construir un arbol de Ia evolucion del gen. La relacion entre los exones y los dominios de protefnas es un tanto erratica; en ciertos casos es clara mente de 1: I y, en otros, no es posible discernir un patron. Una posibilidad es que porIa eliminacion de intrones se han fusionado los exones adyacentes, lo cual significa que el intron debio haber sido eliminado de forma precisa, sin modificaci6n oe Ia integridad de la region codificadora. Una alternativa es que algunos intrones surgieron por inserci6n en un dominio coherente. Ademas de las variaciones observadas en Ia colocaci6n de los exones en casos como el de los genes de la actina, esto sugiere que las posiciones de los intrones pueden ser ajustadas en el curso de la evoluci6n. La ecuad6n de cuando menos algunos exones con los dominios de proteinas y Ia aparici6n de exones reladonados en protefnas diferentes, no deja duda de que la duplicaci6n y Ia yuxtaposid6n de exones ha desempefi.ado un papel in1portante en Ia evolud6n. Es posible que el numero de exones ancestrales, de los cuales se han derivado todas las protefnas por duplicaci6n, variaci6n y recombinaci6n, sea relativamente pequefio (algunos miles o decenas de miles). Considerando al ex6n como unidad fundamental de Ia evoluci6n, desde esta perspectiva se acepta impli-

Gen comun de Ia insulina (pol los y ratas) Ex6n Ex6n · lfder lntr6n codificador

Ex6n lfder lntr6n

lntr6n

1

Ex6n codificador

• • • •>- Deleci6n del intr6n

Ex6n codificador

Segundo gen de insulina de Ia rata El gen de la insulina de la rata, el cual cuenta con un intr6n, evolucion6 par la perdida de un intr6n de un ancestro con dos intrones.

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A2 Erizo de mar C J Musculo de polio Musculo de rata Citoplasma de rata Musculo lisa humano Musculo cardiaco humano Frijol de soya

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S.pombe S. cerevisiae Acanthamoeba Thermomyces C. elegans D. melanogaster A6

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Los genes de la actina varian ampliamente en cuanto a organizaci6n. Los sitios de los intrones se indican en tono mas oscuro.

52


citamente el modelo de los intrones ancestrales como origen de los genes que codifican proteinas.

(_Se encuentra toda la inform acion genetica contenida en el DNA? Conceptos principales • La definicion del gen se ha invertido, de "un gen : una proteina" a "una proteina : un gen". • La informacion sobre la posicion tambien es importante en el desarrollo .

El concepto del gen ha evolucionado significativamente en los ultimos anos . La interrogante respecto de que hay en un nombre es especialmente apropiada para el gen. Ya no podemos aseverar que este sea una secuencia de DNA qu e codifica continua y {micamente a una protefna en particular. En situaciones en las que un fragm ento de DNA es responsable de la produccion de una protefna especifica, hoy dfa se considera que la secuencia entera de DNA -desde el primer punta representado en el RNA mensajero hasta el {lltimo correspondiente a su extrema- comprende a! "gen", los exones, los intrones y todo lo demas. Cuando las secuencias que representan a protefnas se superponen o tienen formas alternas de expresion, es posible revertir la descripcion comun del gen, y en vez de decir "un gen-un polipeptido", podemos describir ala relaci6n como "un polipeptido-un gen", de modo que se considera ~ _Ia secuencia responsable de hecho de la produccwn del polipeptido (incluidos intrones y exones) como productora del gen, al mismo tiempo que se acepta que desde la perspectiva de otra proteina, parte de esta rnisma secuencia tambien pertenece a su gen. Esto permite el usa de descripciones como genes "superpuestos" o "alternativos". Ahara podemos ver que tan lejos se ha llegado desde la hipotesis original de un gen:una enzima . Basta ese momenta, la pregunta fundamental se relacionaba con la naturaleza del gen, pero una vez que se descubrio que los genes representan a proteinas, el paradigma se establecio como el concepto de que cada unidad genetica funciona a traves de la sfntesis de una protefna especifica. Este punta de vista sigue siendo el paradigma central de la biologia molecular: una secuencia de DNA funciona codificando directamente a una proteina en particular o porque es necesaria para el uso de un segmento adyacente que codifica realmente a Ia proteina (.Que tan lejos nos !leva este paradigma

aparte de explicar la relacion basica entre los genes y las proteinas? El desarrollo de organismos multicelulares se sustenta en el usa de genes diferentes para generar los diversos fenotipos celulares de cada tejido. La expresion de los genes depende de una red reguladora que asume la forma de una cascada. La expresion del primer conjunto de genes al principia del desarrollo embrionario conduce a la expresion de los genes implicados en la siguiente etapa de desarrollo, y asf sucesivamente, hasta que todos los tejidos del adulto son funcionales. La naturaleza molecular de esta red reguladora es en gran medida desconocida, pero suponemos que consiste en genes que codifican a productos (probablemente proteinas, quiza en ocasiones RNA) que actuan sabre otros genes. Si bien es casi seguro que dicha serie de interacciones es el media par el cual se ejecuta el programa de desarrollo, es posible preguntarse si es suficiente. Una pregunta especifica concierne ala naturaleza y la funcion de la informacion posicional. Sabemos que no todas las partes de un ovulo fertilizado son iguales; una de las caracteristicas responsables del desarrollo de diferentes partes de tejidos de distintas reaiones del ovulo es Ia localizacion de la informao cion (presumiblemente macromoleculas especfficas) dentro de la celula. Desconocemos como se forman esas regiones particulares, pero se puede especular que la existencia de la informacion posicional en el ovulo conduce a la expresion diferencial de los genes en las celulas formadas despues en estas regiones. Esto conduce al desarrollo del organismo adulto, lo cual a su vez da Juaar al desarrollo de un ovulo con la informacion b posicional apropiada . Esta posibilidad incita a preguntar si informacion necesaria para el desarrollo de organism as esta contenida en una forma que no pueda ser atribuida directamente a una secuencia de DNA (aunque la expresi6n de secuencias particulares puede ser necesaria para perpetuar la informacion posicional) . De una manera mas general, es posible preguntar lo siguiente: cuando leemos la secuencia completa de DNA que comprende al genoma de algun organismo y la interpretamos en funcion de protefnas y regiones reguladoras, (.Se podrfa, en principia, construir un organism a (o incluso una sola celula viviente) por media de la expresion controlada de los genes adecuados?

IEID

Resumen

Todos los tipos de genomas eucarioticos contienen genes interrumpidos. La proporcion de estos es baja 3.12 Resumen

53

en las levaduras y se incrementa en las eucariotas inferiores; en las eucariotas superiores son pocos los genes continuo s. Los intrones se encuentran en todas las clases de genes eucari6ticos. La estructura del gen interrumpido es la misma en todos los tejidos: en el RNA, los exones se unen en el mismo orden en que est
Referencias

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Un gen interrumpido esta formado por intrones y exones

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54


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La organizaci6n de los genes interrumpidos puede ser conservada

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Algunos exones pueden ser equiparados con funciones proteinicas

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El contenido del genoma ESQUEMA DEL

-

-

.a

CAPITU ~

• El polimorfismo puede ser detectado en el nivel fenotipico cuando una secuencia afecta a La funci6n genica, en el de los fragmentos de restricci6n cuando afecta a un sitio diana de una enzima de restricci6n y en el secuencial por analisis directo del DNA. • Los alelos de un gen muestran un amplio polimorfismo en el nivel secuencial, pero muchos cam bios de secuencia no inciden en La funci6n.

Los genomas eucari6ticos contienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitivas • La cinetica de la reasociaci6n del DNA despues de que un genoma ha sido desnaturalizado disti ngue a las secuencias por la frecuencia con se repiten en el genoma . • En el DNA no repetitive, los genes generalmente son codificados por secuencias localizadas. • Los genomas mas grandes de un file no contienen mas genes, pero tienen cantidades mayores de DNA repetitive. • Gran parte del DNA repetitive puede estar formada por transposones.

-

011

Los genes pueden ser aislados por la conservaci6n de los exones • La conservaci6n de los exones puede ser utilizada como base para localizar regiones codificadoras al identificar fragmentos cuyas secuencias estan presentes en multiples organismos.

Los organelos contienen DNA • Las mitocondrias y los cloroplastos tienen genomas cuya herencia es no mendeliana; t1picamente son heredados de la madre. • Los genomas de los organelos pueden ser sometidos a segregaci6n somatica en las plantas . • Las comparaciones del DNA mitocondrial sugieren que los humanos descienden de una sola hembra, la cual vivi6 hace 200 000 aiios en Africa.

Bl!l

(.Por que los genomas son tan grandes? • No hay una buena correlaci6n entre el tamafio del genom a y la complejidad genetica. • Hay un incremento en el tamafio m1nimo del genoma necesario para formar organismos de mayor complejidad. • En numerosos filos, las dimensiones de los genomas de los organismos varian ampliamente.

Rill

• Los algoritmos para identificar genes no son perfectos, de modo que son necesarias numerosas correcciones al conjunto inicial de datos. • Los seudogenes deben distinguirse de los genes actives. • Hay amplias relaciones sintenicas entre los genomas del raton y los del humano, y la mayoria de los genes activos se encuentran en una region sintenica.

Los RFLP y los SNP pueden ser utilizados para el mapeo gen€tico • Los RFLP y los SNP pueden constituir la base de los mapas de ligamiento; permiten establecer relaciones entre progenitores y su progenie.

-

La conservaci6n de la organizaci6n del genoma ayuda a identificar genes

Introducci6n Pueden trazarse mapas de los genomas por ligamiento, restricci6n, division o secuencia de DNA Los genomas individuales son muy variables

Los genomas de los organelos son moleculas circulares de DNA que codifican prote\nas de los organelos • Los genomas de los organelos suelen ser moleculas circulares de DNA (pero no siempre). • Los genomas de los organelos codifican algunas de las proteinas que se encuentran en el organelo, pero no a todas.

HD La organizaci6n del DNA mitocondrial es variable • El DNA mitocondrial de las celulas ani males es extremadamente compacto y suele codificar a 13 proteinas, dos moleculas de RNAr y 22 de RNAt. • El DNA mitocondrial de las levaduras es cinco veces mas largo que el DNAmt de las celulas animales por la presencia de intrones largos.

gg

El genoma de los cloroplastos codifica a numerosas prote\nas y moleculas de RNA • Los genomas de los cloroplastos varian en cuanto a tamafio, pero son lo suficientemente grandes como para codificar de 50 a 100 proteinas, asi como a los RNAr y a los RNAt.

1110

RBI

Las mitocondrias evolucionaron por endosimbiosis Resumen

55

al

Introducci6n

La pregunta crucial sabre el genoma es cuamos genes contiene. Se puede pensar acerca del numero total de genes en cuatro niveles, los cuales corresponden a etapas sucesivas de la expresion genica: • El genoma es el conjunto completo de los genes de un organismo. En ultima instancia se define por la secuencia completa de DNA, aunque por una cuestion practica podrfa no ser posible identificar cada gen inequfvocamente solo con base en la secuencia. • El transcriptoma es el conjunto completo de los genes expresados en determinadas condiciones. Se define en funcion del conjunto de moleculas de RNA presente y puede referirse a un solo tipo de celula, a cualquier ensamble de celulas mas complejo o al organismo completo. Debido a que algunos genes generan multiples moleculas de RNAm, es probable que el transcriptoma sea mayor que el numero de genes definidos directamente en el genoma. El transcriptoma incluye a las moleculas de RNA no codificadoras, asf como a las moleculas de RNAm. • El proteoma es el conjunto completo de protefnas. Debe corresponder a las moleculas de RNAm del transcriptoma, aunque puede haber diferencias de detalle que reflejen cambios de la abundancia relativa o la estabilidad de las moleculas de RN Am y de las protefnas. Puede ser utilizado para referirse a! conjunto de protefnas codificadas por todo el genoma o producidas en cualquier celula 0 tejido especfficos. • Las protefnas pueden funcionar de manera independiente o como pane de ensambles de multiples proteinas. Si fuera posible identificar todas las interacciones entre protefna y protefna, se podria definir el numero total de ensambles independientes de protefnas. El numero de genes del genoma puede ser identificado directamente al definir marcos de lectura abiertos. El mapeo de esta naturaleza a gran escala es complicado porque los genes interrumpidos pueden estar formados por numerosos marcos de lectura abiertos separados. No necesariamente tenemos informacion acerca de las funciones de los productos protefnicos, o de hecho, una prueba de que lleguen a expresarse, de modo que este abordaje se restringe ala definicion del potencial del genoma. Sin embargo, se preswne con relativa certeza que cualquier marco de lectura abierto conservado probablemente llegue a expresarse. Otro abordaje consiste en definir el numero de genes directamente en funcion del transcriptoma (identificando directamente todas las moleculas de RNAm) o del proteoma (identificando directamente 56

CAPITULO 4 El contenido del genoma

todas las protefnas). Esto proporciona la seguridad de que se nata con genes autenticos que se expresan en drcunstancias conoddas y permite investigar cuantos genes son expresados en un tipo de celula o un tejido particular, que variacion existe en los niveles relativos de expresion y cuantos de los genes expresados en una celula particular son unicos de esa celula 0 tambien son expresados en alguna otra parte. Respecto de los tipos de genes, podemos preguntar si alguno en particular es esencial: e,que le sucede a un mutante nulo? Si una mutacion nula es leta!, o el organismo presenta un defecto visible, podemos concluir que el gen es esencial o que a! menos transfiere una ventaja selectiva, pero algunos genes pueden ser suprimidos sin un efecto aparente en el fenotipo c_Son estos genes realmente prescindibles, o resulta una desventaja selectiva por Ia ausencia del gen, quizas en otras circunstancias, 0 en periodos mas largos?

1f1

Pueden trazarse mapas de los genomas por ligamiento, po r restricci6n, por division ~ por secuencia de DNA

Definir esencialmente el contenido de un genoma significa trazar un mapa de genes y genomas en muchos niveles de resolucion: • Mediante un mapa genetico (ode ligamiento) se identifica la distancia entre mu taciones en cuanto a frecuencias de recombinadon. Lo limita su dependencia en la ocurrencia de mutaciones que afectan al fenotipo . Debido a que las frecuencias de recombinacion pueden distorsionarse respecto de la distancia ffsica entre los sitios, no representa con precision distancias fisicas a lo largo del material genetico. • Un mapa de ligamiento puede construirse midiendo la recombinacion entre sitios en el DNA genomico. Estos sitios tienen variaciones secuenciales que generan diferencias en la susceptibilidad de division por ciertas enzimas (de restriccion); como dichas variaciones son comunes, es posible hacer un mapa de ligamiento para cualquier organismo, a pesar de la ocurrencia de mutantes. Su desventaja es la misma para cualquier mapa de ligamiento, es decir, que las distancias relativas se basan en la recombinacion. • Un mapa de restriccion se construye dividendo el DNA en fragmentos con enzimas de restriccion y midiendo las distancias entre los sitios de division. Este mapa representa distancias en cuanto a longitud del DNA, por lo tanto, proporciona un mapa ffsico del

material genetico. Con un mapa de restriccion no se identifican intrfnsecamente los sitios de interes genetico, para relacionarlo con el mapa genetico, las mutaciones de ben ser caracterizadas en funcion de sus efectos en los sitios de restriccion. Pueden reconocerse grandes cambios en el genoma porque afectan a dimensiones 0 el numero de fragmentos de restriccion. Las mutaciones puntuales son mas diffciles de detectar. • El ultimo mapa permite determinar la secuencia del DNA. A partir de la secuencia se identifican los genes y las distancias entre ellos. Al analizar el potencial de codificacion de protefnas de una secuencia de DNA se puede deducir si representa a una protefna, en cuyo caso, la conjetura basica es que la seleccion natural impide la acumulacion de mutaciones dafiinas en las secuencias que codifican protefnas. Invirtiendo el argumento, se puede suponer que es probable que una secuencia codificadora intacta sea utilizada para formar protefna. Al comparar la secuencia de un DNA de tipo silvestre con lade un alelo mutante, es factible determinar la naturaleza de una mutacion y el sitio exacto en que aparecera. Esto define la relacion entre el mapa genetico (el cual se bas a completamente en los sitios de mutacion) y el mapa fisico (basado en la secuencia del DNA incluso puede estar formado por esta). Tecnicas similares son utilizadas para identificar y secuenciar genes y para trazar mapas del genoma, aunque por supuesto hay una diferencia de escala. En cada caso, el principia consiste en obtener una serie de fragmentos superpuestos de DNA que puedan ser conectados en un mapa continuo. La caracterfstica clave consiste en que cada segmento esta relacionado con el siguiente segmento en el mapa caracterizando la superposicion entre ellos, de tal forma que podemos estar seguros de que no faltan segmentos. Este principia es aplicado para ordenar grandes fragmentos en un mapa y para conectar las secuencias que constituyen a los fragmentos.

Dl

Los geno mas in di vidua les son muy variab les

Conceptos principales • El polimorfismo puede ser detectado en el nivel fenotlpico cuando una secuencia afecta a la funci6n genica, en el de los fragmentos de restricci6n cuando afecta a un sitio 'diana de una enzima de restricci6n y en el secuencial por analisis directo del DNA. • Los alelos de un gen muestran un amplio polimorfismo en el nivel secuencial, pero muchos cambios de secuencia no inciden en la funci6n.

En la perspectiva mendeliana original del genoma, los alelos se clasificaban como silvestres o mutantes; posteriormente se aceptola existencia de alelos multiples, cada uno con un efecto diferente en el fenotipo. En algunos casos, incluso podria no ser apropiado definir algun alelo como de "tipo silvestre". La coexistencia de alelos multiples en un locus se denomina polimorfismo genetico. Por definicion, cualquier sitio en el cual existen alelos multiples como componentes estables de la poblacion es polimorfico. Un alelo suele ser definido como polimorfico si su frecuencia en la poblacion es de > l por ciento. (. Cual es la base del polimorfismo entre los alelos mutantes? Poseen diferentes mutaciones que modifican la funcion proteinica, produciendo cambios en el fenotipo. Si se comparan los mapas de restriccion de las secuencias de DNA de estos alelos, estos tambien seran polimorficos, en el sentido de que cada mapa o secuencia sera diferente de los otros. Aunque no es evidente a partir del fenotipo, el tipo silvestre mismo puede ser polimorfico. Las versiones multiples del alelo de tipo Silvestre pueden distinguirse por diferencias secuenciales que no afectan a su funcion y que, por lo tanto, no producen variantes fenotfpicas. Una poblacion puede tener gran polimorfismo en el nivel del genotipo. En un locus determinado pueden existir muchas variantes de secuencia diferentes; algunas son evidentes porque afectan al fenotipo, pero otras estan ocultas porque su efecto no es visible. De manera que puede haber una sucesion de cambios en un locus, incluidos los que cambian la secuencia del DNA pero que no alteran la secuencia de la protefna, los que transforman la secuencia de la protefna sin afectar su funcion, los que crean proteinas con actividades diferentes y los que producen proteinas mutantes no funcionales. Cuando se comparan los alelos, un cambio en un solo nucleotido se denomina polimorfismo de un solo nucle6tido (SNP, single nucleotide polymorphism). Uno de estos cam bios se presenta cada -l 300 bases en el genoma humano. Definido por sus SNP, cada ser humano es unico. Los SNP pueden ser detectados por diversos medios, desde comparaciones directas de secuencia hasta metodos bioqufmicos o de espectroscopia de masas que producen diferencias basadas en variaciones de secuencia en una region definida. Un objetivo del mapeo genetico es obtener un catalogo de variantes comunes. La frecuencia observacia de SNP por genoma pronostica que, respecto de la poblacion humana en general (considerando la suma de todos los genomas humanos de todos los individuos vivientes), debe haber >10 millones de SNP que ocurren a una frecuencia de> 1 por ciento; ya se ha identificado > l mill on. 4.3 Los genomas individuates son muy variables

57

El DNA tiene 3 sitios diana en Ia region

La mutacion elimina un sitio diana

~ ~ ~ '\j · I "t

La division genera dos fragmentos internes

I "t

La division genera un fragmento

0\.'J. 7\)

interno

f\.~

fragmento A fragmento B

fragmento C

~

~

Electroforesis

--1 A

]

r

c

......- - - - - - ' · Fragmentos A + 8 combinadas= C

Una mutaci6n puntual que afecta a un sitio de restricci6n se detecta por una diferencia en los fragmentos de restricci6n.

A

F1

Progenitores 3 son heterocigotos 1 es homocigoto para C

8

B

C

c

B D

8

A

c

A 8

8

D

A B A C D B

AleloA

Alelo B Alelo C Alelo D

Los polimorfismos de los sitios de restricci6n se heredan segun las leyes de Mendel. Hay cuatro alelos para un marcador de restricci6n en todas las combinaciones de pares posibles; se segregan de forma independiente en cad a generaci6n. La fotografia es cortesia de Ray White, Ernest Gallo Clinic and Research Center, University of California, San Francisco.

Algunos polimorfismos del genoma pueden detectarse a! comparar los mapas de restriccion de individuos diferentes. El criteria es un cambia en el patron de fragmentos producidos por division con una enzima de restriccion. En Ia se muestra que cuando en el genoma de un individuo hay un sitio diana y en el de otro no, la division extra en el primer genoma generarc3. dos fragmentos que corresponden al fragmento individual del segundo genoma. El mapa de restriccion es independiente de la funcion genica, de modo que en este nivel, un po58

Los RFLP y los SNP pueden ser utilizados para el mapeo genetico

C 8

A

D

F2 hereda A o D de un progenitor, 8 o C del otro progenitor

13 C

limorfismo puede ser detectado a pesar de que el cambia de secuencia afecte alfenotipo. Probablemente muy pocos de los polimorfismos de los sitios de restriccion de un genoma realmente afecten al fenotipo, la mayoria implican cambios de secuencia que pueden no tener efecto en la produccion de proteinas (por ejemplo, debido a que se encuentran entre genes). Una diferencia en los mapas de restriccion de dos individuos es denominado polimorfismo de Ia longitud de los fragmentos de restriccion (RFLP, restriction fragment length polymorphism). Basicamente, un RFLP es un SNP localizado en el sitio diana de una enzima de restriccion que puede utilizarse como marcador genetico exactamente de Ia misma manera que cualquiera otro marcador. En vez de examinar alguna caracteristica del fenotipo, se evalua directamente el genotipo, como lo revela el mapa de restriccion. En Ia I se observa Ia genealogia de un polimorfismo de restriccion a traves de tres generaciones; exhibe segregacion mendeliana en los fragmentos de marcadores de DNA.


Concepto principal •

Los RFLP y los SNP pueden constituir la base de los mapas de ligamiento; permiten establecer relaciones entre progenitores y su progenie.

La frecuencia de recombinacion puede medirse entre un marcador de restriccion y un marcador fenotipico visible, como se ilustra en la , de tal manera que un mapa genetico puede incluir marcadores genotipicos y fenotipicos. Los marcadores de restriccion no se limitan a los cambios del genoma que afectan al fenotipo, de modo que proporcionan las bases para una tecnica extremadamente poderosa de identificaciof! de loci geneticos en el ambito molecular. Un problema tipico concierne a una mutacion con efectos conocidos en el fenotipo, en el cual ellocus genetico pertinente puede ser colocado en un mapa genetico, pero de !a cual se desconoce el gen o !a proteina correspondiente. Muchas enfermedades humanas dafiinas o fatales pertenecen a esta categoria. Por ejemplo, !a fibrosis quistica muestra herencia mendeliana, pero se desconocia la naturaleza molecular de !a funcion mutante hasta que se pudo identificar como resultado de la caracterizacion del gen. Silos polimorfismos de restriccion son aleatorios en el genoma, algunos de ben ocurrir cerca de un gen diana especifico. Dichos marcadores de restriccion se

• I

I

•

I

•

•

Cruza genetica

lnvestigaci6n de los patrones de DNA de los pacientes con Ia enfermedad

35%

1

!

35%

lnvestigaci6n de control de los patrones de DNA de las personas no afectadas

!

n

Tipos de progenitores

H--La banda es comun a los pacientes La banda es comun a todas las personas no afectadas Recombinantes

15%

Si un marcador de restricci6n es asociado con una caracteristica fenotipica, el sitio de restricci6n debe estar loca lizado cerca del gen responsable del fenotipo. La mutaci6n que cambia la banda comun a las personas sanas en la banda comun a los pacientes, esta muy intimamente relacionada con el gen de la enfermedad.

El marcador de restricci6n esta a 30 unidades de mapeo del marcador de color de ojos ~IG

Un polimorfismo de restricci6n puede ser utilizado como marcador genetico para medir la distancia de recombinaci6n a partir de un marcador fenotipico (como el color de los ojos). En la figura se simplifica la situaci6n mostrando s6lo las bandas de DNA que corresponden al alelo de un genoma en un diploide.

identifican gracias a su estrecha vinculacion con el fenotipo mutante. Si se compara el mapa de restriccion del DNA de pacientes que padecen una enfermedad con el DNA de personas sanas, podrfa encontrarse que, en los pacientes, siempre hay un sitio de restriccion en particular (o siempre esta ausente). En la se muestra un ejemplo hipon§tico que corresponde al descubrimiento de una vinculacion de 100% entre el marcador de restricci6n y el fenotipo, lo cual implicarfa que el marcador de restricci6n esta tan cerca del gen mutante, que o unca se separa de el por recombinacion. La identificaci6n de un marcador de tales caracrerfsticas tiene dos consecuencias importantes: • Puede ofrecer un procedimiento diagn6stico para detectar Ia enfermedad. Algunas de las enfermedades humanas bien caracterizadas geneticamente pero mal definidas en funci6n de las moleculas, no son faciles de diagnosticar. Si un marcador de restricci6n esta ligado confiablemente al fenotipo, puede servir para diagnosticar Ia enfermedad. • Puede conducir al aislamiento del gen. El marcador de restricci6n debe encontrarse

relativamente cerca del gen en el mapa genetico si ambos loci rara vez se recombinan, o nunca. Lo que se considera "relativamente cerca" en genetica puede ser una distancia sustancial entre pares de bases de DNA; no obstante, el marcador de restricci6n proporciona un punta de inicio del cual partir en el DNA para localizar el gen. La frecuente presencia de SNP en el genoma humano los h ace litiles para el mapeo genetico. De los 1.5 x 106 SNP que hasta ahara han sido identificados, en promedio hay uno cada l a 2 kb, lo cual debe permitir la localizaci6n rapida de genes de enfermedades nuevas al ubicarlos entre los SNP mas cercanos. Segun el mismo principia, el mapeo por RFLP ha sido utilizado durante algt'm tiempo. Una vez que se asigna uno de ellos a un grupo de ligamiento, puede colocarse en el mapa genetico. En el hombre y en el raton, este mapeo ha conducido a la construcci6n de mapas de ligamiento para ambos genomas. El ligamiento de un si tio desconocido se prueba con estos sitios y puede ser colocado rapidamente en el mapa. Hay menos RFLP que SNP, asf que, en principia, la resolu cion del mapa de RFLP es mas limitada. La frecuencia del polimorfismo significa que cada individuo tiene una constelacion unica de SNP o de RFLP. La combinaci6n especffica de los sitios encontrados en una region espedfi.ca se denomina haplotipo, un genotipo en miniatura. Si bien el concepto de haplotipo fue introducido originalmen-

4.4 Los RFLP y los SN P pueden ser utilizados para el mapeo genetico

59

te para describir Ia constitucion genetica del locus mayor de histocompatibilidad, region que especifica proteinas considerablemente importantes del sistema inmunol6gico (vease Cap. 23, Diversidad inmunitaria), ahora se ha extendido a Ia descripci6n de combinaciones particulares de alelos o sitios de restricci6n (o cualquier otro marcador genetico) de algun area definida del genoma. Mediante los SNP se cre6 un detallado mapa de haplotipos del genoma humano que facilita el trazado de los mapas de los genes provocadores de enfermedades. La existencia de RFLP constituye Ia base de una tecnica que permite establecer relaciones inequivocas entre los progenitores y su progenie. Cuando se duda de Ia paternidad, Ia comparaci6n del mapa RFLP de una region cromosomica adecuada de los progenitores potenciales y del hijo permite asignar de manera absoluta el parentesco. El uso del analisis de restriccion del DNA para Ia identificaci6n de individuos se ha denominado huella digital del DNA. El analisis de secuencias "minisatelite" especialmente variables se utiliza en el mapeo del genoma humano (vease Ia secci6n 6.14, Los minisatelites facilitan el map eo genetico).

Aves

Mamfferos Reptiles Anfibios Peces 6seos Peces cartilaginosos Equinodermos Crustaceos lnsectos Moluscos Gusanos Mohos Algas Hongos Bacterias gram(+) Bacterias gram (-) Micoplasma II 106

II I

I

•• 107

108

109

1010 1011

4.~ El contenido de DNA del genoma haploide se incrementa con La complejidad morfol6gica de las eucariotas inferiores, pero varia ampliamente en algunos grupos de eucariotas superiores. El rango de los valores de DNA de cada grupo se indica mediante areas sombreadas.

(Por que los genomas son tan grandes?

109 ctl

Conceptos principales • No hay una buena correlaci6n entre el tamaiio del genoma y La complejidad genetica. • Hay un incremento en el tamaiio minima del genoma necesario para formar organismos de mayor complejidad. • En numerosos filos, las dimensiones de los genomas de los organismos varian ampliamente.

La cantidad total de DNA del genoma (haploide) es una caracteristica de cada especie viviente conocida como su valor C. Hay una variaci6n enorme en el rango de los valores C, desde < l 06 bp en un micaplasma hasta >10 11 bp en algunas plantas y algunos anfibios. En Ia :il 5 se resume el rango de valores C encontrados en diferentes filos evolutivos. Conforme se incrementa Ia complejidad, aumenta el tamafio minima del genoma encontrado en cada grupo. Sin embargo, al incrementarse las cantidades absolutas de DNA en las eucariotas superiores, se observan amplias variaciones en las dimensiones de los genomas de algunos filos. En la L ' , el diagrama de la cantidad minima de DNA requerida por un miembro de cada 60


E 0

c

Q)

Ol

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108

1:l

0

•c

ctl

E Ol

107

1-

106

r El genoma minima encontrado en cada fila se incrementa de las procariotas a los mamiferos.

grupo sugiere que para formar procariotas mas complejas y eucariotas inferiores, es necesario que el genoma aumente de tamaiio. Los micoplasmas son las procariotas mas pequeiias, y sus genomas son solo -3 veces el tamafio de un bacteri6fago grande. El tamafio de las bacterias parte de - 2 x l 0 6 bp. Las eucariotas unicelulares (cuyos estilos de vida pueden parecerse a los de las

Filo Alga Micoplasma Bacteria Levadura Moho limoso Nematoda Insecta Ave Anfibio Mamffero

Especies

Genoma (bp)

Pyrenomas salina M. pneumoniae E. coli S. cerevisiae D. discoideum C. elegans D. melanogaster G. domesticus X. laevis H. sapiens

6.6

X 105 1.0 X 106 4.2 X 106 1.3 X 107 5.4x107 8.0 X 107 1.4x10B 1.2 X 109 3.1 X 109 3.3 X 1Q9

IGJ Dimensiones de los genomas de algunos organismos experimentales comunes.

procariotas) tambien subsisten con genomas pequeii.os, aunque son mas grandes que los de las bacterias. El hecho de que un organismo sea eucari6tico en sf, no implica un gran incremento en cuanto al tamafto del genoma; una levadura puede tener un genoJl}a de - 1.3 x 107 bp, el cual es apenas dos veces el tamaii.o de un genoma bacteriano promedio. Otro doble incremento en el tamaii.o del genoma es adecuado para respaldar al moho limoso Dictyostelium discoideum, que puede vivir tanto en Ia modalidad unicelular como en Ia multicelular. Es necesario otro incremento en Ia complejidad para dar Iugar a los primeros organismos completamente multicelulares; el nematodo Caenorhabditis elegans tiene un DNA de 8 x 10 7 bp. Asimismo, en el listado de Ia se observa el incremento constante del tamaii.o del ge noma de acuerdo con la complejidad de algunos de los organismos mas comunmente analizados . Es necesario que aumente el tamano del genoma para que se formen insectos, aves, an:fibios y mamfferos. Sin embargo, despues de este punto no hay una buena relaci6n entre las dimensiones del genoma y Ia complejidad morfol6gica del organismo. Se sabe que los genes son mucho mas grandes que las secuencias necesarias para codi:ficar protefnas porque los exones (regiones codificadoras) pueden imcluir solo una pequena parte de Ia longitud total de un gen, Io cual explica la raz6n de que haya mucho mas DNA del necesario para proporcionar marcos de lectura para todas las protefnas del organismo, pues grandes segmentos de un gen interrumpido pueden no estar relacionados con Ia codi:ficaci6n de protefnas. Adicionalmente puede haber fragmentos significativos de DNA entre los genes, de modo que noes posible hacer deducciones respecto del numero de genes a partir del tamano total del genoma. La paradoja del valor C se refiere a Ia falta de correlaci6n entre el tamaiio del genoma y Ia complejidad genetica. Hay algunas variaciones muy curiosas 4.6

respecto del tamaiio del genoma. En el sapo Xenopus y el hombre, los genomas son esencialmente del mismo tamano, sin embargo, jSe supone que el hombre es mas complejo en cuanto a desarrollo genetico! En algunos filos, las variaciones en contenido de DNA entre organismos que no difieren mucho en cuanto a complejidad extremadamente grandes (vease Ia Fig. 4. 5) . (Esto es especialmente notable en insectos, anfibios y plantas, no as! en aves, reptiles ni mamiferos, los cuales muestran pocas variaciones dentro del grupo, con un rango de dimensiones de genoma de -2 veces). Un grillo tiene un genoma 11 veces mayor que el de una mosca de Ia fruta. En los anfibios, los genomas mas pequeiios son de < 10 9 bp, rnientras que los mas grandes son de -10 11 bp. Es poco probable que se necesite una gran diferencia en el numero de genes para especificar a estos anfibios. Nose sabe por que Ia selecci6n natural permite esta variaci6n, nisi tiene consecuencias evolutivas.

Ill

Los genomas eucari6ticos contienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitivas

Conceptos principales •

La cinetica de la reasociaci6n del DNA despues de que un genoma ha sido desnaturalizado distingue a las secuencias por la frecuencia con se repiten en el genoma.

•

En el DNA no repetitive, los genes generalmente son codificados par secuencias localizadas.

•

Los genomas mas grandes de un fila no contienen mas genes, pero tienen cantidades mayores de DNA repetitive.

•

Gran parte del DNA repetitive puede estar f ormada par transposones.

Las caracteristicas generales del genoma eucari6tico pueden evaluarse porIa cinetica de reasociaci6n del DNA desnaturalizado, tecnica ampliamente utilizada antes de que fuera posible Ia secuenciaci6n del DNA a gran escala. Con Ia cinetica de reasociaci6n se identifican dos tipos generales de secuencias gen6micas: • El DNA no repetitivo consta de secuencias unicas: solo hay una copia en un genarna haploide. • El DNA repetitivo consta de secuencias presentes en mas de una copia en cada genoma. El DNA repetitive con frecuencia se divide en dos tipos generales: • El DNA moderadamente repetitivo consiste en secuencias relativamente cortas que se repiten tfpicamente de 10-1 000 veces en el genoma, dispersas a lo largo de este; son

Los genomas eucari 6ticos contienen secuencias de DNA repetitivas y no repetitivas

61

e

e

I

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1010 65%

58% 109

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33% 7%

5%

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41%

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54%

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14%

107

17%

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3%

106

o0 c,'l>-

_...oc; ~1>"',, ,1>-

• No repetitivo

b~

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• Moderadamente • Muy repetitivo repetitivo

Las proporciones de los diferentes componentes secuenciales varian en los genomas eucari6ticos. El contenido absoluto de DNA no repetitivo se incrementa con el tamaiio del genoma, pero alcanza una meseta a ~2 x 109 bp.

responsables del alto grado de formaci6n de Ia estructura secundaria en el pre-RNAm, cuando repeticiones (invertidas) en los intrones se aparean para formar regiones duplex. • El DNA altamente repetitivo esUi formado por secuencias muy cortas (tfpicamente <100 bp) presentes muchos miles de veces en el genoma, frecuentemente organizadas en forma de repeticiones en tandem (vease Ia secci6n 6.11, Los DNA satelite frecuentemente se encuentran en Ia heterocromatina) . Ninguna clase representa a proteinas. La proporci6n del genoma ocupado por DNA no repetitivo varia mucho. En Ia se resume Ia organizaci6n gen6mica de algunos organismos representativos. Las procariotas contienen solo DNA no repetitivo. En las eucariotas inferiores, Ia mayor parte del DNA es no repetitivo; <20% forma parte de uno o mas componentes moderadamente repetitivos. En las celulas animates, a menudo hasta la mitad del DNA es ocupado por componentes moderada y altamente repetitivos. En las plantas y en los anfibios, los componentes moderada y altamente repetitivos pueden representar hasta el 80% del genoma, de tal manera que el DNA no repetitivo se reduce a un componente minoritario. 62


Una parte significativa del DNA moderadamente repetitivo consiste en transposones, secuencias cortas de DNA (de -1 kb) susceptibles de moverse a localizaciones nuevas en el genoma y de crear capias adicionales de si mismos (veanse Cap. 21, Transposones, y Cap. 22, Retrovirus y retroposones). En algunos genomas eucari6ticos superiores pueden ocupar incluso mas de Ia mitad del genoma (vease Ia secci6n 5.5, El genoma humano tiene menos genes de los esperados). En ocasiones se considera que los transposones se adaptan al concepto de DNA redundante, el cual se define como secuencias que se propagan por sf mismas en un genoma sin contribuir al desarrollo del organismo. Los transposones suelen fomentar las reestructuraciones gen6micas, y estas podrian conferir ventajas selectivas. Sin embargo, es justo decir que en realidad no se sabe porque las fuerzas selectivas no contrarrestan el que los transposones se conviertan en una proporci6n tan grande del genoma. Otro termino qu e se utiliza para describir el exceso aparente de DNA es "DNA basura", que define a secuencias gen6micas sin una funci6n aparente. Obviamente, es probable que en el genoma haya un equilibria entre la generaci6n de secuencias nuevas y la eliminaci6n de secuencias indeseables, y que cierta proporci6n del DNA que aparentemente carece de funci6n, este en proceso de ser eliminada . La longitud del componente no repetitivo de DNA tiende a incrementarse con el tamaiio total del genoma conforme se procede a un tamaiio total del genoma de -3 x 10 9 (caracterfstico de los mamfferos). Sin embargo, incremen tos posteriores generalmente reflejan un aumento de la cantidad y la proporci6n de componentes repetitivos, de tal forma que es raro que un organismo tenga un componente de DNA no repetitivo >2 x 109 . Por lo tanto, el contenido de DNA no repetitivo de los genomas concuerda con nuestra percepci6n de !a complejidad relativa del organismo. E. coli tiene 4.2 x 10 6 bp; C. elegans se incrementa en un orden de magnitud, a 6.6 X 107 bp; D. melanogaster se incrementa aun mas, a -10 8 bp, y en los mamfferos, el incremento es de otro orden de magnitud, a -2 x 109 bp. (.Que tipo de DNA corresponde a los genes codificadores de protefnas? La cinetica de reasociaci6n suele mostrar que el RNAm es derivado del DNA no repetitivo, de modo que la cantidad de este es un mejor indicador del potencial codificador que el DNA total. (No obstante, un analisis mas detallado basado en las secuencias gen6micas muestra que numerosos exones tienen secuencias relacionadas en otros exones [vease la secci6n 3.5, Las secuencias de los exones se conservan, pero las de los intrones varfan]. Dichos exones evolucionan por duplicaci6n

ara formar copias que inicialmente son ictenticas, _ro que despues difieren en secuencia durante la -\-oluci6n.) ..,_ Las translocaciones cromosomicas identifican a Ia banda Xp21 como fuente de Ia DMD

Los genes pueden ser aislados por ta conservaci6n de los exo nes Concepto principal • La conservaci6n de los exones puede ser utilizada como base para loca lizar regiones codificadoras al identificar frag mentos cuyas secuencias estan presentes en multiples organismos.

Mediante el DNA clonado de X ..,_ humano se identifican las deleciones en esta reg ion

8

-70 kb

I

Algunas estrategias importantes para !a identifi.:aci6n de genes se basan en el contraste entre !a . : onservacion de los exones y !a variacion de los in-:rones. En una region que contiene un gen cuya ~u ncion se ha conservado en un rango de especies, :asecuencia que representa ala protefna debe tener -os propiedades distintivas: • Un marco de lectura abierto, • yes probable que tenga una secuencia relacionada en otras especies. Estas caracterfsticas pueden utilizarse para aislar genes. Sup6ngase que por datos geneticos se sabe que ·m rasgo genetico especffico se localiza en determi :lada region cromosornica. Si se desconoce la naturaleza del producto del gen, (_Como se identifica al gen en una region que puede ser, por ejemplo, >l Mb? Una estrategia colosal cuya eficacia ha sido demostrada con algunos genes de importancia medica, consiste en detectar en fragmentos relativamente cortos de la region las dos propiedades esperadas de un gen conservado. Primero se intenta identificar fragmentos sometidos a hibridaci6n cruzada con los genomas de otras especies y despues se examinan dichos fragmentos para detectar marcos de lectura abiertos. El primer criterio se aplica al realizar una zootransferencia, para lo cual se utilizan fragmentos cortos de la region como sondas (radioactivas) para evaluar Ia presencia de DNA relacionado en una variedad de especies a traves de la hibridacion de Southern. Si se encuentran fragmentos de hibridacion relacionados con el de Ia sonda en numerosas especies - la sonda suele ser humana- , esta se convierte en candidate para un ex6n del gen. Los candidates van en secuencia y, si contienen marcos de lectura abiertos, se utilizan para aislar a las regiones genomicas circundantes. Si parecen ser parte de un exon, posteriormente podran ser utilizados para identificar a! gen complete, aislar al

I

Mapa de restriccion construido mediante caminata cromosomica a partir de Ia sonda

~

Ill I I

0

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11 11111

+70 kb

II

1

I Ill

Il l

Las moleculas de DNA de pacientes con DMD presentan deleciones en Ia region de Ia caminata

~ }

El DNA hacia Ia derecha se elimina

El DNA hacia Ia0 { izquierda se elim ina

0

~

Delecion interna

El gen implicado en la distrofia muscular de Duchenne fue detectado mediante un mapeo cromos6mico y "caminando" hacia una region en la cual se pueden identificar de leciones cuando se presenta la enfermedad.

DNAc o al RNAm correspondiente y, por ultimo, para identificar a !a protefna. Esta estrategia es particularmente importante cuando el gen diana esta disperso porque posee numerosos intrones prominentes, como en el caso de la distrofia muscular de Duchenne (DMD, Duchenne muscular dystrophy), trastorno degenerative de los musculos ligado a! cromosoma X, presente en uno de cada 3 500 nacimientos de varones. Los pasos para identificar el gen se resumen en la Mediante el analisis del ligamiento se localiz6 el locus correspondiente en la banda cromosomica Xp2l. Los afectados porIa enfermedad con frecuencia presentan reestructuraciones cromosomicas en dicha banda. AI comparar la capacidad de las sondas de DNA ligadas al cromosoma X para hibridarse con el DNA de pacientes con DNA normal, se obtuvieron fragmentos clonados correspondientes a la region reestructurada o eliminada del DNA de los pacientes.

4. 7 Los genes pueden ser aislados por la conservaci6n de los exones

63

- --

50 clones de Ia region hibridada al DNA de otras especies; 2 clones se hibridan con todos los mamfferos

--

La secuencia del fragmento proveniente del hombre y del raton es 95% identica y tiene un marco de lectura abierto Humano

.... GCCATAGAGCGAGAA····

Murina

.... GCCATAGCACGAGAA ···· Utilizar el fragmento para identificar RNAm de 14 kb; exones del mapa correspondientes al DNAc

DNAc

0

2

4

! - :~~:ih

!.... .\ .: i

1111

0

250

500

a b c d ~~

200 100

50 25

6

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,,

I

ii

8

10

12

kb

'\,,,,,,,,\ ,,._ II

750 1 000

1 500 Kb en el genome..

Los anticuerpos contra Ia secuencia peptfdica corta del DNAc identifican a Ia protefna distrofina La distrofina tiene -500 kD ; esta presente en (a) musculo esqueletico (b) musculo cardfaco y esta ausente en (c) otros tejidos (d) musculo con DMD

El gen de la distrofia muscular de Duchenne se caracteriz6 por medio de hibridaci6n inespeclfica, hibridaci6n de DNAc, hibridaci6n gen6mica e identificaci6n de la protelna.

Una vez que se ha obtenido un poco del DNA localizado en la vecindad general del gen diana, es posible "caminar" a lo largo del cromosoma hasta llegar al gen. Mediante una caminata cromos6mica se construy6 un mapa de restricci6n de las regiones que flanquean ala sonda, el cual cubri6 una region de > 100 kb. Mediante el analisis del DNA de una serie de pacientes, en esta region se identi:ficaron deleciones extensas en ambas direcciones; la mas contundente esta totalmente dentro de la region porque delinea un segmento importante para la funcion del gene indica que este, o cuando menos parte de eJ, yace en dicha region. Una vez en la region del gen, se deben identificar los ex ones y los intrones. Mediante un analisis de hibridacion inespecffica se identificaron fragmentos que presentan hibridacion cruzada con el cromosoma X del raton y con otras moleculas de DNA de 64


mamffero. Como se resume en la , estos se examinaron detalladamente para detectar marcos de lectura abiertos y las secuencias tfpicas de las uniones exon-intron. Los fragmentos que cumplian con estos criterios se utilizaron como sondas para identificar secuencias homologas en una biblioteca de DNAc preparada a partir de RNAm muscular. El DNAc correspondiente al gen identi:fica a un RNAm inusualmente largo, de aproximadamente 14 kb . La hibridacion revenida hacia el genoma muestra que el RNAm esta representado en >60 exones esparcidos en -2 000 kb de DNA, lo cual hace del gen de la DMD el mas largo identificado hasta ahora. El gen codifica a una proteina de -500 kD denominada distrofina, que es uno de los componentes del musculo, mas bien escaso. Todos los afectados por la enfermedad presentan deleciones en este locus y carecen de distro:fina (o es deficiente). El musculo tambien se distingue por tener Ia protefna mas grande conocida, la titina, formada por aproximadamente 27 000 aminoacidos. El gen correspondiente contiene el numero mayor de exones (178) y el exon mas largo del genoma humano (l7000bp). Otra tecnica que permite examinar rapidamente los fragmentos genomicos para detectar los exones se denomina tecnica de captura de exones. En Ia se muestra que empieza con un vector que contiene un promotor fuerte y un solo intron localizado entre los dos exones. Cuando este vector es introducido a las celulas por transfeccion, Ia transcripcion del mismo genera grandes cantidades de RNA que contiene las secuencias de los dos exones. Dentro del intron hay un sitio de restriccion-clonacion que se utiliza para insertar fragmentos genomicos de una region de interes. Si un fragmento no tiene exon, no hay cambios en el patron de corte y empalme, y el RNA contendra solo las mismas secuencias que el vector progenitor. No obstante, si el fragmento genomico contiene un exon flanqueado por dos secuencias intronicas parciales, se reconocen los sitios de corte y empalme a uno y otro lado de este exon y su secuencia es insertada en el RNA, entre los dos exones del vector. No es diffcil detectar este proceso mediante transcripcion inversa del RNA citoplasmico a DNAc utilizando Ia reaccion en cadena de polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) para ampli:ficar las secuencias localizadas entre los dos exones del vector. Por ello, la aparicion de secuencias del fragmento genomico en Ia poblacion ampli:ficada indica que un exon ha sido capturado. Como en las celulas animales los intrones suelen ser grandes y los exones pequenos, hay muchas probabilidades de que un fragmento

El vector contiene dos exones empalmados en el transcrito Union de empalme 3'

Promotor Union de empalme 5'

1__1

I

ex6n intron

I

Transcripcion y corte y empalme para eliminar el intron

t

Fragmento genomico intron exon lnserci6n del fragmento 1 gen6mico en el intr6n ~

intron

ex on intron Transcripcion y corte y empalme para eliminar el intron

intron

I t

Para la captura de exones se utiliza un vector especial de corte y empalme. Si un ex6n esta presente en el fragmento genomico , su secuencia sera recuperada en el RNA citoplasmico, pero si el fragmento genomico esta formado unicamente por secuencias de dentro de un intron, no ocurre el corte y empalme y el RNAm no es exportado al citoplasma.

aleatorio de DNA genomico contenga la estructura :.- equerida de un exon rodeado de intrones parciales . De hecho, la captura de exones puede parecerse a ios eventos ocurridos de forma natural durante la evolucion de los genes (vease la seccion 3 .8, (.Como evolucionaron los genes interrumpidos?)

La co nservaci6n

de La organizaci 6n del genoma ayuda a identificar genes Conceptos principales • Los algoritmos para identificar genes no son perfectos, de modo que son necesarias numerosas correcciones al conjunto lnicial de datos. • Los seudogenes deben distinguirse de los genes activos. • Hay amplias relaciones si ntenicas entre los genomas del raton y los del humano, y la mayoria de los genes activos se encuentran en una region sintenica.

-...:na vez ensamblada la secuencia de un genoma, :odavfa se tienen que identificar los genes que con-

tiene. Las secuencias codificadoras representan una fraccion muy pequena . Los exones pueden ser identificados como marcos de lectura abiertos e ininterrumpidos, flanqu eados por secuencias apropiadas. (. Cuales son los cri terios para identificar un gen activo en una serie de exo nes? En la se mu estra que un gen activo debe estar formado por una serie de exones en la cual el primero de ellos sigue inmediatamente a un promotor; los exones internos son flanqueados por uniones apropiadas de corte y empalme, y el ultimo va seguido de senales de procesamiento 3'; uniendo a los exones puede deducirse un solo marco de lectura abierto que empieza con un codon de iniciacion y termina con uno de terminacion. Los exones internos pueden identificarse como marcos de lectura abiertos flanqueados por unione s de corte y empalme. En los casos mas sencillos, el primero y el ultimo exon inician y terminan la region codificadora, respectivamente (asf como las regiones no traducidas 5' y 3'). En casos mas complejos, dichos exones pueden tener solo regiones no traducidas y, por lo tanto, ser mas diffciles de identificar. Los algoritmos utilizados para conectar los exones no son realmente efectivos cuando el genoma es

4.8 La conservacion de la organizacion del genoma ayuda a identificar genes

65

Secuencia promotora

Union de empalme GT

Primer ex6n

Uni6n de empalme AG

Union de em pal me GT

Exones internes

Union de empalme AG

Seiiales procesadoras

3'

Ultimo exon

+ - - AUG.......... ................. .. .. ...........UGA _ _...,. Los exones forman un marco de lectura abierto continuo Los exones de los genes codificadores de prote\nas son identificados como secuencias codificadoras flanqueadas por seiiales apropiadas (con regiones no traducidas en ambos extremos). La serie de exo nes debe generar un marco de lectura abierto con codones adecuados de inicio y final. ORF, marco de lectura abierto; UTR, regiones no traducidas; GT y AG se refieren a las bases nitrogenadas de las secuencias.

muy grande y los exones estan muy separados. Por ejemplo, en el analisis inicial del genoma humano se mapearon 170 000 exones en 32 000 genes. No es diffcil que estas cifras sean incorrectas porque resultan en un promedio de 5.3 exones por gen, mientras que Ia media de los genes caracterizados completamente es de 10.2, de modo que, o se han omitido muchos exones o deben conectarse de forma diferente en un numero mas pequeiio de genes en toda Ia secuencia genomica. Aun cuando Ia organizacion de un gen sea identificada correctamente, surge el problema de distinguir entre genes activos y seudogenes. Muchos de estos ultimos se reconocen por defectos obvios que dan Iugar a mutaciones multiples que resultan en una secuencia codificadora inactiva. Los seudogenes que han surgido mas recientemente no acumulan tantas mutaciones, de modo que pueden ser mas diffciles de reconocer. En un ejemplo extremo, el raton tiene solo un gen Gapdh activo (que codifica a Ia deshidrogenasa de gliceraldehfdo fosfato), pero -400 seudogenes. De estos, en un principia paredo que aproximadamente 100 estaban activos en la secuencia del genoma del raton y fue necesario examinarlos uno por uno para excluirlos de Ia lista de genes activos. La certeza de que un gen esta activo se puede incrementar comparando regiones de los genomas de especies diferentes. Ha habido una reorganizacion gen eral muy amplia de las secuencias entre los genomas de raton y de humano, como se observa en el simple hecho de que el genoma haploide del humano tiene 23 cromosomas y el del raton, 20. No obstante, local mente, el orden de los genes suele ser 66


el mismo: cuando se comparan pares de homologos de humano y de raton, los genes localizados a ambos !ados tambien tienden a ser homologos. A esta relacion se le denomina sintenia. En Ia se muestra Ia relacion entre el cromosoma 1 del raton y el conjunto cromosomico humano; se observa que 21 segmentos de este cromosoma de raton tienen contrapartes sintenicas en los cromosomas humanos. La extension de Ia reorganizacion ocurrida entre los genomas se demuestra porque los segmentos estan esparcidos en seis cromosomas humanos diferentes. El mismo tipo de relacion se ha detectado en todos los cromosomas del raton, excepto en el X, sintenico solo con el cromosoma humano X, lo cual se explica por el hecho de que el cromosoma X constituye un caso especiaL sujeto a compensacion de dosis para ajustar las diferencias entre machos (una copia) y hembras (dos copias) (vease Ia seccion 31.5, Los cromosomas X experimentan cambios globales). Esto puede ejercer presion selectiva contra Ia translocacion de genes desde y hacia el cromosoma X. La comparacion de las secuendas de los genomas del raton y del humano revela que >90 % de cada genoma se encuentra en bloques sintenicos cuyo tamaiio varfa (de 300 kb a 65Mb). Hay un total de 342 segmentos sintenicos, con una longitud promedio de 7Mb (0.3% del genoma) . El 99% por ciento de los genes del raton tiene un homologo en el genoma humano; para el96 % de dichos genes, ese homologo se encuentra en una region sintenica. La comparacion de los genomas proporciona informacion interesante con respecto de la evo lu cion de las especies. El numero de familias de

1111 10

20

30

40

50

60

70

80

90 100

Mb

Cromosoma 1 del raton

n: 2 14 5

2

6

8

Cromosomas humanos correspondientes El cromosoma 1 del raton tiene 21 segmentos de 1 a 25 Mb que son sintenicos con regiones que corresponden a partes de seis cromosomas humanos.

enes de los genomas del raton y del humano es =I mismo, y una diferencia importante entre las :>species es la expansion diferencial de familias es- ecificas en uno de los genomas, lo cual es parj cularmente notable en los genes que afectan a :aracterfsticas fenotipicas unicas de las especies. En :"I raton, de las 25 familias en las cuales se ha ob.;ervado aumento de tamaiio, 14 contienen genes =specificamente implicados en la reproduccion de : s roedores y cinco, genes especfficos del sistema :.-'1 munologico. Una validacion de Ia importancia de los bloques .;·ntenicos proviene de comparaciones de pares de : s genes contenidos en ellos. Al buscar seudogenes .;"rnilares sobre Ia base de comparaciones de secuen·as, para un gen que no esta en una Iocalizacion j ntenica (esto es, su contexto es diferente en las ios especies) hay el doble de probabilidades de que _;ea un seudogen. En otras palabras, Ia translocaj on lejos del locus original tiende a asociarse con Ia eacion de seudogenes, por lo tanto, Ia falta de un ~en relacionado en una posicion sintenica despierta :ospechas de que un supuesto gen puede realmen:c ser un seudogen. En total, > l 0 % de los genes :Jentificados inicialmente en el analisis del genoma ;.)fobablemente resulten seudogenes. Como regia general, las comparaciones entre ~enomas incrementan significativamente Ia certe=.a del pronostico genico. Cuando se conservan ca:a cterfsticas de Ia secuencia que conducen a genes ::.ctivos, por ejemplo, entre el hombre y el raton, se :.:1crementan las probabilidades de que identifiquen "' homologos activos. La identificacion de genes que codifican RNA :-s mas complicada porque no es posible utilizar el :riterio del marco de lectura abierto. Tambien es ·: erdad que con el analisis comparativo del genoma se incremento el rigor del analisis. Por ejemplo, al ~nalizar el genoma del humano o del raton se iden:ifican - 500 gen es que codifican RNAt, pero la comyaracion de caracterfsti cas sugiere que <3 50 de estos ;enes estan realmente activos en cada genoma.

5

Los organelos contienen DNA

Conceptos principales • Las mitocondrias y los cloroplastos tienen genomas que muestran herencia no mendeliana. Tipicamente son heredados de la madre. • Los genomas de los organelos pueden ser sometidos a segregaci6n somatica en las plantas. • Las comparaciones del DNA mitocondrial sugieren que los humanos descienden de una sola hembra, la cual vivi6 hace 200 000 a nos en Africa.

La primera evidencia de genes fuera del nucleo provino de Ia herencia no mendeliana detectada en plantas (en los prim eros a nos del siglo xx, despues del redescu brimiento de la h erencia mendeliana) . En ocasiones, dicha herencia esta relacionada con el fenomeno de la segregacion somatica, en ambos casos la causa es similar: • La herencia no mendeliana se define como la incapacidad de la progenie de u n apareamiento de mostrar la segregacion mendeliana de los caracteres de los progenitores. Esta lirnitante refleja que falta la asociacion entre el caracter segregante y el huso meiotico. • La segregacion somatica describe un fenom eno en el cuallos caracteres de los progenitores se segregan en las celulas somaticas, de modo que exhiben Ia heterogeneidad del organismo. Esta es una caracterfstica notable del desarrollo de las plantas porque refleja Ia falta de asociacion entre el caracter segregante y el huso mitotico. Par lo tanto, se considera que Ia herencia no mendeIiana y la segregaci6n somatica indican Ia presencia de genes que residen fuera del nucleo y que no recurren a la segregaci6n en el huso mit6tico y el mei6tico para distribuir replicas a los gametos 0 a las celulas hijas, respectivamente. En Ia se muestra que esto sucede cuando las mitocondrias heredadas de los progenitores macho y hembra tienen alelos diferentes, y por casualidad, una o§lula hija recibe una distribucion desequilibrada de rnitocondrias qu e representa solo a un progenitor (vease Ia seccion 17 .12, ;_Como se replican y segregan las mitocondrias?). La forma extrema de la h erencia no mendeliana es Ia herencia uniparental, cuando se hereda el genotipo de solo uno de los progenitores y el del otro progenitor se pierde permanentemente. En ejemplos menos extremos, la progenie de un genotipo progenitor excede a la del otro genotipo; por lo general, es el genotipo de la madre el que se hereda preferentemente (o unicamente ). Este efecto se define en ocasiones como herencia materna. 4.9 Los organelos contienen DNA

67

,

La celula tiene mitocondrias de ambos progenitores Mitocondria paterna

rl ,~ Nucleo tj7

Mitocondria materna

' /!6}

W

~ W

I

/1.11 u

Posibles resultados de Ia segregacl6n estocastica Las celulas suelen tener ambos tipos de mitocondrias

; La distribuci6n as~etrica proporciona celulas de un solo tipo

Cuando los alelos mi tocondriales paternos y maternos difieren, una celula tiene dos conjuntos de DNA mitocondrial. La mitosis suele generar celulas hijas con ambos conjuntos. La variaci6n somatica resulta de una segregaci6n desigual que genera cetulas hijas con s6lo un conjunto.

El punta importante es que predomina el genotipo proporcionado por el progenitor de determinado genera, como se observa en los Indices de segregacion anormales cuando se realiza una cruza entre un mutante y un tipo Silvestre, lo cual contrasta con el comportamiento de Ia genetica mendeliana, que se presenta cuando cruzas recfprocas muestran que las contribuciones de ambos padres son heredadas de forma equivalente. El sesgo en los genomas progenitores se establece a! formarse un cigoto, o poco despues, por varias causas posibles. La aportacion de informacion paterna o materna a los organelos del cigoto puede ser desigual; en el caso mas extrema, solo contribuye un progenitor. En otros casas, las aportaciones son equivalentes, pero Ia informacion provista por un progenitor no sobrevive. Es posible que se combinen ambos efectos, pero independientemente de la causa, la representacion desigual de Ia informacion proveniente de los progenitores contrasta con Ia informacion genetica nuclear, que se deriva de manera equivalente de uno y otro progenitor. La herencia no mendeliana resulta de Ia presencia de genomas de DNA en mitocondrias y cloroplastos, heredados independientemente de los ge68


nes nucleares. En efecto, el genoma de los organelos es un fragmento de DNA ffsicamente secuestrado en una parte definida de la celula y sujeto a su propia forma de expresion y regulacion. Un genoma de organelo puede codificar algunas o todas las moleculas de RNA, pero solo algunas de las protefnas necesarias para perpetuar al organelo. Las otras protefnas son codificadas en el nucleo, expresadas a traves del mecanismo citoplasmico de sfntesis de protefnas e importadas al interior del organelo. Los genes que no residen dentro del nucleo generalmente se describen como genes extranucleares que se transcriben y traducen en el mismo compartimiento del organelo (mitocondria o cloroplasto) en el cual residen. Por el contrario, los genes nucleares son expresados a naves de la sfntesis citopldsmica de protefnas. (El termino herencia citophismica suele utilizarse para describir el comportamiento de los genes en los organelos, pero esta descripcion no debe utilizarse porque es importante poder distinguir entre lo que sucede en el citosol general y lo que acontece en organelos especificos.) Los animales superiores muestran herencia materna, que se explica si las mitocondrias provienen todas del ovulo y en absoluto del esperma. En la se muestra que el esperma contribuye solo con una copia de DNA nuclear, de modo que los genes mitocondriales son derivados exclusivamente de Ia madre, y en los machos, son desechados en cada generacion. Las condiciones del organelo son diferentes de las observadas en el nucleo, y por lo tanto, el DNA de los organelos evoluciona a su propia velocidad. Si Ia herencia es uniparentaL puede no haber recombinacion entre los genomas progenitores. De hecho, la recombinacion suele no presentarse cuando los genomas de los organelos son heredados de ambos progenitores. El DNA de los organelos tiene un sistema de replicacion diferente al del nucleo, por lo que la tasa de error durante Ia replicacion puede ser diferente. El DNA mitocondrial acumula mutaciones mas rapidamente que el DNA nuclear en los mamfferos, sin embargo, en las plantas, Ia acumulacion en Ia mitocondria es mas lenta que en el nucleo (en el cloroplasto Ia velocidad es intermedia). Una consecuencia de la herencia materna es que la secuencia del DNA mitocondrial es mas sensible a reducciones en el tamai'io de la poblacion de reproduccion que Ia del DNA nuclear. La comparacion de las secuencias de DNA mitocondrial en un rango de poblaciones humanas permite construir un arbol evolutivo. La divergencia entre las moleculas de DNA mitocondrial humano cubre el 0.57% . Es posible elaborar un arbol en el cuallas variantes mitocondriales se derivaron de un ancestro (africano) comun. La tasa ala cual el DNA mitocondrial

~tocondria~

El DNA del esperma entra al ovocito para formar el pronucleo masculine en el 6vulo fertilizado, sin embargo, todas las mitocondrias son proporcionadas por el ovocito.

de los mamiferos acumula mutaciones es de 2 a 4% par cad a mill6n de afios, es decir, > 10 veces mas rapida que la tasa de la globina. Dicha tasa generara la divergencia observada en un periodo evolutivo de 140 000 a 280 000 afios, lo cual implica que la raza humana desciende de una sola hembra que vivi6 en Africa hace -200 000 afios.

•

Los genomas de los organelos son moleculas circulares de DNA que codifican prote1nas de los organelos

Conceptos principales • Los genomas de los organelos suelen ser moleculas circulares de DNA (pero no siempre). • Los genomas de los organelos codifican algunas de las proteinas que se encuentran en el organelo, pero no a todas.

La mayoria de los genomas de los organelos asumen Ia forma de una sola molecula circular de DNA de secuencia (mica (Hamada DNAmt en Ia mitocondria y DNAct en el cloroplasto). Hay pocas excep-

ciones en las que el DNA de Ia mitocondria es una molecula lineal; estas estructuras generalmente se presentan en las eucariotas inferiores. En general, en un organelo hay numerosas capias del genoma, y en cada cc:'~lula hay multiples organelos, de modo que son numerosos los genamas de organelos par celula. Aunque el genoma de los organelos es unico, constituye una secuencia repetitiva respecto de cualquier secuencia nuclear no repetitiva. Los genomas de los cloroplastos son relativamente grandes, casi siempre - 140 kb en las plantas superiores y <200 kb en las eucariotas inferiores, dimensiones comparables con las de un bacteri6fago grande, el T4, por ejemplo, rnide -165 kb. Son varias las capias del genoma par organelo, tfpicamente de 20 a 40 en una planta superior, y multiples capias del organelo en cada celula, par lo generaL de 20 a 40. El tamafio total de los genomas mitocondriales varia en mas de un arden de magnitud. Asi, los genomas mitocondriales de las celulas animales son pequefios, aproximadamente de 16.5 kb en los rnamlferos. Hay muchos cientos de mitocondrias por celula, y cada mitocondria tiene m ultiples capias de DNA. La cantidad total de DNA mitocondrial respecto del DNA del nucleo es pequefia, se estima en <1 %. Por el contrario, en las levaduras, el genoma mitocondrial es mucho mas grande, por ejemplo, en Saccharomyces cerevisiae el tamafio exacto varia de una cepa a otra, pero en promedio es de -80 kb. Hay - 22 mitocondrias por celula, que corresponden a -4 genomas por organelo. En celulas de cultivo, la proporci6n de DNA mitocondrial puede llegar al 18 por ciento. En las plantas, el rango de dimensiones del DNA mitocondrial es extremadamente amplio, con un mfnimo de -100 kb. Las dimensiones del genoma hacen diffcil aislarlo intacto, pero el mapeo de restricci6n de muchas plantas sugiere que el genoma mitocondrial suele ser una secuencia individual organizada en un cfrculo, dentro del cual hay secuencias hom6logas cortas. La recombinaci6n entre estos elementos genera moleculas circulares subgen6micas mas pequefias que coexisten con el genoma "maestro" completo, buen ejemplo de Ia complejidad aparente de las moleculas de DNA mitocondrial de las plantas. Ahara que se cuenta con la secuencia de los genomas mitocondriales de numerosos organism as, es posible observar algunos patrones generales en Ia representaci6n de las funciones del DNA mitocondrial. En Ia se resume la distribuci6n de los genes de ese tipo de genomas. El numero total de genes codificadores de protefnas es bastante pequefio y no se correlaciona con el tamafio del gena-

4.10 Los genomas de los organelos son moleculas circulares de DNA que codifican proteinas de los organelos

69

~;,,,,

Especie

Tamafio (en kb)

Hongos Protistas Plantas Ani males

19-100 6-100 186-366 16-17

- IF.11

• -

Genes Genes codificadores codificadores de protefnas de RNA 8-14 10-28 3-62 2-29 27-34 21-30 13 4-24

Los genomas mitocondriales tiene genes (principalmente de los complejos I-IV) que codifican proteinas, moleculas de RNAr y moleculas de RNAt.

ma . Las rnitocondrias de los mamiferos utilizan sus genomas de 16 kb para codificar a 13 proteinas, en tanto que las mitocondrias de las levaduras utilizan los de 60 a 80 kb para codificar a solo ocho protefnas. Las plantas, cuyos genomas mitocondriales son mucho mas grandes, codifican a mas protefnas. En Ia mayorfa de los genomas mitocondriales se encuentran intrones, aunque no en los genomas muy pequefios de mamffero. Los dos RN Ar principales siempre son codificados por el genoma mitocondrial. El numero de moh~culas de RNAt codificado por el genoma mitocondrial fluctua entre ninguno y todo el complemento (25 a 26 en las mitocondrias), lo cualjustifica la variacion en la Figura 4.16 . La parte principal de la actividad codificadora de protefnas esta dedicada a los componentes de los ensambles de multiples subunidades de los complejos de respiracion I-IV. Muchas protefnas ribosomicas son codificadas en los genomas protistas y mitocondriales de las plantas, sin embargo, muy pocas o ninguna se codifican en los genomas de hongos y animales. En muchos genomas mitocondriales protistas hay genes que codifican protefnas y que estan implicados en la importacion.

1111

La organizaci6n del DNA mitocondrial es variable

Conceptos principales • El DNA mitocondrial de las celulas animales es extremadamente compacta y suele codificar a 13 proteinas, dos moleculas de RNAr y 22 de RNAt. • El DNA mitocondrial de las levaduras es cinco veces mas largo que el DNAmt de las celulas animates por la presencia de intrones largos.

El DNA mitocondrial de los animales es extremadamente compacta. En diferentes filos animales se observan diferencias notables en Ia organizacion genica detallada, pero se conserva el principia general de un genoma pequeiio que codifica a un numero 70


ND1 ND3 .,, C03 ' ATPasa6 { ATPasa.B

"-~-- C02

Genes de RNAt _ Regiones codificadoras _.. Indica Ia direcci6n del gen, de 5' a 3' CO: citocromo oxidasa NO: NADH deshidrogenasa J El DNA mitocondrial humano tiene 22 genes de RNAt y 13 regiones codificadoras de proteinas. Catorce de las 15 regiones codificadoras de proteinas o codificadoras de RNA se transcriben en la misma direcci6n. Catorce de los genes de RNAt se expresan en la direcci6n de las manecillas del reloj y ocho en direcci6n contraria.

restringido de funciones. En los genomas mitocondriales de los mamfferos, Ia organizacion es extremadamente compacta, no hay intrones, de hecho, algunos genes se superponen, y casi cada par de bases puede ser asignado a un gen. Con excepcion del lazo D, region implicada en el inicio de la replicacion del DNA, no puede considerarse que mas de 87 de los 16 569 bp del genoma mitocondrial humano se encuentren en regiones intercistronicas. Las secuencias de nucleotidos completas de los genomas mitocondriales de las celulas animales muestran una homologfa extensa en cuanto a organizacion. El mapa del genoma mitocondrial humano se resume en la . Hay 13 regiones codificadoras de proteinas; todas estas forman parte del mecanismo implicado en la respiracion, entre otras, el citocromo b, las tres subunidades de la citocromo oxidasa, una de las subunidades de Ia ATPasa y siete unidades (o proteinas asociadas) de la NADH deshidrogenasa. La discrepancia en el tamafio de los genomas mitocondriales deS. cerevisiae (84 kb), cinco veces mas grandes que los de los mamfferos ( 16 kb)' alerta ante el hecho de que debe haber una gran diferencia en su organizacion genetica, a pesar de su funcion comun . El numero de productos relacionados con las funciones enzimaticas mitocondriales y sintetizados de forma endogena parece ser similar. (.El

'

.. . -:

Genes

Tipos

Codificadores de RNA RNAr 16S RNAr 23S RNAr 4.5S RNAr 5S RNAt

1 1 1 1 30-32

Expresi6n genica Protefnas r RNA polimerasa Otras

20-21 3 2

Funciones del clorop lasto Rubisco y tilacoides 31-32 NADH deshidrogenasa 11 Total

El genoma de los cloroplastos de las plantas terrestres codifica a cuatro moleculas de RNAr, 30 moleculas de RNAt y -60 proteinas.

C01

Exones

lntrones

ali } =subunidades de ATPasa sensible a Ia aap oligomicina oxi = subunidades del citocromo c box

par var

105-113

=citocromo b = funciones desconocidas = subunidad protefnica ribos6mica pequena

U El genoma mitocondrial de 5. cerevisiae contiene Jenes codificadores de proteinas, genes de RNAr y genes de ~NAt interrumpidos y continuos (nose indican las posiciones). _as flechas indican la direcci6n de la transcripci6n.

:naterial genetico aclicional de las levaduras mitoondriales representa a otras proteinas, quiza rela.:lonadas con Ia regulaci6n, o no se expresa? El mapa de la representa al RNA principal y los productos protefnicos de la mitocon. ia de la levadura, en el cualla caracterfstica mas :10table es la dispersion de los loci . Los dos mas prominentes son los genes inte~mpidos box (que codifican al citocromo b) y oxi3 que codifica a la subunidad 1 de la citocromo oxi:'. asa), que juntos son jcasi tan largos como el geno =la mitocondrial entero de los mamfferos! Muchos :.e los intrones largos de estos genes tienen marcos de _::-ctura abiertos en registro con el ex6n precedente -.-ease Ia secci6n 27 .5, Algunos intrones del grupo ~ codifican endonucleasas que promueven la movi_: ·ad), fen6meno que agrega numerosas protefnas, :.)das sintetizadas en cantidades bajas, al compte- ento de la mitocondria de Ia levadura. Los genes restantes son ininterrumpidos y co:::-esponden a otras dos subunidades de la citocro__o oxidasa codificadas por Ia mitocondria, a la(s) ::-.1bunidad(es) de la ATPasa y (en el caso del gen :.rI) a una protefna ribos6mica mitocondrial. Es .- co probable que el numero total de genes mito= ~ ndriales de las levaduras exceda de -25.

DB

El genoma de los cloroplastos codifi ca a numerosas prote1nas y moleculas de RNA

Concepto principal • Los genomas de los cloroplastos varian en cuanto a tamafio, pero son lo suficientemente grandes como para codificar de 50 a 100 proteinas, asi como a los RNAr y los RNAt.

i... Que genes portan los cloroplastos? Las moleculas de DNA de los cloroplastos varfan en longitud de 120 a 190 kb. Los genomas secuenciados de cloroplastos (>10 en total) tienen de 87 a 183 genes. En la se resumen las funciones coclificadas por el genoma de los cloroplastos de las plantas terrestres. Hay mas variaciones en los genomas de los cloroplastos de las algas. En general, la situaci6n es similar a Ia de las mitocondrias, excepto que hay mas genes implicados. El genoma del cloroplasto codifica a todas las especies de RNAr y de RNAt necesarias para Ia sfntesis de protefnas. El ribosoma incluye dos moleculas de RNAr pequefias, ademas de las especies principales. El conjunto de RNAt puede incluir todos los genes necesarios. El genoma de los cloroplastos codifica a -50 protefnas, incluidas la RNA polimerasa y las protefnas ribos6micas. Tambien en este caso, Ia regla es que los genes de los organelos son transcritos y traducidos por el mecanismo del organelo. Cerca de la mitad de los genes de los cloroplastos codifican a protefnas implicadas en la sfntesis de protefnas. El origen endosimbi6tico de los cloroplastos resalta por las relaciones entre estos genes y sus

4.12 El genoma de los cloroplastos codifica a numerosas proteinas y moleculas de RNA

71

contrapartes en las bacterias. La organizadon de los genes de RNAr en particular esta fntimamente reladonada con Ia de una cianobacteria, Ia cual define con mayor precision al ultimo ancestro comun de cloroplastos y bacterias. Intrones y cloroplastos caben en dos clases generales; los que se encuentran en los genes de RNAt suelen estar en ellazo anticodon (aunque no inevitablemente), como los intrones localizados en los genes de RNAt nucleares de las levaduras (vease Ia seccion 26.14, El corte y empalme del RNAt de las levaduras implica procedimientos de corte y empalme). Los intrones localizados en los genes codificadores de protefnas se asemejan a los de los genes mitocondriales (vease Cap. 27, El RNA catalftico), por lo que el evento endosimbiotico se ubica en un periodo de Ia evolucion anterior a Ia separacion de las procariotas con genes ininterrumpidos. La funcion de los cloroplastos es Ia fotosintesis. Muchos de sus genes codifican a proteinas de los complejos localizados en las membranas de los tilacoides, cuya constitudon muestra un balance diferente del de los complejos mitocondriales. Si bien algunos de estos complejos son similares a los rnitocondriales debido a que algunas subunidades son codificadas por el genoma de los organelos y otras por el nuclear, otros complejos de cloroplastos son codificados completamente por un genoma.

1111

Las mitocondrias evolucionaron por endosi mbiosis

1.., Como evoluciono una situacion en Ia cual un organelo contiene informacion genetica para algunas de sus funciones, mientras que otras son codificadas en el nucleo? En Ia , I se ilustra el modelo de Ia endosimbiosis de Ia evolucion de las mitocondrias, durante Ia cual, ce!ulas primitivas capturaron a bacterias que proporcionaron las funciones y las estructuras que evolucionaron hacia mitocondrias y cloroplastos. En ese momenta, el proto-organelo debe haber contenido todos los genes necesarios para especificar sus funciones. Las homologfas secuenciales sugieren que mitocondrias y cloroplastos evolucionaron separadamente a partir de linajes comunes a las eubacterias, pero las mitocondrias comparten su origen con las bacterias purpura a y los cloroplastos, con las cianobacterias. Entre las bacterias, el pariente de las mitocondrias mas cercano que se conoce es Rickettsia (agente causal de titus), parasito intracelular obligado que probablemente desciende de bacterias de vida libre, hipotesis que refuerza Ia idea de que las mitocondrias se originaron en un evento endosim-

72


.. Celula primitiva

Endosimbiosis

La bacteria evoluciona y se transforma en una mitocondria, de modo que pierde genes necesarios para Ia vida independiente Los genes son transferidos de Ia mitocondria al nucleo 1

Las mitocondrias se originaron por un evento endosimbi6tico en el cual una bacteria fue capturada por una celula eucari6tica.

biotico en que tambien estuvo involucrado un ancestro comun. Deben haber ocurrido dos cambios, conforme las bacterias se integraron en Ia celula recipiente y evolucionaron hacia mitocondrias (o cloroplastos). Los organelos tienen mucho menos genes que una bacteria independiente y han perdido muchas de las funciones genicas necesarias para Ia vida independiente (como las rutas metabolicas) . La mayorfa de los genes que codifican funciones de los organelos se localizan de hecho en el nucleo, por lo tanto, estos genes deben haber sido transferidos ahf desde el organelo. La transferencia de DNA entre organelo y nucleo ha ocurrido a lo largo de Ia evolucion, y aun continua. La velocidad de transferencia puede medirse directamente al introducir en un organelo un gen que solo puede funcionar en elnucleo, porque, por ejemplo, contiene un intron nuclear o Ia protefna debe funcionar en el citosol. Respecto de Ia provision del material necesario para Ia evolucion, Ia velocidad de transferencia del organelo a! nucleo equivale aproximadamente a Ia de una mutacion genica unica. El DNA introducido en las mitocondrias

transferidO a) nucleO a una tasa de 2 X 10- 5 pOI eneraci6n. Los experimentos para medir la transfe-:-encia en direcci6n opuesta, del nucleo ala mitoconiria, sugieren que la tasa es mucho mas baja,
~intetizaran .

Los mapas filogeneticos muestran que las trans:erencias de genes han sido independientes en mu-·1os linajes diferentes. Parece que las transferencias ·e genes mitocondriales al nucleo ocurrieron solo ::... principia de Ia evoluci6n de las celulas animales, . ero es posible que el proceso todavfa contintle en ..as celulas de las plantas. El numero de transferen.:as puede ser alto; en el organismo Arabidopsis hay > 00 genes nucleares cuyas secuencias estan relacio::adas con las de genes ubicados en los cloroplastos :e otras plantas, los cuales podrian haber evolucio:::ado a partir de genes originados en el cloroplasto.

sos tienden a tener una proporci6n menor de DNA no repetitivo. Aproximadamente el 50% del genarna humano consta de secuencias repetitivas, y la vasta mayorfa corresponde a secuencias de transposones. La mayorfa de los genes estructurales se localiza en el DNA no repetitivo. La cantidad de DNA no repetitivo refleja mucho mejor la complejidad del organismo que el tamafio total del genoma; la mayor cantidad de DNA no repetitivo en los genamas es -2 x 10 9 bp. La herencia no mendeliana se explica por la presencia de DNA en organelos del citoplasma. Las mitocondrias y los cloroplastos son sistemas delimitados por membranas en los cuales algunas protefnas son sintetizadas en el organelo, mientras que otras son importadas. En general, el genoma de los organelos es una molecula circular de DNA que codifica a todas las moleculas de RNA y a algunas de las proteinas requeridas por el organelo. Los genomas mitocondriales varfan enormemente de tamafio, de 16 kb en el genoma minimalista de los mamfferos, a 570 kb en el de plantas superiores . Los genomas mas grandes pueden codificar funciones adicionales. Los genomas de los cloroplastos flucttlan entre 120 y 200 kb; en los secuenciados, Ia organizaci6n y las funciones codificadoras son similares. En las mitocondrias y los cloroplastos, muchas de las proteinas principales contienen algunas subunidades sintetizadas en el organelo y otras importadas del citosol. En las levaduras, las reestructuraciones son muy frecuentes en el DNA mitocondriaL y se ha encontrado recombinaci6n entre los genomas mitocondriales o los genomas de los cloroplastos. Se han observado transferencias de DNA entre los genomas de los cloroplastos o de las mitocondrias y los genomas nucleares.

Referencias

Ill Resumen :...as secuencias de DNA que componen a un genoma .:x ari6tico pueden ser clasificadas en tres grupos: • secuencias no repetitivas unicas; • secuencias moderadamente repetitivas que se dispersan y repiten pocas veces respecto de copias no identicas; • secuencias muy repetitivas, que son cortas y suelen repetirse en forma de secuencias en tandem. Las proporciones de los tipos de secuencias son :_uacterfsticas de cada genoma, aunque mas exten-

Los genomas individuates muestran una variaci6n extensa

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74

Los genes pueden ser aislados par la conservacion de los exones

Artlculos de investigaci6n Buckler, A. J ., Chang, D. D., Graw, S. L., Brook, J.D., Haber, D. A., Sharp, P. A., and Housman, D. E. (1991 _ Exon amplifica tion: a strategy to isolate mammalian genes based on RNA splicing. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 88, 4005-4009. Kunkel. L. M., Monaco, A. P., Middlesworth, W., Ochs, H. D., and Latt. S. A. ( 1985). Specific cloning of DNA fragments absent from the DNA of a male patient witt an X chromosome deletion. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 82, 4778-4782. Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Middlesworth, W., CollettJi. C. A., Aldridge, J., Fischbeck, K. H., Bartlett, R., Pericak- Vance, M . A., Roses, A. D., and Kunkel. L. M. ( 1985) . Detection of deletions spanning the Duchenne muscula r dystrophy locus using a tightly linked DNA segment. Nature 316, 842-845 .

Ill

Los organelos contienen DNA

Artlcu los de investigacion Cann, R. L., Stoneking, M., and Wilson, A. C. ( 1987). Mitochondrial DNA and human evolution. Nature 325, 31-36.

•

Los genomas de los organelos son moleculas circulares de DNA que codifican protelnas de los organelos

Artlculos de revision Lang, B. F., Gray, M. W., and Burger, G. ( 1999). Mitochondrial genome evolution and the origin of euka ryotes. Annu. Rev. Genet. 33, 351-397.

;Por que los genomas son tan grandes?

Artlculos de revision Gall, J. G. (198 1). Chromosome structure and the C-value paradox. J. Cell Bioi. 91, 3s-1 4s.

Bl

Davidson, E. H. and Britte n, R. J. ( 1973). Organization, transcription, and regulation in the animal genome. ( Rev. Bioi. 48, 565-613.


1111

La organizacion del DNA mitocondrial es variable

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IIIJ

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Las mitocondrias evolucionaron par endosimbiosis

Articulos de revision Lang, B. F., Gray. M. W., and Burger, G. ( 1999). Mitochondrial genome evolution and the origin of eukaryotes. Annu. Rev. Genet. 33, 351-397.

Referencias

75

Secuencias gen6micas y numeros de genes ESQUEMA DEL CAPITULO

R:ll -

Introducci6n El numero de genes bacterianos abarca un rango de un orden de magnitud Se conoce el numero total de genes de numerosas eucariotas

se afiaden genes adicionales pa ra formar eucariotas, organismos multicelulares, animates y vertebrados. • La mayoria de los genes unicos de los vertebrados estan relacionados con el sistema nervioso o el inmunol6gico.

U.

• Hay 6 000 genes en una levadura; 18 500 en un gusano; 13 600 en una mosca; 25 000 en la pequeiia planta Arabidopsis y, probablemente de 20 000 a 25 000 en el raton y el hombre.

-

.a

(Cuantos tipos diferentes de genes hay? El genoma humano tiene menos genes de los esperados • S6lo 1% del genoma humano esta forma do por regiones codificadoras. • Los exones forma n -5% de cada gen, por lo tanto, los genes (exones mas intrones) constituyen -25% del genoma. • El genoma humano tiene de 20 000 a 25 000 genes. • -60% de los genes humanos son sometidos a corte y empalme alternativo. • Hasta el 80% de los cortes y empalmes alternativos cambian la secuencia proteinica, de manera que el proteoma tiene -50 000 a 60 000 .

_..

(Como se distribuyen los genes y otras secuencias

BI!I

Bll

_.

DR

• La comparaci6n de diferentes genomas muestra un incremento constante en el numero de genes conforme

76

El numero de genes expresados puede medirse en mas a • La tecnologia del chip permite tomar una instantanea de la expresi6n del genoma completo de una unidad celular de levadura. • -75% (-4 500 genes) del genoma de las levaduras se expresa en condiciones de cultivo normales. • La tecnologia del chip permite comparar detalladamente celulas animates relacionadas para determinar (por ejemplo) las diferencias de expresi6n entre una celula normal y una cancerigena.

El cromoso ma Ytiene varios genes espedficos de la masculinidad

Las especies mas complejas evolucionan agregando nuevas funciones genicas

(Cuantos genes se expresan? • Los RNAm expresados en niveles bajos se superponen ampliamente en comparaciones de tipos de celulas. • Las moleculas de RNAm abundantemente expresadas suelen ser especlficas del tipo de celula. • -10 000 genes expresados pueden ser comunes a la mayoria de los tipos celulares de una eucariota superior.

• Las secuencias repetidas (presentes en mas de una copia) representan >50% del genoma humano. • La mayor parte de las secuencias repetidas esta formada por capias de transposones no funcionales. • Hay numerosas duplicaciones de extensas regiones cromos6micas.

• El cromosoma Y tiene -60 genes que se expresa n especlficamente en los testkulos. • Los genes espedficos de la masculinidad estan en multiples capias de segmentos cromos6micos repetidos. • La conversion genica entre capias multiples permite el mantenimiento de los genes activos durante la evoluci6n.

Los genes se expresan en niveles muy diferentes • En una celula dada, la mayoria de los genes se expresa en niveles bajos. • Solo un pequefio numero de genes, cuyos productos son especializados para un tipo celular especifico, se expresan amp liamente.

en el genoma?

-

(Cuantos genes son esenciales? • No todos los genes son esenciales. En las levaduras y las moscas, las deleciones de <50% de los genes tienen efectos detectables. • Cuando dos o mas genes son redundantes, una mutaci6n en cualquiera de ellos puede no tener efectos detectables. • No se sabe porque sobreviven los genes que aparentemente son prescindibles en el genoma.

IJIDI

Resumen

Introducci6n Desde que en 1995 se secuenciaron los primeros genomas, Ia velocidad y el rango de secuenciacion han mejorado extraordinariamente. Los primeros genomas secuenciados fueron genomas bacterianos pequenos, de <2 Mb, hacia 2002, el genoma humano de 3 000 Mb habfa sido secuenciado. A Ia fecha se han secuenciado los genomas de una gran variedad de organismos, entre otros, las bacterias, las arqueobacterias, las levaduras, las eucariotas inferiores, las plantas y los animales, incluidos, en este ultimo caso, gusanos, moscas, roedores y algunos mamfferos. Quiza la informacion mas importante derivada de Ia secuencia de un genoma sea el numero de genes. Mycoplasma genitalium, bacteria intracelular obligada, tiene el genoma mas pequeno conocido de cualquier organismo, de solo -470 genes; el genoma e las bacterias de vida libre oscila entre I 700 y 7 500. Los genomas de las arqueobacterias abarcan un rango similar; los de las eucariotas unicelulares empiezan en aproximadamente 5 300 genes, en tano que los de gusanos y moscas tienen unos 18 500 _, l3 500 genes, respectivamente; sin embargo, ese numero se incrementa solo a -25 000 en el raton y el hombre. En la se resume el numero mfnimo de genes encontrado en seis grupos de organismos. Para formar una celula se necesitan -500 genes; -1 500 para una celula de vida libre; > 5 000 para 'Jna celula con nucleo; > 10 000 para un organismo :nulticelular y > 13 000 para un organismo con sis:ema nervioso, pero obviamente muchas especies pueden tener mas del numero mfnimo necesario _ara su tipo, por lo que el numero de genes varia enormemente, aun entre especies fntimamente re:a cionadas. En las bacterias y las eucariotas inferiores, Ia :::1ayorfa de los genes son l'micos, sin embargo, en :os genomas de las eucariotas superiores, los genes " ueden diviclirse en familias de relaciona :! s. No hay duda de que algunos genes son unicos :ormalmente la familia tiene un so lo miembro) , ~ ero muchos pertenecen a familias de diez 0 mas :::1iembros. El numero de farnilias puede estar mejor :e acionado con Ia complejidad global del organis:::w que el numero de genes. Parte de Ia informacion mas reveladora provie::::e de la comparacion de secuencias de genomas. ~. n las secuencias del genoma humano y del geno:::!a del chimpance de que se dispone actualmente, _ posible empezar a abordar algunos de los aspec~0s de Ia interrogante sobre que hace l'micos a los ·::JIDanos.

500 genes Bacteria extracelular (parasitaria)

.

1500 genes Bacteria de vida libre

·. '"· .

(<). ..

.

.

.

/'

5000 genes Eucariota unicelular

13 000 genes Eucariota multicelular

25 000 genes Plantas superiores

25 000 genes Mamfferos

El numero minima de genes requerido por cualquier tipo de organismo incrementa con su complejidad. Fotografta de bacteria extracelular cortesia de Gregory P. Henderson and Grant J. Jensen, California Institute of Technology. Fotografta de celula de vida libre cortesia de Karl 0. Stetter, Universitat Regensburg. Fotografta de eucariota unicelular cortesia de Eishi Noguchi, Drexel University College of Medicine. Fotografta de eucariota multicelular cortesia de Carolyn B. Marks and David H. Hall, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY. Fotografta de planta superior cortesia de Keith Weller/USDA. Fotografta de mamifero © Photodisc.

Ill

El numero de genes bacterianos abarca un ra ngo de un orden de magnitud

Los intensos estuclios actuales han perrnitido la secuenciacion de numerosos genomas, entre otros, los , en Ia cual se describe el incluidos en la tamaii.o de algunos de ellos, que vade 0.6 x 106 bp del micoplasma a 3.3 x 109 bp del genoma humano; se incluyen numerosos animales experimentales importantes, como las levaduras, Ia mosca de Ia fruta y un gusano nematodo.

5.2 El numero de genes bacterianos abarca un rango de un orden de magnitud

77

I

t

I

Especies

•

I

•

•

I

Genomas (Mb)

•

..

Genes

t

I

Loci letales

Mycoplasma genitalium

0.58

470

Rickettsia prowazekii

1.11

834

Haemophilus influenzae

1.83

1 743

Methanococcus jannaschii

1.66

1 738

B. subtilis

4.2

4 100

E. coli

46

4 288

1 800

S. cerevisiae

13.5

6 034

1 090

S. pombe

12.5

4 929

A. thaliana

119

25 498

0. sativa (arroz)

466

-30 000

D. melanogaster

165

13 601

C. elegans

97

18 424

H. sapiens

3 300

-300

3100

-25 000

En numerosos organismos se conocen los tamafios de los genomas y los numeros de genes a partir de secuencias completas. Los loci letales se estiman a partir de bases de datos geneticos.

6000 (/)

Q)

c

~

4 000 2 000

2 5 6 Tamaiio del genoma (Mb) • Bacterias parasitarias obligadas • Otras bacterias • Archaea

7

8

El numero de genes de los genomas de las bacterias y de las archaea es proporcional al tamafio del genoma.

Las secuencias de los genomas de las bacterias y de las arqueobacterias demuestran que virtualmente todo el DNA (tfpicamente del 85 al90%) codifica a se moleculas de RNA o a protefnas. En la observa que el rango de dimensiones de los genomas es aproximadamente de un arden de magnitud y que las del genoma son proporcionales al numero de genes, que suele tener una longitud aproximada de l 000 bp. 78

CAPITU LO 5 Secuencias gen6micas y numeros de genes

Todas las bacterias con genomas de menos de l. 5 Mb son parasitos intracelulares obligados, es decir, viven en un hospedador eucariotico que les proporciona moleculas pequeiias. Sus genomas corresponden al numero mfnimo de funciones n ecesarias para construir una celula. El numero de todas las clases de genes es mas reducido respecto de las bacterias con genomas mas grandes, pero la reduccion mas significativa se observa en los loci que codifican a enzimas relacionadas con funciones metabolicas (que dependen principalmente de la celula h ospedadora) y con la regulacion de Ia expresion genica. Mycoplasma genitalium tiene el genoma mas pequeiio, formado por -470 genes. Las propiedades biologicas de las archaea estan entre las de las procariotas y las de las eucariotas, no obstante, el tamaiio de su genoma y el numero de genes estan en el mismo rango que el de las bacterias. Dichas dimensiones fluctuan entre 1.5 y 3Mb, que corresponde a l 500 a 2 700 genes. Methanococcus jannaschii es una especie productora de meta no que vive en condiciones de alta presion yalta temperatura, y el numero total de genes que contiene es similar a! de Haemophilus influenzae, aunque apenas unos cuantos pueden ser identificados comparandolos con genes conocidos de otros organismos. Sus mecanismos de expresion genica son mas parecidos a los de las eucariotas que a los de las procariotas, pero el mecanismo de division celular se asemeja mas al de estas ultimas. En las archaea y las bacterias de vida libre mas pequeiias se identifica el numero mfnimo de genes necesarios para formar una celula susceptible de funcionar de manera independiente en el entorno; su genoma mas pequeiio tiene -1 500 genes. La bacteria de vida libre con el genoma mas pequeiio conocido es el term6filo Aquifex aeolicus, que mide 1.5 Mb y tiene 1 512 genes. Una bacteria gramnegativa "tfpica", H. injluenzae, tiene 1 743 genes, cada uno de -900 bp. Por ello, se puede concluir que el numero de genes necesarios para formar un organismo de vidalibreesde-1500. Las dimensiones de los genomas bacterianos cubren mas o menos un orden de magnitud, de 0.6 Mb a <8 Mb, y los mas grandes contienen mas genes. Las bacterias cuyos genomas son los mas grandes, Sinorhizobium meliloti y Mesorhizobium loti, son bacterias fijadoras de nitr6geno que viven en las rafces de las plantas. El tamaiio de sus genomas (-7 Mb) y el numero total de genes (>7 500) son similares a los de las levaduras. El tamaiio del genoma de E. coli es intermedio; la cepa comun de laboratorio tiene 4288 genes y una longitud promedio de -950 bp; la separaci6n promedia entre geneses de 118 bp. No obstante, puede haber diferencias muy significativas entre cepas: los

extremos conocidos van de 4.6 Mb y 4 249 genes de la cepa mas pequena, a 5.5 Mb y 5 36 1 genes de lamas grande. Todavfa se desconocen las funciones de todos los genes. En la mayorfa de estos genomas, -60% de los genes pueden ser identificados con base en la homologacion con genes conocidos de otras especies, los cuales se distribuyen mas o menos de manera equivalente en clases cuyos productos se relacionan con el m etabolismo, la estructura celular y el transporte de componentes, asf como con la expresion genica y su regulaci6n, si bien virtualmente a >25 % de los geneses imposible atribuirle una funcion; muchos se encuentran en organismos relacionados, lo cual implica que se ha conservado la funci6n. Por su importancia medica, se ha h echo enfasis en la secuenciacion de los genomas de las bacterias patogenas, y una perspectiva importante de la naturaleza de la patogenia proviene de la demostracion de que las "islas de patogenicidad" son un rasgo caracterfstico de sus genomas. Dichas "islas" son regiones extensas, de -10 a 200 kb, presentes en los genomas de especies pat6genas, pero no en los genomas de las variantes no pat6genas de la misma especie o de una especie relacionada . Su contenio de G-C su ele diferir del contenido del resto del oenoma, y es probable que estas bases migren en:re bacterias merced a un proceso de transferencia ::-torizontal. Por ejemplo, la bacteria qu e provoca el 3ntrax (Bacillus anthracis) tiene dos plasmidos (DNA extracromosomico ) grandes, uno de los cuales tiene :ma isla de patogenicidad qu e incluye el gen codifi·ador de la toxina del antrax.

En numerosas eucariotas se conoce el numero total de genes Concepto principal Hay 6 000 genes en una levadura; 18 500 en un gusano; 13 600 en una mosca; 25 000 en la pequeiia planta Arabidopsis y, probablemente -25 000 en el raton y el hombre.

-=-an pronto como se observan los genom as euca. :oticos, se pierde Ia relacion entre su tamano y el .. Ci mero de genes. Los genomas de las eucariotas ~'1icelulares estan en el mismo rango de tamafio ~e los genomas bacterianos mas grandes. Las euca --: tas superiores tienen mas genes, pero el numero - se correlaciona con el tamafio del gen oma, como . ..:ede observarse en la La informacion mas amplia sobre las eucario~- i.nferiores se relaciona con las secuencias de los '"-:::10mas de las levaduras Saccharomyces cerevisiae y

Arroz •

40 000

-- Raton • Humane •

(/) 30 000

c

• Arabidopsis

20 000

• C. elegans • D. melanoga.ster

10 000 S. cerevisiae ; S. pombe

100

200

300

400

500

3000

Tamaiio del genoma (Mb)

El numero de genes de una eucariota varia de 6 000 a 40 000, pero no se correlaciona con el ta maiio del genoma ni con la complejidad del organismo.

5% de los genes de S. cerevisiae tiene en promedio un intr6n

1400 bp

t 1 426 bp

200 bp Espacio intergenico

~

\

lntrones

\

500bp 43% de los genes de S. pombe tienen intrones El gen interrumpido promedio tiene 2 intrones

El genoma de 5. cerevisiae, de 13.5 Mb, tiene 6 000 genes, casi todos interrumpidos. El genoma de 5. pombe, de 12.5 Mb, tiene 5 000, de los cuales, casi la mitad tiene intrones. Las dimensiones de los genes y el espaciamiento son bastante si mila res.

Schizosaccharomyces pombe, cuyas caracterfsticas mas importantes se resumen en la . Los genomas de las levadura s de 12.5Mb y 13.5Mb tienen - 5 000 y -6 000 genes, respectivamente. El marco de lectura abierto (ORF, open reading frame) promedio mide - 1.4 kb, de manera qu e - 70% del genoma lo ocupan regiones codificadoras. La diferencia principal entre estas cepas es que solo el 5% de los ge nes deS. cerevisiae tiene intrones, respecto del 43 % de los genes de S. pombe. La densidad de genes es alta, y la organizaci6n suele ser similar, aunque los espacios entre los genes son un poco mas cortos en S. cerevisiae. Cerca de Ia mitad de los genes identificados por secuenciaci6n ya se conocfan o estaban relacionados con gen es conocidos, los demas son n uevos, indicio del numero de tipos nuevos que pueden ser descubiertos. La identificaci6n de marcos de lectura extensos con base en la secuencia es muy precisa, pero los ORF que codifican a <100 aminoacidos no pueden ser identificados unicam ente mediante secuencia ci6n porIa elevada incidencia de falsos positivos. El ::: .~

En numerosas eucariotas se conoce el numero total de genes

79

• Transcripci6n

D Traducci6n D Estructura protefnica •

Cicio y muerte celular

0 Citoesqueleto • Enzimas D Transducci6n de senal Adhesion celular

o

Transportadores/ canales Desconocida

-20% de los genes de Drosophila codifican a prote\nas implicadas en el mantenimiento o la expresi6n de los genes; -20% codifican a enzimas y <10% a proteinas relacionadas con el ciclo celular o con la transducci6n de seiia l. La mitad de los genes de Drosophila codifican a productos cuya funci6n se desconoce.

analisis de la expresion genica sugiere que de -300 a 600 de dichos ORF en S. cerevisiae tienden a ser genes genuinos. Una forma eficaz de validar la estructura genica consiste en comparar secuencias de especies intimamente relacionadas; si un gen esta activo, es probable que se conserve. La comparacion de las secuencias de cuatro especies de levaduras fntimamente relacionadas sugiere que 503 de los genes originalmente identificados enS. cerevisiae no tienen contraparte en las otras especies y, por lo tanto, deberian ser eliminadas del catalogo, con lo cual, el numero total de genes para S. cerevisiae se reduce a 5 726. El genoma del DNA de Caenorhabditis elegans varia entre regiones ricas en genes y otras en las cuales escasean. La secuencia total contiene - 18 500, pero solo - 42% tiene contra partes putativas fu era de los nematodos. Aunque el genoma de la mosca es mas grande que el del gusano, D. melanogaster tiene menos genes (13 600), y como resultado del corte y empalme alternativo, el numero de transcritos diferentes es ligeramente mayor (14 100). Nose sabe porque la mosca, que es un organismo mucho mas complejo, tiene solo el 70% de genes del gusano, lo cual subraya enfaticamente la falta de una relacion exacta entre el numero de genes y la complejidad del organismo. El tamafio del genoma de Ia planta Arabidopsis thaliana esta entre el del gusano y el de Ia mosca, pero su numero de genes es mayor (25 000), fenomeno que demuestra nuevamente que no hay una relacion clara y subraya tambien la calidad especial de las plantas, que pueden tener mas genes (debido a duplicaciones ancestrales) que las celulas animales. Gran parte del genoma de Arabidopsis se encuentra en segmentos duplicados, lo cual sugie80

CAPITULO 5 Secuencias gen6micas y numeros de genes

re que bubo una duplicacion ancestral del genoma (para dar Iugar a un tetraploide); solo el35 % de los genes de Arabidopsis son copias individuates. El genoma del arroz (Oryza sativa) es -4 veces mas grande que el de Arabidopsis, pero el numero de sus geneses solo -50 % mayor, probablemente -40 000. El DNA repetitivo ocupa del 42 a! 45 % del genoma. Mas del 80% de los genes encontrados en Arabidopsis estan representados en el arroz, y de estos genes comunes, -8 000 se encuentran en Arabidopsis y en el arroz, pero no en los genomas bacterianos o animales que han sido secuenciados. Este es probablemente el conjunto de genes que codifica funciones especificas de las plantas, como la fotosfntesis . A partir del genoma de la mosca es posible darse una idea de cuantos genes estan dedicados a se dividen las cada tipo de funcion. En Ia funciones en categorfas diferentes. Entre los genes identificados, se encuentran 2 500 enzimas, -750 factores de transcripcion, -700 transportadores y canales de iones y -700 proteinas implicadas en la transduccion de senates. Poco mas de Ia mitad de los genes codifica a productos de funcion desconocida. Aproximadamente el 20% de las proteinas reside en las membranas. El tamafio de las proteinas se incrementa de las procariotas y las archaea, a las eucariotas. El tamafio promedio de las proteinas de Ia archaea M. jannaschii y la bacteria E. coli fluctua entre 287 y 317 aminoacidos, respectivamente, mientras que S. cerevisiae y C. elegans tienen longitudes promedio de 484 y 442 aminoacidos, respectivamente. Las protefnas grandes (de 500 aminoacidos) son raras en las bacterias, pero constituyen un elemento importante (-113) de las eucariotas. El incremento de longitud se debe a Ia agregacion de dominios adicionales, cada uno de los cuales constituye de 100 a 300 aminoacidos; no obstante, el mayor tamafio de las proteinas causa solo una parte muy pequefia del incremento del tamafio del genoma . Otra perspectiva del numero de genes se obtiene al con tar el numero de genes expresados. Basandose en las estimaciones del numero de especies de RNAm que pueden contarse en una celula, se puede concluir que una celula promedio de un organismo vertebrado expresa de -10 000 a 20 000 genes. Las significativas superposiciones entre poblaciones de mensajeros en diferentes tipos de celulas sugeririan que el numero total de genes expresados en el organismo deberia rebasar por poco esa cantidad. La estimacion de 20 a 25 000 para el total del genoma humano (vease Ia secci6n 5.5, El genoma humano tiene menos genes de los esperados) implicarfa que una proporcion significativa del numero total de genes de hecho se expresa en cualquier celula dada.

Los genes eucari6ticos se transcriben de manera individuaL y cada uno produce un mensajero monocistr6nico, y solo hay una excepci6n general a esta regia: en el genoma de C. elegans, - 15 % de los genes -stan organizados en unidades policistr6nicas (asodadas con el uso del empalme en trans para permitir :a expresi6n de los genes en cascada en estas unidajes; vease Ia secci6n 26. 13, Las reacciones de empal::ne en trans utilizan moleculas pequefias de RNA).

l. Cuantos tipos diferentes de genes hay? .-\.lgunos genes son {micos, en tanto que otros pertea familias cuyos estan relacionados pero usualmente no son identicos). La proporci6n j e genes {micos se reduce con el tamafio del ge:1oma y Ia proporci6n de genes en familia se in::rementa. El numero mfnimo de familias de genes :1ecesario para codificar a una bacteria es > 1 000, ·Jna leva dura, >4 000 y una eucariota superior, de ~ 1 000 a 14000. Algunos genes estan presentes mas de una vez :~ se relacionan entre sf, de modo que el numero ~e tipos de genes es menor que el nl'tmero total de ::enes. El numero to tal de genes se puede dividir -:n conjuntos cuyos estan relacionados, :egun se define al comparar sus exones. (Una fa=lilia de genes surge por Ia duplicaci6n de un gen ~e1cestral seguida de Ia acumulaci6n de cambios de ~ecue ncia entre copias. Es muy frecuente que los ::~iembros de una familia esten relacionados, pero :1 son identicos.) El numero de tipos de genes se ~alcula sumando el numero de genes unicos (para s cuales no hay otro gen relacionado) al n6mero ~:: familias que tienen dos 0 mas . En Ia se compara el nt1mero total de : enes con el nl'tmero de familias distintas de cada ~:10 de seis genomas. En las bacterias, Ia mayoria de _ genes son l'micos, asi que el numero de familias · ·.stintas se acerca a! numero total de genes. La si--Jaci6n es diferente incluso en Ia eucariota inferior _-_:erevisiae, en Ia cual hay una proporci6n significa---:a de genes repetidos. El efecto mas sobresaliente :-; que el numero de genes se incrementa abrup'.illlente en las eucariotas superiores, no asi el de · ~_:nilias, que no cambia considerablemente. se demuestra que Ia proporci6n En Ia -" genes unicos disminuye bruscamente con el ta~ aiio del genoma. Cuando los genes se presentan ::-::. familias, el numero de de una familia __ reducido en las bacterias y las eucariotas inferio-- . pero aumenta en las eucariotas superiores. Gran - m e del tamafio adicional del genoma de Arabidop.: se debe a familias de >4 . ~ ecen

Numerosos genes estan duplicados, de modo que el numero de familias es mucho menor que el numero total de genes. En el histograma se compara el numero total de genes con el numero de familias de genes

Genes unicos

Familias Familias de 2-4 de >4

H. influenzae

89%

10%

1%

S. cerevisiae

72%

19%

9%

D. melanogaster

72%

14%

14%

C. elegans

55%

20%

26%

A tha!iana

35%

24%

41%

La proporci6n de los genes presentes en multiples capias se incrementa con el tamaiio del genoma en las eucariotas superiores.

Si todos los genes se expresan, el numero total representaria el numero total de protefnas necesarias para constituir el organismo (proteoma) , sin embrago, dos efectos significan que el proteoma es diferente del numero total de genes. Por una parte, los genes estan duplicados, y como resultado, algunos codifican a Ia misma protefna (aunque puede expresarse en un tiempo o Iugar diferente) y otros pueden codificar a proteinas relacionadas que, nuevamente, tienen Ia misma funci6n en diferentes tiempos y lugares. El proteoma puede ser mas grande que el numero de genes porque algunos pueden producir mas de una proteina mediante corte y empalme alternativo. (__Que es el proteoma fundamental, el numero bcisico de tipos diferentes de protefnas del organismo? El numero de familias de genes proporciona 5.4 ;,Cuantos tipos diferentes de genes hay?

81

80%

60%

40%

Comunes a todas las eucariotas

Adicional en eucariotas multicelulares

Especfticas del genera

El genoma de la mosca puede dividirse en genes que podr1an estar presentes en todas las eucariotas, en genes adicionales que probablemente estan en todas las eucariotas multicelulares y en genes mas especificos de subgrupos de especies incluidas las moscas.

un mfnimo estimado, 1400 en las bacterias, >4 000 en las levaduras y 11000 a 14000 en Ia mosca y el gusano. i_Cual es Ia distribucion del proteoma entre tipos de protefnas? Las 6 000 proteinas del proteoma de las levaduras incluyen 5 000 proteinas solubles y 1 000 transmembrana; aproximadamente la mitad son citopliismicas, un cuarto se encuentran en el nucleolo y el resto se dividen entre las mitocondrias y el retfculo endoplasmico (ER, endoplasmic reticulum)laparato de Golgi. LCuantos genes son comunes a todos los organismos (o a grupos como las bacterias o las eucariotas superiores) y cuantos son especfficos de cada tipo de organismo? En la se resume Ia comparacion entre levaduras, gusanos y moscas . Los genes que codifican a protefnas correspondientes en diferentes organismos se denominan ort6logos. Funcionalmente, suele considerarse que dos genes que se encuentran en organismos diferentes pueden realizar funciones correspondientes si sus secuencias son similares en >80% de la longitud. Con base en este criterio, -20% de los genes de Ia mosca tienen ortologos en las levaduras y los gusanos, genes que probablemente sean necesarios para todas las eucariotas. La proporcion se incrementa a 30% cuando se compara a moscas y gusanos, lo cual probablemente representa Ia suma de las funciones genicas comunes a las eucariotas multicelulares. Esto aun deja una gran proporcion de genes como codificadores de protefnas necesarias espedficamente para las moscas o los gusanos, respectivamente. El proteoma puede deducirse a partir del numero y las estructuras de los genes, y tambien medir82


se directamente al analizar el contenido protefnico total de una celula o un organismo. Mediante dichas metodologias se ha identificado a algunas protefnas no sospechadas con base en el analisis del genoma, lo cual ha conducido a Ia identificacion de genes nuevos . Para el analisis a gran escala de las protefnas se utilizan numerosos metodos . La espectrometria de masas permite separar e identificar protefnas en una mezcla obtenida directamente de celulas o tejidos. Las protefnas hibridas etiquetadas pueden obtenerse por expresion de moleculas de DNAc creadas alligar las secuencias de los ORF con vectores de expresion apropiados que incorporan a las secuencias por etiquetas de afinidad, lo cual permite utilizar el analisis de matriz para evaluar los productos. Estos metodos tambien pueden ser efectivos para comparar protefnas provenientes de dos tejidos, por ejemplo, un tejido de un individuo sano y el de un enfermo, para determinar con precision las diferencias. Una vez que se conoce el numero total de proteinas, entonces se puede preguntar como interactuan. Por definicion, las proteinas que se encuentran en ensambles estructurales de protefnas multiples deben formar interacciones estables entre elias, pero las protefnas de las rutas de sefializacion interactuan de manera transitoria. En ambos casos, dichas interacciones pueden detectarse en sistemas experimentales en que un sistema de lectura amplfa esencialmente el efecto de la interaccion. Un sistema popular es el de dos hibridos, analizado en Ia seccion 25.3, Los dominios independientes se unen a! DNA y activan Ia transcripcion. Dichos sistemas no detectan a todas las interacciones: por ejemplo, si en una ruta metabolica una enzima Iibera a un metabolito soluble que interactua posteriormente con la siguiente enzima, las protefnas pueden no interactuar de forma directa. En terminos practicos, los analisis de interacciones en pares pueden indicar el numero minimo de estructuras independientes o rutas. Un analisis de Ia capacidad de las 6 000 protefnas (pronosticadas) de las levaduras para interactuar en pares muestra que -1 000 pueden unirse cuando menos a otra protefna. Mediante analisis directos de formacion de complejos se han identificado 1 440 protefnas diferentes en 232 complejos multiprotefnicos . Este es el principia de un ana !isis que conducira a Ia definicion del numero de ensambles funcionales o rutas. En un analisis comparable de 8 100 protefnas humanas se identificaron 2 800 interacciones, pero es mas dificil de interpretar debido a las mayores dimensiones del proteoma. Ademas de los genes funcionales, hay copias de genes que se han tornado no funcionales (identificados como tales por interrupciones de sus secuencias

codificadoras de proteinas) y que se conocen como seudogenes (vease Ia seccion 6.6, Los seudogenes son callejones sin salida de Ia evolucion), cuyo numero puede ser alto. En el genoma del raton y el humano, el numero de seudogenes es -10% del numero de genes (potencialmente) activos (vease Ia seccion 4.8, La conservacion de Ia organizacion del genoma ayuda a identificar genes). Ademas de Ia necesidad de conocer la densidad e los genes para estimar el numero total de estos, se impone preguntar (.Cual es su importancia?; (.que ::-estricciones estructurales hacen necesario que es:en espaciados, y si esto comribuye al gran tamano j e los genomas eucarioticos?

El genoma humano tiene menos genes de los esperados Conceptos principales • S6lo 1% del genoma humano esta formado por regiones codificadoras. • Los exones forman -5% de cada gen, por lo tanto, los genes (exones mas intrones) constituyen -25% del genoma. • El genoma humano tiene de 20 000 a 25 000 genes. • -60% de tos genes humanos son sometidos a corte y empalme alternativo. • Hasta el80% de los cortes y empalmes alternativos cambian la secuencia protelnica, de manera que el proteoma tiene -50 000 a 60 000 .

:=: genoma

humano fue el primer genoma de los ::-ganismos vertebrados en ser secuenciado. Esta =-~orme tarea ha revelado informacion valiosa res- :-cto de la composicion genetica de nuestra especie e la evolucion del genoma en general, ademas _:: que los conocimientos se han profundizado por o -apacidad de comparar Ia secuencia del genoma _ ·mano con el genoma del raton, secuenciado mas -~ :ientemente.

El genoma de los mamiferos y el de los roe- :es generalmente se encuentran en un rango de 1ensiones estrecho, -3 x 109 bp (vease Ia seccion .., ::.. (.For que los genomas son tan grandes?). El ::o-=-:10ma del raton es -14% mas pequeno que el hu- -=.:1.0, probablemente porque ha tenido una tasa de .:.ecion mas alta. Los genomas contienen familias _:: aenes y genes similares, y de estos, Ia mayoria :- .. e un ortologo en el otro genoma, pero con dife-: . ias en el numero de de una familia, -=- _cialmente en los casos en que las funciones son - ::cificas de cada especie (vease Ia seccion 4.8, La ervacion de Ia organizacion del genoma ayuda _ ~entificar genes). Ahora se cree que el genoma

Todos los

Codificadores de RNA

30000 ~~--~r--------------------,

25 000

• Genes • Seudogenes

1000

20 000

800

15 000

600

10 000

400 200

El genoma del raton tiene -30 000 genes codificadores de protelnas, los cuales tienen -4 000 seudogenes. Hay -1600 genes codificadores de RNA. Los datos de los genes codificadores de RNA se esquematizan a la derecha, en una esca la ampliada, para demostrar que hay -800 genes de RNAr, -450 genes de RNAt, -150 seudogenes y -350 genes miscelaneos no codificadores de RNA, incluidos RNAsn y RNAmi.

del raton, del cual originalmeme se penso que tenfa -30 000 genes, tiene casi el mismo numero de genes qu e el genoma humano, de 20 000 a 25 000. En Ia se representa Ia distribucion de los genes del raton. Los 30 000 genes codificadores de protefnas estan acompafiados por -4000 seudogenes. Hay -800 genes que represeman a moleculas de RNA que no codifican protefnas, los cuales generalmente son pequenos (excepto las moleculas de RNA ribosomico). Aproximadamente Ia mitad de estos genes codifican a RNA de transferencia, para los cuales tambien ha sido identificado un numero importante de seudogenes. El genoma humano (haploide) contiene 22 autosomas mas el cromosoma X y el Y. El tamafio de los cromosomas varia de 45 a 279 Mb de DNA, qu e resulta en un contenido total del genoma de 3286Mb (- 3.3 x 109 bp). Con base en Ia estructura cromosomica, el genoma total puede dividirse en regiones de eucromatina (que contienen potencialmente genes activos) y de h eterocromatina (vease Ia seccion 28.7, La cromatina se divide en eucromatina y en h eterocromatina) . La eu cromatina com prende la mayor parte del genoma, - 2.9 x 109 bp . La secuencia identificada del genoma representa -90% de la eucromatina. Ademas de proporcionar informacion sobre el contenido genetico del genoma, la secuencia tambien identifica caracterfsticas que pu eden ser de importancia estru ctural (vease la seccion 28. 8, Los cromosomas tienen patrones de distribucion en bandas) . 5.5 El genoma humano tiene menos genes de los esperados

83

En la se muestra que una pequefia proporcion (- l%) del genoma humano es representada por exones que, de hecho, codifican a proteinas. Los intrones que constituyen las secuencias restantes en los genes llevan el total del DNA implicado en la produccion de proteinas a -25 por ciento. Como se observa en la , el gen humano promedio tiene una longitud de 27 kb, con nueve exones que incluyen una secuencia codificadora total de l 340 bp. La secuencia codificadora promedio representa, por Jo tanto, solo el 5% de Ia longitud del gen. Dos esfuerzos independientes de secuenciar el genoma humano resultaron en estimados de -30 000 y 40 000 genes, respectivamente. Una forma de determinar la precision de los analisis consiste en averiguar si identifican a los mismos genes, y Ia sorprendente respuesta es que Ia superposicion entre uno y otro conjunto de genes es de solo -50%, como se resume en la . En un analisis anterior del conjunto de genes humanos, basado en transcritos de RNA, se identificaron - ll 000 genes,

de los cuales casi todos estan en los dos grandes conjuntos de genes humanos y representan la mayor parte de la superposicion entre ellos. As( pues, no hay duda de Ia autenticidad de Ia mitad de cada conjunto de genes humanos, pero todavfa se tiene que establecer la relacion entre Ia mitad restante de cada uno de los conjuntos. jLas discrepancias ilustran los riesgos del analisis de secuencias a gran escala! Conforme se analiza la secuencia (y conforme son secuenciados otros genomas con los que puede ser comparada), el numero de genes validos parece declinar, de modo que ahora suele pensarse que son - 20 000 a 25 000. Sea como sea, el numero total de genes humanos es mucho menor de lo esperado; la mayor parte de las estimaciones anteriores ala secuenciacion del genoma fueron de -100 000. El numero total de genes muestra un incremento relativamente pequefio respecto de las moscas y los gusanos (13 600 y 18 500, respectivamente), sin mencionar a Ia planta Arabidopsis (25 000) (vease la Fig. 5.2). Sin embargo, no debe sorprender Ia noci6n de que no se necesita un gran numero de genes adicionales para formar un organismo mas complejo. La diferencia de las secuencias de DNA del hombre y el chimpance es extremadamente pequefia (la similitudes >99%), de modo que es obvio que las funciones y las interacciones entre un conjunto similar de genes pueden producir resultados muy diferentes. Las funciones de grupos especfficos de genes pueden ser especialmente importantes, debido a que comparaciones detalladas de genes ortologos en el hombre y el chimpance sugieren una evolucion acelerada de ciertas clases de genes, incluidas algunas implicadas en el desarrollo temprano, el olfato, Ia audici6n, todas funciones relativamente especfficas de las especies. El numero de genes es menor que el numero de protefnas potenciales debido al corte y empalme alternativo, cuya extension es mayor en el hombre que en las moscas o los gusanos y puede afectar hasta el60% de los genes, de manera que el incremen-

DNA repetitivo

Exones =1% lntrones = 24%

Otro DNA intergenico

Los genes ocupan el 25% del genoma humano, si bien las secuencias codificadoras de prote\nas son solo una pequefia parte de esta fracci6n.

7 exones internos de una longitud promedio de 145 bp

~

~

~

~

~

~

~

3

4

5

6

7

8

lntr6n promedio =3 365 bp

J

3' UTR = 770

9

bpj

El gen humano promedio tiene una longitud de 27 kb y nueve exones, de los cuales, dos suelen ser mas largos y estar en cada extrema, y siete exones internos. Las UTR de los exones terminales son regiones no traducidas (no codificadoras) localizadas en cada extrema del gen . (Estos datos se basan en el promedio. Algunos genes son extremadamente largos, de modo que la mediana de la longitudes de 14 kb, con siete exones.)

84


Transposones = 45%

Totales

Totales 39 114

29 691

Genesya conocidos

Duplicaciones grandes = 5% Repeticiones simples = 3% Otro DNA intergenico = 22%

Los dos conj untos de genes identificados en el genoma humano se superponen solo parcialmente, como se: muestra en los dos drculos grandes de la parte superior, no obstante, estos incluyen casi todos los genes previamente conocidos, como lo demuestra la superposici6n con el c\rculo inferior mas pequefio.

to de tamaiio del proteoma humano en relacion con el de otras eucariotas puede ser mayor que el incremento en el numero de genes. Una muestra de genes provenientes de dos cromosomas sugiere que la proporcion de cortes y empalmes alternativos, que de hecho resultan en cambios en las secuencias de las protefnas, puede ser hasta del 80 por ciento, Lo cual puede incrementar el tamafio del proteoma a 50 000 a 60 000 . Sin embargo, en cuanto ala diversidad del numero de familias de genes, la discrepancia entre el hombre y otras eucariotas puede no ser tan grande. .\1uchos de los genes humanos pertenecen a familias: en un analisis de -25 000 genes se identificaron 3 500 unicos y l 0 300 pares. Como puede observarse en la Figura 5.7, esto se extrapola a un numero de familias de genes solo un poco mayor que en los gusanos o las moscas.

Ill

tC6mo se distribuyen Los genes y otras secuencias en el genoma?

Conceptos principales • Las secuencias repetidas (presentes en mas de una copia) representan >50% del genoma humano. • La mayor parte de las secuencias repetidas esta formada por capias de transposones no funcionales. • Hay numerosas duplicaciones de extensas regiones cromos6micas.

·Los genes se distribuyen uniformemente en el ge:wma? Algunos cromosomas cuentan con pocos

Exones = 1%

lntrones = 24%

El componente mas grande del genoma esta formade por transposones. Otras secuencias repetitivas incluyen duplicaciones extensas y repeticiones sencillas.

genes y >25% de sus secuencias son "desiertos", o regiones de mas de 500 kb en las que no hay genes, hasta > l 0% de las secuencias de los cromosomas con mas genes lo son. Asi, en total, -20% del genoma humano consiste en desiertos carentes de genes. Las secuencias repetitivas representan a >50% del genoma humano, como se observa en la . Las secuencias repetitivas se agrupan en cinco clases: • Los transposones (activos o inactivos) constituyen la gran mayorfa (45% del genoma); todos se encuentran en multiples copias. • Los seudogenes procesados (- 3 000, constituyen - 0.1% del DNA total). (Son secuencias que surgen por insercion de una copia de una secuencia de RNAm en el genoma; vease la seccion 6.6, Los seudogenes son los callejones sin salida de la evolucion.) • Repeticiones de secuencias simples (DNA muy repetitivo, como el (CA)n que representa -3%). • Las duplicaciones segmentarias (bloques de l 0 a 300 kb duplicados en una nueva region) representan a -5%. Solo una minorfa de estas duplicaciones se encuentra en el rnismo cromosoma; en los otros casos, las duplicaciones estan en cromosomas diferentes. • Las repeticiones en tandem forman bloques de un tipo de secuencia (especialmente en los centr6meros y los telomeros). La secuencia del genoma humano subraya la importancia de los transposones (que tienen la capacidad de replicarse a sf rnismos e insertarse en una ubicaci6n diferente, ademas de que pueden funcionar exclusivamente como elementos del DNA [vease

5.6 tC6mo se distribuyen los genes y otras secuencias en el genoma?

85

Cap. 21, Los transposones] o tener una forma activa RNA [vease Cap. 22, Retrovirus y retroposones]. Su distribucion en el genoma humano se resume en Ia Fig. 22.18). La mayo ria de los transposones que se encuentran en el genoma humano no son funcionales; muy pocos estan realmente activos, sin embargo, Ia gran proporcion del genoma ocupada por estos elementos indica que han participado activamente en el moldeo del genoma. Una caracterfstica importante es que algunos genes presentes se originaron como transposones y evolucionaron hasta llegar a su condicion actual despues de perder Ia capacidad de transponerse. Cerca de 50 genes parecen haberse originado de esta manera. La duplicacion de segmentos en su forma mas sencilla implica Ia duplicacion en tandem de alguna region de un cromosoma (habitualmente debido a un evento de recombinacion aberrante durante Ia meiosis; vease Ia seccion 6.7, El entrecruzamiento desigual reorganiza a los agrupamientos de genes). Sin embargo, en muchos casos, las regiones duplicadas se encuentran en cromosomas diferentes, lo cual implica que originalmente hubo una duplicacion en tandem seguida de Ia translocacion de una copia a un sitio nuevo, o que la duplicacion se debio a mecanismos totalmente diferentes. El caso extrema de Ia duplicacion de segmentos se observa cuando se duplica todo el genoma, en cuyo caso, el genoma diploide inicialmente se convierte en tetraploide. Conforme las copias duplicadas desarrollan diferencias, el genoma puede convertirse en diploide nuevamente de forma gradual y efectiva, no obstante que las homologfas entre las copias divergentes dejan evidencias del evento, fenomeno particularmente comun en los genomas de las plantas. El estado actual del analisis del genoma humano identifica numerosas regiones duplicadas, pero no indica si hubo una duplicacion completa del genoma en el linaje de los vertebrados. Una caracterfstica intrigante del genoma humanoes Ia presencia de secuencias que parecen notener funciones codificadoras, pero que muestran una conservacion evolutiva superior a Ia del nivel de fondo . Como se detecto mediante Ia comparacion con otros genomas (inicialmente con el del raton), dichas secuencias representan aproximadamente el 5% del genoma total. c::.Estan conectadas funcionalmente con las secuencias codificadoras de proteinas? Su densidad en el cromosoma 18 es Ia misma que en cualquier otra region del genoma, aunque el cromosoma 18 tiene una concentracion de genes codificadores de proteinas significativamente menor, lo cual sugiere indirectamente que su funcion no esta relacionada con Ia estructura ni con Ia expresion de los genes codificadores de protefnas. 86


ID

EL cromosoma Y tiene varies genes espedficos de la masculinidad

Conceptos principales • El c'romosoma Ytiene -60 genes que se expresan espedficamente en los testlculos. • Los genes espedficos de La masculinidad estan en multiples copias de segmentos cromos6micos repetidos. • La conversion genica entre copias multiples permite el mantenimiento de los genes activos durante la evoluci6n.

La secuenciacion del genoma humano ha ampliado significativamente los conocimientos sobre Ia funcion de los cromosomas sexuales. En general se piensa que los cromosomas X y Y descienden de un autosoma comun (muy antiguo). Su desarrollo ha implicado un proceso en el cual el cromosoma X ha retenido Ia mayor parte de los genes originales, mientras que el Y, ha perdido casi todos. El cromosoma X se comporta como los autosomas en Ia medida en que las hembras tienen dos copias, y entre ellas puede tener Iugar Ia recombinacion. La densidad de genes localizados en el cromosoma Xes comparable a Ia de otros cromosomas. El cromosoma Yes mucho mas pequeiio que el X y tiene muchos menos genes. Su {mica funcion resulta de que solo los machos portan el cromosoma Y, del cual solo hay una copia, por lo tanto, los loci ligados a este ultimo son efectivamente haploides y' no diploides, como el resto de los genes humanos. Durante muchos aiios se penso que el cromosoma Y casino portaba genes, excepto uno (o mas) de los que determinan el sexo y definen Ia masculinidad. Gran parte del cromosoma Y (>95% de su secuencia ) no experimenta entrecruzamiento con el cromosoma X, lo cual condujo a la perspectiva de que podia no contener genes activos porque no habrfa manera de evitar Ia acumulacion de mutaciones deletereas. Esta region esta flanqueada por regiones seudoautosomicas cortas que se intercambian frecuentemente con el cromosoma X durante Ia meiosis masculina. Originalmente, a esta region se le llamo no recombinante, pero ahora se le conoce como region espedfica determinante de Ia masculinidad. La secuenciacion detallada del cromosoma Y muestra que dicha region contiene tres tipos de regiones, como se ilustra en la I • Las secuencias X transpuestas estan formadas por un total de 3.4 Mb que forman bloques grandes resultado de una transposicion de Ia banda q21 en el cromosoma

Yp

Centr6mero

PB

P7 P6

P5 P4

P3 P2

P1

I) H

•11

•tt

Regiones amplic6nicas

Palindromes de las regiones amplic6nicas

Regiones X transpuestas

Regiones seudoautos6micas

Regiones X degeneradas

- - Centr6mero y heterocromatina

~

Yq

Genes de muchas

r cop1as

~ Genes de una

r sola copia

G El cromosoma Y esta formado par regiones X tra nspuestas, regiones X degeneradas y amplicones. Las regiones X t ranspuestas y degeneradas t i enen dos y 14 genes Cinicos, respectiva mente. Los amplicones tienen ocho pal\ndromos extensos (P1-P8), los cuales contienen a nueve familias de genes. Cada familia contiene par lo menos dos capias.

X hace aproximadamente tres o cuatro millones de afios, lo cual es especffico dellinaje humano. Estas secuencias nose recombinan con el cromosoma X y practicamente se han desactivado, ahora contienen solo dos genes activos. • Los segmentos X degenerados del cromosoma Y son secuencias que comparten un ori gen comun con el cromosoma X (retorno al autosoma comun del cual descienden los cromosomas X y Y) y contienen genes o seudogenes relacionados con el cromosoma X. Hay 14 genes activos y 13 seudogenes. En cierta forma, los activos han desafiado la tendencia a ser eliminados de las regiones cromosomicas que no pueden recombinarse durante la meiosis. • Los segmentos amplic6nicos tienen una longitud total de 10.2 Mb y se repiten internamente en el cromosoma Y. Hay ocho bloques palfndromos grandes que incluyen a nueve familias de genes codificadores de protefnas; el numero de copias por familia fluctua entre 2 y 35. El nombre "amplicon" refleja el hecho de que las secu encias han sido amplificadas internamente en el cromosoma Y. Sumando los genes que se encuentran en estas _cs regiones, el cromosoma Y contiene muchos mas :_-: io que se hubiera esperado, hay 156 unidades de _ anscripcion, de las cuales la mitad representa a ge-:::s codificadores de protefnas y la mitad representa .: ::eudogenes. La presencia de los genes activos se explica por :: h echo de que la existencia de copias de genes _ __ -mamente relacionados en los segmentos ampli.::::nicos permite que la conversion genica entre las

copias multiples de un gen sea usada para regenerar copias activas. Las necesid ades mas comunes de las copias multiples de un gen son cuantitativas (proporcionar mas producto proteinico) 0 cualitativas (codificar protefnas con propiedades Jig eramente distintas o expresadas en tiempos o lugares diferentes) , aunque en este caso, la funcion esencial es evolutiva. De hecho, la existencia de copias multiples permite ]a recombinaci6n en el rnismo cromosoma Y para sustituir ala diversidad evolutiva que suele ser proporcionada por recombinacion entre los cromosomas alelicos. La mayorfa de los genes codificadores de pro teinas en los segmentos ampliconicos se expresa especfficamente en los testiculos, y probablemente esten implicados en el desarrollo de la masculinidad. Si hay -60 de dichos genes en un conjunto total de -25 000 genes humanos, la diferencia genetica entre varones y mujeres es de - 0.2 % .

Ill

Las especies mas complejas evolucionan al agregar nuevas funciones genicas

Conceptos principales • La comparaci6n de diferentes genomas muestra un incremento constante en el numero de genes con fo rme se aiiaden genes adicionales para formar eucariotas, organismos multicelulares, ani males y vertebrados. • La mayoria de los genes (micas de los vertebrados estan relacionados con el sistema nervioso o el i nmunol6gico .

La comparacion de la secuencia del genoma humano con secuencias encontradas en otras especies es reveladora respecto del proceso de evolucion . En

5.8 Las especies mas comp lejas evolucionan al agregar nuevas fun cio nes genicas

87

Incremento de Ia complejidad Todas las procariotas y vertebrados las eucariotas 22%

Solo vertebrados y animales 24%

Compartimientos celulares

21%

Solo eucariotas

Multicelularidad

32%

Los genes humanos pueden clasificarse segun la amplitud de la distribuci6n de sus hom6logos en otras especies.

0 Transcripci6n/ traducci6n Plegamiento protefnico 0 Replicaci6n

5

oo

•

El incremento de la complejidad de las eucariotas se acompaiia de la acumulaci6n de proteinas nuevas para desempeiiar funciones transmembrana y extracelulares.

0 Transporte Metabolismo

sistema inmunol6gico y del n ervioso, pero a muy pocas enzimas, lo cual coincide con la idea de que el origen de las enzimas es muy antiguo y que las rutas metab6licas se originaron al principia de la evoluci6n. Por lo tanto, se observa que el avance de las bacterias a los vertebrados implica agregar grupos de genes que representan a las nuevas funciones necesarias en cada etapa. Una man era de definir las protefnas comunmente necesarias es identificar las que se encuentran en todos los proteomas. Comparando detalladamente el proteoma humano con los proteomas de otros organismos, 46 % del de las levaduras, 43 % del de los gusanos y 61% del de las moscas estan representados en el humano; un grupo clave de - 1 300 protefnas esta presente en los cuatro proteomas. Las protefnas comunes son protefnas domesticas basicas necesarias para funciones esenciales que corresponden a los tipos resumidos en Ia · . Las funciones principales estan relacionadas con la transcripci6n y Ia traducci6n (35%), el metabolismo (22 % ), el transporte (12 % ), Ia replicaci6n y modificaci6n del DNA (10%), el plegamiento y la degradaci6n de protefnas (8%) y los procesos celulares (6 %). Una de las sorprendentes caracterfsticas del proteoma humano es que tiene muchas protefnas nuevas respecto de otras eucariotas, pero relativamente pocos dominios protefnicos nuevos. La mayoria de los dorninlos protefnicos parecen ser comunes al rei-

Las protelnas eucari6ticas comunes estan relacionadas con funciones celulares esenciales.

la se analizan los genomas humanos de acuerdo con la amplitud de su distribuci6n en la naturaleza. Partiendo del mas comun (esquina superior derecha de la figura), el 21% de los geneses comun a eucariotas y procariotas, y tienden a codificar proteinas esenciales para todas las formas vivas, tipicamente para el metabolismo basico, la replicacion, la transcripci6n y la traducci6n. Avanzando en el sentido de las manecillas del reloj, se agrega otro 32% de los genes a las eucariotas en general, por ejemplo, pueden encontrarse en las levaduras. Estos genes tienden a codificar proteinas implicadas en funciones generales de las celulas eucari6ticas, pero no de las bacterias; podrfan relacionarse, por ejemplo, con la especificaci6n de organelos o con los componentes del citoesqueleto. Otro 24% de los genes son necesarios para la especificaci6n de los animales, entre otros, los gen es para la multicelularidad y el desarrollo de diferentes tipos de tejidos. Veintid6s por ciento de los genes son unicos de vertebrados, y codifican principalrnente a protefnas del 88

0 lntracelular


animal. Sin embargo, hay muchas arquitecturas :- t.efnicas recientes definidas como combinaciones _evas de dominios. En la se muestra _e el mayor incremento tiene Iugar en las protei~- transmembrana y las extracelulares. En las led uras, la vasta mayorfa de las arquitecturas tiene _e ver con las protefnas intracelulares. En las mos-: o los gusanos) hay aproximadamente el doble -" arquitecturas intracelulares, pero hay un incre::-nto sorprendente de protefnas transmembrana y - .: acelulares, como es de esperar de Ia adici6n de -2ciones necesarias para las interacciones entre las :::· las de un organismo multicelular. El incremenen las arquitecturas intracelulares necesario para :-:-nar un vertebrado (hombre) es relativamente ::: "ueiio, pero tambien en este caso se incrementan gran medida Ia arquitectura transmembrana y la - .:Tacelular. Desde hace mucho tiempo se sabe que la di: :-encia genetica entre el hombre y el chimpance -· estro pariente mas cercano) es muy pequeiia, - : 9% de los genomas son identicos. Hoy dia, Ia se~ encia del genoma del chimpance permite investi-~: con mas detalle ese 1% de diferencias y detectar . :as caracterfsticas responsables de "lo humano" ·_eden ser identificadas. La comparaci6n muestra - · x 106 sustituciones de nucle6tidos (1.2% dedi: :-encia global en la secuencia), 5 x 106 deleciones .nserciones (dejando en -1.5 % de Ia secuencia : _cromatica, especffica de cada especie) y muchas -:::: tructuraciones cromos6micas. Las protefnas co- ~-pondientes suelen ser muy similares; 29% son -:~micas y entre especies, en Ia mayoria de los casos - c: :· s6lo una o dos diferencias en los aminoacidos - -: la protefna. De hecho, las sustituciones de nu · ~ ' tidos son menos frecuentes en los genes codifi· o ores de protefnas que en los que tienden a estar -·;olucrados en rasgos especfficamente humanos, cual sugiere que !a evoluci6n de las protefnas - es un efecto importante en las diferencias entre . . humano y el chimpance, lo cual deja como po : :lidades principales a los cam bios de estructura ; ::lica en gran escala y los de Ia regulaci6n. El 25 % :- as sustituciones de nucle6tidos ocurre en los di- _de6tidos G (entre los cuales hay m u chos sitios -~ !adores potenciales) .

~Cuantos

genes son esenciales? :Onceptos principales o todos los genes son esenciales. En las levaduras y as moscas, las deleciones de <50% de los genes tienen efectos detectables.

• Cuando dos o mas genes son redundantes, una mutaci6n en cualquiera de ellos puede no tener efectos detectables. • No se sabe porque sobreviven los genes que aparentemente son prescindibles en el genoma.

La se!ecci6n natural es !a fuerza que garantiza que los genes {Jtiles sean retenidos en el genoma; las mutaciones son a!eatorias y su efecto mas comun en un ORF seria daiiar al producto proteinico. Un organismo con mutaciones nocivas estaria en desventaja en Ia evoluci6n, y en ultima instancia, la mutaci6n serfa eliminada por deficiencias de competitividad de los organismos que Ia portan. La frecuencia de un alelo deficiente en la poblaci6n se equilibra entre Ia generaci6n de mutaciones nuevas y Ja eliminaci6n de mutaciones antiguas. Invirtiendo este argumento, siempre que se ve un ORF intacto en el genoma, se supone que su producto desempe.iia una funci6n uti! en el organismo. La selecci6n natural debe haber impedido Ia acumulaci6n de mutaciones en el gen. El destino final de un gen que deja de ser uti! es acumular mutaciones hasta que deja de ser reconocible . El mantenimiento de un gen in1plica que confiere una ventaja selectiva al organismo. Sin embargo, en el curso de Ia evoluci6n, incluso una ventaja relativa pequei'ia puede ser objeto de !a selecci6n natural y un defecto fenotfpico no ser necesariamente detectable de inmediato como resultado de una mutaci6n. No obstante, serfa importante saber cuantos genes son realmente esenciales, lo cual significa que su ausencia es leta! para el organismo, lo cual, en el caso de los organismos diploides, significa por supuesto que la mutaci6n nula homocig6tica es leta!. Se puede suponer que la proporci6n de genes esenciales declinani con el incremento de tamai'i.o del genoma porque los genomas mas grandes pueden tener multiples copias relacionadas con funciones genicas particulares, pero hasta a h ora esta expectativa no ha sido confirmada por los datos (vease Ja Fig. 5.2) . Una forma de abordar el tema del numero de geneses determinar.mediante analisis mutacional el numero de los que son esenciales. Si saturamos una region especffica del cromosoma con mutaciones letales, las mutaciones de ben mapearse en un numero de grupos de complementaci6n que corresponda al numero de loci letales en dicha region. Al extrapolar este metodo al genoma como unidad global, se podra calcular el numero total de genes esenciales. En el organismo que tiene el genoma mas pe queiio conocido (M. genitalium), las inserciones alea torias tienen efectos detectables s6lo en a proximadamente dos tercios de los genes; asimismo, menos 5.9 ;_Cuantos genes son esenciales?

89

.-r---------------- -

de la mitad de los genes de la bacteria E. coli parecen ser esenciales. La proporcion es incluso mas baja en la levadura S. cerevisiae. Cuando las inserciones se introdujeron aleatoriamente en el genoma en un

Cre.cimiento Iento

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10

Los genes esenciales de las levaduras se encuentran en todas las clases. Las barras azules muestran La proporci6n total de cada clase de genes, en tanto que las rajas muestran a los esenciales. :...

0 90% efectos no detectables 0 70% no viables 0

1.6% fenotipos posembrionarios

0

1.6% defectos del desarrollo

En un analisis sistematico de perdida de funci6n que se realiz6 en 86% de los genes del gusano se demostr6 que solo el 10% tiene efectos detectables en el fenotipo.

90


ana !isis previa, solo 12% fueron letales y otro 14'1.:. impedfa el crecimiento. La mayor parte de las inser· ciones (70%) no tuvo ningun efecto. En un sonde mas sistematico, basado en la deleci6n completa de cada uno de los 5 916 genes (>96% de los idenrificados), se muestra que solo el 18.7% es esenciiL para el crecimiento en un medio de cultivo rico er; nutrientes. En la r se observa que las levaduras incluyen genes en todas las categorias. Lc. unica concentraci6n notable de defectos esta en lo.; que codifican a productos implicados en la sfntesis protefnica, en cuyo caso, -50% son esenciales. Obviamente, en este metodo se subestima el numero de genes esenciales para que la levadura viva en su habitat naturaL cuando no esta tan bien provista de nutrientes. En la se resumen los resultados de un analisis sistematico de los efectos de Ia perdida de funcion genica en el gusano C. elegans. Las secuencias de genes individuates fueron pronosticadas a partir de la secuencia del genoma, y al dirigir un RNA inhibidor contra estas secuencias (vease Ia seccion 13.10, La interferencia de RNA esta relacionada con el silenciamiento de genes), se creo un conjunto grande de gusanos en el cual se impidio el funcionamiento de un gen (pronosticado) en cada gusano. Los efectos detectables en el fenotipo se observaron solo en 10% de estos organismos con genes desactivados, lo cual sugiere que la mayorfa de los genes no tiene funciones esenciales. La proporcion de genes esenciales es mayor (21%) entre los genes de gusanos que tienen contrapartes en otras eucariotas, lo cual sugiere que los genes ampliamente conservados tienden a desempefiar funciones mas basicas. Tambien se incrementa Ia proporcion de genes esenciales entre los que se presentan individualmente en cada genoma haploide, respecto de los genomas que tienen muchas copias de genes relacionados o identicos, lo cual sugiere que muchos de los genes multiples pueden ser duplicaciones relativamente recientes que pueden sustituir mutuamente sus funciones. En Drosophila se han realizado analisis extensos del numero de genes esenciales en una eucariota superior mediante intentos de correlacionar los aspectos visibles de la estructura cromosomica con el numero de unidades geneticas funcionales. La idea de que esto pueda ser posible provino originalmente de la presencia de bandas en los cromosomas politenicos de D. melanogaster. (Estos cromosomas se encuentran en determinadas etapas del desarrollo y representan una forma fisica inusualmente amplia, en la cual son evidentes una serie de bandas [denominadas mas formalmente cromomeros]; vease Ia seccion 28.1 0, Los cromosomas politenicos forman bandas.) A partir del concepto anterior de que

~ bandas pueden representar un orden lineal de -=--=nes, se ha llegado al intento de correlacionar la ~ganizaci6n de los genes con la organizacion de las : :1ndas. En el conjunto haploide de D. melanogaster : 11-y -5 000 bandas cuyo tamaiio varia en mas de - · orden de magnitud, pero en promedio hay -20 D de DNA por banda. El metoda basi co consiste en saturar una region :-: mos6mica con mutaciones, las cuales suelen ser ~ncillamente reunidas como letales, sin analizar ' causa de ello. Cualquier mutaci6n leta! se toma - ra identificar a un locus que esencial para el or:-:3.nismo. En ocasiones, las mutaciones provocan ::ectos deletereos visibles pero no letales, en cuyo .:.a.-o, tambien se toman en consideraci6n para iden!lcar un locus esencial. Cuando las mutaciones se : 'locan en grupos de complementacion, el niimero -·..:ede ser compara do con el numero de bandas de Ia :='Zion, o incluso, cada grupo de complementaci6n - de ser asignado a bandas individuales. El propo:o de estos experimentos ha sido determinar si hay ~ a relaci6n coherente entre las bandas y los genes, r ejemplo, c_cada banda tiene un solo gen? Agrupando los analisis realizados en los ulti-:os 30 aiios, el numero de grupos de complemen-. :6n letales es -70 % del numero de bandas; aun desconoce si esta relacion tiene algun significa- funciona l. Independientemente de la causa, la : .:uivalencia constituye un estimado razonable de - 3 600 genes letales; desde cualquier pun to de vista, :-::: Drosophila, el numero de loci letales es significati' 1ente menor que el numero total de genes. Si la proporci6n de genes esenciales humanos __ similar a la observada en otras eucariotas, se - :.:m osticaria un rango de 4 000 a 8 000 genes en - que las mutaciones serfan letales o producirfan ::.aos evidentemente daiiinos. Actualrnente se han ·-:.1tificado 1300 genes en los cuales las mutaciones ~ . vocan defectos evidentes, proporci6n sustancial _-:>_ total esperado, particularmente en vista de que -·..tchos genes letales pueden actuar tan precoz-_:"nte que nunca verfamos sus efectos. Este tipo de _:aos tambien suele explicar los resultados de Ia 5 ~ , en la cual se observa que la mayorfa de i defectos geneticos conocidos se debe a mutacio- . - puntuales (en donde es mas probable que haya __ :lndo menos alguna funcion residual del gen). c. Como se ex plica Ia supervivencia de genes ·<·a deleci6n parece no ten er efecto alguno? La ~ . Ucaci6n mas probable es que el organismo tiene . as alternas de cumplir con la misma funcion. --2 osibilidad mas sencilla es la redundancia, y -_:e hay muchas copias de algunos genes, lo cual - jerto en algunos casos, cuando muchos genes :-: acionados) de ben ser desactivados para producir ~- efecto. En un escenario un poco mas complejo,

un organismo puede tener dos rutas independientes susceptibles de proporcionar cierta actividad. La desactivacion de cualquiera de elias no serfa daiiina, pero Ia ocurrencia simultanea de mutaciones en los gen es de ambas serfa deleterea. Este tipo de situaciones puede evalua rse combinando mutaciones. Para empezar, en la misma cepa se introducen deleciones en dos genes, ninguna leta! de por sf, pero si el mutante doble muere, Ia cepa se denomina letal sintetica. Esta tecnica ha resultado muy efectiva en las levaduras, en las cuales puede automatizarse el aislamiento de mutantes dobles, procedimiento denominado anal isis de matriz genetica sintetica (SGA, synthetic genetic array ana/isis). En la se resume el resultado de un analisis en el cual se realizo una SGA en cada una de las 132 deleciones viables para detectar si puede sobrevivir en combinaci6n con cualquiera de las 4 700 deleciones viables. Cada uno de los genes de prueba tuvo por lo menos un compaiiero con el cual la combinaci6n fue leta!, y en la mayor parte de los genes de prueba fue ese el caso; la mediana es de -25 compaiieros, y el numero mayor se observ6 en un gen de prueba que tuvo 146 compaiieros letales.

Sentido err6neo/sin sentido Corte y empalme Reguladoras

58% 10% <1%

Deleciones pequefias lnserciones pequefias

16% 6%

Deleciones grandes Reestructuraciones grandes

5% 2%

La mayor parte de los defectos geneticos conocidos de los genes humanos se debe a mutaciones puntuales; casi todos afectan directamente a La secuencia prote1nica. El resto se debe a inserciones, deleciones o reestructuraciones de diferentes tamafios.

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0.6 Q)

~ 5 Q) ~ 4 Ol ~ 3

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E 2

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10

20

30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 Numero de genes letales interrelacionados (de 4 700)

Los 132 genes mutantes de prueba presentan algunas combinacio nes letales si se combinan con alguna de las 4 700 mutaciones no letales. En La grafica se ilustra cuantos genes letales interrelacionados hay por cada gen de prueba.

5.9 zCuantos genes son esenciales?

91

Una pequeiia proporci6n (-10%) de los pares mutantes interrelacionados codificaron proteinas que interactuan ffsicamente. Este resultado de alguna manera apunta hacia Ia explicaci6n de Ia falta aparente de efecto de tantas deleciones. La selecci6n natural actuara contra estas deleciones cuando se encuentren a si rnismas en combinaciones de pares letales. Hasta cierto punto, el organismo ha sido protegido contra los efectos daiiinos de las mutaciones merced ala redundancia, pero paga el precio al acumular Ia "carga genetica" de mutaciones que no son deletereas por sf rnismas, pero que pueden causar problemas serios cuando se combinen con otras mutaciones semejantes en generaciones futuras. La teorfa de Ia selecci6n natural sugeriria que Ia perdida de genes individuates en dichas circunstancias produce una desventaja lo suficientemente grande como para mantener al gen activo durante Ia evoluci6n.

EID

Los genes se expresan en niveles rnuy diferentes

Conceptos principales • En una celula dada, la mayoria de los genes se expresa en niveles bajos.

y una reacci6n que abarque un rango mas amplic. debe resolverse por ajuste computarizado de curva. en componentes individuates. Tambien aquf, est representa lo que realmente es un espectro continuo de secuencias. Un ejemplo de una reacci6n RNAm excesivo > DNAc que genera tres componentes se muestra er_ Ia • El primer componente tiene las misma_ caracterfsticas que una reacci6n de contro: de RNAm de ovoalbumina con su copia de DNA, lo cual sugiere que el primer componente es de hecho solo RNAm de ovoalbumina (que ciertamente ocupa aproximadamente Ia mitad de Ia masa de mensajero de: tejido del oviducto). • El siguiente componente proporciona 15 °/( de la reacci6n, con una complejidad tota~ de 15 kb; corresponde a 7 a 8 especies deRNAm con una longitud promedio de 2 OO(l bases. • El ultimo componente proporciona 35% de Ia reacci6n, que corresponde a una complejidad de 26 Mb, lo cual equivale a -13 00 especies de RNAm con una longitud promedio de 2 000 bases. A partir de este analisis se observa que aproximadamente Ia mitad de Ia masa del RNAm de la. r

• Solo un pequeiio numero de genes, cuyos productos son especializados para un tipo celular espedfico, se expresan ampliamente.

La proporci6n de DNA representada en una poblaci6n de RNAm puede determinarse porIa cantidad de DNA susceptible de hibridarse con el RNA. Dicho analisis de saturaci6n habitualmente identifica a -1% del DNA como proveedor de un molde para el RNAm. A partir de este descubrimiento es posible calcular el numero de genes, siempre y cuando se conozca Ia longitud promedio de un RNAm. En una eucariota inferior, como una levadura, el numero total de genes expresados es -4 000, mientras que en los tejidos somaticos de las eucariotas superiores, suele ser de 10 000 a 15 000; el valor es similar en las plantas y los vertebrados. (La unica excepci6n que coincide con este tipo de valor es el cerebro de los mamfferos, en el cual aparentemente se expresan numeros mucho mayores de genes, aunque no se ha confirmado Ia cantidad exacta.) El ana !isis cinetico de Ia reasociaci6n de una poblaci6n de RNA permite determinar Ia complejidad de su secuencia. Este tipo de analisis suele identificar a tres componentes de una celula eucari6tica. Igual que en una curva de reasociaci6n de DNA, un solo componente se hibrida en cerca de dos ctecadas de valores Rot (concentraci6n de RNA x tiempo), 92


Primer componente 50% a Rot0 0.0015

Segundo componente 15%a Rot0 0.04

Ultimo componente 35%a Rot0 30

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Rot La hibridaci6n entre RNAm excesivo y DNAc identifica a numerosos componentes de las celulas del oviducto de polla caracterizadas par el Rot,1, de reacci6n.

-=.ula representa un solo RNAm, -15% de Ia masa :~ proporcionada por solo 7 a 8 moleculas de RNAm -35% de la masa se divide en la enorme cifra de . 3 000 especies de RNAm, por lo tanto, es obvio . ..:.e las moleculas de RNAm que comprenden cada - :nponente deben estar presentes en cantidades - -'Y diferentes. AI numero promedio de moleculas de cada - :.1\m por celula se le denomina abnndancia, que ..:. de calcularse de forma muy sencilla si se conoce -:nasa total de RNA de la celula. En el ejemplo de !a =; ura 5.23, el RNAm total puede representarse mo 100 000 copias del primer componente (Rt~Am -: ovoalbumina) y 4 000 de cada una de las 7 a 8 - leculas de RNAm del segundo componente, pero .o -5 copias de cada una de las 13 000 moleculas de - _:"-\m que constituyen el ultimo componente. La poblacion de RNAm se puede dividir en dos .;; es generales, de acuerdo a su abundancia: • El oviducto es un caso extremo, con gran parte del RNAm representada en una sola especie, pero Ia mayor parte de las celulas contiene un numero pequeiio de moleculas de RNA en numerosas copias. Este RNAm abundante suele estar formado por < 100 moleculas diferentes de RNAm en 1 000 a 10 000 copias por celula. Con frecuencia corresponde a gran parte de Ia masa, cerca de 50 % del RNAm total. • Aproximadamente Ia mitad de Ia masa de RNAm consiste en un numero importante de secu encias, cerca de 10 000, cada una representada por solo un pequefi.o numero de copias en el RNAm, unas
(Cuantos genes se expresan? :::.; cep:os pri nci pales • _Js RNAm expresados en niveles bajos se superponen ~ m pliamente en comparaciones de ti pos de celulas. ..as moleculas de RNAm abundantemente expresadas ;Jelen ser especificas del tipo de celula.

-:o 000 genes expresados pueden ser comunes a la - 3yoria de los tipos celulares de una eucariota superior.

~ango

de genes expresados de muchos tejidos icos de eucariotas superiores es de I 0 000 a - : 0. (. Que tanta es la superposicion entre genes :e ados en tejidos diferentes? Por ejemplo, el =~ io de polio se expresan de - Il 000 a 17 000 to del valor que se observa en el oviducto de -~

- 13 000 a 15 000. (.Cuantos de estos dos conjuntos de genes son identicos? LCuantos son espedficos de cada tejido? Estas interrogantes suelen responderse al analizar el transcriptoma, o conjunto de secuencias representadas en el RNA. De inmediato se observa que es probable que haya diferencias sustanciales entre los genes expresados en Ia clase abundante. La ovoalbumina, por ejemplo, se sintetiza solo en el oviducto y para nada en el hfgado, lo cual significa que el 50% de la masa de RNAm del oviducto es espedfica de dicho tejido. Sin embargo, las moleculas de RNAm abundante representan solo u na pequeiia porcion del numero de genes expresados. Desde Ia perspectiva del numero total de genes del organismo y del numero de cambios que deben darse en Ia transcrip cion entre diferentes tipos de celulas, se necesita conocer Ia extension de Ia superposicion entre los genes representados en las clases de RNAm escaso de diferentes fenotipos celulares. Las comparaciones entre tejidos diferentes muestran que, por ejemplo, -75% de las secuencias expresadas en el hfgado y en el oviducto son las mismas, en otras palabras, -12 000 son expresados en el hfgado yen el oviducto, -5 000 genes adicionales solo en el hfgado y otros -3 000 se expresan solo en el oviducto. Las moleculas de RNAm escaso se superponen ampliamente. Entre el riiion y el higado del raton, -90% de las moleculas de RNAm escaso son iden ticas, en funcion del numero de genes expresados, una diferencia de solo I 000 a 2 000 entre tejido y tejido . El resultado general obtenido en varias comparaciones de este tipo revela que solo -1 0% de las secuencias de RNAm de una cel ula son unicas en ella. La mayoria de las secu encias son comunes en numerosos tipos celulares, quiza en todos. Esto sugiere que el conjunto com{m de funciones de los genes expresados, tal vez -10 000 en los mamfferos, comprende funciones necesarias en todos los tipos de celulas. En ocasiones, este tipo de genes se conoce como genes de mantenimiento o genes constitutivos; sus actividades contrastan con las representadas por funciones especializadas (como Ia ovoalbumina o Ia globina), necesarias solo para fenotipos celulares espedficos. En ocasiones, a estos genes se les llama genes especializados.

liD

El numero de genes expresados puede medirse en masa

Conceptos principales • La tecnolog\a del chip permite tamar una instantanea de la expresi6n del genoma com plete de una unidad celular de levadura.

5.12: El numero de genes expresados puede medi rse en masa

93

ll: 2 000 z a:

40%

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Capias de RNAm por celulas de levadura

La abundancia de las moleculas de RNAm de las levaduras fluctua entre <1 por celula (o sea que no todas las celulas tienen una copia de RNAm) y >100 por celula (que codifican a las proteinas mas abundantes).

El analisis de HDA permite medir los cambios en la expresi6n de cada gen (la parte superior izquierda es el primer gen del cromosoma I y la inferior derecha, el ultimo gen del cromosoma XVI). Los cambios en la expresi6n relativos a los tipos silvestres se indican en los colores rojo (reducci6n), blanco (sin cambios) o azul (incremento). Fotografias cortesia de Rick A. Young, Whitehead Institute, Massachusetts Institute of Technology. • -75% (-4500 genes) del genoma de las levaduras se expresa en condiciones de cultivo normales. • La tecnologia del chip permite comparar detalladamente celulas animates relacionadas para determinar (por ejemplo) las diferencias de expresi6n entre una celula normal y una cancerigena.

La tecnologfa reciente permite estimar de manera mas sistematica y precisa el numero de genes expresados. Un m etodo (analisis serial de Ia expresion genica o SAGE, serial analysis ofgene expression) permite utilizar una etiqueta secuencial unica para identificar a cada RNAm. La tecnologfa permite me94


dir posteriormente la abundancia de cada etiquet« Mediante este metodo se identifican 4 665 genes expresados en S. cerevisiae cuando crece en condicion : normales, con abundancias que fluctuan entre 0.: y >200 transcritos/celula, es decir, que -75% d numero total de genes (-6 000) se expresa en dicha: condiciones. En Ia se resume el numer de moleculas diferentes de RNAm que se encuentran en cada nivel de abundancia. La tecnologfa mas poderosa utiliza chips que contienen matrices de oligonucle6tidos de alta densidad (HDA, high-density oligonucleotide arrays) cu c. construcci6n es posible porque se conoce Ia secuencia del genoma completo. En el caso de S. cerevisiae cada uno de los 6 181 ORF estan representados en Ia HDA por oligonucle6tidos de 20 25-mer que corresponden perfectamente a Ia secuencia del mensaje y 20 oligonucle6tidos no correspondientes que difieren en una posicion de base. El nivel de expresi6n de cualquier gen se calcula sustrayendo la seiial promedio de un apareamiento err6neo de su compaiiero perfecto. El genoma completo de las levaduras puede representarse en cuatro chips. Esta tecnologfa es lo suficientemente sensible como para detectar los transcritos de 5 460 genes (-90% del genoma) y mostrar que numerosos genes se expresan en niveles bajos, con abundancias de 0.1 a 0.2 trascritos/celula. Una abundancia de <1 transcrito/celula significa que no todas las celulas tienen una copia del transcrito en un momento dado. La tecnologfa permite no solo la medici6n de los niveles de expresi6n genica, sino tambien Ia detecci6n de diferencias de expresi6n en celulas mutantes respecto de celulas de tipo silvestre que crecen en condiciones de cultivo diferentes, etcetera. Los resultados de la comparaci6n de dos estados se expresan en una cuadricula en Ia cual cada cuadro representa un gen especffico y el cambio relativo en Ia expresi6n se indica mediante un color. La parte izquierda • muestra el efecto de una mutaci6n de Ia en Ia RNA polimerasa II, la enzima que produce al RNAm, Ia cual, como puede esperarse, provoca que Ia expresi6n de Ia mayorfa de los genes se reduzca mucho. La parte derecha de Ia figura, por el contrario, muestra que una mutaci6n en un componente rio del mecanisme de transcripcion (SRBJO) tiene efectos mucho mas restringidos y provoca incrementos en Ia expresi6n de algunos genes. La extension de esta tecnologfa a las celulas animates permitira que las descripciones generales basadas en el ana !isis de hibridaci6n del RNA sean remplazadas por descripciones exactas de los genes expresados y de las abundancias de sus productos, en cualquier tipo de celula dado. Un mapa de expresion genica de D. melanogaster detecta actividad de transcripci6n en alguna etapa del ciclo vital en casi

: dos (93%) los genes pronosticados y muestra que :-1 40% tiene formas alternas de corte y empalrne.

Resumen : . . os genomas secuenciados induyen numerosas bac: ~ rias y archaea, levaduras y un gusano, una mosca, -D raton y a! hombre. El n umero mfnimo de genes ::!ecesarios para formar una celula viviente (un pa:-asito intracelular obligado) es -470; para una celu.a. de vida libre, -I 70 0. Una bacteria gramnegativa i p ica tiene - I 500 genes. El contenido genico de las ~ e pas de E. coli fluctua entre 4 300 y 5 400 genes . El =-en bacteria no promedio tiene -1 000 bp de longi: d y se separa del siguiente par un espacio de - I 00 _p. Las levaduras S. pombe y S. cerevisiae tienen 5 000 ~- 6 000 genes, respectivamente. Aunque Ia mosca D. melanogaster es un organis::no mas complejo y tiene un genoma mas grande ~ue el del gusano C. elegans, Ia mosca tiene menos :-enes (13 600) qu e el gusano (18 500). La plan:n Arabidopsis tiene 25 000 genes y que no hay una :-elacion clara entre el tamaiio del genoma y el nu ::nero de genes se demuestra porque el genoma del ::.:-roz es cuatro veces mas grande, pero contiene solo .:n incremento de 50% en el numero de genes, a --!0 000 . El raton y el hombre tienen de 20 000 a :.o 000 genes, cantidades mucho menores de lo espe ~a do. La complejidad del desarrollo de un organismo uede depender de la naturaleza de las interacciones -:'ntre los genes, asf como de su numero total. En las procariotas yen las eucariotas, aproxima_<Jmente 8 000 genes son comunes, y probablemen:e esten implicados en funcion es basicas. En otros · rganismos multicelulares se pueden enco ntrar _2 000 genes . Para formar un animaL se agregan .ros 8 000, y 8 000 mas (profundamente relacio:-.ados con el sistema nervioso y el inmunologico) se :'Ocuentran en los vertebrados. En los organismos :-Jyo genoma ha sido secuenciado, solo el 50 % de ) 5 genes tien e funcione s definidas. El analisis de ;enes letales siguiere que so lo una minorfa de genes _- esenci al para cada organism a. Las secuencias que constituyen un genoma 7·Jcariotico pueden clasificarse en tres grupos: las ·:>cuencias no repetitivas son unicas; las secuencias oderadamente repetitivas estan dispersas y se re-:ten pocas veces como capias relacionadas, pero -. identicas, y las secuencia s muy repetitivas son _ rtas, y se repiten como matrices en tandem. Las -:-coporciones de los tipos de secuencias son caracte-:sticas de cada genoma, aunque los genomas mas :: and es tie nden a presentar una proporcion menor _, DNA no repetitive. Aproximadamente el 50% ~:"! gen oma humano consta de secuencias repeti--as, de las cuales, Ia gran mayorfa corresponde

a secuencias de transposones. La mayor parte de los genes estructurales se Ioca liza en el DNA no repetitive, cuya complejidad es mejor indicador de la complejidad del organismo que Ia complej idad total del genoma; el DNA no repetitive llega a tener una COmplejidad maxima de -2 X 10 9 bp. Los genes se ex presan en muy diversos niveles, de modo que puede haber 10 5 capias de RNAm de un gen abundante cuya protefna es el producto principal de Ia celula; 10' capias de cada RNAm de < 10 mensajes moderadamente abundantes, y <10 capias de cada RNAm de > 10 000 genes escasamente expresados. Las superposiciones entre poblacio nes de RNAm de celulas con diferentes feno tipos son frecuentes; la gran mayoria de las moleculas de RNAm se encuentran en la mayoria de las celulas. La herencia no mendeliana se exp lica par la presencia de DNA en organelos Ioca li zados en el citoplasma. Las mitocondrias y los cloroplastos representan a sistemas delimitados par membranas en los cuales algunas protefnas son sintetizadas en el organelo, mientras que otras son importadas. El genoma de los organelos suele ser un DNA circular que codifica a todos los RNA y a algunas de las protefnas que necesita . El tamafio de los genomas mitocondriales va rfa mucho, desde el genoma minimalista de los mamfferos, de 16 kb hasta el de 570 kb de las plantas superiores. Se supone que los genomas mas grandes codifican funciones adicionales . Los genomas de los cloroplastos oscilan entre 120 y 200 kb; los que han sido secuenciados, tienen una organizacion y funciones codificadoras similares. Tanto en las mitocondrias como en los cloroplastos, muchas de las protefnas mayores contienen algunas subunidades sintetizadas en el organelo y otras importadas del citosol. Las moleculas de DNA de los mamfferos se transcriben a un solo transcrito de la banda codificadora principal, en tanto que los productos individuales se generan par procesamiento de RNA. En las levaduras, las reestructuraciones son bastante frecuentes en el DNA mitocondriaL adem as de que se han encontrado recombinaciones entre genomas mitocondriales o genomas de cloroplastos. Las transferencias de DNA han tenido Iugar de los cloroplastos o las mitocondrias a los genomas nucleares.

Referencias

IJI

El numero de genes bacterianos abarca un rango de un orden de magnitud

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95

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Ill

Se conoce el numero total de genes de numerosas eucariotas

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IIJ

(Cuantos tipos diferentes de genes hay?

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Ill

El genoma humano tiene menos genes de los esperados

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(C6mo se distribuyen los genes y otras secuencias en el genoma? - ~:= ·encias

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llll!J

Los genes se expresan en niveles muy diferentes

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EIEI

El numero de genes expresados puede medirse

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Referencias

97

Agrupamientos y repeticiones ESQUEMA DEL CAPITULO en un cromosoma reco mbinante y una duplicacion correspondiente en el otro. • Las talasemias diferentes so n causadas per varias deleciones en que se elimina el gen de la globina a o el de la p. La gravedad de la enfermedad depende de cada delecion.

Introducci6n La duplicaci6n de los genes es una fue rza importante en la evoluci6n • Los genes duplicados suelen separarse para dar Iugar a genes diferentes o bien una de las ca pias se to rna inactiva

liD Los genes del RNAr forman repeticiones en tandem

Los agrupamientos de globinas se forman par duplicaci6n y por divergencia • Todos los genes de las globinas descienden por duplicacion y mutaci6n de un gen ancestral que tenia tres exones. • El gen ancestral dio origen a la mioglobina, la leghemoglobina y las globinas a y p • Los genes de las globinas a y p se separaron al principia del periodo de evolucion de los vertebrados; despues, las duplicaciones generaron agrupamientos individuates de genes simi lares a los genes a y p. .. Una vez que un gen ha sido desactivado per una mutacion, puede acumular mas mutaciones y convertirse en un seudogen homologo al gen activo o los genes actives, pero que no tiene actividad funcional.

La divergencia secuencial es la base del reloj evolutivo • Las secuencias de genes homologos en especies diferentes varian en los sitios de remplazo (donde las mutaciones causan sustituciones de aminoacidos) y en los silenciosos (donde una mutacion no afecta a la secuencia proteinica). • Las mutaciones se acumulan en los sitios silenciosos - 10 veces mas rapido que en los de rem plazo. • La divergencia evolutiva entre des proteinas es medida per el porcentaje de posiciones en que difieren los aminoacidos correspondientes. • Las mutaciones se acumulan mas o menos a una misma velocidad despues de que los genes se separan, de manera que la divergencia entre cualquier par de secuencias de globina es proporcional al tiempo transcurrido desde la separacion de sus genes.

La velocidad de sustituci6n neutral puede ser medida a partir de la divergencia de secuencias repetidas

.a

ni!I

DO

98

Los DNA satelite a menudo estan en la heterocromatina • La secuencia de repetici6n del DNA alta mente repetitive es muy corta y no tiene fu nci6n codificadora. • Se presenta en grandes bloques que pueden tener propiedades fisicas difere ntes. • Suele ser el constituye nte princi pal de la heterocro matina centromerica.

DIM

Los satelites de los artr6podos tienen repeticiones identicas muy cortas •

La longitud de las unidades de repeticion de los DNA satelite de los artropodos es de solo unos cuantos nucleotidos. La mayoria de las capias de la secuencia son identicas.

1!10 los satelites de los mam1feros constan de repeticiones jerarquicas • El DNA satelite del raton ha evolucionado por duplicacion y mutacion de una unidad de repeticion corta para dar origen a una unidad de repeticion basica de 234 bp en la que pueden ser reconocidas la mitad, la cuarta parte y la octava parte de la repeticion original.

f!BB

los minisatelites facilitan el mapeo genetico • La variaci6n entre los microsatelites o minisatelites de los genomas permite identificar la herencia inequivocamente, pues demuestra que el 50% de las bandas de un individuo derivan de un progenitor especifico.

• Cuando un genoma contiene un agrupamiento de genes con secuencias relacionadas, el apareamiento err6neo entre genes no alelicos puede causar un entrecruzamiento desiguaL de modo que se produce una deleci6n

La fijaci6n entrecruzada podr1a mantener repeticiones identicas • Un entrecruzamiento desigual cambia el tamaiio de un agrupamiento de repeticiones en ta ndem. • Las unidades de repeticion pueden eli minarse o reparti rse entre los agrupamientos.

• Los seudogenes carecen de funcion codificadora, sin embargo, pueden ser reconocidos per similitudes secuenciales con los genes funcionales existentes. Surgen de la acumulaci6n de mutaciones en genes (anteriormente) funcionales.

Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran los agrupamientos de genes

Los genes repetidos de RNAr mantienen una secuencia constante • Todos los genes de un agrupamiento de DNAr tienen secuencias identicas. • Los espaciadores no transcritos consisten en unidades repetidoras mas cortas cuyo numero varia, de modo que la lo ngitud de cada espaciador es diferente.

• La velocidad de sustituci6n per aiio en sitios neutrales es mayor en el genoma del raton que en el humane.

Los seudogenes son callejones sin salida de la evo luci6n

• El RNA ribosomico es codificado per un numero considerable de genes identicos que se repiten en tandem para formar uno o mas agrupamientos. • Los agrupamientos de DNAr se organizan de manera tal, que las unid ades de transcripcion que resultan en un precu rsor unido a los RNAr principales alterna n con espaciadores no transcritos.

OBI

Resumen

Introducci6n La familia de genes es un agrupamiento constiruido por descendientes por duplicacion y variacion e algun gen ancestral cuyos rniembros se agrupan dispersan en diferentes cromosomas (o ambos) . El analisis del genoma muestra que m uchos genes pertenecen a familias, por ejemplo, los 25 000 del genoma humano identificados estan en - 15 000 familias, a sf que el gen promedio tiene varios parientes en el genoma (vease Ia Fig. 5.7) . Las fam ilias de genes varian mucho en cuanto a grado de relacion entre us , desde las que constan de m{lltiples rniembros identicos hasta aquellas en que Ia relacion es bastante lejana. En general, los genes se relacionan Unicamente por sus exones, pues sus intrones se han separado (vease Ia seccion 3.5, Las secuencias de los exones se conservan, pero las de los intrones varian). Los genes tambien pueden estar relacionados solo Jor algunos de sus exones, mientras que otros son t'micos (vease Ia seccion 3.9, Algunos exones pueden equipararse con funciones proteinicas) . El evento inicial que permite que los exones o los genes relacionados se desarrollen es una dupliacion, es decir, que de alguna secuencia del genoma se genera una copia. La duplicacion en tandem (cuando las duplicaciones permanecenjuntas) puee provocar algunos errores de duplicacion o de re w mbinacion. La separacion de los duplicados puede :ener Iugar por una translocaci6n que transfiere :naterial de un cromosoma a otro. Un duplicado en una ubica cion nueva tambien puede ser produ ddo directamente por un evento de transposicion sociado con Ia copia de u na region de DNA de los lrededores del transposon. La duplicacion se aplica -anto a genes intactos como a colecciones de exones, induso a exones individuales. Cuando se trata e un gen in tacto, Ia duplicacion genera dos copias cuyas actividades son indistinguibles, en cuyo -aso, normalmente las copias difieren a medida que van acumulando m utaciones diferen tes. Los de una familia de genes estructurales bien relacionados suelen tener fu nciones rela-:ionadas, incluso identicas, a pesar de que pueden :;er expresadas en diferentes momentos o en diferentes tipos de celulas. Asf pues, en los eritrocitos de embriones y en los eritrocitos adultos se expreo,an protefnas diferentes de globina , mientras que en las celulas musculares yen las no musculares se ·Jtilizan diferentes actinas. Cuando los genes se separan significativamente, 0 cuando solo algunos de .os exones estan relacionados, las protefnas pueden :ener diferentes funciones. Algunas familias de genes estan formadas por ::niembros identicos, y el agrupamiento es un re-- isito previo para que lo sigan siendo, a pesar de

que los genes agrupados n o son ne cesariamente identicos. Los agrupamientos de genes van del caso en que una duplicacion ha generado dos genes relacionados adyacentes basta casos en que cientos de genes identicos yacen en u na matriz en tandem; esta ultima puede ser frecuentfsima si se necesitan cantidades inusu almente grandes del producto, por ejemplo, los genes de los RNAr o de las histonas. Este fenomeno da Iugar a una situacion especial respe cto del mantenimiento de la ide ntidad y los efectos de Ia presion selectiva. Los agrupamientos de genes representan una oportunidad para examinar a las fu erzas implica das en Ia evolucion del genoma en regiones mas amplias que un gen . Las secuencias duplicadas, especialmente las que permanecen en la misma area, proporcionan el sustrato para una evol ucion posterior por recombinacion. Una poblacion evoluciona mediante la recombinacion clasica ilustrada en las y _, en las cuales tiene Iugar un entrecruzarniento exacto. Los cromosomas recombinantes estan organizados de la misma manera que el cromosoma progenitor, contienen exactamente los mismos loci, en el mismo orden, pero las combinaciones de alelos difieren y proporcionan la materia prima para Ia seleccion natural. De cualquier forma, la existencia de secuencias duplicadas permite eventos aberrantes ocasionales que modifican el contenido de los genes y no solo Ia combinacion de los alelos. El entrecruzanti.ento desigual (o recombinaci6n no reciproca) describe uneven to de recombinacion entre dos sitios no homologos. La caracterfstica que hace posible estos eventos es Ia existencia de secuencias repetidas. En Ia se observa que esto permite que, en un cromosoma, Ia copia de una

Bivalente contiene 4 cromatidas, 2 de cada progenitor

Quiasma es provocado par entrecruzamiento entre dos de las cromatidas

~ ~~~~~~ ~ a=====-- b a

b

A===== 8 A

&

b

a a

.

8 b

Dos cromosomas siguen siendo progenitores (AB y ab). Los cromosomas recombinantes ~ ~~~~~~ ~ contienen material de cada progenitor y nuevas a 8 combinaciones geneticas (Ab y aB)_a b La formaci6 n del quiasma represe nta la generaci6n de recombinantes.

6.1 Introducci6n

99

Recombinaci6n intermedia

Recombinantes

La recombinaci6n implica apareamientos entre las cadenas complementarias de los dos DNA duplex progenitores.

en los agrupamientos de genes y en las regiones de DNA muy repetido. La fraccion del genoma que se repite mucho es ta formada por multiples copias en tandem de unidades de repeticion muy cortas, que sue len tener propiedades inusuales, una de las cuales es que en un analisis de gradiente de densidad de DNA pueden ser identificadas como un pico independiente, Io cual da Iugar a! nombre de DNA satelite. A menudo se relacionan con regiones inertes de los cromosomas, en particular los centromeros (que contienen los puntos de union para Ia segregaci6n en un huso mit6tico o meiotico). Como resultado de su organizacion repetitiva, presentan parte del mismo comportamiento respecto de Ia evoluci6n que los agrupamientos de genes en tandem. Ademas de las secuencias satelites, fragmentos mas pequefios de DNA, llamados minisatelites, muestran un comportamiento similar, y permiten mostrar un alto grado de divergencia entre genomas espedficos que pueden ser usados con fines de mapeo. Estos eventos que modifican la constitucion del genoma son raros, pero importantes, durante Ia evolucion.

Ill

La duplicaci6n de Los genes es una fuerza importante en la evoluci6n

Concepto principal

ABCABCABCABCABCABCABCABCABCABC ABCABCABCABCABCABC El entrecruzamiento desigual resulta del apareamiento entre repeticiones no equivalentes en regio nes de DNA formadas por unidades de repetici6n. Aqui la unidad de repeti-ci6n es la secuencia ABC, y la t ercera re petici6n del cromosoma azul se ha alineado con la primera repetici6n del cromosoma negro. En toda la region de apareamiento, las unidades ABC de un cromosoma esta n alineadas con las del otro. El entrecruzamiento genera cromosomas con dieciseis repeticiones cada uno, y no ocho de cada progenitor.

repeticion se desalinee y se recombine con una copia diferente de la repeticion en el cromosoma homologo y no con Ia copia correspondiente. Cuando sucede la recombinacion, aurnenta el nlimero de repeticiones en un cromosoma y disminu ye en el otro. De hecho, un cromosoma recombinante sufre una delecion y el otro una insercion. Este mecanismo es responsable de la evolucion de los agrupamientos de secuencias relacionadas, yes posible rastrear su operacion contrayendo o expandiendo el tamafio de una matriz 100

CAPITULO 6 Agrupamientos y repeticiones

• Los genes duplicados suelen separarse para dar Lugar a genes diferentes o bien una de Las copias se torna inactiva.

Los exones se comportan como modulos para construir genes probados en varias combinaciones en el curso de Ia evoluci6n. En un extremo, un exon individual de un gen puede ser copiado y utilizado en otro; en el otro extremo, un gen completo, incluidos exones e intrones, puede ser duplicado. En tal caso, las mutaciones suelen acumularse en una copia sin atraer Ia atencion adversa de Ia seleccion natural, de modo que esta copia puede evolucionar a una nueva funcion, expresarse en un Iugar o tiempo distintos a los de !a primera copia, o bien, asumir actividades diferentes. En Ia . se resume !a vision actual del ritmo a que ocurren estos procesos. La probabilidad de que determinado gen sea incluido en una duplicacion en un periodo de un millon de afios es de - 1%, y despues de que el gen se h a duplicado, las diferencias desarrolladas son resultado de las mutaciones ocurridas en cada copia, las cuales se acumulan a una velocidad de -0. 1% en un mill6n de

demuestra que las dup!icaciones estan sucediendo mas o menos a pesar del contenido genetico. Los genes de estas duplicaciones pueden ser especialmente interesantes por la implicacion de que su evolucion es reciente y, por lo tanto, pueden ser importantes para desarrollos evolutivos no demasiado lejanos (como Ia separaci6n del hombre del mono).

Ill

Los agrupamientos de las globinas son formados por duplicaci6n y por divergencia

Conceptos principales El silenciamiento de una copia lorna -4 millones de anos Activo

UR Desp ues de que un gen ha sido duplicado, las : iferencias pueden acumularse entre las copias. Los genes pue:::n adquirir funciones diferentes, o una de las copias tornarse ' nactiva.

afios (vease Ia seccion 6.4, La divergencia secuencial cs Ia base del reloj evolutivo). No es probable que el organismo necesite re-ener dos copias identicas del gen, de modo que a medida que se desarrollan diferencias entre los genes duplicados, es probable qu e su ceda uno de estos dos eventos: • Ambos genes se vuelven necesarios porque las diferencias entre ellos generan protefnas con diferentes funciones o porque se expresan especificamente en lugares y momentos distintos. • De no ser asL es probable que uno de los genes sea eliminado porque haya adquirido una mutacion deleterea y no habra u n a selecci6n adversa para eliminar dicha copia, fen6meno que habitualmente toma -4 millones de afios. En dicha situacion, es meramente una cuesti6n de probabilidad cual de las copias se desactiva (lo cual puede contribuir a Ia incompatibilidad entre individuos, y, en ultima instancia, a Ia evolucion de las especies, si diferentes copias se tornan inactivas en distintas poblaciones). El analisis de Ia secuencia del genoma humano muestra que -5% comprende duplicaciones de egmentos identificables cuya longitud oscila entre l 0 y 300 kb. El numero de dichas duplicaciones se ha elevado recientemente porque no ha habido suficiente tiempo como para que la clivergencia entre elias elimine su relacion; incluyen una parte proporcional (de -6%) de los ex ones expresados, lo cual

• Todos los genes de las globinas descienden por duplicaci6n y mutaci6n de un gen ancestral que tenia tres exones. • El gen ancestral dio origen a La mioglobina, La leghemoglobina y las globinas a y ~· • Los genes de las globinas a y ~ se separaron al principio del periodo de evoluci6n de los vertebrados; despues, las duplicaciones generaron agrupamientos individuates de genes similares a los genes a y ~· • Una vez que un gen ha sido desactivado por una mutaci6n, puede acumular mas mutaciones y convertirse en un seudogen hom6logo al gen activo o los genes activos, pero que no tiene actividad funciona l.

El tipo mas comlin de duplicacion genera una segunda copia del gen cerca de la p1imera. En algunos casos, ambas copias permanecen asociadas y Ia duplicacion posterior puede generar un agruparniento de genes relacionados. El ejemplo mejor caracterizado de un agrupamiento de genes es el de los genes de globina, que constituyen una familia de genes antigua implicada en una funcion clave para el reino animal, el transporte de oxigeno por el torrente sangufneo. El constitu yente mayor de los eritrocitos es el tetramero de globina que se asocia con su grupo hem (de union al hierro) en forma de hemoglobina. Los genes funcionales de globina tienen la misma estructura general en todas las especies, estan divididos en tres exones ya ilustrados en la Figura 3.7. Se Ilega a la conclusion de que todos los genes de las globinas derivan de un solo gen ancestral, y siguiendo el desarrollo de los genes individuales de globina en una especie, o en especies diferentes, se llegan a conocer los mecanismos involucrados en la evolucion de las familias de genes. En las celulas adultas, el tetramero de globina consiste en dos caden as ex identicas y dos cadenas ~ identicas. Las celulas sangufneas de los embriones contienen tetrameros de hemoglobina distintos de

6.3 Los agrupamientos de las globinas son fo rmados por duplicaci6n y por divergencia

101

. ........ . -

.

~

. ..

- .

.. . •l-'11

~

1------

S2

S! \j/CY.Iji

8

I ,_ 0 ++ +

+

Agrupamiento a

Agrupamiento

10

+

30

20

40

Gen funcional

13

50 kb

Seudogen

Cada una de las familias de genes de globin a tipo a y tipo ~' esta organizada en un solo agrupamiento que incluye genes funcionales y seudogenes (\If) .

Embrionario (<8 semanas): proteinas E 21;,2 1;,2y2
E

.. ~ (/)

~ 0

(Y.

(Y.

1 0 [] ...... y y ++IJ .... azy2

Fetal (3-9 meses): proteinas

.. .... +

Ct.

(Y.

I DD++ +

y y

Adulto (desde el nacimiento): proteinas O-z82 Ct.

.. + +

azP 2

(Y.

+ I [!+++ 0 p + + 0 .... Gen funcional Gen activo

8 Seudogen

Durante el periodo embri onario, el fetal y el adulto del desarrollo humano se expresan genes de hemoglobina diferentes.

los de Ia forma adulta, pues cada tetramero consta de dos cadenas identicas tipo a y dos cadenas identicas tipo ~ , cada una de las cuales esta relacionada con el polipeptido adulto y posteriormente es remplazada por el. :Este es un ejemplo del control del desarrollo, en el cual diferentes genes se activan y desactivan sucesivamente para proporcionar productos alternos que realicen las mismas funcione s en momentos diferentes. La division de las cadenas de globina en tipo a y tipo ~ refleja Ia organizacion de los genes; cada tipo de globina es codificado por genes organizados en un solo agrupamiento. Las estructuras de los dos agrupamientos del genoma de los primates superiores se ilustran en la l Con una extension de mas de 50 kb, el agrupamiento ~ contiene cinco genes funcionales (E., dos y, o y ~) y un gen no funcional (\jf~). La secuencia co102

CAPiTULO 6 Agrupamientos y repeti ciones

dificadora de los dos genes ydifiere en solo un aminoacido, Ia variante G tiene glicina en Ia posicion 136, mientras que Ia variante A tiene alanina . La longitu d del agrupamiento a mas compacta tiene mas de 28 kb e incluye u n gen activo 1;, un gen I; no funcional, dos genes a, dos genes a no funcionales y el gen 8, cuya funcion se desconoce. Los dos genes a codifican a Ia misma proteina. Dos (o mas) genes identicos en el mismo cromosoma se describen como capias no alelicas. Los detalles de Ia relacion entre la hemoglobina embrionaria y Ia adulta varian en funcion del organismo. En el humano, Ia ruta tiene tres etapas, embrionaria, feta l y adulta. La distincion entre embrionaria y adulta es comun en todos los mamfferos, pero varia el n umero de etapas previas a la adultez. En el hombre, I; y a son dos cadenas tipo a, en tanto que E., y, oy ~ son tipo ~·En la I U se muestra como se expresan las cadenas en diferentes etapas del desarrollo. En Ia ruta del humano, I; es Ia primera cadena tipo a en ser expresada, pero es rapidamente remplazada por a. En Ia ruta ~, E. y y se expresan primero yoy ~los remplazan despues. En el adulto, Ia forma a2 ~ 2 proporciona 97% de Ia hemoglobina y a/J2, -2 % , en tanto que -1 % es aportado por Ia persistencia de la forma fe tal a 2y2 • c_ Que importancia tienen las diferencias entre Ia globina embrionaria y del adulto? Las formas em brionaria y fetal tienen mayor afinidad con el oxigeno para obtenerlo de Ia sangre de la madre, lo cual explica que no haya un equivalente en el polio, por ejemplo, dado que las etapas em brionarias tienen Iugar fuera del cuerpo (es decir, en el huevo). Los genes funcionales se definen por su expresion en RNA y, en ultima instancia, por las proteinas a las cuales codifican. Los genes no funcionales se definen como tales por su incapacidad para codificar protefn as por diferentes razones; las deficiencias pueden estar en Ia transcripcion o Ia traduccion (o en ambas) . A estos gen es se Jes denomina seudogenes y se indican mediante el sfmbolo \jf. Una organizacion general similar se encuentra en otros agrupamientos de genes de globina de vertebrados, pero los detalles en cuanto a tipo, numero y orden de los genes varfa como se ilustra en la Cada agrupamiento contien e genes tanto embrionarios como adultos, y su Jongitud total varfa ampliamente. El mas largo se encuentra en Ia cabra, en donde un agrupamiento basico de 4 genes se ha duplicado 2 veces. La distribucion de los genes activos y los seudogenes difiere en cada caso, lo cual ilustra Ia naturaleza fortuita de la conversion de una copia de un gen duplicado al estado de inactividad. La caracterizacion de estos agrupamientos de genes conduce a un punto gen eral importante: una

* "34f4I£1 El Cabra

0

Ell 'VP

EV EVl\j/p pB

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'VPho Raton

EIV\j/p pA

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Genes embrionarios: E;y

E

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__I: _ 0

Conejo

p

'VP

p E

p pH

,...,

Polio

~

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10

20

30

40

Genes adultos: p

n CD

50

60

70

80

100

90

En los vertebrados se encuentran agrupamientos de genes de globina ~ y seudogenes. Siete genes de raton incluyen dos genes embrionarios tempranos, un gen embrionario tardio, dos genes adultos y dos seudogenes. El co nejo y el pollo t i enen cuatro genes cada uno.

-- nilia de genes puede terter mas , tanto fu ncio.:.es como no funcionales, de lo que sospecharfamos con . ::.se en el analisis protein ico. Los genes funcionales = -icionales pueden representar duplicaciones que ~ difican a pohpeptidos identicos o estar relaciona::: s con las protefnas conocidas, pero de diferente arma (y presumiblemente se expresan solo de for.;na breve o en cantidades bajas). Respecto de la interrogante sobre cuanto DNA ~ necesita para codificar a una funcion en parti::-ular, se observa que la codificacion de las globi::as tipo ~ requiere de un rango de 20 a 120 kb :on distintos mamiferos, mucho mas de lo que se :"Sperarfa solo de analizar las protefnas conocidas 2e la globina ~, incluso del ana.lisis de cada gen. De .:ualquier forma, los agrupamientos de este tipo no 50 11 comunes; la mayorfa de los genes se encuentran :omo loci individuales. A partir de Ia organiza cion de los genes de la ~l obina en una variedad de especies, deberfa ser ;JOSible rastrear la evolucion de los actuales agru. amientos de genes de globina partir de un solo _gen ancestral de globina. La perspectiva actual de la 3scendencia evolutiva se ilustra en la El gen de leghemoglobina de las plantas, rela·ionado con los genes de la globina, podrfa representar a la forma ancestraL Lo mas que es posible ::-emontarse en cuanto a un gen de globina en su :orma moderna depende de la secuencia de la cadena individual de Ia mioglobina de los mamfferos, ia cual se separo de la linea de ascen dencia de la globina hace - 800 millones de afios. El gen de la mioglobina tiene la misma organ izacion que los genes de globina, de modo qu e es posible tomar la estructura de tres exones para representar a su ancestro comun.

Agrupamientos separados (mam fferos y aves)

PI

P2

Expansi6n de los agrupamientos

a~ - -

I

Separacion de los genes

--~ a- - [3

Duplicaci6n y divergencia

~-- I Fusion d/ exones

i

700 600

Genes a, p ligados (anlibios y peces)

Gen de globina individual (lamprea y mixino) Globina ancestral (mioglobina)

Leghemoglobina

500 400 300 200 100 Millones de anos

o Todos los genes de globina han evoluci onado por una serie de duplicaciones, t ransposici ones y mutaciones de un solo gen ancestral.

Algunos "peces prim itivos" tienen solo un tipo de cadena de globina, asi que deben haberse separado de Ia linea de la evolucion antes de que el gen

6.3 Los agrupa mientos de las globi nas son form ados por duplicaci6n y por di vergenci a

103

de globina ancestral se duplicara para dar Iugar a las variantes a y ~, lo cual aparentemente ocurrio hace -500 millones de anos, durante Ia evolucion de los osteictios. La siguiente etapa de la evolucion esta representada por el estado de los genes de globina de Ia rana Xenopus laevis, que tiene dos agrupamientos de genes de globina. No obstante, cada agrupamiento tiene ambos genes, a y ~, tanto de tipo larvario como adulto, de modo que el agrupamiento debe haber evolucionado por duplicacion de un par ex~ ligado, seguida de la divergencia entre cada copia . Mas tarde, el agrupamiento entero se duplico. Los anfibios se separaron de !a lfnea de mamfferos/aves hace -350 millones de aii.os, asf que la separacion de los genes de globina a y ~ debe h aber resultado de una transposicion en la lfnea predecesora de mamfferos/aves despues de dicho periodo, lo cual probablemente ocurrio en las primeras etapas de la evolucion de los vertebrados. Tanto en aves como en mamfferos hay agrupamientos independientes de globinas a y ~, de modo que los genes alfa y beta deben haberse separado fisicamente antes de que mamfferos y aves divergieran de su ancestro comun, evento ocurrido probablemente hace -270 millones de anos. Los cambios sucedidos en los agrupamientos a y ~ son mas recientes, como se vera a partir de Ia descripcion de la divergencia de cada gen en Ia siguiente seccion.

Ill

La divergencia secuencial es La base del reloj evolutivo

Conceptos principales • Las secuencias de genes hom6logos en especies diferentes varian en los sitios de remplazo (donde las mutaciones causan sustituciones de aminoacidos) y en los silenciosos (donde una mutaci6n no afecta a la secuencia proteinica). • Las mutaciones se acumulan en los sitios silenciosos ~10 veces mas rapido que en los de remplazo. • La divergencia evolutiva entre dos proteinas es medida por el porcentaje de posiciones en que difieren los aminoacidos correspondientes. • Las mutaciones se acumulan mas o menos a una misma velocidad despues de que los genes se separan, de manera que la divergencia entre cualquier par de secuencias de globina es proporcional al tiempo transcurrido desde la separaci6n de sus genes.

La mayor parte de los cambios de las secuencias protefnicas se debe a mutaciones pequenas que se 104


acumulan lentamente con el tiempo. Las mutaciones puntuales y las inserciones y deleciones pequenas son aleatorias, quiza mas o menos con la misma probabilidad en todas las regiones del genoma. Las excepciones son los puntas calientes, en los que las mutaciones suceden con mucha mayor frecuencia. Casi todas las mutaciones que modifican la secuencia de aminoacidos son deletereas y seran eliminadas por seleccion natural. Pocas mu taciones son provechosas, y cuando ocurre una inusual, es muy probable que se extienda entre la poblacion, remplazando de modo eventual a Ia secuencia anterior. Cuando una nueva variante remplaza a Ia version previa del gen, se dice que se ha fijado en la poblacion. Un aspecto controvertido es que proporcion de mutaciones de una secuencia de amin oacidos es neutral, es decir, sin efecto en la funcion de las protefnas y, por lo tanto, susceptible de acumularse como resultado del flujo aleatorio y de la fijacion. La velocidad a Ia cual se acumulan los cambios derivados de mutaciones es caracterfstica de cada protefna, y presumiblemente depende, por lo menos en parte, de su flexibilidad respecto del cambia. En una especie, una prote.ina evoluciona por sustitu cion de mutaciones, seguida de delecion o de fijacion en el acervo de reproduccion individual. Cabe recordar que cuando se escudrina el acervo genetico de una especie, seven solo las variantes que han sobrevivido. Cuando multiples variantes estan presentes, puede que sean estables (porque ningu na tiene una ventaja selectiva), o de hecho, un a podrfa ser transitoria porque esta en proceso de ser desplazada. Cuando una especie se divide en dos nuevas especies, cada una de las resultantes constituye un acervo independiente para la evolucion. Al compararse las protefnas correspondientes de dos especies, se ven las diferencias acumuladas desde el memento en que sus ancestros dejaron de hibridarse. Algunas estan muy conservadas y muestran pocos cambios, o ninguno, de especie a especie, lo cual indica que casi cualquier cambia es deletereo y, por lo tanto, no seleccionado. La diferencia entre dos protefnas se expresa como su divergencia, el porcentaje de posiciones en que difieren los aminoacidos. La divergencia entre protefnas puede ser diferente de la divergencia entre las secuencias de acido nucleico correspondientes, debido a la representacion de cada aminoacido en un codon formado por tres bases, en el cual, a menudo Ia tercera no incide en el significado. La secuencia nucleotfdica de una region codificadora puede dividirse en sitios de remplazo y sitios silenciosos potenciales:

• En los sitios de remplazo, una mutacion mo difica al aminoacido codificado. El efecto de la mutacion (deletereo, neutral o beneficiaso) depende del re sultado del remplazo del aminoacido. • En los sitios silenciosos, Ia mutacion solo sustituye a un codon sin6nimo por otro, de modo que la protefna no se modifica. En general, los sitios de remplazo representan el 7 5% de una secuencia codificadora y los silenciosos, el 25 por ciento. Ademas de la secuencia codificadora, un gen :ontiene regiones no traducidas, en cuyo caso, las :nutaciones son tambien potencialmente neutras, ?:parte de sus efectos en la estructura secundaria en general, mas bien corta) o en las sefiales regu:adoras. A pesar de que las mutaciones silenciosas son ::eutrales respecto de la protefna, pueden afectar :a expresion genica por el cambia de secuencia del A. For ejemplo, un cambia en la estructura se ::undaria puede influir en la transcripci6n, el pro~esa miento o la traducci6n. Otra posibilidad es que lln cambia en codones sinonimos requiera de Ia respuesta de un RNAt diferente, de modo que influ ye :>n la eficiencia de la traduccion. Las mutaciones en los sitios de remplazo deben corresponder a la divergencia de aminoacidos determinada por el porcentaje de cambios en la >:ecuencia de la proteina). Una divergencia de acido nucleico de 0.45% en sitios de remplazo corresponde a una divergencia de aminoacidos del 1% suponiendo que el numero promedio de sitios de :emplazo por codon sea de 2.25). De hecho, Ia di·:ergencia medida subestima las diferencias ocurriJas durante la evoluci6n porque en un codon han currido muchos eventos, en cuyo caso, normal :nente se hace una correccion. Tomando el ejemplo de las cadenas de globina J y 8 humanas, en 146 residuos hay 10 diferencias, ~s decir, una divergencia de 6. 9 por ciento. La se:-u encia de DNA tiene 31 cambios en 441 residuos . ~\o obstante, estos cambios se distribuyen de manera muy diferente en los sitios de remplazo y los ~ il enciosos: 11 en 330 sitios de remplazo, pero 20 en ·6lo 111 silenciosos, lo cual resulta en velocidades e divergencia (corregidas) de 3.7 % en los sitios de ::-emplazo y de 32% en los silenciosos, una difereni a de casi un orden de magnitud. La asombrosa diferencia en la divergencia de .os sitios de remplazo y los silenciosos demu estra .u existencia de coacciones mucho mayores en las jJ siciones de los nucleotidos que influyen en la :-onstitucion protefnica respecto de aquellos en que :;o, de modo que probablemente muy pocos de los :ambios de aminoacidos son neutrales .

Sup6ngase que se toma el rango de mutacion en sitios silenciosos para indicar el rango subyacente de fijaci6n por mutaci6n (lo cual supone que no hay seleccion en los sitios silenciosos), de modo que en el periodo transcurrido desde la divergencia de los genes~ y 8, deberfa haber carnbios en 32% de los 330 sitios de remplazo, para un total de 105 . Todos, menos 11 , han sido elirninados, lo cual significa que -90% de las mutaciones no sobrevivieron. La divergencia entre cualquier par de secuencias de globina es (mas o menos) proporcional al tiempo que !levan separadas, lo cual proporciona un reloj evolutivo que mide Ia acumulacion de mutaciones a un ritmo aparentemente constante durante la evoluci6n de una protefna dada. La velocidad de divergencia puede ser medida como la diferencia porcentual por millon de afios, o como su recfproco, la unidad de periodo evolutivo (UEP, unit evolutionary period), e! tiempo en millones de afios que tarda en desarrollarse el 1 % de divergencia. Una vez establecido el reloj por comparaciones pareadas entre especies (recuerdense las dificultades practicas para establecer el tiempo real de la evolucion de las especies) , puede aplicarse a genes relacionados dentro de una especie. A partir de su divergencia se podra calcular el tiempo transcurrido desde la duplicaci6n qu e los genero . Comparando las secuencias de genes homologos en diferentes especies, podra determinarse !a velocidad de divergencia tanto en sitios de remplazo como en sitios silenciosos, segD.n se ilustra en la En las comparaciones pareadas, hay una divergencia promedio de 10% en los sitios de remplazo de cualquiera de los genes de globina a o ~ de los mamfferos separados desde la radiaci6n de los mamfferos, ocurrida hace -85 millones de afios, que

.

I

"I · I I I

Q)

I

·~ 20

I I

Q)

S? 0

Sitios de remplazo

I I

Q_

100

200

300

Millones de afios de

400

500

sRrl>-~r:~""~n

La divergencia de las secuencias de DNA depende de la separaci6n evolutiva . Cada punto de la gratica representa una comparaci6n de pares.

6.4 La di vergencia secuencial es la base del reloj evolutivo

105

..

600

500 400

300

200

Millones de anos ~l Las divergencias en los sitios de remplazo entre pares de genes de globina p permiten la reconstrucci6n de la historia del agrupamiento humano. Este arbol represe nta la separaci6n de las clases de genes de globina.

corresponde a una velocidad de divergencia de remplaza de 0.12% por millon de afios. La velocidad es estable cuando la comparacion incluye los genes que se separaron en epocas mas distantes. Por ejemplo, el promedio de divergencia de remplazo entre los genes de globina correspondientes de mamfferos y pollos es de 23%, que relacionado con una separacion ocurrida hace -270 millones de afios, resulta en 0.09% por millon de afios. Remontandose aun mas, es posible comparar los genes de las globinas a y ~ de una especie, los cuales no han dejado de divergir desde que los tipos de genes individuales se separaron hace 500 millones de afios (vease Ia Fig. 6.8), de modo que el promedio de divergencia de remplazo es de -50 % , que resulta en una velocidad de 0.1 % por millon de afios. En el resumen de estos datos que aparece en Ia Figura 6. 9, resalta que !a divergencia de remplazo en los genes de globina tiene Iugar a una velocidad promedio de -0.096% por millon de ai'ios (o una UEP de 10.4). Considerando Ia incertidumbre en Ia estimacion del momenta en que las especies se separaron, los resultados proporcionan un buen respaldo a !a idea de que existe un reloj lineal. La informacion sobre Ia divergencia en los sitios silenciosos es mucho menos clara. En cada caso es evidente que es mucho mayor que Ia divergencia en los sitios de remplazo, por un factor que fluctu a entre 2 y 10. No obstante, Ia difusion de las divergencias en los sitios silenciosos en comparaciones pareadas es demasiado grande como para mostrar 106


si el reloj es aplicable (de modo que las comparaciones temporales tienen que basarse en los sitios de remplazo). A partir de Ia Figura 6. 9 resulta obvio que Ia velocidad de los sitios silenciosos no es lineal respecto del tiempo. Si se supone que fa divergencia debe ser cera a los cera aiios de separaci6n, se observa que Ia velocidad de divergencia en los sitios silenciosos es mucho mayor para los primeros -100 mill ones de afios de separacion. Una interpretacion es que una fraccion de aproximadamente Ia mitad de los sitios silenciosos se satura rapidamente de mutaciones (en unos 100 millones de afios ) y se comporta como los sitios neutrales. La otra fraccion acumula m u taciones mas lentamente, a una velocidad aproximadamente igual ala de los sitios de remplazo; esta fraccion identifica a los sitios silenciosos respecto de Ia protefna, pero por alguna otra razon, eso sucede por presion selectiva. Ahora es posible revertir el calculo de las ve locidades de divergencia para estimar el momenta en que los genes de una especie se separaron. La diferencia entre los genes~ y 8 humanos es de 3.7 % para los sitios de remplazo. En una UEP de 10.4, estos genes deb en haberse separado hace 10.4 x 3.7 = 40 millones de afios, mas o menos en Ia epoca de Ia separacion de las lfneas que dieron Iugar a los mo nos del Nuevo Mundo y a los del Viejo Mundo, los grandes simios, y al hombre. Todos estos primates superiores tienen tanto genes ~como 8, lo cual sugiere que la divergencia genica comenzo justo antes de este punto de Ia evolucion. Remontandose aun mas, la divergencia entre los sitios de remplazo de los genes y y E es de l 0 %, lo cual corresponde a un momento de separacion de hace -100 mill ones de afios. La separacion entre los genes de globina embrionarios y fetales, por lo tanto, puede haber precedido o acompafiado la radiacion de los mamiferos. En Ia r r se construye un arbol evolutivo de los genes de globina humanos. Las caracterfsticas que evolucionaron antes de Ia radiacion de los mamfferos, como la separacion de ~ / 8 de y, deben encontra rse en todos los mamfferos, en tanto que las que evolucionaron despues, como Ia separacion de los genes de las globinas ~ y 8, de ben encontrarse en lfneas espedficas de mamffe ros. En cada especie han existido cambios comparativamente recientes en cuanto a las estructuras de los agrupamientos, lo cual se sabe por las diferencias observadas en el numero (un gen de globina ~ adulto en el hombre, dos en el raton) o el tipo (casi siempre en fu ncion de genes embrionarios y fetales independientes) de los genes. Cuando se ha reunido suficiente informacion sobre las secuencias de un gen en particular, pueden

los argumentos y usar las comparaciones . ..:re ~enes de diferentes especies para evaluar re~=o nes taxonomicas.

~:--;ertirse

La velocidad de sustituci6n neutral puede ser medida a partir de la divergencia de secuencias repetidas

GCCAGCGTAGCTTCCATTACCCGTACGTTCATATTCGG

7/38 = 0.18

GCTGGCGTAGCCTACGTTAGCGGTACGTGCATATTGGG

6/38 = 0.16

GGTAGCCTACCTTAGGCTACCGGTTCGTGC

GTTCGG

6/38 = 0.16

GGTAGCCTAGCTTAGGTTA TTGGTAGGTGCATGTCCGG GCTACCCTAGGTTACG TTATCGGTACGTGTCCGTTCGG

6/38 = 0.16 6/38 = 0.1 6

GCCACCCCAGCTCACGTTACCGGCACGTGCATGATCGC

7/38 = 0.18

CCTAGCCTCGCTTTCGTTAGCGGTACCTGCATCTTCCG

7/38 = 0.18

GCTTGCCTAG

ACGTTACTGGTACGCGCATGTTGGG

5/38 = 0.13

GCCAGGCTAGCTTACGCCACCGGTACGTGGATGTCCGG

6/38 = 0.16

Concer-to principal • La velocidad de sustitucion par aiio en sitios ne utrales es mayor en el genoma del raton que en el genoma humano. ::_3 mejor manera de estimar la velocidad de sus-

Calcula secuencia de consenso

1

GCTAGCCTAGCTTACGTTACCGGTACGTGCATGTTCGG

l

Calcula divergencia a partir de Ia secuencia de consenso

-~ u cion

en los sitios neutrales es examinar las se_~Je ncias que no codifican protefnas. (En este caso ': utiliza el termino neutral y no silencioso po rque -_ hay potencial codificador.) Se obtiene una com- .rracion informativa comparando a los :e una familia repetitiva comun en los genomas del -.-c~ mano y del raton. El principia del am1lisis se resume en Ia 1, partiendo de una familia de secuencias rela.ionadas que h an evolucionado por duplicacion y .: '.lstitucion de un miembro original de Ia m isma _ suponiendo que Ia secuencia ancestral comun ~ u ede deducirse tomando la base mas com{m en :<>da posicion. A partir de ahf se puede calcular la =.:vergencia de cada miembro especffico de Ia famia como Ia proporcion de bases que difieren de Ia : ecuencia ancestral deducida. En este ej emplo, Ia :::.: •ergencia entre individuales va de 0.1 3 ~ 0.18, y el promedio es 0.16. Una familia utilizada para este analisis en el ge~ rna humano y el de raton deriva de una secuencia ~'-'e supuestamente dejo de estar activa porIa epoca _e la divergencia entre el hombre y los roedores (la ~- milia LINES [long interspersed repeated sequences]; ease Ia seccion 22. 9, Los retroposones se dividen :: :-~ tres clases). Esto significa que durante to do ese :::empo no ha dejado de divergir sin presion selectia en ambas especies. La divergencia promedio en -=~ hombre es de -0.17 sustituciones por sitio, lo cual : rresponde a un fndice de 2.2 x l o-9 sustituciones :x>r base por a no en los 7 5 mill ones de anos des de .-:1 separacion. Sin embargo, en el genoma del raton ::an ocurrido sustituciones neutrales al doble de esta ·-elocidad, es decir, a 0. 34 sustituciones por sitio en -"- familia, 0 a una velocidad de 4. 5 X 1o-9 . Notese, .:in embargo, que si se calcula Ia velocidad por gene:!lcion y no por ano, seria mayor en el hombre que : n e] raton (- 2.2 X 10-s frente a - 10-9 ).

Una secue ncia de consenso ancestral para una familia se calcula tomando la base mas comun de cada posicion. La di vergencia de cada miemb ro actua l existente de la fa milia es calculada como la proporcion de bases en que difie re de la secuencia ancestral.

Probablemente en estas cifras se subestima Ia velocidad de sustitu cion en el raton ; en el momento de Ia divergencia, ambas tasas deben haber sido las m ismas y Ia diferencia debe haber evolucionado desde entonces. La velocidad actual de sustitucion neutral por afio en el raton es probablemente 2 a 3 veces mayor que el promedio h istorico. Estas tasas retlejan el equilibria entre Ia ocurrencia de mutaciones y Ia capacidad del sistema gen etico del organismo para corregirlas. La diferencia entre especies demuestra que cada especie tiene sistemas que fu ncionan con una eficiencia caracterfstica. Comparar los genomas del human o y del raton permite evaluar silas secuencias sintenicas (correspondientes) muestran signos de conservado o han diferido de Ia velocidad esperada de acumulacion de susti tuciones neutrales. La proporcion de sitios que muestra signos de seleccion es -5%, much o mas elevada que Ia proporcion que codifica a proteinas o a RNA (- 1% ), lo cual implica que el genoma in cluye m u chos mas fragme ntos cuya secuen cia es importante para las funcion es no codificadoras, no para las codificadoras . Los elementos reguladores conocidos tienden a representar solo una pequena parte de esta proporcion. Esta cifra tambien sugiere que Ia mayor parte de las secuencias del genoma (es decir, el resto), no tiene ninguna funcion que dependa de Ia secu encia exacta.

6.5 La velocidad de sustitucion neutral puede ser medida a partir de la divergencia de secuencias repetidas

107

Ill

Los seudogenes son callejones sin salida de la evoluci6n


Los seudogenes no tienen funci6n codificadora, sin embargo, pueden ser reconocidos por similitudes secuenciales con los genes funcionales existentes. Surgen de La acumulaci6n de mutaciones en genes (anteriormente) funcionales.

Los seudogenes (\{') se definen por su posesion de secuencias relacionadas con las de los genes funcionales, pero que no pueden ser traducidas en una protefna funcional. Algunos tienen Ia misma estructura general que los genes funcionales, con secuencias que corresponden a los exones y los intrones en las ubicacio nes habituates, pero pueden haberse tornado inactivos por mutaciones que inhibieron una o todas las etapas de Ia expresion genica. Los cambios pueden abolir las senales de inicio de la transcripcion a! impedir el corte y empalme en las uniones exon-intron o terminar la traduccion prematuramente. En generaL un seudogen tiene numerosas mutaciones deletereas, pues, presumiblemente, una vez que dejo de estar activo, ya no hubo impedimenta para la acumulacion de mutaciones adicionales. En varios sistemas se han encontrado seudogenes que representan versiones inactivas de genes activos actualmente, entre otros, los de la globina, los de las inmunoglobulinas y los de los antfgenos de histocompatibilidad, en los cuales se localizan cerca del agrupamiento de genes, a menudo intercalados con los genes activos.

Caracterlsticas del gen activo

Cambios en el seudogen

Promotor

Mutaciones del promotor

Empalmes

Perdida de los empalmes

Marcos de lectura abiertos

Mutaci6n sin sentido Mutaciones de cambia de sentido

Desde que un gen de globina ~ se convirti6 en seudogen, han ocurrido muchos cambios.

108

CAPiTULO 6 Agrupamientos y repeticiones

Un ejemplo tipico es el seudogen \{'~2 del conejo, que presenta Ia organizacion usual de exones e intrones y se relaciona muy fntimamente con el gen funcional de globina ~1, pero noes fu ncional. En la se resumen los multiples cam bios ocurridos en dicho seudogen. La delecion de un par de bases en el codon 20 de \f'~2 ha dado Iugar a un cambio del marco de lectura que poco despues llevara ala terminacion . Numerosas mutaciones puntuales ha n modificado a codones posteriores que representan a aminoacidos muy conservados en las globinas ~- Ninguno de los dos intrones tiene ya fronteras reconocibles con los exones, asi que probablemente los intrones no podrian ser cortados, ni siquiera si el gen fuera transcrito. De cualquier forma, no hay transcritos que correspondan al gen, quiza porque ha habido cambios en la region flanqueante 5'. Esta lista de defectos incluye mutaciones qu e podrian impedir cada etapa de la expresion genica, por lo tanto, n ose cuenta con medios para decir que evento desactivo originalmente a dicho gen. Ahora bien, si se mide Ia divergencia entre el seudogen y el gen funcional, sera posible estimar el momento en que se origino el seudogen y cuando se empezaron a acumular sus mutaciones. Si el seudogen se desactivo en cuanto fue generado por !a duplicacion de ~ l , se debe esperar que la velocidad de divergencia tanto en sitios de remplazo como en sitios silenciosos sea Ia misma (diferiran solo Si el gen es traducido para Crear presion selectiva en los sitios de remplazo) . De hecho, hay menos sustituciones en los sitios de remplazo que en los silenciosos, lo cual sugiere que, al principia (mientras el genera expresado) , hubo seleccion contra Ia sustitucion en el sitio de remplazo. A partir de Ia extension relativa de Ia sustitucion en los dos tipos de sitio, podemos calcular que '-!1 ~2 se separo de ~ 1 h ace -55 millones de anos y siguio siendo un gen funcional durante 22 millones de afios, pero ha sido un seudogen durante los ultimos 33 millones de anos. Es posible hacer calculos similares para otros seudogenes. Algunos parecen haber estado activos por algun tiempo antes de convertirse en seudogenes, en tanto que otros parecen haber estado inactivos desde el momento mismo de su generacion. El punto general man ifestado por las estructuras de estos seudogenes es que cada uno evoluciono de manera independiente durante el desarrollo del agrupamiento de genes de globina de cada espe cie, fenomeno que refuerza la conclusion de que la creacion de nuevos genes, seguida de su aceptacion como duplicados funcionales, de la variacion para convertirse en nuevos genes funcionales o de

_ :n activacion como seudogenes, es un proceso -. ~ inuo en el agrupamiento de genes. La mayoria _ ~ a s familias de genes tienen que son - .~d ogenes, los cuales suelen constituir una mino- :_ reducida del numero total de genes. El gen de globina Cf'a3 del raton tiene una pro_dad interesante, precisamente carece de ambos - ~c ones. Su secuencia puede ser aline ada (permi~ :1do la acumulacion de mutaciones) con la del :~ · Am de la globina a. El momento aparente de la _: sactivacion coincide con la duplicacion original, cual sugiere que el evento desactivador original ._: ~ u vo asociado con la perdida de los intrones. Las secuencias genomicas inactivas similares al . anscrito de RNA se llaman seudogenes procedos, que despues de un evento de transposicion - : ~ rograda se originan por insercion en algun sitio .:_eatorio de un producto derivado del RNA, como ·c: describe en el Capitulo 22, Retrovirus y retropo~ nes. Sus rasgos caracteristicos se resumen en la ::igura 22.19. Silos seudogenes son callejones sin salida de la :.'volucion, simples compafiias no deseadas de la re:-structuracion de genes funcionales, epor que aun : > stan presentes en el genoma? c:,Llevan a cabo algu:la funcion o no tienen ning{m fin, en cuyo caso, no deberfa existir presion selectiva para su retencion? Cabe recordar que se ven los genes que han sobrevivido en poblaciones presentes, pero en el pasado puede haber sido eliminado un n{lmero inde~ erminado de ellos. Dicha eliminacion pudo ocurrir por delecion de la secuencia como evento repentino o por la acumulacion de mutaciones hasta el punto de que el seudogen ya no fuera reconocido como m.iembro de su familia de secuencia original (probablemente el destino final de cualquier seudogen no eliminado repentinamente). Incluso las reliquias de la evolucion pueden ser duplicadas. En los genes de globina ~de la cabra hay tres especies adultas, ~A, ~By ~C (vease la Fig. 6.7), cada una con seudogen localizado algunas kilobases en flujo ascendente. Los seudogenes se relacionan mejor entre sf que con los genes de globina ~ adultos; en particular, comparten varias mutaciones desactivadoras. Ademas, estos ultimos se relacionan mejor entre sf que con los seudogenes, lo cual implica que se duplico una estructura original Cf'~~ y se originaron genes ~ funcionales (que despues se separaron) y dos genes no funcionales (que divergieron hacia los seudogenes actuales). Los mecanismos que causan la duplicaci6n, la delecion y !a reorganizaci6n de los genes actuan en todas las secuencias reconocidas como del agrupamiento, sean o no funcionales. Se deja ala seleccion la tarea de discriminar entre los productos.

Por definicion, los seudogenes no codifican proteinas y en general, carecen de funcion. Empero, cuando menos en un caso excepcional, un seudogen desempefia una funcion reguladora. La transcripcion de un seudogen inhibe la degradacion del RNAm producido por su gen activo homologo. Muy probablemente hay una protefna responsable de esta degradacion que une a una secuencia especffica en el RNAm. Siesta secuencia esta tambien presente en el RNA transcrito del seudogen, el efecto de la proteinase diluira cuando el seudogen sea transcrito. No esta claro que tan comunes puedan ser tales efectos, pero como regla general, podemos esperar que los efectos de dilucion de este tipo sean posibles siempre que los seudogenes se transcriban .

Ill

Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran Los agrupamientos de genes

Conceptos pri ncipales • Cuando un genoma contiene un agrupamiento de genes con secuencias relacionadas, el apareamiento err6neo entre genes no alelicos puede causar un entrecruzamiento desigual, de modo que se produce una deleci6n en un cromosoma recombinante y una duplicaci6n correspondiente en el otro. • Las talasemias diferentes son causadas por varias deleciones en que se elimina el gen de la globina a o el de la ~- La gravedad de la enfermedad depende de cada deleci6n.

En un agrupamiento de genes identicos o relacionados hay oportunidades frecuentes de reorganizacion, cuyos resultados se aprecian al comparar los agrupamientos ~ de los mamfferos incluidos en la Figura 6.7. A pesar de que los agrupamientos cumplen la misma funcion y todos tienen la misma organizacion general, difieren en tamafio y varia el numero total y el tipo de genes de globina ~' asi como los numeros y las estructuras de los seudogenes. Todos estos cambios deben haber ocurrido desde la radiacion de los mamiferos, hace -85 millones de afios (tlltimo punto de la evolucion comun a todos los mamfferos). La comparacion resalta el punto general de que la duplicacion, la reorganizacion y la variacion de los genes son factores tan importantes en la evolucion como la acumulacion lenta de mutaciones en genes individuales. c:. Que tipos de mecanismos son responsables de la reorganizacion genica? Como se describio en la introduccion de este capitulo, el entrecruzamiento desigual puede ser resultado del apareamiento entre dos sitios no homo-

6.7 Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran los agrupamientos de genes

109

Entrecruzamiento normal Gen 1

Gen 2

Cromosoma 1

Cromosoma2

Cromosomas recombinantes reciprocos

Entrecruzamiento desigual

Entrecruzamiento

Jt

Cromosomas progenitores apareados err6neamente

recombinantes no reciprocos

El numero de genes puede ser modificado por entrecruzamiento desigual. Si el gen 1 de un cromosoma se aparea con el 2 del otro, las otras capias del gen quedan excluidas del apareamiento. La recombinaci6n entre genes apareados err6neamente produce un cromosoma con un sola copia (recombinante) del gen y un cromosoma con tres capias del gen (una de cada progenitor y una recombinante).

logos. Normalmente, Ia recombinacion involucra a secuencias de DNA corresponclientes situadas en alineadon exacta entre los dos cromosomas homologos. Sin embargo, cuando hay dos copias de un gen en cada cromosoma, un desalineamiento ocasional permite que se apareen entre sf (lo cual implica que algunas de las regiones adyacentes se desapareen). Esto puede suceder en una region de repeticiones conas (vease Ia Fig. 6. 3) o en un agrupamiento de genes. En Ia se observa que el entrecruzamiento desigual en un agrupamiento de genes puede tener dos consecuencias, una cuantitativa y otra cualitativa: • El numero de repeticiones aumenta en un cromosoma y disminuye en el otro, de tal forma que un cromosoma recombinante sufre una delecion y el otro una insercion, indepenclientemente de Ia localizacion exacta del entrecruzarniento. En la figura, en el primer recombinante au menta el numero de copias del gen, de dos a tres, en tanto que en el segundo recombinante se reduce de dos a una. • Si el evento de recombinacion sucede en un gen (y no entre genes), el resultado depende de que los genes recombinados sean identicos o solo esten relacionados. Si las 110


copias uno y dos del gen no correspondiente son completamente homologas, no hay cambios en la secuencia de ninguno de los genes. Sin embargo, tambien puede ocurrir un entrecruzamiento no equivalente cuando los genes adyacentes estan bien relacionados (aunque Ia posibilidad es menor que cuando son identicos) . En este caso, cada uno de los genes recombinantes tiene una secuencia diferente de Ia de cualquiera de los progenitores. Que el cromosoma tenga una ventaja o una desventaja selectiva, dependera de Ia consecuencia de cualquier cambio en la secuencia del producto del gen, asf como del cambio en el numero de copias. Un obstaculo para el entrecruzamiento desigual es representado por Ia estructura interrumpida de los genes. En un caso como el de las globinas, los exones correspondientes de las copias adyacentes del gen tienden a estar lo suficientemente bien relacionadas como para sostener el apareamiento, pero las secuencias de los intrones han divergido de manera notoria. La restriccion de aparearse con los exones reduce considerablemente el fragmento continuo del DNA potencialmente involucrado, con lo cual se reduce Ia posibilidad de un entrecruzamiento desigual, por lo tanto, Ia divergencia entre intrones potenciarfa Ia estabilidad de los agrupamientos de genes y disminuirfa Ia posibilidad de un entrecruzamiento desigual. Las talasemias son resultado de mutaciones que reducen o inhiben Ia sfntesis de Ia globina a o Ia ~· La incidencia de entrecruzamiento desigual en los agruparnientos de genes de Ia globina humana es revelada por la naturaleza de ciertas talasemias. Muchas de las talasemias mas severas resultan de deleciones de una parte del agrupamiento. Cuando menos en algunos casos, los extremos de la delecion se encuentran en regiones homologas, que es exactamente lo que se esperarfa si se hubiera generado por un entrecruzamiento desigual. En Ia se resumen las deleciones que causan talasemias a; las de a-tal-l son largas y su localizacion varia en el extremo izquierdo, en tanto que las posiciones del extremo derecho se localizan mas alla de los genes conocidos y eliminan a los dos genes a. Las deleciones de a-tal-2 son cortas y eliminan solo a uno de los dos genes a. La delecion L elimina 4 .2 kb de DNA, incluido el gen a2; probablemente resulta de un entrecruzamiento desigual, porque los extremos de Ia delecion estan en regiones homologas, justo a Ia derecha de los genes \!fay a2, respectivamente. La delecion R resulta de la eliminacion de exactamente 3.7 kb de DNA, distancia exacta entre los genes al y a2. Esta delecion parece haber sido generada por un entrecruzamiento des-

igual entre los mismos genes cd y ex2, precisamente la situacion que se ilustra en la Figura 6.13. Dep endiendo de la combinacion diploide de cromosomas talasemicos, un individuo afectado puede tener de cero a tres cadenas ex. Hay algunas diferencias entre el tipo silvestre (cuatro genes ex) en individuos con dos o tres genes ex, pero si un individuo tiene solo un gen ex, el exceso de cadenas ~forma el inusual tetramero ~ 4 , que provoca la enfermedad de hemoglobina H (HbH). La carencia total de genes ex resulta en hidrops fetalis (o hidropesfa fetal), que es fatal al nacer o despues del nacimiento. El mismo entrecruzamiento desigual que genero el cromosoma talasemico debe haber generado tambien un cromosoma con tres genes ex. En ciertos casos se han identificado individuos con dicha caracterfstica, y en algunas poblaciones, la frecuencia del locus ex triple es casi Ia misma que la del locus ex sencillo, mientras que en otras, los genes ex triples son mucho menos comunes que los sencillos, Io cual sugiere que en diversas poblaciones operan factores selectivos (desconocidos) que ajusta los niveles genicos. Las variaciones en el numero de genes ex son reIativamente frecuentes, Io cual permite argumentar que el entrecruzamiento desigual en el agruparnienIO debe ser bastante comun, si bien se observa con mas frecuencia en el agrupamiento ex que en el ~' posiblemente porque los intrones de los genes ex son mucho mas cortos y por Io tanto presentan menos impedimentos para el apareamiento erroneo entre genes no homologos. Las deleciones que provocan las talasemias ~ se resumen en la , . En algunos casas (raros), solo el gen ~ resulta afectado, con una delecion de 600 bp, a partir del segundo intron, pasando por la s regiones flanqueantes 3'. En los otros casas, muchas de las deleciones son muy largas, del extrema 5', indicado en el mapa, basta >50 kb bacia Ia derecha. El tipo Hb Lepore proporciona la clasica evidencia de que Ia delecion puede resultar de un entrecruzamiento desigual entre genes ligados. Los genes ~ y 8 difieren unicamente -7% en sus secuencias. La recombinacion desigual elimina material entre los genes, fusionandolos (vease Fig . 6.13) . El gen fusionado produce una cadena individual tipo ~ formada por Ia secuencia terminal N de o, unida a Ia secuencia terminal C de ~ · Actualmente se conocen numerosos tipos de Hb Lepore, y Ia diferencia radica en el punta de transicion de las secuencias de 8 a ~, asf que cuando los oenes 8 a ~ se aparean por entrecruzamiento des2gual, el punta exacto de recombinacion determina :a posicion en que sucede cambia de secuencia oa en Ia cadena de aminoacidos.

.......... ..... a2

a.l

8

a-tai-2L a-tai-2R a-tal-1-Tailandesa a-tai-1-Griega

Restante

Borrado

Las talasemias a. resultan de varias deleciones en el agrupamiento de genes de globina a..

..... .....p

.....

3

e

P= tal

Gf'-.1 HPFH

I

GA HPFH Gf.y HPFH Hb Kenia Gf.y tal

yj3 tal

bina

~

Las deleciones del agrupamiento del gen de glocausan varios tipos de talasemias.

El recfproco de este evento ha sido encontrado en la forma de Hb anti- Lepore, producida por un gen que tiene la parte terminal N de ~ y la parte terminal C de 8. EL gen fusionado esta entre los genes 8 y ~ normales . La evidencia de que pueden presentarse entrecruzamientos desiguales entre genes cu ya relacion es lejana proviene de la identificacion de Ia Hb Kenia, otra hemoglobina fusionada, Ia cual contiene Ia secuencia terminal N del gen ~ y Ia secuencia terminal C del gen ~· La fusion debe haber resultado del entrecruzamiento desigual entre ~ y ~, cuyas secuencias difieren -20%.

6.7 Mediante entrecruzamiento desigual se reestructuran los agrupamientos de genes

111

A partir de las diferencias entre los agrupamientos de genes de globina de varios mamfferos se observa que la duplicacion seguida (algunas veces) de la variacion ha sido un elemento importante en Ia evolucion de cada agrupamiento. Las deleciones talasemicas humanas demuestran que el entrecruzamiento desigual sigue ocurriendo en ambos agrupamientos de genes de globinas . Cada vez que un evento de esta naturaleza genera una duplicacion y una delecion, debe tomarse en cuenta el futuro de los loci recombinantes de la poblacion . Las deleciones tambien pueden ocurrir (en principia) por recombinacion entre secuencias homologas que se encuentran en el mismo cromosoma, fenomeno que no genera una duplicacion correspondiente. Es diffcil calcular Ia frecuencia natural de estos eventos porque las fuerzas selectivas ajustan nipidamente los niveles de los diversos agrupamientos de la poblacion. En general, una contraccion en el numero de genes tiende a ser nociva y descartada a favor de otra, sin embargo, algunas poblaciones pueden tener una ventaja compensadora que mantenga ala forma eliminada en una frecuencia baja. Las estructuras de los agrupamientos humanos actuates muestran varias duplicaciones que dan testimonio de la importancia de tales mecanismos. Las secuencias funcionales incluyen dos genes a que codifican a la misma protefna, bastante bien relacionados con los genes ~ y 8, y dos genes y casi identicos. Estas duplicaciones independientes comparativamente recientes han sobrevivido en la poblacion, sin mencionar a las duplicaciones mas clistantes que originalmente generaron los diversos tipos de genes de globina. Otras duplicaciones pueden haber dado lugar a seudogenes o se han perdido. Es de esperar que la duplicacion y la delecion continuas sean caracteristicas de todos los agrupamientos de genes.

Los genes del RNAr forman repeticiones en tandem Conceptos principales • El RNA ribos6mico es codificado por un numero considerable de genes identicos que se repiten en tandem para formar uno o mas agrupamientos . • Los agrupamientos de DNAr se organizan de manera tal, que las unidades de transcripci6n que resultan en un precursor unido a los RNAr principales alternan con espaciadores no transcritos.

En los casas descritos hasta ahara, hay diferencias entre los individuates de un agrupamiento de genes que permiten que la presion selectiva 112


actue de manera independiente en cada gen, y hay, por el contrario, dos casas de agrupamientos grandes de genes que contienen varias capias identicas del mismo gen o genes. La mayoria de los organismos contienen multiples capias de los genes para las histonas, que son un componente fundamental de los cromosomas, y casi siempre hay varias copias de los genes que codifican a los RNA ribosomicos; lo que plantean interrogantes evolutivas de interes. El RNA ribosomico es el producto predominante de la transcripcion, pues constituye del80 al 90% de la masa total del RNA celular de las eucariotas y las procariotas. El numero de genes mayores de RNAr fluctua entre 7 de E. coli, 100 a 200 de las eucariotas inferiores y varios cientos en las eucariotas superiores. Los genes que codifican al RNAr grande y al pequefio (encontrados en las subunidades grandes y pequefias del ribosoma, respectivamente) suelen formar un par en tandem (la unica excepcion son las mitocondrias de las levaduras). La ausencia de una variacion detectable en las secuencias de las moleculas de RNAr implica que todas las capias de cada gen deben ser identicas, o cuando menos sus diferencias deberan estar por debajo del nivel de deteccion del RNAr (-l%). Un pun to de gran in teres son los mecanismos utilizados para evitar que las variaciones se acumulen en las secuencias individuates. En las bacterias, los multiples pares de genes de RNAr estan dispersos, mientras que en la mayorfa de los nucleos eucarioticos es tan contenidos en agrupamientos en tandem, regiones que suelen llamarse DNAr. (En algunos casas, la proporcion de DNAr en el total del DNA aunada a su composicion basica atfpica, es lo suficientemente importante como para aislarse como fraccion independiente, directamente del DNA genomico cortado.) Una caracterfstica cliagnostica importante de un agrupamiento en tandem es que genera un mapa de restriccion circular, como se muestra en la Supongamos que cada unidad de repeticion tiene tres sitios de restriccion. Cuando se mapean estos fragmentos por medios convencionales, se observa qu e A esta junto a B, que esta junto a C, que esta junto a A, generando un mapa circular. Si el agrupamiento es grande, los fragmentos internos (A, B y C) estaran presentes en cantidades mucho mayores que los terminales (X y Y), mismos que conectan al agrupamiento con el DNA adyacente. En un agrupamiento de l 00 repeticiones, X y Y estarfan presentes al l % del nivel de A, B y C, lo cual puede dificultar la obtencion de los extremos de un agrupamiento de genes con fines de mapeo. La region del nucleo donde sucede la sfntesis del RNAr ti ene un aspecto caracterfstico, con un nucleo

Organizaci6n lineal del agrupamiento Repetici6n 1

Repetici6n 3

Repetici6n 2

Espaciador no transcrito

I

Repetici6n 4

Unidad de transcripci6n

I

u

fi\,.0\.~Q

~

~

Sitios de divisi6n por restricci6n

X

t

A

t Bt

C

t

A

tB

Ct

A l B!

C

A

I

Bt Y

Mapa de restricci6n

c

A B

Un agrupamiento de genes en tandem presenta alternancias en las unidades de transcripci6n y los espaciadores no transcritos y genera un mapa de restricci6n circular.

de naturaleza fibrilar rodeado de una corteza granular. El nucleo fibrilar es donde se transcribe el RNAr a partir del molde de DNA, y la corteza granular esta formada por partfculas ribonucleoprotefnicas en las cuales se ensambla el RNAr. El area completa se llama nucleolo, y su morfologfa caracterfstica es obvia en Ia Las regiones cromos6micas particulares asociadas con un nucleolo se Haman organizadores nucleolares, cada uno de los cuales corresponde a un agrupamiento de genes de RNAr repetidos en tandem en un cromosoma. La concentraci6n de dichos genes, aunada a su muy intensa transcripci6n, es la causa de Ia morfologfa caracterfstica de los nucleolos. El par de RNAr mayores es transcrito como el unico precursor, tanto en los nucleos de las bacterias como de las eucariotas . Despues de Ia transcripci6n, el precursor se divide para liberar a las moleculas individuales de RNAr. La unidad de transcripci6n es mas pequeiia en las bacterias y ma s larga en los mamiferos (en cuyo caso se conoce como RNA 45S, segun su velocidad de sedim entaci6n) . Un agrupamiento de DNAr contiene muchas unidades de transcripci6n, cada una separada de la siguiente por un espaciador no transcrito. La alternancia de una unidad de transcripci6n y el espaciador no transcrito es observable directamente en micrografias electr6nicas . El ejemplo de Ia proviene del triton N otopthalmus viridescens, en el que cada unidad de transcripci6n se expresa intensa-

, ..

~ .~·

. -~ ~~'

~;;'~f~{:i~~i ·_:~r~·t '

..

:}.

El centro nucleolar identifica a los DNAr en proceso de transcripci6n, y la corteza granular circundante consta de unidades ribos6micas ensambladas. Esta secci6n delgada muestra el nucleolo de la nutria Notopthalmus viridescens. Imagen cortesia de Oscar Miller.

mente, de manera que varias polimerasas de RNA participan simultaneamente en Ia transcripci6n de una unidad de repetici6n. Las polimerasas estan tan cercanas que los transcritos de RNA forman una matriz caracterfstica que muestra una longitud creciente a lo largo de la unidad de transcripci6n. 6.8 Los genes del RNAr forman repeticiones en tandem

113

La transcripci6n de ag rupamientos de DNAr genera una serie de matrices, cada una de las cuales corresponde a una unidad de transcripci6n separada de la siguiente por el espaciador no transcrito. Imagen cortesia de Oscar Mi ller.

Region repetitiva

-500 bp

Region Region repetitiva 2 repetitiva 3 lslote lslote lslote Bam Bam

-300 bp

-300 bp

Longitud variable repeticiones de 97 bp

Longitud variable repeticiones de 60/81 bp

2 300 - 5 300 bp

Longitud variable repeticiones de 60/81 bp

El espaciador no transcrito del DNAr de X. laevis tiene una estructura que se repite internamente y es la causa de sus variaciones de longitud. Los islotes Bam son secue ncias constantes cortas que separan a las regiones repetitivas.

Ill

Los genes repetidos de RNAr mantienen una secuencia constante

Conceptos principales • Todos los genes de un agrupamiento de DNAr tienen secuencias identicas. • Los espaciadores no transcritos consisten en unidades repetidoras mas cortas cuyo numero varia, de modo que la longitud de cada espaciador es diferentes.

La longitud del espaciador n o transcrito varia mucho entre especies y (en ocasiones) dentro de una misma especie. Las levaduras tienen un espaciador no transcrito corto cuya longitud es relativamente constante. En D. melanogaster se observa una variacion casi del doble entre diferentes copias de la unidad de repeticion. En X. laevis Ia situacion es similar. En cada uno de estos casos, todas las unidades de repeticion estan presentes a manera de un solo agrupamiento en tandem individual en un cromosoma especifico. (En el ejemplo de D. melanogaster, este re114


sulta ser el cromosoma sexual. El agrupamiento del cromosoma Xes mas grande que el del cromosoma Y, asf que las moscas hembra tienen mas copias de los genes de RNAr que las moscas macho. ) En los mamfferos, la unidad de repeticion es mucho mas extensa, y comprende Ia unidad de transcripcion de -13 kb y un espaciador no trans crito de -30 kb. Normalmente, los genes forman numerosos agrupamientos dispersos, en el caso del hombre y del raton, los agrupamientos residen en cinco y seis cromosomas, respectivamente. Una pregunta interesante (pero sin respuesta) es como puede funcionar el mecanismo corrector que, presumiblemente funciona en un solo agrupamiento y garantiza la constancia de la secuencia del RNAr, cuando hay varios agrupamientos. Las diferencias de longitud del espaciador no trans crito de un solo agrupamiento de genes contrasta con Ia conservacion de la secuencia de Ia unidad de transcripcion. A pesar de esta variacion, las secuencias de los espaciadores no transcritos mas extensos siguen siendo iguales a las de los espaciadores no transcritos mas cortos, lo cual implica que cada espaciador no transcrito es intemamente repetitivo, de modo que Ia variacion en longitud resulta de los cambios en el numero de repeticiones de alguna subunidad. Las caracterfsticas generales de los espaciadores no transcritos se ilustran con el ejemplo de X. laevis en la . Las regiones cuya longitud es fija, alternan con las de longitud variable. Cada una de las tres regiones repetitivas comprende un numero variable de repeticiones de una secuencia mas bien corta . Un tipo de region repetitiva tiene repeticiones de una secuencia de 97 bp; el otro, presente en dos ubicaciones, tiene una unidad de repeticion en dos fonnas, de 60 bp y de 81 bp de largo. La variacion en el numero de unidades de repeticion en las regiones repetitivas representa Ia variacion total en Ia longitud de los espaciadores. Las regiones re petitivas estan separadas por secuencias constantes mas cortas, llamadas islotes Bam. (Su nombre se debe a que para el aislamiento se utilizo Ia enzima de restriccion BamHI. ) A partir de este tipo de organizacion, se observa que el agrupamiento ha evolucionado por duplicaciones en que esta implicada la region promotora . Es necesario explicar la falta de variaciones en las copias expresadas de los genes repetidos. Un modelo supondrfa la demanda cuantitativa de determinado n umero de secuencias "buenas", pero esto permitirfa que las secuencias mutadas se acumula ran a tal punto, que su porcion en el agrupamiento serfa lo suficientemente grande como para que fuera ejercida Ia presion selectiva. Es posible excluir

estos modelos por Ia ausencia de cticha variacion en el agrupamiento. La falta de variacion implica una presion seectiva insensible, en cierta forma, a las variaciones i.ndividuales. Un modelo supondrfa que el agruamiento entero es regenerado periodicamente a _artir de uno o de varios . De hecho, en ada generacion, practicamente en cualquier mecanismo necesita estar involucrada Ia regeneracion. I::ste tipo de modelos puede ser excluido porque un 3.grupamiento regenerado no mostrarfa variaciones eo las regiones n o transcritas de las repeticiones inJividuales. Lo cual plantea un dilema. La variacion en las !'egiones no transcritas sugiere frecuentes entrecruzamientos desiguales, con lo cual cambiara el tama:1o del agrupamiento, pero no las propiedades de las . epeticiones individuales. c.Entonces como se evita _a acumulaci6n de mutaciones? En Ia proxima sec·on se vera que Ia contraccion y Ia expansion con:inuas de un agrupamiento suelen proporcionar un :necanismo para Ja homogenizaci6n de sus copias.

La fijaci6n entrecruzada podria mantener repeticiones identicas Conceptos principales • Un entrecruzamiento desigual cambia el tamaiio de un agrupamiento de repeticiones en tandem . • Las unidades de repetici6n pueden eliminarse o repartirse entre los agrupamientos.

:=1 mismo problema se encuentra siempre que un 5en ha sido duplicado. (.Como imponer Ja selecci6n ?ara evitar Ia acumulacion de mutaciones delete:eas? La duplicacion de un gen probablemente resulte ::-n una relajacion inmediata de Ia presion evolutiva ~ bre su secuencia. Ahara que hay dos capias iden-cas, un cambio en Ia secuencia de una no privara -=-~ organismo de una proteina funcional, porque Ia ~~cuencia original de los aminoacidos sigue siendo ~odificada porIa otra copia. Despues, Ia presion se~n iva se difunde en ambos genes, hasta que uno :e ellos muta lo suficientemente lejos de su funci6n _:gina! como para enfocar toda la presion selectiva -:~ el otro. Inmediatamente despues de Ia duplicacion de - - gen, los cambios pueden acumularse mas rapida--ente en una de las copias, llevando eventualmente : ·_ma nueva funci6n (o a Ja obsolescencia en forma -~ seudogen). Si se desarrolla una nueva fun cion, ~.:onces el gen evoluciona a Ia misma velocidad,

mas lenta, caracterfstica de la funcion original. Probablemente este sea el tipo de mecanismo causante de Ia separaci6n de las funciones entre los genes de globina embrionarios y los adultos. Aun asi, hay instancias en que los genes duplicados conservan la misma funcion, coctificando protefnas identicas o casi identicas. Las protefnas identicas son coclificadas por dos genes de globina a humanos y solo clifiere un aminoacido entre las dos protefnas de glob ina y. c. Como se ejerce la presion selectiva para mantener Ia identidad de Ia secuencia? La posibilidad mas obvia es que, de hecho, dos genes no tienen funciones identicas, sino que difieren en algunas propiedades (no detectadas), como el tiempo o ellugar de expresion. Otra posibilidad es que Ja necesidad de dos copias sea cuantitativa, dado que ninguna produce, de por sf, suficiente cantidad de protefna . De cualquier forma, en casos mas extremos de repeticion es imposible evitar Ia conclusion de que ninguna de las copias del gen es esencial. Cuando hay varias, los efectos inmediatos de la mutaci6n en cualquiera de elias deben ser m uy !eves. Las consecuencias de una mutacion individual se diluyen por el gran numero de copias del gen que conservan Ia secuencia de tipo silvestre, pueden acumularse m uchas copias mutantes antes de que se genere un efecto leta!. La letalidad se torna cuantitativa, conclusion que se refuerza por Ia observacion de que Ia mitad de las unidades del agrupamiento de DNAr de X laevis o de D. melanogaster pueden ser borradas sin efectos adversos. c. Como se impide, entonces, que estas unida des acumulen gradualmente m u tacio nes deletereas? c. Que posibilidades h ay de qu e Ia rara mutacion favorab le muestre sus ventajas en el agrupamiento? El principia basico de los modelos para explicar Ia conservacion de Ia identidad entre copias repetidas es suponer que los genes no alelicos nose heredan de manera independiente, sino que deben ser regenerados continuamente de una de las capias de una generacion precedente. En el caso mas sencillo de dos genes identicos, cuando en una copia ocurre una mutacion, o es eliminada de forma aleatoria (porque Ia secuencia de Ia otra copia toma el control), o se extiende a ambos duplicados (porque Ia copia mutante se convierte en Ia version dominante ). La dispersion expone a Ia mutacion a Ia seleccion. El resultado es que los dos genes evolucionan juntos, como si existiera un solo locus, fenomeno conocido como evoluci6n coincidental o evoluci6n concertada (ocasionalmente, coevoluci6n), que puede aplicarse a un par de genes identicos (con suposiciones posteriores) o a un agrupamiento que contenga n um erosos genes.

6.10 La fijaci6n entrecruzada podria mantener repeticiones identicas

115

Un mecanismo supone que las secuencias de los genes no alelicos se comparan directamente y son homogeneizadas por las enzimas que detectan cualquier diferencia . Esto se logra por el intercam bio de cadenas individuales para formar genes, una de cuyas cadenas deriva de una copia y la otra, de la otra copia. Cualesquiera diferencias se revelan como bases apareadas impropiamente, lo cual atrae la atencion de las enzimas susceptibles de escindir y remplazar una base, de modo que solo los pares A-T y G-C sobreviven. A este tipo de evento se le llama conversion genica y se relaciona con la recombinacion genetica. Deberfa ser posible comprobar el alcance de tales eventos al comparar las secuencias de genes duplicados, pero si estan sujetos a la evolucion concertada, no deberia verse la acumulacion de sustituciones de sitios silenciosos (porque el proceso de homogeneizacion se aplica tanto para estos como para los sitios de remplazo). Se sabe que la extension del mecanismo de mantenimiento no debe rebasar al gen mismo, puesto que hay casas de genes duplicados cuyas secuencias flanquean tes son enteramente distintas. De hecho, podrfan verse limites abruptos que marcan los extremos de las secuencias homogeneizadas. Cabe recordar que la existencia de dichos mecanismos puede invalidar Ia determinacion de Ia historia de genes de ese tipo a traves de su divergencia, puesto que fa divergencia refleja solo el tiempo transcurrido desde el ultimo evento de homogeneizaci6nl regeneraci6n, no la duplicaci6n original. El modelo de fijacion cruzada supone que un agrupamiento entero esta sujeto a reestructuracion continua por el mecanismo de entrecruzamiento desigual. Dichos eventos suelen explicar la evolucion concertada de multiples genes si el entrecruzamiento desigual provoca que todas las capias sean regeneradas ffs icamente a partir de una copia. Siguiendo el tipo de evento ilustrado en la Figura 6.13, por ejemplo, el cromosoma que porta un locus triple podrfa sufrir la delecion de uno de los genes. De los dos restantes, 1 V2 representa la secuencia de una de las capias originates; solo la mitad de la secuencia de la otra copia original ha sobrevivido. Cualquier mutacion de Ia primera re gion ahara existe en ambos genes y esta sujeta a la presion selectiva. El agrupamiento en tandem proporciona oportunidades frecuentes de "apareamiento erroneo" de genes cuyas secuencias son las mismas, pero que ocupan diferentes posiciones en sus agrupamientos. Mediante la expansion y contraccion constantes del numero de unidades por entrecruzamiento desigual, es posible que todas las unidades de un agrupamiento sean derivadas de una proporcion bastame pequefia de las de un agrupamiento ancestral. 116


Las variaciones en la longitud de los espaciadores coinciden con la idea de que los eventos de entrecruzamiento desigual suceden en los espaciadores apareados internamente de manera erronea, lo cual explicaria la homogeneidad de los genes comparada con la variabilidad de los espaciadores. Los genes son expuestos a la seleccion cuando unidades de repeticion especfficas son amplificadas en el agru pamiento, pero los espaciadores son irrelevantes y pueden acumular cambios. En una region de DNA no repetitivo, Ia recombinacion ocurre entre puntos coincidentes precisos de dos cromosomas homologos, generando asf recombinantes recfprocos. La base de esta precision es la capacidad que tienen dos secuencias de DNA duplex para alinearse exactamente. Se sabe que la recombinacion desigual puede ocurrir cuando hay multiples capias de un gen cuyos exones estan relacionados, incluso si sus secuencias flanqueadoras e interventoras difieren, y esto por el apareamiento erroneo entre exones correspondientes en genes no a!elicos. Imagfnese que tan frecuente debe ser Ia desalineacion de un agrupamiento en tandem de repeticiones identicas o casi identicas. iExcepto en los me ros extremos del agrupamiento, la cercana relacion entre repeticiones sucesivas imposibilita incluso la definicion de las repeticiones exactamente correspondientes! Esto tiene dos consecuencias: ajuste continuo del tamaiio del agrupamiento y homogeneizacion de la unidad de repeticion. Consicterese una secuencia formada por la unidad de repetici6n "ab" con extremos "x" y "y". Si se representa un cromosoma de color negro y el otro de distinto color, el alineamiento exacto entre las secuencias alelicas serfa: xababababababababababababababababy xababababababababababababababababy Sin embargo, es probable que cua!quier secuencia ab del cromosoma se aparee con cualquier secuen cia ab del otro cromosoma, en una desalineaci6n del tipo de: xabababababababababababa ba babababy

xababababababababababababababababy la region de apareamiento no es menos estable que en el par alineado, a pesar de ser mas corta. No se sabe mucho acerca de como se inicia el apareamiento antes de la recombinaci6n, pero es muy probable que empiece entre regiones cortas correspondientes y luego se difunda . Si empieza en el DNA satelite, es mas probable que no imp lique unidades de repeticion que no tengan ubicaciones exactamente correspondientes en sus agrupamientos. Ahora supongase que un evento de recombinacion tiene Iugar en la region apareada desigualmente.

los recombinantes tendran un numero diferente de unidades de repeticion. En un caso, el agrupamiento sera mas largo yen el otro, se habra acortado,

X?babababababababababababababababy X

xababababababababababababababababy

1 xababababababababababababababababababy +

xabababababababababa bababababy donde "x" indica el sitio del entrecruzamiento. Si este tipo de even to es comun, los agrupamientos de repeticiones en tandem estaran sometidos a expansion y contraccion continuas, lo cual puede Uevar a que una unidad de repeticion en particu lar se disperse en el agrupamiento, segun se ilustra en Ia . Supongase que el agrupamiento consiste inicialmente en una secuencia abcde, en la

cual cada letra representa una unidad de repeticion. La relacion entre las diferentes unidades de repeticion es lo suficientemente estrecha como para que se apareen erroneamente por recombinacion, de modo que por una serie de eventos recombinantes desiguales, el tamano de Ia region repetitiva aumenta o disminuye, y una unidad se extiende para remplazar a todas las otras. El modelo de fijacion cruzada pronostica que cualquier secuencia de DNA no sometida a presion selectiva, seguramente sera sometida par una serie de repeticiones en tandem identicas generadas de esta manera. La suposicion critica es que el proceso de fijacion cruzada es bastante rapido respecto de Ia mutacion, de manera que las mutaciones nuevas son eliminadas (se pierden sus repeticiones) o llegan a tomar el control de todo el agrupamiento. Obviamente, en el caso del agrupamiento del DNAr, Ia seleccion impone un factor posterior para una secuencia transcrita efectiva.

Los DNA satelite a men udo se encuentran en la heterocromatina Conceptos principales • La secuencia de repetici6n del DNA altamente repetitive es muy corta y no tiene funci6n codificadora. • Se presenta en grandes bloques que pueden tener propiedades ftsicas diferentes. • Suele ser el constituyente principal de la heterocromati na centromerica.

7

9

11

abbbbbcdcde1 abbbbbcdcde

10

10

7

bbbbbbb " La recombinaci6n desigual permite que una uni-- de repetici6n especifica ocupe el agrupamiento entero. _:; nCtmeros indican la longitud de la unidad de repetici6n en :=ja etapa.

El DNA repetitivo se define por su (relativamente) rapido fndice de renaturalizacion. El componente que se renaturaliza mas rapidamente en el genoma eucariotico se llama DNA altamente repetitive y consiste en secuencias muy cortas repetidas en tandem, varias veces, en agrupamientos grandes. Como su unidad de repeticion es corta, suele describirse como DNA de secuencia simple. Este tipo de componente se encuentra en casi todos los genomas eucarioticos superiores, pero, en general, la cantidad es muy variable. En los genomas de los mamfferos es tfpicamente < l 0%, pero en Drosophila virilis, por ejemplo, llega a -50%. Ademas de los agrupamientos extensos en que este tipo de secuencia se descubrio originalmente, hay otros mas pequenos intercalados con DNA no repetitivo, que suele constar de secuencias cortas repetidas en copias identicas o relacionadas en el genoma. La repeticion en tandem de una secuencia corta crea una fracci6n con propiedades ffsicas distintivas que permiten aislarla. En algunos casos, Ia composicion basica de Ia secuencia repetitiva es distinta de

6.U Los DNA sate lite a me nuda se encuentran en la heterocromatina

117

Banda principal

Sate lite

cu

(.)

E. ·O cu

'()

c

cu

.0

0 (f)

.0

Densiqad boyante J Par centrifugaci 6n, el DNA de raton se separa en una banda principal y un satelite a traves de un gradiente de densidad de CsCl.

la del genoma promedio, lo cual le permite formar una fraccion independiente en virtud de su densidad boyante diferente. Una fraccion de este tipo se llama DNA satelite, termino que, en esencia, es sinonimo de DNA de secuencia simple. Coincidiendo con su secuencia simple, este DNA ni se transcribe ni se traduce. Las secuencias repetidas en tandem estan especialmente obligadas a experimentar alineamientos erroneos durante el apareamiento cromosomico, de modo que sus dimensiones tienden a ser polimorficas, con amplias variaciones entre individuos. De hecho, los agrupamientos mas pequeiios de tales secuencias pueden usarse para caracterizar genomas individuales mediante la tecnica de huella digital del DNA (vease Ia seccion 6.14, Los minisatelites facilitan el mapeo genetico}. La densidad boyante de un DNA duplex depende de su contenido G-C segun la formula empirica p= 1.660 + 0.00098 (%G-C) g-cm-3 Normalmente, la densidad boyante se determina centrifugando el DNA a traves de un gradiente de densidad de CsCI. EL DNA forma una banda en la posicion correspondiente a su propia densidad. Las fracciones de DNA que difieren en contenido G-C por >5%, usualmente pueden ser separadas en un gradiente de densidad. Cuando un DNA eucariotico es centrifugado en gradiente de densidad, pueden distinguirse dos tipos de materiales: • La mayor parte del genoma forma un continuo de fragmentos observables como un pico mas bien ancho centra do en la densidad boyante que corresponde al promedio de contenido de G-C del genoma. A esto se le denomina banda principal. 118


• En ocasiones, un pico adicional, mas pequeiio (o varios picos}, se observa en un valor diferente. Este material es el DNA satelite. En muchos genomas eucarioticos hay satelites, los cuales pueden ser mas pesados 0 m as ligeros que la banda principal, pero casi nunca representan >5% del DNA totaL Un ejemplo claro es el DNA de raton que se ilustra en la . La grafica es una exploracion cuantitativa de las bandas que se forman cuando dicho DNA es centrifugado a traves de un gradiente de densidad de CsCI. La banda principal contiene 92% del genoma y esta centrada en una densidad boyante de 1.701 g-cm- 3 (que corresponde a su promedio de G-C de 42 %, tfpico de los mamfferos}. El pico m as pequefio representa el 8 % del genoma y tiene una densidad boyante distinta de 1.690 g-cm-3 ; en el se encuemra el DNA satelite del raton, cuyo contenido de G-C (30%} es mucho mas bajo que en cualquiera otra parte del genoma. El comportamiento del DNA satelite en gradientes de densidad suele ser anomalo. Cuando se determina la composicion de bases real de un satelite, difiere del pronostico basado en su densidad boyante porque p es una funcion no solo de la composici6n de bases, sino de Ia constitucion en cuanto a pares de vecinos mas cercanos. Para las secuencias simples, tienden a desviarse de las relaciones de apareamiento aleatorio necesarias para que se cumpla Ia ecuacion de densidad boyante. Ademas, el DNA satelite puede estar metilado, lo cual cambia su densidad. A menudo, Ia mayor parte del DNA altamente repetitivo de un genoma puede ser aislado en forma de satelites. Cuando un componente de estas caracteristicas no se separa de esa manera, en aislamiento, sus propiedades a menudo demuestran su similitud con las del DNA satelite, es decir, el DNA altamente repetitivo esta formado por multiples repeticiones en tandem con centrifugacion anomala. Al material aislado de esta forma su ele llamarsele satelite criptico. Juntos, los satelites crfpticos y los aparentes representan, en generaL a todos los grandes bloques repetidos en tandem del DNA altamente repetitivo. Cuando un genoma tiene mas de un tipo de DNA altamente repetitivo, cada uno esta en su propio bloque satelite (aunque, en ocasiones, bloques diferentes ocupan posiciones adyacentes} . .:,En que parte del genoma se localizan los bloques de DNA altamente repetitivo? Una extension de las tecnicas de hibridacion de acido nucleico permite determinar directamen te la localizaci6n de secuencias satelite en el complemento del cromosoma. En las tecnicas de hibridacion in situ, el DNA cromosomico se desnaturaliza tratando celulas aplastadas en un cubreobjetos. A continuacion, se

1- ·

Ji}.m1!1m .

Longitud total

ACAAACT TGTTTGA

1.1

X

107

25%

II

ATAAACT TATTTGA

3.6

X

106

8%

Ill

ACAAATT TGTTTAA

3.6

X

106

8%

Crfptico

AATATAG TTATATC

Satelite

*

..

.

Secuencia predominante

Proporci6n del genoma

Los DNA satelites de D. virilis estan relacionados. Mas del 95% de cada satelite consiste en una repeticion en tandem de la secuencia predominante.

La hibridacion citologica muestra que el DNA satelite del raton esta localizado en los centromeros. Imagen :artesia de Mary Lou Pardue and Joseph G. Gall, Carnegie Insjtution.

aplica una soluci6n que contenga DNA o RNA marcado radioactivamente. La sonda se hibrida con sus -o mplementos en el genoma desnaturalizado. La _ocalizaci6n de los sitios de hibridaci6n puede deter:ninarse por autorradiograffa (vease la Fig. 28.19). Los DNA satelite se encuentran en regiones de heterocromatina, terrnino, este ultimo, utilizado _ara describir a las regiones de los cromosomas per::nanentemente enrolladas con firmeza y que son :nertes, a diferencia de la eucromatina, que repre<emta la mayor parte del genoma (vease la secci6n 1S.7, La cromatina se divide en eucromatina y he:erocromatina). La heterocromatina se encuentra -om{mmente en los centr6meros (regiones en que 'e forman los cinetocoros durante la mitosis y la :neiosis para controlar el desplazamiento del cro:-:wsoma). La locaci6n cemromerica del DNA sate:ite sugiere que tiene alguna funci6n estructural :-n el cromosoma, la cual podrfa estar relacionada ..:on el proceso de segregaci6n del mismo. En la se muestra un ejemplo de lo:alizaci6n del DNA satelite para el complemento ..:romos6mico del raton. En este caso, un extrema ie cada cromosoma esta etiquetado porque es donde s centr6meros se localizan en los cromosomas Mus ·:usculus.

Los satelites de los artr6podos tienen repeticiones identicas muy cortas Concepto principal • La longitud de las unidades de repeticion de los DNA satelite de los artropodos es de solo unos cuantos nucleotidos. La mayoria de las capias de la secuencia son identicas.

En los artr6podos, tipificados por insectos y cangrejos, cada DNA satelite parece bastante homogeneo. Normalmente, una unidad de repetici6n individual muy corta representa a >9 0 % de los satelites, lo cual hace relativamente sencilla la determinacion de la secuencia. Drosophila virilis tiene tres satelites principales y un satelite criptico, que juntos representan >40% del genoma. Las secuencias de los satelites se resumen en la . Las secuencias de los tres satelites principales estan intimamente relacionadas. La sustituci6n de una sola base es suficiente para generar el satelite II o el ill de la secuencia del satelite I. La secuencia de este ultimo se encuentra en otras especies de Drosophila relacionadas con virilis, de modo que pueden haber precedido a la evoluci6n de las especies. Las secuencias de los satelites II y III parecen espedficas de D. virilis, asf que pueden haber evolucionado del satelite I despues de la evoluci6n de las especies. La caracterfstica principal de estos satelites es su unidad de repetici6n tan corta, de s6lo 7 bp. En otras especies se encuen tran sa telites similares. D. melanogaster tiene varios satelites, muchos de los cuales tienen unidades de repetici6n muy cortas (de 5, 7, 10 o 12 bp). En los cangrejos se encuentran satelites comparables . La estrecha relaci6n entre las secuencias de los satelites de D. virilis no es necesariamente una caracterfstica de otros genomas, en los cuales, las secuencias de los satelites podrfan no estar relacionadas. Cada satelite surge de una ampliaci6n lateral de una secuencia muy corta, la cual podrfa representar una variante de un satelite ya existente (como en D. virilis), o tener otro origen. Los satelites se generar y eliminan continuamente del genoma, lo cual dificulta establecer las relaciones evolutivas, ya que un satelite actual puede haber evolucionado de uno anterior, ya perdido. La caracterfstica importante de estos satelites es que representan fragmentos muy largos de DNA con secuen-

6.12. Los satelites de los artropodos tienen repeticiones identicas muy cortas

119

cias poco complejas, dentro de los cuales se puede mantener una secuencia constante. Una de las caracterfsticas de muchos de estos satelites es una pronunciada asimetrfa en Ia orientacion de los pares de bases de las dos cadenas. En el ejemplo de los satelites de D. virilis que se muestra en la Figura 6.22, una de las cadenas es mucho mas rica en basesT y G en cada uno de los satelites mayores, con lo cual aumenta su densidad boyante, de manera que en la desnaturalizacion, esta cadena pesada (H, heavy) puede ser separada de la cadena ligera (L, light) complementaria, procedimiento que facilita la determinacion de la secuencia del satelite.

1111

Los satelites de los mamlferos constan de repeticiones jerarquicas

Concepto principal • El DNA satelite del raton ha evolucionado por duplicaci6n y mutaci6n de una unidad de repetici6n corta para dar origen a una unidad de repetici6n basica de 234 bp en la que pueden ser reconocidas la mitad, la cuarta parte y la octava parte de la repetici6n original.

En los mamiferos, tipificados por varios roedores, las secuencias que componen cada satelite muestran divergencias apreciables en las repeticiones en tandem. Las secuencias cortas comunes se reconocen por su preponderancia entre los fragmentos de oligonucleotidos liberados por tratamiento qufmico o enzimatico, si bien la predominante suele constituir una escasa minoria de las capias. Las secuencias conas restantes se relacionan con la secuencia predominante por una variedad de sustituciones, deleciones e inserciones. Sin embargo, una serie de las variantes de la unidad corta puede constituir una unidad de repeticion mas larga, que a su vez se repite en tandem con ciertas variaciones, de modo que los DNA satelite de los mamfferos se construyen a partir de una jerarqufa de unidades de repeticion. Estas unidades de repeticion mas largas constituyen las secuencias que se renaturalizan en el analisis de reasociacion, las cuales tambien pueden ser reconocidas mediante digestion con enzimas de restriccion. Cuando un DNA satelite es digerido con una enzima que tiene un sitio de reconocimiento en su unidad de repeticion, se obtendra un fragmento para cada unidad de repeticion en la que se presente el sitio. De h echo, cuando el DNA de un genoma eucariotico es digerido con una enzima de restriccion, la mayor parte de el produce una mancha generalizada debido a la distribucion aleatoria de 120


los sitios de division . No obstante, el DNA satelite genera bandas agudas porque un gran numero de fragmentos del mismo tamafi.o, o casi, son creados por division en los sitios de restriccion separados por una distancia regular. La determinacion de la secuenda del DNA satelite puede ser dificil. Usando las bandas discretas generadas por la division por restriccion, se puede intentar directamente la obtencion de una secuencia, pero si hay una divergencia apreciable entre las unidades de repeticion, en la misma posicion, pero en repeticiones distintas, se presentaran diferentes nucleotidos, de manera que los geles de secuenciacion seran oscuros. Si la divergencia no es considerable, digamos en el rango del -2 %, sera posible determinar una secuencia de repeticion promedio. Se pueden insertar segmentos individuales del satelite en plasmidos, para su clonaci6n, aunque un problema es que, en el hospedador bacteriano, las secuencias satelite tienden a ser escindidas del plasmido quimerico por recombinacion. No obstante, cuando la clonacion es exitosa, permite determinar sin ambigiiedades la secuencia del segmento d onado. A pesar de que asi se obtiene la secuencia de la unidad de repeticion, ode las unidades, se necesitan varias de estas secuencias individuales para reconstruir como un todo el tipo de divergencia tfpico de los satelites. Mediante cualquier metoda de secuenciacion, la informacion que se puede obtener depende de la distancia analizable en un conjunto de geles de secuencia. La repeticion de capias en tandem divergentes hace i.mposi.ble la reconstrucci.on de secuencias mas largas mediante superposiciones de fragmentos de restriccion individuales. El DNA satelite del raton M. musculus es dividido por la enzi.ma EcoRII en una serie de bandas, in cluido un fragmento monomerico predominante de 234 bp. Esta secuencia debe repetirse con pocas va riantes en el 60% a 70% del satelite, que es dividido en la banda monomerica. Esta secuencia se puede analizar en funcion de las unidades de repeticion constituyentes, cada vez mas pequefi.as. En la U se ilustra la secuencia en cuanto a dos medias repeticiones. AI escribir la secuencia de 234 bp de manera que los primeros 11 7 bp se alineen con los segundos, se observa que ambas mitades estan bastante bien relacionadas, aunque difieren en 22 posiciones, lo cual corresponde a una divergencia del 19%, es decir, que la unidad de repeti.cion actual de 234 bp debe haberse generado en algun momenta del pasado por duplicacion de una unidad de repeticion de 117 bp, y despues se acumularon diferencias entre los duplicados. En la unidad de 117 bp se identi.fican dos subunidades mas, cada una de las cuales corresponde a

10 20 30 40 50 60 70 G 80 90 100 11 0 ~ ~TGGAATATGGCGAGAAAACTGAAAATCACGGAAAATGAGAAATACACACTTTAGGACGTGAAATATGGCGAGAAAACTGAAAAAGGTGGAAAATT~GAAATGTCCACTGTA 3GACGTGGAATATGGCAAGAAAACTGAAAATCATGGAAAATGAGAAACATCCACTTGACGACTTGAAAAATGACGAAATCACTAAAAAAOSTGAAAAATGAGAAATGCACACTGAA

-zD

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

A 6.2 ~ La unidad de repetici6n del DNA sate lite del raton contiene dos mitades de repetici6n, alienadas para mostrar las identi-:..: : ~ s (en color azul).

10

20

30

40

50

GGACCTGGAATATGGCGAGAA AACTGAAAATCACGGAAAATGAGAAATACACACTTTA 60

70

80

1~

1~

90

100

11 0

G T GGACGTGAAATATGGCGAGAAAACTGAAAAAGGTGGAAAATTAGAAATGTCCACTGTA 1~

1~

1~

1ro

GGACGTGGAATATGGCAAGAAAACTG.AAAATCATGGAAAATGAGAAACATCCACTTGA 180

190

200

210

220

230

CGACTTGAAAAATGACGAAATCACTAAAAAACGTGAAAAATGAGAAATGCACACTGAA " L 25 El alineamiento de los cuartos de repetici6n identifica homolog\as entre la primera y la segunda mitad de cada mitad de repetici6n. Las posiciones que son las mismas en todos los cuartos de repetici6n se muestran en color gris; las identidades que abarcan s6lo tres de los cuartos de repetici6n se indican con letras negras en el area verde.

_-:-_ cuarto de repeticion, respecto del satelite ente- _ Los cuatro cuartos de repeticion aparecen ali-:-ados en la Gl P . ~ . Las dos llneas superiores ~ :_-~resentan a Ia primera mitad de repeticion de Ia :--::ura 6.24, las dos inferiores, a la segunda mitad __ :-epeticion; es obvio que la divergencia entre los _. :mo cuartos de repeticion ha aumentado a 23 de '" posiciones, o 40 por ciento. En cierta forma, los · :..::neros tres cuartos de repeticion estiin mejor re.:. .=onados, y gran parte de Ia divergencia se debe a '~lbios en el ultimo cuarto de repeticion. Observando cada cuarto de repeticion, se ve . ~e cada uno consta de dos subunidades relaciona...;: (un octavo de repeticion), marcadas como se- :.ncias a y ~en la FIGU A 6 26 . Todas las secuencias ::enen una insercion de C, en tanto que las ~in - ~· en la insercion de un trinucleotido, respecto de ..:...:Ja secuencia de consenso comun. Esto sugiere que ~ :uarto de repeticion se origino por duplicacion _~ una secuencia como la secuencia de consenso, ~p u es de lo cual ocurrieron cambios para gene-~ los componentes que ahora observamos como :- ~ · Entre las secuencias a~ repetidas en tandem _·i eron Iugar cambios posteriores para generar los _ .onos y las mitades de la repeticion original que • ~ Een hoy. Entre los octavos de repeticion, la dic::-gencia actual es de 19/31 = 61%. La secuencia de consenso se analiza clirectamen. ?7 , en la cual se demuestra que la - ':n la FI U c :-_iencia satelite actual puede ser considerada como

un derivado de una secuencia de 9 bp. En el satelite se identifican tres variantes de esta secuencia, segun se inclica en la parte inferior de la figura. Si en una de las repeticiones se toma la siguiente base mas frecuente en dos posiciones, y no la mas frecuente, se obtienen tres secuencias de 9 bp bien relacionadas:

GAAAAACGT GAAAAATGA GAAAAAACT El origen del satelite muy bien podria estar en una amplificacion de uno de estos tres nonameros . La secuencia de consenso general del satelite actual es GAAAAA¢2T. que efectivamente es una amalgama de las tres repeticiones de 9 bp. La secuencia promedio del fragmento monomerico del DNA satelite del raton explica sus propiedades. La unidad de repeticion mas larga, de 234 bp, se identifica mediante division por restriccion. La unidad de reasociacion entre las cadenas individuales del DNA satelite desnaturalizado es probablemente la mitad de la unidad de repeticion de 117 bp porque los fragmentos de 234 bp pueden asociarse ambos en un registro y en medio registro (en el ultimo caso, la prim era mitad de repeticion de una cadena se renaturaliza con la segunda mitad de repeticion de Ia otra). Basta aqui se ha tratado al satelite presente como formado por capias identicas de la unidad de repeticion de 234 bp, y si bien esta unidad represen-

6,13 Los satelites de los mam\feros constan de repeticiones jerarquicas

121

GGACCTGGAATATGGCGAGAA ~

AATCACGGAAAATGA

o:2

G G A C G T G A A A T A T G G C GA G AGA

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A A A G G T G G A A A A T TTA

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A A T C A T G GA A A A T G A

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A A ACGT G AA A AA T GA

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GA AA T GT CCA C TGT A AACTGAA

GA AA C A T C C A C T T GA CACTAAA

GA AA T GC ACA C TGAA

GAAAT CAC ........................................................... . (,Ancestral? A A A C G T G A A A A A T G A

GA AA T GC AC AC TGAA

El alineamiento de los octavos de repeticion muestra que cada cuarto de repeticion consiste en una mitad a y una ~· La secuencia consenso proporciona la base mas comun en cada posicion. La secuencia "ancestral" muestra una secuencia muy estrechamente relacionada con La secuencia consenso, que pudo haber sido el predecesor de las unidades a y ~· (La secuencia satelite es continua, de manera que con elfin de deducir la secuencia consenso, se puede tratar como permutacion circular, segun indica la union del ultimo triplete GAA con los primeros 6 bp.)

ta Ia mayor parte del sat<§lite, tambien hay variantes de este, algunas de las cuales estan distribuidas aleatoriamente en el satelite y otras estan agrupadas. La existencia de variantes se deriva de que el material inicial para el analisis de secuencia haya sido descrito como fragmento "monomerico". Cuando el satelite es digerido por una enzirna que tiene un sitio de division en Ia secuencia de 234 bp, tambien genera dfmeros, trfmeros y tetrameros relativos al fragmento de 234 bp, los cuales surgen cuando una unidad de repeticion ha perdido el sitio de division de Ia enzima como resultado de una mutacion. La unidad monomerica de 234 bp es generada cuando dos repeticiones adyacentes tienen cada una un sitio de reconocimiento. El dfmero se crea cuando una unidad ha perdido al sitio, un trfmero cuando dos unidades adyacentes han perdido dicho sitio, y asf sucesivamente. Con algunas enzimas de restriccion, Ia mayor parte del satelite se divide en un miembro de sus series de repeticion, como se muestra en el ejemplo de la . La declinacion del numero de dfmeros, trfmeros, etc., muestra que hay una distribucion aleatoria de las repeticiones en Ia cual el sitio de reconocimiento de Ia enzima ha sido eliminado por mutacion. En otras enzimas de restriccion se observa un tipo diferente de comportamiento con el DNA satelite, pues siguen generando las mismas series de bandas. De cualquier forma, dividen solo una pequeii.a proporcion del DNA, digamos de 5% a 10%, lo cual implica que determinada region del satelite contiene una concentracion de unidades de repeti122


cion con este sitio de restriccion particular. Presumiblemente, todas las series de repeticiones de este dominio se derivan de una variante ancestral que poseyo a este sitio de reconocimiento (si bien en el modo comun, algunos lo han perdido des de entonces, por mutacion). Un DNA satelite experimenta una recombinacion desigual que tiene otras consecuencias cuando en la unidad de repeticion hay una repeticion interna . Volviendo al agrupamiento formado por repeticiones "ab", y suponiendo que los componentes "a" y "b" de la unidad de repeticion tienen una relacion suficientemente estrecha como para aparearse, los dos agrupamientos podran alinearse en medio registro, con Ia secuencia "a" de un grupo alineada con Ia secuencia "b" del otro. La frecuencia con que esto ocurra, dependera de la cercanfa de Ia relacion entre ambas mitades de la unidad de repeticion. In vitro, en el DNA satelite del raton, la reasociacion entre las cadenas de DNA satelite desnaturalizado suele tener Iugar en el media registro. Cuando un evento de recombinacion sucede fuera de registro, cambia Ia longitud de las unidades de repeticion involucradas en la reaccion:

xababababababababababababababababy X

xababababababababafiabababababababy

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xabababababababab babababababababy

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.. L ,: La digestion del DNA satelite del raton con la enzima de restriccion EcoRII identifica una serie de unidades de repeticion (1, 2 y 3) que son multimeros de 234 bp y tam bien una serie menor (112, 1112 y 2V2) que incluye mitades de repeticiones (vease el texto de esta pagina). La banda del extrema izquierdo es una fraccion resistente a la digestion.

c

G20A16A21 ~OA12A17 Ts G11 As Ty Cs

As Cg

T1s

Cy * indica un triplete insertado en Ia secuencia ~ C en Ia posicion 10 es una base extra en Ia secuencia

a

GL 6 La existencia de una secuencia de consenso ge-eral se muestra al escribir la secuencia satelite segun una ·epeticion de 9 bp.

En el agrupamiento recombinante superior, .ma unidad "ab" ha sido remplazada por una unidad aab", en tanto que en el inferior, la unidad "ab" ha j do remplazada por una unidad "b". Este tipo de evento explica una caracterfstica J el extracto, digerido por enzimas de restriccion, Jel DNA satelite del raton. En la Figura 6.28 se ob~e rv a una serie desvanecida de bandas en los frag:-:1entos de 1/z, P/z, 2!f2 y 3lh unidades de repeticion, ~demas de las repeticiones de fragmentos integrales ::::~ as fuertes. Supongase que en el ejemplo prece.::ente, "ab" representa ala repeticion de 234 bp del ::)NA satelite del raton, generada por division en ..:n sitio del segmento "b". Los segmentos "a" y "b" ~o rresponden a las mitades de ll 7 bp de medias :::-peticiones. As! pues, en el agrupamiento recombinante su;:;e rior, la unidad "aab" genera un fragmento de llh · eces la longitud usual de la unidad de repeticion,

en tanto que, en el inferior, la unidad "b" genera un fragmento de la mitad de la longitud usual. (Los multiples fragmentos de la serie de la mitad de la repeticion se generan del mismo modo que los mas largos de la serie integral, en cuyo caso, algunas unidades de repeticion han perdido el sitio de restriccion por mutacion.) Invirtiendo el argumento, la identificacion de la serie de la mitad de la repeticion en el gel muestra que la unidad de repeticion de 234 bp esta formada por dos mitades de repeticion relacionadas lo suficientemente bien como para aparearse, en ocasiones por recombinacion. En la Figura 6.28 tambien pueden identificarse otras bandas bastante desvanecidas que corresponden a espaciamientos de \~ y % de longitud, los cuales seran generados del mismo modo que los espaciamientos de la mitad de la longitud, en los cuales la recombinacion ocurre entre agrupamientos alineados en un cuarto de registro. La relacion decreciente entre los cuartos de repeticiones, comparada con las mitades de repeticiones, explica la reduccion en la frecuencia de las bandas de 14 y de %, respecto de las bandas de lh.

Ill

Los minisatelites facilitan el mapeo genetico

Concepto principal

• La variacion entre los microsatelites o minisatelites de los genomas permite identificar la herencia inequivocamente, pues demuestra que el 50% de las bandas de un individuo derivan de un progenitor especifico.

6.14 Los minisatelites facilitan el mapeo genetico

123

..

.

1-

.. . '

·m,:+-')[o

Progenitores

.

GGGCAGGAXG CCCGTCC TXC

Division

repeticion de 64 bp y se distribuye en Ia poblacion de la manera siguiente:

No. de repeticion

7% 11 % 43 % 36% 4%

Division ... Progenitor 1

y

6

.

9

..................

... ... ..... .. ... ..... .

.. . . ..... ..... ...

Progenitor 2• • • • • • • • • • • •, 5 7

Progenie

............. ... . . . .. ... 6 ••......• . .. 9 7

'f'

~····~00;

'f'

....

··t-

9 8 7

.. .. - t- 6t5 1 .. ..

•

00

i

Los alelos pueden diferir en cuanto al numero de repeticiones en ellocus de un minisatelite, de modo que la division de cada lado genera fragmentos de restriccion que difieren en longitud. Se puede seguir el patron de herencia utilizando un minisatelite con alelos que difieren entre los progenitores.

Las secuencias que parecen satelites por su constitucion de repeticiones en tandem de una unidad corta, pero que en general son mucho mas cortas, por ejemplo, de 5 a 50 repeticiones, son comunes en los gen omas de los mamfferos y fueron descubiertas por casualidad como fragmentos cuyas dimension es son muy variables en las genotecas del DNA b urnano. La variabilidad resalta cuando una poblacion contiene fragmentos de muchos tamaiios diferentes que representan Ia misma region gen6mica, y al examinar a los individuos, resulta que h ay gran polimorfismo y que pueden encontrarse muchos alelos diferentes. El apelativo de microsatelite se utiliza en general cuando Ia longitud de la unidad de repeticion es < l 0 bp, en tanto la longitud de la unidad de repe ticion del minisatelite es de ~ l 0 a l 00 bp, aunque Ia terminologfa no ha sido definida con precision. Este tipo de secuencias tambien se Haman regiones de re peticiones en tandem de n umero variable (VNTR variable number tandem repeat). La causa de la variacion entre genomas en los microsatelites o minisatelites es que cada alelo tiene un numero diferente de unidades de repeticion. Por ejemplo, un minisatelite tiene una longitud de 124


de de de de de

18 repeticiones 16 repeticiones 14 repeticiones 13 repeticiones 10 repeticiones

La velocidad de intercambio genetico en las secuencias de los minisatelites es alta, de ~ l o-4 por kb de DNA. (Se supone que Ia frecu encia de los intercambios por locus es proporcional a !a longitud del minisatelite.) Esta velocidad es ~ 10 veces mayor que la velocidad de recombinacion homologa en Ia meiosis, es decir, en cualquier secu encia de DNA aleatoria . La gran variabilidad de los minisatelites los hace especialmente utiles para el mapeo genetico, pues es alta Ia probabilidad de que los alelos de un individuo varien en un locus determinado. En Ia ' se muestra un ejemplo de mapeo por minisatelites que constituye un caso extremo en que dos individuos son heterocigotos en el locus de un minisatelite y, de hecho, los cuatro alelos son diferentes. Toda Ia progenie obtiene un alelo de cada progenitor del modo usual y es posible determinar sin ambigiiedad la fuen te de cada alelo de la progenie. En Ia terminologfa de Ia gen etica h umana, las meiosis descritas en esta figura proporcionan gran cantidad de informacion por Ia variacion entre alelos. Una familia de m inisatelites del genoma humano comparte una secuencia "nuclear" comun. El nucleo es u na secuencia rica en G-C de 10 a 15 bp que muestra asimetrfa en Ia distribucion de purinas/pirimidinas en ambas dos cadenas. Cada minisatelite tiene una variante de la secuencia nuclear, pero ~ 1 000 minisatelites pueden ser detectados en Ia hibridacion por el metodo de Southern mediante una sonda formada porIa secuencia nuclear. Considerese Ia situacion mostrada en la Figura 6.29, pero m ultiplicada varias veces porIa existencia de m uchas de estas secuencias. El efecto de Ia variacion en los loci individuales es Ia creacion de un patron unico para cada individuo, lo cual hace posible asignar sin ambigu edad !a herencia entre los progenitores y Ia progenie a! demostra r qu e 50% de las bandas de cualquier individuo derivan de un progenitor en particular. Esto constituye Ia base de Ia tecnica conocida como "huella digital del DNA". Tanto los microsatelites como los minisatelites son inestables, aunque por diferentes razones. Los primeros experimentan un apareamiento erroneo intracatenario cuando el deslizamiento durante la replicaci6n conduce a Ia expansion de Ia repeticion, como se muestra en la . Los sistemas que reparan los daiios que sufre el DNA, en particular

s que detectan pares de bases apareados erronea':"'! ente, son imponantes para Ia reversion de tales ~a mbios, como se muestra por un gran incremenen Ia frecuencia cuando los genes reparadores n desactivados. Las mutaciones de los sistemas reparacion contribuyen de manera importante .:.. desarrollo del cancer, pues las celulas tum ora -=- suelen mostrar variaciones en las secuencias de microsatelites. Los minisatelites experimentan -: mismo tipo de entrecruzamiento desigual entre - _ eticiones descrito para los satelites (vease Fig . . 3 .. Un caso contundente es que el incremento en -: numero de variaciones se relaciona con un puncaliente meiotico. El evento de recombinacion • suele relacionarse con Ia recombinacion entre .....,arcadores flanqu eantes, pero presenta una forma mpleja en Ia cual el nuevo alelo mutante obtiene -:ormacion tanto de ]a cromatida hermana como -= _otro cromosoma (homologo). No es obvio en que fragmento de repeticion Ia -=.: sa de Ia variacion cambia de deslizamiento de :-:: _ltcacion a recombinacion.

-=

Deslizamiento de una repetici6n

Deslizamiento de una repetici6n

Resumen - _, i todos los genes pertenecen a familias, defini.. - estas por secuencias relacionadas en los ex ones =cada miembro. Las familias evolucionan por Ia _.z licacion de un gen (o genes) seguida de diver- ~:lcia entre las copias, algunas de las cuales su -O"n mutaciones desactivadoras y se transforman - . seudogenes que ya no tienen ninguna funcion. :::. - seudogenes tambien pueden ser gen erados como ias de DNA de las secuencias de RNAm. Un sistema de genes en proceso de evolucion ...:ede mantenerse unido en un agrupamiento o -: ersarse en nuevas ubicaciones por reestructu-.: j on cromosomica. En ocasiones, Ia organizaci6n _:: los agrupamientos existentes puede ser usada ..:.:-a inferir Ia serie de eventos ocurridos, los cuales _:-: j an respecto de Ia secuencia y no de Ia funcion, _~ m odo que incluyen tanto a seudogenes como a _: · es activos. Las mutaciones se acumulan m as rapidamente - :os sitios silenciosos que en los de remplazo (que : . a an Ia secuencia de amino;kidos) . El rango de e rgencia en los sitios de remplazo puede utilizar: para establecer un reloj calibrable en porcentaje : divergencia por mill6n de afios que se utilizarfa .:::a calcular el tiempo de divergencia entre dos cmbros cualesquiera de la familia. Un agrupamiento en tandem esta formado por -has capias de una unidad de repetici6n que - ~- u y,e la(s) secuencia(s) transcrita(s) y a un(os ) _ aciador(es) no transcrito(s). Los agrupamientos

El deslizamiento en la replicaci6n sucede cuando la cadena hija se desliza hacia atras una unidad de repetici6n al apa rearse con la cadena molde. Cada evento de deslizamiento agrega una unidad de repetici6n a la cadena hija. Las repeticiones extra se ext raen como un lazo de cadena individual. La duplicaci6n de esta cadena hija en el siguiente ciclo genera un DNA duplex con un numero mayor de repeticiones.

de genes de RNAr codifican a u n solo precursor de RNAr. La conservaci6n de los genes activos en los agrupamientos depende de mecan ismos como Ia conversion genica o el entrecru zamiento desigua l, que hacen qu e las m utaciones se esparzan por todo el agrupamiento y queden expuestas a la presion evolutiva . El DNA satelite consta de secu en cias muy cor tas repetidas muchas veces en tandem . Sus distintas propiedades de centrifugaci6n refl ejan su composici6n de bases sesgada. El DNA sa telite se concentra en la heterocromatina centromerica, pero se desconoce su funcion (si la tiene ). Las unidades de repetici6n de los satelites de los artr6podos son identicas, en tanto que las de los satelites de los mamfferos estan relacionadas y pueden organizarse en una je rarqufa que refl eje la evoluci6n del sa telite por Ia ampliaci6n y divergencia de secuencias elegidas de forma aleatoria . El entrecruzamiento desigual parece haber sido un determinante im portante en Ia organizacion del DNA satelite. La fijaci6n cruzada explica la capaci6.15 Resumen

125

dad de las variantes para distribuirse por el agrupamiento. Los minisatelites y los microsatelites consisten en secuencias de repetici6n aun mas cortas qu e las de los satelites, <10 bp para los microsatelites y de 10 a 50 bp para los minisatelites. El numero de unidades de repetici6n suele ser de 5 a 50, con variaciones considerables en el numero de repeticiones de un genoma a otro. El numero de repeticiones de un microsatelite varia como resultado del deslizamiento durante la replicaci6n; Ia frecuencia es afectada por sistemas que detectan y reparan dafios en el DNA. El numero de repeticiones de un minisatelite varia como resultado de eventos similares a la recombinaci6n. La variaci6n en el numero de repeticiones puede ser usada para determinar relaciones hereditarias por medio de la tecnica conocida como "huella digital del DNA".

Referen cias La duplicacion de los genes es una fuerza importante en la evolucion Articulo de investigacion Bailey, J. A., Gu, Z., Clark, R. A., Reinert, K., Samonte, R. V., Schwartz, S., Adams, M. D., Myers, E. W., Li, P. W., and Eichler, E. E. (2002). Recent segmental duplications in the human genome. Science 297, 1003-1007.

Ill

Los agrupam ientos de las globinas son fo rmados por duplicacion y por divergencia

Articulo de revision Hardison, R. (1998). Hemoglobins from bacteria to man: evolution of different pa tterns of gene expression. J. Exp. Bioi. 201, 1099-111 7 La velocidad de sustitucion neutral puede ser medida a partir de la divergencia de secuencias repetidas.

126


Articulo de investigaci6n Waterston, R. H. et al. (2002) . Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420, 520-562.

Ill

Los seudogenes so n callejones sin salida de la evolucion

Articulo de investigaci6n Hirotsune, S., Yoshida, N., Ch en, A., Garrett, L., Sugiyama, F., Ta kahashi, S., Yagami, K., Wynshaw -Boris, A., and Yoshiki, A. (2003 ). An expressed pseudogene regulates the messenger-RNA stability of its homologous coding gene. Nature 423, 91-96.

111!1

La fijacion entrecruzada podria mantener repeticiones identicas

Articulo de revision Cha rlesworth, B., Sniegowski, P., and Stephan, W . (1994). The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eu karyotes. Nature 37 1, 215-220.

aD

Los minisatelites faci litan el mapeo genetico

Articulos de investigacion Jeffreys, A. J., Murray, J ., and Ne umann, R. (1998). High-resolution mapping of crossovers in human sperm defines a minisatellite -associated recombination hotspot. Mol. Cell 2, 267-273. Jeffreys, A. J., Royle, N.J., Wilson, V., and Wong, Z. (1 988 ). Spontaneous muta tion rates to new leng th alleles at tandem-repetitive hypervariable loci in human DNA. Natu re 332, 278-281 . Jeffreys, A. J ., Tamaki, K., MacLeod, A., Monckton, D. G., Neil, D. L., and Armour, J. A. ( 1994) . Complex gene conversion events in germline mutation at human minisatellites. Nat. Genet. 6, 136-14 5. Jeffreys, A. J., Wilson, V., and Thein, S. L. (1985). Hypervariable minisa tellite regions in human DNA. Nature 314, 67-73 . Strand, M., Prolla, T. A., Liskay, R. M., and Fetes, T. D. (1993 ). Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by m u tations affecting DNA mismatch repair. Nature 365, 274-276.

l RNA mensajero _ _ _ _ ESQUEMA DEL CAPITULO ) Introducci6n El RNAm se produce por transcripci6n y se traduce

El RNAm eucari6tico es modificado durante su transcripci6n 0 despues de esta

• Solo una de las dos cadenas de DNA se transcribe en RNA.

• Un transcrito de RNAm eucari6tico es modificado en el nucleo durante 0 poco despues de su transcripcion. • Las modificaciones incluyen la adici6n de un casquete metilado en el extrema 5' y una secuencia de poli(A) en el extrema 3'. • El RNAm no es exportado del nucleo al citoplasma hasta que todas las modificaciones estan completas.

El RNA de transferencia forma una hoja de trebol • Un RNAt tiene una secuencia de 74 a 95 bases que se dobla para formar una estructura secundaria de hoja de trebol con cuatro brazos constantes (y un brazo adicional en los RNAt mas largos). • El RNAt se carga para formar un aminoacil-RNAt y da lugar a un enlace ester del grupo OH 2' o 3' del acido adenilico en el extrema del brazo aceptor del grupo COOH del aminoacido. • La secuencia del anticodon mada mas es responsable de la especificidad del aminoacil-RNAt.

_.

El tallo aceptor y el anticodon se encuentran en los extremos de la estructura terciaria

161!!1

• Un casquete 5' se forma al agregar una G a la base terminal del transcrito a traves de una ligadura 5'-5'. A la base o ribosa de la guanosina terminal nueva se agregan de uno a tres grupos metilo.

El RNA mensajero es traducido por los ribosomas

Dill

El ciclo vital del RNA mensajero de las bacterias • En las bacterias, la transcripci6n y la traducci6n ocurren simultimeamente, pues los ribosomas empiezan a traducir un RNAm antes de que su sintesis este completa. • El RNAm bacteriano es inestable y su vida media es de solo unos cuantos minutes. • Un RNAm bacteriano puede ser policistr6nico, con varias regiones codificadoras que representan a diferentes genes.

La degradaci6n del RNAm bacteriano involucra a multiples enzimas • La direcci6n global de la degradaci6n del RNAm bacteriano es de 5' a 3'. • La degradaci6n es resultado de la combinaci6n de divisiones endonucleoliticas seguidas de la degradaci6n exonucleolitica del fragmento de 3'~ 5'.

Df:l

La estabilidad del RNAm depende de su estructura y su secuencia • Las modificaciones de ambos extremes del RNAm lo protegen contra la degradaci6n mediada par las exonucleasas. • Las secuencias especificas de un RNAm pueden producir efectos estabilizadores o desestabilizadores. • La desestabilizaci6n puede ser activada par la perdida de poli(A).

A una molecula de RNAm se unen numerosos ribosomas • Una molecula de RNAm es traducida simultaneamente par numerosos ribosomas. Cada ribosoma se encuentra en una etapa diferente de progresion a lo largo del RNAm.

El extrema 3' esta poliadenilado • Despues de la transcripci6n se agrega un fragmento de poli(A) de -200 nucle6tidos a un transcrito nuclear. • El poli(A) esta unido a una proteina especifica (PABP). • El poli(A) estabiliza al RNAm contra la degradaci6n.

• La hoja de trebol constituye una estructura terciaria en forma de L con el brazo aceptor en un extrema y el brazo anticodon en el otro. • Los ribosomas se caracterizan par su velocidad de sedimentacion (70S en los bacterianos y 80S en los eucarioticos). • Un ribosoma esta formado por una unidad grande (de 50S o 60S en bacterias y eucariotas) y una subunidad pequefia (de 30S o 40S). • El ribosoma proporciona el ambiente en el cual el aminoacil-RNAt agrega aminoacidos a la cadena polipeptidica creciente en respuesta a los codones corres pondientes. • Un ribosoma se desplaza a lo largo de una molecula de RNAm en direcci6n 5' a 3'.

El extrema 5' del RNAm eucari6tico posee un casquete

1610

La degradaci6n del RNAm implica multiples actividades • Para la degradaci6n del RNAm de las levaduras se requiere de la eliminaci6n del casquete 5' y del poli(A) 3'. • Una ruta de las levaduras implica la degradaci6n exonucleolitica en direcci6n 5' ~3'. • Otra ruta de las levaduras uti liza un complejo de numerosas exonucleasas que fun cionan en direccion 3'~ 5'. • La desadenilasa de las celulas animates puede unirse directamente con el casquete 5'.

Continua en Ia siguiente pagina

127

1lD1

• Las mutaciones sin sentido provocan la degradaci6n del RNAm. • En las levaduras y los gusanos se han encontrado genes que codifican al sistema de degradaci6n.

1JB1

Las moleculas de RNA eucari6tico se transportan • El RNA es transportado a traves de una membrana a manera de particulas ribonucleoproteinicas. • Todas las moleculas de RNA eucari6tico que funcionan en el citoplasma deben exportarse desde el nucleo.

ID

Introducci6n

El RNA es uno de los participantes principales de la expresion genica que en un principia se caracterizo como intermediario en la sfntesis de proteinas, pero desde entonces se han descubierto muchas otras moleculas de RNA que desempefian un papel estructural o funcional en otras etapas de la expresion genica. La implicacion del RNA en muchas funcio-

El RNAm tiene una secuencia de bases que representa a una proteina

Ran go de dimensiones de 500-1 0 000 bases

El RNAt es una molecula pequena de RNA con estructura secundaria extensa: Rango de dimensiones de 74-95 bases

Los RNAr principales tienen una estructu ra secundaria exte nsa y se asocian con protefnas para formar el ribosoma: Rango de dimensiones de 1 500-1 900 (RNAr pequefio) y de 2 900-4 700 (RNAr grande)

Los tres tipos de RNA universalmente necesarios para la expresi6n genica son RNAm (que porta la secuencia codificadora), RNAt (que proporciona los aminoacidos correspondientes a cada codon) y RNAr (componente importante del ribosoma que proporciona el ambiente necesario para la sfntesis protefnica).

128

• Las moleculas de RNAt y el componente de RNA de una ribonucleasa se importan al interior de las mitocondrias. • Las moleculas de RNAm pueden recorrer grandes distancias entre las celulas de las plantas.

Las mutaciones sin sentido activan un sistema de vigilancia

CAPITULO 7 El RNA mensajero

Ulil

El RNAm puede localizarse especificamente • El RNAm del Ash1 de la levadura forma una ribonucleoproteina que se une a un motor de miosi n;; . • Un motor lo transporta a lo largo de los filamentos c!< actina en el brote germinal. • Se ancla y se traduce en el brote, de manera que la proteina se encuentra s6lo en el brote.

Resumen

nes relacionadas con la expresion genica respalci: la perspectiva general de que todo el proceso pu d haber evolucionado en un "mundo de RNA" en e cual este fue originalmente el componente actiY responsable de conservar y expresar la informaci 6r.; genetica. Muchas de estas funciones fueron sut . secuentemente asumidas por las protefnas, con e consiguiente incremento de la versatilidad y, pro bablemente, la eficiencia. Como se resume en la , en la produccion de las protefnas participan directamente tr e= clases principales de RNA: • El RNA mensajero (RNAm, messenger RNA constituye un intermediario que porta lc. copia de una secuencia de DNA que representa proteinas. • Los RNA de transferencia (RNAt, transfe· RNA) son moleculas pequefias de RNA mi lizadas para suministrar los aminoacidos correspondientes a cada codon especffico de: RNAm. • Los RNA ribosomicos (RNAr, ribosoma. RNA) son componentes del ribosoma, complejo ribonucleoproteinico de gran tamafi0 que contiene numerosas protefnas y sus componentes de RNA, los cuales proporcionan el mecanismo para polimerizar a los aminoacidos en una cadena polipeptfdica. El tipo de funcion del RNA en cada caso es distinto. En el RNA mensajero, su secuencia es la caracteristica importante: cada triplete de nucleotido< de la region codificadora del RNAm representa a un aminoacido en la protefna correspondiente. Sin embargo, la estructura del RNAm, en particular las secuencias localizadas a ambos lados de la region codificadora, puede ser importante para el contro: de su actividad y, por lo tanto, de la cantidad de protefna producida a partir de eL En el RNAt se observan dos de los temas comunes que rigen el uso del RNA: su estructura tridimensional es importante y tiene la capacidac de aparearse con otro RNA (RNAm). La estructurc.

-:i imensional se reconoce primero por una enzima -~ constituye una diana apropiada para el vincu:on un aminoacido especffico que crea un amil cil-RNAt, identificado como la estructura que : ·J tiliza para la sfntesis proteinica. La especifici,:::_ de uso de un aminoacil-RNAt se controla por ::pareamiento de las bases, cuando una secuencia - _lete corta (anticodon) se aparea con el triplete de _. .::leotidos que representa a su aminoacido. En el RNAr se observa otro tipo de actividad; .:-:.a de sus funciones es estructural, de manera que -: porcionando un marco en el que se adhieren - protefnas ribosomicas, ademas de que participa :-ectamente en las actividades del ribosoma. Una ': las actividades principales de este ultimo es su .-:;>a.cidad para catalizar la formacion de un enlace =:~ rfdico mediante el cual se incorpora un amino_: 'o a una protefna. Esta actividad reside en uno ~ ;os RNAr. Lo importante de este antecedente es que, al .. [emplar la funcion del RNA en la sfntesis pro'~1i ca, se debe analizar como un componente que -::" empefia una funcion activa y que puede ser : · eto de regula cion tanto por protefnas como por -=as moleculas de RNA; nose debe olvidar, por otra " ~ e, que los RNA pueden haber sido las bases del .1rato original. El tema constante en todas las ac·ctades del RNA, tanto en la sintesis de protefnas :n o en otras partes, es que sus funciones depen. -c:1 fundamentalmente del apareamiento de bases ":a formar su estructura secunda ria y para interac- ~r especfficamente con otras moleculas de RNA. _c ~u ncion codificadora del RNAm es unica, si bien :.. 3.NAt y el RNAr son ejemplos de una clase mucho - is amplia de moleculas de RNA no codificadoras :1 diversas funciones en la expresion genica.

El RNAm se produce por transcripci6n y se traduce i

~ncepto

codificadora relacionada con una secuencia protefnica a traves del codigo genetico: cada triplete de nucleotidos (codon) de la region codificadora representa a un aminoacido. Solo una de las cadenas de un DNA diiplex se transcribe en un RNA mensajero. Las dos cadenas de DNA se distinguen segun se ilustra en la • La cadena de DNA que dirige la sfntesis de RNAm por el apareamiento complementario de bases se denomina cadena molde o cadena anticodificadora. (Antisentido es el termino general para describir una secuencia de DNA o de RNA complementaria al RNAm). • La otra cadena de DNA tiene la misma secuencia que el RNAm (excepto porT, en lugar de U) y se le denomina cadena codificadora o cadena con sentido. En este capitulo se describe el RNAm y su funcion de molde para la sfntesis proteinica. En el Capitulo 8, Sintesis proteinica, se analizara el proceso por el cual se sintetiza una protefna, en tanto que en el 9, Utilizacion del codigo genetico, se describira la forma en que se utiliza el codigo genetico para interpretar el significado de una secuencia de RNAm. En el Capitulo 10, Localizacion de las proteinas, el enfoque esta en la interrogante sobre como encuentra una protefna su localizacion apropiada en la celula durante la sfntesis o despues de ser sintetizada.

Transcripci6n

principal

S6lo una de las dos cadenas de DNA se transcribe en RNA. Traducci6n -~

expresion genica tiene lugar mediante un pro. ~ de dos etapas. • La transcripcion genera un RNA de cadena unica con una secuencia identica a la de una de las cadenas del duplex de DNA. • La traduccion convierte a la secuencia de nucleotidos del RNAm en una secuencia de aminoacidos que forman una protefna. No todo el RNAm se traduce, pero cada RNAm contiene por lo menos una region

La transcripci6n genera un RNA complementario a la cadena molde del DNA y tiene la misma secuencia que la cadena codificadora del DNA. La traducci6n interpreta cada triplete de bases y le asigna un aminoacido. Tres vueltas de una molecula de DNA duplohelicoidal contienen 30 bp, que codifican a 10 aminoacidos.

7.2 El RNAm se produce par transcripci6n y se traduce

129

Ill ~Aminoacido


Aminoacido ligado al extrema 3' del RNA!

-~

Aminoacido

~

El brazo esta 5' formado por: ~ ~ • Ta.llo de bases ~ ~ apareadas ~ ~ ~ • Lazo de cadena .~f ~~ indiVidual ~\'0'<]'1] if'> YYYLYf-~ ? 0~ o~n ~;-ir /cV>.YLY.Y)

i

. __, _

•y .}U-.D.fl ' ,, ·r

;~y

"'cs;," Q

Apareamiento---cod6n-anticod6n

•' l"'

~

RNAm

Un RNAt tiene las propiedades duales de un adaptador que reconoce al aminoacido y al anticodon. La adenosina 3' esta ligada de forma covalente a un aminoacido. El anticodon se aparea con el codon del RNAm.

A

c

c 7:> 1 72 71

Brazo aceptor- 2

3 70

Brazo D\ 1716 Pu G" A1,~ G

20

:

1 4~Y W

9

--~~

U'· l

I I

Brazo T'VC

Py59 66 65 64 63 62 C A' Pu 49505152G c

p

A 2223Pu25 Y 47 26 27 434445 46 28 42 29 41 30 40

31 39

T y

l Brazo extra

Py' 38 U Pu' 34 36 35

Anticodon

J

La hoja de trebol de RNAt tiene bases i nvariables, bases semiinvariables y un conjunto conservado de interacciones de apareamiento de bases.

130

El RNA de transferencia forma una hoja de trebol


• Un RNAt tiene una secuencia de 74 a 95 bases que se dobla para formar una estructura secundaria de hoja de trebol con cuatro brazos constantes (y un brazo adicional en los RNAt mas largos). • El RNAt se carga para formar un aminoacil-RNAt y da lugar a un enlace ester del grupo OH 2' o 3' del acido aden\lico en el extremo del brazo aceptor del grupo COOH del aminoacido. • La secuencia del anticodon nada mas es responsable de la especificidad del aminoacil-RNAt.

El RNA mensajero se distingue del mecanismo responsable de su traduccion mediante sistemas sincelulas para sintetizar proteinas in vitro. Con un sistema de sfntesis de protefnas a partir de Ul1 tipo de celulas se puede traducir el RNAm de otro para demostrar que el c6digf genetico y el mecanisme de traducci6n son universales. Cada triplete de nucleotidos del RNAm representa un aminoacido. La incongruencia estructura: entre un trinucleotido y un aminoacido conduce inmediatamente a preguntarse como se aparea cada codon con su aminoacido espedfico. El "adaptador ~ es el RNA de transferencia (RNAt), que tiene do< propiedades clave: • Representa a un solo aminoacido, al cual se une de forma covalente. • Contiene una secuencia de tres nucleotidos el anticodon, que es complementaria del codon que representa a su aminoacido. El anticodon permite al RNAt reconocer el codon po_ el apareamiento de bases complementarias Todas las moleculas de RNAt tienen estructurao secundarias y terciarias comunes. La estructura secundaria del RNAt puede describirse como una hoja de trebol, ilustrada en la , en la cual el apareamiento de bases complementarias forma los tallos de los lazos de cadena unica. Las estructuras tallo-lazo se denominan brazos de RNAt, y sus secuencias incluyen bases "inusuales" generadas por Ia modificacion de las cuatro bases estandar despues de Ia sintesis de Ia cadena polinucleotidica. La construccion de la hoja de tr<~bol se ilustra en mas detalle en Ia . Los cuatro brazos mayores reciben su nombre de acuerdo con su estructura o funcion: • El brazo aceptor consta de un tallo formado por bases apareadas que termina en una secuencia no apareada cuyo grupo 2'- o 3'-0H puede ligarse a un aminoacido. • El hrazo Tlj!C se llama asi por ese triplete. (\jf representa a la seudouridina, una base modificada).

• Eo el brazo anticodon, el anticodon siempre esta en el centro dellazo. • El brazo D debe su oombre a que contiene la base dihidrouridina (otra de las bases modificadas del RNAt). • El brazo extra yace entre el T\j!C y el anticodon, y su extension flucttia entre tres y 21 bases. El sistema de numeraci6n del RNAt ilustra Ia .. !1stancia de su estructura . Las posiciones se nu-=ran de 5' a 3' de acuerdo con Ia estructura del -~ -At mas comun, el cual tiene 76 residuos. El ran- tota l de loogitud de sus moleculas es de 74 a 95 ·::. ·es, y Ia variaci6n se debe a diferencias estructu-~es en el brazo D y en el extra. El apareamiento de bases que mantiene la esJa ura secundaria se muestra en Ia Figura 7.4. En ·- RNAt dado, Ia mayorfa de los apareamientos de =.·es son asociaciones convencionales de A-U y -:: -e, aunque tambien se encuentran pares ocasio.:..:es de G-U, G-\jf o A -\jf. Los tipos adicionales de ~es de bases son menos estables que los regulares, .-::o de cualquier forma permiten que se forme una _ ctura duplo-helicoidal en el RNA. Cuando se comparan las secuencias de las dife:= es moleculas de RNAt, las bases que se encuen--'- - en deterrninadas posiciones son invariables (o .:'nservadas); casi siempre una base especffica se · -..::Jentra en Ia misma posicion. Algunas posiciones : ..:escriben como semi-invariables (o semi-con_.::·vadas) porque estan restringidas a un tipo de · (purin a fren te a pirimidina), pero puede haber ~-quier base del tipo correspondiente. Cuando un RNAt esta em-gada con el amino _.:_ que corresponde a su anticodon, se le llama - - oacil-RNAt y el aminoacido se liga mediante ::nlace ester que va del grupo carboxilo al hi. -:·lo 2' o 3' de Ia ribosa de la base terminal 3' del ·.-.t (que siempre es adenina). El proceso de carga ..:.!1 RNAt es catalizado por una enzima especf.:: .a aminoacil-RNAt sintetasa. Hay (cuando ==.os) 20 de ellas, y cada una reconoce a un solo _ oacido y a todos los RNAt en los cuales puede · · :olocado de manera legitima. :lay cuando menos un RNAt (pero en general - .. as) para cada aminoacido. Un RNAt se nom- ·..:rilizando como superfndice Ia abreviatura de - ::"tras de cada aminoacido, y si hay mas de un · -.: para el m.ismo aminoacido, se utilizan subfn. :-o uumericos para distinguirlos. Asf, dos RNAt .:. ;a tirosina se describen como RNAt 1Tir y RNAt2Ti'. .-'lAt que transporta un aminoacido, es decir, =:::1inoacii-RNAt, se indica mediante un prefijo :: entifica a! aminoacido, de modo que Ala-RNAt ·ale a RNAtAl• que porta a su aminoacido.

)3H Cisterna CH 2 CH 0 / '-c~

NH2

La desulfuraci6n cambia al aminoacido

I

'Y

_ _ _ACA

on

<(H 3

Alanina

CH 0 /' q

NH, ~

Rooooodm,.oto del codon sin

b.

cam 1os

ACA UGU

El significado del RNAt depende de su anticodon y no de su aminoacido.

(.La secuencia anticodon por sf misma permite al aminoacil-RNAt reconocer al codon correcto? En Ia se ilustra un experimento clasico para responder esta pregunta. La desulfuracion reductora convierte al aminoacido del cisteinil-RNAt en alanina, generando alanil -RNAtCis_El RNAt tiene un anticodon que responde a! codon UGU. La modificacion del aminoacido no influye en la especificidad de Ia interaccion anticod6n-cod6n, de manera que el residuo de alanina es incorporado a Ia protefna en el Iugar de Ia cistefna. Una vez que un RNAt ha sido cargado, el aminoacido no desempefza ningun papel en su especificidad, la cual es determinada exclusivamente por el anticodon .

Ill El tallo aceptor y el anticodon estan localizados en los extremes de la estructura terciaria Concepto principal • La hoja de trebol constituye una estructura terciaria en forma de L con el brazo aceptor en un extreme y el brazo anticodon en el otro .

La estructura secundaria de cada RNAt se dobla para formar una estructura terciaria compacta en forma de L en Ia cual el extremo 3' qu e se une al aminoacido esta lejos del anticodon que se u n e al RNAm. Todos los RNAt tienen la misma estructura tercia ria general, aunqu e se distinguen por variaciones individuales. Los tallos duplo-helicoidales apareados por bases de la estructura secundaria se mantienen en Ia estructura terciaria, pero su distribucion en tres dimen siones crea, esencialmente, dos helices dobles en angulo recto una respecto de la otra, como se ilustra en Ia . El tallo aceptor y el tallo T\j!C forman una helice doble continua con una sola

7.4 El tallo aceptor y el anticodon estan loca lizados en los extremes de la estructura terciaria

131

La estructura de hoja de trebol tiene cuatro brazos 3'

Brazo aceptor

BrazoD

5'

~ d - ~ BrazoT\j/C

U

Brazo anticodon

La proyecci6n bidimensional tiene dos duplex perpendiculares

La estructura principal adquiere Ia forma de una L R I

NH 2/

Aminoacido

Brazo T\j/C

CH

'

0

c//

--6

Brazo aceptor Brazo D

El RNA de transferencia se dobla en una estructura terciara compacta en forma de L, con el aminoacido en un extremo y el anticodon en el otro.

interrupcion; el tallo D y el tallo anticodon forma :· otra helice continua doble, tambi en con una interrupcion. En Ia region localizada entre las h elic dobles, donde se forma el angulo de la L, se encuer:tran ellazo 1\j!C y el D, de modo que el aminoacid reside en Ia extremidad de un brazo de Ia estructur: en L y ellazo anticodon forma el otro extrema . La estructura terciaria se crea mediante puent : de hidrogeno formados principalmente por bases n apareadas en la estructura secundaria. Muchas de las bases invariables y semiinvariables estan impEcadas en estos puentes de hidrogeno, lo cual expliG. que se conserven. No todas estas interacdones so:. universales, pero probablemente identifican el patron general para establecer Ia estructura del RNA: En Ia se muestra un modelo mol cular de la estructura del RNAtPhe, y la imagen de !ado izquierdo corresponde a! esquema de Ia pa n e inferior de Ia figura 7 .6. En otros RNAt se observ
111

El RNA mensajero es traducido por los ribosomas

Conceptos principales • Los ribosomas se caracterizan por su velocidad de sedimentaci6n (705 en los bacterianos y 805 en los eucari6ticos). • Un ribosoma esta formado por una unidad grande (de 50 o 605 en bacterias y eucariotas) y una subunidad pequena (de 30 o 405). • El ribosoma proporciona el ambiente en el cual el aminoacil-RNAt agrega aminoacidos a la cadena polipeptidica creciente en respuesta a los codones correspondientes. • Un ribosoma se desplaza a to largo de una molecula de RNAm en direcci6n 5' a 3'.

Un modelo espacial compacta de esferas s6lidas muestra que la estructura terciara del RNAtPhe es compacta. Las dos perspectivas del RNAt giran 90°. Imagen cortes\ a de 5ung-Hou Kim, University of California, Berkeley.

13 2


La traduccion de un RNAm en una cadena polipeptfdica es catalizada por el ribosoma . Los ribosoma. se describen tradicionalmente en funcion de su velocidad (aproximada) de sedimentacion (medida e:Svedbergs, donde un valor mayor de S indica un:.

~l ocidad de sedimentacion mayor y mayor masa). _ · s ribosomas bacterianos generalmente se sedi-entan a -70S. Los ribosomas del citoplasma de -'..5 celulas eucarioticas superiores son mas grandes ·uelen sedimentarse a -80S. El ribosoma es una particula ribonucleopro-cinica compacta formada por dos subunidades, _,a a una de las cuales tiene un componente de 7 . ·A, incluida una molecula muy larga de RNA y _merosas protefnas. La relacion entre un riboso=: a y sus subunidades se ilustra en Ia _..:. dos subunidades se disocian in vitro cuando se ·:-duce Ia concentracion de iones de Mg 2+. En cada ~ s o, la subunidad grande tiene una masa aproxi_ adamente dos veces mayor que Ia subunidad __equefia. Los ribosomas bacterianos (70S) tienen ~ unidades que se sedimentan a 50S y a 30S. Las - J unidades de los ribosomas citoplasmicos euca:-:6ticos (80S) se sedimentan a 60S y a 40S . Las _ s subunidades operan juntas como parte del ri: soma completo; sin embargo, cada una asume -7acciones distintas en Ia sintesis proteinica. Todos los ribosomas de un compartimiento ce~ :ar dado son identicos y asumen La sfntesis de di~m tes protefnas asociandose con diferentes RNAm que - .porcionan las secuencias codificadoras en sf. El ribosoma crea el ambiente que controla el re-. nacimiento entre un codon de RNAm y un anticon de RNAt. AI interpretar el codigo genetico como __a serie de tripletes adyacentes, la sintesis protei:...ca procede del inicio de una region codificadora "- 5nal. Una protefna se ensambla par adici6n secuencial ·: 1minoacidos en direcci6n del terminal N al tenninal C :forme el ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm. Un ribosoma empieza Ia traduccion en el ex:"ID O 5' de una region codificadora y traduce cada - don en un aminoacido conforme procede hacia : . extremo 3'. En cada codon, el aminoacil-RNAt -_ ::opiado se relaciona con el ribosoma y dona su 1inoacido a Ia cadena polipeptidica. En cualquier .um ento, el ribosoma puede albergar dos ami"'dcil-RNAt que corresponden a codones sucesivos, :c-mitiendo que se forme un enlace peptidico en-:~ los dos aminoacidos correspondientes. En cada .:..~ o . Ia cadena polipeptidica creciente se alarga un -'--· inoacido mas.

A una molecula de RNAm se unen numerosos ribosomas · =Jncepto principal • Una molecula de RNAm es traducida simultaneamente por numerosos ribosomas. Cada ribosoma se encuentra en una etapa diferente de progresi6n a lo largo del RNAm.

•

'

•

r

a

Ribosoma bacteriano = 70S Eliminaci6n de Mg2+

lt

Adici6n de Mg2+

Un ribosoma esta formado por dos subunidades.

Cuando se afslan ribosomas activos en forma de fraccion asociada a proteinas recien sintetizadas, seencuentran como un complejo forma do por un RNAm relacionado con numerosos ribosomas, estructura que se denomina polirribosoma o polisoma. La subunidad 30S de cada ribosoma se asocia con el RNAm y Ia subunidad 50S porta ala proteina recien sintetizada; el RNAt abarca ambas unidades. Cada ribosoma del polisoma sintetiza independientemente a un polipeptido en particular durante su recorrido por la secuencia del mensajero. En esencia, el RNAm es jalado a traves del ribosoma y cada triplete de nucle6tidos se traduce en un aminoacido, de manera que el RNAm tiene una serie de ribosomas que portan fragmentos crecientes del producto protefnico y que se desplazan del extremo 5' al 3', como se ilustra en Ia . Una cadena polipeptfdica en proceso de sfntesis suele llamarse proteina naciente. En general, los 30 a 35 aminoacidos recientemente agregados a una cadena polipeptfdica creciente estan protegidos del ambiente porIa estructura del ribosoma. Probablemente toda Ia parte anterior del polipeptido sobresale y es libre de empezar a plegarse en su conformaci6n apropiada, de modo que las protefnas pueden exhibir parte de la conformaci6n madura incluso antes de que concluya su sfntesis. En Ia micrograffa electr6nica de Ia se muestra una caracterizaci6n clasica de polisomas. La globina es sintetiza por un conjunto de cinco ribosomas adheridos a cada RNAm (pentasomas). Los ribosomas aparecen como objetos esfericos deformados de -7 nm (70 A) de diametro, conectados por una hebra de RNAm. Los ribosomas se localizan en varias posiciones a lo largo del mensajero. Los que se encuentran en un extremo apenas han empezado Ia sfntesis protefnica, en tanto que los 7.6 A una molecula de RNAm se unen numerosos ribosomas

133

Un polirribosoma esta formado por un RNAm t raducido sim ultaneamente por numerosos ribosomas que se desplazan en direcci6n 5' -3'. Cad a ribosoma tiene dos moleculas de RNAt, una que porta La proteina naciente y otra que porta al siguiente aminoacido que se agregara.

La sintesis proteinica tiene Lugar en Los polisomas. Imagen cortesia de Alexander Rich, Massachusetts Institute of Technology.

.· ........... : ... ~ /V_

.. ............................... Los ribosomas traducen el RNAm y regresan al banco

El RNAm es degradado

EL RNA mensajero se traduce por media de ribosomas que se reciclan en un banco.

del otro, estan por terminar Ia produccion de un polipeptido. El tamano del polisoma depende de multiples variables; en las bacterias, por ejemplo, es muy grande, con decenas de ribosomas dedicados simultaneamente ala traduccion. Las dimensiones se de ben en 134


parte ala longitud del RNAm (que suele codificac c numerosas proteinas) yen parte a Ia gran eficienc.: con que se adhieren a este los ribosomas. Los polisomas del citoplasma de una celula e:_cari6tica tienden a ser mas pequenos que los de L bacterias, y tambien en este caso, su tamano es u:...o funci6n de Ia longitud del RNAm (que usualmec : representa solo a una protefna en las eucariotas1 de Ia frecuencia caracterfstica con Ia que se adhk ren los ribosomas. Un RNAm eucariotico promeci probablemente tenga -8 ribosomas adheridos a :~ vez. se ilustra el ciclo vital del _:En la bosoma . Los ribosomas son extrafdos de un bane (formado de hecho por subunidades ribosomica ~ se utilizan para traducir un RNAm y posteriormen:: se regresan para ciclos posteriores . El numero d: ribosomas adheridos a cada molecula de RNAm q ·: sintetiza a una protefna en particular nose ha dete minado de manera precisa ni en las bacterias ni ey las eucariotas, pero es una cuestion de fluctuaci6estadfstica deterrninada por las variables del tamai, . y la eficiencia del RNAm. La constituye una perspectiva globe. de la atencion dedicada ala sfntesis de protefnas e:una bacteria intacta. Los aproximadamente 20 OC~ ribosomas representan un cuarto de la masa de :_;_ celula. Hay >3 000 copias de cada RNAt, y todas lc.~ moleculas de RNAt, juntas, son casi 10 veces mL numerosas que los ribosomas; la mayor parte es-: en forma de aminoacil-RNAt, listo para utilizarse C.: inmediato en la sfntesis protefnica. Dada su inest.;.bilidad, es diffcil calcular el numero de molecula..: de RNAm, pero un calculo razonable serfa -1 5C : en cliferentes estados de sfntesis y descomposicio Hay -600 tipos de RNAm en una bacteria, lo cue sugiere que, en general, hay solo de dos a tres c pias de cada RNAm por cada una de ellas que, e::. promedio, codifican quiza a -3 protefnas. Si h a ~ 1850 protefnas solubles diferentes, debe haber u:-. promedio de> 1 000 copias de cada protefna en u _ bacteria.

El ciclo vital del RNA mensajero de las bacterias I Conceptos principales En las bacterias, la t ranscripci6n y la traducci6n ocurren simultaneamente, pues los ribosomas empiezan a traducir un RNAm antes de que su sintesis este completa. El RNAm bacteriano es inestable y su vida media es de solo unos cuantos minutos. Un RNAm bacteriano puede ser policistr6nico, con varias regiones codificadoras que representan a diferentes genes.

::. ~'-l"A mensajero tiene la misma fun cion en todas - celulas, pero con diferencias importantes en los - ~:alles de la sfntesis y la estructura del RNAm eu..::._:6tico y del procariotico. Una diferencia importante en la produccion del --·..un depende de donde ocurran Ia transcripcion 2 traduccion: • En las bacterias, el RNAm se transcribe y se traduce en el compartimiento celular unico; los dos procesos estan tan intimamente relacionados que son simultaneos. Los ribosomas se adhieren al RNAm bacteriano incluso antes de que haya terminado su transcripci6n, de modo que el polisoma tiende a adherirse al DNA. El RNAm bacteriano suele ser inestable, y por lo tanto se traduce en proteinas durante solo algunos minutos. • En una celula eu cariotica, la sfntesis y Ia maduracion del RNAm tienen Iugar exclusivamente en el nucleo, y solo despues de terminados dichos eventos, el RNAm es exportado a! citoplasma, donde es traducido por los ribosomas. El RNAm eucariotico es relativamente estable y sigue traduciendose durante muchas horas. En la se muestra que en las bacterias ::-anscripci6n y la traducci6n estan fntimamente .:......:. -ionadas. La primera empieza cuando la enzima .; polimerasa se une al DNA y posteriormente se _ laza formando una copia de una cadena. Tan _ to se inicia Ia transcripci6n, los ribosomas se 2eren al extrema 5' del RNAm y comienza Ia tra__::i6n, incluso antes de que el resto del mensaje se ;;. sintetizado. Un grupo de ribosomas se mueve .argo del RNAm mientras este es sintetizado. ~xtremo 3' del RNAm se genera cuando termina ::.-:mscripci6n, en tanto que los ribosomas sigu en -.: x iendo el mRNA mientras sobrevive, pero se -~ada en la direccion general 5 ' ~ 3' con bastante

..

• Masa celular deshidratada Componente

Moleculas/celula

(%

Pared Membrana

10 10

DNA

1.5

RNAm RNAI RNAr Proteinas ribos6micas Proteinas solubles Moh§culas pequefias

Tipos diferentes

Copias de cada tipo

1 2

1 2

1

1 3 16 9

1 500 200 000 38 000 106

600 60 2 52

2-3 >3 000 19 000 19 000

46 3

2.0 x 1o• 7.5x106

1 850

>1 000

BOO

Analisis de E. coli en funci6n de sus componentes macromoleculares.

0 min

Empieza Ia transcripci6n

ppp

~ El extrema 5' esta trifosfatado

0.5 min

Los ribosomas inician Ia traducci6n

1.5 min

La degradaci6n empieza en el extremo 5'

/.IYf¥1

2.0

La RNA polimerasa termina en el extremo 3'

3.0 min

La degradaci6n continua, los ribosomas terminan Ia traducci6n

/\../ Sinopsis: el RNAm se transcri be, se traduce y se deg rada simultaneamente en las bacterias. 7.7 El ciclo vital del RNA mensajero de las bacterias

13 5

En las bacterias pueden observarse las unidades de transcripci6n. Imagen cortes1a de Oscar Miller.

rapidez. El RNAm es sintetizado, traducido por los ribosomas y se degrada, todo en rapida sucesion . Una molecula individual de RNAm sobrevive si acaso, unos minutos. La transcripcion y la traduccion bacteriana tienen Iugar a velocidades similares. A una temperatura de 37°C la transcripcion del RNAm ocurre a -40 nucleotidos/segundo, velocidad muy cercana a la de la sfntesis proteinica, que es aproximadamente de 15 aminoacidos por segundo, de modo que se necesitan -2 minutos para transcribir y traducir a un RNAm completo de 5 000 bp, que corresponden a 180 kD de protefna. Cuando se inicia la expresion de un nuevo gen, su RNAm suele aparecer en Ia celula en -2.5 minutos. La proteina correspondiente aparecera quizas en medio minuto mas. La traduccion bacteriana es muy eficiente, y la mayorfa de las moleculas de RNAm son traducidas por muchos ribosomas empacados de forma compacta . En un caso (trp RNAm), se inician aproximadamente 15 transcripciones por minuto y cada una de las 15 moleculas de RNAm probablemente sea traducida por- 30 ribosomas en el intervalo que media entre su transcripcion y su degradacion. La inestabilidad de la mayor parte del RNAm bacteriano es sorprendente. La degradacion del RNAm sigue de cerca a su traduccion y quiza empieza en un lapso de un minuto desde el inicio de la transcripcion. El extremo 5' del RNAm comienza a degradarse antes de que el 3' haya sido sintetizado o traducido. La degradacion parece seguir al ultimo ribosoma del convoy del RNAm, pero la degradacion procede con mayor lentitud, tal vez aproximadamente a la mitad de Ia velocidad de la transcripcion o la traduccion. La estabilidad del RNAm influye de manera importante en la cantidad de protefna que se produce; 136


suele expresarse en funcion de la vida media. ::_ RNAm que representa a un gen especifico tiene uvida media caracterfstica, pero el promedio es de - = minutos en las bacterias. Obviamente, esta serie de eventos solo es sible porque la transcripcion, la traduccion y la r: gradacion ocurren en la misma direccion. En la L crografia de electrones de Ia U se descut>_ Ia dinamica de la expresion genica en de lito flagra c En estas unidades de transcripcion (desconocida~ varias moleculas de RNAm estan en proceso : sfntesis simultaneamente y cada una porta nun~ rosos ribosomas implicados en la traduccion. (Es: corresponde a la etapa que se muestra en eJ segun de la Figura 7.13 .) Un RNA cuya sfntesis a no ha concluido con frecuencia se denomina Rl\. naciente. Las moleculas de RNAm bacteriano va ric. enormemente en cuanto al numero de protefnas las cuales codifican. Algunos RNAm representan : un solo gen, son monocistr6nicos, en tanto q·-: otros (la mayo ria) portan secuencias que codific a numerosas proteinas y son policistr6nicos. E· estos casos, una sola molecula de RNAm se transc:::- be a partir de un grupo de genes adyacentes. (Die :~ agrupamiento de genes constituye un operon co trolado como una unidad genetica unica; vease .Capitulo 12, El operon.) Todos los RNAm constan de dos tipos de rtgiones; la codificadora esta formada por una ser : de codones que representa a !a secuencia de ar ·noacidos de una protefna, empieza (normalmentecon AUG y termina con un codon de terminaci6No obstante, el RNAm siempre es mas largo qt<: la region codificadora por la presencia de region adicionales \ocalizadas en ambos extremos. Una se-cuencia adicional en el extremo 5' que precede c. inicio de Ia region codificadora se describe con _ lfder o region 5' UTR (region no traducida). La secuencia adicional que sigue ala sefial de terminaci6que forma el extremo 3' se denomina remolque region 3' UTR y aunque son parte de la unidad a~ transcripcion, estas secuencias no se utilizan pac codificar proteinas. Un RNAm policistronico tambien contiene regiones intercistr6nicas, como se ilustra en la FIG 'i . Su tamafio varia mucho, ya que puede terreuna longitud de basta 30 nucleotidos en los RNAL bacterianos (e incluso pueden ser mas largos en 1<": RNA de los fagos) o ser muy cortos, en cuyo cas solo uno o dos nucleotidos separan al codon determinacion de una proteina del codon de inicio de L:. siguiente. En un caso extremo, dos genes de hech se superponen, de manera que la ultima base de un: region codificadora tambien es la primera base de !::. siguiente region codificadora.

El numero de ribosomas comprometidos en la =.duccion de un cistron en particular depende de _:_ d iciencia de su sitio de inicio, que para el primer - ~ron esta disponible siempre y cuando se sintetice - extrema 5' del Rl~Am . .:_Como se traducen los cis::- nes subsiguientes? .:_Las numerosas regiones codi. ::.edoras de un RNAm policistronico se traducen de ~a independiente o su expresion esUi conectada? _;:.· mecanismo de iniciacion es el mismo para todos ~ cistrones o es diferente para el primer cistron y -.:.:a los cistrones internos? La traduccion de un RNAm bacteriano proce: de manera secuencial a traves de sus cistrones . .:: _;mdo los ribosomas se adhieren a la primer a re- :1 codificadora, las subsiguientes aun no han sido ~::1scritas. Para cuando el segu ndo sitio ribosomico ~~ disponible, la traduccion esta muy avanzada a .=.·:es del primer cistron . En general, los ribosomas :_-:uinan Ia traduccion a! final del primer cistron (y : disocian en subunidades), y un ribosoma nuevo = ~ns-ambla de manera independiente al principia ::- .a siguiente region codificadora. (El proceso de -::....::acion se describe en el Capitulo 8, Sintesis pro-_-:_ica.)

El RNAm eucari6tico es modificado durante su transcripci6n 0 despues de esta ::•ceptos principales ~ transcrito de RNAm eucari6tico es modificado en el -.:ideo durante o poco despues de su transcripci6n.

2s modificaciones incluyen la adici6n de un casquete -etilado en el extrema 5' y una secuencia de poli(A) -=- el extrema 3'. :_ RNAm no es exportado del nucleo al citoplasma -:sta que todas las modificaciones estan completas.

- ~o duccion

del RNAm eucariotico involucra a eta pas posteriores a la transcripcion. La trans- :::on ocurre de la forma usual, iniciando un -- Jito con un extremo 5' trifosfato, pero el extre::;· se genera por division del transcrito, y no por - =.11scripcion determinacion en un sitio determi- · . Las moleculas de RNA que derivan de genes :-~-:u mpidos requieren de corte y empalme para -~ar los intrones, generandose una molecula de -_::n mas peque.fia que contiene una secuencia _:: .::adora intacta. ::: la fiGU A 1. se muestra que ambos extre.iel transcrito son modificados por adiciones _::_·ores de nucleotidos (lo cual implica a siste: e enzimas adicionales). El extremo 5' del RNA .=.u-dificado por la adicion de un "casquete " vir~-

Ellider precede al codon de iniciacion

El remolque sigue al codon de terminacion La distancia intercistr6nica varia de -1 a +40 bases

5'

~~~==~

1Codificaci6n ,_..

lnicio

=~~jcodificaci61

Alto

lnicio

-+-j

3'

Alto

El RNAm bacteria no i ncluye regiones traducidas y no traducidas . Cada region codificadora tiene sus propias seiiales de iniciaci6n y terminaci6n. Un RNAm tipico puede tener numerosas regiones codificadoras.

El RNAm eucari6tico es modificado por la adici6n de un casquete en el extrema 5' y un poli(A) en el 3'.

tualmente tan pronto como aparece. Este remplaza al trifosfato del transcrito inicial con un nucleotido en orientacion inversa (3'-t5 '), "sellando", por lo tanto, el extrema. El extremo 3' es modificado por Ia adicion de una serie de nucleotidos de acido adenflico [acido poliadenflico o poli(A)] inmediatamente despues de su division. Solo una vez concluidos todos los eventos de modificacion y de procesamiento, el RNAm puede ser exportado del nucleo al citoplasma. La demora promedio para salir del citoplasma es de -20 minutos. Una vez que el RNAm ha entrado a! citoplasma, es reconocido por los ribosomas y traducido. En la se muestra que el ciclo vital del RNAm eucariotico es mas prolongado que el bacteriano. La transcripcion en las celulas animales ocurre mas o menos a la misma velocidad que en las bacterias, a -40 nucleotidos por segundo. Muchos genes eucarioticos son grandes, y un gen de 10 000 bp necesita -5 minutos para transcribirse. La transcripcion del RNAm no termina con la liberacion de enzima del DNA, mas bien, la enzima sigue mas alia del final del gen. Una serie coordinada de eventos genera el extremo 3' del RNAm por division y adhiere un fragmento de poli(A) al extremo 3' recien generado . El RNAm eucariotico constituye solo una pequefia porcion del RNA celular total (-3% de Ia masa). La vida media es relativamente corta en las

7.8 El RNAm eucari6tico es modificado durante su transcripci6n o despues de esta

137

<1 min

Empieza Ia transcripci6n: el extremo 5' es modificado

6min

El extremo 3' del RNAm es liberado por division

sustancial en la estabilidad; el RNAm de las celu....... animales es relativamente estable, con una vida r::: _ dia de entre 4 y 24 horas. Los polisomas eucarioticos son razonableme:-. estables. Las modificaciones de ambos extremos .:..RNAm contribuyen a su estabilidad.

Ill

El extremo 5' del RNAm

eucari6tico posee un

cas qu et ~


El extrema 3' es poliadenilado

20min

.,._.,.

ppp _/\,

La transcripcion empieza con un nucleosido trif fatado (casi siempre una purina, A o G). El prirT _ nucleotido retiene a su grupo fosfato 5' y fo n:: el enlace fosfodiester usual de su posicion 3' a 5' del siguiente nucleotido. La secuencia inicial c: transcrito puede representarse como:

"'- AAAAAA

El RNAm es transportado al citoplasma

25min

ppp ....1\.. ~7

~

5'pppAJ GpNpNpNp ...

> 240 min Los ribosomas traducen a! RNAm

Sinopsis: La expresi6n del RNAm en las celulas ani males requiere de transcripci6n, modificaci6n, procesamiento, transporte nucleo-citoplasmico y traducci6n.

Presente en todos los casquetes

I 0 HN" I

1

c

c

Puede ser metilado- NH 2 I en el casquete 1 c

CH 3

I

N

' c. II 'cH c

N

N""' '-C- ~ I II 'l:CH

/

~

2HN 'N...- ......_Nb·

0

6

II

ll

c

o~""'W" ......_N II

c)-

c)-

/

~H2

C

-

N""' '-c..-N

CH 2 -0-P-0-P-0-P-.0-CH .

c)-

I

HC:

II . C.

'w'

Presente en el casquete 1

o CH3

~CH

......_N

/

~

O-P-0-CH

0 Presente en el casquete 2

El casquete bloquea el extrema 5' del RNAm y puede ser metilado en varias posiciones.

levaduras, en las cuales oscila entre l y 60 minutos. En las eucariotas superiores, hay un incremento 138

Un casquete 5' se forma al agregar una G a la base terminal del transcrito a traves de una ligadura 5'-5'. [ :. uno a tres grupos metilo se agregan a la base o ribose de la guanosina terminal nueva.


Sin embargo, cuando el RNAm maduro es tL tado in vitro con enzimas que deben degradarlo enucleotidos individuales, el extrema 5' no origi:-..: el nucleosido trifosfatado esperado, en cambia, co:tiene dos nucleotidos conectados por una ligadu.i': 5'-5' trifosfato, e incluso ostenta grupos metilo. :..: base terminal siempre es una guanina que se agre.- : ala molecula de RNA original despues de la transcripcion. La adicion de Ia G 5' terminal es catalizada p una enzima nuclear, la guanilil transferasa. La rea:. cion tan poco despues de iniciada la transcripci6_ que es imposible detectar mas que rastros del e:\.tremo 5' trifosfato en el RNA nuclear. La reacci6.::. global puede representarse como una condensacic.: entre el GTP y el trifosfato terminal 5' del RNA. P~ lo tanto 5'

5'

Gppp + pppApNpNp ... j_

5'-5' GpppApNpNp ... + pp + p El residua de G nuevo adherido al extrema dt RNA se encuentra en orientacion inversa respe a de los otros nucleotidos. A esta estructura se le denomina casquete, qt:: es un sustrato de muchos eventos de metilacion. E::. la se observa la estructura completa d:c un casquete despues de que se han agregado todc-

~ grupos metilo posibles. Los tipos de casquetes se .::inguen por el numero de metilaciones de este ocurridas: • La primera metilacion ocurre en todas las eucariotas y consiste en Ia adicion de un grupo metilo en la posicion 7 de Ia guanina terminal. Un casquete que posee este grupo metilo unico se conoce como casquete 0. La reaccion procede hasta este punto en las eucariotas unicelulares, y Ia enzima responsable de esta modificacion se denomina guanina- 7- metiltransferasa. • El siguiente paso es agregar otro grupo metilo en la posicion 2' -0 de Ia pen ultima base (que de hecho era Ia prim era base original del transcrito antes de que se hicieran modificaciones), reaccion catalizada por otra enzima, la 2' -0-metil-transferasa. A un casquete condos grupos metilos se le denomina casquete l, que es el tipo predominante en las eucariotas, excepto en los organismos unicelulares. • En una pequefi.a minorfa de eucariotas superiores, a Ia segunda base se agrega otro grupo metilo, pero solo cuando la posicion es ocupada por adenina; Ia reaccion implica la adicion de un grupo metilo en Ia posicion N6 . La enzima responsable actua solo en un sustrato de adenosina que ya tiene el grupo metilo en Ia posicion 2'- 0. • En algunas especies se agrega un grupo metilo a la tercera base del RNAm que cuente con casquete. El sustrato de esta reaccion es el RNAm con casquete l que ya tiene dos grupos metilo. La modificacion de Ia tercera base siempre es una metilacion de una ribosa en Ia posicion 2 ' -0, lo cual da Iugar a! casquete 2. En general, este caso representa menos del 10% a! 15 % de Ia poblacion total con casquete. En una poblacion de RNAm eucarioticos, todas _ ::-wleculas poseen casquete, y Ia proporcion co- -::; ondiente a cada tipo es caracteristica de cada ;2nismo. No se sabe si Ia estructura de una mo-:-..: a especifica de RNAm es invariable o si puede - cr mas de un tipo de casquete. _-\demas de Ia metilacion implicada en el proceso .c i adicion del casquete, solo en el RNArn de las . - 2riotas superiores ocurre una metilacion interna : _aja frecuencia merced a Ia generacion de resi_:;- - deW metiladenina a una frecuencia de aproxi=..;.a.mente una modificacion por cada 1 000 bases. - : ~- una o dos metiladeninas en un RNArn eucario- _ fpico, aunque su presencia no es obligatoria; =..::ws RNAm no tienen ninguna de estas mole-

1111

El extrema 3' esta poliadenilado

Conceptos principales • Despues de La transcripci6n se agrega un fragmento de poli(A) de -200 nucle6tidos a un transcrito nuclear. • El poli(A) esta unido a una prote\na espec\fica (PABP). • El poli(A) estabiliza al RNAm contra la degradaci6n.

El fragmento 3' terminal de residuos de A con frecuencia se describe como cola de poli(A); al RNAm con esta caracterfstica se le denomina poli(A)+. La secuencia de poli(A) no se codifica en el DNA, mas bien se adhiere a! RNA del nucleo despues de Ia transcripcion. La adicion de poli(A) es catalizada por Ia enzima poli(A) polimerasa, que agrega -200 residuos de A al extremo 3' -OH libre del RNAm. El tracto poli(A) del RNA nuclear y del RNAm se relaciona con una protefna, Ia proteina de union al poli(A) (PABP, poly(A)-binding protein) . En muchas eucariotas se encuentran formas relacionadas de esta protefna. Un monomero de Ia PABP de -70 kD se une cada 10 a 20 bases de la cola de poli(A), asf qu e una caracterfstica comun en muchas, o Ia mayoria, de las eucariotas es que el extrema 3' del RNAm esta formado por un fragmento de poli(A) unido a una gran masa protefnica. La adicion del poli(A) es parte de una reaccion en la que el extrema 3' del RNAm es generado y modificado por un complejo de enzimas (vease Ia seccion 26.19, Los extremos 3' de los RNAm se generan por division y poliadenilacion). La union del PABP con el factor de iniciaci6n eiF4G genera un lazo cerrado en el cual los extremos 5' y 3' del RNAm se encuentran sujetos al mismo complejo proteinico (vease Ia Fig. 8.20 de la seccion 8.9, Las eucariotas utilizan un complejo de numerosos factores de iniciacion). La formaci on de este complejo puede ser la causa de algunos de los efectos del poli(A) en las propiedades del RNAm, que suele ser estabilizado por aqu€1. La capacidad del poli(A) de proteger al RNAm contra la degradacion implica Ia union con Ia PABP. La eliminacion del poli(A) inhibe el inicio de Ia traducci6n in vitro, en tanto que el agotamiento de Ia PABP en las levaduras in vivo tiene el mismo efecto, desenlaces que podrfan depender de Ia union de Ia PABP con el complejo de iniciacion en el extremo 5' del RNAm. En el desarrollo embrionario temprano hay muchos ejemplos de ello, en los cuales Ia poliadenilacion de un RNAm especffico esta correlacionada con su traduccion. En algunos casas, los RNAm se almacenan en forma de no poliadenilada y se agrega un poli(A) cuando es necesaria su 7.10 El extrema 3' esta poliadenilado

139

La mayor parte de Ia poblaci6n de RNA es RNAr que carece de poli(A)

El RNAm con poli(A) representa una pequena porci6n de RNA ~AAA

~~~A

Sefarosa - ' oligo(dT) -AAA- El RNA poli(A( -=AAA se pega a Ia - AAA columna

El RNAr fluye a !raves de Ia columna Q El RNA poli(A)+ puede separase de otros RNA por fraccionamiento en sefarosa-oligo(dT).

traduccion; en otros, los RNAm poli(A)+ son desadenilados y se reduce su traduccion. La presencia del poli(A) tiene una aplicacion practica importante. La region poli(A) del RNAm puede aparearse con un oligo(U) o con un oligo(dT), reaccion que puede servir para aislar el RNAm poli(Aj+. La tecnica mas conveniente es inmovilizar el oligo (U o dT) en un soporte solido y posteriormente, cuando se aplica una poblacion de RNA a la columna, como se ilustra en la f 1 , solo se retiene el RNA poli(A) +. El RNA puede liberarse tratando a Ia columna con una solucion que rompa los enlaces. El unico inconveniente de este procedimiento es que afsla todo el RNA que contiene poli(A). Por ejemplo, si se utiliza el RNA de toda Ia celula, los RNA poli(A) + nuclear y citoplasmico seran retenidos, pero si se utilizan preparaciones de polisomas (un procedimiento comun), Ia mayoria de los RNA poli(A) +seran RNAm activos. Sin embargo, ademas del RNAm en los polisomas, en el citosol que contiene RNAm poli(A)+ tambien hay partfculas ribonucleoproteinicas que nose traducen. Este RNA puede ser "almacenado" para usarse en otra ocasion, de modo que el aislamiento del RNAm poli(A)+ total no corresponde exactamente a la poblacion del RNAm activo. El metoda de "clonacion" para purificar el RNAm consiste en copiarlo para formar una cadena de DNA complementario (conocido como DNAc, complementmy DNA) que posteriormente podra utilizarse como molde para sintetizar una cadena de DNA identica a Ia secuencia del RNAm original. El producto de estas reacciones es un DNA de doble 140


cadena que corresponde ala secuencia del RNArr. que puede reproducirse en grandes cantidades. La disponibilidad de un DNA clonado facik~ el aislamiento del RNAm correspondiente por m dio de tecnicas de hibridacion, incluso las molec las de RNAm cuyas capias por celula se presenta en cantidades reducidas pueden aislarse median:este metoda. De hecho, solo los RNAm presentes ecantidades relativamente grandes pueden aislar~: directamente, sin necesidad de la clonacion . Casi todos los RNAm celulares poseen poli(A pero una excepcion que debe tomarse en cuen: ~ son los RNAm que codifican a las proteinas de 1 histonas (componente estructural importante dematerial cromosomico). Estos RNAm comprendea Ia mayorfa, si no es que a toda, de la fracci · poli(Af. El significado de Ia ausencia de poli(;._ en el RNAm de las histonas no ha sido definid y no hay un aspecto particular de su funcion que: justifique dicha ausencia.

liD La degradaci6n del RNAm bacteriano involucra a multiples enzimas Conceptos principales • La direcci6n global de la degradaci6n del RNAm bacteria no es de 5'---73'. • La degradaci6n es resultado de la combinaci6n de divisiones endonucleollticas seguidas de la degradaci6n exonucleol\tica del fragmento de 3'---75'.

El RNAm bacteriano es constantemente degradad por una combinacion de endonucleasas y exonucleasas. Las endonucleasas dividen a un RNA en u sitio interno, en tanto que las exonucleasas estar. implicadas en reacciones de recorte en las cuale_ los residuos adicionales son retirados, base por base desde el extrema. Las exonucleasas bacterianas que actuan en moleculas de RNA de cadena individua_ proceden a lo largo de la cadena de acido nucleic a partir del extrema 3'. La manera en que dos tipos de enzimas trabajar: en conjunto para degradar al RNAm se muestra er; la . La degradacion de un RNAm bacteriano se inicia con un ataque endonucleolftico, por el que pueden generarse numerosos extremos 3 mediante divisiones endonucleolfticas del RNAm. La direccion global de Ia degradacion (medida por Ia perdida de la capacidad de sintetizar proteinas ) es 5'---73', lo cual quiza se deriva de una sucesion de divisiones endonucleoliticas qu e siguen al ultimo ribosoma. Mas adelante, la degradacion de los fragmentos liberados de RNAm a nucleotido

: debe al ataque exonucleolftico del extremo libre -OH hacia el extremo 5' (en direccion opuesta a :ranscripcion). El ataque endonucleolftico Iibera :.gmentos con diferente susceptibilidad a las exoleasas. Una region de la estructura secundaria ::: RNAm puede ser un obstaculo para la exonu::asa, de manera que se protegen las regiones lo' ·zadas en su !ado 5'. Por lo tanto, Ia estabilidad : cada RNAm depende de !a susceptibilidad de su : :uencia especffica a las divisiones tanto endonu:: lfticas como exonucleoliticas. En E. coli se han encontrado -12 ribonuclea~~- Los mutantes carentes de endorribonucleasas : :cepto Ia ribonucleasa I, cuya carencia no tiene · .gun efecto) acumulan precursores no procesados :: RNAr y RNAt, pero son viables . En el caso de · mutantes que carecen de exonucleasas, con fre..:cncia sus fenotipos aparentemente no han sufrido :craciones, lo cual sugiere que una enzima puede .plir la ausencia de otra. Los mutantes que carecen -: •arias enzimas en ocasiones no son viables. La RNAasa E es la enzima clave para iniciar la ··ision del RNAm, y podrfa ser la que hace la pri_-:ra division de numerosos RNAm. En los mutan~ · bacterianos cuya ribonucleasa E esta defectuosa, ~ estabilidad del RNAm es mayor (de dos a tres :: :es), pero noes esa su unica funcion. La RNAasa :=: ;e descubri6 originalmente como !a enzima cau-::ie del procesamiento 5' del RNAr del transcrito ~mario por un evento especffico de procesamiento --. :Ionucleolftico. El proceso de degradaci6n puede ser catalizapor un complejo multienzimatico (en ocasiones ' 1ado degradosoma) que incluye ribonucleasa : ?)J"Pasa (polinucle6tido fosforilasa) y helicasa. La - ·.-\.asa E tiene funciones duales. Su domi.nio termi, . )T proporciona una actividad de endonucleasa, :anto que el terminal C constituye un andamio -: mantiene unidos a los otros componentes. La ::.:casa desenrolla el sustrato de RNA para que este onible para Ia PNPasa. De acuerdo con este mo:. , Ia RN Aasa E realiza el corte inicial y posterior~~te pasa los fragmentos a los on·os componentes _. omplejo para que sean procesados. Fodria ser que la poliadenilaci6n estuviera rela. :1ada con el inicio de la degradacion de algunas :eculas de RNAm en las bacterias. En E. coli, la :: A) polimerasa esta asociada con los ribosomas :: agregan fragmentos cortos (de l 0 a 40 nucle6- s) de poli(A) cuando menos a algunos RNAm. - c mutaciones triples que eliminan la poli(A) po- erasa, la ribonucleasa E y Ia polinucleotido fos:-·asa (PNPasa, una exonucleasa 3' -5' ) ejercen un :: -:o contundente en la estabilidad. (El efecto de ::mtaciones en genes individuales o en pares de --cs es apenas perceptible.) La poli(A) polimerasa

Traducci6n

I ""- 3'

5 ' . /'

Endonucleasa

!

~ ~ ~ r__r::_

RNAasa E Exonucleasa

La degradaci6n del RNAm bacteria no tiene Lugar en un proceso de dos etapas. Las divisiones endonucleol\ticas proceden en direcci6n 5' -3', detras de los ribosomas. Los fragmentos liberados son degradados par exonucleasas que avanzan en direcci6n 3'-5'.

puede crear una cola de poli(A) que funge como sitio de union para las nucleasas, asf que su funci6n en las bacterias serfa diferente a su funcion en las celulas eucari6ticas.

liB

La estabilidad del RNAm depende de su estructura y su secuencia

Conceptos principales • Las modificaciones de ambos extremos del RNAm La protegen contra La degradaci6n mediada par Las exonucleasas. • Las secuencias espec\ficas de un RNAm pueden producir efectos estabilizadores o desestabilizadores. • La desestabilizaci6n puede ser activada par la perdida de poli(A).

Las caracterfsticas principales del RNAm relacionadas con su estabilidad se resumen en la . Tanto la estructura como la secuencia son importantes. Las estructuras terminales 5' y 3' protegen contra

7.12 La estabilidad del RNAm depende de su estructura y su secuencia

141

El casquete protege contra Ia exonucleasa 5'-3'

Los codones sin sentido activan el sistema de vigilancia

La endonucleasa ataca a Ia secuencia desestabilizadora

UAA UAG UGA

15'

5' UTR

El poli(A) protege contra Ia exonucleasa 3'-5'

xxxx ~,I

Region codificadora

3' UTR

Las modificaciones de los extremos del RNAm lo protegen contra la degradacion. Secuencias internas pueden activar a los sistemas de degradacion.

Protefna de union a Ia secuencia ARE

Poli(A) ribonucleasa

l Una ARE en una region no traducida 3' inicia la degradacion del RNAm.

La protefna de union aiiRE se une aiiRE en ausencia de hierro

(A)~ La protefna de union aiiRE se disocia en presencia de hierro

(A)n

Un IRE localizado en la region no traducida 3' controla la estabilidad del RNAm.

la degradacion, y secuencias especfficas del RNAm pueden funcionar como ctianas para desencadenar la degradacion 0 conferir proteccion contra esta: • Las modificaciones de los extremos 5' y 3' del RNAm tien en funciones importantes en Ia prevencion del ataque de las exonuclea142


sas, de modo que el casquete evita qv: exonucleasas 5'- 3' ataquen el extrem y el poli(A) que las exonucleasas 3'-5 ' ~ quen el extremo 3'. • Los elementos espedficos de Ia secue:.del RNAm pueden estabilizarlo o des _ bilizarlo. La localizacion mas comun de elementos desestabilizadores se encue- en la region no traducida 3'. La presen :~ dicho elemento acorta la vida del RNA::::• En Ia region codificadora, las mutacione· crean codones de terminacion activar. sistema de vigilancia que degrada a! Ri' \_(vease Ia seccion 7 .14, Las mutaciones sentido activan un sistema de vigilancia En numerosas moleculas de RNAm de las k duras se han encontrado elementos desestabiliza: res, aunqu e todavfa no se han observado secu cias comunes o no se sabe como desestabiliza;:: RNAm. No necesariamente actuan de forma dire ~ (proporcionando dianas para las endonuclease _ pero pueden funcionar de manera indirecta, q ~ fomentando Ia desadenilacion. El criterio para ~= finir a un elemento desestabilizador de secue1: es que su introduccion en un RNAm nuevo pue _ provocar su degradacion, si bien Ia eliminacion ~ un elemento de un RNAm no necesariamente lo tabiliza, lo cual sugiere que cada uno de ellos pu tener mas de un elemento desestabilizador. Una caracterfstica comun de algunas mole.c de RNAm inestables es una secuencia rica en AC : -50 bases (denominada ARE ) en Ia region rem · que 3'. La secuencia de consenso de Ia ARE es _ pentanucle6tido AUUUA, repetido varias veces. :=: Ia se muestra que la ARE desencadela desestabilizacion por un proceso en dos etapc.. primero es desadenilado el RNAm y posteriormen:. se degrada. La desadenilacion podrfa ser necesar:. porque da Iugar a Ia perdida de Ia protefna de uni ' al poli(A), cuya presencia estabiliza a Ia region ~ (vease Ia seccion 7 .13, La degradacion del RNA=. involucra multiples actividades). En algunos casos, un RNAm puede ser estab~ lizado a! inhibir espedficamente la funcion de u:elemento desestabilizador. El RNAm de la transferrina contiene una secuencia denominada elemem de respuesta al hierro (IRE, iron-responsive elemen: que controla Ia respuesta del RNAm a los cambio: de concentracion del mismo y que se localiza e la region 3' no traducida, ademas de que contiene estructuras tallo-lazo que se unen a protefnas cuyc afinidad por el RNAm se controla por medio de_ hierro. En Ia se muestra que Ia union de Ia protefna con el IRE estabiliza al RNAm al inhibt la funcion de secuencias desestabilizadoras cercana_ (no identificadas). Este es un modelo general de lc

~ :abilizaci6n

del RNAm, es decir, la estabilidad es : _!lferida par la inhibici6n de la funci6n de secuen-::.:::s desestabilizadaras. La eliminaci6n del casquete y Ia degradaci6n ~J rren en complejos protemicos grandes localiza. ::s como unidades citoplasmicas discretas denomi- o. :las cuerpos- P, en los cuales pueden localizarse -:-as enzimas implicadas en la producci6n o el mec: _"lO]ismo del RNAm. De hecho, dichos cuerpos pue- ~:t secuestrar a cualquier molecula de RNAm que - este involucrada activamente en la traducci6n.

Casquete I

l

Ccr4 D1

La degradaci6n del RNA m im plica multiples actividades :::-nceptos principales Para La degradaci6n del RNAm de las levaduras se requiere de la eliminaci6n del casquete 5' y del poli(A) 3'. U11a ruta de las levaduras implica la degradaci6n exonucleolitica en direcci6n 5' ~3'. Otra ruta de las levaduras utiliza un complejo de numerosas exonucleasas que funcionan en direcci6n 3'~5'.

La desadenilasa de las celulas animales puede unirse directamente con el casquete 5'.

~

::: ia degradaci6n del RNAm de las levaduras es de ~ u e mas se sabe. Basicamente hay dos rutas que :--:·_piezan con Ia eliminaci6n de Ia cola de poli(A), _.; :racci6n catalizada por una desadenilasa especf=~ que probablemente funciona como parte de un ~1p]ejo protefnico vasto. (La subunidad catalftica : :a exonucleasa Ccr4 en las levaduras, asf como .:. ::xonucleasa PARN en los vertebrados, que esta · :.~cionada con Ia RNAasa D.) La acci6n enzimatica · _rogresiva, una vez que ha empezado a degradar -~ sustrato especifico de RNAm, sigue desensam=--• dolo, base por base. La ruta de degradaci6n principal se resume en Ia . La desadenilaci6n del extremo 3' activa .:lrninaci6n del casquete del extremo 5'. La base __ ta relaci6n es que Ia presencia de Ia PABP (pro-::-.B. de union a poli(A)) en el poli(A) impide que la - -::ma responsable de la eliminaci6n del casquete .:- _:ta a! extremo 5'. La PABP se Iibera cuando la ::: ; irud del poli(A) esta por debajo de 10 a 15 resi- ~ s . La eliminaci6n del casquete ocurre al separar : ::se metilada del extremo 5' para dejar un mono: .u o en la reacci6n: m 7 GpppX ... ~m 7 GDP + pX ... ~ ::nzima requiere del grupo 7-metilo. Cada extremo del RNAm influye en los eventos _: ocurren en el otro extremo, lo cual se explica ~ .;u e ambos extremos del RNAm se mantienen

Desadenilaci6n

XRN1

l

Eliminaci6n del casquete

l

Degradaci6n 5'-3'

.

La desadenilaci6n permite la eliminaci6n del casquete, lo cual provoca la division endonucleolitica a partir del extremo 5'.

unidos par los factores implicados en la sintesis proteinica (vease la secci6n 8.9, Las eucariotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciaci6n). El efecto de la PABP en la eliminaci6n del casquete permite que el extremo 3' incida en la estabilizaci6n del extremo 5'. Asimismo, hay una conexi6n entre la estructura del extremo 5' y ladegradaci6n del extremo 3'. La desadenilasa se une directamente al casquete 5', interacci6n necesaria para su ataque exonucleolitico contra el poli(A). ;_, Cual es el fundamento de la conexi on entre los eventos que ocurren en ambos extremos de una molecula de RNAm? Quiza sea necesario asegurarse de que el RNAm no permanezca en un estado (teniendo Ia estructura de un extremo, pero no Ia del otro) que pueda competir con el RNAm activo par las proteinas que se unen a los extremos. La eliminaci6n del casquete activa Ia ruta de degradaci6n 5'- 3', en Ia cual el RNAm es degradado rapidamente a partir del extremo 5' mediante la exonucleasa 5'- 3' XRNl. La enzima responsable de la eliminaci6n del casquete se concentra en loci citoplasmicos discretos, los cuales pueden ser "cuerpos de procesamiento" en que el RNAm es desadenilado y posteriormente degradado, despues de eliminarse el casquete. Enla segunda ruta, las moleculas de RNAm desadeniladas de las levaduras pueden ser degradadas porIa actividad 3'- 5' de Ia exonucleasa del exosoma, un complejo de >9 exonucleasas. El exosoma tambien participa en el procesamiento de precursares de moleculas de RNAr. La adici6n de las exonucleasas individuales al complejo del exosoma puede des7.13 La degradaci6n del RNAm implica multiples actividades

143

1111 Desadenilaci6n



Degradaci6n endonucleolftica

• Las mutaciones sin sentido provocan la degradacion del RNAm. • En las levaduras y los gusanos se han encontrado genes que codifican al sistema de degradaci6n.

Degradaci6n exonucleolitica 5'-3'

• La desadenilacion puede provocar directamente la division endonucleolltica y la division exonucleolitica desde los extremos 3'.

Traducci6n ...,.

s· rvvV

tr~ v

\J\/'\A 3'

Una mutaci6n sin sentido activa Ia degradaci6n Traducci6n __,.

s· .rvvv

r-~

~ 3'

Terminaci6n prematura /

t

Se inicia Ia degradaci6n

J Las mutacio nes sin sentido pueden provocar La degradacion del RNAm.

encadenar las actividades exonucleolfticas 3'- 5' para que sean controladas coordinadamente. De igual forma, el exosoma puede degradar a fragmentos de RNAm liberados por division endonucleolitica. En Ia .1 se muestra que la ruta de degradaci6n 3'-5' puede de hecho implicar combinaciones de actividad endonucleolftica y exonucleolftica. El exosoma tambien se encuentra en el nucleo, donde degrada a precursores de RNAm no empalmados. Los mutantes de levaduras que carecen de cualquiera de las rutas exonucleolfticas degradan a su RNAm mas lentamente, pero la perdida de ambas rutas es leta!. 144


Otra ruta de degradaci6n se identifica por la degradaci6n del RNAm mediada por mutaciones sin sentido. En la f se observa que Ia introducci6n de una mutaci6n sin sentido cor. frecuencia incrementa Ia degradaci6n del RNAm Como puede esperarse de la dependencia de ILU : codon de terminaci6n, Ia degradaci6n ocurre er: el citoplasma, y podrfa representar un control de calidad o un sistema de vigilancia para elimina ~ moleculas de RNAm no funcionales. El sistema de vigilancia ha sido mejor estudiad en las levaduras yen C. elegans, pero tambien puede ser importante en las celulas animates. Por ejemplo, durante Ia formaci6n de inmunoglobulinas \. de receptores de celulas Ten las celulas del sistem.o inmunol6gico, los genes son modificados por recombinaci6n somatica y mutaci6n (vease el Cap. 23 La diversidad inmunitaria). suceso que genera UJ: numero significativo de genes no funcionales cuyos productos de RNA son eliminados por un sistemc. de vigilancia. En las levaduras, la degradaci6n requiere d elementos de secuencia (denominados DSE) de fluj descendente a partir de Ia mutaci6n sin sentido. La posibilidad mas sencilla serfa que se trata de elementos desestabilizadores y que Ia traducci6n suprime su uso. Sin embargo, cuando se bloquea lo. traducci6n, el RNAm se estabiliza, lo cual sugiere que el proceso de degradaci6n esta vinculado de alguna forma directa con la traducci6n del RNArr: o con el evento de terminaci6n. los genes necesarios para el proceso han sido identificados en S. cerevisiae (loci upj) y en C. elegans (loci smg) mediante Ia detecci6n de supresores de degradaci6n mediada por mutaciones sin sentido. Las mutaciones de estos genes estabilizan o. las moleculas aberrantes de RNAm, pero no afectan la estabilidad de Ia mayoria de los transcritos de tipo silvestre. Uno de estos genes se conserva en las eucariotas (upfllsmg2) y codifica a una helicasa dependiente de ATP (enzima que desenrolla los acidos nucleicos de doble cadena para formar cadenas individuales). Esto implica que el reconocimiento del RNAm como objetivo apropiado para Ia degradaci6n requiere de un cambia de estructura.

El gen Upfl interactua con los factores de libe:. 2 'n (eRFl y eRF3) que catalizan Ia terminaci6n,

es probablemente Ia forma en que reconoce el : 7nto de terminaci6n. Posteriormente puede "es- ::._n 6ar" al RNAm desplazandose bacia el extrema ;tara buscar los elementos de secuencia de flujo __ ::endente. En las celulas de los mamfferos, el sistema de ;:.:ancia parece operar s6lo en mutaciones locali- .:as antes del ultimo ex6n, es decir, debe haber - :ntr6n despues del sitio de la mutaci6n, lo cual _pere que el sistema requiere de un evento en el - _:leo antes de que los intrones sean eliminados :- corte y empalme. Una posibilidad es que las · _:efnas se adhieren al RNAm en el nucleo, en Ia - :Hera ex6n-ex6n cuando ocurre un evento de ~e y empalme. En Ia se muestra un - · je]o general de Ia operaci6n de dicho sistema. :..:~ c mecanismo es similar a la forma en que un _ -_-\.In puede ser marcado para exportarlo desde el -_..:leo (vease la secci6n 26.1 0, El corte y empalme -"':i conectado con la exportaci6n del RNAm) . La :... ::ion de una protefna ala union ex6n-ex6n crea ~ marca del evento que persiste en el citoplasma. _. =b om6logos humanos de las protefnas Upf2,3 de .-:-vadura podrfan estar implicados en dicho siste- c pues se unen especificamente a! RNAm que ha :. '-' cortado y empalmado.

Las moleculas de RNA eucari6tico se transportan

Ex6n

lntr6n

Ex6n

-~

=~~---

Corte y empalme

~

La protefna se une a Ia union ex6n-ex6n

NUCLEO

r----------· t --------~ CITOPLASMA

.-

Se unen mas protefnas

La terminaci6n prematura desencadenala '---d_e~ gradaci6n

-~ Un sistema de vigilancia podria tener dos tipos de componentes. Las proteinas deben unirse en el nucleo para marcar el resultado de un evento de corte y empalme, en tanto que otras pueden unirse a la marca, ya sea en el nucleo o en el citoplasma. Estas se activan para degradar al RNAm cuando los ribosomas terminan prematuramente.

RNA

Trans porte

Localizaci6n

Todo el RNA

Nucleo ....., citoplasma

Todas las celulas

:l RNA es transportado a traves de una membrana a ;na nera de particulas ribonucleoprote\nicas.

RNAt

Nucleo ....., mitocondria

Muchas celulas

-odas las moleculas de RNA eucari6tico que funcionan en el citoplasma deben exportarse desde el nucleo.

RNAm

Celula nodriza ....., ovocito

Genesis embrionaria de Ia mosca

RNAm

Ovocito anterior ....., ovocito Genesis embrionaria posterior de Ia mosca

RNAm

Celula ....., celula

::1ceptos principales

a.

... ..,

~,.__

• t.a s moleculas de RNAt y el componente de RNA je una ribonucleasa se importan al interior de las ;nitocondrias. ..as moleculas de RNAm pueden recorrer grandes jistan6as entre las celulas de las plantas.

..

---

Floema de las plantas

Las moleculas de RNA se transportan a traves de membranas en diversos sistemas.

~

bacterias estan formadas por un solo comparti_ Ento, de modo que todos los RNA funcionan en =Usmo ambiente en el cual son sintetizados, lo -~: es particularmente sorprendente en el caso del _ -_-\m, en cuyo caso, Ia traducci6n es simultanea a =:-anscripci6n (vease la secci6n 7. 7, El ciclo vital : . RNA mensajero bacteriano). El RNA se transp orta a traves de las membra~ en los diversos ejemplos resumidos en Ia . Transportar una molecula de RNA altamente ::" 3tiva a traves de una membrana hidr6foba cons-

tituye un problema termodinamico que se soluciona transportandola empaquetada en protefnas. En las celulas eucari6ticas, los RNA se transcriben en el nucleo, pero Ia traducci6n ocurre en el citoplasma. Los diferentes tipos de RNA deben transportarse en el citoplasma para ensamblar el mecanismo necesario para Ia traducci6n. As!, el RNAr se ensambla con las protefnas ribos6micas para formar subunidades ribos6micas inmaduras que constituyen los sustratos para el sistema de 7.15 Las moleculas de RNA eucari6tico se transportan

145

transporte; el RNAt es transportado por un sistema de proteinas especifico; el RNAm es transportado como una ribonucleoproteina, la cual se forma en el transcrito de RNA en el nilcleo (vease el Cap. 26, Corte, empalme y procesamiento del RNA). Estos procesos son comunes en todas las celulas eucarioticas. Muchos RNAm se traducen en el citosol, si bien algunos se localizan en el interior de la celula porque se adhieren a un elemento del citoesqueleto. En situaciones en que hay localizacion, es importante que el producto proteinico sea producido cerca del sitio de su incorporacion a alguna estructura macromolecular. Algunas moh~c ulas de RNA se forman en el nilcleo, se exportan al citosol y posteriormente se importan al interior de las rnitoconcirias, que en algunos organismos no codifican a todos los RNAt necesarios para la sfntesis de proteinas (vease la seccion 4.1 0, Los genomas de los organelos son moleculas circulares de DNA que codifican a proteinas de los organelos). En estos casos, los RNAt adicionales deben importarse desde el citosol. La enzima ribonucleasa P, que contiene RNA y subunidades protefnicas, es codificada por genes nucleares, no obstante que se encuentra tanto en las rnitocondrias como en el nilcleo, lo cual significa que el RNA debe ser importado al interior de la mitocondria. Se sabe de algunas situaciones en que el RNAm es transportado incluso entre celulas. Durante el desarrollo del ovocito en Drosophila, ciertas moleculas de RNAm son transportadas al interior del ovulo desde las celulas nodrizas que lo rodean, dado que estas illtimas tienen uniones especializadas con el ovocito que permiten el paso del material necesario para el desarrollo inicial. Este material incluye ciertos RNAm, que una vez dentro del ovulo, asumen localizaciones especfficas. Algunos sencillamente se difunden en el extrema anterior por el que entran, pero otros recorren todo el ovulo, hasta el extrema posterior, mediante un motor adherido a microtilbulos. El caso mas asombroso de transporte del RNAm es el de las plantas. El movimiento de acidos nucleicos especificos por distancias largas se descubrio por primera vez en las plantas, en las cuales, las protefnas de movimiento vfrico propagan la infeccion vfrica transportando el genoma de un virus de RNA a naves de los plasmodesmas (conexi ones entre las celulas). Por otra parte, las plantas tienen un sistema de defensa que hace que las celulas silencien a un virus infeccioso, el cual, de igual manera, puede implicar la dispersion de componentes, incluido al RNA, a grandes distancias entre las celulas. Ahora se ha descubierto que las mol eculas de RNAm pueden ser transportadas por sistemas similares entre las celulas de las plantas. Aunque la existencia del sistema 146


se conoce desde hace tiempo, solo recientemen~ se demostro su importancia funcional al injen.:: plantas de tomate de tipo silvestre en plantas c la mutacion dominante Me (que provoca cambi_ en la forma de la hoja) . El RNAm de la reserva mutantes se transporto al interior de las hojas ci _ injerto de tipo silvestre, donde cambio su forma.

liD

El RNAm puede localizarse espedficamente

Conceptos principales • El RNAm del Ashl de la levadura fo rma una ribonucleoproteina que se une a un motor de miosina. • Un motor lo transporta a lo largo de los filamentos de actina en el brote germinal. • Se ancla y se traduce en el brote, de manera que la proteina se encuentra solo en el brote.

En una celula eucariotica, un RNAm se sintetiza el nucleo pero se traduce en el citoplasma; ent~~ en el citoplasma como una partfcula ribonucleoprcteinica que se transporta a naves de un poro n clear. Una vez en el citosol, el RNAm puede ascciarse con los ribosomas y ser traducido. El citost esta atestado, lo ocupa una alta concentracion ": protefnas. Nose sabe bien que tan libremente puec~ difundirse un polisoma en el citosol, y la mayor pa ~ te de las moleculas de RNAm se traducen probablemente en locaciones aleatorias, determinadas p su punto de entrada al citosol y por la distancia qt:-: han recorrido hasta alejarse de el, aunque algunse traducen en sitios especfficos mediante diversomecanismos: • Un RNAm puede ser transportado especif camente a un sitio en el cual se traduce. • Puede estar distribuido universalmente per: se degrada en todos lo sitios, excepto en e_ de traduccion. • Puede difundirse libremente, pero qued:: atrapado en el sitio de traduccion. Uno de los casos mejor caracterizados de localizacion dentro de una celula es el del Ashl de !a· levaduras, que reprime la expresion de la endonucleasa HO en la celula hija que brota, asf que el HO ~ expresa solo en Ia celula madre. La consecuencia : que el tipo de apareamiento cambia solo en la celulc madre (vease la seccion 19.24, La regulacion de lc. expresion de HO controla el cambia). La causa de lc. restriccion en la celula hija es que el RNAm del Ash: es transportado a partir de la celula madre, donde Se produce, al interior de la celula hija que brota. Las mutaciones en cualquiera de los cinco genes conocidos como SHE 1-5 impiden la localizaci6 _

Citoplasma materna estructuras tallo-lazo en el RNAm La She3 conecta a Ia She2 con Ia miosina La She1 se une al

Filamento de actina

El RNAm del Ashl forma una ribonucleoproteina :nntiene un motor de miosina que se desplaza por un --=nto de actina. ~

~ ::dfica y hacen que el RNAm del Ash 1 se distri__~ simetricamente en los compartimientos tanto :.c. madre como de la hija. Las protefnas She1, 3 se unen al RNAm del Ash1 en una partfcu__,-:>onucleoprotefnica que transporta al RNAm al :::ior de la celula hija. En Ia se mues-- las funciones de las protefnas. She 1p es una _:tna (identificada previamente como Myo4), en que She3 y She2 son proteinas que conectan ....,'osina con el RNAm. La miosina es un motor . :: :nueve al RNAm a lo largo de los filamentos : ~.:tina. .=n ]a se resume el proceso completo. ? -Am del Ash1 es exportado del nucleo en for~e ribonucleoprotefna yen el citoplasma se une -~e ro a Ia She2, que detecta algunas estructuras ::- darias tallo-lazo en el RNAm. Posteriormente, : ::e3 se une a la She2, despues de lo cual se les - :c ~a miosina She 1. A continuacion, la partfcula se :o~::1cha a un filamento de actina y se transporta - ..: el brote. Cuando el RNAm del Ashl llega al ~ :.-. se ancla ahi, quiza por medio de protefnas - _e unen especfficamente a! RNAm. J1ros casos en los cuales el RNAm se transporta ..:. s especfficos son regidos por principios simi-- EI RNAm es reconocido mediante secuencias : ::uacion en cis, las cuales suelen ser regiones - _::ructura secundaria de la region no traducida -=~ RNAm del Ash1 es poco comun en el senie que las regiones de actuacion en cis estan :::_ marco codificador.) El RNAm se empaca en - _a.rticula ribonucleoprotefnica, y en ocasiones - ~,: verse en particulas muy grandes denomina: -anulos de RNAm, los cuales son los suficien==--te grandes (muchas veces el tamafio de un : -:na) como para contener numerosas proteinas ~ :iples componentes de RNA.

El RNAm del Ashl se exporta del nucleo al citoplasma, donde es ensamblado a un complejo con las prote\nas She. El complejo lo transporta a lo largo de los filamentos de actina, hasta el brote.

Una RNPm transportada debe conectarse a un motor que la mueve a lo largo de un sistema de vias, que pueden ser filamentos de actina o microtubulos. Mientras que el Ashl utiliza un motor de miosina en las vias de actina, el RNAm de Ia proteina oscar del huevo de Drosophila utiliza un motor de cinesina para moverse a lo largo de microtubulos. Una vez que el RNAm llega a su destino, necesita ser anclado para evitar que se difunda. Poco se sabe al respecto, pero el proceso parece ser independiente del transporte. Un RNAm transportado por microtubulos puede anclarse a filamentos de actina localizados en su destino .

1m

Resumen

La informacion genetica que porta el DNA se expresa en dos etapas, la transcripcion del DNA en RNAm y Ia traduccion del RNAm en una proteina. El RNA mensajero se transcribe de una cadena de DNA complementaria de esta cadena (no codificadora) e identica ala otra cadena (codificadora). La secuencia del RNAm, en codones triples 5'- 3', esta relacionada con la secuencia de aminoacidos de Ia protefna, del grupo terminal N al grupo terminal C. El adaptador que interpreta el significado de un codon es el RNA de transferencia, que tiene una estructura terciaria compacta en forma deL; un extremo del RNAt tiene un anticodon complementario del codon, y el otro extremo puede estar unido de forma covalente al aminoacido especffico que corresponde al codon diana. Un RNAt que porta un aminoacido se denomina aminoacil-RNAt. El ribosoma proporciona el mecanismo que permite que los aminoacil-RJ.'\fAt se unan a sus codones en el RNAm; Ia subunidad grande transporta al polipeptido naciente. Un ribosoma se desplaza a lo largo de un RNAm a partir de un sitio de iniciacion localizado en Ia region 5' hasta un sitio de terminacion ubicado en Ia region 3', y los aminoacil-RNAt 7.17 Resumen

147

apropiados responden a sus codones, descargando a su aminoacido, de tal manera que Ia cadena polipeptfdica creciente aumenta un residuo por cada codon recorrido. El mecanismo de traduccion no es especffico de cada tejido u cada organismo; un RNAm proveniente de una fuente puede ser traducido por los ribosomas y por las moleculas de RNAt de otra fuente. El nC1mero de veces que un RNAm se traduce depende de Ia afinidad de su(s) sitio(s) de iniciacion por los ribosomas y de su estabilidad. En algunos casos se impide especfficamente Ia traduccion de grupos de RNAm o de moleculas de RNAm, evento conocido como control de Ia traduccion. Una molecula tfpica de RNAm contiene un lfder 5' y un remolque 3' no traducidos y regiones codifi.cadoras. El RNAm bacteriano suele ser policistronico, con regiones no traducidas localizadas entre los cistrones. Cada cistron esta representado por una region codificadora que empieza con un sitio de iniciacion especffico y concluye en un sitio de terminacion. Las subunidades ribosomicas se asocian en el sitio de iniciacion y se disocian en el de terminacion de cada region codificadora. Una bacteria E. coli en cultivo tiene -20 000 ribosomas y -200 000 moleculas de RNAt, principalmente en forma de aminoacil-RNAt. Hay -1 500 moleculas de RNAm, que representan ados o tres copias de cada uno de los 600 mensajeros. Un solo RNAm puede ser traducido por numerosos ribosomas de manera simultanea y formar un polirribosoma (o polisoma). Los polisomas bacterianos son grandes y en general estan formados por decenas de ribosomas unidos a un solo RNAm. Los polisomas eucarioticos son mas pequefios, tfpicamente de menos de 10 ribosomas; cada RNAm porta solo una secuencia codificadora. El RNAm bacteriano tiene una vida media extremadamente corta, de solo unos minutos; incluso, el extremo 5' empieza a ser traducido mientras las secuencias en cascada estan siendo transcritas. La degradacion es iniciada por las endonucleasas que realizan cortes en sitios discretos, siguiendo a los ribosomas en direccion 5' -3 ' . Despues, las exonucleasas reducen los fragmentos a nucleotidos, degradandolos a partir del extremo 3' liberado hacia el extremo 5'. Cada secuencia puede promover o retardar Ia degradacion en los RNAm bacterianos. El RNAm eucariotico debe ser procesado en el n(tcleo antes de ser transportado al citoplasma para su traduccion. AI extrema 5' se agrega un casquete metilado constituido por un nucleotido que se agrega al extremo original por un enlace 5' -5', despues del cual se agregan grupos metilo. La mayor parte de las moleculas bacterianas de RNAm tienen una secuencia de -200 bases de poli(A) adheridas a su 148


extremo 3', en el nudeo, despues de Ia transcri~ cion, sin embargo, los RNAm poli(A)- parecen s:traducidos y degradados con Ia misma cinetica q~ · los poli(A)+. El RNAm eucariotico existe como particula ribonucleoproteinica; en algunos case RNPm estan almacenados, por lo que no se trad· cen. Los RNAm eucarioticos suelen ser estables d rante muchas horas y tener varias secuencias q· : inician Ia degradaci6n; hay ejemplos en los cuaL el proceso es regulado. El RNAm de las levaduras es degradado cua:-do menos por dos rutas que empiezan con Ia e: minaci6n del poli(A) del extremo 3', provocando ...: perdida de Ia protefna de union al poli(A), lo cua: su vez conduce a Ia eliminaci6n del casquete me:.lado del extremo 5' . Una ruta degrada al RNAm c partir del extremo 5' por medio de una exonuclea ' y Ia otra degrada al RNAm desde el extremo 3', a trc.ves del exosoma, complejo que contiene numeros= exonucleasas. La degradacion mediada por mutaciones s' sentido provoca Ia destruccion de las moleculas c. RNAm que tienen un codon de terminaci6n (s:..: sentido) antes del ultimo ex6n; para el proceso .:necesitan los loci upf de las levaduras y los loci s11 _ de los gusanos, sitios que incluyen la actividad ·Ia helicasa para desenrollar el RNAm y una prote_na que interactua con los factores que terminan sintesis proteinica. Las caracteristicas del proceso las celulas de los mamfferos sugieren que algunde las protefnas se adhieren al RNAm en el nud e al momento del corte y empalme del RNA parae~ minar a los intrones. Los RNAm pueden ser transportados a loca:..zaciones especfficas dentro de una celula (especic4men te en el desarrollo embrionario). En el sisteiL Ash1 de las levaduras, el RNAm es transportaG. de Ia celula madre al interior de Ia celula hija pe>medio de un motor de miosina que se desplaza s bre filamentos de actina. En las plantas, los RNA-= pueden ser transportados grandes distancias entr ~ las celulas .

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El RNA de transferencia forma una hoja de trebol

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IIIII

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intesis proteinica ESQUEMA DEL CAPITULO Introducci6n La s1ntesis prote1nica ocurre por iniciaci6n, elongaci6n y terminaci6n • • • • •

e.

El ribosoma tiene tres sitios de union al RNAt. Un aminoacil-RNAt entra al sitio A. El peptidil-RNAt esta unido al sitio P. El RNAt desacilado sale a traves del sitio E. Al transferir el polipeptido del peptidil-RNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A, se agrega un aminoacido a la cadena polipeptidica.

La precision de la s1ntesis prote1nica es controlada por mecanismos especiales

I(;Jtl

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Un RNAt iniciador especial empieza la cadena polipept1dica

por el ribosoma • El IF-2 se une al fMet-RNAtf iniciador y le permite entrar al sitio P parcial de la subunidad 30S.

La iniciaci6n implica el apareamiento de bases entre el RNAm y el RNAr • Un sitio de iniciaci on del RNAm bacteriano esta formado por el codon de iniciaci6n AUG precedido de un espacio de -10 bases que contiene el hexa mero de po lipurina ShineDalgarno.

Las eucariotas utilizan un complejo formado por numerosos facto res de i niciaci6n • los factores de iniciacion son necesarios en todas las etapas de esta, incluida la union del RNAt iniciador, la union de las subunidades 405 al RNAm, el desplazamiento a lo largo del RNAm y la union de la subunidad 605. • El RNAt iniciador eucariotico es un Met-RNAt diferente del utilizado en la elongacion, pero la metionina no esta formilada. • El eiF2 une al Met-RNAt; iniciador con el GTP y el complejo se une a la subunidad 405 antes de que se asocie con el RNAm.

La iniciaci6n en las bacterias requiere de subunidades 305 y de factores rios

• La sintesis proteinica empieza con una metionina usualmente codificada por el triplete AUG. • los diferentes RNAt de metionina estan implicados en la iniciacion y la elongaci6n. • El RNAt iniciador tiene caracteristicas estructurales (micas que lo di stinguen del resto de los RNAt. • El grupo NH , de la metionina unida al RNAt iniciador bacteriano esta formilado. El uso del fMet-RNAtr es controlado por el IF-2 y

Las subunidades pequeiias buscan sitios de iniciaci6n en el RNAm eucari6tico • Las subunidades ribos6micas 40S se unen al extrema 5' del RNAm y exploran al RNAm hasta que llegan a un sitio de iniciacion. • Un sitio de iniciacion eucariotico esta formado por una secuencia de 10 nucleotidos que incluye un codon AUG. • las subunidades ribosomicas 60S se unen al complejo en el sitio de iniciacion.

• La precision de la sintesis proteinica es controlada por meca nismos especificos en cada etapa.

• La iniciaci 6n de la sintesis proteinica requiere de subunidades ribos6micas 30S y 50S separadas. • Tambien se necesitan factores de iniciaci6n (IF-1, -2 y -3) que se unen a las subunidades 30S. • Para formar un complejo de iniciacion, una subunidad 30S que porta los factores de iniciaci6n se une a un sitio de iniciacion del RNAm. • El IF-3 debe ser liberado para permitir que las subunidades 50S se unan a los complejos 30S-RNAm.

• El RNAr de la subunidad ribosomica 30S bacteriana tiene una secuencia complementaria que se aparea con la secuencia Shine-Dalgarno durante la iniciacion.

El factor de elongaci6n Tu carga al aminoacilRNAt en el sitio A • El EF-Tu es una proteina G monomerica cuya forma activa (unida al GTP) se une al aminoacil-RNAt. • El complejo EF-Tu-GTP-aminoacil-RNAt se une al sitio A ribo s6 mico.

1m La cadena polipept1dica se transfiere al aminoacilRNAt • La subunidad 50S tiene actividad peptidil transferasa. • La cadena polipeptidica naciente se transfiere del peptidilRNAt del sitio Pal aminoacil-RNAt del sitio A. • La sintesis de enlaces peptidicos genera RNAt desacilado en el sitio P y peptidil-RNAt en el sitio A.

r;m

La translocaci6n mueve al ribosoma • La translocaci6n ribos6mica desplaza al RNAm tres bases a lo largo del ribosoma . • La translocacion lleva al RNAt desacilado al interior del sitio E y al peptidil-RNAt al interior del sitio P, ademas de vaciar el sitio A. • El modelo del estado hibrido propane que la translocaci6n ocurre en dos etapas, en las cuales la subunidad 505 se mueve respecto de la subunidad 305, y posteriormente

Continua en Ia siguiente pagina 151

esta se desplaza a lo largo del RNAm para restaurar la conformacion original.

lim

Los factores de elongaci6n se unen alternativamente al ribosoma • La translocacion requiere de EF-G, cuya estructura es semejante ala del complejo aminoacil-RNAt-EF-Tu-GTP. • La union de EF-Tu y EF-G con el ribosoma es mutuamente excluyente. • La translocacion requiere de La hidrolisis de GTP, la cual desencadena un cambia en la estructura del ribosoma.

011

La s1ntesis prote1nica termina con tres codones

• Virtualmente todas las proteinas ribosomicas estan en o con el RNAr. • La mayor parte de los os entre las subunidades ribosomicas se realiza entre los RNAr 165 y 235.

B& ilos ribosomas tienen numerosos centros :activos •

Las interacciones en que esta implicado el RNAr son clave para La funci6n del ribosoma. • El ambiente de los sitios de union al RNAt depende ampliamente del RNAr.

aD

El RNAr 165 desempeiia un papel activo en la s1ntesis prote1nica •

• Los codones UAA (acre), UAG (ambar) y UGA terminan la sintesis proteinica. • En las bacterias se utilizan muy a menudo con frecuencias relativas UAA>UGA>UAG.

Dill

El RNAr 165 desempefia un papel activo en las funciones de la subunidad 305, pues interactua directamente con la subunidad 505 y con los anticodones de las moleculas de RNAt localizadas en los sitios P y A.

Los codones de terminaci6n son reconocidos por facto res prote1 nicos

El RNAr 235 tiene actividad peptidil transferasa

Los codones determinacion son reconocidos por factores de liberaci6n de proteinas, no por moleculas de aminoacil-RNAt. 0 Las estructuras de los factores de liberacion clase 1 son semejantes a las del aminoacil-RNAt-EF-Tu y del EF-G . o Los factores de liberacion clase 1 responden a codones de terminacion especificos e hidrolizan La ligadura polipeptido-RNAt. • Los factores de liberacion clase 1 son asistidos par los factores de liberacion clase 2 que dependen del GTP. • El mecanisme es similar en las bacterias (que tienen dos tipos de factores de liberacion clase 1) yen las eucariotas (que tienen solo un factor de liberacion clase 1).

•

0

I!E!II

La actividad peptidil transferasa reside exclusivamente en el RNAr 235.

Las estructuras ribos6micas cambian cuando se unen las subunidades •

La cabeza de La subunidad 305 gira en torno al cuello cuando se forman los ribosomas completes. • El sitio activo peptidil transferasa de La subunidad 50S tiene mayor actividad en los ribosomas completes que en las subunidades individuales 505 . • La interfase entre las subunidades 505 y 305 es muy rica en os disociables.

mil

Resumen

El RNA ribos6mico abarca ambas subunidades ribos6micas • Cada RNAr tiene muchos dominies distintos que se doblan de manera independiente.

Introducci6n Un RNAm contiene una serie de codones que interactuan de tal manera con los anticodones de los aminoacil-RNAt que la serie correspondiente de aminoacidos es incorporada a una cadena polipeptfdica. El ribosoma proporciona el ambiente necesario para controlar la interacci6n entre el RNAm y el aminoacil-RNAt a! comportarse como una pequefia fabrica migratoria que viaja a lo largo del molde conduciendo ciclos rapidos de sfntesis de enlaces peptfdicos. Los aminoacil-RNAt entran y salen de Ia partfcula a una velocidad impresionante mientras depositan aminoacidos, y ciertos factores de elongaci6n se asocian y disocian dclicamente de ellos. Junto con sus factores rios, el ribosoma proporciona el rango completo de actividades necesarias para todos los pasos de la sfntesis protefnica. En Ia se muestran las dimensiones relativas de los componentes del mecanisme de Ia sfntesis protefnica. El ribosoma esta formado por 152

CAPITULO 8 Sintesis proteinica

dos subunidades que tienen funciones especfficas en Ia sfntesis de protefnas. El RNA mensajero esta asociado con Ia subunidad pequefia, de modo que -30 bases del RNAm estan comprometidas en un momenta dado. El RNAm se desliza por la superfide, cerca de la union de la subunidades. Dos moleculas de RNAt presentan actividad en Ia sfntesis protefnica en todo momenta, de modo que Ia elongaci6n del polipeptido implica reacciones que suceden (aproximadamente) dos de los 10 codones que abarca el ribosoma. Los dos RNAt se insertan en sitios internos que se extienden por las subunidades. Antes de ser reciclada, una tercera molecula de RNAt puede permanecer en el ribosoma despues de haber sido utilizada en Ia sfntesis protefnica . La forma basica del ribosoma se ha conservado durante la evoluci6n, sin embargo, hay variaciones apreciables en el tamafio general y en las proporciones de RNA y de proteinas en los ribosomas de las bacterias, del citoplasma eucari6tico y de los orgase comparan los componennelos. En Ia

_ ~e los ribosomas bacterianos y de los mamfferos, _:: en ambos casos son partfculas ribonucleoprotef-= que contiene una mayor cantidad de RNA que : ""':-otefnas. Las protefnas ribosomicas se conocen ~

::::. protefnas r.

Cada una de las subunidades ribosomicas con::- '= un RNAr importante y cierta cantidad de · :einas pequenas. La subunidad grande tambien _:: ·e tener una o mas moleculas pequenas de _..._. En E. coli, la subunidad pequena (305) esta __ ada por RNAr 165 y 21 protefnas r, en tanto -=en la grande (50S) se encuentran el RNAr 235, ? "A pequefio 55 y 31 proteinas. Excepto por ' j e la cual hay cuatro copias por cada ribosoma, . ay una copia de cada protefna. Las moleculas .-> es de RNA constituyen la parte principal de la _ =.del ribosoma bacteriano; su presencia es pene:e y, de hecho, todas o casi todas las protefnas :' micas an al RNAr, de modo que los · -.:: mayores constituyen lo que en ocasiones se . ·era como la columna vertebral de cada sub-~d, una hebra continua cuya presencia domina :: estructura y determina las posiciones de las . = ~as ribosomicas. ::.os ribosomas citoplasmicos de las eucariotas ~:-:ores son mas grandes que los de las bacterias. _, enido total de RNA y de proteinas es mayor; ;::oleculas mayores de RNA son mas largas (se · :-:Unan RNAr 185 y 285) y hay mas protefnas. : -=.J lemente Ia mayor parte de las protefnas, si .: que todas, estan presentes en cantidades es- 1metricas. El RNA sigue siendo el componente - _:-ninante por mas a. ::_ s ribosomas de los organelos son distintos de -=- citosol y asumen diversas formas, de maneen algunos casos son casi del tamano de los · ::=-:anos y tienen 70% de RNA rnientras que en . ·olo son de 60S y tienen <30% de RNA. ~ - ribosoma posee numerosos centros activos, ..:::10 de los cuales esta constituido por un grupo : ~:efnas relacionadas con una region de RNAr · _::nico. Los centros activos requieren de la par: -2on directa del RNAr en una funcion estrucincluso catalftica. Para algunas funciones ca-= se requiere de protefnas individuales, pero : _,a de las actividades puede ser reproducida : ~ tefnas aisladas o por grupos de protefnas; - :-tan solo en el contexto del ribosoma. .:::-. el analisis del ribosoma son importantes dos _e informacion. Las mutaciones implican a ___as ribosomicas especificas o a bases del RNAr -.:.:ciones especificas. En el analisis estructural, ja Ia modificacion directa de los componentes -.: soma y las comparaciones para identificar :-::.crerfsticas conservadas en el RNAr, se iden-

-=

0 0 N

/ RNAm de 35 bases ~ Las comparaciones de tamaiio muestran que el ribosoma es lo suficientemente grande coma para unirse a los RNAt y el RNAm .

. ...:......:.._ •

~w.·~

Ribosomas

RNAr

Protefnas r

Bacterianos (?OS) masa: 2.5 MDa

50S

238 = 2904 bases 58 = 120 bases

31

66% de RNA

308

168 = 1542 bases

21

288 = 4718 bases 60S 5.8S = 160 bases 58 = 120 bases

49

Mamfferos (80S) masa: 4.2 MDa 60% de RNA

40S

33

188 = 1874 bases

Los ribosomas son partlculas ribonucleoprotelnicas que contienen mas RNA que protelnas y que se disocian en subunidades grandes y pequeiias.

tifican las localizaciones especificas de componentes implicados en funciones particulares.

ID

La s1ntesis proteinica ocurre por iniciaci6n, elongaci6n y terminaci6n

Conceptos principales • El ribosoma tiene tres sitios de union al RNAt. • Un aminoacil-RNAt entra al sitio A. • El peptidil-RNAt esta unido al sitio P. • El RNAt desacilado sale a traves del sitio E. • Al transferir el polipeptido del peptidil-RNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A, se agrega un aminoacido a La cadena polipeptidica.

Un aminoacido es transportado al ribosoma por un aminoacil-RNAt, y Ia adici6n a Ia cadena protefnica creciente se debe a una interaccion con el RNAt que transport6 a! aminoacido previo. Cada uno de

8.2 La slntesis protelnica ocurre par iniciaci6n, elongaci6n y terminaci6n

153

Codon "n" El sitio P sujeta al peptidii-RNAt

Codon "n + 1"

~

Movimiento del ribosoma

3'

5' 1 Antes de Ia formacion del enlace peptidico, el peptidii-RNAt ocupa el sitio P; el aminoacii-RNAt Aminoacido para el ocupa el sitio A 1 Cadena nac1ente 1 1 on n +

·······~

~ '

~

3 La translocacion mueve al ribosoma un codon; coloca al peptidii-RNAt en el sitio P; el RNA! desacilado sale por el sitio E; el sitio A es desocupado para el proximo aa-RNAt

El ribosoma tiene dos sitios para unirse al RNAt cargado.

Los extremos aminoacilo del RNAt interac!Uan con Ia subunidad ribosomica grande

Los anticodones estan unidos a tripletes adyacentes del RNAm en Ia subunidad pequeiia del ribosoma Los sitios P y A posicionan a los RNAt que interactuan a traves de ambas subunidades ribos6micas.

154

CAPiTULO 8 Sintesis proteinica

estos RNAt yace en un sitio distinto del ribosoma. En Ia se muestra que los dos sitios tienen caracteristicas distintas: • Un aminoacil-RNAt se une a! sitio A, per antes de que entre, el sitio expone el codon que representa al siguiente aminoacido que se agregara a Ia cadena. • El codon que representa al aminoacido ma5 recientemente agregado a Ia cadena poli· peptidica naciente esta en el sitio P, el cuai es ocupado por el peptidil-RNAt, RNA1 que porta Ia cadena polipeptfdica naciente. En Ia se muestra que el extrema de ~ RNAt que !leva un aminoacido se localiza en la subunidad grande, mientras que el anticodon ubicado en el otro extrema interactua con el RNAm unido a Ia subunidad pequena, de modo que los sitios P y A abarcan las dos subunidades ribosomicas. Para que un ribosom a sintetice un enlace peptfdico, debe encontrarse en el estado que se muestra en el paso l de Ia Figura 8.3, cuando el peptidilRNAt se encuentra en el sitio P y el aminoacil-RNA! en el A. La formacion del enlace peptidico ocurre cuando el polipeptido transportado por el peptidilRNAt es transferido al aminoacido transportado por el aminoacil-RNAt, reacci6n catalizada por Ia subunidad grande del ribosoma. La transferencia del polipeptido genera el ribosoma que se muestra en el paso 2, en el cual el RNAt desacilado, que carece de aminoacido, seencuentra en el sitio P, mientras que en el sitio A se ha creado un peptidil-RNAt nuevo mas largo debido a que tiene un aminoacido mas que el peptidil-RNAt que estaba en el sitio P en el paso l. Ahora, el ribosoma desplaza un triplete a lo largo del mensaj ero, etapa denominada translocacion. El movimiento transfiere al RNAt desadlado fuera del sitio P y desplaza al peptidil-RNAt al interior de este (vease el paso 3 de Ia figura). El siguiente codon que debe ser traducido se encuentra ahora en el sitio A, listo para que entre un nuevo aminoacil-RNAt, repitiendose asf el ciclo. En Ia r. · se resume Ia interacci6n entre los RNAt y el ribosoma. El RNAt desacilado abandona al ribosoma a traves de otro sitio de union de RNAt, el sitio E, ocupado transitoriamente por el RNAt despues de que sale del sitio P y antes de ser liberado del ribosoma hacia el citosol. Asi pues, el RNAt entra al sitio A. pasa por el sitio P y sale por el sitio E (vease tambien Ia Fig. 8.28, seccion 8.12). En Ia se compara el movimiento del RNAt y del RNAm, que puede considerarse como una especie de engranaje en el cualla reacci6n es conducida porIa interaccion entre codon y anticodon.

El aminoacii-RNAt entra al sitio A

El polipeptido es transferido al aminoacii-RNAt

La translocaci6n mueve al peptidii-RNAt al sitio P

El aminoacil-RNAt entra al sitio A, recibe a la cadena polipeptldica del peptidilRNAt yes transferido al sitio P para el siguiente ciclo de elongaci6n.

lniciaci6n La subunidad 508 se une a Ia 308 por media del sitio de union al RNAm y se agrega el aminoacii-RNAt

RNA!

~t \ ••••

~~

••••

E

¥¥.~:~:?

Sitio P

••• •

qNAm ....._ • • • •·• • • • • • • • ···············• • • • • ••·•• • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Elongaci6n El ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm, ampliando Ia protefna por transferencia del peptidii-RNAt al aminoacii-RNAt

6 El RNAt y el RNAm se mueven a traves del ribo-

- =;?n la misma direcci6n.

=._a sfntesis protefnica se divide en tres etapas, -..:adas en Ia 1 La iniciaci6n implica las reacciones que preceden a Ia formaci6n del enlace peptfdico entre los primeros dos aminoacidos de Ia protefna, proceso que exige que el ribosoma se una a! RNAm para formar un complejo de iniciaci6n que contiene al primer aminoacilRNAt. Este paso es relativamente Iento en Ia sfntesis protefnica y usualmente determina la velocidad a Ia cual se traduce un RNAm. La elongaci6n incluye todas las reacciones que tienen Iugar desde Ia sfntesis del primer enlace peptfdico hasta Ia adici6n del ultimo amino
Terminaci6n La cadena polipeptfdica es liberada del RNA! y el ribosoma se disocia del RNAm

1

La s\ntesis prote\nica se divide en tres etapas.

Durante la iniciaci6n, la subunidad ribos6mica pequefi.a se une al RNAm y posteriormente a Ia subunidad 50S. Durante Ia elongaci6n, el RNAm se desplaza a Jo largo del ribosoma y se traduce en tripletes. (Aunque en general se hace referenda a que el ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm, es mas realista pensar que el Rt\fAm es jalado a traves del ribosoma .) En la terminaci6n, la proteinase Iibera, el RNAm se separa y las subunidades ribos6rnicas se disocian para poder ser utilizadas nuevamente.

8.2 La s\ntesis prote\nica ocurre por iniciaci6n, elongaci6n y terminaci6n

155

Ill

La precision de La sintesis proteinica es controlada por mecanis mos especiales

Concepto principal • La precision de La s1ntesis prote1nica es controlada por mecanismos espedficos en cada etapa.

Se sabe que, en general, la sintesis de las protefnas es exacta por la coherencia con se deterrnina Ia secuencia de una protefna, y aunque son pocas las mediciones detalladas de la tasa de error in vivo, suele pensarse que el rango de error oscila entre 10 4 y 10 5 arninoacidos incorporados. Considerando que la mayor parte de las proteinas se produce en grandes cantidades, la tasa de error es muy baja como para incidir en el fenotipo de la celula. No es inmediatamente obvio como se logra dicha tasa de error tan baja, y de hecho, la naturale za de los eventos discriminatorios es un tema 0oeneral planteado en varias de las etapas de Ia expresion genica. ,:, Como reconocen las sintetasas jus to a los RNAt y a los aminoacidos correspondientes? LComo reconoce un ribosoma los RNAt y los aminoacidos correspondientes? LComo detecta un ribosoma al

Tasa de error

l

/VVV\..

Base equivocada

A

Cambia del marco de lectura

'1\.

Aminoacii-RNAt equivocado

I I

I

t NH 2

l

[email protected]!C-H Rf"W.{I;t ~co sintetasa

Aminoacido equivocado RNA! equivocado

I 1

-

o-6 1 o-5 1 o-4

rtJ Los errores se presentan a tasas que oscilan entre 10·6 y 5 x 10·4 en etapas diferentes de La s1ntesis prote1nica.

156

CAPITULO 8 S1ntesis prote1nica

RNAt que corresponde al codon del sitio A? ,;,Come identifican las enzimas que sintetizan DNA o RN.~. solo ala base complementaria del molde? Cada case' plantea un problema similar: como distinguir a u:-: miembro especffico en un conjunto en el que tod o~ los integrantes tienen las mismas caracterfsticas g . nerales . Es probable que uno de los empiect por ar el centro activo mediante un procesc de impactos aleatorios, pero despues, los miembro' erroneos son rechazados y solo se acepta el apropiado, que siempre forma parte de una minorfa (unc de 20 arnino
La iniciaci6n en las bacterias requiere de subunidades 305 y de factores rios I

:Jnceptos principales La iniciaci6n de la sintesis proteinica requiere de subunidades ribos6micas 305 y 505 separadas. Tambien se necesitan factores de iniciaci6n (IF-1, -2 y -3) que se unen a las subunidades 305. Para formar un complejo de iniciaci6n, una subunidad 305 que porta los factores de iniciaci6n se une a un sitio de iniciaci6n del RNAm . • :Ol IF-3 debe ser liberado para permitir que las subunidades 505 se unan a los complejos 305-RNAm.

- ·- ribosomas bacterianos implicados en el alarga::nto de una cadena polipeptfdica existen como : :-:'culas 70S que en Ia terminacion son liberadas :. RNArn como ribosomas libres. En las bacterias : .:-ultivo, la mayor parte de los ribosomas sinte~n protefnas; el banco libre tiende a contener . <~% de los ribosomas . Los ribosomas que se encuentran en el banco ; ~e pueden disociarse en subunidades indepen:-_.res, es decir, que los ribosomas 70S estan en . _- 'brio dinamico respecto de las subunidades 50S - }S. La iniciaci6n de la sfntesis proteinica no es una --=· 'n de los ribosomas intactos, la asumen las subuni-:s independientes, las cuales se reasocian durante :::accion de la iniciacion. En Ia · se resu: el ciclo de las subunidades ribosomicas durante : _:.resis proteinica de las bacterias. ::..a iniciacion tiene Iugar en una secuencia es' ::a! localizada en el RNAm denominada sitio = i.llli6n con el ribosoma, que es una secuencia -: ~ de bases que precede a la region codificadora :.:.!e Ia Fig. 8.1). Las subunidades grande y peque-:: asocian en el sitio de union con el ribosoma, ~ :ormar un ribosoma intacto, mediante una reen dos pasos: o El reconocimiento del RNArn ocurre cuando se une una subunidad pequefia para formar un complejo de iniciaci6n en el sitio de union con el ribosoma. o Una subunidad grande se une al complejo para formar un ribosoma completo . .-_u nque !a subunidad 30S esta involucrada en .::iacion, no es susceptible de asumir por sf mis' - reacciones que unen el RNArn con el RNAt, _o cual se necesitan protefnas adicionales de. adas factores de iniciaci6n (IF, initiation ), los cuales se encuentran solo en las sub'.:ies 30S y se liberan cuando estas se asocian con _ unidades 50S para formar los ribosomas 70S .

Este comportamiento clistingue a los factores de iniciacion de las proteinas estructurales del ribosoma. Los factores de iniciacion participan unicamente en la formacion del complejo de iniciacion, no forman parte de los ribosomas 70S y no desempefian ninguna funcion en las etapas de elongacion. En la se resumen las etapas de la iniciacion.

........

~

iniciaci6n

J

8ubunidades • 308 con : factores de

_..... .,_

8ubunidades separadas

..........

.

Banco de : ribosomas • libres '

I;,;,II-~-,...... lniciaci6n

Elongaci6n

Terminaci6n

La iniciaci6n requiere de subunidades ribos6micas libres. Cuando los ribosomas son liberados en la terminaci6n, la subunidad 305 se une a factores de iniciaci6n y se disocia para generar subunidades libres. Cuando las subunidades se reasocian para formar un ribosoma funcional en la iniciaci6n, liberan a los fa ctores.

1 La subunidad 308 se une al RNAm

2 EIIF-2 acarrea al RNA! al sitio P 1F-2

3 Los IF son liberados y se adhiere Ia unidad 508

Los factores de iniciaci6n estabilizan a las subunidades 305 libres y unen al RNAt iniciador con el complejo 305-RNAm.

8.4 La iniciaci6n en las bacterias requiere de subunidades 305 y de facto res rios

15 7

Banco de 8ubunidades ribosomas 708 lib res Equilibria dinamico

__....

...,__

!

La subunidad 308 con el IF-3 puede unirse al RNAm, a diferencia de Ia subunidad 508

EIIF-3 debe ser liberado antes de que Ia subunidad 508 pueda unirse

1

Q ~••• •

La iniciaci6n requiere de subunidades 30$ que portan IF-3.

Las bacterias utilizan tres factores de iniciacion, denominados IF-1, IF-2 e IF-3, que el RNAm y el RNAt necesitan para entrar al complejo de iniciaci6n: • El IF- 3 permite que las subunidades 30S se unan especfficamente a los sitios de iniciacion del RNAm. • El IF-2 se une a un RNAt iniciador especial y controla su entrada al ribosoma. • El IF-l se une a las subunidades 30S solo como parte del complejo de iniciacion completo. Se une al sitio A y evita que entre el aminoacil-RNAt. Su localizacion tambien puede impedir que Ia subunidad 30S se una ala subunidad 50S. El IF- 3 tiene multiples funciones; primeramente es necesario para estabilizar a las subunidades 30S (libres); despues las habilita para que se unan al RNAm y, como parte del complejo 30S-RNAm, inspecciona la exactitud del reconocimiento del primer aminoacilRNAt (vease la seccion 8.6, El uso del fMet-RNAtr es controlado por el IF-2 y por el ribosoma). La primera funcion del IF- 3 es controlar el equilibria entre los estados ribosomicos, como se muestra en Ia . Este factor de iniciacion se une a las subunidades 30S libres que son liberadas del banco de ribosomas 70S; su presencia evita que la subunidad 30S vuelva a asociarse con la subunidad 50S. La reacci6n entre el IF- 3 y la subunidad 30S es estequiometrica: una molecula de IF-3 se une a cada subunidad. La cantidad de IF- 3 es relativamente escasa, por lo tanto, su disponibilidad determina el numero de subunidades 30S libres. 158

CAPITULO 8 S\ntesis proteinica

El IF- 3 se une a la superficie de Ia subunida 30S cerca del sitio A. Hay una superposicion signjficativa entre las bases del RNAr l6S protegido poe! IF- 3 y las protegidas por la union de Ia subun· · dad 50S, lo cual sugiere que evita ffsicamente I;: union de las subunidades, de modo que el IF- 3 s: comporta como un factor anti-asociativo que hac7 que una subunidad 30S permanezca en el banco d: subunidades libres. La segunda funcion del IF- 3 es controlar la capacidad de las subunidades 30S para unirse al RNAn: Las subunidades pequefias de ben tener IF- 3 pa_ . o formar complejos de iniciacion con el RNAm, facto: que debe ser liberado del complejo 30S-RNAm par: permitir que se una Ia subunidad 50S; una vez l: berado, inmediatamente se recicla al encontrar orr: subunidad 30S. El IF-2 tiene una actividad GTPasa dependien:: de ribosomas, pues tomenta la hidrolisis de GTP epresencia de ribosomas, liberando Ia energfa a]m - · cenada en el enlace de alta energfa . El GTP es hidrolizado cuando se une la subunidad 50S para genera: un ribosoma completo. La division del GTP podL estar implicada en el cambia de conformaci6n de ribosoma, de modo que las subunidades unidas seatransformadas en un ribosoma 70S activo.

Ill

Un RNAt iniciador especial empieza la cadena poli pepti di ca

Conceptos pri nci pales • La s\ntesis proteinica empieza con una metionina usualmente codificada por el triplete AUG. • Los diferentes RNAt de metionina estan implicados en La iniciaci6n y La elongaci6n. • El RNAt iniciador tiene caracteristicas estructurales (micas que lo distinguen del resto de los RNAt. • El grupo NH, de la metionina unida al RNAt iniciador bacteriano esta formilado.

La sfntesis de todas las proteinas empieza con el n · mo aminoacido, Ia metionina. La sefial para inic:"una cadena polipeptfdica es un codon de iniciaci : especial que marca el principia del marco de lectm,:: dicho codon de iniciacion suele ser el triplete AC ~ aunque en las bacterias tambien se utilizan los c dones GUG o UUG. El codon AUG representa a Ia metionina, an-_noacido que puede ser transportado por dos tip . de RNAt, uno utilizado para la iniciacion y el oara el reconocimiento de los codones AUG dur~ la elongaci6n.

En las bacterias y los organelos eucarioticos, el At iniciador transporta una metionina formilada : ::J. su grupo amino y poder formar una molecu ~ de N-formil-metionil-RNAt, conocido como _ NAtt•t. El nombre del aminoacil-RNAt generalente se abrevia como fMet-RNAt 1• El RNAt iniciador adquiere a su aminoacido ~o dificado en una reaccion de dos etapas, primero :: carga con el aminoacido para generar Met-RNAt1 posteriormente, Ia reaccion de formilacion ilus2 bloquea al grupo NH2 libre. -ada en la , -_:.mque el grupo aminoacido bloqueado evitara que ~ . iniciador participe en la elongacion de la cade- -. no interfiere con Ia capacidad para iniciar una - -otefna. Este RNAt se utiliza solo para la iniciacion, re~ · noce a los codones AUG o GUG (en ocasiones, al .-JG) . Dicho reconocimiento no es tan bueno en _ bos casos, la extension de la iniciacion djsminuye - roximadamente ala mitad cuando el codon AUG remplazado por el GUG y nuevamente a Ia mitad :::..ando se utiliza el codon UUG. La especie responsable del reconocimiento de : codones AUG en Jocalizaciones in ternas es el ? ~'lAtmMet, el cual responde unicamente a los cones AUG internos. (.Que caracteristicas distinguen al fMet-RNAt 1 ·ciador del Met-RNAtm utilizado en la elongacion? _gunos rasgos caracteristicos de la secuencia del ·_ ·At son importantes, como se resume en la , pues son necesarias para evitar que el iniciador :3 utilizado en la elongacion, mientras que otras 7:-miten su funcionamiento en la iruciacion: • La forrnilacion no es estrictamente necesaria porque el Met-RNAt1 no formilado puede funcionar como iniciador, pero incrementa la eficiencia con la cual es utilizado porque es una de las caracteristicas reconocidas por el IF-2 que se une al RNAt iniciador. • Las bases que se enfrentan una a otra en Ia ultima posicion del tallo, a las cuales se conecta el aminoacido, estan apareadas en todos los RNAt, excepto en el RNAt1Met . Las mutaciones que crean un par de bases en esta posicion del RNAtte' le permiten actuar en Ia elongacion, de modo que su ausencia es importante para evitar que el RNAt 1Met sea u tilizado en la elongacion; tambien es necesario para la reaccion de la formilacion . • En el RNAt/VIet hay una serie exclusiva de tres pares G-C en el tallo que precede allazo que contiene al anticodon, los cuales son necesarios para permitir que el fMet-RNAt 1 se inserte directamente en el sitio P. ~

Grupo amino bloqueado ...._______

0

~&

Cf-t. aScii.

c~

<"C~ H

""'H

1

<:01-f. H ~C= O <:,c/~

"''c_....NH2 I

I

yo

yo

C=O

C=O

I

I

Mot-RNAt,nmmil-mot-RNAt, 1O-form1l tetrahidrofolato

tetrahidrofolato

.l. El N-formil-metioni l-RNAt (fMet-RNAt1) iniciador es generado par la formilaci6n del metionil-RNAt utilizando al formil-tetrahidrofolato como cofactor.

Aminoacido formilado

Formilo I

Met I A

c c A

Sin apareamiento de bases

C

<3

Necesario para Ia fonmilaci6n

A

c

C G

G

G

C

C .

U

SG - C 9G~9 1P

c

]1.

G)

DA

G CGAG

GJ UCG

~~ua

0

Y. . A C; G G· C

3 pares de bases G-C

G ··· C G ·· C

C

U

A

uGl G

Necesarios para entrar al sitio P

A

C A U

El fMet-RNAt1 tiene caracteristicas unicas que lo distinguen como RNAt iniciador.

En las bacterias y en las mitocondrias, el resi dua formilo localizado en la metionina iniciadora es eliminado por una enzima desformilasa espedfica para generar un grupo NH 2 terminal normal. Si la metionina resulta ser el aminoacido terminal N de Ia protefna, este paso sera el unico necesario. Mas o menos en Ia rrutad de las proteinas, la metionina localizada en el extrema es eliminada por una amino peptidasa, la cual crea una terminacion nueva de R2 (originalmente el segundo arrunoacido in corpora do en Ia cadena). Cuando ambos pasos son necesarios, son secuenciales. Las reacciones de eliminacion son bastante rapidas, probablemente cuando la cadena polipeptfdica naciente ha alcanzado una longitud de 15 aminoacidos. 8.5 Un RNAt iniciador especial empieza la cadena polipeptldica

159

Bl

El uso del fMet-RNAtf es controlado por el IF-2 y por el ribosoma

Concepto principal • El IF-2 se une al fMet-RNAt1 iniciador y le permite entrar al sitio P parcial de La subunidad 305.

El significado de los codones AUG y GUG depende de su contexto. Cuando AUG se utiliza para la iniciacion, se lee como formil-metionina , pero en Ia region codificadora representa a Ia metionina. Por otra parte, el significado del codon GUG depende aun mas de su localizacion, de modo que cuando se presenta como primer codon, mediante la reaccion de iniciacion se lee como formil -metionina, pero si esta dentro de un gen, es lefdo por el Val-RNAt, uno de los regulares del conjunto del RNAt, para proporcionar valina conforme lo exija el codigo genetico. (_Como se interpreta el contexto de los codones AUG y GUG? En Ia se ilustra el papel decisivo del ribosoma cuando actua en conjunto con los factores rios.

IF-2

fMet~

v

Solo el fMet-RNAt1 entra al sitio P parcial de Ia subunidad ' O S unida al RNAm fMet

S61o aa-RNAt entra al sitio A en el ribosoma 70S..,.--complete ~

aa

EF-Tu

. . .. 1

. 56lo el fMet-RNAt 1 puede ser utilizado par la s subumdades 305 para la iniciaci6n; los otros aminoacil-RNAt (aa-RNAt) deben ser utilizados para La elongaci6n par los ri bosomas 705.

160

CAPITULO 8 5intesis proteinica

En un complejo de iniciacion, solo Ia subunidac pequefia esta unida a! RNA y el codon de iniciaci6c se encue ntra en la parte del sitio P que porta l guno de los aminoacil-RNAt normales, participe er... Ia reaccion de iniciaci6n. Por el contrario, el EF-Tu que coloca los aminoacil-RNAt en el sitio A, no pueden unirse al fMet-RNAt1, cuyo uso, por lo tanto, eexcluido de la elongacion. El IF- 3 se encarga de realizar una verificaci6r adicional de Ia exactitud, por Ia cual se estabiliza ~ union del RNAt iniciador merced ala detecci6n d apareamiento correcto de bases con Ia segunda y L tercera base del codon de iniciacion AUG. En Ia se detalla Ia serie de eventC'. por media de los cuales el IF-2 coloca a! fMet-RNA iniciador en el sitio P. El IF-2, unido al GTP se re· laciona con el sitio P de Ia sub unidad 30S. En es -~ punto, dicha subunidad porta a todos los factore-. de iniciacion . El fMet-RNAt 1 se un e a! IF-2 en :: subunidad 30S y posteriormente el IF-2 transfier: el RNAt a! sitio parcial P.

IF-1

IF-3

Complejo 308-RNAm

Union del ribosoma con el sitio de iniciacion del RNAm

~ ~

AU('

Adici6n de nucleasa para digerir todo el RNAm no protegido

IF-2 GTP

EII F2-GTP se une al complejo

"V

fllll../

~-

AC:

Fragmento aislado del RNAm prolegido

l

fMet Se une el RNA! iniciador

Determinacion de Ia secuencia AACAGGAGGAUUACCCCAUG UCGAAGCAA. .. del RNAm , - - - - - -- - - - . . . -- -- - - --. protegido Lider Region codificadora

I

Se une Ia subunidad 50S . los IF1, 2 y 3 son liberados !Met

t1V.

I

Shine-Dalgarno <1 0 bases en flujo ascendente desde el AUG

)?

I

AUG en el centro del fragmento protegido

IF-1 IF-2 IF-3 GDP P; '\..; • ~ El IF-2 es necesario para unir al fMet-RNAt1 con ~ - -plejo 305-RNAm. Despues de la union de la subunidad _: - dos los IF son liberados y el GTP es dividido.

La iniciaci6n implica el apareamiento de bases entre el RNAm y el RNAr I

' :..:-.:ep:os pri ncipales _- sitio de iniciaci6n del RNAm bacteria no esta =: -mado por el codon de iniciaci6n AUG precedido de _- espacio de -10 bases que contiene el hexamero de :: .ipurina Shine-Dalgarno. ~ ~NAr de la subunidad ribos6mica 305 bacteriana :-" e una secuencia complementaria que se aparea con .: ;ecuencia Shine-Dalgarno durante la iniciacion.

contiene numerosos tripletes AUG, se reconoce al codon de iniciacion como -:-cdor del punto de inicio de la traduccion? ::ios del RNAm en los cuales se inicia la sfnte~mefnica pueden ser identificados por la union -: osoma y el RNAm en condiciones en que se . _ea la elongacion. Posteriormente, el riboso --:.-rmanece en el sitio de iniciacion. Cuando se : .;:a la ribonucleasa al complejo de iniciacion . -"eado, todas las regiones del RNAm ajenas al rna son degradadas, pero las que estan unidas ~stan protegidas, como se ilustra en la .:..os fragmeotos protegidos pueden ser recupe- ~ caracterizados.

Todaslas regiones de iniciaci6n tienen dos elementos de consenso

Los sitios de union con el ribosoma del RNAm pueden ser recuperados de los complejos de iniciaci6n; incluyen la secuencia de flujo ascendente Shine-Dalgarno y el codon de iniciaci6n.

Las secuencias de iniciacion protegidas por los ribosomas bacterianos tienen una longitud de -30 bases. Los sitios de union a! ribosoma de distintos RNAm bacterianos muestran dos caracterfsticas comunes: • El codon de iniciacion AUG (o, con menos frecuencia , los codones GUG y UUG) siempre forma parte de la secuencia protegida. • En un espacio de diez bases de flujo ascendente a partir del AUG hay una secuencia que corresponde total o parcialmente al hexamero . 5' . .. A G GAG G ... 3' A este fragmento de polipurina se le conoce como secuencia Shine-D algarn o, yes complementaria de una secuenda muy conservada que se localiza cerca del extremo 3' del RNAr l6S . (La extension de la complementariedad es diferente entre las rnolt~culas de RNA.m y puede extenderse desde una secuencia fundamental formada por cuatro bases GAGG, a una secuencia de nueve bases que se extiende mas alla del hexamero.) Escrito de forma inversa, la secuencia del RNA.r es el hexamero: 3' . . .

u c c u c c . .. 5'

c.Se aparea la secuencia Shine-Dalgarno con su cornplem ento del RNAr durante la union ribosoma-RNAm? Las m utaciones de ambas partes de esta reaccion demuestran su importancia en la ini-

8.7 La iniciacion implica el apareamiento de bases entre el RNAm y el RNAr

161

ciacion. Las mutaciones puntuales de la secuencia Shine- Dalgarno pueden impedir la traduccion de un RNAm. Ademas, la introduccion de mutaciones en la secuencia complementaria del RNAr es perjudicial para la celula y cambia el patron de sfntesis protefnica. La confirmacion decisiva de la reaccion de apareamiento de bases es que una mutacion en la secuencia Shine-Dalgarno de un RNAm puede ser suprimida por una mutacion compensadora en el RNAr que restaure el apareamiento de bases. La secuencia que se encuentra en el extremo 3' del RNAr se conserva entre procariotas y eucariotas, con Ia diferencia de que en todas las eucariotas tiene Iugar Ia delecion de la secuencia de cinco bases CCUCC que es el complemento principal de Ia secuencia Shine-Dalgarno. No parece haber apareamiento de bases entre el RNAm y el RNAr 18S eucarioticos. Esta es una diferencia significativa en el mecanismo de iniciacion. En las bacterias, una subunidad 30S se une directamente con el sitio de union del ribosoma, de modo que el complejo de iniciacion se forma en una secuencia que rodea a! codon de iniciacion AUG. Cuando el RNAm es policistronico, cada region codificadora empieza con un sitio de union con el ribosoma. Las caracterfsticas de la expresion genica bacteriana significan que Ia traduccion de un RNAm bacteriano procede secuencialmente a traves de sus cistrones. Cuando los ribosomas se adhieren ala primera region codificadora, las subsiguientes no han sido transcritas todavfa. Cuando el segundo sitio ribosomico esta disponible, la traduccion a traves del primer cistron ya esta bastante avanzada. Lo que sucede entre las regiones codificadoras depende del RNAm individual. En Ia mayor parte de los casos, quiza los ribosomas se unen de manera independiente a! inicio de cada cistron. La serie de eventos mas comun se ilustra en la J

lniciaci6n

Terminaci6n

I

•

I

I ~

lniciaci6n

t

~~

•

....

t Primera region codificadora

Segunda region codificadora

r

I La iniciaci6n ocurre de manera independiente en cada cistr6n de un RNAm policistr6nico. Cuando la region intercistr6nica es mas larga que la extension del ribosoma, la disociacion en el sitio de terminacion es seguida por otra reiniciacion independiente en el siguiente cistron.

162

CAPITULO 8 51ntesis proteinica

Cuando termina la sfntesis de la primera protefna los ribosomas abandonan el RNAm y se disocian er: subunidades, y a continuacion, debe ensamblarse un ribosoma nuevo en la siguiente region codificadora para empezar a traducir el siguiente cistron. En algunas moleculas de RNAm bacteriano, lc traduccion entre cistrones adyacentes se vincula di· rectamente porque los ribosomas logran el iL codon de iniciacion del segundo cistron conforme terminan la traduccion del primer cistron, efect<' que implica que el espacio entre las dos regione ~ codificadoras sea pequefto, lo cual dependeria de lc. alta densidad local de los ribosomas, o bien, la yu x· taposicion de los sitios de terminacion e iniciaci6r podria permitir la omision de algunos de los evento. intercistronicos usuales. Un ribosoma abarca ffsica· mente -30 bases del RNAm, de manera que puedt ar simultaneamente a un codon de termina· cion y al siguiente sitio de iniciacion si los separa:solo unas cuantas bases.

Ill

Las subunidades pequenas bus can sitios de i niciaci6n en el RNAm eucari6tico

Conceptos principales • Las subunidades ribosomicas 405 se unen al extreme 5' del RNAm y exploran al RNAm hasta que llegan a un sitio de iniciacion. • Un sitio de iniciacion eucariotico esta formado par una secuencia de 10 nucleotidos que incluye un codon AUG. • Las subunidades ribosomicas 605 se unen al complejo en el sitio de iniciacion.

La iniciacion de la sfntesis proteinica en el citopla<: · rna eucariotico es similar al proceso observado e::. las bacterias, sin embargo, difiere el orden de 1 eventos y el numero de factores rios es mayo~ En Ia iniciacion, algunas de las diferencias estan rtlacionadas con una diferencia en la manera en qu ~ las subunidades 30S bacterianas y 40S eucariotic
- z:no 5' y porta un poli(A) de l 00 a 200 bases en -;xtremo 3'. Ellfder 5' no traducido es relativamente cornormalmente de
=

de estructura secundaria con estabilidades de hasta -30 kcal, pero las horquillas de mayor estabilidad obstaculizan o evitan Ia migracion. La migracion cesa cuando Ia subunidad 40S se encuentra con el codon de iniciacion AUG. En general, aunque no siempre, el primer triplete AUG que se encuentre sera el codon de iniciacion, aunque por sf mismo no es suficiente como para interrumpir Ia migracion; se reconoce eficientemente como codon de iniciacion solo cuando se encuentra en el contexto adecuado. Los determinantes mas importantes del contexto son las bases que ocupan las posiciones -4 y + l. Un codon de iniciacion puede ser identificado en Ia secuencia NNNPuNNAUGG. La presencia de una purina (A o G) tres bases antes del codon AUG, y laG que viene inmediatamente despues de el pueden influir en Ia eficiencia de Ia traduccion hasta par l 0 veces. Cuando la secuencia lfder es larga, el extrema 5' puede ser reconocido por subunidades 40S adicionales antes de que la primera haya abandonado el sitio de iniciacion, creando una cola de subunidades que proceden a lo largo dellfder, hacia el sitio de iniciacion. Probablemente sea verdad que el codon de iniciacion es el primer triplete AUG en ser encontrado en los RNAm mas eficientemente traducidos. ;__Que sucede, sin embargo, cuando hay un triplete AUG en la region no traducida 5'? Hay do s mecanismos de escape posibles para un ribosoma que empieza a

~~~ GCC~CCAUG

~quete

metilado

G

Sitio de union / con el ribosoma

La subunidad pequena se une al casquete metilado

~'-- GCC~CCAUG G 2 La subunidad pequena migra al sitio de uni6n

I

G

3 Si ellfder es largo, las subunidades pueden formar una cola

Lus ribosomas eucarioticos migran del extrema 5' del RNAm al sitio de union con el ribosoma, el cual incluye un codon de iniciacion AUG.

8.8 Las subunidades pequefias buscan sitios de iniciacion en el RNAm eucariotico

163

rastrear desde el extrema 5'. El mas comun consiste en que Ia exploracion presenta fugas, en otras palabras, un ribosoma puede pasar por alto un codon AUG que no sea de iniciacion debido a que no se encuentra en el contexto correcto. En casos poco frecuentes en que el ribosoma sf reconoce al AUG, puede iniciarse Ia traduccion, pero terminara antes del codon de iniciacion apropiado, despues de lo cual reanuda Ia exploracion. Una gran parte de los eventos de iniciacion eucarioticos implican el rastreo desde el casquete 5', sin embargo, hay un medio de iniciacion alterno utilizado especialmente por ciertos RNA vfricos, en el cual una subunidad 40S se asocia directamente con un sitio interno denominado IRES (internal ribosome entry site) (que elude por completo cualquier codon AUG que se encuentre en Ia region 5' no traducida). Hay pocas secuencia homologas entre los elementos de los IRES conocidos; con base en su interaccion con Ia subunidad 40S es posible distinguir tres tipos: • Un tipo de IRES incluye el codon de iniciacion AUG en su frontera de flujo ascendente. La subunidad 40S se une directamente a el utilizando un subconjunto de los mismos factores necesarios para Ia iniciacion en los extremos 5'. • Otro esta localizado incluso a l 00 nucleotidos del AUG en flujo ascendente, lo cual implica una subunidad 40S que migre, tambien en este caso quiza por un mecanismo de rastreo. • Un tipo excepcional de IRES del virus de Ia hepatitis C puede unirse a Ia subunidad 40S de forma directa, sin necesidad de factores de iniciacion. El orden de los eventos es diferente del de Ia iniciacion de todas las eucarioticas. Despues de Ia union 40S-RNArn, se une un complejo que contiene factores iniciadores y RNAt iniciador. El empleo de IRES es especialmente importante en Ia infeccion por picornavirus, en Ia cual se descubrio por primera vez, debido a que el virus inhibe Ia sfntesis proteinica del hospedador, destruye las estructuras de los casquetes e inhibe los factores de iniciacion que los unen (vease Ia seccion 8. 9, Las eucariotas utilizan un complejo fo rmado por numerosos facto res de iniciacion). La union se estabiliza en el sitio de iniciacion. Cuando a Ia subunidad 40S se le une una subunidad 60S, el ribosoma intacto se localiza en el sitio identificado por el ana.Jisis de proteccion . Una subunidad 40S protege a una region de hasta 60 bases; cuando las subunidades 60S se unen al complejo, Ia region protegida se contrae a aproximadamente Ia misma longitud de 30 a 40 bases que se observa en las procariotas. 164


Ill Las eucariotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciaci6n Conceptos principales • Los factores de iniciacion son necesarios en todas las etapas de esta, incluida La union del RNAt iniciador, la union de las subunidades 405 al RNAm, el desplazamiento a lo largo del RNAm y la union de la subunidad 605. • El RNAt iniciador eucari6tico es un Met-RNAt diferente del utilizado en la elongaci6n, pero la metionina no esta formilada. • El eiF2 une al Met-RNAt, iniciador con el GTP y el complejo se une a la subunidad 405 antes de que se asocie con el RNAm.

En las eucariotas, Ia iniciacion tiene las mismas caracterfsticas generales que en las bacterias, pues usan un codon de iniciacion especffico y un RNAt iniciador. Para Ia iniciacion, el citoplasma eucariotico utiliza el codon AUG como iniciador. El RNAt iniciador, denominado RNAt;Me<, es una especie distinta, pero su metionina no se formila , asf que entre los MetRNAt, Ia diferencia radica unicamente en Ia porcion de RNAt, donde el Met-RNAt; es utilizado para 1a iniciacion y el Met-RNAtm para Ia elongacion. El RNAt;Met iniciador de las levaduras tiene por io menos dos caracterfsticas unicas, posee una estructura terciaria inusual y se modifica por fosforilacion en Ia posicion 2' de Ia ribosa, en Ia base 64 (si se evita esta modificacion, el iniciador puede ser utilizado en Ia elongacion). Asf pues, el principia de una distincion entre el Met-RNAt iniciador y el utilizado en el proceso de elongacion se conserva en las eucariotas. pero su base estructural es diferente a Ia de las bacterias (para comparar, vease Ia Fig. 8.13). Las celulas eucarioticas tienen mas factores iniciadores que las bacterias, Ia lista actual incluye 12. directa o indirectamente necesarios para Ia iniciacion, los cuales reciben su nombre de forma similar a las bacterias, en ocasiones por analogfa con los factores bacterianos; se les asigna el prefijo "e" para indicar su origen eucariotico. Participan en todas las etapas del proceso, entre otras: • formacion de un complejo de iniciacion con el extremo 5' del RNArn; • formadon de un complejo con el Met-RNAt: • union del complejo RNAm-factor con ~ I complejo Met-RNAt;-factor; • capacitacion del ribosoma para Ia exploracion del RNAm del extrema 5' al primer codon AUG;

::omplejo 43S eiF3, . et-RNAti

El eiF4F es un heterotrfmero formado por eiF4G, protefna de andamiaje eiF4E, une al casquete metilo 5' eiF4A, helicasa que se desenrolla hacia Ia estructura 5'

~IF2,

Complejo de union al casquete + mRNA ~ I F4A, B, E y G eiF4G, une otros dos factores eiF4B, estimula a Ia helicasa eiF4A PABP, se une al poli(A) 3'

El complejo 43S

se une al extrema 5' del RNAm

El heterotrimero eiF4F se une al extreme 5' del RNAm y tambien a mas factores.

:::1complejo 48S 5e forma en el codon :e iniciaci6n eiF2, ~IF3, eiF1, 1A, ~I F4A, B, F

8..

El eiF-2 esta formado por - subunidades

-

-

Algunos factores de iniciaci6n se unen a la sub-

-~ d ribos6mica 405 para formar el complejo 435, en tanto

-:: se unen al RNAm. Cuando el complejo 435 se une al RNAm, ~ -=a al codon de iniciaci6n y forma el complejo 485.

• detecci6n de la union del RNAt iniciador con el codon AUG en el sitio de iniciacion, y • mediadon en la union de la subunidad 60S. .=n Ia JG se resumen las etapas de ini.- ::on, ademas de que se muestran los factores de . .::3don imp!icados en cada etapa: el eiF2 y el eiF3 - _:Jen ala subunidad ribosomica 40S; el elF4A, el -:::-'73 y el eiF4F, a! RNAm, y el eiFl y el eiFlA, al -~lejo subunidad ribosomica-RNAm. .=n la r. J se observa el grupo de factores -= ; e unen a! extremo 5' del RNAm. El factor eiF4F -~ complejo protefnico que contiene tres de los . cces de iniciacion, aunque no esta claro si antes --=llrse al RNAm se ensambla como complejo, o '~ subunidades individuales se agregan separa_::nte para formar el complejo en el RNAm. In- " Ia subunidad de union con el casquete eiF4E, -::icasa eiF4A y Ia subunidad de "andamiaje" - "' ~ - Despues que el eiF4E se une al casquete, =-.:'-!A desenrolla cualquier estructura secunda::· e haya en las primeras 15 bases del RNAm . ~=ergfa necesaria para desenrollar Ia estructura ~ ~ne de Ia hidrolisis de ATP. El desenrollado :'::ior de Ia estructura a lo largo del RNAm lo "=.cabo el eiF4A aunado a otro factor, el eiF4B. _ _cfon principal del eiF4G es ligar otros compo- - ~ del complejo de iniciaci6n . :...=. subunidad elF4E es un centro de regulacion ~ 3Ctividad se incrementa por fosforilacion, Ia

eiF-28 El eiF2B genera Ia forma activa del eiF2

l

J

Met

Complejo '" ""''o

En la iniciaci6n eucari6tica, el eiF-2 forma un complejo terminal con el Met-RNAt. El complejo ternario se une a las subunidades 405 libres, las ~uales se unen al extreme 5' del RNAm. Despues en la reacci6n, el GTP es hidrolizado cuando el eiF-2 es liberado en forma de eiF2-GDP. El eiF-2B regenera la forma activa .

cual es desen cadenada por estimulos que acentuan Ia sintesis protelnica y revertida por estfmulos que Ia reprimen. La subunidad eiF4F tiene una actividad cinasa que fosforila a! eiF4E. La disponibilidad del eiF4E tambien es controlada por proteinas que se unen a el (llamadas 4E-BPl, -2 y -3) para impedir qu e funcione en Ia iniciaci6n. La subunidad ei F4G tambien constituye una diana para !a degradacion durante Ia infecci6n por picornavirus, como parte de Ia destrucci6n de Ia capacidad para iniciar en las estructuras de los casquetes 5' (vease Ia seccion 8 .8, Las subunida des pequenas buscan sitios de iniciaci6n en el RNAm eucari6tico) . La presencia de poli(A) en el ex tr emo 3' de un RNAm estimula Ia formacion de un complejo de

8.9 Las eucariotas utilizan un complejo formado por numerosos factores de iniciaci6n

165

El e\F3 mantiene en forma libre a las subunidades 408 El e\F2 une a\ Met-RNA! con Ia subunidad 408 43S

El e\F2 es una GTPasa El e\F2B es el factor de intercambio

2 GDP-

2 GTP

( 2B

Los factores de iniciacion unen al Met-RNAt iniciador con la subunidad 405 para formar un complejo 435. Posteriormente, en la reaccion, el GTP es hidrolizado cuado el eiF-2 es liberado en forma de eiF2-GDP. El eiF-28 regenera la forma activa.

lnteracciones posibles: el e\F4G se une a\ e\F3, el RNAm une a\ e\F4G, a\ e\F3 y a Ia subunidad 408

Las interacciones que involucran a los factores de iniciacion adquieren importancia cuando el RNAm se une al complejo 435.

' ~ '

. I

Met

El e\F1 y e\ e\F1A activan Ia exploraci6n

3 ~

--

-2~A

"""tomplejo48S 1 -

E\ e\F5 induce Ia hidr6\isis de GTP por el e\F2 El e\F2 y el e\F3 son liberados

~

El e\F5B media Ia union _ de Ia subunidad 608 ·~ '-..,J ·

Met

1

~t ( 5P. lf ~~--

El eiF1 y el eiF1A ayudan al complejo de iniciacion 435 a explorar el RNAm hasta que llega a un codon AUG. El eiF2 hidroliza a su GTP para permitir su liberacion junto con el eiF3. El eiF5B media la union 605-405.

iniciacion en el extrema 5', para lo cual es necesaria la proteina de union al poli(A) (Pablp en las levaduras). La Pab l p se une a Ia proteina de andamiaje eiF4G, fenomeno que implica que el RNAm se organizara de forma circular siempre y cuando el eiFG este unido con los extremos 3' y 5' sujetos a este complejo (vease la Fig. 8.20). La importancia de la formacion de este lazo cerrado no es obvia, aunque podria tener muchos efectos, por ejemplo: • estimular Ia iniciacion de Ia traduccion; 166


• promover Ia reiniciacion de los ribosomas. de manera que cuando terminan en el extrema 3', las subunidades liberadas ya se encuentran cerca del extrema 5'. • estabilizar el RNAm contra la degradacion, y • perrnitir que los factores que se unen al extrema 3' regulen la iniciacion de la traduccion. La subunidad eiF2 es el factor clave en la unio1~ del Met-RNAti; se trata de una proteina monomerica de union con el GTP tfpica, la cual se activii cuando se une al GTP y se desactiva al unirse co1~ el difosfato de guanosina (GDP; guanine diphosphate). En la (, se muestra que el complej c> eiF2-GTP se une al Met-RNAti, producto que suele denominarse complejo ternario (debido a sus tre ' componentes, eiF2, GTP y Met-RNAt). En la .l se observa que el complejo ternario ubica al Met-RNAti sobre Ia subunidad 40S, lo cual genera el complejo de iniciacion 43S. La reaccion es independiente de Ia presencia de RNAm. De hecho, el Met-RNAti iniciador debe estar presente para que Ia subunidad 40S se una al RNAm. Uno de los factores de este complejo es el eiF3, necesario para mantener a las subunidades 40S en estado de disociacion. El eiF3 es un factor muy grande, formado por 8 a l 0 subunidades. El siguiente paso consiste en la union del complejo 43S con el extrema 5' del RNAm. En la GU se muestra que las interacciones implicadas en esta etapa no estan completamente definidas, pero probablemente involucren a eiF4 y eiF3, asi como al RNAm y ala subunidad 40S. La subunidad eiF4G se une al eiF3 para permitir que la subunidad ribosomica 40S se una a! eiF4F, y por lo tanto. sea reclutada en el complejo. En efecto, Ia funcio n del eiF4F es colocar al eiF4G de manera que pueda atraer ala subunidad ribosomica pequefia. Cuando Ia subunidad pequefia se ha unido al RNAm, migra (habitualmente) al primer codon AUG, evento que requiere de gasto de energia en forma de ATP, con ayuda de los factores eiFl y eiFlA. En la ~ · se observa que la sub-unidad pequefia se detiene cuando llega al sitio de iniciacion, formando un complejo 48S. La union de las subunidades 60S con el complejo de iniciacion no ocurre hasta que el eiF2 y el eiF3 han sido liberados de dicho complejo por mediacion del eiF5, de modo que el eiF2 hidroliza a su GTP. La reaccion ocurre en la subunidad ribosomica pequefia e implica que el RNAt iniciador este apareado con el codon de iniciacion AUG. Todos los factore s restantes probablemente sean liberados cuando se forma el ribosoma completo 80S. Por ultimo, el factor elF5B permite que la subunidad 60S se una con el complejo y forme un ribosoma intacto, listo para iniciar la elongacion. La

_·Jbunidad eiF5B tiene una secuencia similar a Ia -=-~! factor procariotico IF2, el cual tiene una fun cion :uilar en Ia hidrolisis del GTP (ademas de panicipar -:::-. Ia union del RNAt iniciador) . Una vez que los factores han sido liberados, pue_:::1 asociarse con el RNAt iniciador y las subunidades --._ sornicas en otro ciclo de in.iciacion. La subun.idad =:::2 ha hidrolizado a su GTP, y como resultado, debe :::generarse la forma activa, lo cual se logra por me__o de otro factor, el eiF2B, que desplaza al GDP para _..:e pueda ser remplazado por un GTP. La subunidad eiF2 constituye un objetivo para --= regulacion. Muchas cinasas reguladoras actuan == Ia subunidad a del eiF2. La fo sforilacion evita _. .:e el eiF2B regenere Ia forma activa, evento que - ·tala accion del eiF2B a un ciclo de iniciacion y, ~ : lo tanto, inhibe Ia sfntesis protefnica.

~ ••••

s ·..·

•••••••••••••••• •

~£

"'•' ~........ Ts····••• .. Tu·GTP ··.:· ~ . .... .....·

GTP "".I

Comple~···'

ternario

Tu-Ts

GDP wV,. ~

·..-:

•

....

El aa-RNAt entra al sitio A de Ia subunidad 308

El factor de elongaci6n Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A

.

.... . . . .. ...

Tu-GDP

El extremo CCA se desplaza al interior del sitio A de Ia subunidad 50S

El EF-Tu-GTP coloca al aminoacil-RNAt en el ribosoma y posteriormente es liberado en forma de EF-Tu-GDP. El EF-Ts es necesario para mediar el remplazo de GDP par GTP. La reacci6n consume GTP y Libera GDP. El unico aminoacil-RNAt que no puede ser reconocido par el EF-TU-GTP es el fMet-RNAt,, cuya incapacidad para unirse evita que responda a los codones internes AUG o GUG .

Conceptos pri nci pales • El EF-Tu es una protein a G monomerica cuya forma activa (unida al GTP) se une al aminoacil-RNAt. • El complejo EF-Tu-GTP-aminoacil-RNAt se une al sitio A ribos6mico.

_·::.a vez formado el ribosoma completo en el codon ~ miciacion, Ia etapa esta lista para un ciclo en el ~ el aminoacil-RNAt entra al sitio A de un ribo:::~a cuyo sitio P esta ocupado por peptidil-RNAt. ~ _a.lquier arninoacil- RNAt, excepto el iniciador, in=-::-:a al sitio A. entrada mediada por un factor de - ngacion (EF-Tu en las bacterias). El proceso es -=Jar en las eucariotas; el EF-Tu es una proteina -:· conservada en las bacterias yen las mitocon_ _; ;, yes homologo a su contraparte eucariotica. igual que su contraparte en la iniciacion (IF-2) , ~- Tu se asocia con el ribosoma solo en el proceso :: :-nnrada del aminoacil-RNAt, y una vez en su lu__;__-_- abandona al ribosoma para funcionar de nuevo : __ otro aminoacil-RNAt, de manera que exhibe ~ j acion y disociacion cfclica del ribosoma, una - .:.aerfstica distintiva de los factores rios. l a ruta de entrada del aminoacil-RNAt al sitio · .e ilustra en Ia GU L . El EF-Tu porta una __.:.::~ina. El factor es una protefna G monomeri::-Jya actividad es controlada por el estado de la -=..::tina:

• En presencia de GTP, el factor se encuentra en su estado activo. • Cuando el GTP es hidrolizado a GDP, el factor se desactiva.

• La actividad se restaura cuando el GDP es remplazado por GTP. El complejo binario formado por EF-Tu-GTP se une al aminoacil-RNAt para formar un complejo ternario constituido por aminoacil-RNAt-EF-TuGTP, el cual se une solo con el sitio A de los ribosomas cuyos sitios P ya estan ocupados por un peptidil-RNAt. Esta es reaccion es crftica para asegurar que el arninoacil-RL~At y el peptidil-RNAt esten correctamente posicionados para la formaci6n del enlace peptidico. El aminoacil-RNAt es cargado en el sitio A en dos etapas; primero, el extrema anticodon se une con elsitio Adela subunidad 305, y posteriormente, el reconocirniento codon-anticodon desencadena un cambio en Ia conformacion del ribosoma, fenomeno que estabiliza la union del RNAt y provoca que el EF- Tu hidrolice a su GTP. El extrema CCA del RNAt ahora entra alsitio A de Ia subunidad 50S yes liberado el complejo binario EF-Tu-GDP. Esta forma de EF-Tu esta desactivada y nose une al aminoacilRNAt de forma efectiva. Otro factor, el EF-Ts, media Ia regeneracion de la forma utilizada, EF-Tu-GDP a EF-Tu-GTP. Primero, el EF-Ts desplaza al GDP del EF-Tu para formar, asL el factor combinado EF-Tu-EF-Ts, que a su vez sera desplazado por el GTP, para reconstituir el EF-TuGTP. El complejo binario activo se une a! arninoacilRNAt y el EF-Ts liberado puede ser reciclado.

8.10 El factor de elongaci6n Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A

167

Hay -70 000 molecu las de EF-Tu par bacteria (-5% del total de las protefnas de Ia bacteria) , cifra

que se aproxima al numero de moleculas de aminoacil-RNAt. Esto implica que Ia mayor parte de los aminoacil-RNAt tiendan a presentarse en complejos ternarios. Hay solo -10 000 moleculas de EF-Ts por celula (mas 0 menos el mismo numero de ribosomas). La cinetica de Ia interaccion entre EF-Tu y EF-Ts sugiere que el complejo EF-Tu-EF-Ts existe solo transitoriamente, de man era que el EF-Tu se convierte muy rapidamente en Ia forma unida a GTP y despues en un complejo ternario. La funcion del GTP en el complejo ternario ha sido estudiada sustituyendolo con un analogo que no pueda ser hidrolizado. El compuesto GMP-P tiene un puente metilenico en vez del oxfgeno que se liga a los fosfatos ~ y y del GTP. En presencia de GMP-P puede formarse un complejo ternario que une el aminoacil-RNAt con el ribosoma, pero no puede formarse el enlace peptfdico, de manera que se necesita GTP para que el aminoacil-RNAt se una a! sitio A; Ia hidrolisis no es necesaria hasta despues. La kirromicina es un antibiotico que inhibe Ia fun cion del EF-Tu. Cuando este ultimo se une a Ia kirromicina, sigue siendo susceptible de unir el aminoacil-RNAt cone, pero el complejo EF-TuGDP no puede liberarse del cromosoma, su presencia continua evita la forma cion del enlace peptidico entre el peptidil-RNAt y el aminoacil-RNAt, de tal forma que el ribosoma se queda "atascado" en el RNAm, frenando la sintesis proteinica. Este efecto de Ia kirromicina demuestra que Ia inhibicion de uno de los pasos de Ia sintesis protefnica bloquea el siguiente porque la presencia continua del EF-Tu impide que el extremo aminoacilo del

aminoacil-RNAt entre al sitio Adela subunidad 50S (vease Ia Fig. 8.31), de modo que para que el ribosoma lleve a cabo Ia formacion del enlace peptfdico . es necesaria Ia liberacion del complejo EF-Tu -GDP. El mismo principio se observa en otras etapas de la sfntesis protefnica: una reaccion debe terminar d.e forma adecuada antes de que pueda tener Iugar la siguiente. La interacci6n con EF-Tu tam bien desempefi.a una funci6n en el control de calidad. Los aminoacilRNAt son introducidos en el sitio A sin saber si sus anticodones corresponderan con el codon. La hidr6lisis del EF-Tu -GTP es relativamente leota; el tiempo que necesita un aminoacil-RNAt para disociarse del sitio A es mayor del necesario, por lo tanto, Ia mayor parte de las especies incorrectas son eliminadas en esta etapa. La liberaci6n del EF-Tu-GDP despues de Ia hidr6lisis tambien es leota, asf que cualquier aminoacil-RNAt incorrecto, sobreviviente, puede disociarse en esta etapa. El principio basico es que las reacciones que involucran a! EF- Tu ocurren con Ia lentitud suficiente como para permitir que los RNAt incorrectos se disocien antes de que queden atrapados en Ia sfntesis protefnica . En las eucariotas, el factor elF es el responsable de acarrear el aminoacil-RNAt al ribosoma, tambien en una reaccion que implica la division de un enlace de alta energfa del GTP, que igual que su hom6logo procari6tico (EF-Tu) , es una proteina abundante. Despues de Ia hidr6lisis del GTP, la forma activa es regenerada por el factor eEFl ~y, contra parte del EF-Ts.

1111

La cadena polipept1dica se transfiere al aminoacil-RNAt

Conceptos principales • La subunidad 505 tiene actividad peptidil transferasa. • La cadena polipeptidica naciente se transfiere del peptidil-RNAt del sitio P al aminoacil-RNAt del sitio A. • La sintesis de enlaces peptidicos genera RNAt desacilado en el sitio P y peptidil-RNAt en el sitio A.

La formaci6n del enlace peptidico se debe a la reacci6n que ocurre entre el polipeptido del peptidil-RNAt en el sitio P y el aminoacido del aminoacil-RNAt en el sitio A.

168


El ribosoma se mantiene en posicion mientras Ia cadena polipeptfdica se alarga al transferir el polipeptido adherido a! RNAt en el sitio P a! aminoacil-RNAt del sitio A. La reacci6n se ilustra en Ia " . La actividad responsable de Ia sfntesis del enlace peptfdico se llama peptidil transferasa . La naturaleza de la reaccion de transferencia es revelada por Ia capacidad del antibiotico puromicina, asemeja a un aminoacido adherido a Ia adenosina terminal del RNAt, para inhibir Ia sfntesis protefnica . En Ia !s se muestra que dicho antibi6tico tiene un N en vez del 0 que une un

- _; wacido al RNAt, y es tratado por el ribosoma - ::Jo sifuera un aminoacil -RNAt entrante, despues ~ .o cual el polipeptido adherido al peptidil-RNAt . ::::-ansferido al grupo NH, de la puromicina. La porcion de puromicina no esta anclada al __ Cl A del ribosoma, por lo que de este es bberado el - -ducto polipeptidil-puromicina. Esta terminacion ·::-::natura de la sfntesis protefnica es Ia causa de la . :ion leta! del antibiotico. La peptidil transferasa es una funcion de la sub·dad ribosomica grande (50S o 60S). La reaccion : desencadena cuando el EF-Tu lib era el extremo ~inoacilo de su RNAt, que despues se traslada a . :-: sitio cercano al extremo del peptidil-RNAt cuya - :-;:,·idad peptidil transferasa asegura esencialmente ::::-ansferencia rapida de ]a Cadena peptfdica al ami::dl-RNAt. El RNAr y las protefnas de la subuni. ::! 50S son necesarias para dicha actividad, pero Ia ....: ~ i sis es una propiedad del RNA ribosomico de la . ::-unidad 50S (vease la seccion 8.19, El RNAr 23S .. e actividad peptidil transferasa).

NH 2

I

c

N,__C/ ' N 1.1 I Base \ .......-C.....__ -:P""CH

HC/

tRNA

I

N

b~o~/ 1\

H\•

Azucar/ 0

N

aminoacii-RNAt

I

C-C I

I

0

OH

I

O~C-CH-R

I NH 2

Aminoacido

Puromicina

8.2 ~ La puromicina imita al aminoacil-RNAt porque ..:. :~ m ejante a un aminoacido aromatico ligado a una porci6n ..:::...::.u -base.

liD La translocaci6n mueve al ribosoma Conceptos princi pales • La translocaci6n ribos6mica desplaza al RNAm tres bases a lo largo del ribosoma. • La translocaci6n lleva al RNAt desacilado al interior del sitio E y al peptidil-RNAt al interior del sitio P, ademas de vaciar el sitio A. • El modelo del estado hibrido propane que la translocaci6n ocurre en dos etapas, en las cuales la subunidad 505 se mueve respecto de la subunidad 305, y posteriormente esta se desplaza a lo largo del RNAm . para restaurar la conformaci6n original.

El ciclo de adicion de aminoacidos a la cadena polipeptfdica creciente culmina con la translocacion, cuando el ribosoma avanza tres nucleotidos a lo largo del RNAm . En Ia ~ se observa que la translocacion expele al RNAt descargado del sitio P para que pueda entrar el nuevo peptidil-RNAt, de modo que el ribosoma tiene un sitio A vado listo para Ia entrada del aminoacil-RNAt correspondiente al siguiente codon. Como se muestra en Ia figura, en las bacterias, el RNAt descargado es transferido del sitio PalE (del cual es expelido bacia el citoplasma). En las eucariotas se expulsa directamente al citosol. Los sitios A y P se extienden a ambos !ados, hasta abarcar la subunidad grande y Ia pequefia; el sitio E (en las bacterias) se localiza principalmente en la subunidad 50S, pero tiene algunos os en la 30S. Casi todas las ideas en torno a Ia translocacion se gufan por el modelo de estado hfbrido, el cual propone que tiene dos etapas. En la l se muestra que primero hay un cambia de la subunidad 50S respecto de la 30S, seguido de un segundo cambio que tiene Iugar cuando la subunidad se mueve a lo largo del RNAm para restaurar Ia conformacion original. La base de este modelo fue la observacion de que el patron de os del RNAt con el ribosoma (medidos por la impresion qufmica de las hu ellas) cambia en dos etapas. Cuando se agrega puromicina a un ribosoma que tiene un RNAt aminoacilado en el sitio P, los os del RNAt en Ia subunidad 50S cambian del sitio Pal sitio E, pero los os con Ia subunidad 30S no cambian, lo cual sugiere que Ia subunidad 50S se ha despla zado a un estado de postransferencia, si bien Ia subunidad 30S no ha cambiado. La interpreta cion de estos resultados sugiere que los extremos aminoacilo de los RNAt (localizados en la subunidad 50S) se mueven primero a sitios nuevas (mientras que los extremos anticodon permanecen unidos a sus anticodone s en 8. 12 La translocaci6n mueve al ribosoma

169

Sitio E

Sitio A Sitio P La subunidad 508 se desplaza respecto de Ia subunidad 308

Postranslocaci6n: El RNAt desacilado se mueve al sitio E; el peptidii-RNAt se desplaza al sitio P

Un ribosoma bacteriano tien e tres sitios de union con el RNAt. El aminoacil-RNAt entra al sitio A de un ribosoma que tiene peptidil-RNAt en el sitio P. La sintesis del enlace peptidico desacila al RNAt del sitio P y genera peptidilRNAt en el sitio A. La translocacion mueve al RNAt desacilado al interior del sitio E y desplaza al peptidil-RNAt al interior del sitio P.

la subunidad 30S) . En esta etapa, los RNAt estan unidos efectivamente a sitios hfbridos, formados por los sitios 50SE/30S P y 50SP/3 0S A. Despues, el movimiento se extiende a las subunidades 30S, de manera que la region de apareamiento anti codon- codon se encu entra en el sitio correcto. El medio mas probable para crear el estado hfbrido es el movimiento de una subunidad ribosomica respecto de la otra, de manera que la translocacion efectivamente implica dos etapas y la restauracion de la estructura normal del ribosoma sucede durante la segunda. El ribosoma enfrenta un dilema interesante en Ja translocacion, pues tiene que romper muchos de sus os con el RNAt para permitir el movimiento, pero al mismo tiemp o debe mantener el 170


J

't

Los modelos de translocacion constan de dos etapas. Primero, en la form acion del enlace peptidico, el extrema ami noaci lo del RNAt localizado en el sitio A es reubicado en el P. En la segunda etapa, el extrema anticodon del RNAt se traslada al sitio P.

apareamiento entre el RNAt y el anticodon (rompiendo el apareamiento del RNAt desacilado en el momenta preciso). Una posibilidad es que el ribosoma cambie entre conformaciones alternas y discretas. El cambio puede consistir en variaciones en el apareamiento de bases del RNAr. La precision de la traduccion depende de ciertas mutaciones que influyen en el apareamiento alterno de las bases de las secuencias. La interpretacion mas probable es que el efecto es media do porIa estrech ez de Ia union de las conformaciones alternas con el RNAt.

1111

Los factores de elongaci6n se unen alternativamente al ribosoma

Conceptos principales • La translocacion requiere del EF-G, cuya estructura es semejante ala del complejo aminoacil-RNAt-EF-Tu-GTP. • La union de EF-Tu y de EF-G al ribosoma es mutuamente exclusiva. • La translocaci6n requiere de la hidrolisis de GTP, la cual desencadena un cambio en la estructura del ri bosoma.

-'- :ranslocacion requiere de GTP y de otro factor : clongacion, denominado EF-G, el cual es uno de _:actores constituyentes mayoritarios de Ia celula, - ~~ hay -1 copia por ribosoma (20 000 moleculas ~ celula). Los ribosomas no pueden unirse al EF-Tu y al -:=:~ - G simultaneamente, de modo que Ia sfntesis -_ :efnica sigue el ciclo ilustrado en Ia Figura 8.31, - ~ ~ cuallos factores se unen al ribosoma y se libe--: eel alternativamente, por lo tanto, el complejo -=-:: -Tu-GDP debe ser liberado antes de que el EF-G .eda unirse; despues, el EF-G debe ser liberado ._es de que pueda unirse al complejo aminoacil- -_\t-EF -Tu-GTP. (.La capacidad que tiene cada factor de elonga:) para excluir a otro se basa en un efecto alas:--: o sabre la conformacion total del ribosoma o :a competencia directa por sitios de union su :-:-;mestos? En la U se observa una simi...!d extraordinaria entre las estructuras del com- ~ ternario de aminoacil -RNAt-EF-Tu-GDP y el .: --G. La estructura de este ultimo es similar a Ia - _--u ctura global del EF-Tu unido al tallo aceptor : aminoacido del aminoacil-RNAt, de donde la __jeiura inmediata de que completan el mismo _o de union (presumiblemente en las cercanfas =-- ·itio A). La necesidad de cada factor de ser libe- .: antes de que el otro pueda unirse, garantiza _:- los eventos de Ia sfntesis protefnica proceden : :nanera ordenada. .Ambos factores de elongacion son protefnas . omericas de union al GTP las que se activan j as a este, pero estan inactivas cuando se unen ~ DP . Para la union a! ribosoma se necesita Ia for' :rifosfatada para asegurar que cada factor tenga : :~ so a! ribosoma solo en compafifa del GTP que ~.: e sita para cumplir con su funcion. El EF-G se une a! ribosoma para promover la _...::cslocacion yes liberado despues del movimiento :i.bosoma. El EF-G aun puede unirse al ribosoma ~ GMP-P es sustituido por GTP; por lo tanto, ':--:;: Ia union es necesaria la presencia de guanina, _-.que su hidrolisis no es absolutamente esencial _~ la translocacion (si bien la translocacion es mu. - :nas lenta sin Ia hidrolisis del GTP). La hidrolisis : S TP es necesaria para liberar al EF-G. La necesidad de la liberacion del EF-G se des-::·0 por los efectos del acido fusfdico, antibiotico _:- ~oideo que "atasca" al ribosoma en ese estado ~e rior a la translocacion (vease la ). =- _resencia de acido fusfdico ocurre un ciclo de o.= -locaci6n: el EF-G se une a! ribosoma, el GTP es ..:o1izado y el ribosoma se mueve tres nucleotidos. _ embargo, el acido fusfdico estabiliza el complejo - ~ s oma-EF-G-GDP, de manera que el EF-G y el =? permanecen en el ribosoma en Iugar de ser

Aminoacii-RNAt-EF-Tu-GTP

La estructura del complejo ternario aminoacilRNAt-EF-Tu-GTP (izquierda) es semejante a la del EF-G (derecha). La estructura conservada de los dominios del EF-Tu y del EF-G se encuentran en color rojo y verde; el RNAt y el dominio del EF-G semejante a el es purpura. Imagen cortes1a de Paul Nissen, University of Aarhua, Denmark.

.. . .

Union del aminoacii-RNAt EF-Tu-GTPaminoacii-RNAt

Hidr61isis de GTP

Sfntesis del enlace peptidico

EF-G + GOP

EF-G/GTP El acido fusidico I bloquea Ia #•~ ~., liberaci6n , ......

--""'

La union de los facto res EF-Tu y EF-G se altern a conforme los ribosomas aceptan nuevas aminoacil-RNAt forman los enlaces pept1dicos y se transfieren a otra posicion.

8.13 Los factores de elongacion se unen alternativamente al ribosoma

171

liberados, de modo que este ultimo no puede unirse al aminoacil-RNAt y no se agregan mas aminoacidos a Ia cadena. La translocacion es una propiedad intrlnseca del ribosoma que requiere de un cambia mayor en Ia estructura (vease Ia seccion 8.17, Los ribosomas tienen numerosos centros activos), sin embargo, es activada por el EF-G aunado a Ia hidrolisis del GTP, que ocurre antes de Ia translocacion y acelera el movimiento del ribosoma. El mecanismo mas probable consiste en que Ia hidrolisis de GTP provoca un cambia en Ia estructura del EF-G, el cual a su vez fuerza un cambia en la estructura del ribosoma. En la translocacion tiene Iugar una reorientacion del EF-G que, antes de esta, se encuentra unido mediante las dos subunidades ribosomicas. La mayor parte de sus os con Ia subunidad 30S depende de una region Hamada domin.io 4, que se inserta en el sitio A y que puede ser responsable de desplazar al RNAt. Despues de Ia translocacion, el dominio 4 estara, por el contrario, orientado bacia Ia subunidad 50S. La contraparte eucariotica del EF-G es la protelna eEF2, la cual funciona de forma similar a una translocasa dependiente de Ia hidrolisis de GTP cuya accion tambien es inhibida por el acido fusfdico. Es posible aislar un complejo estable formado por eEF2 y GTP, en tanto que el complejo puede unirse a los ribosomas con Ia consiguiente hidrolisis de su GTP. Una reaccion unica del eEF2 es su susceptibilidad a Ia toxina difterica, que utiliza dinucleotido de nicotinamida y adenina (NAD, nicotinamide adenine dinucleotide) como cofactor para transferir una porcion de ribosil-adenosina difosfato (ADPR, adenosine diphosphate ribosyl) al eEF2. El conjugado ADPR-eEF2 esta inactivo en Ia sfntesis protelnica. El sustrato al que se une dicho conjugado es un aminoacido in usual que se produce al modificar una histidina; es comun al eEF2 de muchas especies. La ribosilacion del ADP provoca los efectos letales de Ia toxina difterica. La reaccion es extremadamente efectiva, pues una sola molecula puede modificar suficientes moleculas de eEF2 como para matar una celula.

La sintesis protei nica termi na con tres codones Conceptos principales • Los codones UAA (ocre), UAG (ambar) y UGA terminan la sintesis proteinica. • En las bacterias se utilizan muy a menudo con frecuencias relativas UAA>UGA>UAG.

172

CAPiTULO 8 Sintesis proteinica

Solo 61 tripletes son asignados a aminoacidos, I otros tres son codones de terminaci6n (o cod nes de parada) con los que concluye Ia sfnte_ protefnica cuyos nombres informales provienen Ia historia de su descubrimiento. El triplete UAG e llama do codon ambar, el UAA es el codon ocre y secuencia UGA suele denominarse codon 6palo. En un principia, las caracteristicas de estos r:- pletes se demostraron mediante un analisis geneti por el que se distinguieron dos tipos de mutacion ~. puntuales: • La mutacion puntual que modifica a un c don de manera que represente a un am, noacido diferente se denomina mutacion c.~ cambio de sentido. Un aminoacido ren::plaza a otro en Ia proteina, y el efecto en ·: funcion de Ia proteina depende del sitio dla mutacion y de Ia naturaleza del remplaz del aminoacido. • Cuando una mutacion pumual crea uno clos tres codones de terminacion, da Iugar : una terminaci6n prematura de Ia sfnte~ protelnica del codon mutante y en Ia celu:: mutante solo se produce Ia primera parte · la protelna. Este fenomeno tiende a supri.n:li: Ia funcion protefnica (dependiendo, por Sl.!puesto, de que tan lejos en Ia protefna seer cuentre el sitio mutante). Un cambia de es-:: tipo se denomina mutaci6n sin sentido. (En ocasiones, el termino codon sin sentido s: utiliza para describir a los tripletes de terminacio .. La expresion "sin sentido" es erronea, dado que 1 _ codones sf tienen significado, aunque perjudicial e: un gen mutante. Un termino mas adecuado es "c don determinacion"). En los genes secuenciados, uno de los codon de terminacion se ubica inmediatamente despu ·: del codon que representa al aminoacido terminC.: C de Ia secuencia de tipo silvestre. Las mutacion : sin sentido muestran que cualquiera de los tres codones basta para term.inar Ia sfntesis protelnica er: un gen. Las secuencias de los tripletes UAG, UAA: UGA son, por lo tanto, necesarias y suficientes par;: terminar Ia sfntesis protefnica si ocurren de manernatural al final de un gen o son creadas por mutacion en una secuencia codificadora. En los genes bacterianos, el triplete UAA es e' codon de terminacion mas comunmente utilizado La secuencia UGA se utiliza con mayor frecuencic que Ia UAG, aunque parece haber mas errores er. la lectura de Ia UGA. (Un error alleer un codon de terminacion, cuando el aminoacii-RNAt responde ii el equivocadamente, resulta en la continuacion de Ia sintesis protelnica h asta que se en cuentra otro codon de terminacion.)

Los codones de terminaci6n son reconocidos por fa ctores protei nicos :onceptos principales • Los codones de terminaci6n son reconocidos por factores de liberaci6n de prote1nas, no por moleculas de aminoacil-RNAt. • Las estructuras de Los factores de liberaci6n clase 1 son semejantes a las del aminoacil-RNAt-EF-Tu y del EF-G. • Los factores de liberaci6n clase 1 responden a codones de terminaci6n espedficos e hidrolizan La ligadura polipeptido-RNAt. l os factores de liberaci6n clase 1 son asistidos por los de liberaci6n clase 2 que dependen del GTP.

~ctores

tl mecanisme es similar en las bacterias (que tienen dos tipos de factores de liberaci6n clase 1) y en las i!ucariotas (que tienen s6lo un factor de liberaci6n :lase 1).

:: :ill de la traduccion implica dos etapas. La reacci6n ::rminaci6n tiene que ver con Ia liberacion de Ia · ::_na protefnica del ultimo RNAt, en tanto que -:acci6n de posterminaci6n implica Ia liberacion del - _· t y del RNAm y la disociacion del ribosoma . ~inguno de los codones de terminacion es re -:: ·entando por un RNAt, funcionan de man era <.diferente a los otros codones y son reconocidos ::::tamente por factores proteinicos. (La reaccion epende del reconocimiento codon-anticodon, :-. tanto, parece no haber una razon en particu~ · ejustifique que su funcion requiera de una se:: .cia de tres nucleotidos. Presumiblemente esto · -::ala evolucion del codigo genetico.} .:. . s codones de terminacion son reconocidos ~ : s factores de liberaci6n (RF, release factors) . : l . En E. coli, por ejemplo, dos factores de libe:1 clase l son espedficos para secuencias dife: _·. El RFl reconoce a los codones UAA y UAG, ' to que el RF2 identifica a las secuencias UGA - --~·Los factores actuan en el sitio A ribosomico :~'..l ieren de polipeptidil-Rl'l"At en el sitio P. Los - -o:an presentes en niveles mucho mas bajos que :2:tores de iniciacion y de elongacion; hay -600 ~ - las de cada uno por celula, que equivale a un -. : cada 10 ribosomas. Quiza en algun momen~:tia solo un factor de liberacion que reconoda .:. ) S los cod ones de terminacion, el cual evolu: . osteriormente para formar dos factores con : ::::.Scidades para cod ones especfficos. En las eu·;s hay solo un factor de liberacion clase l, de -.ado eRF. La eficiencia con la cuallos factores ---ianos reconocen a sus codones diana depende ases que se encuentran en ella do 3'.

Los factores de liberacion clase l son asistidos por los factores de liberacion clase 2, que no son especificos de ningun codon. Los factores clase 2 son protefnas de union a! GTP. En E. coli, la funcion del factor clase 2 es liberar al factor clase l del ribosoma. Aunque el mecanismo de term.inacion general es similar en las procariotas y las eucariotas, las interacciones entre los factores clase l y clase 2 presentan algunas diferencias. Los factores de clase l , RFl y RF2, identifican a los codones de terminacion y activan el ribosoma para hidrolizar a! peptidil-RNAt. La division del polipeptido y el RNAt tiene lugar mediante una reaccion analoga a la transferencia usual del grupo peptidil, excepto que el aceptor es H2 0 en vez de aminoacil-Rl'l"At (vease Ia Fig. 8.34) En este punto, el RFl o el RF2 es liberado del ribosoma por el factor clase 2 RF3, que esta relacionado con el EF-G. El RF3-GDP se une a! ribosoma antes de que ocurra Ia reaccion de terminacion y el GDP es remplazado por GTP, lo cual faculta al RF3 para ar al centro GTPasa del ribosoma, donde provoca Ia liberacion de los RFl /2 cuando se termina Ia cadena polipeptfdica. El RF3 se asemeja a los dominios de union del EF-Tu y del EF-G con el GTP, en tanto que el RFl y el RF2 son similares al dominio terminal C del EF-G, parecido a! RNAt. Esto sugiere que los factores de liberacion utilizan el mismo sitio empleado por los factores de elongacion. En la se ilustra la

,

,1

,. , ,

EF-Tu

RNA!

, /

, t! ~

EF-G

; #

#

#

SitfoP Sitio E Silio~

~~ ~

'' '

RF3 ~

~

RF1 /2

~ ~

~(

RRF

El mimetismo molecular permite que el complejo factor de elongaci6n Tu-RNAt, el factor de translocaci6n EF-G y los factores de liberaci6n RF1/ 2-RF3 se unan al mismo sitio ribos6mico . El RRF es el factor de reciclaje del ribosoma (vease La Fig. 8.35).

8.15 Los codones de terminaci6n son reconocidos por factores proteinicos

173

GGO

sucesiva en el mismo sitio (basicamente el sitio -~ una region sobrepuesta a esta). El factor eucariotico de liberaci6n clase l. : eRFl, es una proteina individual que reconocclos tres codones de terminacion cuya secuencia esta relacionada con la de los factores bacteria~: y puede terminar Ia sintesis proteinica in vitro ~ · el facto r clase 2, eRF2, aunque in vivo es esend' en las levaduras . La estructura del eRFl sigue- contexto familiar; en Ia se muestra q-_. esta formada por tres dominios que simulan Ia etructura del RNAt. Un componente esencial de los tres aminoacio GGQ se exhibe en Ia parte superior del dominio ::. Su posicion en el sitio A cm·responde a Ia loca· zacion usual de un aminoacido en un aminoa c RNAt, lo cuallo posiciona para utilizar la glutamir(Q) para sustituir al aminoacido del aminoacil-RN.con una molecula de agua en Ia reacci6n de trar.: ferencia del grupo peptidilo. En Ia 3 := compara la reacci6n determinacion con Ia de tran . . ferencia peptidica usual. La terminaci 6n transfie: un grupo hidroxilo del agua e hidroliza de mane~ efectiva el enlace peptido-RNAt (vease Ia Fig. 8 ...; ~ para Ia descripcion de como funciona el centro pe ~ tidil transferasa). Las mutaciones en los gene s RF reducen la e:':ciencia de Ia terminacion, como se observa por u:incremento de Ia capacidad para continuar Ia sfr. tesis proteinica mas alia del codon de terminaci6::. La expresio n excesiva de RFl ode RF2 incremen·-' Ia eficiencia de Ia terminaci6n en los codones en lc cuales actua, lo cual sugiere que la identificacio:: de estos por uno u otro compite con los aminoaci:RNAt que reconocen erroneamente a los codon _ de terminaci6n. Los factores de liberacion identif can sus secuencias diana de forma muy eficiente. La reaccion de terminaci6n implica la liberaciodel polipeptido completo, pero deja a un RNAt des&cilado y al RNAm todavia asociadas con el ribosoma. En Ia se muestra que Ia disociacion de let' componentes restantes (RNAt, RNAm y subunidades 30S y 50S) requiere del factor de reciclaje del ribosoma (RRF, ribosome recycling factor). El RRF actu.; con el EF-G en una reacci6n que utiliza Ia hidrolisis de GTP. En cuanto a los on·os factores implicados er Ia liberacion, Ia estructu ra del RRF imita al RNAt excepto que ca rece de un componente equivalentc de Ia region 3' de union al aminoacido. Tambih se necesita IF- 3 para cerrar el ciclo de cuando fue descubierto originalmente y se propuso que jera uu: factor de disociacion! El RRF actua sobre Ia subunidad 50S y el IF-3 elimina el RNAt desacilado de Ia subunidad 30S. Obviamente, una vez que se han separado las subunidades, el IF- 3 sigue siendo necesario para evitar que vuelvan a asociarse.

=

Dominio 1 (extrema anticodon)

La estructura del factor de terminaci6n eucari6tico eRFl imita a la del RNAt. El componente GGQ localizado en la punta del dominio 2 es esencial para hidrolizar a la cadena polipeptidica del RNAt. Imagen cortesia de David Barford, The Institute of Cancer Research.

Elongaci6n

Terminaci6n

Centro de transferencia del peptidilo

Centro de transferencia del peptidilo

Base: Sitio P cadena peptrdica H-NI

s ;tloP " ' " H

cadena peptfdica

~' :N

H-C-R I

~c,

, c~

0

0

I

0 I

·o

I

~~~-R rH.: H: c I

I

H-C-R I

j

0

cf ' o

' :,

I

RNA!! RNA!

RNAt

:

'

' 1' I

cadena peptfdica

CH I

I

H-N

1

I

crC, N' H I

H-C-R I

..c~

H

0 I

RNA!

0 I

r,

cadena peptfdica

H-C-R

I

H-N

RF1

I

H-C-R I cfc'oH

0

RNAt

La transferencia y la terminaci6n del peptido son reacciones similares en que una base del centro de transferencia del grupo peptidilo desencadena una reacci6n de transesterificaci6n al atacar a un enlace N-H u 0-H, liberando al N o al 0 para que ataque la ligadura formada con el RNAt.

idea basica de que tod os estos factore s tiene la misma forma general y se unen a! ribosoma de forma 17 4


El RNA ribos6mico abarca

ambas subunidades ri bos6 micas

1. El RF Iibera a Ia prote fna

2. El RRF entra al siti o A

U!nceptos principales Cada RNAr tiene muchos dominios distintos que se doblan de manera independiente. • Virtualmente todas las prote\nas ribos6micas estan en o con el RNAr. La mayor parte de los os entre las subunidades ri bos6micas se realiza entre los RNAr 165 y 235. 3. El EF-G tran sfiere al RR F

tercios de la masa de los ribosomas bacterianos constituidos por RNAr. El enfoque de anali..: nas penetrante de Ia estructura secundaria de . h~culas grandes de RNA consiste en comparar - secuencias de los RNAr correspondientes en or' =-lismos relacionados. Dichas regiones importantes = Ia estructura secundaria conservan la capacidad ::- interactuar por apareamiento de bases, de modo _e si se requiere de un par de ellas, puede formarse =- Ia misma posicion relativa de cada RNAr. Este =: i :odo ha permitido la creaci6n de modelos deta-..:.dos del RNAr l6S y del RNAr 23S. Los principales RNAr pueden trazarse en una ~"":TUctura secundaria con numerosos dominios dis=.:::os. En el RNAr 16S, que forma cuatro dominios _.: :lerales, poco menos de la mitad de la secuencia ·.: -enta apareamiento de bases (vease Ia Fig . 8.45), ~ :anto que el RNAr 23S forma seis. Las regiones de ~ le helice individuales tienden a ser cortas (<8 bp) ; :-:. frecuencia, las regiones dtiplex no son perfectas :ontienen abultamiemos de bases no apareadas. _:._ ;e han trazado modelos comparables de los RNAr ---.::ocondriales (mas cortos y con menos dominios ) y . ~ :os RNAr del citosol eucari6tico (mas largos y con -::::.is dominios). La mayor longitud de los RNAr eu.2:i6ticos se debe principalmente a Ia adquisici6n de .:..:-c~ encias que representan a dominios adicional es. -=. estructura cristalina (o tridimensional) del ribo:Da muestra que en cada subunidad, los dominios :_ RNAm mayor se pliegan independientememe y -~ p an un Iugar discreto. Cuando las subunidades 30S se comparan con _ ribosomas 70S se encuentran diferencias en la "!Jacidad del RNAr 16S para reaccionar con los -=::'ntes quimicos; asimismo, hay diferencias entre .:. ribosomas libres y los comprometidos en la sime:- roteinica. Los cambios de reactividad del RNAr c ;:nesentan cuando el RNAm esta unido, cuando se : cian las subunidades o cuando se ha incorporado :{.\fAt. Algunos cambios reflejan una interacci6n -~eta del RNAr con el RNAm o el RNAt, miemras _-: otros son provocados indirectamente por cam~ - adicionales en Ia estructura del ribosoma. El 5

: ~:an

El RF (factor de liberaci6n) termina la sintesis prote\nica liberando a la proteina. El RRF (factor de reciclaje del ribosoma) libera al ultimo RNAt y el EF-G libera RRF, provocando la disociaci6n del ribosoma.

pumo principal es la flexibilidad de la conformaci6n del ribosoma durante Ia sfntesis proteinica. Una caracterfstica de Ia estructura primaria del RNAr son los residuo s m etilados. Hay -10 grupos metilo en los RNAr 16S (l ocalizados principalmente bacia el extrema 3' de la molecula) y -20 en el RNAr 23S. En las celulas de los mamfferos, el RNAr l8S y el 28S portan 43 y 74 grupos metilo, respectivamente, de modo que - 2 % de los nucle6tidos estan metilados (aproximadamente tres veces la proporci6n de metilados en las bacterias) . La subunidad ribos6mica grande tambi61 contiene una molecula de RNA 5S de unas 120 bases (en todos los ribosomas, ex cepto en los de las mitocondrias). La secuencia del RNA 5S noes tan buen como Ia de las secuencias de los RNAr mayores. Todas las moleculas de RNA 5S exhiben una estructura con intenso apareamiento de bases. En los ribosomas del citosol de las eucariotas esta presente otro RNA pequeiio en Ia subunidad grande, el RNA 5.85. Su secu encia corresponde a! extrema 5' del RNAr 23S procari6tico. Algunas proteinas ribos6micas se unen fuertemente al RNAr aislado; otras no se unen al RNAr libre, pero pueden hacerlo de spues de !a incorporaci6n de otras protefnas, lo cual sugiere que Ia conformaci6n del RNAr es importante para determinar 8.16 El RNA ribos6mico abarca ambas subunidades ribos6micas

175

Surco rico en RNA

~ Plataforma Cabeza

Cuello Cuerpo

La subunidad 30S tiene una cabeza separada del cuerpo por un cuello, con una plataforma protuberante.

Protuberancia central 58

Pedunculo

\

Hendidura

La subunidad 50S tiene una protuberancia central donde se encuentra el RNAr 5S, separada por una hendidura del pedunculo formado por copias de la prote1na L7.

La plataforma de la subunidad 30S embona en la hendidura de la subunidad 50S para formar el ribosoma 70S.

La subunidad ribos6mica 30S es una part1cula ribonucleoprote1nica. Las prote1nas se muestran en color amarillo. Imagen cortes1a de V. Ramakrishnan, Medical Research Council (UK).

si existen sitios de union para algunas proteinas. Conforme se une cada una de estas, introduce cam-

176

CAPITULO 8 S1ntesis prote1nica

bios conformacionales en el RNAr que hacen po· sible la incorporacion de mas proteinas. En E. co.· virtualmente todas las proteinas ribosomicas 30S in · teractuan (si bien en diferente medida) con el RN.k 16S. Los sitios de union localizados en las proteina~ muestran una amplia variedad de caracteristicas estructurales que sugiere diferencias en los mecanismos de reconocimiento proteina-RNA. La estructura del ribosoma 70S es asimetrica_ En la se observa una representacion esquematica de la estructura de la subunidad 30S, qut se divide en cuatro regiones, cabeza, cuello, cuerpCi y plataforma, y en la , una represe!il tacion similar de la 50S, donde dos caracteristica< prominentes son la protuberancia central (dondc se localiza el RNAr 5S) y el pedunculo (formad o por m{Iltiples capias de la proteina L7). En Ia I se muestra que la plataforma de la subunidac pequefia encaja en la hendidura de la grande; entre ambas subunidades hay una cavidad que contient algunos de los sitios importantes. La estructura de !a subunidad 30S sigue la organizacion del RNAr 16S, en donde cada caracteristica estructural corresponde a un dominio. El cuerp o esta basado en el dominio 5', la plataforma en e: central y Ia cabeza, en la region 3'. En la 3 se muestra que la distribucion de RNA y proteinas de la subunidad 30S es asimetrica. Una caracteristica importante es que !a plataforma de esta subunidad. que proporciona la interfase para la subunidad 50S . esta compuesta casi por completo de RNA. Solo do s proteinas (una parte pequefia de !a S7 y posiblemente de la S 12) se localizan cerca de la interfase. es decir, que la asociacion y la disociacion de las subunidades ribosomicas deben depender de las interacciones con el RNAr 16S. La asociacion de las subunidades experimenta una mutacion en un lazo de RNAr 16S (posicion 719), localizado en la interfase de la subunidad, ademas de que por medio de experimentos de modificacion/interferencia se ha demostrado que otros nucleotidos del RNAr 16S estan involucrados. Este comportamiento respalda la idea de que el origen evolutivo del ribosoma pudo haber sido una particula formada por RNA y no par proteinas. La subunidad 50S presenta una distribucion de componentes mas uniforme que la 30S, con varillas largas de RNA de doble cadena que entrecruzan la estructura. El RNA forma una masa de helices estrechamente empaquetadas. La superficie exterio[ consta principalmente de proteinas, con excepci6n del centro peptidil transferasa (vease la seccion 8.19, El RNAr 23S tiene actividad peptidil transferasa). Casi todos los segmentos del RNAr 23S interactuan con las proteinas, si bien muchas de las proteinas carecen relativamente de estructura.

La union de las subunidades en el ribosoma 70S lica os entre el RNAr l6S (muchos en Ia -=_?.ion de Ia plataforma) y el 23S, asf como algunas :::-racciones entre el RNAr de cada subunidad con _ roteinas de la otra, y pocos os protefna: _reina. En la se identifican los puntas =:ontacto de las estructuras del RJ\fAr. En Ia se abre la estructura (imagfnese Ia subunidad --- rotada en direccion contraria a las manecillas :-: reloj y Ia 30S en sentido contrario, en torno a! :: :le Ia figura) para mostrar las localizaciones de los _ .tos de o en Ia cara de cada subunidad.

A

70Q 710 J

e9o 185.0 900 1830 ' >#' •1920 1700 17\~61) '1930 169'0

89o-

89o 1400-

1 99~ 1950 35Q

·880 ~10 ~

790. _ ,8oo 780 770-

340

14101420. 1430.

numerosos centros activos '

~ceptos

principales

,1520

·i~~g

~~~~g

72rf

Jl

RNAr 23S

Los ribosomas tienen

-9oo

RNAr 16S

Los puntas de o entre los RNAr estan localizados en dos dominies de RNAr 16S yen uno de RNAr 23S. Reproducida de Yusupov, 1"1. M. 2001. Science. 2g2: 883 - 8g6. © 2001 AAAS. Imagen cortes\a de Harry Noller, University of California, Santa Cruz.

__as interacciones en que esta implicado el RNAr son : lave para la funci6n del ribosoma.

:t ambiente de los sitios de union al RNAt depende ::mpliamente del RNAr. -=: ::~ ensaje

basico que no debe olvidarse sabre el -: ·oma es que se trata de una estructura coope- ·a que depende de cambios en las relaciones en- sus sitios activos durante Ia sfntesis protefnica. ::_ os sitios no son regiones discretas y pequefias ~o los centros activos de las enzimas, son regia- extensas cuya construccion y cuyas activida--:<: pueden depender tanto del RNAr como de las - :efnas ribos6micas. Las estructuras cristalinas s subunidades individuales y de los ribosomas .-- -: ::-rianos proporcionan una buena impresion de :ganizacion general y subrayan Ia funcion del -ll. La estructura mas reciente, a una resolucion ~_5 A, identifica claramente Ia ubicacion de los -_: y de los sitios funcionales, de modo que ahara -:' ible dar cuenta de muchas funciones riboso~ - en funci6n de su estructura. ::..as funciones ribosomicas giran en torno a !a in::. :cion con los RNAt. En Ia se muestra - ='O soma 70S con las posiciones de los RNAt en :::::-es sitios de union, en los sitios A y P estan casi ~elos; todos se alinean con sus lazos anticodon :_ s al RNAm en el surco de Ia subunidad 30S y - __o de cada RNAt se une a Ia subunidad 50S. El ~:ente que rodea a cada RNAt es proporcionado - .:ipalmente por el RNAr. En cada sitio, el RNAr ~eta al RNAt en partes de Ia estructura univer::-me conservadas. .::·empre ha sido un gran enigma como dos -_: oluminosos pueden acomodarse uno allado :ro en codones adyacentes de lectura . La es:: .~ra cristalina muestra un doblez de 45° en el

Los os entre las subunidades ribos6 micas son principalmente de RNA (en color purpura). Los os que implican prote\nas se identifican con color amarillo. Las dos subunidades se han rotado para alejar una de otra y mostrar las caras en que tienen lugar los os; desde un plano perpendicular ala pantalla, la subunidad 50S ha sido girada goo en direcci6n contraria a las manecillas del reloj, en tanto que la 30S ha sido rotada goo en direcci6n de las manecillas del reloj (aqu\ muestra al contra rio de la orientaci6n usual) . Imagen cortes\ a de Harry Noller, University of California, Santa Cruz.

RNAm, entre los sitios P y A, que permite que los RNAt embonen, segun seve en Ia ampliacion de Ia . Los RNAt de los sitios PyA se ubican en u n angulo de 26° respecto de ellos mismos, en sus anticodones. La aproximaci6n mayor entre las columnas vertebrates del RNAt ocurre en los extremos 3', donde convergen con una separacion 5 A (perpendicular al plano de Ia pantalla), lo cual permite que Ia cadena peptfdica sea transferida del peptidilRNAt del sitio Pal aminoacil-RNAt del sitio A. Para que el EF-Tu hidrolice al GTP y sea liberado del ribosoma, es necesario que el aminoacilRNAt sea insertado en el sitio A por el EF-Tu y qu e se aparee con el codon (vease Ia seccion 8.10, El factor de elongacion Tu carga al aminoacil-RNAt en el sitio A). Para empezar, el EF-Tu coloca al aminoacil8.17 Los ribosomas tienen numerosos centros actives

177

El ribosoma 70S esta formado por la subunidad 50S (blanco) y la 30S (purpura), con tres moleculas de RNAt localizadas superficialmente: representadas con color amarillo en el sitio A, azul en el sitio P y ve rde en el E. Imagen cortesia de Harry Noller, University of California, Santa Cruz.

Las tres moleculas de RNAt tienen orientaciones distintas en el ribosoma. El RNAm gira entre los sitios P y A para permitir que los aminoacil-RNAt se unan a codones adyacentes. Imagen cortesia de Harry Noller, University of California, Santa Cruz.

RNAt en la subunidad pequeiia, donde el anticodon se a pare a con el codon. Es necesario que el RNAt se mueva para que penetre totalmeme en el sitio A, cuando su extremo 3' entra al centro peptidil transferasa en la subunidad grande. Hay diferentes modelos que explican como ocurre este proceso . Uno de ellos exige que el RNAt completo gire, de manera que el codo de la estructura en forma deL formada por los brazos D y T'l'C entre en el rib osoma para que el brazo T'l'C se aparee con el RNAr. En otro se requiere que Ia estructura interna del RNAt cambie y utilice ellazo anticodon como bisagra para que el resto del RNAt rote de una posicion en la cual esta apilado en el !ado 3' del lazo anticodon, a una en que este apilado en ellado 5' . Despues de Ia transi178


cion, el EF-Tu hidroliza al GTP para que proceda !c. sfntesis protefnica . La translocaci6n implica movimientos amplio~ en las posiciones de los RNAt en el ribosoma. E extremo anticodon del RNAt se mueve -28 A de: sitio A a! P, y posteriormente otros 20 A del P alE. Como resultado del angulo de cada RNA respect del anticodon, el volumen deiRNAt avanza distancias mucho mas grandes: 40 A del sitio A a! P, y 5:' del PalE, lo cual sugiere que Ia translocaci6n exige una importante reorganizaci6n de la estructura. Durante muchos aiios se penso que Ia trans locacion podia ocurrir solo en presencia del facto EF-G, sin embargo, el antibiotico esparsomicina (que inhibe la actividad de Ia peptidil transferasa) Ia desencadena. Esto sugiere que Ia energia necesaria para conducir la translocacion de hecho es almacenada en el ribosoma despues de que se ha formad el enlace peptfdico. En generaL el EF-G actua en e: ribosoma para liberar esa energia y permitirle conducir la translocacion, no obstante la esparsomicina puede tener la misma funci6n. La esparsomicina inhibe Ia peptidil transferasa al unirse a! peptidil-RNA: al bloquear su interaccion con el aminoacil-RNAt. Probablemente crea una confonnaci6n semejante a la conformacion postranslocaci6n usuaL que a su vez, favorece el movimiento del peptidil-RNAt. L importante es que Ia translocacion es una propiedac intrinseca del ribosoma. El modelo de estados hibridos sugiere que lc. translocaci6n puede suceder en dos etapas, con una unidad ribosomica desplazandose respecto de Ia otra para dar Iugar a una etapa intermedia en la cua: hay sitios de union al RNAt hfbridos (50SE/30S P y 50SP/3 0S A) (vease la Fig. 8.29). La comparaci6n de Ia estructura del ribosoma entre el estado previ y el posterior a la translocaci6n y de la conformaci6n del RNAr l6S entre las subunidades 30S libre~ y los ribosomas 70S, sugiere que Ia motilidad de [<: estructura es especialmente obvia en las regiones d la cabeza y de la plataforma de Ia subunidad 30S. Una perspectiva interesante del modelo de estados hfbridos proviene de que numerosas bases del RNAr implicadas en la asociaci6n de las subunidades estan cerca de bases involucradas en Ia interacci6 con el RNAt, fen6meno que sugiere que los sitio5 de union con el RNAt estan pr6ximas a la interfase entre las subunidades e implica que ciertos cambios en la interaccion entre estas tengan relaci6n cone movimiento del RNAt. Gran parte de Ia estructura del ribosoma es ocupada por sus centros activos. La perspectiva esquemcitica de los sitos ribos6micos de la ,uR muestra que constituyen unos dos tercios de la estructura ribosomica. Un RNAt entra al sitio A. es transferido por translocaci6n a! interior del P y

~ :eriormente abandona el ribosoma (bacteriano) .=-aves del sitio E. Los sitios A y P cubren las dos : !.l nidades ribosomicas; el RNAt se aparea con el ·Am en Ia subunidad 305, sin embargo, Ia transfe·-: ja del peptido sucede en Ia subunidad 50S. Los s P y A son adyacentes, lo que permite que Ia .. locacion desplace a! RNAt de un sitio a! inte : el otro. El sitio E esta localizado cerca del sitio sicion a mectio camino hacia Ia superficie de bunidad 50S). El centro peptidil transferasa se :~~ iza en Ia subunidad 50S, cerca de los extremos - :1oacilo de los RNAt de los sitios A y P (vease Ia _jon 8.18, El RN Ar 165 desempefia una funcion . .·: a en Ia sintesis protefnica ). Todas las protefnas de union a! GTP que fun:-:an en Ia sfntesis protefnica (EF-Tu, EF-G, IF -2 : ::1, -2 y -3) se unen al mismo sitio de union a! . . r (en ocasiones llamado centro GTPasa), el cua l _ blemente desencadena Ia hidrolisis de sus GTP. _ . ~ sitio se encuentra enla base del ped{mculo de Ia : ·.;nidad grande, formada por protefnas L7 y Ll2 _- es una modificacion de Ll2 y tiene un grupo .: ::to en Ia terminal N). Adem.3s de esta region, _ mplejo formado por Ia protefna Ll1 con un ..:.;::nento de 58 bases del RNAr 235 provee el sitio - -_nion para algunos antibioticos que inciden en - :·ividad GTPasa, y si de hecho ninguna de estas -_: cruras ribosomicas posee actividad GTPasa, am son necesarias para ello. La funcion del riboso . ~ activar Ia hidrolisis de GTP mediante factores 2-os al sitio de union con el factor. :..a union inicial de las subunidades 305 con el ·""m requiere de Ia protefna S 1, que posee una =-=e afinidad por el acido nucleico de cadena in: a! y es responsable del mantenimiento del .:-:lo de cadena {mica en el RNAm unido a Ia sub_:ad 305. Esta accion es necesaria para evitar que :_·..un adquiera una conformacion de bases parea..:ladecuada para Ia traduccion. La estructura de - tefna S 1 es demasiado alargada y se relaciona :as protefnas S18 y 521; las tres constituyen un - inio involucrado en la union inicial del RNAm ··nion del RNAt iniciador, lo cual ubica el sitio - . .ion con el RNAm en las cercanfas de Ia hendi.:. :ie Ia subunidad pequefia (vease !a Fig. 8.3). El ·-::mo 3' del RNAr, que se aparea con el sitio de -;;,cion del RNAm, se localiza en esta region. :.. s factores de iniciacion se unen a Ia misma _ . :1 del ribosoma . El IF -3 puede estar entrelazado :::1 extrema 3' del RNAr, asf como con numeroro tefnas ribosomicas, incluidas las que proba: -.ente estan implicadas en la union del RNAm. _:lcion del IF-3 podrfa ser estabilizar Ia union -..;:;}·Subunidad 305; posteriormente serfa desplaal unirse Ia subunidad 50S.

Membrana

El ribosoma tiene numerosos centros activos y puede estar asociado con una membrana. El RNAm gir.a .at pasa~ a traves de los sitios PyA, que forman un angulo. El s1t10 Eesta mas alta del P. El sitio peptidil transferasa (no ilustrado) abarca las regiones superiores de los sitios P y A. Parte del sitio unido al EF-Tu/ G se encuentra en la base de los sitios A y P.

La incorporacion del R.t'lA 55 a las subunidades 50S ensambladas in vitro depende de Ia capacidad de tres proteinas, L5, LS y L25, para formar un complejo estequiometrico con el. Dicho complejo puede unirse con el RNAr 235, a diferencia de los componentes aislados; se encuentra proximo a los sitios A y P. Una protefna naciente emerge a traves del ribo soma, lejos de los sitios activos, en el interior de Ia reoion en Ia cuallos ribosomas pueden ser adherio dos a las membranas (vease el Capitulo 10, La localizacion de las protefnas). Una cad en a polipeptfdica emerae del ribosoma a naves de un canal de salida b . que va del sitio peptidil transferasa a Ia superfioe de Ia subunidad 50S . El t{mel esta formado principalmente por RNAr. Es bastante angosto, mide de 1 a 2 nm, y tiene -10 nm de largo . El polipeptido naciente emerge del ribosoma a -1 5 A de distancia del sitio peptidil transferasa. En el tune! caben -50 aminoacidos y probablemente constrifie a Ia cadena polipeptfctica, de manera que no pueda plegarse hasta abandonar el domino de salida . I!B!I

liliil

El RNAr 165 desempefia una

funci6n activa en la sintesis prote1nica

Concepto principal • El RNAr 165 desempefia un papel activo en las funciones de la subunidad 305, pues interactua directamente con la subunidad 50S y con los anticodones de las moleculas de RNAt localizadas en los sitios P y A.

Originalmente se pensaba que el ribosoma era una coleccion de protefnas con varias actividades catalfticas mantenidas juntas por interacciones protefna-

8.18 El RNAr 165 desempefia una funci6n activa en la slntesis protelnica

179

Dominio central

II

1111

Dominio 5' 111 1 II

II

Jl

Dominio me nor 3'

1111 l

= Algunos sitios del RNAr 165 estan protegidos de sondas qu\micas cuando las subunidades 50S se unen a las 305 o cuando el aminoacil-RNAt se une al sitio A. Otros son los sitios de mutaciones que afectan a la s\ntesis prote\nica. Los sitios de supresi6n TERM pueden afectar la terminaci6n en algunos o muchos codones de terminaci6n. Los bloques grandes coloreados indican los cuatro dominios del RNAt.

protefna y por union al RNAr. Sin embargo, el descubrimiento de moleculas de RNA con actividades catalfticas (vease el Capftulo 26, Corte, empalme y procesamiento del RNA) sugiere inmediatamente que el RNAr puede tener una participacion mas activa en Ia funcion del ribosoma. Ahora hay evidencias de que el RNAr interactua con el RNAm o con el RNAt en todas las etapas de Ia traduccion y que las protefnas son necesarias para mantener al RNAr en una estructura en la cual pueda realizar las funciones catalfticas. En numerosas interacciones estan involucradas regiones especificas del RNAr: • El extremo 3' del RNAr interactua directamente con el RNArn en Ia iniciacion. • Regiones espec:fficas del RNAr 16S interactuan directamente con las regiones anticodon de los RNAt en e l sitio A y el P. De manera similar, el RNAr 23S interactua con el extremo CCA del peptidil-RNAt en el sitio A yel P.

180

CAPITULO 8 S\ntesis prote\nica

• La interaccion de las subunidades implica interacciones entre los RNAr 16S y 23S (vease Ia seccion 8.16, El RNA ribosomico abarca am bas subunidades ribosomicas). Mediante antibioticos que inhiben el proceso en ciertas etapas se ha obtenido mucha informacion acerca de cada paso de Ia sfntesis protefnica bacteriana. La diana del antibiotico puede ser identificada por el componente en el cual ocurren mutaciones resistentes, y si bien algunos antibioticos actuan sobre proteinas ribosomicas individuales, muchos inciden en el RNAr, lo cual sugiere que esta involucrado en muchas de las funciones del ribosoma. si no es que en todas. Las funciones del RNAr se han investigado mediante dos tipos de metodos. Los estudios estructurales muestran que regiones especificas estan localizadas en sitios importantes del ribosoma y que las modificaciones qufmicas de estas bases impide1: funciones particulares de los ribosomas. Por otra parte, las mutaciones identifican a bases del RNAr necesarias para funciones ribosomicas particulares_ En Ia se resumen los sitios del RNAr 165 identificados por estos medias. Un indicio de Ia importancia del extremo 3' deRN Ar 16S es su susceptibilidad a! agente leta! colicina E3 producida por algunas bacterias, Ia cu~ divide a -50 nucleotidos del extremo 3' del RNAr 16S de E. coli. Esta division suprime por completo el inicio de Ia sfntesis protefnica. Muchas funcione' importantes necesitan la region dividida, como l2 union del factor IF- 3, el reconocimiento del RNAn: y Ia union del RNAt. El extremo 3' del RNAr 16S participa directamente en la reaccion de iniciacion por apareamient con Ia secuencia Shine-Dalgarno en el sitio de unior. con el ribosoma del RNAm (vease la Fig. 8.16). Otrc: funcion directa del extremo 3' del RNAr l6S en Ia sintesis protefnica se demuestra por las propiedades de los mutantes resistentes a la kasugamicina que carecen de ciertas modificaciones en el RNA 16S. La kasugamicina bloquea la iniciacion de lc: sintesis proteinica. Los mutantes resistentes del tipc ksgA carecen de la enzima metilasa que introduce cuatro grupos metilo a adeninas adyacentes localizadas en un sitio cercano al extremo 3' del RNA 16S. La metilacion genera la secuencia altamente conservada G-m/A-m 26 A, que se encu entra en e: RNAr pequefio de las eucariotas y las procariotas La secuencia metilada se relaciona con Ia union de las subunidades 30S y 50S, Ia cual a su vez est.{ vinculada con Ia retencion del RNAr iniciador e _ el ribosoma completo. La kasugamicina induce lc. libe racion del fMet-RNAt, de los ribosomas sensitivos (metilados), pero los ribosomas resistentes sor. capaces de retener al iniciador.

lnteracci6n RNAm-RNAt El complejo codon-anticodon forma 3 pares de bases lnteracci6n

I

O••••••••• N1 . HO••••••••••

RA 8.4 Durante la sintesis proteinica puede ocurrir un -- bio en la conformacion del RNAr 165.

Los cambios en la estructura del RNAr 16S ocu-:-.:> n cuando los ribosomas estan implicados en la -~t esis protefnica, como se observa por la protec=5n de bases particulares contra ataques quirnicos. :.. -s sitios individuales se encuentran en algunos :--1pos concentrados en los dominios 3' menor y :.=:ural. Aunque las localizaciones estan dispersas o::. Ia secuencia lineal del RNAr 16S, parece probable : .:e la posicion de las bases involucradas en Ia mis-.il fun cion esten de hecho ubicadas en la estructura -=:ciaria, cerca una de la otra. Algunos de los cambios del RNAr 16S son in-_:_ "dos por la union de las subunidades 50S, la del -_ -_-\ill o la del RNAt. Dichos cambios indican que ~os eventos tienen relacion con cambios en Ia con-:-:-nacion del ribosoma que afectan la exposicion -:. RNAr, aunque no necesariamente indican la - : :t:icipacion clirecta del RNAr en estas funciones. _:__-_la Tr, se muestra un cambio que ocurre -.::ante la sintesis protefnica; implica un movirnien: cal para moclificar la naturaleza de una secuen- ~ duplex corta. El RNAr 16S tiene que ver con la funcion del ·o A y del P, y cuando estos sitios estan ocupa- . -;:, ocurren cambios significativos en su estructu- Ciertas regiones distintas estan protegidas por ~NAt unido al sitio A (vease la Fig. 8.45). Una : ~ l lazo 530 (que tambien es el sitio de una mu· -;6n que impide la terminacion en los codones - _-,___-\, UAG y UGA) . La otra es la region 1400 a 1500 .:::wminada asi porque las bases 1399 a 1492 y - 3deninas 1492-1493 son dos fragmentos de ca::::._a unica conectados por una horquilla larga). - 2os los efectos de la union del RNAt en RNAr - ~ pueden ser producidos por el oligonucleotido ..:.do del tallo-lazo anticodon, de tal manera que _nion RNAt-subunidad 30S debe involucrar a ~r egion.

Las adeninas que se encuentran en 1492 y 3 proporcionan un mecanismo para detectar -::.plejos codon-anticodon apareados adecuada:- re. El principio de la interaccion es que la es-

--= ~

La combinacion apareada erroneamente tiene solo dos pares de bases

El apareamiento codon-anticodon respalda la interaccion con las adeninas 1492 a 1493 del RNAr 165, si bien los apareamientos erroneos RNAt-RNAm no pueden interactuar.

tructura de RNAr 16S responde a la estructura de los dos primeros pares de bases en el surco menor del duplex formado por la interaccion codon-anticodon. El cambio de la posicion N1 de la base 1492 ode la 1493 en el RNAr impide la union del RNAt con el sitio A Sin embargo, las mutaciones en las posiciones 1492 y 1493 pueden ser suprimidas por la introduccion de fluorina en la posicion 2' de las bases corresponclientes del RNAm (con lo cual se restablece la interaccion). En la se muestra que el apareamiento entre el codon y el anticodon permite que el N1 de cada adenina interactue con el grupo OH-2' de la estructura principal del RNAm. Cuando entra un RNAt incorrecto a! sitio A, la estructura del complejo codon-anticodon se distorsiona y no puede tener lugar dicha interaccion, que la asociacion del RNAt con el sitio A. El RNAt localizado en el sitio P protege a una variedad de bases en posiciones diferentes del RNAr l6S; muy probablemente las bases se encuentren cerca una de la otra en la estructura terciaria. De hecho, hay mas os con el RNAt cuando se encuentra en el sitio P que cuando se encuentra en el A, situacion que puede ser responsable de la mayor estabilidad del peptidil-RNAt respecto de la del ami-

8.18 El RNAr 165 desempefia una funcion activa en la sintesis proteinica

181

noacil-RNAt. Esto tiene sentido, pues una vez que el RNAt ha llegado al sitio P, el ribosoma ha decidido que esta correctamente unido, mientras que en el sitio A tiene Iugar la evaluaci6n de las uniones. La region 1400 puede entrelazarse directamente con el peptidil-RNAt, lo cual sugiere que esta region es un componente estructural del sitio P. La conclusion basica derivada de estos resultados es que el RNAr tiene numerosas interacciones con el RNAt y con el RNAm y que estas interacciones serepiten cada ciclo de formaci6n de enlaces peptfdicos.

1m El RNAr 235 tiene actividad peptidil transfe rasa Concepto principal • La actividad peptidil transferasa reside exclusivamente en el RNAr 235. Los sitios implicados en las funciones del Rt'JAr 2 3 S no estan tan bien identificadas como los del RNAr 16S, sin embargo, se observa el mismo patron general: las bases de ciertas posiciones influyen en funciones espedficas. Las bases ubicadas en algunas posiciones del RNAr 23S son afectadas por la conformaci6n del sitio A o del P; en particular, los oligonucle6tidos derivados del CCA terminal 3' del Rt'JAt protegen a un conjunto de bases del RNAr 23S, esencialmente las mismas protegidas por el peptidil-RNAt, lo cual sugiere que la interacci6n principal del RNAr 23S con el peptidil-RNAt en el sitio P involucra al extremo 3' del RNAt. El RNAt establece os con el RNAr 23S tanto en el sitio P como en el A. En el sitio P, la G2552 del RNAr 23S se aparea con la C74 del peptidil-RNAt. Una mutacion en laG del RNAr evita la interacci6n con el RNAt, si bien dicha interacci6n es restablecida por una mutaci6n compensadora en la C del extremo amino aceptor del Rt'JAt. En el sitio A, la G2553 del RNAr 23S se aparea con la C75 del aminoacil-RNAt, de modo que en ambos sitios de union con el RNAt hay una funci6n cercana del RNAr. Ciertamente, cuando se tenga una perspectiva estructural mas clara de Ia region, sera posible entender los movimientos del RNAt entre los sitios A y Pen cuanto a establecimiento y perdida de os con el RNAr. Otro sitio que se une al RNAt es el E, localizado casi exclusivamente en la subunidad 50S. Las bases afectadas por su conformaci6n pueden ser identificadas en el RNAr 23S. 2,Cual es Ia naturaleza del sitio de la subunidad 50S que proporciona la funcion peptidil transferasa? Primero se indica la implicaci6n del RNAr debido a 182

CAPITULO 8 5\ntesis prote\nica

que una region del RNAr 23S es el sitio de mutaciones que confiere resistencia a los antibioticos que inhiben a la peptidil transferasa. No se ha tenido exito en una larga busquedc. de protefnas ribos6micas que potencialmente tengan actividad catalitica, aunque resultados reciente< sugieren que el RNA ribos6mico de la subunida ri grande posee dicha actividad. La extracci6n de cas: todo el contenido protefnico de las subunidade ' 50S deja al RNAr 23S asociado en gran medida cor. fragmentos de protefnas que representan <5% dt> Ia masa de las protefnas ribos6micas. Esta preparaci6n retiene la actividad peptidil transferasa. Lo' tratamientos que dai'ian al metabolismo del RN; _ suprimen la actividad catalitica. A partir de estos resultados, el RNAr 23S preparado por transcripci6n in vitro puede catalizar lc formaci6n de un enlace peptfdico entre el Ac-PheRNAt y el Phe-RNAt. El rendimiento del AC-PhePhe es muy bajo, lo cual sugiere que el RNAr 23 5 requiere de protefnas para funcionar con la maxima eficiencia. Sin embargo, debido a que el RNk tiene la actividad catalftica basica, la funci6n de la: protefnas debe ser indirecta, de modo que pliegueL al RNAr de forma adecuada o para presentar a e: los sustratos. Por otra parte, la reacci6n funciona aunque con menor efectividad, si los dominios de: RNAr 23S son sintetizados separadamente y despues se combinan. De hecho, el dominio V, que tiene al centro catalftico, presenta cierta actividad Esta ultima es abolida por mutaciones en la posici6r 2252 del domino V que yace en el sitio P. La estructura cristalina de la subunidad 50S de las archaea muestra que el sitio peptidil transferas e. basicamente esta formado por RNAr 23S. iNO ha\ protefnas a una distancia de 18 A del sitio activo e{~ donde ocurre la reacci6n de transferencia entre e: peptidil-RNAt y el aminoacil-RNAt! La sfntesis del enlace peptfdico exigue que e: grupo amino de un aminoacido ataque al grup o carboxilo de otro aminoacido. La catalisis implica que un residuo basico acepte el atomo de hidr6geno liberado del grupo amino, como se muestra en la l . Si el RNAr es el catalizador, debe proporcionar dicho residuo, sin embargo no se sabe como sucede esto. Las purinas y las pirimidinas n o son basicas a pH fisiol6gico. Una base ampliamente conservada (en la posicion 2451 de E. coli) habia sido implicada, pero ahora parece no tener las propiedades adecuadas ni ser crucial para la activida d peptidil transferasa. Las protefnas unidas al RNAr 23S fuera de la region peptidil transferasa casi seguramente necesarias son que que el RNAr forme la estructura apropiada in vivo. La idea de que este ultimo es el componente catalftico coincide con los resultados descritos en el

transferencia del peptidi~ -

Base:~

cadena peptfdica I

''•~ H-C-R

H-N

' H-C-R I

I

0

,.C~

dc"o

0

I

RNAt

I

I

RNA!

f

cadena pept,idica

~

N :~-N H-C-R H-C-R I I

Base

I

I

dc''o

o'c"o

I

I

RNAt

RNA!

cadena peptidica

' H-N ' H-G-R

C' N,.H

cf

' H-C-R H

' , C,.

0I

0I

RNA!

RNAt

0

La formaci6n de enlaces peptldicos requiere de acido-base en la cual se transfiere un atomo de H a · ·::siduo basico.

-=- ~.isis

::.. :.. itulo 26, Corte, empalme y procesamiento del -_-\, los cuales identifican las propiedades cataliticas :. RNA involucradas en numerosas reacciones de -- :esamiento del RNA, ademas de que concuerda - Ia nocion de que el ribosoma evoluciono a partir - nciones originalmente posefdas por el RNA.

Las estructuras ribos6micas cambian cuando se unen las subunidades ' :Onceptos principales _a cabeza de la subunidad 30S gira alrededor del cuello :uando se forman los riboso mas completes.

:t sitio activo peptidil transferasa de la subunidad 50S es mas activo en los ribosomas completes que en las subunidades individuates 50S. . a interfase entre las subunidades 50S y 305 es muy ica en os disociables. _.:has evidencias indirectas sugieren que las es-- :turas de las subunidades individuales cambian _ · cativamente cuando se juntan para formar un

ribosoma completo. Las diferencias de susceptibilidad de los RNAr a agentes externos constituyen uno de los indicadores mas poderosos (vease Ia seccion 8.18, El RNAr 16S desempena una funcion activa en Ia sfntesis protefnica). De forma mas directa, las comparaciones entre estructuras cristalinas de alta resolucion de las subunidades individuales y Ia estructura de menor resolucion del ribosoma intacto sugieren diferencias significativas, idea confirmada por una estructura cristalina del ribosoma de E. coli a 3.5 A, Ia cual, ademas, identifica dos conformaciones diferentes del ribosoma que prueban representar eta pas diferentes de Ia sfntesis protefnica. El crista! contiene dos ribosomas por unidad, cada uno con diferente conformacion. Las diferencias se de ben a cambios en el posicionamiento de los dominios en cada subunidad, y Ia mas importante consiste en que en una conformacion, Ia cabeza de Ia subunidad pequena ha girado aproximadamente 6° en torno a Ia region del cuello, hacia el sitio E. Asimismo, Ia rotacion de 6° en Ia direccion opuesta se observa en las estructuras (de baja resolucion) de los ribosomas de Thermus thermophilus que estan unidos al RNAm y que tienen moleculas de RNAt en los sitios A y P, lo cual sugiere que Ia cabeza puede girar en total 12°, dependiendo de Ia etapa de Ia sfntesis protefnica. La rotacion de Ia cabeza sigue el curso de los RNAt a traves del ribosoma, haciendo posible que su rotacion controle el movimiento del RNAm y el RNAt. Los cambios de conformacion que ocurren con Ia union de las subunidades son mucho mas marcados en Ia subunidad 30S que en Ia 50S, y probablemente estan relacionados con el control de Ia posicion y con el movimiento del RNAm. El cambio mas significativo en Ia subunidad 50S concierne al centro peptidil transferasa. Las subunidades 50S son -1 000 veces menos efectivas en Ia catalisis de Ja sintesis de los enlaces peptfdicos que los ribosomas completos, quiza por un cambio en Ia estructura que posiciona a! sustrato de forma mas efectiva en el sitio activo del ribosoma completo. Una de las caracteristicas principales derivadas de Ia estructura del ribosoma completo es Ia densidad extremadamente alta de os disociables en su interfase, que puede ayudar a establecer y romper os, fenomeno esencial para Ia asociacion y disociacion de subunidades que tambien podria estar involucrado en los cambios estructurales que ocurren durante Ia translocacion .

EEl

Resumen

Los ribosomas son particulas ribonucleoproteinicas en las cuales Ia mayor parte de Ia masa es propor8.21 Resumen

183

cionada por el RNAr. La forma de todos los ribosomas suele ser similar, no obstante, solo los de las bacterias (70S) han sido caracterizados en detalle. La subunidad pequefia (30S) es de forma alargada y esta constituida por un "cuerpo" que contiene aproximadamente dos tercios de Ia masa dividida a Ia altura de Ia "cabeza" por una hendidura . La subunidad grande (50S) es mas esferica, con un "pedunculo" prominente en Ia parte derecha y una "protuberancia central". En Ia subunidad pequefia se conoce la localizacion de aproximadamente todas las protefnas. Cada subunidad contiene un RNAr mayor unico, de l6S y 2 3S en las procariotas y de l8S y 28S en el citosol eucariotico. Tambien hay RNAr menores, notablemente el 5S localizado en Ia subunidad grande. Los RNAr presentan un extenso apareamiento de bases, principalmente en forma de cortos tallos duplex apareados de manera imperfecta con lazos de cadena unica. Las caracterfsticas conservadas en el RNAr pueden ser identificadas a! comparar las secuencias y las estructuras secundarias que pueden extraerse de los RNAr de diversos organismos. El RNAr l6S tiene cuatro dominios, en tanto que el 23S posee seis dominios diferentes. Los RNAr eucarioticos tienen dominios adicionales. La estructura cristalina muestra que en Ia subunidad 30S la distribucion del RNA y las protefnas es asimetrica, el primero esta concentrado en Ia interfase con Ia subunidad 50S. La subunidad 50S tiene una superficie de protefnas con varillas largas de RNA de cadena doble que se entrecruzan sobre Ia estructura. La union de las subunidades 30S y 50S implica os entre el RNAr l6S y el RNAr 23S. La interfase entre las subunidades es muy rica en os disociables. En ambas subunidades ocurren cambios estructurales cuando se unen para formar un ribosoma completo. Cada subunidad tiene varios centros activos concentrados en el domino de traduccion del ribosoma, donde las protefnas son sintetizadas. Estas ultimas abandonan a! ribosoma a traves del dominio de salida, el cual puede asociarse con una membrana. Los sitios activos principales son A y P, asf como el E y los sitios de union con el EF-G y el EF-Tu, el peptidil transferasa y el de union con el RNAm. La conformacion del ribosoma puede cambiar en etapas de la sfntesis protefnica; se han detectado diferencias en Ia accesibilidad de regiones especfficas de los RNAr mayo res. Los RNAt localizados en los sitios A y P son paralelos. Los lazos anticodon estan unidos al RNAm en un surco localizado en Ia subunidad 30S. El resto de cada RNAt se une ala subunidad 50S. Un cambia conformacional del RN At en el sitio A es nece184

CAPITULO 8 Slntesis proteinica

sario para colocar su extremo aminoacilo en yuxtaposicion con el extremo del peptidil-RNAt del sitio P. El sitio peptidil transferasa que liga a los sitios de union A y P esta hecho de RNAr 23S, el cual tiene actividad catalitica peptidil transferasa, aunque Ia. protefnas son probablemente necesarias para que se adquiera Ia estructura correcta. La funcion activa del RNAr en Ia sfntesis protefnica es indicada por mutaciones que inciden en la funcion ribosomica, las interacciones con el RNAm o el RNAt que pueden ser detectadas por ligamiento cruzado qufmico y los requerimientos para mantener las interacciones de apareamiento de base individuales con el RNAt o el RNAm. La region 3' terminal del RNAr se aparea con el RNAm en Ia iniciacion. Las regiones internas forman os individuates con los RNAt en los sitios PyA. El RNA ribosomico es el objetivo de algunos antibioticos u otros agentes que inhiben Ia sfntesis protefnica. Un codon en el RNAm es reconocido por un aminoacii-RNAt, el cual tiene un anticodon complementario del codon que transporta al aminoacido correspondiente a dicho codon. Un RNAt iniciador especial (fMet-RNAtr en las procariotas o Met-RNAt en las eucariotas) reconoce al codon AUG, el cual es utilizado para iniciar todas las secuencias cod.ificadoras. En las procariotas tambien se utiliza el codon GUG. Solo los codones de terminacion (sin sentido), UAA, UAG y UGA, no son reconocidos por los aminoacil-RNAt. Los ribosomas son liberados de Ia sfntesis protefnica para entrar a un banco de ribosomas libre que estan en equilibria con subunidades pequefias y grandes separadas. Las subunidades pequefias se unen al RNAm y posteriormente se ensamblan con las subunidades grandes para formar ribosomas intactos que asumen Ia sfntesis protefnica. El reconocirniento de un sitio de iniciacion procariotico implica la union de una secuencia localizada en el extrema 3' del RNAr con la secuencia Shine-Dalgarno, la cual precede al codon AUG (o GUG) en el RNAm. El reconocimiento de un RNAm eucariotico involucra Ia union con el casquete 5'; posteriormente. la subunidad pequefia migra al sitio de iniciacion a] buscar codones AUG, y cuando reconoce a! apropiado (en generaL aunque no siempre, el primero que encuentra), se le adhiere una subunidad grande. Un ribosoma puede portar dos aminoacil-RNAt simultaneamente: su sitio Pes ocupado por un polipeptidil-RNAt, el cual transporta la cadena polipeptfdica sintetizada hasta el momenta, mientras que el sitio A es utilizado como entrada por un aminoacil-RNAt que porta a! siguiente aminoacido que sera agregara a la cadena. Los ribosomas bacterianos tambien tienen un sitio E a traves del cual pasa

: 1.NAt desacilado antes de su liberacion despues = haber sido utilizado en Ia sfntesis protefnica. La i ena polipeptfdica ubicada en el sitio P se transfi.e-7 at aminoacil-RNAt del sitio A, creando un RNAt __ cilado en el sitio P y un peptidil RNAt en el A. Despues de la sfntesis de los enlaces peptfdicos, el - ~ oma transfiere un codon a lo largo del RNAm, _ plazando a! RNAt desacilado al interior del sitio E "-- peptidil-RNAt del sitio A a! interior del sitio P. La -.:.....slocacion es catalizada por el factor de elongacion : :. =-Gy, como muchas otras etapas de Ia funcion del ~ ;;oma, requiere de la hidr61isis de GTP. Durante la .:. .. Jocacion, el ribosoma pasa por una etapa hibrida :a cualla subunidad 50S se mueve, respecto de - ··.tbunidad 30S. La sintesis protefnica es un proceso costoso, _o que se utiliza ATP para proporcionar energfa - .:.~ umerosas etapas, incluida Ia carga del RNAt con =..:ninoacido y el desenrollamiento del RNAm. jSe -:stimado que hasta el 90% de las moleculas de - -:? sintetizadas en una bacteria que se desarrolla . - -damente es consumido en el ensamblaje de los - n oacidos para formar protefnas! En cada etapa de Ia sintesis protefnica se nece=n factores adicionales, los cuales son definidos ~ su asociacion cfclica con el ribosoma y por su d aci6n del mismo. Los IF estan implicados en Ia :::acion procariotica. El IF- 3 es necesario para que ~ubunidades 30S se unan al RNAm, y tambien :~ ponsable del mantenimiento de Ia subunidad ~ en forma libre. El IF-2 es necesario para que el :::-~-RNAt se una ala subunidad 30S yes respon1 -~ de excluir a otros aminoacil-RNAt de la reac--. de iniciacion. El GTP es hidrolizado despue s . __ ·.1 el RNAt iniciador se ha unido a! complejo de -',:;cion. Los factores de iniciacion deben ser Jib e- . '> para permitir que se adhiera una subunidad - de al complejo de iniciacion. :_a iniciaci6n eucari6tica implica un mayor nu::: de factores, algunos de los cuales estan im~ os en la union inicial de la subunidad 40S :-·::: remo 5' del RNAm, que posee un casquete, .= do-e! RNAt iniciador esta unido a otro grupo de :- · :-es. Despues de esta union inicial, la subunidad · __ efi.a explora a! RNAm hasta que reconoce al _.: !1 AUG correcto. En ese punto, son liberados ::.ctores de iniciacion y la subunidad 60S se une _ :nplejo. :..os EF procari6ticos ti enen que ver con la elon__ n . El EF-Tu une el aminoacil-RNAt con el ri:na 70S. El GTP se hidroliza a! ser liberado el ~ - -=--J. y para regenerar Ia forma activa del EF-Tu, - ~=e sita EF-Ts. El EF-G es necesario para Ia trans- ::::o n. La union de los factores EF- Tu y EF-G con :- oosomas es excluyente, de modo de garantizar

Ia conclusion de cada paso ante s de que se inicie el siguiente. La terrninacion ocurre en cualquiera de los codones especiales, UAA, UAG y UGA. Los RF clase l que identifican especfficamente a los codones determinacion activan al ribosoma para que hidrolice a! peptidil-RNAt. Un RF clase 2 es necesario para liberar a! RF clase I del ribosoma. Los factore s de union con el GTP, IF-2, EF-Tu, EF-G y RF3, tienen estructuras similares, ademas de que los dos ultimos simulan Ia estructura RNA-protefna de los primeros dos cuando estan unidos a RNAt. Todos se unen al rnismo sitio ribos 6mlco, el sitio de union al factor G.

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IIIII

La iniciaci6n en las bacterias requiere de subunidades 305 y de factores rios

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......

liliil El RNAr 165 desempefia un papel activo en la sintesis proteinica

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liD

El RNAr 235 tiene actividad peptidil transferasa

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187

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188


E

Las estructuras ribos6micas cambian cuando se unen las subunidades

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ti lizaci6n del c6digo genetico - ·· -- ----·- ·-

----

ESQUEMA DEL CAPITULO Introducci6n Los codones relacionados representan a aminoacidos relacionados • Sesenta y uno de los sesenta y cuatro tripletes posibles codifican a veintiun aminoacidos. • Tres codones no representan a aminoacidos y provocan la terminacion. • El codigo genetico fue congelado en una etapa inicial de la evolucion y es universal. • La mayoria de los aminoacidos estan representados por ma s de un codon. • Los codone s multiples asignados a un ami noacido suelen estar relacionados. • Los aminoacidos relacionados con frecuencia tienen codones relacionados, as1 se mi nimizan los efectos de la mutacion .

• En los genomas nucleares, los cambios son esporadicos y normalmente afectan solo a los codones determinacion.

Rll

• En ciertos genes pueden ocurrir cambios en la lectura de codones especificos. • La insercion del sele no-Cis-RNAt en ciertos codones UGA imp lica que muchas proteinas modifiquen al Cis-RNAt y lo inserten en el ribosoma. • La pirrolisina puede ser insertada en ciertos codones UAG .

U.

Los RNAt son procesados a partir de precursores mas largos • Un RNAt maduro se genera por el procesamiento de un precursor. • El extrema 5' se crea por division mediada par la endonucleasa RNAasa P. • El extrema 3' se genera por division seguida de recorte de las ultimas bases y de la adicion del trinucleotide te rminal comOn CCA.

111!1

Las bases modificadas afectan el apareamiento cod6n-anticod6n • Las modificaciones del anticodon inciden en el patron de apareamiento por balanceo y par lo tanto son importantes para la determinacion de la especificidad del RNAt.

El c6digo universal tiene alteraciones esporadicas • En el codigo genetico universal de algunas especies han ocurrido cambios. • Estos cambios son muy comunes en los genomas mitocondriales, en los cuales puede construirse un arbol filogenetico de los cambios.

Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos grupos • Las aminoacil-RNAt sintetasas se dividen en clase I y clase II de acue rdo con su secuencia y sus si militudes estructurales.

mil

Las sintetasas utilizan mecanismos de correcci6n para incrementar la precision • La es pecificidad del reconocimiento del aminoacido y del RNAt es controlada por las aminoacil-RNAt sintetasas par reaccio nes de correccion que in vierte n la reaccion catalitica en caso de que haya sido incorporado un co mponente erroneo.

El RNAt contiene bases modificadas • Los RNAt contienen >50 bases modificadas. • La modificacion implica generalmente la alteracion directa de las bases primarias del RNAt, si bien hay algunas excepciones en que una base es eliminada y remplazada por otra.

Los RNAt son cargados con aminoacidos por medio de si ntetasas • Las aminoacil-RNAt sintetasas son enzimas que cargan al RNAt con un am inoacido para generar aminoacil-RNAt en una reaccion de dos etapas que utiliza energia proveniente del ATP. • Las celulas tienen 20 aminoacil-RNAt sintetasas, cada celula porta todos los RNAt que representan a un aminoacido especifico. • El reconocimiento de un RNAt se basa en un pequefio numero de puntas de o en la secuencia del RNAt.

El reconocimiento cod6n-anticod6n implica balanceo • Los codo nes multi ples que rep resentan al mismo aminoacido frecuentemente difieren en la posicion de la tercera base. • El balanceo del apareamiento entre la primera base del anticodon y la tercera base del codon resulta de la estructura dellazo anticodon.

En ciertos codones de terminaci6n pueden insertarse aminoacidos nuevas

1m

Los RNAt supresores tienen anticodones mutados que leen a codones nuevas • Un RNAt supresor suele presentar una mutaci6n en el anticodon que cambia los codones a los cuales responde. • Cuando el anticodon nuevo corresponde a un codon determinacion, se inserta un aminoacido y la cadena polipeptidica rebasa al codon de terminacion, lo cual resulta en la supresion de una mutacion sin sentido en el sitio de una mutacion sin sentido, o en la lectura a traves de un codon natural determinacion. • La supresion de mutaciones de sentido err6neo oc urre cuando el RNAt reconoce a un codon distinto del normal, de manera que un aminoacido es sustituido por otro.


189

Hay supresores de mutaciones sin sentido para cada codon determinacion

1m La modificacion de la codificacion cambia el significado de los codones • Los cambios de significado de los codones pueden ser provocados por RNAt mutantes o por RNAt con propiedades especiales. • El marco de lectura puede sufrir modificaciones po r desviacion o por cambios en la pauta de lectura que dependen de las propiedades del RNAm.

• Cada tipo de codon sin sentido es suprimido por moleculas de RNAt con anticodones mutantes. • Algunos RNAt supresores extraiios presentan mutaciones en otras partes de la molecula.

Los supresores pueden competir con la lectura de tipo silvestre del codigo

lllfl

• Los RNAt supresores compiten con los RNAt de tipo silvestre que tienen el mismo anticodon para leer el codon o los codones correspondientes. • La supresi6n eficiente es perjudicial porque resulta en una lectura que rebasa codones de terminaci6n. • El codon UGA es permeable y noes interpretado correctamente por el Trp-RNAt del 1 al 3% de las veces.

Dill

DO

• La estructura del RNAr 165 de los sitios PyA del ribosoma influye en la exactitud de la traducci6n.

DO

La secuencia de una cadena codificadara de DNA que se lee en direccion 5' a 3', esta farmada par tripletes de nucleotidos (codones) que corresponden a Ia secuencia de aminoacidos de una proteina leida del grupo terminal N al terminal C. La secuenciacion del DNA y las proteinas permite comparar de manera directa las secuencias correspondientes de nucleotidos y aminoacidos. Hay 64 codones (uno de los cuatro nucleotidos posibles puede ocupar una de las tres posiciones del codon, es decir, 4 3 = 64 secuencias de trinucleotidos posibles). Cada uno de estos codones tiene un significado especifico en Ia sintesis proteinica, 61 codones representan a aminoacidos; tres provocan Ia terminacion de la sintesis proteinica. El significado de un codon que representa a un aminoacido depende del RNAt que le corresponde; el significado de los codones de terminacion es determinado directamente por factores proteinicos. La descodificacion del codigo genetico demostro originalmente que Ia informacion genetica se almacena en forma de tripletes de nucleotidos, pero no revelo Ia forma en que cada codon especifica al aminoacido correspondiente. Antes de Ia secuenciacion, las asignaciones de los codones se deducian con base en dos tipos de estudios in vitro. En 1961 se introdujo un sistema que implicaba Ia traduccion de polinucleotidos sinteticos, cuando Nirenberg demostro que el acido poliuridilico [poli(U)] dirige el ensamblado de Ia fenilalanina en la polifenilalanina, resultado que implica que el triplete UUU debe ser un codon de fenilalanina. Despues se introdujo un segundo sistema en el cual se utilizaba un trinucleotido para imitar a un codon, para que el ami-

190

• El marco de lectura debe ser influido por la secuencic del RNAm y por el ambiente ribosomico. • Las secuencias resbaladizas permiten que el RNAt se desplace una base despues de que se ha apareado casu anticodon, cambiando asi el marco de lectura. • La traducci6n de algunos genes depende de la aparici6n regular de cambios programados del. marco de lectura.

El ribosoma influye en la precision de la traduccion

Introducci6 n

CAPITULO 9 Utilizaci6n del c6digo genetico

Los cambios del marco de lectura ocurren en las secuencias resbaladizas

La evasion implica el movimiento del. ribosoma Resumen

noacil-RNAt correspondiente se uniera a un rib soma. AI identificar el componente aminoacido d: aminoacil-RNAt, se puede encontrar el significa ci del codon. Las dos tecnicas combinadas le asignar0:un significado a todos los codones que represent<.: a aminoacidos. Sesenta y uno de los 64 codones representan : aminoacidos, los tres restantes provocan la term,nacion de la sintesis protefnica. La asignacion d · los aminoacidos a los codones no es aleatoria, me. bien muestra relaciones en las cuales Ia tercera bas: tiene menos efecto en el significado del codon. Pc otra parte, los aminoacidos relacionados suelen st' representados par codones relacionados.

Ill

Los codones relacionados representan a aminoacidos relacionados

Conceptos principales • Sesenta y uno de los sesenta y cuatro tripletes posibles codifican a veintiun aminoacidos. • Tres codones no representan a aminoacidos y provocan la terminaci6n. • El c6digo genetico fue congelado en una etapa inicial de la evoluci6n y es universal. • La mayoria de los aminoacidos estim representados por mas de un codon. • Los codones multiples asignados a un aminoacido suelen estar relacionados. • Los aminoacidos relacionados con frecuencia tienen codones relacionados, as1 se minimizan los efectos de la mutaci6n.

; ·digo se resume en la . Hay mas co; que aminoacidos, de modo que casi todos .:....-ninoacidos estan representados por mas de un n . Las unicas excepciones son la metionina y el . -:ano. Los codones que tienen el mismo signifi·e denominan sin6nimos. El codigo genetico 77 de hecho en el RNAm, de modo que sue le ::-:-lbirse en funci6n de las cuatro bases presentes : _RNA, U, C, A y G. _ s codones que representan a! mismo aminoo a aminoacidos relacionados tienden a tener = ~ecuencia similar. Con frecuencia, la base de Ia - ~:-a posicion de un codon noes significativa por- - J S cuatro cod ones que clifieren solo en Ia tercera . :epresentan a! mismo aminoacido. En ocasiones - -:ingue solo entre una purina y una pirimiclina :-;.a posicion. La menor especificidad de Ia ulti"'X.lsicion se conoce como degeneraci6n de Ia .era base. :..a interpretacion de un codon implica el aparea~ .... :o de sus bases con el anticodon del aminoacil·.: correspondiente. La reacci6n ocurre dentro _'bosoma: los trinucleotidos complementarios ..:. ·os suelen ser demasiado cortos para aparearse nna estable, sin embargo, Ia interacci6n es es..:!zada por el ambiente del sitio A del ribosoma. -:lismo, el apareamiento de bases entre el codon y _::: j codon no es solo una cuesti6n de apareamien... :re A-U y G-C; el ribosoma controla el ambiente ......anera que el apareamiento convencional tiene : .::c- en las primeras dos posiciones del codon, a ,;:- de que las reacciones adicionales suceden en la : . . ra base. El resultado es que un solo aminoacil-.: puede reconocer a mas de un codon, lo cual ~7 spon de al patron de degeneracion. Por otra --: :: . las interacciones de apareamiento tambien ·..;en ser influidas por Ia introduccion de bases · .:-ciales en el RNAt, sabre todo por moclificaciones =: anticodon o cerca de eJ. :..a tendencia de los aminoacidos similares a ser - :-::-sentados por cod ones relacionados minimiza ::iectos de las mutaciones, con lo cual se incre ; :;ra Ia probabilidad de que el cambia aleatorio ..:na sola base no resulte en una sustituci6n de - oacido 0 en un cambia que involucre amino- s de caracterfsticas similares. Por ejemplo, una _:.Kion de CUC a CUG no produce ningun efecto : :_ e ambos codones representan a Ia Ieucina, en - :o que una mutacion de CUU a AUU resulta en : ~mp lazo de leucina por isoleucina, aminoacido :-chamente relacionado. Ll1 Ia b es una grafica del numero de · n es que representan a cada aminoacido frente _ frecuencia con que el aminoacido es utilizado : s protefnas (en E. coli). Los aminoacidos mas - ·.unes tienden solo ligeramente a ser represen-

·m-·~'i

1.31~;~-;m:

I-I.:J,l'il,;l--;1

Segunda base u

::J

Q)

Ul

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e

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G

UCU}Ser UAC UAU} nc UGC UGU}c;,

uuu}Phe uuc UCC UCA UUA} UUG Leu UCG

UAA } ALTO UGA ALTO UAG UGG Trp

CCU} CAU}H;, CG"} cu"} CGC cue CCC CAC CGA Arg CUA Leu CCA CCG

CUG

Q)

A

ProCAA} CAG Gin

CGG

E

3:

<(

AUU } AUC lie AUA AUG Met

GUU} GUC

<.9 GUA

GUG

ACU} AAU}A' o ACC AAC

AGU}ser AGC

ACA ACG

AGA}Arg AGG

=rreo AAA} . AAG LIS

GCU}

Val

GCC GCA GCG

GAU}A'P GG"} GGC Gl

GAC Ala

GA~

GA

Glu

GGA GGG

I

Todos los codones tienen significado; 61 representan a aminoacidos y tres inducen la terminaci6n (ALTO) .

10

Leu .

<1l

c

2

e

Q.

8

Glu .

~

c

Q)

Ul

6

0

:::l '"0

'iii ~ QJ

4

'"0 QJ

'iii'

c

QJ

2 0

2

Lis • Asp. ~ln . sn o Phe • Tir

lie .

• Ala • Gli

Ser .

• Val • Treo • Pro

Arg •

1

.

Met . His . Cis . Trpo

0..

2

3

4

5

6

Numero de codones

El numero de codones para cada aminoacido no se correlaciona estrechamente con la frecuencia de uso en las proteinas.

tados por mas codones, de modo que no parece que el c6cligo genetico haya sido optimizado respecto del uso de los aminoacidos. Los tres codones (UAA, UAG y UGA) que no representan a amino
9. 2 Los codones relacionados representan a aminoacidos relacionados

191

de codon es e n el citoplasma e u cariotico y en la s bacterias, de modo que el RNAm de una especie en general puede ser traducido correctamente in vitro o in vivo por el mecan ismo de sfntesis de proteinas de otra especie; por lo tanto, los codones utilizados en el RNAm de una especie tienen el mismo significado para los ribosomas y para los RNAt de otras especies . La universalidad del codigo sugiere que debe haber sido establecido muy a! principia de Ia evolucion, quiza como una forma prirnitiva en !a que un numero reducido de codones se utilizaba para representar a un numero comparativamente pequeiio de aminoacidos; es posible, incluso, que un codon correspondiera a cualquiera de los de u n grupo de aminoacidos y que el significado mas preciso de otros codones y aminoacidos adicionales hubieran sido introducidos posteriormente. Una posibilidad es que, al principia, solo dos de las tres bases de cada codon se utilizaran; la discriminacion en Ia tercera posicion pudo haber evolucionado despues. (Origi nalmente pudo haber una relacion estereoqufmica entre los aminoacidos y los codones que los representaban , la cual despues evoluciono un sistema mas complejo.) La evolucion del c6digo pudo "congelarse" en un punto en el que el sistema llego a ser tan complejo que cualquier cambia en el significado de los codones hubiera deteriorado a las proteinas exis-

uuu uuc

ucu ucc

.!,lUG

UCA UCG

cuu cue

ccu ccc·

CUA CUG

CCA CCG

AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG

ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG

:rr-UA

Relaci6n de Ia tercera base

UAU WAC UAA UAG CAU CAC CAA CAG AAU AAC A P,AG GAU GAC -G A GAG

UGU UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC

AW

AG_G_ GGU GGC GGA GGG

Terceras bases Numero con el mismo de :;odones significado

}

La tercera base no es pertinente

U,C, A,G U, C,A

32 3

}

Las purinas difieren de las pirimidinas

AoG U oC

14 10

Codones unicos

Solo G

2

Las terce ras bases influyen muy poco en el significado de los codones. Las cajas indican grupos de codones dentro de los cuales La degeneracion de la tercera base asegura que el significado sea el mismo.

192

CAPITULO 9 Utilizacion del codigo genetico

tentes por !a sustitucion con aminoacidos inaceptables. Su universalidad implica que esto debio habe~ ocurrido en una etapa tan temprana que todos los organismos vivientes descienden de un solo bancc de celulas primitivas en el que esto tuvo lugar. Las excepciones a la universalidad del codig genetico son raras. Los cambios en el significado de genoma principal de una especie en general conciernen a los codones de terrninacion. Por ejemplo en los micoplasmas, el codon UGA codifica al tript6fano; en ciertas especies de los ciliados Tetrahymen_y Paramecium, los codones UAA y UAG codifican la glutamina, y m odificaciones sistemci.ticas del c6digo solo se han presentado en el DNA mitocondria_ (vease Ia seccion 9.7, El codigo universal tiene alteraciones esporadicas ).

Ill

El reconocimiento codonanticodon involucra balanceo


Los codones multiples que representan al mismo ami noacido frecuentemente difieren en la posicion de la tercera base.

•

El balanceo del apareamiento entre la primera base del anticodon y la tercera base del codon resulta de la estructura dellazo anticodon .

La funcion del RNAt en la sfntesis protefnica se Ueva a cabo cuando reconoce al codon en el sitio "! _ ribosomico . La interaccion entre el anticodon y e codon sucede por apareamiento de bases, pero er. funcion de reglas que Jlevan el apareamiento ma.alla de las asociaciones usuales A-U y G-C. Las reglas que rigen Ia interaccion pueden dedu cirse a partir de las secuencias de los anticodon _ que corresponden a codones especificos. La capacdad de cualquier RNAt para responder a un cod6[_ dado puede medirse directamente por la prueba de union a trinucle6tidos o utilizandolo en un sistem.:. de sintesis de proteinas in vitro. El c6digo genetico proporciona algunas pist- importantes respecto del proceso del reconocimier:to de los codones. El patron de degeneracion de !=. tercera base se ilustra en la , la cual muestra que, en casi todos los casos, Ia tercera base es npertinente 0 solo se distingue entre purinas y pif.midinas. Hay ocho familias de codon es en las cuales I cuatro codones que comparten las mismas primera;: dos bases tienen el mismo significado, de maner.:. que la tercera base no desempefia ninguna funcio: en !a determinacion del arninoacido . Hay siete par de codones en los que el significado es el mism

· -.:pendientemente de que pirimidina este presen~::t la tercera posicion, y cinco pares en los que _;;je presentarse cualquier purina sin cambiar al o ignificado Cmico: AUG (para metionina), UGG :.:a triptofano) y UGA (para terminacion), de ma2- !l que Ia C y el U nunca tienen un significado ~ en Ia tercera posicion, y Ia A n unca significa - ,; rninoacido Cmico. :::1 anticodon es complementario del codon; por :.=.nto, la primera base de la secuencia del antico-- escrita convencionalmente en direccion 5' a 3', ...a que se aparea con la tercera base del codon, _:to de Ia misma manera (de 5' a 3'). Asf pues, : mbinacion Codon .-\nticodon

5' A C G 3'

tambien debe reconocer a Ia G). De man era similar, Ia C ya no tiene un significado unico (porque Ia G que Ia reconoce tambien debe reconocer al U). En la se resume el patron de reconocimiento. Asf pues, el reconocimiento de codones {micas solo es posible cuando las terceras bases son G o U, opcion no frecuente debido a que UGG y AUG son los (micas ejemplos del primer tipo y no hay ninguno del segundo. (Los pares G-U son comunes en las estructuras duplex de RNA, pero cuando solo pueden formarse tres pares de bases, Ia formacion de os estables entre el codon y el anticodon es mas estrecha, o sea que los pares G-U pueden contribuir solo en Ia ultima posicion del codon.) J .

.n

Los pares de bases estand ar ocurren en todas las posiciones

;mm

=

3' U G C 5'

- _:cribe generalmente como codon ACG/anticodon ~ -_-, donde Ia secuencia del anticodon debe ser lefda :--:ves para que sea complementaria del codon. Para evitar confusiones, se debe obedecer Ia -:-: ·encion usual de escribir todas las secuencias - ->-, pero marcar las secuencias anticodon con una . .:...i)a dirigida en sentido inverso como recordatorio ~u relacion con el codon, de modo que el ante~apareamiento codon/ anticodon se escribe ACG =Gu, respectivamente. ( Cada codon triple exige su propio RNAt con _ anticodon complementario, o es posible que un ·_-\t individual responda a ambos de -:.par de codones y a los cuatro (o a! c: :-tos algunos) de una fami lia de codones? .-\. menudo un RNAt puede reconocer a mas de - codon, o sea que la base que ocupa Ia prime- posicion del anticodon debe ser susceptible de :rrearse con bases alternas en la tercera posicion ::-espondiente del codon. El apareamiento de ba- en esta posicion no se limita a la s asociaciones :_ ituales G-C y A-U. Las reglas que rigen el reconocimiento de los ::~pafieros se resume en la hip6tesis del balan~ - que establece que el apareamiento entre el co:-: y el anticodon en las primeras dos posiciones - -=-- codon siempre sigue las reglas normales, pero --= en la tercera posicion se presentan "balanceos" - _-epcionales. El balanceo se debe a que Ia con~acion del lazo anticodon del RNAt confiere .: ·ibilidad a la primera base del anticodon. En Ia A g 4- se muestra que pueden formarse pares : -:.: . ademas de los normales. Este cambia crea un patron de apareamiento de - es en el que la A ya no puede tener un significado :-...: o en el codon (debido a que el U que la reconoce

yH3

HG""c cro·

Ur.acilo

1

T

/ '

N N 'C" 'H . 11

•• H

'N'

.

~"'C'c_ ~N

••

Azucar 0

H

I

H

11

~N/

C

Aden1na ~H

/ 'N

'A·

zucar

El apareamiento de balanceo entre G y U ocurre solo en Ia tercera posicion del cod6n H

Hy"'c.?""o

Uracilo

/N'r."N'H ·.

.,

lf

Azucar 0 . .

•

0

6

• H.... N/ 'c~N, I

II

'CH

Guanlna

H,N,c~N/c,N

H

" 'Azucar

El balanceo en el apareamiento de bases permite que se formen pares G-U entre la tercera base del codon y la primera del anticodon.

Base en Ia primera posicion del anticodon

u

c A

G

Bases reconocidas en Ia tercera posicion del codon AoG SoloG Solo u CoU

El apareamiento cod6n-anticod6n implica balanceo en la tercera posicion.

9.3 El reconocimiento cod6n-anticod6n involucra balanceo

193

Ill

Los RNAt son procesados a partir de precursores mas largos

Conceptos principales • Un RNAt maduro se genera par el procesamiento de un precursor. • El extrema 5' se crea por division mediada por la endonucleasa RNAasa P. • El extrema 3' se genera par division seguida de recorte de las ultimas bases y de La adicion del trinucleotido terminal comun CCA.

Los RNAt se sintetizan comunmente como cadenas precursoras con material adicional en uno o ambos extremos. En la I se observa que las secuencias adicionales son eliminadas par combinaciones de actividades endonucleolfticas y exonucleolfticas. Una caracteristica comun a todos los RNAt es que los tres nucleotidos localizados en el extrema 3', siempre la secuencia triple CCA, no son codificados en el genoma, sino agregados como parte del procesamiento del RNAt.

El RNA! precursor tiene secuencias 5' y 3' adicionales 5'

3'

Endcnuc\easa Se recorta el extrema 3' 3' - - 3' 5' = = =:::;) ..__

Se divide el extrema 3' 5'

I f

Exonucleasa

El extrema 5' del RNAt se genera par una a· cion de division catalizada par la enzima ribom cleasa P. Las enzimas que procesan el extrema 3' esta: mejor caracterizadas en E. coli, donde una endon cleasa activa la reaccion al dividir al precursor flujo descendente y despues, muchas exonudea. = recortan el extrema par degradacion en direccion 3 5' . En las eucariotas, Ia reaccion tambien involucra numerosas enzimas y genera un RNAt que neces1 que se agregue el trinucle6tido CCA al extrema 3 La adici6n de la secuencia CCA es exclusiE mente resultado de un proceso enzimatico, en atE palabras, Ia actividad enzimatica porta la especi cidad de la secuencia del trinucleotide, que no _. determinada por un molde. Hay numerosos m delos para el proceso, que puede ser diferente c: organismos distintos. En algunos organismos, el proceso es cataliza~. por una sola enzima. En un modelo se propane q una sola enzima se une a! extrema 3' y en secuecia adhiere C, C y A, y que la especificidad de ca.:.. etapa depende de la estructura del extrema 3'. E· otros modelos se propane que Ia enzima tiene sit activos diferentes para el trifosfato de citosina (CL cytosine triphosphate) y para el trifosfato de adenos· _ (ATP, adenosine triphosphate). En otros organismos, son otras las enzimas r ponsables de Ia adicion de residuos de C y de A funcionan en forma secuencial. Cuando un RNAt no es procesado adecuad.: mente, atrae la atencion de un sistema de cone de calidad que lo degrada, con Io cual se garantj_. que el mecanismo de sfntesis de proteinas no ~-: bloqueado por moleculas no funcionales de RN._\.-

Ill

El RNAt contiene bases modificadas

Conceptos principales Se divide el extrema 5' Endonucleasa (RNAasa P)

l

5'3'

• Los RNAt contienen >50 bases modificadas. Se agrega CCA 3' Enzimas de A adici6n del 5 extrema 3'

,8

El extrema 3' del RNAt se genera por media de division y recarte seguidos de la adicion de la secuencia CCA; el extrema 5' se genera por medio de corte.

194


• La modificacion implica generalmente la alteracion directa de las bases primarias del RNAt, si bien hay algunas excepciones en que una base es eliminada y remplazada par otra.

El RNA de transferencia es unico entre los acid nucleicos debido a su contenido de bases "inust.;.: les". Una base inusual es cualquier anillo de puri- · o de pirimidina diferente de los anillos normales .::A, G, C y U a partir de los cuales se sintetizan toci los RNA; las demas bases se producen par mo ficaci6n de una de estas cuatro despues de que han incorporado a la cadena polirribonucleotfdi =

-=- das las clases de RNA exhiben cierto grado de lilicacion, pero en todos los casas, excepto en el <. se trata de eventos bastante sencillos, como - ~:c ion de grupos metilo. En el RNAt, Ia gama ~ ctificaciones es amplia, desde metilaciones . :es hasta la reestructuracion total del anillo de - .a, yen cualquier parte de Ia molecula; hay >5 0 _ 1iferentes de bases modificadas en el RNAt. :=.n la m;; se muestran algunas de las ba__odificadas mas comunes. Las modificaciones "opirimidinas (C y U) son menos complejas que :..e las purinas (A y G). En Ia posicion 2'-0 del de ribosa, ademas de las modificaciones de las -- rambien ocurren metilaciones. :..as modificaciones mas comunes de la uridina o ~ncillas. La metilacion en Ia posicion 5 crea · ' :-~lidina (T), y aunque la base es Ia misma que :-cuentra coml"mmente en el DNA, en este caso - - herida a una ribosa y no a una desoxirribosa. ::: RJ."TA, la timina constituye una base inusual - ada de Ia modificacion del U. :..a dihidrouridina (D) se genera par !a saturaJe un doble enlace que modifica Ia estructura :.~illo . La seudouridina (\jf) intercambia las po:::es de los atomos de N y de C (vease Ia Fig. - J) . En Ia 4-tiouridina, el azufre es sustituido . xJgeno. :=.: nucleosido inosina suele estar en Ia celula intermediario de Ia ruta de biosintesis de las -..::as, sin embargo, nose incorpora directamente - -A, en cambia, su existencia depende de la mo_.:.cion de Ia A para crear I. Otras modificaciones :. _-\ incluyen la adicion de grupos complejos . .Jos series complejas de nucleotidos dependen . ;;: modificacion de la G. Las bases Q, como Ia : _. sina, tienen un anillo pentonilo adicional : gada mediante una ligadura de NH al gru~e tiilo de Ia 7-metilguanosina, el cual puede ortar varios grupos acticionales. Las bases Y, la wyosina, tienen un anillo adicional fusiocon el propio anillo de purina . Ese anillo adi- .:.! transporta una cadena larga de carbona a Ia :ambien en este caso, se agregan mas grupos __:erentes casas. :..:> reaccion de modificacion suele implicar dificacion de bases existentes del RNAt o el : ~ado de grupos adicionales. Una excepcion es -.:esis de las bases Q en el RNAt, pues una en- especial intercambia queuosina libre por un - J O de guanosina. La reaccion implica !a rotura ~e construccion de enlaces en ambos !ados del :6sido. - s nucleosidos modificados son sintetizados ::ozimas especfficas modificadoras del RNAt. - .J.cleosido original presente en cada posicion

se puede determinar comparando !a secuencia del RNAt con !a de su gen o (con menos eficiencia) aislando moleculas precursoras que carezcan de una o de todas las modificaciones. Las secuencias de los precursores muestran que durante Ia maduracion del RNAt se introducen ctiversas modificaciones en etapas distintas. Ciertas modificaciones son caracterfsticas constames de todas las moleculas de RNAt, par ejemplo los residuos D que dan Iugar a! nombre del brazo D y los residuos \jf que se encuentran en Ia secuencia T\j!C. En ellado 3' del anticodon siempre hay una purina modificada, aunque Ia variedad de modificaciones es amplia. Otras modificaciones son especfficas de determinados RNAt o grupos de RNAt, como las bases de wyosina, que son caracteristicas del RNAtrhc de las bacterias, las levaduras y los mamfferos. Par otra parte, hay tambien algunos patrones especfficos de cada especie . Las numerosas enzimas modificado ra s del RNAt (-60 en las levaduras) varfan enormemente en cuanto a especificidad. En algunos casas, una enzima actua y provoca una modificacion en particular en una sola posicion, mientras que en otros casas, una enzima puede moctificar bases en diversas posiciones ctiana. Algunas enzimas asumen reacciones unicas en RNAt especificos, en tanto que

Bases normales

Bases modificadas

3-metilcitidina

FIGURA

5-metilcitidina

Las cuatro bases del RNAt pueden ser modificadas. 9.5 El RNAt contiene bases modificadas

195

otras tienen un rango de moleculas de sustrato. Se desconocen las caracterfsticas reconocidas por las enzimas modificadoras de RNAt, pero probablemente implican la identificacion de caracterfstica s estructurales en torno a! sitio de modificacion; algunas modificaciones requieren de !a accion de mas de una enzima .

~

N-1-1 --- 0

~

rv · L, ., ' c-C /C-c" ~c\-\ lnosina Ad enlna ''C ->rv u .N '' I I

I

II

II

I

· ·f'

C-N

I

~lV-C,N"'CI-{ 1-\C,~

'

Azucar

fi URA

Azucar

La inosina puede aparearse con U, C y A.

Un enlace no es S

T 1ourac1·1 o ""'c, H 0 HC'"' C"" I

0

II

/ N ' C_.-N -. H .,

11

11 -... N _.- C -... c - N Guanina

Azucar S

1

H-...

~

11

CH

_.-C.::, ..-C- N/ N

"

Azucar

El 2-tiouracilo se aparea unicamente con A

~H 3 HC""'C'c0 ~ / ' C..- ' H .

N

~

Azucar Tiouracilo

-H,

~

-H

· - N,.c, p-N Adenina r ~ ~CH

HC..,N..-

-J

"Azucar

La modificacion de la 2-tiouridina restringe el apareamiento solo a la A, pues solo puede formarse un en lace de H con G.

196


Ill

Las bases modificadas afectan E apareamiento cod6n-anticod6n

Concepto principal • Las modificaciones del anticodon inciden en el patron de apareamiento por balanceo y por lo tanto son importante.: para la determinacion de la especificidad del RNAt.

El efecto mas directo de la modificaci6n se obs : va en el anticodon, donde el cambio de secuen influye en su capacidad de aparearse con el cododeterminado asf el significado del RNAt. Las mocli.;-caciones en cualquier otro lado, en las cercanfas a anticodon, tambien influyen en su apareamient Cuando se modifican las bases del anticod6suelen producirse patrones de apareamiento a cionales, ademas de los pronosticados por el ap-. reamiento regular y con balanceo que llevan a catlas bases A, C, U y G. En Ia se muestra _ uso de la inosina (I), que con frecuencia se presen~ ~ en Ia primera posicion del anticodon, y que pue · aparearse con cualquiera de las bases U, C, y A. Esta capacidad es especialmente importante E~ los codones de isoleucina, en los cuales el triple~ : AUA codifica ala isoleucina, mientras que el cod 'AUG hace lo propio con la metionina . Con las bas usuales no es posible reconocer a la A sola en := tercera posicion, y como resultado, cualquier RN_!_· con U en la primera posicion de su anticodon tencir~ que reconocer al triplete AUG y al AUA, asf qu:este ultimo debe leerse junto con los AUU y AUC problema que se resuelve porIa existencia de RN..:,. con I en el anticodon. De hecho, algunas de las combinaciones regulares pronosticadas no se realizan porque alguna. bases siempre estan modificadas. Parece haber un~ prohibicion absoluta en el empleo de Ia A, que sue convertirse en I. En Ia mayorfa de los casas, el · localizado en Ia primera posicion del anticodon pa~ a ser una forma modificada cuyas propiedades d:: apareamiento se han alterado. Ciertas modificaciones crean lecturas preferenciales de algunos codones respecto de otros. Los ar:ticodones con uridina-5-acido oxiacetico y 5-metox~ uridina en la primera posicion reconocen a Ia A y ~ Ia G eficientem ente como terceras bases del codor. pero Ia deteccion del Uno es tan eficiente. Otro cas en el que pueden tener Iugar apareamientos mutti ples, pero preferentemente unos respecto de otros, . el de Ia serie de queuosina y sus derivados, ya que estas bases de G modificadas siguen reconociendo a 1.: C y al U, pero se aparean mas facilmente con el U. Una restriccion no permitida por las reglas normales se logra utilizando 2-tiouridina en el anticodon. En Ia se muestra que su modifica-

~

facilita que siga apareandose con Ia A, pero :a que se aparee por balanceo con Ia G. :=.stas y otras relaciones de apareamiento res__ .:an Ia conclusion general de que hay muchas ~:as de construir un conjunto de moleculas de · _-_t susceptibles de reconocer los 61 cod ones que -esentan a los aminoacidos. Ningun patron espe- :o predomina en un organismo dado, aunque Ia :::~cia de cierta ruta de modificacion puede evitar _; de algunos patrones de reconocimiento, de ;o que una familia de codones en particular se -:-ie leer con moleculas de RNAt con anticodones :- ~entes en organismos distintos. Con frecuencia, RNAt tendran respuestas su-~u estas, de tal manera que un codon en parti- ~:- pueda ser leido por mas de un RNAt, en cuyo . podni haber diferencias en cuanto ala eficien.= ..:e las reacciones de reconocimiento alterno. ~.:n o regia generaL los codones que se utilizan -:::.-' nmente tienden a ser leidos de forma mas - ...:ente.) Ademas de la construccion de un con-:o de RNAt susceptible de reconocer a todos los _ n es, podria haber muchas moleculas de RNAt _::- respondieran a los mismos codones. -=..os pronosticos del apareamiento por balanceo :-. ::uerdan muy bien con las capaddades observadas - :.asi todos los RNAt, pero hay excepciones en las -= :os.codones reconocidos por un RNAt difieren de : _ronosticados por las reglas del balanceo. Dichos ::- ::os probablemente se de ban a Ia influencia de _ _- vecinas o a Ia conformacion del lazo anticodon -=. estructura terciaria global del RNAt. De h echo, :illportancia de Ia estructura de lazo del anticodon ___herente a la idea de la hipotesis del balanceo. - .:.:slamiento de mutantes ocasionales en los que :ambio de una base en alguna otra region de la -~cula modifica Ia capacidad del anticodon para · : nocer a los cod ones, proporciona soporte adicio~ 3 Ia influencia de la estructura circundante. Otra reaccion de apareamiento inesperada se =::.'fiesta porIa capacidad del iniciador bacteriano, _.ten-RNAtv para reconocer tanto al codon AUG -: al GUG. Este comportamiento erroneo impli.:. Ia tercera base del anticodon.

EL c6digo universal tiene alteraciones esporadicas S.ceptos principales :: el codigo genetico universal de algunas especies -an ocurrido cambios. :Stos cambios son muy comunes en los genomas itocondriales, en los cuales puede construirse un ~ rbol filogenetico de los cambios. : n los genomas nucleares, los cambios son esporadicos y -ormalmente afectan solo a los codones determinacion.

La universalidad del codigo genetico es impresionante, pero hay excepciones que tienden a afectar a los codones implicados en Ia iniciacion o Ia terminacion y que resultan de la produccion (o ausencia) de los RNAt que representan a ciertos codones. Los cambios encontrados en los genomas principales (bacterianos o nucleares) se resumen en Ia U Casi todos los cambios que permiten que un codon represente a un aminoacido afectan a los codones de terminacion: • En Ia procariota Mycoplasma capricolum, el triplete UGA nose utiliza para Ia terminacion, sino que codifica a! triptofano (Trp). De hecho, es el codon Trp predominante, y Ia secuencia UGG es utilizada con poca frecuencia. Existen dos especies de Trp-RNAt que tienen anticodones UCA<-- (que lee a UGA y a UGG) y CCA<-- (que solo lee a UGG). • Algunos ciliados (protozoarios unicelulares) leen a las secuencias UAA y UAG como glutamina y no como seiiales de terminacion. Uno de ellos, Tetrahymena thermophila, contiene tres especies de RNAtG 1u, de las cuales, una reconoce a los codones usuales CAA y CAG para glutamina; Ia segunda, a los tripletes UAA y UAG (de acuerdo con Ia hipotesis del balanceo), y la tercera, solo al triplete UAG. Se supone que la especificidad restringida del factor de liberacion eRF es un cambio posterior respecto del de otras eucariotas. • En otro ciliado (Euplotes octacarinatus), el codon UGA codifica a Ia cistefna; solo se utiliza el triplete UAA como codon determinacion y falta la secuencia UAG. El cambio en el rL •

..,

4 •

•

-0

uuu uuc

Phe

UUA UUG Leu

cuu cue

'

ucu UCC Ser UCA UCG

ccu Leu

CUA CUG Leu->Ser AUU AUC lie AUA lie --7 NULA AUG Met ,GUU GUC 'GUA Val GUG

LI:ti• •ITI ~ _:.UI=lUti•-..."'IT:~r.:Ii]~

"EG'i~ . . • ·~··d~~

CCC Pro CCA CCG ACU

UAA ALTO UAG CAU His CAC CAA Gin CAG AAU - AAC Asn

ACC Treo ACA AAA L. AAG IS ACG GCU GCC Ala GCA GCG

UGU UGC Cis

UAU Tir UAC

, GAU Asp GAC GAA GAG Glu

--7

Gin UGA ALTO UGGTrp

--7

Trp, Cis, Sel

CGU CGC CGA Arg CGG Arg

--7

NULA

--7

NULA

AGU AGC Ser AGA Arg AGG Arg GGU GGC GGA Gli GGG

(,l Los cambios del codigo genetico en los genomas bacterianos o nucleares eucarioticos usualmente asignan aminoacidos a codones de terminacion o cambian a codon, de manera que deja de codificar a un aminoacido. Es raro un ca mbia de significado de un aminoacido a otro.

9.7 El codigo universal tiene alteraciones esporadicas

197

-~

.. ... ., ....

.;o;:

A~ =

AUA = Met A AGG = Ser UGA = Trp

Alto

Vertebrados lnsectos

AUA =lie AAA = Asn

Moluscos Equinodermos Nematodes

AAA = Asn

Platelmintos

AUA = Met CUN = Treo

Mohos Levaduras Plantas

C6digo universal Los cambios del c6digo genetico de las mitocondrias pueden rastrearse en una filogenia. El numero m\nimo de cambios independientes se genera al suponer que los cambios AUA=Met y AAA=Asn tuvieron Lugar de manera independiente en dos ocasiones, y que el cambia temprano AUA=Met se revirti6 en los equinodermos.

significado del codon UGA puede lograrse por una modificacion en el anticodon del RNAtCis para permitirle leer a la secuencia UGA con los codones usuales UGU y UGC. • La unica sustitucion en la codificacion de aminoacidos ocurre en una levadura (Candida), en la que el triplete CUG representa a la serina y no a la leucina (y el triplete UAG se utiliza como codon codificador). Para que un codon de terminacion adquiera una funcion coclificadora se necesitan dos tipos de cambios, un RNAt debe ser mutado para reconocer a! codon y el factor de liberacion clase I debe mutar para que Ia terminacion no tenga Iugar en dicho codon. El otro tipo comun de cambio es la perdida del RNAt que responde a un codon, de manera que este ya no especifique a ningun arninoacido. Lo que suceda a dicho codon dependera de que el factor de terminacion evolucione para reconocerlo. Todos estos cambios son esporadicos, es decir, parecen haber ocurrido de man era independiente en lineas de evolucion espedficas; pueden concentrarse en los codones de terminaci6n porque los cambios no implican Ia sustitucion de un aminoacido por otro. Una vez establecido el codigo genetico a! principia de Ia evolucion, cualquier cambio general en el significado de un codon hubiera provocado una sustitucion en todas las protefnas que contuvieran dicho aminoacido. Parece probable que el cambio podrfa haber sido perjudicial cuando menos en algunas de estas protefnas, con el resultado de una eliminacion selectiva determinante. Los usos divergentes de los codones de terminacion tal vez representaron su "captura" con fines de codificacion normal. Si algunos codones de terminaci6n rara vez 198


eran utilizados, solo serfan reclutados para codificacion por cambios que permitieran que los RNAt lo' reconocieran. En las mitocondrias de numerosas especies tambien se observan excepciones a! codigo genetico universal. En la Ir se representa una filogeni.;. de los cambios en la cual se sugiere que bubo ur codigo universal modificado en varios periodos d{' Ia evolucion mitocondrial. El primero de ellos fue e: empleo del triplete UGA para codificar al tript6fan que es comun en todas las mitocondrias (ajenas . las plantas). Algunos de estos cambios simplifican el codig al remplazar dos codones con significados diferent _ por un par con significado unico, entre los que se incluyen los tripletes UGG y UGA (ambos representa · a Trp, en vez de que uno represente Trp y el otro, !~ terminacion) y AUG y AUA (ambos Met, y no un1. Met y el otro Ile). (.Por que han podido evolucionar los cambic. en el codigo mitocondrial? La mitocondria sintetiz.: a un numero pequeiio de protefnas ( -1 0), de moci . que el problema de la discontinuidad provocada p cambios de significado es mucho menos grave. L probable que los codones alterados no fueran m u· utilizados en localizaciones en que las sustitucion . de aminoacidos hubieran sido nocivas. La varieda-de cam bios encontrados en las mitocondrias de diferentes especies sugiere que dichos cambios han ev . lucion)uo de manera aislada y no por transmisi ' :de un c6'digo mitocondrial ancestral corrkm. De ac~do con la hipotesis del balap ceo, sent cesita un mfnlln._o de 31 RNAt (excluidd el iniciado: para reconocer IO's-&l-C.Ddones (.s.m'Iiiecesarios cuar.do menos dos RNA de transferencia para cada fa m lia de codones y un RNAt por cada par de codon o por cada codon). No obstante, cuando menos e:las mitocondrias de los mamfferos se presenta u r...: situacion inusual, pues solo hay 22 RNAt. (.Co~ caben en este conjunto limitado de moleculas cRNAt todos los codones? La caracterfstica clave es una simplificacion d apareamiento codon-anticodon, de manera que u RNAt reconoce a los cuatro rniembros de una fami"· o de codones, con lo que se reduce a 23 el numer minimo de moleculas de RNAt necesarias para re:ponder a todos los codones normales. El uso de I tripletes AGAc para la terminacion elimina Ia nec sidad de otro RNAt y los reduce a 22. En las ocho familias de codones, la secuenc:· del RNAt contiene un Uno modificado en Ia prime-ra posicion del anticodon y los codones restantes ' agrupan en pares, en los cuales, los que termina.: en pir imidinas son leidos por una G del anticod ' : y todos los que terminan en purinas son lefdos p

-:. U modificado en el anticodon, como se pronostien Ia hipotesis del balanceo. La complicacion del _on individual UGG se evita mediante un cambio -"::. el codigo, de modo que los tripletes UGA y UGG : m terpreten como triptofano. En los mamfferos, : cuencia AUA deja de representar ala isoleucina --= lee como metionina, aunada al triplete AUG, lo ., - permite que todos los codones que no son de _ ':Jmilia sean lefdos como 14 pares. Asf pues, los 22 genes d e RNAt identificados Jifi.ca n a 14 moleculas de RNAt que representan -.ares, y a ocho moleculas de RNAt que represen'-: a familias, lo cual implica que los dos codones : :erminacion usuales, UAG y UAA, ademas del ::: de codones AGAG' no sean reconocidos por el - -_-\ r. En las mitocondrias de los hongos aplican c ~as similares. ~

En ciertos codones de terminaci6n pueden insertarse aminoacidos nuevas I :OOceptos pri nci pales

:1 ciertos genes pueden ocurrir cambios en la lectura :e codones espec\ficos. _a inserci6n del seleno-Cis-RNAt en ciertos codones JGA implica que muchas proteinas modifiquen al :·s-RNAt y lo inserten en el ribosoma.

_a pirrolisina puede ser insertada en ciertos codones JAG.

- - j ertos genes ocurren cambios especificos en Ia -·- ra del codigo. La especificidad de dichos cam. implica que Ia lectura de un codon en particular _ndera de las bases circundantes. En dos casos ~ ertan aminoacidos diferentes a los 20 clasicos ~ ::nedio de aminoacil-RNAt especiales. Un ejemplo destacado es Ia incorporacion del _noacido modificado selenocistefna en ciertos _ones UGA localizados en los genes que codifi- a selenoprotefnas tanto en procariotas como ~ cariotas. En general, estas protefnas catalizan ~eacciones oxidacion-reduccion y comienen un residuo de selenocisteina, el cual forma parte si rio activo . Se sabe mas sobre el uso de los co:-es UGA en tres genes de E. coli que codifican .:. ~ isoenzimas formato deshidrogenasa. El codon __. ._ interno es interpretado por un RNAt de se cistefna, reaccion inusual determinada por Ia - ctura secundaria local del RNAm, en particular - :a presencia de un lazo en horquilla en flujo ~endente del UGA.

Las mutaciones en cuatro genes sel crean una deficiencia en Ia sfntesis de selenoprotefnas. El gen selC codifica a RNAt (con el anticodon ACU<--) que se carga con serina. Los genes selA y selD permiten transformar a Ia serina en selenocistefna. Se!B es un factor alterno de elongacion; se trata de una protefna de union a guanina que act'l1a como factor espedfico de traduccion para Ia entrada del seleno Cis-RNAt al sitio A y, por lo tanto, proporciona un remplazo para el factor EF-Tu (solo para este RNAt). La secuencia de Ia protefna SelB esta relacionada con Ia del EF-Tu y Ia del IF-2. (.POr que se inserta el seleno-Cis-RNAt solo en ciertos codones UGA? Dichos codones van seguidos de una estructura tallo-lazo en el RNAm. En Ia se muestra que el tallo de Ia misma es reconocido por un dominio adicional de Ia protefna SelB (el cual no esta presente en el EF-Tu ni en el IF-2 ). Por un mecanismo similar se interpretan algunos codones UGA en las celulas de los mamiferos, con Ia salvedad de que se necesitan dos protefnas para identificar los codones UGA apropiados. Una protefna (SBP2) se une ala estructura tallo-lazo en flujo descendente, lejos del codon UGA, mientras que Ia contra parte del SelB (denominada SECIS) se une a la SBP2 y simultaneamente une el RNAt con el codon UGA. Otro ej emplo de la insercion d e un aminoacido especial es Ia colocacion de pirrolisina en un codon UGA en las archaea y las bacterias a traves de un mecanismo probablemente similar al de Ia insercion del seleno -Cis-RNAt. Un RNAt inusual se carga con lisina, el cual presumiblemente sera modificado mas tarde. El RNAt tiene un anticodon CUA que responde al triplete UAG, y debe haber otros componentes del sistema que restrinjan su respuesta a los codones UGA apropiados .

SelB es un factor de elongaci6n que une especificamente el seleno-Cis-RNAt con el codon UGA, que va seg uido de una estructura tallo-lazo en el RNAm.

9.8 En ciertos codones de terminaci6n pueden insertarse aminoacidos nuevos

199

Ill

Los RNAt son cargados con aminoacidos por medio de si ntetasas

Conceptos principales • Las aminoacil-RNAt sintetasas son enzimas que cargan al RNAt con un aminoacido para generar aminoacilRNAt en una reacci6n de dos etapas que utiliza energia proveniente del ATP. • Las celulas tienen 20 aminoacil-RNAt sintetasas, cada celula porta todos los RNAt que representan a un aminoacido especifico. • El reconocimiento de un RNAt se basa en un pequefio nCtmero de puntos de o en la secuencia del RNAt.

Es necesario que los RNAt tengan ciertas caracterfsticas en comun, y que aun asf, otras permitan distinguirlos uno de otro. La caracterfstica clave que confiere esta facultad, es Ia capacidad del RNAt para doblarse en una estructura terciaria especffica. Los

· Enzima Sitio del aminoacido

Sitio del ATP

La sintetasa tiene 3 sitios de union

Sitio del RNAt

R

o-

I

H-C-NH2

d

~

I

-o-P=O

6

o-

~s

El aminoacido

y el ATP forman aminoacii-AMP

-o-P=O I 0 I Adenosina

R ' H-¢-NH 2

Cdc-...o-

r

d'" ~"'-~

0-H

· Se une el RNAt

0-P=O I

Ade~osina El RNAt es cargado con aminoacido

Una aminoacil-RNAt sintetasa carga al RNAt con un aminoacido .

200


diferentes detalles de esta estructura, como el angulc que forma n los dos brazos de la "L" o Ia protrusion de bases unicas, son los que caracterizan a cada RNAt. Todos los RNAt pueden embonar en los sitio5 P y A del ribosoma, en un extrema se asocia n co:G el RNAm por el apareamiento cod6n- anticod6n, ~ en el otro, el polipeptido esta siendo transferido. De manera similar, todos los RNAt (e xcepto el iniciador) comparten Ia posibilidad de ser reconocido' por los factores de traducci6n (EF-Tu o eEFl) pare: unirse al ribosoma. Por el contrario, el RNAt iniciador es reconocido por el IF-2 o por el eiF2, de modo que el conjunto de moleculas de RNAt posee caracterfsticas comunes para interactuar con los factores de elongaci6n, si bien es posible reconocer a: RNA t iniciador. Los aminoacidos entran a la ruta de la sfntes i~ protefnica a traves de las aminoacil-RNAt sintetasas las cuales proporcionan Ia interfase para Ia conexi6r. con el acido nucleico. Todas las sintetasas funciona r. por medio del mecanismo de dos pasos que se ilustra en Ia L • Primero, el aminoacido reacciona con e: ATP para formar aminoacil-adenilato, liberando pirofosfato. La energfa necesaria par.; la reacci6n es proporcionada por la divisi6-. del enlace de alta energia del ATP. • Despues, el aminoacido activado es transferido al RNAt, liberandose AMP. Las sintetasas clasifican a los RNAt y a los aminoacidos en sus conjuntos correspondientes. Cad.;: sintetasa reconoce solo a un aminoacido y a todo; los RNAt que deben ser cargados con el. En general, cada aminoacido es representado por mas de un RNAt, y pueden necesitarse muchos RNAt pare. responder a codone s sin6nimos; por otra parte suele haber varias especies de RNAt que reaccionan con el mismo codon. Los multiples RNAt que representan a! mismo aminoacido se denominar. RNAt isoaceptores, y como Ia misma sintetas.:. los reconoce a todos, tambien se definen como su. RNAt cognados. Mediante muchos intentos para deducir las similitudes de las secuencias de los RNAt o para indue·~ alteraciones qufmica s que inciden en su carga se he. demostrado que Ia base de reconocimiento noes lc. misma para los diferentes RNAt y que no necesariamente yace en alguna caracterfstica de la estructur· primaria o secundaria. Gracias a Ia estructura cristalina se sabe que el tallo aceptor y el tallo anticodoc. forman os firmes con Ia sintetasa y que Ia: mutaciones que influyen en el reconocimiento de un RNAt se encuentran en estas dos regiones. (E . anticodon no necesariamente es reconocido come tal; por ejemplo, las mutaciones "supresoras" que se describen mas adelante en este capitulo cambia-

-=. base del anticodon y, por lo tanto, a los codones s cuales responde un RNAt, sin alterar su carga ~ el aminoacido correspondien te.) Un grupo de RNAt isoaceptores debe ser cargasolo porIa aminoacil-RNAt sintetasa especifica .:.~a su aminoacido, de modo que deben compartir .;-mas caracterfsticas que permitan ala enzima dis -=- irlos de los otros RNAt. Todo el complemene moleculas de RNAt se divide en 20 grupos .;.ceptores, y cada grupo es susceptible de identi:-=.r a su sintetasa particular. Los RNAt son identificados por sus sintetasas :: iante os que reconocen a un numero : -=~1 cido de bases, en general, de una a cinco. Noro ...mente se utilizan tres tipos de caracterfsticas: • Generalmente (pero no siempre), se reconoce cuando menos una base del anticodon. En ocasiones todas las posiciones del anticodon son importantes. • Con frecuencia se reconoce uno de los tres ultimos pares de bases del tallo aceptor. Un caso extremo lo representa el Ala-RNAt, identificado solo por un par de bases unico en el tallo aceptor. • La asf Hamada base discriminadora, que se encuentra entre el tallo aceptor y el CCA terminal, nunca varfa en los RNAt isoaceptores. \'inguna de estas caracterfsticas constituye un - iio unico para distinguir 20 conjuntos demo: -~ as de RNAt ni proporciona suficiente especi_dad, de modo que, aparentemente, el recono 'ento de los RNAt es idiosincrasico, y cada uno =:-c sus reglas . :--.lumerosas sintetasas pueden cargar de mane-::pecifica una "mini-helice" formada solo por el ~= aceptor y el T\j/ C (equivalentes a un brazo - .a molecula en forma de L) con el aminoacido ~:e cto. En ciertos RNAt, Ia especificidad depende ::..>Jsivamente del tallo aceptor, pero es obvio que ~ ,·ariaciones significativas entre los RNAt y que, .:.:gunos casos, Ia region anticodon es imponan:..as mutaciones del anticodon pueden afectar el ·. Ciocimiento por Ia Phe-RNAt sintetasa clase II, - eden estar implicadas muchas caracterfsticas; ... ·ni-helices del RNAtv•' y del RNAtM« (de los . " es sabemos que el anticodon es importante in · pueden reaccionar especfficamente con sus erasas . .-\sf pues, el reconocimiento depende de una in~ :ci6n entre varios puntos de o del RNAt, -.:entrados en las extremidades, y unos cuantos e1oacidos que constituyen el sitio activo de la :efna. La importancia relativa de las funciones :allo aceptor y del anticodon difiere en cada in_::cion RNAt-sintetasa.

11m

Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos grupos

Concepto principal • Las aminoacil-RNAt sintetasas se dividen en clase I y clase II de acuerdo con su secuencia y sus similitudes estructurales.

A pesar de su funcion comun, las sintetasas constituyen un grupo de protefnas mas bien variado . Las subunidades fluctuan entre 40 y 110 kD, y las enzimas pueden ser monomericas, dimericas o tetramericas, yes raro que se parezcan. Obviamente, el sitio activo que reconoce al RNAt comprende una parte bastante pequefia de la molecula, y es interesante comparar los sitios activos de diferentes sintetasas. Las sintetasas se han dividido en dos grandes grupos, cada uno forma do por l 0 enzimas, con base en Ia estructura del dominio que contiene al sitio activo. En Ia t se ilustra un tipo genera l de organizacion aplicable a ambos grupos. El dominio catalftico incluye a los sitios de union con el ATP y a! aminoacido, y se distingue por ser una region extensa interrumpida porIa insercion del dorninio que se une a la helice aceptora de RNAt, lo cual coloca al extrema del RNAt cerca del sitio catalftico. Un dominio independiente se une a la region anticodon del RNAt. Las sintetasas multimericas tambien poseen un dominio de oligomerizacion. Las sintetasas clase I poseen un dominio catalftico terminal N que se identifica por dos secuencias cortas de aminoacidos parcialmente conservadas que en ocasiones se denominan "secuencias distintivas". El dominio catalftico asume la forma de un rasgo llamado pliegue de union con el nucleotido (que tambien se encuentra en otras clases de enzimas que se unen a nucleotidos). Dicho pliegue

Dom inio catalftico: Union de Ia Union con Formacion helice aceptora anticodon del sitios del ATP y del aminmicido de RNA! del RNA! oligomero Pliegue nucleotido (clase I) o lamina ~ antiparalela (clase II)

Helice a. o barril ~

Clase I principalmente monomeros, algunos homodimeros

Clase II principalmente homodimeros, 2 tetrameros

Una aminoacil-RNAt sintetasa contiene tres o cuatro regiones con funciones distintas. (Solo las sintetasas multimericas poseen un dominio de oligomerizaci6n .)

9.10 La s aminoaci l- RNAt sintet asas se clasifican en dos grupos

201

- Las estructuras cristalinas muestran que las aminoacilRNAt sintetasas de clase I y II se unen a caras opuestas de sus sustratos de RNAt. El RNAt se muestra en color rojo y la proteina en color azul. Imagen cortes\ a de Dino Moras, Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology.

Se interrumpe el par de bases U1-A72 / U1A72 •./""EI tallo aceptor se • / encuentra en una cavidad profunda de Ia protefna

....

•' --EI ATP se une cerca del tallo aceptor

-

El lazo anticodon se distorsiona en U35-U36

Gln-RNAt sintetasa Una RNAt sintetasa de clase I a al RNAt en el surco menor del tallo aceptor y en el anticodon.

esta formado por cadenas ~ paralelas y helices a; la secuencia distintiva forma parte del sitio de union con el ATP. La insercion que hace o con Ia helice aceptora del RNAt difiere ampliamente entre enzimas de clase I. Los dominios terminal C de las sintetasas clase I, que incluyen el domino de union con el anticodon del RNAt, y con cualquier dominio de oligomerizacion, tambien difieren bastante uno de otro. Las enzimas clase II companen en sus dominios catalfticos tres similitudes de secuencia basta nte generales. El sitio activo contiene una gran lamina ~ 202


antiparalela rodeada de helices a. Tambien eil ecaso, el dominio de union con la helice aceptora c_ interrumpe el dominio catalftico tiene una estru~ ra que depende de la enzima individual. El dom: de union con el anticodon tiende a ser termina: . La localizacion de los dominios de oligomerizad es muy variable. El hecho de que aparentemente no haya rrelacion entre los dos grupos de sintetasas es · enigma, quizas evolucionaron de manera indep diente, incluso parece posible que existiera una : rna de vida ancestral con protefnas formadas por los l 0 aminoacidos codificados por uno u -::tipo de sintetasas. Un modelo general de la union de las RNAt ~- tetasas sugiere que la protefna se acopla al RNAr = el "!ado" de la molecula con forma deL, y el mis principio general se a plica a todas las uniones de · RNAt sintetasas: la adhesional RNAt tiene Iugar bre todo en sus dos extremidades, y la mayor pade la secuencia del RNAt no participa en el recor: cimiento por medio de una sintetasa. Sin embar ~ la naturaleza detallada de la interacci6n difiere ~ tre las enzimas clase I y clase II, como se obse:en los modelos de la F' , que se basae _ estructuras cristalinas. Ambos tipos de enzima. aproximan at RNAt por !ados opuestos, lo cual h=. que los modelos RNAt-proteina luzcan casi co-imagenes en espejo. Una enzima clase I (Gln-RNAt sintetasa) abor · ellado dellazo D del RNAt, reconoce el surco mer: del tallo aceptor localizado en un extremo del si: de union e interactua con ellazo anticodon del o :extremo. La es un diagrama de Ia estn : -tura cristalina del complejo RNAtGin_sintetasa. caracterfstica reveladora de la estructura es que ! os con la enzima cambian Ia estructura dRNAt en dos puntos importantes, que se observan ~ comparar las lfneas punteadas y las continuas ubicc· das en ellazo anticodon y el tallo aceptor: • Las bases U3 5 y U36 dellazo anticodon s--jalan para alejarlas del RNAt, hacia el interior de Ia proteina. • El extremo del tallo aceptor se distorsionc. mucho, lo cual resulta en Ia interrupcion de: apareamiento de bases entre Ul y A72. El extremo de cadena unica del tallo se empotra en una cavidad profunda de Ia protefna sintetasa que tambien contiene al sitio de union para el ATP. Esta estructura explica porque los cambios del U35, la G7 3 y el par de bases Ul-A72 afectan Ia identificacion del RNAt por su sintetasa. En toda5 estas posiciones se forman ligaduras de hidr6gen entre Ia proteina y el RNAt.

Una enzima clase II (Asp -RNAt sintetasa) se - xima al RNAt por el otro !ado y reconoce ellazo : able y el surco mayor del tallo aceptor, como . ~ ustra en Ia - . Este l'lltimo conserva : onformacion helicoidal regular y el ATP proba.-::1ente se una cerca de Ia adenina terminal. En -:ro extremo del sitio de union hay un o _-:- cho con ellazo anticodon, el cual muestra un . io de conformacion que permite que el antico:. este en estrecho o con Ia protefna.

Las sintetasas utilizan mecanismos de correcci6n para incrementar la precision ~'Aicepto

principal

especificidad del reconocimiento del aminoacido _ del RNAt es controlada par las aminoacil-RNAt ;intetasas par reacciones de correcci6n que invierten .c reacci6n catal1tica en caso de que haya sido '1corporado un componente err6neo. .3

-

3minoacil-RNAt sintetasas tienen una labor dipues cada sintetasa debe distinguir a uno de ::e 20 aminoacidos y diferencia a los RNAt cog__-. s (tfpicamente de uno a tres) del conjunto total ...u:a 1oo en total). ~ay muchos aminoacidos fntima mente relacio- s entre si, amen de que todos estan relaciona- con los intermediarios metabolicos de su ruta - :erica particular. Es especialmente diffcil distin..:: entre dos aminoacidos que difieren solo en Ia - :,itud del esqu eleto de carbonos (por ejemplo, ~ 'J n grupo CH 2 ). La discriminacion intrfnseca ba---=. en las energfas relativas de Ia union de estos aminoacidos serfa solo de -1 I 5. Las enzimas - ~erasas incrementan -1 000 veces este fndice. ::_a discriminacion intrfnseca entre RNAt es me- _orque el RNAt ofrece una superficie mas am -' que provee mas os, pero sigue siendo .---:o que todos se conforman a la misma estructura --:.,:ral, y el grupo de caracterfsticas que distinguen ~ RNAt cognados de los no cognados podrfa ser -..an te limitado. ?odrfan imaginarse dos formas generales en _: :a enzima selecciona a su sustrato: • El ciclo de ision, escrutinio y acepta cion/rechazo podrfa representar un solo paso de union previo a todas las etapas restantes de cualquier reaccion involucrada, lo cual equivale a decir que la afinidad del sitio de union es suficiente como para controlar Ia entrada del su strato. En el caso de las sin tetasas, esto significarfa que solo los amino -

La cola de cadena - individual yace profundamente en Ia protefna

El lazo anticodon se distorsiona Asp-RNAt sintetasa

Una aminoacil-RNAt sintetasa clase II a al RNAt en el surco mayor de la helice aceptora y en el lazo anticodon.

acidos correctos y los RNAt cognados podrfan formar una union estable en el sitio. • Alternativamente, Ia reaccion avanza por algunas de estas etapas, despues de las cuales se decide si Ia especie correcta esta presente; en caso contrario, Ia reaccion se revierte o se toma una ruta de evasion, y el miembro erroneo es expulsado. Este tipo de escrutinio posterior a Ia union suele llamarse correcci6n. En el ejemplo de las sintetasas, implica que Ia reaccion de carga proceda a traves de ciertas etapas, incluso si hay un RNAt o un aminoacido erroneos. Las sintetasas utilizan mecanismos de correcdon para controlar el reconocimiento de ambos tipos de sustrato, y mejoran significativamente en las diferencias intrfnsecas entre aminoacidos o entre RNAt, pero coincidiendo con las diferencias intrfnsecas de cada grupo, cometen mas errores al seleccionar aminoacidos (las tasas de error van de 10-4 a l0- 5 ) que a! seleccionar RNAt (en cuyo caso, Ia rasa de error es -10-6 ) (vease Ia Fig. 8.8). El RNA de transferencia se une a Ia sintetasa mediante la reaccion ilustrada en la . Los RNAt cognados tienen una mayor afinidad imrfnseca por el sitio de union, por Io que se unen mas rapidamente y Ia disociacion es mas lenta. Despues de Ia union, Ia enzima analiza al RNAt que se ha unido, y si es el RNAt correcto, Ia union es estabilizada por un cambio de conformacion en la enzima, lo cual permite que Ia aminoacilacion ocurra rapidamente . Si se presenta un RNAt equivocado, no ocurre el cambio de conformacion, la reaccion sucede mucho mas despacio y se incre mentan las probabilidades de que el RNAt se disocie

9.11 Las si ntetasas utili zan mecanismos de correcci6n para incrementar la precision

203

•

I

•

Y~,

___tl /

(

El RNA! cagnada se asacia rapidamente, se disacia lentamente

El RNA! no cognado se asocia lentamente, se disocia rapidamente

(r

(.2

I

La aminoacilaci6n sin cambia de canfarmaci6n es lenta

;.co

AMP

r

El aminoacil-adenilato es hidrolizadol Aminoacido 2 incorrecto / NH2 ;.co ...,. AMP R~H AMP COOH El aminoacii-RNAt es hidrolizado

1

t

~a aminoacilaci6n es rapida

~ RCH ~ '

r-eo '

El reconocimiento del RNAt correcto por La sintetasa se controla en dos pasos. En el primero, La enzima tiene mayor afinidad por su RNAt cognado, yen el segundo, La aminoacilaci6n del RNAt incorrecto es muy lenta.

de la enzima antes de ser cargado. Este tipo de control se denomina correcci6n cinetica. La especificidad por los aminoacidos varfa entre las sintetasas; algunas son muy especfficas y se unen inicialmente a un solo aminoacido, mientras que otras tambien pueden activar aminoacidos estrechamente relacionados con el sustrato apropiado . En ocasiones, el aminoacido analogo puede ser convertido a Ia forma adenilada, pero en ninguno de estos casos se utiliza un aminoacido incorrectamente activado para formar un aminoacii-RNAt estable. El RNAt cognado usualmente es necesario para activar Ia correcci6n, incluso si la reacci6n ocurre en Ia etapa previa ala formaci6n del complejo aminoacil-adenilato. (Una excepci6n es Ia Met-RNAt sintetasa, que puede rechazar a complejos aminoacilo-adenilato no cognados incluso en ausencia de RNAt. ) Hay dos etapas en que puede hacerse la correcci6n de un aminoacil-adenilato incorrecto durante 204

/N 2

RCH

N '~RCH

El RNA! cagnada desencadena un cambia de confarmaci6n

/

\

Adenilaci6n


Aminoacido NH 1ncorrecto ~ RCH 2 ..... ~' COOH correcto

AMP

Cuando una sintetasa une al aminoacido incorrecto, la correcci6n requiere de La union con el RNAt cognado. la cual puede tener Lugar por un cambia conformacional quE provoque la hidr6lisis del aminoacil-adenilato incorrecto o po· medio de la transferencia del aminoacido al RNAt, seguida dE hidr6lisis.

1 !a formaci6n del aminoacil-RNAt. En la se observa !a aplicaci6n de una correcci6n quimica, en la cualla reacci6n catalftica es invertida. El grado de predominio de una ruta u otra varfa de acuerdo con cada sintetasa: • El aminoacil-adenilato no cognado podria hidrolizarse si se une el RNAt cognado. En este mecanismo es utilizado de manera predominante por numerosas sintetasas, incluidas las de metionina, isoleucina y valina. (E general, la reacci6n no puede observarse in vivo, pero puede ser seguida par la Met-RNAt sintetasa cuando el aminoacido activado incorrectamente es !a homocistefna, que carece del grupo metilo de la metionina.) La correcci6n libera una forma modificada del aminoacido, como la homocistefna tiolactona. De hecho, esta es producida en E. col:" como un producto derivado de !a reacci6n de carga de !a Met-RNAt sintetasa, lo cuaJ demuestra que la correcci6n continua es parte del proceso de carga de un RNAt con su aminoacido.

• Algunas sintetasas utilizan Ia correccion quimica en una etapa posterior. De hecho. el aminoacido erroneo es transferido al RNAt, despues es reconocido como incorrecto por su estructura en el sitio de union con el RNAt, y por lo tanto, hidrolizado y liberado. El proceso requiere de un ciclo continuo de ligamiento e hidrolisis hasta que se transfiere el aminoacido correcto al RNAt. La Ile-RNAt sintetasa de E. coli constituye un :!!l plo clasico en el que la discriminacion entre :...n oacidos depende de Ia presencia de R.l\TAt. La """'rna puede cargar valina con AMP, pero hidroli.=1 valil-adenilato cuando se agrega el RNAt1k La ~ de error general depende de las especificidades _ ..:ada paso, como se resume en Ia ~de 1.5 x 10-s es menor que la tasa a la cualla __::1a es sustituida por isoleu cina (en Ia glob ina del .ejo), que oscila entre 2 y 5 x 10---'~ , por lo tanto, :.;;rga erronea probablemente represente solo una - ~·..1efi.a fracci6n de los errores que ocurren en Ia :esis protefnica. La Ile-RNAt sintetasa utiliza el tamaiio como -:: para discriminar aminoacidos. En la .uestra que tiene dos sitios activos: el sitio sinteIO de activaci6n) y el sitio de edici6n (o hidrolf. La estructura cristalina de Ia enzima muestra - el sitio sintetico es dem asiado peque!'io como ·: permitir Ia entrada de la leucina (analogo cer- de Ia isoleu cina) . Todos los aminoacidos mas ~ es que la isoleucina son excluidos de Ia activa-· debido a que no pueden entrar a! sitio sinteti- ero un aminoacido que sf lo logra, es colocado :: RNAt. Despues, Ia enzima intenta transferirlo .:io de edici6n. La isoleucina es ta a salvo de la -·on porque es demasiado grande como para en. a! sitio correspondiente. Sin embargo, Ia valina . i e entrar a ese sitio, de modo que se hidroliza - ·:al-RNAt11< incorrecto. En esencia, la enzima -xJrciona un filtro molecular doble. en el que el ~ no del arnino
Frecuencia de errores

Paso Activaci6n de valina a Vai-AMP119

1/225

Liberaci6n de Val-RNA! Tasa global de error

1/225

X

1/270 1/270 =1 /60 000

La precision de la carga del RNAt11• par media de su sintetasa depende del control de los errores en dos etapas.

El sitio de edici6n es mas pequeno que el sintetico Sitio sintetico

~a

Sitio de edici6n

lie entra en el sitio sintetico pero no en el de edici6n

La Val pasa del sitio sintetico al de edici6n

La Ile-RNAt sintetasa tiene dos sitios actives. Los ami noacidos mas grandes que la leucina no pueden ser act ivados debido a que no embonan en el sitio sintetico, en tanto que los mas pequeiios son eliminados porque son susceptibles de entrar al si tio de edici on .

Extreme de horquilla alterno

Extrema helicoidal usual

Sitio de edici6n

34At Sitio sintetico

Un ami noacido es transportado del sitio sint{~ tico al de edicion de la Ile-RNAt sintetasa par un cambia en la conformacion del tallo aceptor del aminoacido del RNAt.

9 .11 Las si ntetasas uti lizan mecanismos de correcci on para incrementar la precision

205

La translocacion entre sitios es el paso que limita la velocidad de la correccion. La Ile-RNAt sintetasa es una sintetasa de clase I, sin embargo, el mecanismo de doble filtro tambien es utiUzado por las sintetasas clase II.

AUG

UAA

UUG AAC

L e,J

Los RNAt supresores tienen anticodones mutados que leen a codones nuevos

~

Leu /


Mutante sin sentido: termina el codon UAG

• Un RNAt supresor suele presentar una mutacion en el anticodon que cambia los codones a los cuales responde. • Cuando el anticodon nuevo corresponde a un codon de terminacion, se inserta un aminoacido y La cadena polipeptldica rebasa al codon determinacion, lo cual resulta en La supresion de una mutacion sin sentido en el sitio de una mutacion sin sentido, o en La lectura a traves de un codon natural determinacion. • La supresion de mutaciones de sentido erroneo ocurre cuando el RNAt reconoce a un codon distinto del normal, de manera que un aminoacido es sustituido por otro.

El aislamiento de los RNAt mutantes ha sido una de las herramientas mas potentes para analizar la capacidad de un RNAt para responder a sus codones en el RNAm y para determinar los efectos que tienen diferentes partes de la molecula de RNAt en el reconocimiento codon-anticodon. Los RNAt mutantes se afslan por su capacidad para superar los efectos de las mutaciones en genes codificadores de protefnas. En terminologfa genetica general, una mutacion susceptible de superar los efectos de otra se denomina supresora. En los sistemas de RNAt supresores, Ia mutacion primaria transforma un codon de un RNAm de manera que el producto protefnico deja de ser funcional. La mutacion supresora secundaria cambia el anticodon de un RNAt, de tal forma que este reconoce a! codon mutante en Iugar de (o tambien) a su codon diana original. El aminoacido que se inserta ahora restaura la funcion de Ia protefna. Los supresores se describen como supresores de mutaciones sin sentido o supresores de mutaciones de sentido err6neo, dependiendo de Ia naturaleza de Ia mutacion original. En una celula de tipo silvestre, una mutacion sin sentido es reconocida solo por un factor de liberacion que termina Ia sfntesis protefnica. La mutacion supresora crea un aminoacil-RNAt capaz de reconocer al codon de termina cion, y por medio de Ia insercion de un aminoacido, permite que Ia 206

CAPiTULO 9 Utilizacion del codigo genetico

UAG \ UAA Faetoc..de liberaci6n

Mutaci6n supresora: cambia al anticodon del Tir-RNAt

J

AUG

UAG AU G

Mutaci6n delE_NAt UAC UAG _/( AUG AU C /

,,J~

r;,

UAA

~ Tir

Las mutaciones sin sentido pueden ser suprirr · das por un RNAt con un anticodon mutante, el cual inserta _aminoacido en el codon mutante, de modo que se produce e prote1na de longitud total en La cual el residua de Leu origi-o ha sido remplazado por Tir.

sintesis protefnica rebase el sitio de la mutacion sentido. Esta nueva capacidad del sistema de tradli.: cion permite que se sinteticen protefnas de longi completa, como se ilustra en la l 9 . En cade que el aminoacido insertado por supresion sdiferente del que estaba originalmente en ese si de la protefna de tipo silvestre, la actividad de protefna puede ser modificada. Las mutaciones de sentido err6neo transform;a un codon que representa a un aminoacido en ;_ codon que representa a otro que no pueda funcior~' en Ia protefna en Iugar del residuo original. (Fe malmente, cualquier sustitucion de aminoaciG. constituye una mutacion de sentido erroneo, p en la practica se detectada s6lo si altera Ia activiC.: de Ia protefna.) La mutaci6n puede ser supriffi por Ia insercion del aminoacido original o de al otro que sea aceptable para la proteina. En la se demuestra que Ia supres:. de una mutacion de sentido erroneo puede loge

: e Ia misma manera que Ia supresion de una ..: acion sin sentido, mutando el anticodon de un · . ·_-\t que porta a un aminoacido aceptable de ma~ ~a que responda al codon mutante. Por lo tanto, ;upresion de una mutacion de sentido erroneo .plica un cambio en el significado del codon de :-. aminoacido a otro.

Tipo silvestre: el codon GGA es lefdo por el Gli-RNAt AUG

GGA ccu

UAA

GIIJ !

Hay supresores de mutaciones sin sentido para cada codon de termi naci6n

Gli

Sentido erroneo: el triplete AGA es lefdo por el Arg-RNAt :~:1 ceptos principales

AUG

• ( ada tipo de codon sin sentido es suprimido por moleculas de RNAt con anticodones mutantes.

A GA ucu

UAA

A~J~

• Algunos RNAt supresores extraiios presentan mutaciones en otras partes de la molecula.

Arg

. · > supresores de mutaciones sin sentido se enca-

_.an en tres clases, una por cada tipo de codon de . :-:ninacion . En la se describen las pro.::Jades de algunos de los supresores mejor carac:~.z ados.

Supresion: el triplete AGA es lefdo por el Gli-RNAt mutante AUG Mutacron del RNAt

A GA u cu

UAA

,;r _~

Los mas faciles de caracterizar han sido los succ u ucu ~ ~ ~:'Sores ambar. En E. coli se han mutado cuando .-::1os seis RNAt para reconocer a los codones UAG. - - OS los RNAt supresores ambar tienen el anticoI Gil . :-. CUA~ y derivan del tipo silvestre por un solo -.Zlbio de base. El sitio de la mutacion puede ser -~ lquiera de las tres bases del anticodon, como se - ·erva en supD, supE y sup F. Cada RNAt supresor La supresion de una mutacion de sentido erroneo ocurre cuando el anticodon del RNAt es mutado de tal manera : ~ - noce solo al codon UAG, no a sus codones anque responde al codon incorrecto. La supresion es solamente :.- res. Los aminoacidos insertados son serina, gl uparcial porque tanto el RNAt de tipo si lvestre como el RNAt . ina o tirosina, los mismos que portan los RNAt supresor pueden responder al triplete AGA. : i po silvestre correspondientes. Los supresores ocre tambien surgen por mu. . :ones del anticodon; los que mejor se conocen ::. supC y supG, que insertan tirosina o lisina en .. uesta a los codones ocre (UAA) o a los ambar .·. G) , fenomeno que concuerda con el pronostico Locus RNAt Tipo silvestre Supresor hipotesis del balanceo de que un triplete UAA Codon/anti Antilcodon . no es susceptible de ser reconocido. ~ Un supresor UGA tiene una propiedad inessupD (su 1) Ser UCG CGA CUA UAG __ ada, es un derivado del RNAtTrp, pero su unica supE (su2) Gin GAG CUG CUA UAG _. : :acion consiste en la su stitucion de una A y no supF (su3) Tir - ·..:na G en la posicion 24. Con este cambio se remuA8 GUA C UA UAG ~ un par G-U por un par A-U en el tallo D, de supC (su4) Tir UA8 GUA UUA UA~ . j o que se incrementa Ia estabilidad de la helice. ~ o:ecuencia del anticodon se mantiene igual que supG (su5) Lis AA~ uuu UUA UA~ -:i tipo silvestre, CCA'-. Por lo tanto, las mutacio~.- el tallo D deben, de alguna manera, alterar Ia supU (su7) Trp UGG CCA UCA UG~ . 'ormacion dellazo anticodon al permitir que el ;- -ete CCA<- se aparee con el UGA en un balanceo Los RNAt supresores de mutaciones sin sentido ..:·ual que permite el apareamiento entre C y A. son generados par mutaciones en el anticodon.

GI JG~

!

9.13 Hay supresores de mutaciones sin sentido para cada codon determinacion

207

El RNAt supresor sigue reconociendo a su codon usual, UGG. En un RNAt eucariotico se observa una respuesta similar. El hfgado bovino contiene un RNArser con el anticodon 111 CCA'- . Las reglas del balanceo pronostican que este RNAt debe responder a! codon de triptofano UGG, pero de hecho responde a! codon de terminacion UGA, de modo que es posible que el triplete UGA sea suprimido de forma natural en esta situacion. La importancia general de estas observaciones yace en la demostracion de que el reconocimiento codon-anticodon del RNAt silvestre o del RNAt mu tante no es pronosticable completamente a partir de las secuencias de los tripletes pertinentes, sino que tambien depende de otras caracterfsticas de Ia mol ecula.

1111

Los supresores pueden competir con la lectura de tipo silvestre del c6digo

Conceptos principales • Los RNAt supresores compiten con los RNAt de tipo silvestre que tienen el mismo anticodon para leer el codon o los codones correspondientes. • La supresion eficiente es perjudicial porque resulta en una lectura que rebasa codones determinacion. • El codon UGA es permeable y noes interpretado correctamente par el Trp-RNAt del 1 al 3% de las veces.

Traducci6n de tipo silvestre

&.....=:::==::==AUG

UAA

UAG

El factor de liberacion termina Ia sintesis en un codon de terminaci6n

Supresion ambar AUG

UAG

~~C

El RNA! supresor lee el codon UAG y Ia proteina ~ se extiende al codon de Tir 1 terminacion

UAA

Factor de liberacion

t

Tir

Los supresores de mutaciones sin sentido tambien leen a traves de los codones determinacion, sintetizando as\ proteinas mas largas que las de tipo silvestre.

208

CAPITULO 9 Utilizacio n del codigo genetico

Hay una diferencia interesante entre el reconocimiento usual de un codon por el aminoacil-RNAt apropiado y la situacion en Ia cualla mutacion permite que un RNAt supresor reconozca a un codon nuevo. En una celula de tipo Silvestre solo puede atribufrsele un significado a un codon determinado, el cual representa a un arninoacido panicular o a una sei1al de terminacion. Sin embargo, en una celula que porta una mutacion supresora, el codon mutante tiene la alternativa de ser reconocido por el RNA< supresor o de ser leido con su significado usual. Un RNAt supresor de mutaciones sin sentid debe competir con los factores de liberacion qu reconocen a! codon o a los codones de terminacion. Un RNAt supresor de mutaciones de sentid erroneo debe competir con los RNAt que responden adecuadamente a su nuevo codon. La extension de Ia competencia influye en Ia eficiencia de 1supresion, de modo que Ia efectividad de un supresor particular depende no solo de la afinidad entr~ su anticodon y el codon diana, sino tambien de s· concentracion en la celula y de los parametros qu rigen las reacciones competitivas de terminacion de insercion. La eficiencia con la que se lee cualquier cod6en particular depende de su localizacion, de mod que Ia extension de Ia supresion de una mutaci6sin sentido por un RNAt dado puede variar ampli<'- mente, seg(m el contexto del codon. Se desconoce C' efecto de las bases vecinas del RNAm en el recon cimiento codon-anticodon, pero el contexto pue -~ cambiar Ia frecuencia con que un codon es recom cido por un RNAt especffico en mas de un arden magnitud. El efecto de la base que se encuentra e_ellado 3' de un codon parece ser particularmen-: contundente. Un supresor de mutaciones sin sentido es a: lado por su capacidad para responder a un cod mutante sin sentido. ;Pero el mismo triplete cons:... tuye una de las sefiales determinacion de la celu:..:. El RNAt mutante que suprime una mutacion s sentido debe, en principio, ser capaz de supri Ja terminacion natural en el extrema de cualq ' : gen que utilice dicho codon. En Ia 92 muestra que esta ultralectura del codon de teminacion natural resulta en Ia sfntesis de una p~ tefna mas larga, con material terminal c adicioc __:_ La protefna ampliada terminara en la siguiente : cuencia determinacion que se encuentre en la f· del marco de lectura. Cualquier supresion exte _ de la terminacion probablemente sea perjudiara la celula porque se han producido protei':-: ampliadas cuyas funciones han sido modificadc. Los supresores ambar tienden a ser relarim ente eficientes, en general funcionan a tasa l 0% a 50%, dependiendo del sistema. Esta eficit-

.:l es posible porque los codones ambar se utilizan _:ativamente con poca frecuencia para terminar la _.resis protefnica de E. coli. los supresores ocre son diffcil es de aislar, siem-: son mucho menos eficientes, su acrividad suele ::ar por debajo del 10%. El crecimiento de todos . : supresores ocre es deficiente, lo cual indica que _: supresion de los tripletes UAA y UAG es daflina .:.ra E. coli, probablemente debido a qu e el codon .:re se utiliza con mayor frecuencia como seflal de :-:-minacion natural. El triplete UGA es el menos eficiente de los co- n es determinacion en su funcion natural; el Trp - •At lo interpreta de manera erronea con una fre_Jencia de l a 3% en situaciones de tipo sitvestre, - -:ro a pesar de esta deficiencia, se utiliza con mayor -:-:cuencia que el triplete ambar para terminar a los c :'nes bacterianos. El supresor de mutaciones de cambio de senti.:. de un gen tiende a ser el mutador de otro gen. ._ ~ supresor corrige una mutacion al sustituir a un inoacido por otro en el sitio mutante. No obs . ·:1te, en otras ubicaciones, la misma sustitucion ·:::nplazara a! amino
na de la cubierta del fago de RNA Q~. La formacion de partfculas Q~ ineficientes implica que el codon de terminacion ubicado en el extremo de ese gen sea suprimido a baja frecuencia para generar una pequefla proporcion de protefnas de cubierta con una extension terminal C. En efecto, este codon de terminacion es permeable, y !a razon es que el Trp-RNAt reconoce a! codon a baja frecuencia . La ultra lectura de los codones de terminacion tambien ocurre en las eucari otas, donde los virus de RNA son los que !a utilizan con mas frecuencia, fenomeno que puede implicar !a supresion de los tripletes UAG!UAA por el Tir-RNAt, el Gln-RNAt o el Leu-RNAt, o bien !a supresion del triplete UGA por Trp -RNAt o Arg -RNAt. La extension de la supresion parcialla dicta el contexto circundante del codon.

aD El ribosoma influye en la precision de la traducci6n Concepto principal • La estructura del RNAr 165 en los sitios PyA del ri bosoma influye en la exactitud de la traducci6n.

La falta de una variacion detectable cuando se analiza la secuencia de una protefna demuestra que Ia sintesis protefnica debe ser extremadamente precisa. Muy p ocos errores son aparentes en forma de sustituciones de un aminoacido por otro. Hay dos etapas generales en la sfntesis protefnica en las cuales pueden cometerse errores (vease Ia Fig. 8.8, seccion 8 .3, La precision de Ia sfntesis protefnica es controlada por mecanismos especiales ): • No hay duda de que cargar a un RNAt solo con su aminoacido correcto es imponantfsimo, lo cual es una de las funciones de la aminoacii-RNAt sintetasa. La tasa de error probablem ente varfa en fun cion de la enzima espedfica, pero en generaL se producen errores en < l! l 0 5 aminoacilaciones . • La especificidad del reconocimiento codonanticodon es crucial, pero desconcertante. Aunque las constantes de union varfan segun la reaccion codon -anticodon, la espe cificidad siempre es demasiado baja como para proporcion ar una tasa de error < l o- 5 . Cuando se encuentran libres en solu cion, los RNAt se unen a sus co dones muy ctebilmente. Los tripletes relacionados, pero erroneos (con dos de tres bases correctas), son reconocidos de 10-t a 10-2 veces mas eficientemente que los correctos. Asf pues, el apareamiento de bases codon-anticodon parece ser un punto debil en la exactitud de 9.15 El ribosoma influye en la precision de la traducci6n

209

la traduccion. El ribosoma tiene una funcion importante en el control de la especificidad de esta reaccion, funciona de manera directa o indirecta como un "corrector" para distinguir entre apareamientos codon-anticodon correctos e incorrectos, de modo que la diferencia intrinseca bastante modesta seamplfa -I 000 veces. Ademas de Ia funcion del ribosoma, los factores que ponen a los aminoacil-RNAt y a los RNAt iniciadores en el ribosoma tambien pueden influir en la reaccion de aparearniento. Debe haber algunos mecanismos para estabilizar al aminoacil-R1\l'At correcto y permitir que su aminoacido sea aceptado como sustrato para recibir a Ia cadena polipeptfdica; los os con un aminoacil-RNAt incorrecto deben romperse rapidamente, de manera que el complejo salga sin reaccionar. Supongase que no hay especificidad en la colision inicial entre el complejo aminoacil-RNAt-

El RNA! correcto interac!Ua con el RNAr

~

RNAm

Un RNA! incorrecto sale del sitio A

Un aminoacil-RNAt puede ser colocado en el sitio A (por el EF-Tu), pero s6lo uno que se aparee con el anticodon puede hacer os estabilizadores con el RNAr. En ausencia de estos os, el aminoacil-RNAt se difunde fuera del sitio A.

210

CAPiTULO 9 Utilizaci6n del c6digo genetico

EF-Tu-GTP y el ribosoma. Si cualquier complejo. independientemente de su RNAt, puede entrar al sitio A, el numero de entradas incorrectas debe exceder por mucho el de entradas correctas. Hay dos modelos basicos que explican como el ribosoma discrimina entre aminoacil-RN At apareados correcta o incorrectamente. La situacion actual incorpora elementos de ambos modelos. • El modelo de reconocimiento directo supone que Ia estructura del ribosoma esta disenada para reconocer a los aminoacil-RNAt apareados de forma correcta, lo cual significarfa que el apareamiento correcto resulta e _ algun cambio pequeno en Ia conformacion del aminoacil-RNAt, que puede reconoce al ribosoma. La discriminacion ocurre ante~ de cualquier reaccion posterior. • El modelo de Ia correccion cinetica propone que hay cuando menos dos etapas en el proceso, de manera que el aminoacil-RNAt tiene multiples opmtunidades para disgregarse. Ur. aminoacil-RNAt apareado incorrectamente puede pasar a traves de algunas etapas de !c. reaccion antes de ser rechazado. En principia, Ia selectividad global puede ser productc de las selectividades de cada etapa. La es un diagrama de lo que sucede a los aminoacil-RNAt apareados de manera correctc. e incorrecta. Un aminoacil-RNAt apareado de forme:. correcta es susceptible de establecer os estabilizadores con el RNAr, en tanto que el incorrectamente apareado no forma dichos os y, por It tanto, puede difundirse fuera del sitio A. La ruta del descubrimiento de estas interacciones comenzo con investigaciones de los efecto~ de la estreptomicina, un antibiotico, en Ia decadz de 1960. Dicho farmaco impide la sfntesis protefnica al unirse al RNAr 16S e inhibir Ia capacida · del EF-G para catalizar Ia translocacion. Asimismo incrementa el nivel de lecturas erroneas de las pirimidinas U y C (una suele ser confundida con la otra y, en ocasiones, con A). La proteina S 12, cuya secuencia ha sido modificada en mutantes resistentes influye en el sitio en que actua Ia estreptomicina Los ribosomas con una protefna S 12 derivada de bacterias resistentes muestra una reduccion en e: nivel de lecturas erroneas respecto de los ribosomas de tipo silvestre, pues efectivamente, Ia Sl.:: controla el nivel de lecturas erroneas, y cuando e! mutada para disminuirlas, suprime el efecto de lc. estreptomicina. La Sl2 estabiliza la estructura del RNAr 16S eL Ia region que se une a Ia estreptomicina. Lo importante aquf es que !a region de los sitios P y A influye e1 la precision de la traduccion, que puede ser mas 0 menc: precisa al cambiar la estructura del RNAr 16S. La com-

=acion de los efectos de la proteina S 12 y de la :::-eptomicina en Ia estructura del RNAr explica el __ portamiento de mutantes diferentes de Ia S 12, =:.mos de los cuales incluso hacen a! ribosoma de__:.iente de !a estreptomicina para realizar !a tra_: ·oncorrecta. Por !a estructura cristalina del ribosoma ahora -c-mos que el RNAr l6S se encuentra en posicion :..:-3 formar os con el aminoacil-RNAt. Dos __ =s del RNAr l6S pueden hacer o con el -.:-:o menor de !a helice formada por el aparea:::J.to entre el anticodon del RNAt y las dos pri::-:-as bases del codon del RNAm, lo cual estabiliza ·-:ctarnente Ia estructura cuando se forman los :.:actos correctos codon-anticodon en las prime- l os posiciones del codon, pero no monitorea a ~ :ontactos de la tercera posicion. La estabilizacion de los arninoacil- R.t~At correcta': te apareados puede tener dos efectos. Al mante-- el aminoacil-RNAt en el sitio A, se evita que esca- :..ntes de !a siguiente etapa de Ia sintesis proteinica. .::.. :iill1bio conformacional del RNAr puede ayudar a --:ar la siguiente etapa de Ia reaccion, que consiste .a hidrolisis de GTP por medio de EF-Tu. Una parte del efecto de correccion depende del :::."lpo. Un aminoacil-RNAt ubicado en el sitio A _~d e, en efecto, quedar atrapado si la siguiente -'.;la de la sintesis proteinica ocurre mientras se ,-Jentra ahf, de modo que un retraso entre la en:.:a a! sitio A y la transferencia del grupo peptidilo _~ e incretnentar Ia posibilidad de disociacion de mlinoacil-RNAt apareado de forma incorrecta, lo ---=.: ocurre con mayor rapidez que en el aminoacil- -.-\. t apareado de forma correcta, probablemente - ' ·:eces, de modo que su oportunidad para escapar x rementa cuando disminuye Ia velocidad de la ·-:de transferencia del peptido. Se supone que Ia especificidad de Ia decodifica- : __ reside en el ribosoma, pero resultados recientes < ·eren que los factores de traduccion influyen en -::-:oceso en los sitios P y A. Un indicia de que el .:_:=·--u esta implicado en la conservacion del marco . :ectura son los mutantes del factor que suprime - ·ambios de este ultimo, lo cual implica que el ~-:: _-uno simplemente transporta aminoacil-RNAt ~ : tio A, sino que tambien esta involucrado en el · _:cionamiento del aminoacil-RNAt entrante res~ :-:o del peptidil-RNAt del sitio P. Un caso sobresaliente en el cuallos facto res in_.en en el sigruficado es Ia iniciacion. La mutacion :... codon de iniciacion AUG a UUG en el gen HIS4 : :.as levaduras evita Ia iniciacion, pero puede ser --= las mutaciones supresoras extragenicas permi-=: que se inicie Ia sintesis proteinica en el codon - _:ante UUG. Se ha demostrado que dos de estos _-::-:esores se encuentran en los genes que codifican

a las subunidades a y ~ del eiF2, factor que une a! Met-RNAt, con el sitio P. La mutacion del eiF~2 reside en una parte de Ia proteina que casi seguramente se relaciona con ]a uruon del acido nucleico, parece probable que su diana sea !a secuencia de iniciacion del RNAm como tal o la asociacion de aparearniento de bases entre el codon del RNAm y el anticodon del Met-RNAt, lo cual sugiere que el eiF2 participa en la discrimi~acion de los codones de iniciacion y en el transporte del RNAt iniciador al sitio P. El costo de Ia sintesis protefnica en cuanto a enlaces de alta energia puede incrementarse por los procesos de correccion. Una pregunta importante en el calculo del costo de Ia sfntesis proteinica es en que etapa se toma Ia decision de aceptar a! RNAt. Si inmediatamente se toma la decision de liberar un complejo arninoacil-RNAt-EF-Tu-GTP, hay poco costo extra por rechazar el gran numero de RNAt incorrectos que (estadisticamente) tienden a entrar a! sitio A antes de que el RNAt sea reconocido. Sin embargo, si el GTP es hidrolizado antes de que se disocie el aminoacil-RNAt apareado de manera erronea, el costo sera mayor. Un aminoacil-RNAt apareado erroneamente puede ser rechazado antes o despues de la division del GTP, aunque aun no sabemos donde, en promedio, es rechazado. Hay evidencias de que el uso de GTP in vivo es mayor que el de los tres enlaces de alta energfa utilizados en !a adicion de cada aminoacido (correcto) a !a cadena.

Ill

La modificaci6n de la codificaci6n cambia el significado de los codones

Conceptos pri nci pales • Los cambios de significado de los codones pueden ser provocados por RNAt mutantes o por RNAt con propiedades especiales. • El marco de lectura puede sufrir modificaciones por desviaci6n o por cam bios en Ia pauta de lectura que dependen de las propiedades del RNAm .

El marco de lectura de un mensajero suele ser invariable. La traduccion empieza en un codon AUG y continua en tripletes hasta un codon de terminacion. La lectura no nota el sentido: Ia insercion o delecion de una base provoca una mutacion de cambia de marco, en la cual Ia fase de lectura va mas alla del sitio de !a mutacion. Los ribosomas y los RNAt siguen inevitablemente en tripletes, sintetizando una serie de arrtinoacidos completamente diferente. Hay algunas excepciones a! patron usual de traduccion que permiten que un marco de lectu-

9.16 La modificaci6n de la codificaci6n cambia el significado de los codones

211

La supresion es provocada par el anticodon mutado

l-l

8

Cambia del marco de lectura -1 en el

mtm,lme VIH

NNNNUUUUU UAGGNNNNNNNN

NNNNN UGA NNNNNNNNNN Ultimo codon lefdo en Ia fase de lecture inicial

Factor especial + RNAt reconocen al codon

NN NN NN NN NNNNN UGA NNNNNNNNNN

Sei-Cis ~

-&

Una mutacion en un RNAt individual (usualmente en el anticodon) puede suprimir el significado normal de ese codon. En un caso especial, un RNAt especifico se une a un factor de elongacion inusual para reconocer a un codon de terminacion adyacente a un lazo de horquilla.

ra con algun tipo de interrupcion, como un codon sin sentido o un cambio en el marco de lectura, sea traducido en un proteina de longitud total. Los eventos de recodificacion son responsables de las excepciones a las reglas usuales e involucran a cierto tipo de eventos. El cambia del significado de un solo codon permite que un aminoacido sea sustituido por otro o que un aminoacido se inserte en un codon de terminacion. En la se muestra que estos cambios se basan en las propiedades del RNAt individual que responde al codon: • La supresion implica el reconocimiento de un codon por un RNAt (mutante) que usualmente responderia a un codon diferente (vease la seccion 9.12, Los RNAt supresores tienen anticodones mutados que leen a codones nuevas). • La redefinicion del significado de un codon ocurre cuando se modifica un aminoacilRNAt (vease la seccion 9.8, En ciertos codones de terminacion pueden insertarse aminoacidos nuevos). Los cambios del marco de lectura ocurren en dos tipos de situaciones: • Los cambios del marco de lectura tipicamente implican permutaciones en Ia fase de lectura cuando el aminoacil-RNAt se desliza una base, hacia delante + 1 o hacia a tras -1 (vease la siguiente seccion, Los cambios del marco de lectura ocurren en las secuencias resbaladizas). El resultado que se muestra en la .. es que la traduccion rebasa al codon de terminacion.

212


Lectura sin cambia en Ia fase de lectura

NNNNUUUUU UAGGNNNNNNNN Lectura despues del cambia del marco de lectura

NNNNUUUUU _ Un RNAt que se desliza una base en el apare.omiento con un codon provoca un cambia en el marco de lecL que suprime la terminacion. La eficiencia suele ser de ~5%.

Evasion de 60 nucleotidos en el gen 60 del fago f 4

~

GAUGGA UGAC............ AUUGGAUUA Ultimo codon del marco de lectura original

Lectura sin cambia del marco de lectura

GAUGGA UGAC............ AUUGGAUUA Lectura despues del cambia del marco de lectura

GAUGGAUGAC ....

.. AUUGGfl! Ul:JA

La evasion ocurre cuando el ribosoma se c=. plaza a lo largo del RNAm, de manera que el peptidil- R' localizado en el sitio P es liberado del apareamiento co c _ codon y posteriormente repara con otro codon localizado adelante en la cadena.

• La evasion implica un movimiento del rit soma para cambiar al codon apareado c el peptidil-RNAt que se localiza en el sitic La secuencia entre los dos codones no JY de ser representada en una proteina. Co se muestra en Ia , esta situac' permite que la traduccion vaya mas allci cualquier codon de terminacion localize.. en la region intermedia.

Los ca mbios del marco de lectura ocurren en las secuencias resbaladizas

Polipeptido-Le~

c d dA(lGC El Arg-RNAt reconoce al triplete AGG Continua Ia lectura normal

:.:-nceptos principales El marco de lectura debe ser influido por la secuencia : el RNAm y por el ambiente ribosomico. _as secuencias resbaladizas permiten que el RNAt se 1esplace una base despues de que se ha apareado con su anticodon, cambiando as\ el marco de lectura. _a traduccion de algunos genes depende de la aparicion ·egular de cam bios programados del marco de lectura.

::__ ::a.mbio del marco de lectura se relaciona con mo: ::Jlas de RNAt especificas en dos circunstancias: • Algunos RNAt supresores mutantes reconocen a un "codon" por cuatro bases y no por las tres usuales. • Ciertas secuencias "resbaladizas" permiten que el RNAt se mueva una base hacia adelante o hacia atrci.s del RNAm en el sitio A. Las mutaciones de cambio del marco de lectu: ~ esultan de la insercion o delecion de una base, _ u eden ser suprimidas al restaurar el marco de _::-r ura original compensando deleciones e insern es de bases en un gen (vease la secci6n 2.8, El ·igo genetico se lee en tripletes). Sin embargo, los __resores de los cambios del marco de lectura ex.:-.;aenicos tambien pueden encontrarse en forma de - . te culas de RNAt con propiedades aberrantes. El tipo mas sencillo de supresor de cambios del - u co de lectura externo corrige la fase de lectura __,:;11do se ha provocado una mutacion por la in~ c ion de una base adicional en un fragmento de -: 'iduos identicos, por ejemplo, una G puede ser -3ertada en una serie de muchas bases G contiguas. :: supresor de cambio del marco de lectura es un -- ~ AtGli que tiene una base extra insertada en su lazo - - j codon, convirtiendo al anticodon de la secuen:::_:: triplete usual ccc- en la secuencia cuadruple ~ .:::c c--. El RNAt supresor reconoce a un "codon" ~ cuatro bases. Algunos supresores de los cam bios del marco de c = ~ura pueden reconocer a mas de un "codon" -"' cuatro bases, por ejemplo, un supresor RNAtLis o.n eriano puede responder a las secuencias AAAA .:; AAAU, y no al codon usual AAA. Otro supresor - _e de leer cualquier "codon" de cuatro bases con - =c en las tres primeras posiciones; la siguiente -~ e noes pertinente. En estos casos, las bases al~:-n as aceptables en la cuarta posicion del "codon" -.as largo no estan relacionadas con las reglas de ba::Keo normales. El RNAt supresor probablemente ·.:conoce a un codon de tres bases, pero por alguna

/ A, c c 1

Modos alternos de traducci6n resultan en Tya o Tya-Tyb Proteina Tya lniciaci6n

Terminaci6n

~~--~ ~---~~u1

lniciaci6n

marco de lectura

~A Terminaci6n

Fusion protefnica Tya-Tyb En ausencia de Arg-RNAt, el leu-RNA! se desliza una base, Gli-RN;econoce al triple~e~GC~ 'CG o~AU

---+

CJJUA,GGC

u~ Al.J

CUUAGGC

• Para la expresion del gen tyb del elemento Ty de las levaduras se necesita un cambia +1 del marco de lectura, el cual tiene Lugar en una secuencia de siete bases en la que dos codones de Leu van seguidos de un codon de Arg escaso.

razon, probablemente obstaculizacion espacial, la base adyacente esta bloqueada, lo cual fuerza a pasar por alto una base antes de que el siguiente RNAt pueda encontrar un codon. Las situaciones en que el cambio de marco de lectura es un evento normal se presentan en fagos y virus, y pueden afectar la continuacion o terminacion de la sintesis protefnica, ademas de ser resultado de las propiedades intrfnsecas del RNAm. En los retrovirus, la traduccion del primer gen es terminada por un codon sin sentido en fase con el marco de lectura. El segundo gen se encuentra en un marco de lectura diferente, y (en algunos virus) se traduce por un cambio del marco de lectura que modifica una segunda fase de lectura y, por lo tanto, evade al codon de terminacion (vease la Fig. 9.29 e incluso la seccion 22.3, Los genes retrovfricos codifican a poliprotefnas). La eficiencia del cambio de marco de lectura es baja, habitualmente -5%; de hecho, este hallazgo es importante en la biologfa del virus, un incremento en la eficiencia puede ser danino. En la .. se ilustra la situacion similar del elemento Ty de las levaduras, en el cual el codon de terminacion del gen tya debe ser evadido por un cambio del marco de lectura para leer al gen tyb subsecuente.

9.17 Los cambios del marco de lectura ocurren en las secuencias resbaladizas

213

Dicha situacion aclara porque Ia rara (pero predecible) ocorrencia de eventos de "lectura erronea" puede basarse en un paso necesario de Ia traduccion natural, Hamada cambio programado del marco de lectura, que ocurre en sitios especfficos a frecuencias 100 a 1 000 veces mas altas que Ia tasa a Ia cual se presentan errores en sitios no programados (-3 x 10-s por codon). Hay dos caracterfsticas comunes en este tipo de cambio del marco de lectura: • Una secuencia "resbaladiza" permite que un aminoacil-RNAt se aparee con su codon y que despues se desplace + 1 base (poco frecuente) o -1 base (mas frecuente) para aparearse con una secuencia triplete superpuesta que tambien puede aparearse con su anticodon. • El ribosoma se demora en el sitio del cambio de marco de lectura de modo de dar tiempo a que el aminoacil-RNAt reestructure su apareamiento. Las causas de Ia demora pueden ser un codon adyacente que necesita un aminoacil-RNAt que escasea; un codon determinacion que tarda en ser reconocido por su factor de liberacion, o un impedimenta estructural del RNAm (por ejemplo, un "seudonudo", conformacion particular del RNA) que obstaculiza al ribosoma.

GAUGGA JGAC ............ AUU S6'AUUA

I El ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm

Aterrizaje El peptidii-RNAt se aparea nuevamente con un codon nuevo

.. En el modo de evasion, un ri bosoma cuyo sitio P esta ocupado, puede detener la traducci6n si se desliza a lo largo del RNAm hasta un sitio en donde el peptidil-RNAt se aparee con un codon nuevo en el sitio P. Se rea nuda la sintesis proteinica.

214

CAPiTULO 9 Utilizaci6n del c6digo genetico

Los eventos de deslizamiento suelen implicar movimiento en cualquier direccion; se provoca un cambio del marco de lectura -1 cuando el RNAt se desplaza hacia atras, y al contrario, un cambio del marco de lectura + 1 cuando se mueve bacia delante. En cualquier caso, el resultado es Ia exposicion de un triple fuera de fase en el sitio A para el siguiente aminoacil-RN At. El evento del cambio de marco de lectura ocurre antes de Ia sfntesis del enlace peptidico, muy comunmente, cuando es activado por una secuencia resbaladiza aunada a una horquilla de flujo descendente del RNAm y las secuencias circundantes influyen en su eficiencia. El cambio de marco de lectura de Ia Figura 9.31 muestra el comportamiento de una secuencia resbaladiza tfpica. La secuencia CUUAGGC de siete nucleotidos suele ser reconocida por el Leu-RNAt en el codon CUU y despues por el Arg-RNAt en el triplete AGG. Sin embargo, el Arg-RNAt es escaso,} cuando Ia escasez resulta en retraso, el Leu-RNAt se desliza del codon CUU al triplete superpuesto UUA para provocar un cambio en el marco de lectura, debido a que el siguiente triplete en fase como el nuevo apareamiento (GGC) es leido por el Gli-RNAt. Normalmente, el deslizamiento ocurre en el sitio P (cuando el Leu-RNAt de hecho se ha convertido en peptidil-RNAt y porta Ia cadena naciente). El cambio de marco de lectura en un codon de terminacion da Iugar a Ia ultralectura de Ia protefna. La base que se localiza en el !ado 3' del codon de terminacion influye en las frecuencias relativas de terminacion y en los cambios de marco, y por lo tanto, en Ia eficiencia de Ia sefial de terminacion, Io cual facilita Ia explicacion de Ia importancia del contexto en Ia terminacion.

Ill

La evasion implica el movi miento del ribosoma

Ciertas secuencias desencadenan un evento de evasion, en el que un ribosoma detiene la traduccion. se desliza a lo largo del RNAm con el peptidil-RNAt en el sitio P y posteriormente reanuda Ia traduccion (vease Ia Figura 9.30), pero es un fenomeno bastante raro, solo se han autentificado -3 ejemplos. El ejemplo de evasion mas impactante se observa en el gen 60 del fago T4, donde el ribosoma se desplaza sesenta nucleotidos a lo largo del RNAm. La clave del sistema de evasion son los codones identicos (o sinonimos) en ambos extremos de la secuencia evadida. En ocasiones se les denomina sitios de "despegue" y de "aterrizaje". Antes de Ia evasion, el ribosoma se posiciona con un peptidilRNAt apareado con el codon de "despegue", en el sitio P, con un sitio A vacio en espera de Ia entrada

_::. aminoacil-RNAt. En Ia se muestra : ::-1 ribosoma se desplaza a lo largo del RNAm : -:a condicion hasta que el peptidil-RNAt puede :<'arse con el codon del sitio de aterrizaje. Una ' ::erfstica sobresaliente del sistema es su gran --:::lcia, -50 por ciento. :=..n secuencia del RNAm desencadena la evasion. :.aracterfsticas importantes son los dos codones . -.. ara el despegue y el aterrizaje, el espacio en. ~:· os, una estructura tallo-lazo que incluye a! . __ de despegue y el codon de term.inacion adya·-: a el; ademas esta involucrada la protefna que . .3 sintetizando. ?'ua Ia etapa de despegue se necesita el desapa..'ento del peptidil-RNAt de su codon, seguido de ;)vimiento del RNAm que evita que se aparee illlente. Despues, el ribosoma explora a! RNAm ~q ue el peptidil-RNAt puede aparearse de nue: . . el codon en !a reaccion de aterrizaje, seguido - ::-eanudacion de la sfntesis protefnica cuando el : acil-RNAt entra a! sitio en Ia forma usual. :; ual que en el cambia del marco de lectura, :.o:cion de evasion depende de que el ribosoma . ' :.:na pausa. La probabilidad de que el peptidil-.: se disocie de su codon en el sitio P se incre- .,. con la demora de Ia entrada del am.inoacil-.: a! sitio A. La escasez de aminoacidos puede adenar la evasion en los genes bacterianos ::o al retraso provocado porque no hay ami=.: -RNAt disponible para entrar al sitio A. Una - ) n de Ia estructura del RNAm en el gen 60 del -::-4 puede ser la reduccion de Ia eficiencia de la ·:1acion, que da Iugar a! retraso necesario para -=.:cion de despegue.

-=

Resumen : .:11encia del RNAm lefda en tripletes 5' ~ 3' se - na por media del codigo genetico con una se- ::a de aminoacidos de una protefna lefda de Ia _ al N a Ia terminal C. De los 64 tripletes, 61 co-=_ aminoacidos y tres proporcionan sefiales de ~acion. Los codones sinonimos que represen. . os mismos aminoacidos estan relacionados, :::udo por un cambia en Ia tercera base del co:=sta degeneracion de la tercera base, acoplada · ~ atron en el cuallos aminoacidos relacionados : ~ a ser codificados por codones relacionados, _ iza los efectos de las mutaciones. El codigo -.• co es universal y debe haber sido establecido :-:mprano en la evolucion. Los cambios de los . as nucleares son raros, pero han ocurrido al- urante Ia evolucion mitocondrial. .:.Ichos RNAt pueden responder a un codon en ::- Jar. El conjunto de moleculas de RNAt que

responde a los varios codones de cada aminoacido es distintivo de cada organismo. El reconocimiento codon-anticodon implica un balanceo en Ia primera posicion del anticodon (tercera del codon) que perm.ite que algunos RNAt reconozcan a varios codones. Todos los RNAt tienen bases modificadas, introducidas estas por enzimas que reconocen a las bases diana de !a estructura del RNAt. El apaream.iento codon-anticodon depende de modificaciones del codon mismo y tambien del contexto de las bases adyacentes, en especial dellado 3' del anticodon. Aprovechando el balanceo codon-anticodon, las mitocondrias de los vertebrados utilizan solo 22 RNAt para reconocer a todos los codones, a diferencia del mfnimo usual de 31 moleculas de RNAt; en esto colaboran los cambios del codigo mitocondrial. Cada arninoacido es reconocido por una aminoacil-RNAt sintetasa especffica, que tambien reconoce a todos los RNAt que codifican a dicho aminoacido. Las aminoacil-RNAt sintetasas tienen una funcion correctora que explora los productos de aminoacil-RNAt e hidroliza las moleculas unidas de manera incorrecta . Las aminoacil-RNAt sintetasas varian ampliamente, pero se clasifican en dos grupos generales segun Ia estructura del dominio catalftico. Las sintetasas de cada grupo se unen lateralmente al RNAt, formando os principalmente con las extremidades del tallo aceptor y con el tallo-lazo anticodon, y lo hacen por lados opuestos. La importancia relativa del tallo aceptor y Ia region anticodon para el reconocimiento especffico varfa en funcion de cada RNAt. Las mutaciones pueden permitir que un RNAt lea codones diferentes; la forma mas comun de dichas mutaciones ocurre en el anticodon. La alteracion de su especificidad puede permitir que el RNAt suprima una mutacion de un gen codificador de una protefna. Un RNAt que reconoce a un codon determinacion es un supresor de cambia de sentido, y el que cambia al aminoacido que corresponde a un codon, es un supresor de sentido err6neo. Los supresores de los codones UAG y UGA son mas eficientes que los de UAA, lo cual se explica porque el UAA es el codon de terminacion natural mas comun mente utilizado. La eficiencia de todos los supresores, sin embargo, depende del contexto del codon diana individual. Los cam bios del marco de lectura de tipo + 1 pueden ser provocados por RNAt aberrantes que leen a "codones" de cuatro bases. Los cambios del marco de lectura + 1 o -1 pueden ser provocados por secuencias resbaladizas localizadas en el RNAm, las cuales permiten que un peptidii-RNAt se deslice de su codon a una secuencia superpuesta que tambien 9.19 Resumen

215

puede aparearse con su anticodon. Este cambio del marco de lectura tambien requiere de otra secuencia que hace que el ribosoma se retrase. Los cambios del marco de lectura determinados por la secuencia del RNAm pueden ser necesarios para la expresion de genes naturales. La evasion ocurre cuando un ribosoma detiene la traduccion y se desplaza a lo largo del RNAm con su peptidil-RNAt en el sitio P, hasta que este se aparea con un codon apropiado; posteriormente se reanuda Ia traduccion.

Referencias

Ill

Introduccion

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Ill

El reconocimiento codon-anticodon implica balanceo

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Ill

Los RNAt son cargados con aminoacidos por medio de si ntetasas

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III!J

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Los RNAt son procesados a partir de precursores mas largos

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Ill

El RNAt contiene bases modificadas

Articulo de revision Hopper, A. K. and Phizicky, E. M. (2003). tRNA transfers to the limelight. Genes Dev. 17, 162-180.

Ill

Las bases modificadas afectan el apareamiento codon-anticodon

Articulo de revision Bjork, G. R. (!987). Transfer RNA modification. Annu. Rev. Biochem. 56, 263-287.

IJI

El codigo universal tiene alteraciones esporadicas

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216

En ciertos codones de terminacion pueden insertars< aminoacidos nuevas


Las aminoacil-RNAt sintetasas se clasifican en dos grupos

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1111

Las sintetasas utilizan mecanismos de correccion para incrementar la precision

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IIIJ

La evasion implica el movimiento del ribosoma

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Referencias

217

Localizacion de las proteinas ESQUEMA DEL CAPITULO

m:l II!D

• Las chaperoninas del grupo I y del grupo II son ensambles oligomericos extensos que actuan en proteinas diana a las cuales secuestran en cavidades internas. • La proteina Hsp90 es un chaperon especializado que actua en proteinas de rutas de transduccion de seiial.

Introducci6n El desplazamiento a traves de una membrana requiere de un mecanismo especial •

Las proteinas atraviesan las membranas por estructuras proteinicas especializadas insertadas en la membrana. • Los sustratos proteinicos interactuan directamente con el sistema de transporte del ER, las mitocondrias o los cloroplastos, pero requieren de proteinas acarreadoras para interactuar con los peroxisomas. • Para el transporte dentro del nucleo es necesario un mecanisme mucho mas grande y complejo.

La familia Hsp70 es ubicua • Los de la familia Hsp?O se encuentran en el citosol, el ER, las mitocondrias y los cloroplastos. • La proteina Hsp?O es un chaperon que actua en protei'nas diana aunada a los chaperones DnaJ y GrpE.

Las secuencias de senal inician la translocaci6n • Las proteinas se asocian con el sistema del ER solo durant< la traduccion . • La secuencia de seiial del sustrato proteinico es responsable de la asociaci6n con la membrana.

II!R La translocaci6n de las proteinas puede ser posterior a la traducci6n

0

durante esta

• Las proteinas que son importadas al interior de los organelos citoplasmicos se sintetizan en los ribosomas libres del citosol. • Las proteinas que son importadas al interior del sistema ER-Golgi se sintetizan en los ribosomas que estan asociadas al ER. • Las protei nas se asocian con las mem bran as por media de secuencias de aminoacidos especificas denominadas secuencias de sefial. • Las secuencias de sefial con mayor frecuencia son lideres localizados en la terminal N. • Las secuencias de seiial terminal N usualmente son separadas de La proteina durante el proceso de inserci6n.

m;J

lll!lll

liB Los chaperones pueden ser -necesarios para el

ll!D

Las proteinas desnaturalizadas y las sintetizadas recientemente necesitan chaperones • Los chaperones actuan en proteinas recien sintetizadas, en proteinas que atraviesan membranas o en proteinas que han sido desnaturalizadas. • La Hsp?O y algunas proteinas relacionadas constituyen una clase mayor de chaperones que actuan en numerosas proteinas diana.

218

La SRP interactua con el receptor de SRP • La 5RP es un complejo formado por RNA 75 y seis protein as. • El equivalente bacteriano de la 5RP es un complejo forma_~ por RNA 4.55 y dos proteinas. • El receptor de la 5RP es un dimero. • La hidr6lisis de GTP Libera a la 5RP de su receptor despues de su interacci6n .

'J)legamiento de las proteinas • 5e dice que las proteinas que pueden adquirir su conformaci6n de manera espontanea se autoensamblan. • Con frecuencia, las proteinas pueden ensamblarse en estructuras alternas. • Un chaperon dirige a una proteina a una ruta panticular al excluir rutas alternas. • Los chaperones evitan la formaci6n de estructuras incorrectas al interactuar con proteinas no plegadas para impedir que se plieguen de manera incorrecta.

La secuencia de senal interactua con la SRP • La secuencia de seiial se une a la 5RP (particula de reconocimiento de seiial) . • La union seiial-5RP provoca la interrupci6n de la sintesis proteinica. • La sintesis proteinica se reinicia cuando la 5RP se une al receptor de la 5RP en la membrana. • La secuencia de seiial es separada de la proteina de translocaci6n por la peptidasa seiiallocalizada en la cara "interna" de la membrana.

lam

El trasloc6n forma un poro • El complejo trimerico 5ec61 proporciona el canal para que pasen proteinas a traves de una membrana. • Una proteina transferente pasa directamente del ribosoma al trasloc6n sin exponerse al citosol.

HD

La translocaci6n requiere de inserci6n en el trasloc6n y (en ocasiones) de un trinquete en el • El ribosoma, la 5RP y el receptor de la 5RP bastan para insertar una proteina naciente en un trasloc6n . • Las proteinas que se insertan despues de La traduccion requieren de componentes adicionales en el citosol y del BiP en el ER.

E~

• El BiP es un trinquete que evita que una proteina se deslice hacia atras.

iiiiEJ La membrana mitocondrial interna y la externa tienen traslocones distintos

a translocaci6n inversa envia proteinas al citosol para que sean degradadas

• El transporte a traves de las membranas mitocondriales interna y externa utiliza diferentes complejos de receptores. • El complejo TOM (membrana exterior) es un complejo grande en el que los sustratos proteinicos son dirigidos al canal Tom40 per uno de des subcomplejos. • Los diferentes complejos TIM (membrana interna) se utilizan dependiendo de que el sustrato proteinico esta dirigido a la membrana interna o allumen. • Las proteinas pasan directamente del complejo TOM al complejo TIM.

• Los traslocones Sec61 pueden utiliza rse para la translocacion inversa de proteinas del ER al citosol.

Las proteinas residen en las membranas por media de regiones hidr6fobas • Las proteinas del grupo I tienen al grupo terminal N en el extreme distante de la membrana y las del grupo II presentan una orientaci6n opuesta. • Algunas proteinas tienen multiples dominies transmembrana.

mJm

Las secuencias de anclaje determinan la orientaci6n de las proteinas • Una secuencia de anclaje detiene el paso de una proteina a traves del trasloc6n. Habitualmente esta secuencia se localiza en el extreme C y resulta en una orientacion de grupo I en la cual el extreme N ha pasado a traves de la membrana. • Para insertar a una proteina en la membrana y anclar el sitio de insercion puede utilizarse una secuencia combinada ancla-sefial. Tipicamente, esto es interne y resulta en una orientacion de grupo II en la cual el extrema N es citosolico.

• Las proteinas son importadas al interior de los peroxisomas en su estado de plegamiento complete. • Tienen una secuencia PTSl en el extreme C o una secuencia PTS2 en el extreme N. • El receptor Pex5p se une a la secuencia PTSl y el Pex7p a la PTS2. • Los receptores son proteinas del citosol que transbordan al interior del peroxisoma portando un sustrato proteinico y despues regresan al citosol.

mE!)

(C6mo se insertan las proteinas en las membranas? • La transferencia de los dominies transmembrana del traslocon al interior de la bicapa de lipidoses activada per la interaccion de la region transmembrana con el traslocon.

II!BJ El sistema Sec transporta proteinas al interior de la membrana interna

y

a traves de ella

• El trasloc6n bacteriano SecYEG de la membrana interna esta relacionado con el trasloc6n eucari6tico Sec61. • En la orientacion de las proteinas secretadas al trasloc6n estan implicados varies traslocones.

l:nm Sistemas de translocaci6n independientes de Sec en Escherichia coli

Una jerarquia de secuencias determina la localizaci6n dentro de los organelos • La porcion terminal N de una secuencia lider dirige a una proteina a la matriz mitocondrial o allumen del cloroplasto. • Una secuencia adyacente puede controlar la direccion a una membrana o a los espacios intermembranosos. • Las secuencias son divididas sucesivamente de la proteina.

Las bacterias utilizan tanto translocaci6n cotraduccional como translocaci6n postraduccional • Las proteinas bacterianas exportadas a las membranas o a traves de ellas utilizan mecanismos postraduccionales y cotraduccionales.

La inserci6n en la membrana despues de la traducci6n depende de las secuencias lider • Las secuencias lider terminates N proporcionan la informacion que permite a las proteinas asociarse con las membranas de las mitocondrias o de los cloroplastos.

Los peroxisomas emplean otro tipo de sistema de translocaci6n

• E. coli y los organelos tienen sistemas de translocacion

proteinica relacionados. • Un sistema permite que ciertas proteinas se inserten en las membranas sin un mecanisme de translocacion. • YidC es hom6logo al sistema mitocondrial para transferir proteinas al interior de la membrana interna. • El sistema tat transfiere proteinas con un elemento de arginina doble al espacio periplasmico.

11iBJ

Resumen

CAPITULO 10 Localizaci6n de las proteinas

219

1111

Introducci6n

Las proteinas son sintetizadas en dos tipos de loca ciones: • La vasta mayorfa de las protefnas es sinte tizada por los ribosomas en el citosol. • Una pequefla minorfa se sintetiza en los organelos (mitocondrias o cloroplastos) . Las protefnas sintetizadas en el citosol pueden dividirse en dos clases generales segun su localizacion, las que no estan asociadas con las membranas y las asociadas con ellas. En Ia se ilustra Ia celula en funci6n de los destinos finales pro babies de una protefna recien sintetizada y los sistemas que la transportan. • Las proteinas citos6licas (o "solubles") n ose encuentran en ningun organelo en particu lar, se sintetizan en el citosol y permanecen

•

•

•

•

Protefna de Ia membrana plasmatica -

• Sefial mitocondrial

1111 Transporte postraduccional

Transporte cotraduccional

Sinopsis: las prote\nas localizadas de forma postraduccional son liberadas en el citosol despues de ser sintetizadas en los ribosomas libres. Algunas tienen senates de asignaci6n a organelos como el nucleo o como las mitocondrias. Las prote\nas as\ localizadas se asocian con la membrana del ER durante la s\ntesis, de modo que sus ribosomas estan "unidos ala membra na". Las prote\nas pasan al interior del reticula endoplasmico a un lado del aparato de Golgi y despues a traves de la mem brana plasmatica, a menos que posean senates para ser retenidas en alguna de las etapas de la ruta. Incluso pueden ser dirigidas a otros organelos, co mo los endosomas o los lisosomas.

220

CAPITULO 10 Localizaci6n de las prote\nas

ahL donde funcionan como centros catalfticos individuales, actuando sobre metabolitos que se encuentran en soluci6n en el citosol. Las es tructuras macromoleculares pueden localizarse en sitios especfficos del citoplasma; por ejemplo, los centrfolos estan asociadas con las regiones que se convierten en los polos del huso mit6tico. Las proteinas nucleares deben ser transportadas de su sitio de sfntesis en el citosol, a traves de Ia envoltura nuclear, al interior del nucleo. La mayoria de las protefnas localizadas e n los organelos citoplasmicos se sintetizan en el citosol y se transponan especfficamelil.te a Ia membrana del organelo y a naves de ella, por ejemplo, a las mitocondrias, los peroxisomas 0 los cloroplastos (en las celulas de las plantas) . (Las proteinas que se sintetizan dentro del organelo permanecen en et. ) El citoplasma contiene una serie de cuerpos membranosos, incluidos retfculo endoplasmico (ER, endoplasmic reticulum) , apara to de Golgi, endosomas y lisosomas. En ocasiones. a este conjunto se le conoce como "sistema reticuloendotelial". Las protefnas dentro de estos compartimientos se insertan en las membranas del ER y luego son dirigidas a sus localizaciones particulares por el sistema de transporte del aparato de Golgi. Las protefnas que son secretadas a partir de Ia celula son transportadas a la membrana plasmatica y despues deben pasar a traves de ella, hacia el exterior. Su sfntesis empieza de Ia misma manera que Ia de las protefnas asociadas con el sistema reticuloendotelial, pero pasan completamente a naves del sistema en Iugar de detenerse en algun punto particular dentro de el.

El desplazamiento a traves de una membrana requiere de un mecanisme especial

Conceptos principales • Las prote\nas atraviesan las membranas por est ructuras proteinicas especializadas insertadas en la membrana. • Los sustratos prote\nicos interactuan directamente con el sistema de transporte del ER, las mitocondrias o los cloroplastos, pero requieren de protei nas acarreadoras para interactuar con los peroxisomas. • Para el transporte dentro del nucleo es necesario un mecanismo mucho mas grande y complejo.

_roceso de inserci6n de una protefna en Ia mem: na o el paso a traves de ella se denomina translo- '6n protefnica. El mismo dilema debe resolverse ~a cada situaci6n en la que una protefna atraviesa :.:;. membrana. La superficie de la protein a es hi- 'ilica, pero la membrana es hidr6foba, y como ~g ua y el aceite, ambos componentes preferirfan :nezclarse, de modo que la soluci6n es crear una ~u ctura especial en la membrana para que pase roteina. Hay tres tipos cliferentes de clistribuci6n ::il dichas estructuras. El retfculo endoplasmico, las mitocondrias y cloroplastos contienen estructuras protefnicas :::ustadas en sus membranas que permiten que _roteinas pasen a traves de ellas sin entrar en -;acto con los lfpidos hidr6fobos circundantes. En se muestra que un sustrato protefnico ~ :1e directamente a Ia estructura, es transportado -ella al otro !ado y posteriormente, liberado. l os peroxisomas tambien cuentan con dicha s :... ucturas en sus membranas, pero los sustratos roteinas no se unen directamente a elias . En 1 se observa que mas bien se unen a :efnas transportadoras localizadas en el citosol, ::uales son acarreadas por el canal al interior del - :xisoma y, posteriormente, elsustrato pro tefn i~s liberado. Para el transporte hacia el interior del n ucleo _:iliza una estructura mucho mas grande y mas ~pleja, el poro nuclear. En Ia se mues_:: ue aunque dicho poro proporciona el ambiente :- permite que un sustrato entre (o salga) del nu_ de hecho no proporciona un sistema que se .:. a los sustratos protefnicos y los desplace. Este =: nismo incluye protefnas transportadoras que _:1en a los sustratos y los transportan a traves del - 'J bacia el otro lado.

Las prote\nas entran al ER o a una mitocondria al unirse a un trasloc6n que las transporta a traves de la membrana .

La translocaci6n de las prote1nas puede ser despues de la traducci6n o durante ella '

.ceptos principales . 3s prote\nas que son importadas al interior de los :·ganelos citoplasmicos se sintetizan en los ribosomas .':Jres del citosol. 2s prote\nas que son importadas al interior del ;'stema ER-Golgi se sintetizan en los ribosomas que ~stan asociadas al ER . 2s prote\nas se asocian con las membranas por medic :e secuencias de aminoacidos especificas denominadas :ecuencias de seriaL ..as secuencias de seiial con mayor frecuencia son ·deres localizados en la terminal N. ..as secuencias de serial terminal N usualmente son ~:p aradas de la prote\na durante el proceso de inserci6n.

Las proteinas son transportadas al interior de los peroxisomas por una proteina acarreadora que se une a ellas en el citosol, pasa con ellas a traves del canal de la membrana y las libera en el otro lado.

Hay dos maneras de que una protefna haga su o inicial con una membrana: • La protefna naciente puede asociarse con el mecanismo de translocaci6n mientras sigue siendo sintetizada en el ribosoma, proceso conocido como translocaci6n cotraduccionaL

10.3 La translocaci6n de las proteinas puede ser despues de la traducci6n o durante ella

221

t Proteina

t

Acarreador

Las prote\nas entran al nucleo al atravesar poros nucleares bastante amplios. El mecanismo de transporte es distinto del poro e incluye componentes que transportan a la prote\na a traves del poro.

/ /

/ /

Organelo

Sefial de localizaci6n

Tipo

Longitud de Ia sefial

Mitocondria Cloroplasto Nucleo Peroxisoma

Terminal N Terminal N lnterna Terminal C

Helice anfipatica Cargada Basica o bipartita Peptido corto

12-30 >25 4-9 3-4

Las proteinas sintetizadas en los ribosomas libres del citosol son dirigidas despues de su liberaci6n a destinos especificos por media de elementos de sefial cortos.

• La protefna puede ser liberada de un ribosoma una vez terminada Ia traducci6n. Posteriormente, Ia protefna completa se difunde a Ia membrana apropiada y se asocia con el mecanjsmo de translocaci6n. A esto se le denomina translocaci6n postraduccional. 222


La localizaci6n de un ribosoma depende de que Ia proteina que esta siendo sintetizada este asociada de manera cotraduccional con una membrana : • Las protefnas que entran a! retfculo endoplasmico (ER, endoplasmic reticulum) utilizan translocaci6n cotraduccional. La consecuencia de esta asociaci6n es que el ribosoma esta en !a superficie del ER. Los ribosomas se asocian con las membranas del ER durante la sfntesis de estas protefnas, por lo tanto, se encuentran en fracciones de membrana de la celula, por lo que suelen decirse de ellos que estan "unidos a !a membrana". • El resto de los ribosomas estan en el citosol, y como no estan asociados con ningun organelo y se fraccionan separadamente de las membranas, en ocasiones se les denomina "ribosomas libres", los cuales sintetizan a todas las protefnas, excepto las sometidas a translocaci6n cotraduccional. Las protefnas son liberadas en el citosol mientras se completa su sfntesis. Algunas de estas protefnas permanecen libres en el citosol en forma casi soluble, mientras que otras se asocian con estructuras macromoleculares citos6licas, como filamentos , microtubulos, centrfolos, etc., son transportadas al nticleo o se asocian con organelos unidos a membranas por translocaci6n postraduccional. Para asociarse con una membrana (o con cualquier otro tipo de estructura), una proteina requiere de una sefial apropiada, habitualmente un fragmento de secuencia que hace que esta sea reconocida por un sistema de translocaci6n (o sea ensamblada en una estructura macromolecular). En Ia se resumen algunas sefiales utilizadas por las protefnas liberadas de los ribosomas citos6licos. La importaci6n al interior del nucleo resulta de Ia presencia de una variedad de secuencias mas bien cortas en el interior de las protefnas. Estas "sefi.ales de localizaci6n nuclear" les permiten pasar a traves de los poros nucleares. Un tipo de sefi.al que determina el transporte al perorisoma es una secuencia terminal C muy corta. Las protefnas mitocondriales y de los cloroplastos se sintetizan en los ribosomas "libres"; despues de su liberaci6n en el citosol, se asocian con las membranas de los organelos por medio de secuencias terminales N de -25 aminoacidos de longitud reconocidas por receptores localizados en Ia envoltura del organelo. Las protefnas que residen dentro del sistema reticuloendotelial entran a! ER mientras estan siendo sintetizadas. El principio de la translocaci6n cotraduccional se resume en Ia . Una caracteristica importante de este sistema es que la protefna naciente es responsable del reconocimiento del me-

:=.;Usmo de translocaci6n, para lo cual se necesita · ~ e Ia seiial para Ia translocaci6n cotraduccional fore parte de Ia proteina que se sintetiza primero y, de x ho, usualmente se localiza en el extrema N. Las proteinas que utilizan secuendas terrninales ·- para ser transportadas de forma cotraduccional - :=R o postraduccional a las mitocondrtas o los do- · plastos tienen una caracterfstica com(m. La se,-~e ncia terminal N incluye un lider que no forma :O !"te de la proteina madura. La protefna que porta este lfder se denominada preproteina y es un - ~e cursor transitorio de la proteina madura . Ellider ~- separado de Ia proteina durante Ia translocaci6n .oteinica.

Separaci6n de Ia secuencia de seii~ ~

t CITOSOL

/

Las proteinas pueden entrar a La ruta ER-Golgi solo asociandose con el reticula endoplasmico mientras estan siendo sintetizadas.

Los chaperones pueden ser necesarios para el plegamiento de las protei nas Parche hidr6fobo

' Canceptos principales • Se dice que las proteinas que pueden adquirir su conformacion de manera espontanea se autoensamblan. • Con frecuencia, las proteinas pueden ensamblarse en estructuras alternas. • Un chaperon dirige a una proteina a una ruta particular al excluir rutas alternativas. • Los chaperones evitan La formacion de estructuras incorrectas al interactuar con proteinas no plegadas para impedir que se plieguen de manera incorrecta.

-._gunas protefnas son susceptibles de adquirir su . · nformaci6n madura de forma espontanea, y una anera de probarlo consiste en desnaturalizarla y ~"1 determinar si se renaturaliza en la forma acti3. . Esta capacidad se denomina autoensarnblaje. _a protefnas con esta capacidad pueden plegarse o -':_;:J iegarse en el estado activo a partir de otras conrmadones, incluido el estado en que inidalmente -:: sintetiz6, lo cual implica que las interacciones in::-:nas se dirijan intrinsecamente a la conformaci6n rrecta. El caso clasico es el de la rib6nucleasa; en · decada de 1970 se demostr6 que, cuando la enzi- es desnaturalizada, puede renaturalizarse in vitro , ' n la conformaci6n correcta. Mas recientemente el ~ ceso del plegamiento intrinseco ha sido descrito _ detalle para algunas proteinas pequeiias. Cuando no tiene Iugar el plegamiento correcto suelen ocurrtr conjuntos alternos de interacdones, a protefna puede quedar atrapada en una confor~ don estable que no es la forma final pretendida, '=! cuyo caso no puede autoensamblarse, y para ad. :llrir la estructura apropiada requiere de la asisten- de un chaperon.

Las regiones hidr6fobas de las proteinas interactuan intrinsecamente, y a menos que se les impida, se agregaran entre si cuando una proteina sea sintetizada (odesnaturalizada).

El plegamiento de las proteinas se debe a interacciones entre superficies reactivas que, en general, estan formadas por cadenas laterales hidr6fobas expuestas cuyas interacciones forman un centro hidr6fobo. La reactividad intrinseca de estas superficies significa que las interacciones podrfan ser incorrectas, a menos que el proceso sea controlado. En la se ilustra este caso. Conforme una proteina recien sintetizada emerge del ribosoma, uno de los parches hidr6fobos de la secuencia tiende a agregarse a otro, asociaciones generalmente aleatorias que quiza no representen la conformaci6n deseada de la protefna. Los chaperones son proteinas que median el ensamble correcto al provocar que una protefna diana adquiera cierta conformaci6n y no otras posibles por la union de los chaperones a superficies reactivas de Ia protefna diana expuestas durante el proceso de ensamblaje, de modo de impedir que dichas superficies interact(Jen con otras regiones de Ia protefna

10.4 Los chaperones pueden ser necesarios para el plegamiento de las proteinas

22 3

Las prote1nas desnaturalizadas y las recien sintetizadas necesitan chaperones Conceptos plincipales Chaper6n

\

I Los chaperones se unen a las regiones interactivas de las proteinas conforme so n sintetizadas para evitar la agregaci6n aleatoria. Las regi ones de las protein as son liberadas para que interactuen de forma ordenada y adquieran, asi, la conformaci6n apropiada.

para establecer una conform.aci6n incorrecta. La funci6n de los chaperones es evitar la formaci6n de estructuras incorrectas, no de promover la formacion de estructuras correctas. En la se muestra un ejemplo en el que un chaperon efectivamente secuestra a un parche hidr6fobo de modo de permitir interacciones que no hubieran sido po sibles en su presencia, como puede observarse al comparar el res ultado con la Figura 10.7. Una estructura incorrecta puede ser producto del plegamiento err6neo de una sola protefna o de interacciones con otra protefna. La densidad de las protefnas en el citosol es alta, y el "hacinamiento macromolecular" puede incrementar la eficiencia de numerosas reacciones respecto de las tasas observadas in vitro. El ha cinamiento puede provocar que las protefnas plegables se agregu en, pero los cha perones pueden contrarrestar este efecto, asf pues, una de las funciones de los chaperones podrfa ser proteger a una protefna de manera que pueda plegarse sin resultar afectada de manera adversa por el haci.namiento en el citosol. Se desconoce la proporci6n de protefnas susceptible de autoensamblarse, contrario ala que requiere la asistencia de un chaperon. (No es axiom
CAPITULO 10 Loca lizaci6n de las proteinas

• Los chaperones actuan en proteinas recien sintetizadas, en proteinas que atraviesan membranas o en proteinas que han sido desnaturalizadas. • La Hsp70 y algunas protei nas relacionadas constituyen una clase mayor de chaperones que actuan en numerosas proteinas diana . • Las chaperoninas del grupo I y del grupo II so n ensambles oligomericos extensos que actuan en proteinas diana a las cuales secuestran en cavidades internas. • La proteina Hsp90 es un chaperon especializado que actua en proteinas de rutas de transducci6n de seiial.

La capacidad de los chaperones para reconocer conformaciones protefnicas incorrectas les permite desempei'iar dos funciones relacionadas que conciernen a la estructura proteinica: o Cuando una protefna es sintetizada inicialmente, es decir, cuando sale del ribo soma para entrar al citosol, aparece desplegada. Pos teriormente, el plegamiento espontaneo se produce conforme Ia secuencia emergente interactua con las regiones de la protefna que se sintetizaron previamente. Los chaperones influyen en el proceso de plegamiento controlando Ia accesibilidad de las superficies reactivas. Este proceso esta involucrado en la adquisici6n inicial de la conformaci6n cmTecta. o Cuando una protefna es desnaturalizada, se exponen nu evas regiones que adquieren !a capacidad de interactuar, interacciones que son similares a las que se producen cuando una proteina se pliega (transitoriamente) de forma err6nea confo rme; tmpieza a sintetiza rse y los chaperones peconocen la conformaci6n de pliegues incbrrectos. Este proceso esta implicado en el ~~conocimiento de una proteina desnaturali;zada y ayuda a la renaturalizaci6n o hace qu'e sea eliminada por degradaci6n. Los chaperones tambien pueden ser necesarios para la formaci6n de estructuras oligomericas y para el transporte de proteinas a naves de las membranas, respecto del cual, un tema persistente es la imponancia del control (o la demora) del plegamiento. En la se muestra que, dada la geometrfa del pasaje, podrfa ser necesario mante nerlas no plegadas antes de que penetren la mem-

~----La

protelna adquiere su conformaci6n despues de atravesar Ia membrana

La protefna se inserta en una camara cerrada

La protefna emerge despues del plegamiento

~

La protelna debe pasar a traves del canal de Ia membrana La conformaci6n podrfa impedir el paso a traves de Ia membrana

lbli~J"'""'..I,__--- plegada

Una proteina se aprieta en un pasaje angosto nforme atraviesa la membrana .

Una chaperonina forma un complejo oligomerico amplio y pliega a un sustrato proteinico en su interior.

t La s proteinas emergen desplegadas del ribo- :
. -ana, sencillamente porque la protefna madura po~a ser demasiado grande como para embonar en . canal disponible. Los chaperones evitarfan que __a protefna adquiriera una conformacion que imiiera su paso por la membrana, de modo que su n cion serfa, basicamente, mantener la protefna · ::;;ibPe y sin plegarse. Una vez que ha pasado por membrana, pu ede requerir otro chaperon que le _•.1de a plegarse en su conformacion m adura, casi -or: Ia misma forma en que una protefna citosolica : ·uiere de ]a asistencia de un chaperon al salir del . soma. Probablemente el estado de la prorefna !'!forme emerge de una membrana es similar a - _el en que se encu entra cuando emerge del ri- rna, basicamente extendida, en posicion mas o . nos lineal. Se han caracterizado apropiadamente dos tipos -:ncipales de chaperones que inciden en el plega-~ nto merced a dos mecanismos diferentes: • En la se muestra que el sistema Hsp70 consiste en proteinas individuates que se unen a los sustratos cuyo plegamiento debe ser controlado y actuan en ellos y las reconoce .1

conforme son sintetizadas o emergen de las membranas (incluso cuando son desnaturalizadas por estres). Basicamente, controla las interacciones entre las regiones reactivas expuestas de la protefna. permitiendole plegarse en la conformacion correcta in situ. Los componentes del sistema son Hsp70, Hsp40 y GrpE. y su nombre refleja la identificacion original de la Hsp70 como una protefna inducida por choque termico. Las protefnas Hsp70 y Hsp40 se unen individualmente a los sustratos protefnicos y utilizan la hidrolisis de ATP para proporcionar la energfa necesaria para cambiar la estructura del sustrato protefnico. ademas de que trabaj an en conjunto con un factor de intercambio que regenera ATP a partir de ADP. • En !a se muestra que un sistema de chaperoninas estd formado por un ensamble oligomerico extenso (representado como un cilindro) . Este ensamble forma una estructura en la cual se insertan las protefnas no plegadas. El ambiente protegido dirige su plegamiento. Hay dos tipos de sistemas de chaperoninas, el GroEL/GroES se encuentra en todo tipo de organismos y el TRiC, en el citosol de las eucariotas. Los componentes de los sistemas se resumen en la figura . El sistema Hsp70 y los dos sistemas de chaperoninas actuan sobre numerosos sustratos protefnicos distintos y otro, el de la protefna Hsp90, funciona en conjunto con la Hsp70, sin embargo,

.5 Las proteinas desnaturalizadas y las recien sintetizadas necesitan chapero nes

225

Sistema

de las proteinas de choque termico son chaperones y fueron descubiertas y nombradas inicialmente como parte de Ia respuesta al choque termico.)

Estructura/funci6n Chaperones lndividuales

Sistema Hsp70 Hsp70(DnaK) Hsp40 (DnaJ) GrpE (GrpE)

ATPasa Estimula a Ia ATPasa Factor de intercambio de nucle6tidos

Hsp90

Funciones en las proteinas implicadas en Ia transducci6n de sefial

1!11

Conceptos principales • Los de la familia Hsp70 se encuentran en el citosol, el ER, las mitocondrias y los cloroplastos.

Estructuras oligomericas (chaperon inas)

• La protefna Hsp70 es un chaperon que actua en proteinas diana aunada a los chaperones DnaJ y GrpE.

Grupo I Hsp60 (GroEL) Hsp10 (GroES) Grupo II TRiG

Forma dos anillos heptamericos Forma un casquete

Forma dos anillos octamericos

La familia de chaperones tiene contrapartes eucari6ticas y bacterianas (nombres entre parentesis).

Hsp70 hidroliza ATP

Hsp70-ATP se une a Hsp40 + sustrato

Hsp40 se une al sustrato

... ATP DnaK Hsp70

•········. Q):

GrpE desplaza al ADP

Hsp40 es liberado

Hsp70 se disocia

~· 0.• ~ Q) C/)

0

TI 'ti

ADP

[jJ

El Hsp40 se une al sustrato y despues al Hsp 70. La hidr6lisis de ATP dirige un cambio conformacional. El GrpE desplaza al ADP, de modo que los chaperones son liberados. Durante el plegamiento de un sustrato proteinico pueden ocurrir multiples ciclos de asociaci6n y disociaci6n .

se dirige aclases especificas de proteinas involucradas en la transduccion de seiiaL especialmente los receptores de hormonas esteroideas y las cinasas de seiializacion. La funcion basica del sistema Hsp90 es mantener a sus dianas en una conformacion adecuada hasta que sean estabilizadas por Ia interaccion con otros componentes de Ia ruta. (La razon de que muchas de estas protefnas se denominen "Hsp", "proteina de choque termico" (por sus siglas en ingles, heat shock protein], es que el incremento de temperatura induce la produccion de este tipo de proteinas cuya funcion es minimizar el daiio provocado por la desnaturalizacion calorica. Muchas 226

La familia Hsp70 es ubicua


La familia Hsp70 se encuentra en las bacterias, el citosol de las eucariotas, el ER, los cloroplastos y las rnitocondrias . Una Hsp70 tfpica tiene dos dominios, de los cuales, la terminal N es una ATPasa y la terminal C se une al sustrato polipeptfdico. Cuando esta unida a ATP, la Hsp70 se une a los sustratos y los Iibera rapidamente, por el contrario, con ADP las reacciones son lentas. El reciclaje entre estos estados es regulado por otras dos proteinas, Ia Hsp40 (DnaJ) y la GrpE. En Ia se muestra que la Hsp40 (DnaJ) se une primero a una proteina naciente conforme emerge del ribosoma. La Hsp40 contiene una region denominada dorninio J (cuyo nombre se deriva de DnaJ) que interactua con Ia Hsp70 (DnaK). Esta ultima se une ala Hsp40 y a Ia proteina desplegada. En efecto, dos chaperones que interactuan se unen ala proteina. El dominio J representa la especifidad de la interaccion de apareamiento y conduce a una Hsp40 espedfica a seleccionar al compaiiero adecuado de Ia familia Hsp70. La interaccion de Ia Hsp70 (DnaK) con la Hsp40 (DnaJ) estimula la actividad ATPasa de la Hsp70. La forma del complejo unida a ADP se mantiene asociada con el sustrato proteinico hasta que Ia GrpE des plaza al ADP, fenomeno que provoca la perdida de la Hsp40 seguida de la disociaci6n de la Hsp70, que se une a otro ATP y el ciclo puede repetirse. La GrpE (o su equivalente) se encuentra solo en las bacterias, las rnitocondrias y los cloroplastos; en otras ubicaciones. Ia reaccion de disociacion esta acoplada a Ia hidrolisis de ATP de manera mas compleja. El plegamiento de las proteinas se logra mediante multiples ciclos de asociacion y disociacion. Conforme se alarga la cadena proteinica, la Hsp70 (DnaK ) puede disociarse de un sitio de union y posteriormente reasociarse a otro, de modo de liberar partes del sustrato proteinico para plegarlo correcta y ordenadamente. Por ultimo, Ia protefna intacta se Iibera del ribosoma plegada en su conformacion madura. Diferentes de la clase Hsp70 funcionan en varios tipos de protefnas diana. Las proteinas

_. tOsol (Hsp70 ep6nima y una protema relacioHamada Hsc70) actuan en las protefnas na- :es de los ribosomas. Las variantes del ER (de_inadas BiP o Grp78 en las eucariotas superiores · 2 en Saccharomyces cerevisiae), las mitocondrias · s cloroplastos, funcionan de manera bastante ar en las protefnas conforme se introducen en ~ganelo o en su paso a traves de Ia membrana. i.. Que caracterfstica reconoce la Hsp70 en una :efna diana? Se une a un fragmento lineal de - :noacidos incrustados en un contexto hidr6foyue es precisamente el tipo de elemento que c tierra en el centro hidr6fobo de una protema "'- -ura adecuadamente plegada, de modo que su sici6n indica que Ia protema es naciente o esta . .atmalizada. Los elementos de esta naturaleza ~ resentan aproximadamente cada 40 aminoaciy la union con el elemento evita que este se ' e manera err6nea a otro. !:ste modelo de acci6n explica la forma en que :otefna Hsp70 Bip puede cumplir con dos fun-.es, ayudar a Ia oligomerizaci6n y a! plegamiento rotefnas recien translocadas en el ER y eliminar :efnas plegadas de forma err6nea. Sup6ngase _ Ia Bip reconoce ciertas secuencias peptfdicas _~ esibles en Ia conformaci6n de una protefna - 'ura plegada adecuadamente; dichas secuencias xponen y atraen a Ia Bip cuando Ia protefna ·::-a a! lumen del ER en una forma esencialmente .iimensional. Si una protefna es plegada de ma·~.l incorrecta o es desnaturalizada, la secuencia =.e ser expuesta en su superficie, en vez de ser .errada adecuadamente. .:.2.

Las secuencias de sefial inician la translocaci6n '

~ ..cep: os

principaLes

..as proteinas se asocian con eL sistema del ER s6lo :urante la traducci6n. ..a secuencia de seiiaL del sustrato proteinico es ·esponsabLe de La asociaci6n a La membrana.

protefnas que se asocian con las membranas :- iante lfderes terminales N utilizan una jerar.2 de sefiales para encontrar su destino final. En :~ so del sistema reticuloendotelial, la localizaci6n ~: de una proteina depende de Ia forma en que c: igida conforme transita por el retfculo endo-illlico y el aparato de Golgi. La secuencia lider :-oduce Ia protefna a Ia membrana, y Ia conse_ncia intrfnseca de Ia interacci6n es que Ia pro" pasa a traves de Ia membrana hacia el interior .:ompartimiento. Para que una protefna resida

Reticula endoplasmico Lisosoma ~.

Manosa -6fosfato

........... ~

KDEL terminal C •

• Golgi- - - -

. ..... .

~

Membrana plasmatica

~

Serial de residencia

....

... .

PREDETERMINADA Extracelular Las proteinas que entran a la ruta ER-Golgi pueden fluir a traves de la membrana plasmatica o ser desviadas a otros destinos por medio de sefiales especificas.

en Ia membrana, se necesita una sefial adicional que le impida atravesarla. Para que una protefna sea designada a un destino particular, en otras palabras, para que permanezca dentro de la membrana o del lumen de algtm compartimiento especffico se necesita otro tipo de sefiales. El proceso general necesario para la localizaci6n del destino final de una protefna transportandose a naves de sistemas membranosos sucesivos se denomina trafico de proteinas o asignaci6n, y se describe en el trafico de protefnas. Las caracterfsticas generales de Ia ru ta se resumen en la . La "ruta predeterminada" !leva a una protefna a naves del ER, al interior del aparato de Golgi y a la membrana plasmcitica. Las protefnas que residen en el ER poseen un tetrapeptido terminal C (KDEL, el cual de hecho proporciona una sefial para que las protefnas regresen del a para to de Golgi al ER). La sefial que desvfa a una protefna allisosoma es una modificaci6n covalente, es decir, la adici6n de un azucar en particular. Para que una protefna se transforme en un constituyente permanente del aparato de Golgi o de la membrana plasmarica, se necesitan otras sefiales. Hay un punto de inicio comun para las protefnas que se asocian con el sistema reticuloendotelial de membranas o que pasan a traves de el. Estas proteinas pueden asociarse con Ia membrana solo mientras estim siendo sintetizadas. Los ribosomas que sintetizan a estas protefnas se asocian con el ER, de modo de permitir que la protefna naciente sea transferida de forma cotraduccional a Ia membrana. En ocasiones, a las regiones en las que estan asociadas ribosomas y ER se les llama "ER rugosa", en contraste con las regiones de "ER liso" que carecen de polisomas asociadas y tienen una apariencia tubular, en vez 10.7 Las secuencias de seiial inician la translocaci6n

227

de laminar. En Ia se muestran los ribosomas en Ia transferencia de proteinas nacientes a las membranas del ER. Las proteinas sintetizadas en el ER rugosa pasan del ribosoma directamente a Ia membrana, para despues ser transferidas a! aparato de Golgi y finalmente clirigidas a su destino finaL ya sea un lisosoma, una vesicula de secreci6n o la membrana plasmatica. El proceso ocurre en un ambiente membranaso, puesto que las proteinas son acarreadas entre los organelos en vesiculas pequenas con revestimiento de membrana. La inserci6n cotraduccional es clirigida por una secuencia de sefi.al, que suele ser una secuencia lider clivisible de 15 a 30 aminoacidos terminales N. En el extrema N, o cerca de el, hay numero sos residuos polares, y dentro del lider, un centro hidr6fobo que consiste exclusiva, o principalmente, de aminoacidos hidr6fobos. No se conserva ninguna otra secuencia. La es un ejemplo de ello. La secuencia de senal es necesaria y suficiente para promover Ia transferencia de cualquier polipeptido a! interior de la membrana diana. Una secuencia de sefial agregada a! extrema N de una globina, por ejemplo, hace que sea secretada a traves

El reticula endoplasmico esta formado por una lamina de membranas muy plegada que parte del nucleo. Los pequeiios objetos adheridos a la superficie externa de las membranas son los ribosomas. Imagen cortes\a de Lelia Orci, University of Geneva, Switzerland.

de las membranas de las celulas en Iugar de qu e permanezca en el citosol. La secuencia de sefial proporciona Ia conexi6r. que permite a los ribosomas adherirse a Ia membrana. No hay una diferencia intrinseca entre los ribosomas libres (que sintetizan proteinas en el citosol) y los adheridos al ER. Un ribosoma empieza 1.: sintesis de una protefna sin saber si sera sintetizadc. en el citosol o sera transferida a una membrana. Lc. sintesis de una secuencia de senal es Ia que provoc.; que el ribosoma se asocie con una membrana.

La secuencia de senal interactua co n la SRP Conceptos principales La secuencia de seiial se une a la SRP (partlcula de reconocimiento de seiial). • La union seiial-SRP provoca la interrupcion de la slntesis protelnica. • La slntesis prote\nica se reinicia cuando la SRP se une al receptor de la SRP en la membrana. • La secuencia de seiial es separada de la prote\na de translocacion por la peptidasa seiiallocalizada en la cara "interna" de la membrana.

La translocaci6n protefnica puede dividirse en dos etapas generales, primero; los ribosomas que porta n polipeptidos nacientes se asocian con las membrana s y posteriormente Ia cadena naciente es transferida a! canal y transportada a traves de eL La union de los ribosomas a las membrana exige Ia particula de reconocimiento de sefi.al (SRP, signal recognition particle), que tiene dos capacidades importantes: • Puede unirse a Ia secuencia de senal de una protefna secretora naciente. • Puede unirse a una proteina (receptora de Ia SRP) localizada en Ia membrana. La SRP y su receptor funcionan de manera catalitica para transferir a un ribosoma que porta una

lniciaci6n

4ee· ~C§S

Af\1 T reo Ser

. ,e,:n,v:r~l:."

• Polar • ..,__ Centro hidr6fobo

La secuencia de seiial de la hormona de crecimiento bovina esta formada por 29 aminoacidos terminates Ny tiene una region central altamente hidrofoba, precedida o flanqueada por regiones que contienen aminoacidos polares.

228

CAPiT UI. 10 Localizacion de las prote\nas

·::ina naciente ala membrana. El primer paso es : .a SRP reconozca la secuencia de seflaL se una a ·:- .:eptor y el ribosoma ala membrana. Las etapas ::::-aducci6n de las protefnas de la membrana se -:-!1en en la ~a funci6n del receptor de la SRP en la trans· ~j 6n protefnica es transitoria; cuando Ia SR.P se ~ a la secuencia de sefiaL detiene la traducci6n, .:-eneral cuando se han incorporado -70 ami: j dos ala cadena polipeptfdica (en este punto er de 25 residuos ha quedado expuesto, con ~0 aminoacidos siguientes aun enterrados en el ;;oma). Cuando la SRP se une a! receptor correspon::~t e, Iibera la secuencia de sefial y el ribosoma :idhiere a otro componente de la membrana, . _ ento en que Ia traducci6n puede continuar. .s.ndo el ribosoma haya pasado a la membrana, _J nci6n combinada de la SRP y del receptor de Ia -: ? habra concluido. Despues se reciclan y son li::-; para fomentar la asociaci6n de otro polipeptido :. ·ente con la membrana. Este proceso puede ser necesario para contro- ~ ~ a conformaci6n de la protefna. Si la protefna · :iente fuera liberada en el citoplasma, adquirirfa _;;, conformaci6n que no le perrnitirfa atravesar la - .:-:nbrana, por lo tanto, la capacidad de la SRP para !.ibi rel="nofollow"> la traducci6n mientras el ribosoma es entre- ~io a la membrana es importante para evitar que - _rotefna sea liberada en el ambiente acuoso. El peptido sefial es separado de una protefna en · ;,:1slocaci6n por un complejo de cinco protefnas :-!lominado peptidasa sefial, que suele ser mas : ·. mdante que Ia SRP y que su receptor, casi equi;,.e ala cantidad de ribosomas unidos, lo cual su- -::re que su capacidad de funcionamiento es estruc-~al. Dicho complejo se localiza en Ia cara luminal Ia membrana del ER, lo cual implica que toda Ia .:-.::uencia de seflal debe atravesar la membrana an.:-o de que onura la division. En las eubacterias, las -~ haea y las eucariotas pueden reconocerse peptio as de seflal hom6logas.

I

'

La interacci6n entre Ia SRP y su receptor es elevento principal de la traducci6n eucari6tica que transfiere un ribosoma que porta a una protefna naciente a Ia membrana. Las bacterias tienen un sistema de interacci6n analogo, aunque su funci6n esta mas restringida . La SRP es un complejo ribonucleoprotefnico 11 S que contiene seis protein as (con una masa total de 240 kD) y un RNA 7S pequefio (de 305 bases, 100 kD). En la se muestra que el RNA 7S proporciona el esqueleto a Ia partfcula; las protefnas no se ensamblan sino esta presente. El RNA 7S de Ia SRP se divide en dos partes; las l 00 bases del extremo 5' y las 45 del extremo 3'

El ribosoma inicia Ia sfntesis protefnica en el mRNA "libre"

La SRP se adhiere a Ia secuencia lfder; se interrumpe Ia traducci6n

La SRP se une al receptor respectivo; el ribosoma se adhiere a Ia membrana; se reinicia Ia traducci6n

La secuencia lfder entra a Ia membrana

La protefna pasa a !raves de Ia membrana; ellfder es dividido; continua Ia traducci6n

La SRP interactua con el receptor de la SRP

' onctos plincipales La protefna es secretada a !raves de Ia membrana; las subunidades ribos6micas son liberadas del mRNA

• La SRP es un complejo formado por RNA 75 y seis prote1nas. • El equivalente bacteriano de la SRP es un complejo formado por RNA 4.55 y dos prote1nas. • El receptor de la SRP es un d\mero. La hidr6lisis de GTP libera a la SRP de su receptor despues de su interacci6n.

Los ribosomas que sintetizan prote1nas secretoras estan adheridos ala membrana por media de la secuencia de sefiallocalizada en el polipeptido naciente.

10.


229

+------

La secuencia de senal emerge del ribosoma; Ia SAP se aproxima en conformaci6n extendida

23-24 nm - - - - - - • .-oominio Alu RNA+..,. Dominio S RNA_.

-

Secuencia de serial I

SRP54

SRP19

SRP54M

I

SRP54NG Secuencia de senal

230

La SAP se une a Ia secuencia de senal y se dobla en Ia bisagra para ar al ribosoma

El RNA 75 de la SRP tiene dos dominies. Las prote\nas se unen como se muestra en el diagrama bidimensional (arriba) para formar la estructura cristalina que se muestra abajo. Cada funci6n de la SRP esta asociada con una parte discreta de la estructura.

La SRP se une a una secuencia de seiial tan pronto emerge del ribosoma. La union provoca que La SRP camhie de conformaci6n y se doble en la "bisagra", de modo de permi tir que la SRP54 entre en o con el ribosoma en el sitio de salida de La prote\na, en tanto que La SRP19 forma un segundo conju nto de os.

estan estrechamente relacionadas con la secuencia de Alu RNA, un pequefi.o Rl\l"A comun en los mamfferos, de modo que definen a! dom.inio Alu. La parte restante del RNA forma el dominio S. Las diferentes partes de la estructura de la SRP representadas en Ia figura 10.18 desempefi.an funciones independientes en Ia asignacion de las proteinas. La SRP54 es la subu nidad mas importante; se localiza en un extremo de Ia estructura de RNA y es responsable directa de reconocer al sustra to proteinico por Ia union con Ia secuencia de sefi.al, ademas de que se une al receptor de Ia SRP junto con el dfmero SRP68-SRP72 Iocalizado en la region central del RNA. El dirnero SRP9-SRP14 esta en el otro extremo de la molecula y se encarga de la interrupcion de la elongacion. La SRP es una estructura flexible que en su forma libre (separada de la secuencia de sefi.al) es bastante amplia, como se observa en Ia estructura cristalina de Ia figura 10.18. En la lQ se muestra que Ia union con una secuencia de sefi.al desencadena un cambio conformacional. La protefna se dobla en una bisagra para permitir que el extremo SRP54 h aga o con el ribosoma en el sitio de salida de la protefna, mientras que Ia SRP19

se balancea para ar al ribosoma en el sitio de union con el factor de elongacion, lo cualle permite provocar Ia interrupcion de Ia elongacion y dar tiempo ala asignacion del sitio de translocacion en Ia membrana. El receptor de la SRP es un dfmero que contiene subunidades SRa (de 72kD) y SR~ (de 30 kD). La subunidad ~ es una protefna integral de membrana. El extremo N de la subunidad a grande es anclado por la subunidad ~· El grueso de Ia protefna a sobresale hacia el citosol. Gran parte de la secuenda de la region dtoplasrnica de la proteina se asemeja a una proteina de union con acido nucleico con muchos residuos positives. Lo cual sugiere la posibilidad de que el receptor de la SRP reconozca al RNA 7S de la SRP. En las bacterias hay una contraparte de la SRP, aunque contiene menos compon entes; E. coli, por ejemplo, tiene un RNA 4.5S que se asocia con los ribosomas y es homologo del RNA 7S de la SRP. Se asocia con dos proteinas, Fth es homologa de la SRP54 y FtsY, de la subunidad a del receptor de la SRP. De h echo, la FtsY remplaza las funciones de las subunidades a y ~ de Ia SRP; su dominio terminal N sustituye a la SRP~ en Ia asignacion de


-:-nbrana y el dominio terminal C interactua con - ~otefna diana. La funcion de este complejo es limitada que la del complejo formado por el ·= tor de la SRP y la SRP; quiza sea necesario para :- ener a algunas protefnas secretadas (aunque :1 todas) en una conformacion que les permiteractu ar con el mecanismo de secrecion. Esta ria ser la conexion original entre Ia sfntesis pro- ca y Ia secrecion; en las eucariotas, Ia SRP ha - irido las funciones adicionales de provocar la :-: rupcion de Ia traduccion y permitir el a embrana . ..:Por que Ia SRP debe tener un componente de ? La respuesta debe estar en la evolucion de !a .?: debe haberse originado muy a! principia de : • olucion, en un mundo domina do por el RNA, - :Jmiblemente en conjunto con un ribosoma cu:unciones eran responsabilidad principalmente R...'·lA. La estructura cristalina del complejo entre - rninio de union con la prote.fna del RNA 4 . 5 S ~ de union con el RNA de Ia Ffh sugiere que el -."\. sigue desempefiando algun papel en Ia fun cion - SRP. .::1 RNA 4.5S tiene una region (dom.i.rllo IV) muy ___ar al dominio IV del RNA 7S (vease la - 10.18). La Fth esta formada por tres domin.ios -:::; y M). El dominio M (asf llamado por su alto . :enido de moleculas de metionina) realiza las - ·pales funciones de union. Tiene una cavidad · · foba qu e se une a la secuencia de sei'ial de · protefna diana. Las cadenas laterales hidrofode los residuos de metionina crean la cavidad ~o yectarse en una hendidura de la estructura protefna. Junto a la cavidad se encuentra un .ento helice-vuelta-helice tipico de las proteide union con el DNA (vease Ia seccion 14. 11, El - SOli utiliza un elemento helice-vuelta-helice ~ :. unirse a! DNA). ::..a estructura cristalina muestra que la estruc-:. helice-lazo -helice del dominio M se une a una _ ' n dluplex del RNA 4.5S en el dominio IV. El es: .eto del RNA cargado negativamente esta junto - .:avidad hidrofoba, lo cual sugiere la posibilidad :·Je una secuencia de sefial de hecho se una a ~ mponentes prote.fnicos y de RNA de Ia SRP. ~ecuencias cargadas positivamente que inician .-: uencia de sefial (vease Ia Fig. 10. 16) podrfan :-:-actuar con el RNA, mientras que la region hi: ba de la secuencia de sefial podria postrarse ~ cavidad. :..a hidrolisis de GTP tiene una funcion impor-: en Ia insercion de la secuencia de seiial a la : ... brana. La SRP y su receptor tienen capacidad : 3sa. La subunidad de union con la sefial de !a :. SRP54, es una GTPasa. Las dos unidades del re--r de la SRP son GTPasas. Todas las actividades

La SRP transporta GO P cuando se une a la secuencia de seiiaL El ribosoma hace que la GOP sea remplazada par GTP.

....!. GOP

La SRP y su receptor hidrolizan GTP cuando la secuencia de seiial es transferida a la membrana .

GTPasa son necesarias para que una protefna naciente sea transferida a la membrana. En Ia se muestra que Ia SRP empieza con GDP cuando se une a la secuencia de sefial y posteriormente el ribosoma estirnula el remplazo del GDP por GTP. La secuencia de sefial inhibe la hidrolisis de GTP con lo que asegura que al complejo se le haya unido GTP cuando encuentre a! receptor de la SRP. Para que Ia proteina naciente sea transferida de Ia SRP a la membrana, Ia SRP debe ser liberada de su receptor. En Ia se muestra que para ello es necesario que se hayan hidrolizado las moleculas de GTP de la SRP y de su receptor. La reaccion se h a caracterizado en el sistema bacteriano, donde tiene la caracterfstica inusual de que la Ffh active Ia hidrolisis mediada por FtsY, y la FtsY active recfprocamente la hidrolisis mediada por Ia Ffh.

IE

El trasloc6n forma un poro

Conceptos principales • El complejo trimerico Sec61 proporciona el canal para que pasen proteinas a traves de una me mb rana. • Una proteina transferente pasa directamente del ribosoma al trasloc6n sin exponerse al citosoL

Hay un problema basi co en el paso de una protefna hidrofflica (en gran medida) a traves de una membrana hidrofoba. La energetica de la interaccion entre Ia proteina cargada y los lipidos hidrofobos es 10.10 El trasloc6n forma un poro

2 31

Sello en Ia porci6n luminal

RETfCULO ENDOPLASMICO

CITOSOL El poro contiene un canal acuoso

El trasloc6n es un trimero de Sec61 que forma un canal a traves de la membrana. Esta sellado en la porci6n luminal (del ER).

muy desfavorable. Sin embargo, una protefna en proceso de translocaci6n a traves de la membrana del ER puede ser extrafda por agentes de desnaturalizaci6n efectivos en un ambiente acuoso, que no son los que extraen las protefnas que son componentes residentes de Ia membrana, fen6meno que sugiere el modelo de translocaci6n que se ilustra en Ia , en el cuallas protefnas que forman parte de la membrana del ER constituyen un canal acuoso a naves de la bicapa. Una protefna en proceso de translocaci6n se desplaza por este canal e interactua con las protefnas residentes, no con la bicapa de lfpidos. El canal es sellado en el !ado luminal para detener la transferencia libre de iones entre el ER y el citosol. El canal que atraviesa la membrana se denomina trasloc6n. Sus componentes se han identificado de dos formas: las proteinas que residen en la membrana del ER entrecruzadas con protefnas transferentes son subunidades potenciales del canal, y los mutantes sec de las levaduras (asi Uamados porque son incapaces de secretar proteinas) incluyen una clase que provoca que los precursores de las protefnas de secreci6n o de la membrana se acumulen en el citosol. Mediante estos metodos juntos se identific6 el complejo Sec61, formado por tres proteinas transmembrana, Sec6l ex, ~ y y. Sec6l es el componente principal del trasloc6n. En detergente (que proporciona un ambiente hidr6fobo que imita el efecto de una membrana circundante), el Sec6l forma olig6meros cilfndricos con un diametro de -85 A y un poro central de -20 A, cada uno de los cuales consta de cuatro heterotrimeros. En todos los organismos se encuentra una estructura trimerica similar para el canal, que en las bacterias y las archaea se denomina complejo SecY. La subunidad Sec6l ex (o la SecY correspondiente de las bacterias/archaea) proporciona el poro a traves 232

CA PITULO 10 Localizaci6n de las prote\nas

del cual pasa la protefna, y es la mejor conservada en cuanto a secuencia. El poro se crea a partir de dimeros del complejo trimerico organizados ininterrumpidamente de man era que las subunidades ex se fusionan en un solo canal. Un complejo de canal de la membrana puede contener dos dimeros, probablemente organizados lado a lado, aunque el ribosome: solo puede acceder a uno en un momento dado. ,:,El canal es una estructura preexistente (como se implica en Ia figura) o puede ser ensambladC' como respuesta a Ia asociaci6n entre una secuencia de seiial hidr6foba y la bicapa de lfpidos? Los canal6 pueden ser detectados por su capacidad para permiti~ el paso de iones (medida como un cambio localizado en la conducci6n e!ectrica). En Ia membrana de: ER pueden ser detectados canales conductores de iones, y su estado depende de la translocaci6r. proteinica, lo cual demuestra que el canales una caracterfstica permanente de la membrana. Un canal se abre cuando un polipeptido naciente es transferido de un ribosoma a la membrana del ER. La protefna transferente llena el canal po_ completo, de manera que los iones son incapaces de atravesar durante la translocaci6n, pero si Ia protefna es liberada mediante tratamiento con puromicina, el canal se torna permeable. Si los ribosoma < son eliminados de Ia membrana, el canal se cierra lo cual sugiere que el estado de abierto exige y Ia presencia del ribosoma y que el canales controlad en respuesta a una proteina transferente. La medici6n de Ia capacidad de entrada al cana: de los agentes de desactivaci6n de fluorescencia de diferentes tamaiios sugiere que es grande, con ur. diametro interno de 40 A a -60 A, mucho mayo; que el de un fragmento de protefna ex helicoidal, : tambien es mas grande que el poro que se observe: en perspectivas visuales directas del canal, discrepancia que aun debe ser explicada. El ambiente acuoso de un aminoacido en una protefna puede medirse incorporando aminoacid o~ variables con residuos fotorreactivos. La fluore scencia de estos residuos indica si se encuentran er. un ambiente acuoso o en un medio hidr6fobo. E ~ experimentos con dichas sondas se ha observad que cuando se sintetiza inicialmente la secuencic.. de seiial en el ribosoma, se encuentra en un estad acuoso, pero es inaccesible para los iones del citoso: permanece en estado acuoso durante su interacci6r con una membrana; esto sugiere que la protefnc. transferente viaja directamente de untune! incluidl en el ribosoma al interior de un canal acuoso localizado en la membrana. De hecho, el al poro es controlado ! "cercado") en ambos !ados de la membrana, ante-: de que se una el ribosoma, el poro se cierra de_ !ado luminal. En la se muestra qu e

l dherirse el ribosoma, sella al poro del lado del ' SOL Cuando Ia protefna naciente alcanza una _,itud de -70 aminoacidos, muy probablemente m do se extiende por comple to a traves del canaL " Oro se abre dellado luminaL de modo que, en momenta esta cerrado de un !ado o del otro, ::1teniendo las integridades i6nicas de cada com:-:imiento . El trasloc6n es versa til y puede ser utilizado por :efnas transferentes de mucha maneras: Es el medio por el cuallas protefnas nacientes son transferidas de los ribosomas citos6licos al lumen del ER (vease la secci6n l 0.11 , La translocaci6n requiere de inserci6n en el trasloc6n y [en ocasiones] de un trinquete en el ER). Tambien es Ia ruta por la cual las protefnas integrales de la membrana del sistema ER son transferidas a la membrana, para lo cual es necesario que el canal se abra o desagregue en alguna forma desconocida, de manera que la protefna se pueda desplazar lateralmente dentro de la bicapa de lfpidos (vease Ia secci6n l 0.15, (.Como se insertan las proteinas en las membranas?). Las protefnas tambien pueden ser transferidas del ER al citosoL evento que se conoce como translocad6n inversa (vease la secci6n l 0.12, La translocaci6n in versa en via protefnas al citosol para que sean degradadas).

La translocaci6n requiere de inserci6n en el trasloc6n y (en oca siones) de un trinquete en el ER ·.:eptos prhcipales ::. ribosoma, Ia SRP y el receptor de La SRP bastan para -sertar una proteina naciente en un trasloc6n. 2s proteinas que se insertan despues de la traducci6n ""t'quieren de componentes adicionales en el citosol y :e . BiP en el ER . :.. BiP es un trinquete que evita que una proteina se : eslice hacia atras. ~

loc6n y el receptor de la SRP son los compo-

·es basicos de Ia translocaci6n cotraduccional. _ • o el complejo Sec6l es incorporado a mem- -s artificiales con el receptor de la SRP, puede _ ar Ia translocaci6n de proteinas nacientes, otras requieren de la presencia de un compoe adicionaL la proteina de membrana asociada :-! polipeptido de translocaci6n (TRAM, trans :g chain-associating membrane), una protefna


~

El ribosoma sella el lado citos61ico CITOSOL

Una proteina naciente es transferida directamente del ribosoma al trasloc6n. El ribosoma sella el canal en ellado citos6lico.

ER

La TRAM es requerida por algunas protefnas

Receptor de Ia SRP une al ribosoma

CITOSOL La translocaci6n requiere de trasloc6n, SRP, receptor de SRP, Sec61, TRAM y peptidasa sefial.

mayor que se entrecruza con una cadena transferente naciente. La TRAM estimula Ia translocaci6n de todas las protefnas. Los componentes del trasloc6n y sus funciones se resumen en Ia . La sencillez de este sistema genera varios puntas importantes. El Sec6l se visualiza como parte del canal y tambien intera ctuando con el ribosoma. La asignaci6n inicial se realiza cuando Ia SRP reconoce Ia secuencia de sefi.al conforme empieza a emerger del ribosoma Ia proteina recien sintetizada y se une a su receptor, y Ia secuencia de sefial es transferida a! trasloc6n. Cuando esta ultima entra al trasloc6n, el ribosoma se adhiere al Sec6l para formar un sello que impide que el poro sea expuesto al citosol. En este sistema no ocurre Ia separaci6n del peptido sefi.al, de modo que no puede ser necesaria por sf misma para la translocaci6n. En este sistema no se necesitan los

10.11 La translocaci6n requiere de inserci6n en el trasloc6n y (en ocasiones) de un trinquete en el ER

233



CITOSOL

CITOSOL

El BiP hace las veces de trinquete para evitar la difusi6n hacia atras de una prote\na transferente.

componentes dellado luminal de Ia membrana para Ia translocacion. Por supuesto, Ia eficiencia del sistema in vitro es relativamente baja, pues in vivo pueden requerirse otros componentes para lograr una transferencia eficiente o para evitar que otras protefnas celulares interfieran con el proceso. En ciertos casos en que se inserta una proteina en una membrana de manera postraduccional, se necesita un mecanismo mas complicado. El n1ismo complejo Sec61 forma al canal, pero tambien son necesarias otras cuatro protefnas Sec, ademas del chaperon Bi.P (miembro de Ia clase Hsp70) y del abastecimiento de ATP en ellado luminal de Ia membrana. En la se muestra que el chaperon Bi.P se comporta como un trinquete, que de no estar, el movimiento browniano permitira que Ia proteina se deslice hacia atras, al interior del citosol. En caso contrario, afianza a la protefna dentro del ER conforme sale del poro e impide que se desplace hacia atras. El Bi.P no jala a la protefna, solo evita que se deslice hada atras. (La raz6n de que se necesite BiP para la translocacion postraduccional, pero no para Ia cotraduccional, puede ser que una proteina recien sintetizada es extrafda continuamente del ribosoma y, por lo tanto, es incapaz de deslizarse hacia atras.)

IDE

La translocaci6n inversa env1a prote1nas al citosol para que sean degradadas

Concepto principal • Los traslocones Sec61 pueden utilizarse para la translocaci6n inversa de prote\nas del ER al citosol.

234


La translocaci6n inversa utiliza el trasloc6para enviar una prote\na desplegada del ER al citosol, do · de es degradada. Se desconoce el mecanisme para orientar ;: trasloc6n en reversa.

En el ER tienen Iugar varias actividades importantes. Las proteinas se desplazan a traves del ER rumba a diversos destinos, glucosiladas y plegadas en SL conformacion final. El ER proporciona un sistemc de "control de calidad" por el cual se identifican ·. degradan las protefnas plegadas de forma erronea. No obstante, la degradacion no sucede en el ER, . podrfa ser necesario que Ia protefna se exportarc. nuevamente a! citosol. La primera indicacion de que las protefnas de: ER son degradas en el citosol y no en el ER mism provino de evidencias de implicacion del proteasoma, agregado protefnico grande con numerosa ~ actividades proteolfticas. Los inhibidores del proteasoma evitan la degradacion de protefnas aberrante. del ER. Las protefnas por degradar son marcadas po:: el proteasoma cuando son modificadas por la adicion de ubiquitina, pequefi.a cadena polipeptfdica. El punto importante es que la adicion de ubiquitina y la degradacion por proteasomas ocurren en el citosol (y una proporcion menor en el nucleo). El transporte del ER al citosol se debe a Ia in· version del proceso usual de importacion, al que se le llama translocaci6n inversa (en ocasiones tambien se le llama retrotranslocacion o dislocacion) . para la cual se utiliza el traslocon Sec6l. Las condiciones son distintas; por ejemplo, el traslocon no esta asociado con un ribosoma. Algunas mutaciones del Sec61 impiden la translocacion inversa, pero no Ia translocacion ordenada, quiza por diferencias en el proceso o (muy probablemente) porque estas regiones interactuan con otros componentes necesarios para la translocacion inversa. En la se sefi.ala que se desconoce Ia forma en que se abre el canal para permitir la insercion de la protefna en el lado del ER; presumiblemente estan implicados componentes especiales. Un modelo consiste en que los chaperones reconocen las proteinas mal ensambladas o plegada

:-;oneamente y las transfieren al traslocon. En un ..:.so especifico, el citomegalovirus (CMV) humano ·fica a proteinas citosolicas que destruyen a pro_'nas clase I del complejo mayor de histocompati_·dad (MHC, major histocompatibility complex) recien .tetizadas, para lo cual se necesita un producto ~ tefnico vfrico (el US Il ), el cual es una protefna :membrana que funciona en el ER, interactua con ~ protefnas del MHC y probablemente las trans~a al traslocon para Ia translocacion in versa. El sistema implicado en Ia degradacion de pro, .nas aberrantes del ER puede ser identificado me- te mutaciones (en las levaduras) que conducen acumulacion de las mismas. En Ia mayorfa de ;. casas, una proteina que se pliega erroneamente ~ ducida por un gen mutante) es degradada y no ~ :1sportada a traves del ER. Los mutantes de leva-~as incapaces de degradar al sustrato se clasifican - os grupos, los que identifican a componentes _. mecanismo proteolitico, como las enzimas invo.:radas en Ia adicion de ubiquitina, y los que iden-can a componentes del mecanismo de transporte, ~:u idos Sec6I, Bip y Sec63. Las proteinas involucradas en el sistema tam-=~ han sido identificadas por su s interacciones -_ el sistema del CMV, cuya proteina US II pasa sustratos del MHC a una protefna denominaeJrlin que se localiza en Ia membrana del ER. protefna Derlin, a su vez, pasa a los sustratos a .a ATPasa citosolica Hamada p97, la cual proba~ :::nente es responsable de sacarlos del canal, hacia 2tosol. La protefna Derlin es un homologo de la :~I p de las levaduras, una de las protefnas iden- ~a das por mutaciones como parte del sistema de :"1slocaci6n inversa.

Las protefnas residen en las membranas por medio de regiones hidr6fobas , ~:-;ceptos principales _as proteinas del grupo I tienen al grupo terminal N en :: extrema distante de La membrana y las del grupo II :resentan una orientaci6n opuesta. .;[gunas prote\nas tienen multiples domi nios :-ansmembrana.

- las membranas biologicas contienen protei- :etenidas en la bicapa de lfpidos por medio de ::acciones no covalentes. La definicion operaa! de una proteina integral de membrana · _e requiere de Ia discontinuidad de Ia bicapa de · s para ser liberada de Ia membrana. Una carac-..ca comun de dichas proteinas es Ia presencia

Las proteinas del grupo I tienen el extremo N en el lado distante y el extremo C en el citosol Extremo N EXTERIOR

CITOSOL Extremo C Las proteinas del grupo II tienen el extremo C en el lado distante y el N en el citosol

EXTERIOR

CITOSOL Extremo N Las prote\nas transmembrana del grupo I y del grupo II tienen orientaciones opuestas respecto de La membrana.

de por lo menos un dominio transmembrana, forma do por un fragmento a- helicoidal de 21 a 26 aminoacidos hidrofobos. Una secuencia que cumpla con los criterios para Ia insercion en Ia membrana puede identificarse por medio de un diagrama de hidropatfa, el cual rnide Ia hidrofobicidad acumulativa de un fragmento de aminoacidos. Una protefna que tiene dominios expuestos en ambos !ados de Ia membrana se denomina proteina transmembrana. La asociacion de una proteina con una membrana adopta diferentes formas, y esta topograffa depende del numero y de Ia distribucion de las regiones transmembrana. Cuando una proteina tiene una sola region transmembrana, su posicion determina Ia porcion que se expondra a un lado y otro de la membrana. Una proteina puede tener extensos dominios expuestos a ambos !ados de Ia membrana o un sitio de insercion cerca de un extremo, de manera que en un !ado se expone muy poco material, en su caso. La longitud de Ia cola terminal N o terminal C que sobresale de Ia membrana, cerca del sitio de insercion, puede ser insignificante o de dimensiones considerables. se muestra que las protefnas En Ia con un solo dominio transmembrana se agrupan en dos clases; las del grupo I, en las cuales el grupo terminal N apunta hacia el espacio extracelular, son mas comunes que las del grupo II, en las cuales

10.13 Las prote\nas residen en las membranas por medio de regiones hidr6fobas

235

Las proteinas que tienen un numero impar de dominios transmembrana tienen los extremos N y C en Iadas opuestos

Las proteinas con un numero par de dominios transmembrana tienen los extremos N y C del mismo lado

La orientaci6n de los extremos de las proteinas con multiples segmentos transmembrana depende de que haya un nCtmero par o impar de segmentos transmembrana.

la orientaci6n ha sido invertida, de manera que el grupo terminal N apunta hacia el citoplasma. La orientaci6n se determina durante la inserci6n de Ia protefna en el ER. En la se muestra Ia orientaci6n de las protefnas que tienen multiples dominios transmembrana. Un numero impar significa que ambos extremos de Ia protefna estan en !ados opuestos de Ia membrana, mientras que un numero par implica que los extremos se encuentran del mismo !ado . La extension de los dominios expuestos en uno o ambos !ados depende de la localizaci6n de los dominios transmembrana; los que estan en uno u otro extrema pueden estar expuestos, y las secuencias internas ubicadas entre dominios forman "lazos" en el espacio extracelular o en el citoplasma. Un tipo comun de estructura es el pasaje de siete dominios transmembrana, o receptor "serpentina"; otro es el pasaje de 12 dominios transmembrana que forma parte de un canal de iones. ;__ Un dominio transmembrana desempefia un papel importante en la funci6n proteinica, ademas de permitir que la protefna se inserte en la bicapa de lfpidos? En las protefnas simples del grupo I o del II, tiene poco que hacer, y con frecuencia puede ser remplazado por cualquier otro dominio transmem236

CA PITULO 10 Localizaci6n de las proteinas

brana. Sin embargo, estos ultimos desempeiian un papel importante en la funci6n de las protefnas que atraviesan varias veces la membrana o que tienen subunidades que se oligomerizan dentro de Ia membrana. En tales casos, los dominios transmembrana a menudo contienen residuos polares, los cuales no se encuentran en los dominios individuales transmembrana de las protefnas del grupo I ni en las del grupo II. Las regiones polares de los dominios transmembrana no interactuan con la bicapa de lfpidos, interactuan entre sf, lo que les permite formar un poro o canal polar dentro de Ia bicapa de lfpidos. La interacci6n entre dichos dominios transmembrana puede crear un pasaje hidrofilico por el interior hidr6fobo de Ia membrana y permitir que las moleculas o los iones altamente cargados pasen a traves de la membrana, ademas de ser importante para Ia funci6n de los canales de iones y el transporte de los ligandos. Otro caso en el que la conformaci6n de los dominios transmembrana es importante, es el de ciertos receptores que se unen a ligandos lipofflicos, en cuyo caso, los dominios transmembrana (y no los dominios extracelulares) se unen a los ligandos dentro del plano de Ia membrana.

Las secuencias de anclaje determi nan la orientaci6n de las prote1 nas Co nee ptos pri nci pa les • Una secuencia de anclaje detiene el paso de una proteina a traves del trasloc6n . Habitualmente esta secuencia se localiza en el extrema C y resulta en una orientaci6n de grupo I en La cual el extrema N ha pasado a traves de La membrana. • Para insertar una proteina en la membrana y anclar el sitio de inserci6n puede utilizarse una secuencia combinada ancla-seiial. Tipicamente, esto es interno y resulta en una orientaci6n de grupo II en la cual el extrema N es citos6lico .

Las protefnas secretadas por Ia o~lula atraviesan la membrana mientras permanecen en el canal acuoso del trasloc6n, por el contrario, las que residen en las membranas empiezan el proceso de Ia misma manera, pero despues se transfieren del canal acuoso al interior del ambiente hidr6fobo. El reto al explicar la inserci6n de protefnas en el interior de las membranas es diferenciar a las protefnas transmembrana de las secretadas y encontrar Ia causa de esta transferenda. La ruta porIa cuallas proteinas de tipo I o de tipo II son insertadas en la membrana es igual a Ia ruta inicial de las protefnas secretoras, basada en una secuencia de sefial que funciona de forma co-

_juccional. Sin embargo, las protefnas que deben · 1anecer en Ia membrana poseen una segunda "'a! de parada de transferencia que asume Ia -:na de un agrupamiento de amino
1. La secuencia entra a Ia membrana

2. La senal es separada; Ia translocaci6n continua

3. La secuencia de anclaje interrumpe Ia transferencia

c Las proteinas que residen en las membranas entran por La misma ruta que las secretadas, pero su transferencia es interrumpida cuando La secuencia de anclaje pasa a t raves de La membrana . Si el ancla se encuentra en el extrema C, el volumen de La proteina atraviesa la membrana y se ex pone en la superficie distante.

mientras que el resto del polipeptido creciente continua enrollandose en el ER. La secuencia sefi.al-ancla suele ser interna, y su Iocalizacion determina las partes de la proteina que permaneceran en el citosol y las que seran extraceJulares. En esencia, todas las secuencias terminales N que preceden al complejo sei'ial-ancla estan expuestas en el citosol, muy frecuentemente la cola citosolica es corta, de -6 a 30 aminoacidos. En efecto, el extremo N es restringido, mientras que el resto de Ia protefna atraviesa la membrana, con lo cual se revierte Ia orientacion de la protefna respecto de Ia membrana. Las secuencias sefial-ancla combinadas de las protefnas tipo II se asemejan a las secu encias sefial divisibles; en la se ilustra un ejemplo . Igual que en las secuencias clivisibles, la composicion de aminoacidos es mas importante que la secuencia en si. Las regiones localizadas en las extremidades de la secuencia sefial-ancla portan cargas positivas;

O. !L. Las secuencias de anclaje determinan la orientaci6n de las proteinas

237

1. La secuencia sefial-ancla entra a Ia membrana

2. La sefial-ancla permanece y Ia translocaci6n continua

t

la region central no tiene carga y se parece al centr hidrofobo de un lfder divisible. Las mutaciones que introducen aminoacidos cargados en la region cen· tral evitan la insercion en la membrana; las muta· ciones localizadas a ambos !ados evitan que funci one el ancla, de manera que Ia protefna es secretadi o colocada en un compartirniento incorrecto. La distribucion de cargas en torno a Ia secuencic de anclaje produce un efecto importante en Ia orientacion de la protefna. Normalmente hay mas carga_ positivas en ellado del citoplasma (!ado terminal · de las proteinas tipo II) , pero silas cargas positiva son removidas por una mutacion, Ia orientacion dcla proteina puede invertirse . El efecto de las carga en la orientacion se resume en la regia del "interio:positivo", la cual asevera que ellado del ancla cor las cargas mas positivas se localizara en el citoplasma . En efecto, las cargas positivas proporcionan ur: garfio que se engancha en ellado citoplasrnico de la membrana, que a su vez controla la direccion eL qu e se inserta la region hidrofoba, deterrninando as: la orientaci6n de la proteina .

3. La translocaci6n termina

E

(C6mo se insertan las proteinas en las membranas?

Concepto principal • La transferencia de los dominies transmembrana del trasloc6n al interior de la bicapa de lipidos es activada par la interacci6n de la region transmembrana con el trasloc6n. Una secuencia combinada sefial-ancla hace que una proteina invierta su orientaci6n, de manera que el extrema N permanezca en la cara interna y el C se exponga en la cara externa de la membrana.

et

Es razonable la comprension de los procesos por lo cuales las protefnas secretadas pasan a traves de Ia membranas y de como esto se relaciona con la inser-

t

--lniciaci6n

Citoplasmicos

!

La secuencia combinada sefial-ancla de la neuramidasa de la influenza se localiza en el extrema N y tiene un centro hidr6fobo.

238

CAPITULO 10 Localizaci6n de las protelnas

La prole ina transferente se desplaza a !raves del canal

La proteina transmembrana reside en Ia bicapa de lipidos

A -~mbrana

(Como hace Ia transicion una prote1na transy se desplaza a traves de un canal prote1nico para

-:eractuar directamente con la bicapa de llpidos?

:. ' n de las protemas del grupo I y del grupo II con ;1 dominio transmembrana individuaL pero aun es :::nposible explicar los detalles de Ia inserdon de las . tefnas con multiples dominios transmembrana. Se sabe como una protema secretada atraviesa _ a membrana sin problema, sin embargo, es mas ·cil aplicar el mismo modelo a una protefna que -~ ide en la membrana. En Ia se ilustra ..: diferencia entre la organizacion de una protema -ansferente, protegida de Ia bicapa de lipidos por el -~na l acuoso, y Ia de una protema transmembrana, · e tiene un segmento hidrofobo en o di. o con la membrana. La pregunta clave es como ~ transfiere una protefna del canal protefnico al :erior de Ia bicapa de lipidos. En la se sugiere Ia posibilidad de ... e haya un mecanismo que transfiera dominios rofobos transmembrana directamente del canal interior de la membrana. Esta idea esta respaldada _r las observaciones de un sistema in vitro en el cual _ micli6la transferencia de protemas con diferentes _minios transmembrana al interior de un ambien- ipfdico. Cuando el dominio paso un umbra! de ofobicidad, Ia protefna pudo pasar de un canal Sec6l y TRAM al interior de la bicapa de lipidos. - _emas de Ia hidrofobicidad global, la localizacion ~los residuos polares en los segrnentos transmem-_ma tiene un efecto impo rtante . La explicacion

Las prote1nas de membrana recien sintetizadas son capaces de transferirse lateralmente del traslocon al interior de la bicapa de lipidos. Se desconoce el mecanismo de transferencia.

mas sencilla es que la estructura del canal perrnite que la proteina transferente entre en o con Ia bicapa de lipidos, de manera que un segmento lo suficientemente hidrofobo pueda d.istribuirse de rnanera sencilla directamente en ellipido. La estructura del trasloc6n sugiere que entre dos helices podrfa haber una compuerta para Ia transferencia. Siempre se ha supuesto que, independientemente del mecanismo exacto, la transferencia del segmento transmembrana al interior de Ia membrana es activada por Ia secuencia transmembrana que esta en el poro. Sin embargo, los cambios del poro ocurren antes, como respuesta a la sfntesis de Ia secuencia transmembrana en el ribosoma . Cuando una protefna secretada pasa a traves del poro, el canal se mantiene sellado dellado del citosol, pero se abre dellado luminal despues de la sfntesis de los primeros 70 residuos. Tan pronto como se ha sintetizado completamente una secuencia transmembrana, en otras palabras, rnientras esta totalmente dentro del ribosoma, el poro se cierra dellado luminal. No se sabe bien a bien emil es Ia relacion de este cambia con Ia transferencia de Ia secuencia transmembrana en el interior de Ia membrana. El proceso de insercion en una membrana ha sido caracterizado para las protefnas de tipo I y las de tipo II, en las cuales h ay un solo dominio trans membrana. (.De que manera se inserta una protefna con multiples regiones transmembrana en una membrana? Se sabe mucho menos acerca de este proceso, pero se supone que se basa en las secuencias con capacidades de seiial o de ancla. Un modelo consiste en suponer que hay una serie alternante de secuencias de seiial y de ancla, y que !a translocadon se inicia en la primera secuencia de seiial y contin{ta basta que es detenida por Ia primera secuencia de anclaj e. Despues se reinicia mediante una secuencia de seiial subsiguiente basta que Ia interrumpe la siguiente ancla. Es posible que haya lO.lS. (Como se insertan las proteinas en las membranas?

239

varias rutas para Ia integracion en Ia membrana, pues en algunos casos el dominio transmembrana parece desplazarse al interior de la bicapa de lfpidos tan pronto entra al traslocon. En otros, sin embargo, puede presentarse una demora hasta que se hayan sirHetizado otras regiones transmembrana.

IE

La inserci6n en la membrana despues de la traducci6n depende de las secuencias lider

Concepto principal • Las secuencias llder terminales N proporcionan la informacion que permite a las protelnas asociarse con las membranas de las mitocondrias o de los cloroplastos.

ORGANELO

La protefna pasa a traves de Ia membrana y Ia secuencia llder es separada

Lfder J

N~

t

La secuencia lfder se une al receptor en Ia membrana del organelo CITOSOL

Las secuencias llder permiten que las proteinas reconozcan las superficies de las mitocondrias o de los cloroplastos par media de un proceso postraduccional.

Las mitocondrias y los cloroplastos sintetizan solo a algunas de sus protefnas, las primeras solo a -10 y los segundos, a -50. La mayoria de las protefnas de los organelos es sintetizada en el citosol por el mismo banco de ribosomas libres que sintetiza a las proteinas de este; despues deben ser importadas a! interior del organelo . Muchas proteinas que entran a las mitocondria o a los cloroplastos por un proceso postraduccional tienen secuencias lider encargadas del reconocimiento primario de Ia membrana exterior del organelo. Como se muestra en el diagrama simplificad de la , la secuencia lfder inicia Ia interaccion entre el precursory Ia membrana del organelo, la proteina atraviesa Ia membrana y ellider e~ dividido por una proteasa en ellado del organelo. En general, los lfderes de las proteinas importadas al interior de las mitocondrias y de los cloroplastos tienen aminoacidos hidrofobos y basicos; estan formados por fragmentos de aminoacidos sin carga interrumpidos por aminoacidos basicos y carecer:: de aminoacidos acidos, hay poca homologfa de otro tipo, como en Ia . El reconocimiento de: lider no depende de su secuencia exacta, sino de su capacidad para formar helices anfipaticas, en la cuales una cara tiene aminoacidos hidrofobos y Ia otra, aminoacidos basicos. La secuencia lider contiene toda la informacior. necesaria para localizar una proteina de organelo. La capacidad de una secuencia lfder puede evaluarse construyendo una protefna artificial en la cual e: lfder de una proteina de organelo se une con una del citosol. El experimento consiste en crear un ger: hfbrido que posteriormente es traducido en la protefna hfbrida. Mediante estos experimentos se ha demostrad que numerosas secuencias lfder son independientes para dirigirse a cualquier secuencia adherida a la mitocondria o a! cloroplasto; por ejemplo, si Ia secuencia lfder de Ia figura 10.35 esta adherida a Ia proteina del citosol DHFR (dihidrofolato reductasa ) la DHFR estara en Ia mitocondria. La secuencia lider y Ia protefna transportada representan dominios que se pliegan de manera inde-

Hidr6fobo

Polar

lniciaci6n

I

+

+

+

Mef '·

• - - - -- SeFial de asignaci6n a Ia matriz

------!~

La secuencia llder de la subunidad IV de la citocromo c oxidasa de las levaduras esta form ada par 25 aminoacidos neutros y basicos. Los primeros 12 son suficientes para transportar a la matriz mitocondrial cualquier polipeptido adherido.

240

CAPITULO 10 Localizaci6n de las protelnas

- ndiente. A pesar de la secuencia ala cual se ad·ere, ellfder debe poder plegarse en una estructura : ropiada para ser reconocido por los receptores de o envoltura d el organ elo. La secu encia polipeptidi:i. adherida no desempei'ia ninguna funcion en el ·"conocimiento de !a envoltura. (.Que restricciones se imponen a! transpone de . :1a protefna hidrofilica a traves de Ia membrana hir6foba? Una respuesta podrfa ser Ia obs ervacion de _ eel metotrexato, un ligando de Ia enzima DHFR, quea el transporte a! interior de Ia mitocondria : :- Ia DHFR fusionada a un lfd er mitocondrial. La !lion estrecha del metotrex ato impide a Ia en zima =plegarse cuando se transfiere a traves de Ia mem~ana. Para ser asignada, Ia secuencia de Ia protefna -an sportada no tiene importancia, pero para seguir su lfder a traves de Ia membrana, de fl exibilidad ·.ira desplegarse. Para la translocacion, Ia hidrolisis de ATP es .:cesaria dentro y fuera; podrfa tener que ver con ::1.pujar Ia protefna desde el e xterior y jalarla des~ el interior. En caso de importacion mitocondrial _a cteriana, tam bien se requiere de un potencial : ~ ctroqufmico a traves de !a membrana interna ~ ~a transferir Ia porcion terminal N del Hder .

Una jerarq u1a de secuencias determi na la localizaci6n dentro de los organelos :Jnceptos Jrincipales

que especifica su destino en el organelo. Un lfder formado por varias porciones contiene sei'iales que funcionan de manera jerarquica, como se resume en la . La primera parte dellfder dirige a la protefna al organelo, y necesita la segunda parte si su destino esta en alguna parte ajena a la matriz. Las dos partes del lider son eliminadas por divisiones sucesivas. Ejemplo de ello es el citocromo cl, que esta unido a !a membrana interna y apunta hacia el espacio intermembrana. Su secuencia lider esta formada por 61 aminoacidos y puede dividirse en regiones con funciones distintas. La secuencia de los primeres 32 aminoacidos, o incluso Ia mitad terminal N de esta region, puede transportar la DHFR ala matriz, de modo que la primera parte de la secuencia lfder (los 32 aminoacidos terminales N) comprende una sei'ial de asignacion a la matriz. El lfder intacto, sin embargo, !leva adherida una secuencia, por ejemplo, !a DHFR murina, en el interior del espacio intermembrana. i. Que imp ide que la protefna rebase el espacio intermembrana si el lfder esta intacto? La region

Serial para Ia membrana externa

R~eptoc TOM~

"'pao;o ;ot"membca"'

Receptor TIM ...,_.--=::;_.-

• La porcion terminal N de una secuencia lider dirige a una proteina a la matriz mitocondrial o allumen del cloroplasto. Una secuencia adyacente puede controlar la direcci6n a una membrana o a los espacios intermembranosos. Las secuencias son divididas sucesivamente de la nroteina.

--=: :nitocondria esta rodeada de una env oltura for=da por dos membranas, y las protefnas impona- a! interior de las mitocondrias pueden estar en ::1embrana externa, el espacio intermembrana, Ia :-:nbrana interna o Ia matriz; cuaJquiera que forme : e de una de las membranas, puede es tar orienta. de tal manera que apunte hacia un lado o hacia :ro. <.Que dirige a una protefna mitocondrial a! • partimiento apropiado? La ruta "predetermi- i a" para una protefna importada a! interior de .i mitocondria es a traves de las dos membranas, :a Ia matriz, propiedad que le confiere Ia por.. terminal N de la secuencia lider. Una protei.ocalizada en el espacio intermembrana o en la . :nbrana interna requiere de una sei'ial adicional

Membrana externa

Senal para el espacio intermembrana

Las mitocondrias tienen receptores para el transporte proteinico en las membranas interna y externa. El reconocimiento en la membrana externa puede provocar el transporte a traves de ambos receptores, al interior de la matriz, donde el lider es escindido. Si la proteina tiene una sefial de asignaci6n a la membrana, puede ser reexportada.

10 .17 Una jerarqu1a de secuencias determina la localizaci6n dentro de los organelos

241

-~

Ala Gli

~

'Ala Gli

II

'Ala

-+- La region lfder continua, sin carga, asigna el sustrato a Ia membrana interna___.

s ISe

'Ala Division 2

Ellider del citocromo c1 de las levaduras contiene una region terminal N que dirige la proteina a la mitocondria, seguida de una region que dirige a la proteina (dividida) a la membrana interna. Ellfder es eliminado por dos eventos de division.

posterior ala sefial de asignacion ala matriz (formada por 19 aminoacidos delUder) proporciona otra sefial que ubica a la proteina en la membrana intema o en el espacio intermembrana. Para fines de trabajo, esta sefial se denomina sefial de asignacion a la membrana. La com posicion de las dos partes de un lider que contiene ambos tipos de sefial es distinta. Como se , los 3 5 aminoacidos terindica en la minates N son semejantes a otras secuencias lider de los organelos en cuanto al alto contenido de aminoacidos sin carga intercalados con aminoacidos basicos, pero los siguientes 19 comprenden un fragmento ininterrumpido de aminoacidos sin carga lo suficientemente grande como para abarcar una bicapa de lfpidos. Esta sefial de asignacion a la membrana se asemeja a las secuencias implicadas en la translocacion de las proteinas en el interior de las membranas del ER (vease la seccion 10.7, Las secuencias de sefial inician la translocacion). La division de la sefial de asignacion a la matriz es el unico evento de procesamiento que necesitan las proteinas residentes en la matriz, seiial que tambien debe separarse de las proteinas que residen en el espacio intermembrana; sin embargo, despues de esta division, la sefial de asignacion a la membrana (que es ahora la secuencia terminal N de la proteina) dirige a la proteina a su destino en la membrana extema, el espacio intermembrana o 242

CAPITULO 10 Localizacion de las proteinas

la membrana interna. A su vez, la sefial se dividir: posteriormente. La sefial de asignacion a la matriz terminal . funciona de la misma manera en todas las proteina. mitocondriales, al ser reconocida mediante un rt· ceptor de la membrana externa sera transportada :. traves de las dos membranas. Notese que el mism proceso esta involucrado en la division de la sei1c. de asignacion a la matriz, a pesar del destino fine... de la proteina. Esta proteasa es una enzima sol ubi: en agua y dependiente de Mg 2 + que se localiza en ::. matriz, asf que la secuencia terminal N debe llegc. a esta, incluso si la proteina finalmente residira e:el espacio intermembrana. La residencia en la matriz ocurre en ausenc'.:. de cualquiera otra seiial, pero si hay una sefial d. asignacion a la membrana, esta se activara por :..:. division de la seiial de asignacion ala matriz. D ~ pues, la porcion remanente dellider (que ahora e terminal N) provoca que la proteina se aloje en . _ destino final. La naturaleza de la sefial de asignacion a _ membrana es motivo de controversia. Median·un modelo se afirma que toda la proteina entra a .:. matriz, despues de lo cualla sefial de asignacion la membrana hace que sea reexportada al interi o a traves de la membrana interna. En un mode alterno se propane que la secuencia de asignaci -ala membrana simplemente evita que el resto · c

rotefna siga al lider a naves de la membrana :erna hasta el interior de la matrtz. Independienente del modelo que se aplique, otra proteasa alizada en el espacio intermembrana) termina eliminaci6n de las secuencias lider. El desplazarniento a naves de la membrana del . roplasto se logra de forma similar. En la se ilustra la variedad de localizaciones dispo_]es para las protefnas del cloroplasto, que atra~ an las membranas interna y externa de !a envol,..a para llegar a! estroma, proceso que involucra mismos tipos de desplazarniento al interior de !a ..atriz mitocondrial. No obstante, algunas protefnas . transportadas aun mas, a traves de las pilas de . mbrana de tilacoides, hasta ellumen; en su carnilas protefnas destinadas a las membranas de los acoides o allumen deben atravesar el estroma. Las sefiales de asignaci6n de los cloroplastos ' asemejan a las de las mitocondrias. El lfder esta . ado por -50 aminoacidos y !a mitad terminal permite reconocer la envoltura del cloroplasto. : :re las posiciones 20 y 25 tiene Iugar una division _,ante o despues del paso a traves de !a envoltura, _ modo que las proteinas destinadas a la mem·3 na de los tilacoides o a! lumen tienen un lider ~a! N nuevo que dirige el reconocimiento de membrana de los tilacoides. Son varios los sis·, as (cuando menos cuatro) del cloroplasto que :.alizan la importaci6n de proteinas al interior de :nembrana de los tilacoides . Asi pues, el principia general que rige el trans:te de las proteinas al interior de las rnitocondrias 4e los cloroplastos consiste en que la porci6n ternal N dellfder dirige a una protefna a la matriz . organelo, y para ubicarla protefna en la mem_na externa, el espacio intermembrana o la . :nbrana interna es necesaria una secuencia adi. al (dentro delUder).

Las membranas mitocondriales i nterna y extern a tienen traslocones disti ntos ::1ceptos principales ~l transporte a traves de las membranas mitocondriales ·nterna y externa utiliza diferentes complejos de ·eceptores. El complejo TOM (membrana exterior) es un complejo 3rande en el que los sustratos prote1nicos son dirigidos 3l canal Tom40 par uno de dos subcomplejos. • ~os diferentes complejos TIM (membrana interna) se Jtilizan dependiendo de que el sustrato proteinico esta jirigido a La membrana interna o allumen. Las prote1nas pasan directamente del complejo TOM al :omplejo TIM.

.ESTROMA

Una proteina se aproxima al cloroplasto desde el citosol con un lider de -50 residuos. La mitad terminal N del l1der promueve el paso al interior de La envoltura o a traves de ella hacia el estroma. La escisi6n ocurre durante el transporte a traves de la envoltura.

CITOSOL

Receptor Tom37,71 ,70

Tom40 =canal

Tom5,6,7

Las prote1nas TOM forman un complejo de receptores, o varios, necesario para la translocaci6n a traves de La membrana mitocondrial externa.

Los receptores que median el transporte a traves de cada membrana del cloroplasto y la rnitocondria son diferentes. En el primer caso se denomina TOC y TIC, en tanto que en las rnitocondrias son TOM y TIM, refriendose a las membranas externa e interna, respectivamente. El complejo TOM esta formado por aproximadamente nueve protefnas, muchas de las cuales son protefnas integrales de membrana. En la se muestra un modelo general del complejo . El agregado TOM mide >500 kD, con un diametro de - 138 A , y forma un canal conductor de iones. Un complejo consta de dos o tres anillos de 75 A

10.18 Las membranas mitocondriales interna y externa tienen traslocones distintos

243

ESPACIO INTERMEMBRANA

Tim17-23 =.-,canal?

jo TIM, mientras que el resto de Ia protefna sigu: transfiriendose a traves del complejo TOM. En Ia membrana interna hay dos complejos Tr de los cuales, Timl7 -23 transfiere protefnas all li men. Los sustratos son reconocidos porque pose ~ una sefial terminal N cargada positivamente. L;, protefnas transmembrana Timl 7 a Tim23 formael cana l. En la se muestra que est ' asociada s con Ia protefna Tim44 en el lado de ~' matriz de la membrana, proteina que a su vez ~ une a! chaperon Hsp70, asociado tambien con otr el Mge, contraparte del GrpE bacteriano. Esta as ciacion garantiza que cuando la protefna importa ·:_ llegue a Ia matriz, se una a! chaperon Hsp70. La gra:. afinidad del Hsp70 par Ia conformacion n o plega · = de la protefna conforme emerge de la membran ~ interna ayuda a "jalar" esta a traves del canal. Una importante actividad del chaperon en :~ matriz m itocondrial proviene del Hsp60 (que fo rna Ia misma clase de estructura que su contraparte GroEL). La asociaci6n con el Hsp60 es necesari; para Ia union de las subunidades de protefnas importadas que forman complejos oligomericos. Un.: proteina importada puede ser "transmitida" de. Hsp70 al Hsp60 en el proceso de adquisicion de lc. conformacion correcta. El complejo Tim22 - 54 transfiere a protefna: que residen en la membrana interna. (.Como encuentra una protefna transferente st:. camino del complejo TOM al complejo TIM apr piado? Dos complejos protefnicos localizados en e espacio intermembrana escoltan a una protefna que se transfiere del complejo TOM al TIM. Los complejos Tim9- l 0 y Ti.In8-l3 fungen como escoltas de diferentes conjuntos de sustratos protefnicos. El Tim9-l C' puede dirigir a sus sustratos al complejo Tim22-s.;. o al Tim23 - l7, mientras que el complejo Tim S13 los dirige solo al Tim22 -54. Algunos sustrato_ no utilizan el Tim9-l0 ni el Tim8 -l 3, de manera qu tambien debe haber rutas, que se resumen en Ia c

MATRIZ

Tim44 MGE

Las prote\nas Tim forman el complejo de translocaci6n a traves de la membrana mitocondrial interna.

de diametro, cada uno con un poro de 20 A de diametro. El Tom40 esta incrustado profunda mente en la membrana y proporciona el canal para la translocacion, ademas de ar a las protefnas conforme atraviesan la membrana externa y de u nirse a tres proteinas mas pequefias, TomS, 6 y 7, que pueden ser componentes del canal o factores de ensamblaje. Hay dos subcomplejos que proporcionan receptores de superficie. Tom20 y Tom22 forman un subcomplej o con dominios expuestos en el citosol. La mayoria de las proteinas importadas al interior de las mitocondrias son reconocidas par el subcomplejo Tom20,22, receptor primario que reconoce a la secuencia term inal N de Ia protefna transferente. Tom37,70,7l proporciona un receptor para un nu mero mas reducido de protefnas que tienen secuencias de asignacion interna. Cuando una protefna es translocada a traves del complejo TOM, pasa, de estar expuesta al citosol a estar expuesta al espacio intermembrana, pero normalmente no es liberada, sino transferida directamente a! complejo TIM. Es posible capturar intermediarios en las cuales ellfder es separado de la matriz par la proteasa, dejando gran parte del precursor expu esta en Ia superficie citosolica de la envoltura, lo cual sugiere que, durante el paso, una protefna abarca las dos membranas. Los complejos TOM y TIM no parecen interactuar directamente (o cuando menos no forman un estable complejo detectable ), de modo que pueden estar ligados nada mas par una protefna en transito. Cuando una protefna transferente llega al espacio intermembrana, de inmediato los residuos expuestos pueden unirse a un comple244


(.Cual es la funci on de los complejos de escolta? Tal vez sean necesarios para ayudar a Ia protefna ii salir del complejo TOM, asf como para reconocer a! complejo TIM. En la se muestra que una protefna en proceso de transferencia puede pasar directamente del canal TOM al complejo Tim9l 0 y despues al interior del canal Tim22- 54. Una protefna mitocondrial se pliega en diferentes condiciones antes y despues de atravesar la membrana. Las condiciones ionicas y los chaperones presentes difieren en el citosol y Ia matriz mitocondrial, de modo que es posible que una protefna mitocondrial adquiera su conformacion madura solo en Ia mitocondria.

CITOSOL

TOM

Los peroxisomas emplean otro tipo de sistema de translocaci6n Conceptos principales • Las prote\nas son importadas al interior de los peroxisomas en su estado de plegamiento completo. • Tienen una secuencia PTS1 en el extrema C o una secuencia PTS2 en el extrema N. • El receptor Pex5p se une a la secuencia PTS1 y el Pex?p a la PTS2 . • Los receptores son protelnas del citosol que transbordan al interior del peroxisoma portando un sustrato prote\nico y despues regresan al citosol.

Tim17-23

Tim22-54 MATRIZ

El complejo Tim9-10 lleva prote\nas del TOM a : ier complejo TIM, y Tim8-13 a Tim22-54.

TOM

CITOSOL

Una prote\na transferente puede ser transpor: ' ectamente de TOM a Tim22-54.

Los peroxisomas son cuerpos pequeii.os (de 0.5 a 1.5 1-1m de diametro) cubiertos por u na sola mem brana que contienen enzimas implicadas en el uso del oxfgeno que lo convierten en per6x.ido de hidr6 geno al eliminar atomos de los sustratos. Posteriormente, la catalasa utiliza el per6xido de hidr6geno para oxidar diversos sustratos; sus actividades son cruciales para Ia celula. Desde que se encontr6 que la enfermedad fatal del sfndrome de Zellweger es provocada por fa lta de peroxisomas, > 15 enfermedades humanas han sido vinculadas con trastornos de funcionamiento de los peroxisomas. Todos los componentes del perox.isoma son im portados del citosol; las protefnas necesarias para su formaci6n se denominan peroxinas, y se han identificado 23 genes que las codifican. Por otra parte, se han localizado enfermedades del peroxisoma humano en 12 grupos de complementaci6n, de las cuales, Ia mayorfa se identifica con genes especfficos. Los peroxisomas parecen estar ausentes de las celulas con mutaciones nulas en algunos de estos genes, que en ciertos casos reaparecen con Ia introducci6n de un gen de tipo silvestre. En general se supone que, igual que otros organelos unidos a membranas, los peroxisomas pueden surgir solo por duplicaci6n de peroxisomas preexistentes. Sin embargo, estos resultados despiertan Ia duda de si serfa posible ensamblarlos de novo a partir de sus componentes. Cuando menos en algunos casos, Ia ausencia de peroxinas deja a las celulas con fantasmas peroxis6micos, o cuerpos membranosos vacfos. Incluso si no es facil verlos, resulta diffcil excluir la posibilidad de que haya remanentes que sirvan para regenerarlos. El transporte de las protefnas a los peroxisomas ocurre despues de la traducci6n. La s protefnas importadas a Ia matriz tienen una de dos secuencias cortas, Ia seii.al de asignaci6n peroxis6mica l (PTS, peroximal targeting signal) y Ia PTS2. La PTS l es un

10.19 Los peroxisomas emplean otro tipo de sistema de translocaci6n

245

tripeptido o tetrapeptido localizado en el extremo C que originalmente se caracterizo como la secuencia SKL (Ser-Lis-Leu), pero se ha demostrado que una gran variedad de secuencias hacen las veces de una PTS l. La adicion de una secuencia adecuada al extremo C de las protefnas del citosol es suficiente como para garantizar la importacion al interior del organelo. La PTS2 es una secuencia de nueve aminoacidos, muy diversos, tambien en este caso, que puede localizarse cerca del extremo N o internamente. Podria haber incluso un tercer tipo de secuencia, la PTS3. Para la importacion de proteinas desde el citosol son necesarias numerosas protefnas peroxisornicas, cuyos receptores, ya unidos a los dos tipos de sefiales se llaman Pex5p y Pex7p, respectivamente. Las otras protefnas son parte de complejos asociadas a membranas e involucrados en la reaccion de translocacion. El transporte al interior del peroxisoma exhibe caracteristicas inusuales que marcan importantes diferencias del sistema utilizado para el transporte a otros organelos. Las protefnas pueden ser importadas al interior del peroxisoma en estado maduro, totalmente plegadas, lo cual contrasta con la necesidad de desplegar una protefna para que se introduzca en el ER o la rnitocondria, donde se desplaza a traves de un canal localizado en la membrana, en el interior del organelo, de forma semejante a una cadena desplegada de aminoacidos. Si bien no esta claro de que manera podria expandirse la estructura de un canal preexistente para perrnitirlo, una posibilidad serfa resucitar una idea antigua y suponer que el canal se ensarnbla en torno al sustrato protefnico cuando se asocia con la membrana. Los receptores Pex5p y Pex7p no son protefnas integrales de membrana, son mas bien citosolicas, con solo una pequefia proporcion asociada con los peroxisomas, ademas de que se comportan de la misma manera, alternando entre el peroxisoma y el citosol. En la se muestra que el receptor se une al sustrato protefnico en el citosol, lo lleva al peroxisoma, se desplaza con el a traves de la membrana hacia el interior y despues regresa al citosol para emprender otro ciclo. Este comportamiento de transbordador es semejante al sistema acarreador de importacion hacia el interior del nucleo. Las rutas de importacion convergen en la membrana del peroxisoma, donde Pex5p y Pex7p interactuan con el rnismo complejo protefna-membrana formado por Pexl4p y Pexl3p. Los receptores se ensamblan a este complejo, y despues, muchas otras peroxinas se involucran en el proceso de transportacion allumen; los detalles del proceso aun no han sido aclarados. 246

CAPiTULO 10 Localizaci6n de las proteinas

El receptor Pex5p se une a un sustrato pratE'· nico en el citosol, lo trans porta a traves de la membrana hac' : el interior del peroxisoma y despues regresa al citosol.

Las protefnas incorporadas a la membrana de" peroxisoma llevan una secuencia denominada mPTS pero poco se sabe sobre el proceso de integracior: La Pex3p puede ser una protefna clave porque si n esta presente, en las membranas de los peroxisomas no se encuentran otras protefnas. Por otra parte Pex3p tiene su propia rnPTS, que lleva a preguntar~ f como entra ala membrana, quiza interactua con e Pex3p que ya se encuentra en esta, lo cual influyc en la duda respecto de que los peroxisomas puedaL. ensamblarse de nuevo.

a:& Las bacterias utilizan tanto translocaci6n cotraduccional como translocaci6n postraduccional Concepto principal • Las protei nas bacterianas exportadas a las membranas o a traves de ellas utilizan mecanismos postraduccionales y cotraduccionales.

La envoltura bacteriana esta formada por dos capa de membrana, y el espacio intermedio se conon · como periplasma. Las protefnas se exportan de citoplasma para que residan en la envoltura o seaL secretadas por la celula. Los mecanismos de secrecion de las bacterias son similares a los caracteriza-

: en las celulas eucari6ticas, con la posibilidad de ,,: nocer algunos componentes relacionados. La 1 muestra las protefnas exportadas del plasma con uno de cuatro destinos posibles: • ser insertadas en la membrana interna • ser transferidas a naves de la membrana interna para postrarse en el periplasma • ser insertada en Ia membrana externa o • ser translocadas a traves de la membrana, hacia el medio. Varios de los complejos protefnicos de la mem·: :1a interna son responsables del transporte de las _1einas, ya sea que esten destinadas a atravesar ::tembrana interna o a permanecer en ella. Esta aci6n es semejante a la observada en las mito:.drias, donde complejos diferentes de la membra. interna y de la externa manejan subconjuntos : ·ntos de sustratos protefnicos, dependiendo de destino (vease la secd6n l 0.16, La inserci6n en la =:nbrana despues de la traducci6n depende de las :.- encias lider). Una diferencia con la importaci6n terior de los organelos es que la transferencia en :A i puede ser cotraduccional o postraducdonal. ~ .mas proteinas son secretadas de manera cotra:cional o postraduccional, y la cinetica relativa ' traducci6n frente a la secreci6n a traves de la . 1brana podrfa determinar el balance. Las protefnas bacterianas exportadas tienen se_ncias llder terminales N con un extremo N hi:mco y un centro hidr6fobo adyacente. Ellfder epara mediante una peptidasa seii.al que reconoas formas precursoras de muchas proteinas ex:.adas. La peptidasa seii.al es una proteina integral !.Ilembrana localizada en la membrana interna. :nutaciones que se producen en los lideres ter- ales N evitan la secreci6n, y son suprimidas por _:aciones de otros genes, que, por lo tanto, son ~ nidos como componentes del mecanismo de ex:-_,aci6n de proteinas. Muchos genes, de acuerdo Ia descripci6n general del sec, estan implicados • codifi.caci6n de componentes del mecanismo ··-eror por las mutaciones que bloquean la secre- de muchas, o todas, las proteinas exportadas.

El sistema Sec transporta proteinas al interior de La membrana i nterna y a traves de ella -:eptos principales :_ trasloc6n bacteriano SecYEG de la membrana interna ._ a relacionado con el trasloc6n eucari6tico Sec61. : la orientaci6n de las proteinas secretadas al :-asloc6n estan implicados varios traslocones.

Protefna de Ia membrana interna

Protefna de Ia membrana externa

Protefna

,.

Transporte protefnico postraduccional

CITOPLASMA

/

t t

Translocaci6n cotraduccional

Membrana interna PERl PLASMA Membrana externa

Las proteinas bacterianas pueden ser exportadas de manera postraduccional o cotraduccional y ser ubicadas en la membrana o en el espacio periplasmico, o bien, ser secretadas.

CITOPLASMA SecB es un chaperon que se une a Ia protefnas naciente

SecA es un motor asociado a Ia membrana

El sistema Sec consta del trasloc6n SecYEG incrustado en la membrana, la proteina asociada a SecA que impulsa a las proteinas a traves del canal, el chaperon SecB que transfiere las proteinas nacientes al SecA y la peptidasa sefial que divide la sefial terminal N de la proteina tra nslocada.

Hay varios sistemas de transporte a traves de la membrana interna, pero el mejor caracterizado es el sistema Sec, cuyos componentes se muestran en la . El trasloc6n incrustado en la membrana consta de tres subunidades relacionadas con los componentes del Sec6l de las levaduras y los mamfferos, cada una de las cuales es una proteina integral transmembrana (SecY tiene 10 segmentos transmembrana; SecE, tres). El trasloc6n funcional es un trimero con una copia de cada subunidad . La ruta principal para dirigir a las proteinas al trasloc6n consiste en SecA y SecB . Este ultimo es un chaperon que se une ala proteina naciente para con-

10.21 El Sistema Sec transporta proteinas al interior de la membrana interna y a traves de ella

247

. .. SeeS transfiere Ia protefna a SecA

t

CITOPLASMA

\._. 4.5S RNA

~-

---FtsY

SecA inserta protefnas en el trasloc6n

- Ffh

SecB/SecA transfiere proteinas al trasloc6n que pasa a traves de la membrana . El RNA 4.55 transfiere a las proteinas que entran a la mem brana.

trolar el plegamiento y que transfiere ala protefna al SecA, el cual, a su vez, Ia transfiere a! traslocon. En Ia se muestra que son dos las formas principales de dirigir las proteinas al canal Sec: • el chaperon SecB y • Ia SRP basada en el RNA 4.5S Muchos chaperones pueden incrementar la eficiencia de la exportacion protefnica bacteriana impidiendo el plegamiento prematuro; incluyen el "factor desencadenante" GroEL (caracterizado como chaperon que colabora con la exportacion) (vease !a seccion l 0. 5, Las protefnas desnaturalizadas y las recien sintetizadas requieren de chaperones, y Ia l 0.8, La secuencia de sefi.al interactua con Ja SRP) y !a protefna SecB (identificada com o el producto de uno de los mutantes sec). SecB es !a m enos abundante de estas protefnas, p ero desempefia la importante funcion de fomentar la exportaci6n, que comprende dos actividades. Primero, la SecB se comporta como chaperon y se une a una proteina naciente para retrasar el plegamiento, no puede revertir el cambio de estructura de una proteina plegada, de m anera que no funciona como factor de desdoblamiento, por lo tanto, su funcion es inhibir el plegamiento erroneo de la protefna recien sintetizada. Segundo, Ia SecB tiene cierta afinidad porIa proteina SecA que le permite dirigir a un precursor proteinico a !a membrana. La ruta SecB-SecYEG se utiliza para Ia translocaci6n de proteinas secretadas en el interior del periplasma y se resumen en Ia SecA es una gran proteina periferica de membrana que tiene alternativas para asociarse con la membrana. Como proteina periferica de membrana, se asocia con esta membrana gracias a su afinidad

248


SecA se recicla

SecB transfiere una protein a naciente al 'Seer el cual la inserta en el canal. La translocaci6n requiere de _: hidr6lisis de ATP y de una fuerza protonmotriz. SecA ejecu:.c ciclos de asociaci6n y disociaci6n con el canal y pro porcio~ : la fuerza motriz para empujar la proteina.

por lipidos acidos y por el componente SecY de traslocon, los cuales son parte de un complejo dt" subunidades multiples que proporciona !a funci6r translocasa. No obstante, en presencia de otras protefnas (SeeD y SecF), SecA puede asumir !a forme: de una protefna transmembrana. Probablementt' constituye el motor que empuja a! sustrato protefnico a traves del traslocon SecYEG. La SecA reconoce a !a SecB y a! precursor protefnico, a los cuales sirve de chaperon; es muy probable que las caracteristicas de la secuencia de la protefna madura, asf como su lfder, sean necesarias para e: reconocimiento. La SecA tiene actividad ATPasa qu depende de la union con lipidos, Ja SecY y la protefna precursora. La ATPasa funciona de forma ciclica durante la translocacion. Despues de unirse a un precursor protefnico, Ia SecA se une a! ATP y - 20 aminoacidos son translocados a traves de la membrana. Para liberar al precursor de !a SecA se necesita la hidrolisis de la ATP, para que pueda repetirse el ciclo. El precursor protefnico se une de nuevo y

. orciona el estfmulo para unir mas moleculas de :'. transferir otro segmento de proteina y liberar ~ ~ecursor . La SecA puede alternar entre Ia forma ·-:gral y la periferica de la membrana durante la .. locacion; en cada ciclo, un dominio de 30 kD : - cA puede insertarse en Ia membrana y despues . actarse. La translocacion tambien puede suceder por - proceso. Cuando un precursor es liberado por ~ cA, puede ser conducido a traves de Ia mem- .a por una fuerza protonmotriz (es decir, un po·al electrico a traves de la membrana) , que no ;;:de iniciar Ia transferencia a traves de la membrapero sf continuar el proceso iniciado por un ciclo - ~ cion ATPasa de la SecA, de modo que despues - - s ciclos de la reaccion mediada por el complejo : .. -ATP, o entre ellos, la fuerza protonmotriz pue :npulsar la translocacion del precursor. El complejo ribonucleoprotefnico de E. coli -->'lado por RNA 4 . 5S y las protefnas Ffh y FtsY ~ ·rituye una contra parte de Ia SRP eucariotica :::se la seccion 10.9, La SRP interactua con el re~ ~ r de Ia SRP), cuya fun cion quiza sea mantener a roteina naciente en una conformacion apro ::a hasta que interactue con otros componentes · ~ecanismo secretor, se necesita para Ia secre - de algunas proteinas, pero no de todas. Como . serva en Ia Figura l 0.46, sus sustratos son pro:~s integrales de membrana. La base de la selec- diferencial de sustratos es que la SRP de E. coli oce una secuencia de anclaje localizada en la :efna (por definicion, las secuencias de anclaje . . presentes solo en las protefnas integrales de ::ctbrana) . Los cloroplastos tienen contra partes : proteinas Ffh y FtsY, pero no requieren de un -ponente de RNA.

Sistemas de trans~ocaci 6n independientes de Sec en f. coli · :-ceptos principales .:S herichia coli y los organelos tienen sistemas de :"3nslocaci6n proteinica relacionados. _- sistema permite que ciertas protelnas se inserten :~ las membranas sin un mecanisme de translocaci6n. ·:JC es hom6logo al sistema mitocondrial para la : t~ nsferencia de proteinas al interior de la membrana ·:erna. :. sistema tat transfiere a proteinas con un elemento == arginina doble al espacio periplasmico. -~ema !1

alterno mas sobresaliente para la translode protefnas en E. coli se presenta en la pro-

La proteinase transfiere

lnteracciones hidr6fobas

.++IFuerza + protonmotriz

La protelna de envoltura M13 se inserta en la membrana interna al hacer un o electrostatico inicial, seguido de la inserci6n de secuencias hidr6fobas. La translocaci6n es conducida par interacciones hidr6fobas y una fuerza protonmotriz hasta que la secuencia de anclaje entra a la membrana.

tefna de envoltura del fago Ml3. En la se observa que jparece no necesitar ningun meca nismo de translocacion! Puede insertarse de forma postraduccional en el interior de los liposomas sin protefnas. Dirigir Ia proteina hacia la membrana implica secuencias especfficas (formadas por residuos basicos) en las regiones terminal N y terminal C que pueden interactuar con cabezas de fosfolfpidos con carga negativa. Posteriormente, la proteina entra ala membrana utilizando grupos hidrofobos en su secuencia lfder terminal N y una secuencia de anclaje interna. La hidrofobicidad es la fuerza impulsora principal para Ia translocacion, pero puede ser asistida por una fuerza protonmotriz generada entre ellado periplasmico de la membrana, cargado positivamente, y una region acida de Ia protefna, que !leva a esta atravesar la membrana; la peptidasa dellfder puede posteriormente separar la secuencia

10.22 Sistemas de translocaci6n independientes de Sec en E. coli

249

terminal N. La generalizaci6n de este mecanismo en las bacterias no esta clara, puede aplicarse solo al caso especial de las proteinas de envoltura del bacteri6fago . Algunas protefnas de los cloroplastos pueden insertarse en la membrana de los tilacoides por una ruta similar. Las mutaciones del gen yidC bloquean la inserci6n de protefnas en la membrana interna. Dicho gen es hom6logo de !a protefna Oxalp, necesaria cuando las proteinas son insertadas en la membrana mitocondrial interna desde la matriz, el cual puede funcionar independientemente de Ia SecYEG o aunada a ella. La inserci6n de algunas protefnas dependientes del YidC requiere de SecYEG, lo cual sugiere que YidC actua en conjunto con el trasloc6n para desviar el sustrato en !a inserci6n ala membrana de manera opuesta a la secreci6n. Otras protefnas cuya inserci6n depende del YidC no necesitan SecYEG, parece probable que sean necesarias otras funciones (no identificadas) y no el trasloc6n. El nombre del sistema tat se deriva de su capacidad para transportar proteinas que portan un elemento de arginina doble; su responsabilidad es la translocaci6n de proteinas que tienen cofactores estrechamente unidos, lo cual podrfa implicar limitaciones en su capacidad para desplegarse y atravesar la membrana. Este fen6meno iria en contra del principia de Ia mayorfa de los sistemas de translocaci6n, en los cuales la proteina pasa desplegada a traves de la membrana y ya madura, despues de haber pasado, se pliega. Este sistema esta relacionado con un sistema del lumen del tilacoide del cloroplasto llama do Hcfl 06. Ambo s transportan protefnas al interior del periplasma.

IE

Resumen

Una proteina que se inserta en una membrana o que la atraviesa, tiene una secuencia de senal reconocible por un receptor que forma pane de la membrana o que puede asociarse con ella. La proteina pasa a traves de un canal acuoso creado por la proteina transmembrana que reside en la membrana. En casi todos los casos, la proteina pasa desplegada por el canal, y es necesario que se asocie con los chaperones cuando emerge para adquirir Ia conformaci6n correcta. La excepci6n principal es el peroxisoma, en el cual una protefna importada con conformaci6n madura, se une a una proteina del citosol que la transporta a traves del canallocalizado en Ia membrana. La sfntesis de proteinas en el citosol empieza en los ribosomas "libres". Las proteinas secretadas en la celula 0 insertadas en membranas del sistema reticuloendotelial inician con una secuencia de senal terminal N que hace que el ribosoma se adhiera a !a 250


membrana del reticula endoplasmico. La protein· es translocada a traves de Ia membrana por transferencia cotraduccional. El proceso empieza cuando la secuencia de senal es reconocida por Ia SRI (particula ribonucleoproteinica), que interrumpe I"" traducci6n, se une a su receptor en la membrane: del ER y transfiere la secuencia de senal al recepto: Sec6l /TRAM ubicado en !a membrana. La sintes'~ se reinicia y !a protefna es translocada a traves de I membrana mientras esta siendo sintetizada, aunqu e no hay una conexi6n energetica entre los procesos El canal que atraviesa Ia membrana proporciona ur ambiente hidrofi1ico y esta formado principalmente por Sec6l. Una protefna secretada atraviesa por complet Ia membrana, hasta ellumen del ER. Las proteina ~ integradas en las membranas se dividen en dos tip _ generales, con base en su orientaci6n. En las protefnas integrales de membrana tipo I, Ia secuencia de sefial terminal N es dividida y !a transferencia a rraves de Ia membrana se interrumpe posteriormente por una secuencia de anclaje. La proteinase oriemen la membrana con su extrema N localizado e:el !ado alejado y con su extrema C, ubicado en e citosol. Las proteinas tipo 1I no tienen una senal terminal N divisible, sino una secuencia combinada sefial-ancla, Ia cual entra a !a membrana y se incrust<:. en ella, fen6meno que provoca que el extrema C se localice en ellado alejado, mientras que el extrern N permanece en el citosol. La orientaci6n de !a secuencia senal-anda depende de !a regia del "interio: positivo", que afirma que ellado del anda con m
:-~na haya entrada a la matriz. El control del _::..;n iento mediante Hsp70 y Hsp60, ubicados en -:riz mitocondrial, es una caracterfstica imp or: el proceso. ::..as mitocondrias y los cloroplastos tienen com.-; de receptores separados que crean canales _ es de la membrana interna y de Ia externa. - las proteinas importadas pasan directamen=": complejo TOM localizado en Ia membrana :::~ a a un complejo TIM que se encuentra en Ia rana interna. Las protefnas que residen en el · -:!o intermembrana o en la membrana externa ~e exportadas desde el complejo TIM despues __ e entran a Ia matriz. El complejo TOM utiliza - ntes receptores para protefnas importadas de-endo de que tengan secuencias de sefial termi~ o internas, y las dirige al interior del canal ..,Q. Hay dos receptores TIM en Ia membrana --:1a, uno es utilizado por las protefnas cuyo des!inal es la matriz interna y el otro por las que ~eexportadas al espacio intermembrana o a la _) rana externa. :_,as bacterias tienen componentes para Ia trans.:!6n a traves de Ia membrana que se relacionan _ s del sistema cotraduccional eucari6tico, pero ~n slocaci6n a menudo tiene Iugar mediante un -2 nismo postraduccional. SecY IE proporcionan - slocasa, y la SecA se asocia con el canaL adede estar implicada en Ia inserci6n y la propul- :Jel sustrato protefnico. SecB es un chaperon : il carrea a Ia proteina hasta al canal. Algunas ·-:" inas integrates de membrana son insertadas :. canal por una interacci6n con un aparato se=..nte ala SRP, formado por RNA 4.5S y por las d nas Ffh y Fts Y. ::..a proteina YidC es hom61oga a una protelna -.:ondrial, es necesaria para la inserci6n de al- ~s proteinas de membrana.

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IDE

La membrana mitoco ndrial interna y Ia externa tienen traslocones dis tintos

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1111!

El sistema Sec transporta prote\nas al interior de la membrana interna y a traves de ella

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Referencias

255

Transcripci6n ESQUEMA DEL CA PITULO

• El DNA esta unido en un canal y entra en o con las subunidades ~ y W-

Introduccion

liD

La transcripcion ocurre por media de apareamiento de bases en una "burbuja" de DNA no apareado

liD

• La polimerasa de RNA bacteriana puede dividirse en La enzima central o:,~W. la cual cataliza la transcripcion, ye n La subunidad cr, que es necesaria solo para la iniciacion. • El factor cr cambia las propiedades de union al DNA de la polimerasa de RNA de tal manera que su afinidad por el DNA general se reduce y su afinidad por los promotores aumenta. • Las constantes de union de la polimerasa de RNA a diferentes promotores varian en alrededor de seis ordenes de magnitud, lo cual corresponde a la frecuencia con La cualla transcripcion es iniciada en cada promotor.

• La polimerasa de RNA separa las dos cadenas de DNA en una "burbuja" transitoria y utiliza una cadena como molde para dirigir la sintesis de una secuencia complementaria de RNA. • La longitud de la burbuja es -12 a 14 bp y la longitud del hibrido de RNA-DNA dentro de ella es de -8 a 9 bp.

La reaccion de la transcripcion consiste en tres eta pas • La polimerasa de RNA inicia la transcripcion despues de unirse a un sitio promotor en el DNA. • Durante la elongacion la burbuja de transcripcion se des plaza a lo largo del DNA y la cadena de RNA se extiende en direccion 5' -3'. • Cuando La transcripcion se detiene, el duplex de DNA se vuelve a formar y la polimerasa de RNA se disocia en un sitio determinacion.

liD

liD

La estructura cristalina sugiere un modelo de desplazamiento enzimatico

111111

• Las polimerasas centrales de RNA bacterianas son complejos de subunidades multiples de -500 kD con una estructura general o:,~W

256

0

cambia en la

Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la transcripcion • Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la transcripcion al separar al transcrito de RNA para generar un extremo 3' nuevo.

111!mJ

• El DNA se desplaza por un surco de La polimerasa de RNA de las levaduras que forma una vuelta pronunciada en el sitio activo. • Un puente proteinico cambia La conformacion para controlar La entrada de los nucleotidos al sitio activo.

La polimerasa de RNA bacteriana esta formada por multiples subunidades

La asociacion con el factor iniciacion

• Cuando la polimerasa de RNA se une a un promotor, separa las cadenas de DNA para formar una burbuja de transcripcio ~ e incorpora hasta nueve nucleotidos en el RNA. • Puede haber un ciclo de iniciaciones abortivas antes de que la enzima avance a la siguiente fase. • El factor cr puede ser liberado de la polimerasa de RNA cuando La cadena naciente de RNA alcanza una longitud d~: ocho a nueve bases.

La polimerasa de RNA del fago T7 es un sistema de modelos util • Las polimerasas de RNA de los fagos T3 y T7 son polipeptidos individuates con actividades minimas en el reconocimiento de un pequeiio numero de promotores de fagos. • Las estructuras cristalinas de la polimerasa de RNA T7 con DNA identifican la region de union al DNA y el sitio activo.

La polimerasa de RNA esta formada por la enzima central (o enzima medular) y por un factor 0

~Como encuentra una polimerasa de RNA las secuencias promotoras?

• La velocidad con la cualla polimerasa de RNA se une a los promotores es demasiado alta para que la justifique la difusion aleatoria. • Es probable que la polimerasa de RNA se una a sitios aleatorios del DNA y los intercambie por otras secuencias con bastante rapidez hasta que encuentra un promotor.

Dm

El factor

0

controla la union al DNA

• Un cambio en la asociacion entre el factor cry la holoenzima modifica la afinidad de union por el DNA de t;

manera que la enzima central puede desplazarse a lo largo del DNA.

• Uno de los genes tempranos codifica un factor cr que hace que la polimerasa de RNA transcriba los genes intermedios. • Dos de los genes intermedios codifican subunidades de un factor cr que hace que La polimerasa de RNA transcriba los genes tardios.

El reconocimiento del promotor depende de las secuencias de consenso • Un promotor es definido por la presencia de secuencias de consenso cortas en localizaciones especlficas. • Las secuencias de consenso promotoras estan formadas por una purina en el punta de inicio, por el hexamero TATAAT ce ntrado en -10, y por otro hexamero centrado en -35. • Los promotores individuates suelen diferir del consenso en una o mas posiciones.

La eficiencia de los promotores puede aumentar o disminuir por media de mutaciones • Las mutaciones lentificadoras que disminuyen la eficiencia de un promotor a menudo reducen la adaptaci6n a las secuencias de consenso, mientras que las mutaciones aceleradoras tienen el efecto contrario. • Las mutaciones que se presentan en la secuencia -35 suelen afectar la union inicial de la polimerasa de RNA. • Las mutaciones localizadas en la secuencia -10 a menudo influyen en la reaccion de desnaturalizacion que convierte un complejo cerrado en uno abierto.

1-.J

lltii)

• Las secuencias de consenso localizadas en - 35 y -10 proporcionan La mayor parte de los puntas de o para La polimerasa de RNA en el promotor. • Los puntas de o se encuentran en una de las caras del DNA.

El superenrollamiento es una caracteristica importante de la transcripci6n • El superenrollamiento negative incrementa la eficiencia de algunos promotores al ayudar en la reacci6n de desnaturalizaci6n. • La transcripci6n genera superenrollamientos positives delante de la enzima y superenrollamientos negatives detras de ella, y estos deben ser retirados por la girasa y por La topoisomerasa.

La sustituci6n de los factores controlar la iniciaci6n

0

Los facto res al DNA

0

• Los terminadores intrinsecos estan formados por una horquilla abundante en G-C localizada en el producto de RNA seguida por una region rica en U en La cual ocurre la terminacion.

II&J

1111iJ La antiterminaci6n es un episodio regulador • La terminacion es inhibida cuando las proteinas antiterminacion actuan sab re la polimerasa de RNA para provocar que esta lea a traves de un terminado r espedfico o de varies de ellos. • El fago A tiene dos proteinas antiterminaci6n, pN y pQ, las cuales actuan en diferentes unidades de transcripci6n.

De

OR Los factores de terminaci6n y de antiterminaci6n interactuan con la polimerasa de RNA • Numerosas proteinas bacterianas son necesarias para que la pN de A interactue con La polimerasa de RNA. • Estas protelnas tambien participan en la antiterminaci6n en los operones rrn de La bacteria hospedadora. • El antiterminador pQ de A tiene un mecanisme de acci6n diferente que comprende la union al DNA en el promotor.

union al DNA cuando se asocia a la enzima central. • a 70 se une a las secuencias -35 y - 10. 0

La antiterminaci6n requiere sitios que sean independientes de los terminadores • El sitio en el cual una proteina antiterminaci6n actua se encuentra en sentido ascendente al sitio de terminacion en la unidad de transcripcion. • La localizaci6n del sitio antiterminador varia en casas diferentes y puede ubicarse en el promotor o dentro de La unidad de transcripci6n.

• a' 0 cambia su estructura para liberar a sus regiones de

Los factores

2,C6mo funciona el factor p? • El factor pes una proteina terminadora que se une a un sitio rut ubicado en un RNA naciente y viaja par el RNA para liberarlo de La estructura del hibrido de RNA-DNA en la polimerasa de RNA.

an de manera directa

pueden organizarse en cascadas

• Una cascada de factores a se crea cuando un factor cr es necesario para transcribir al gen que codifica al siguiente factor cr. • Los genes tempranos del fago SP01 son transcritos por una polimerasa de RNA hospedadora.

La polimerasa de RNA bacteriana termina en sitios discretos

1161 Hay dos ti pos de termi nadores en E. coli

puede

• Escherichia.coli tiene numerosos factores a, cada uno de los cuales provoca que la polimerasa de RNA inicie en un conjunto de promotores definido par secuencias espedficas -35 y -10. • a 70 se utiliza en la tra nscripcion general y los demas factores a son activados por condiciones especiales.

0

• La terminacion puede requerir el reconocimiento de La secuencia terminadora en el DNA y La formaci6n de una estructura en fo rma de horquilla en el producto de RNA.

La polimerasa de RNA se une a una cara del DNA

La esporulaci6n es controlada por factores

• La esporulacion divide a una bacteria en una celula madre que es desintegrada y una espora que es liberada. • Cada compartimiento avanza a la siguiente etapa de desarrollo al sintetizar a un factor cr nuevo que des plaza al factor cr anterior. • La comunicaci6n entre los dos compartimientos temporiza las sustituciones de los factores cr.

IDflil

Resumen

11 Transcripci6n

257

.

. ..

. .

Cadena codificadora

Cadena molde

TRANSCRIPCION

Transcrito de RNA

11

La secuencia de RNA es complementaria a Ia cadena molde e identica a Ia cadena codificadora

La funci6n de la polimerasa de RNA es copiar a RNA una cadena del DNA duplex.

~ronrotor

-35-10-1 +1 +10

..,.._

Proximal

Distal

Sentido Sentido ascendente descendente Una unidad de transcripci6n es una secuencia de DNA transcrita a una cadena individua l de RNA, que comienza en el promotor y finaliza en el terminador.

Dll

Introducci6n

La transcripci6n comprende Ia sintesis de una cadena de RNA que representa a una cadena del DNA duplex. Cuando se dice "que representa", lo que se quiere decir es que el RNA time una secuencia identica a una de las cadenas del DNA, Ia cual se denomina cadena codificadora. Es complementaria a la otra cadena, Ia cual es la cadena molde para su sintesis. La recapitula Ia relaci6n entre el DNA de doble Cadena y su transcrito de RNA de cadena individual. La sfntesis de RNA es catalizada por la enzima polimerasa de RNA. La transcripci6n comienza cuando la polimerasa de RNA se une a una region especial, el promotor, que se encuentra en el inicio del gen. El promotor rodea al primer par de bases que se transcribe en RNA, el punto de inicio. A partir de este punto, Ia polimerasa de RNA se desplaza a lo largo del molde, sintetizando RJ."l"A, hasta que alcanza a una secuencia terminadora (t). Esta acci6n define a una unidad de transcripci6n que se extiende desde el promotor hasta el terminador. La caracterfs258

CAPITULO 11 Transcripci6n

tica determinante de la unidad de transcripci6n, qu se describe en Ia , es que constituye u:-. fragmento de DNA expresado por media de La producci · de una sola molecula de RNA. Una unidad de transcripci6n puede incluir a mas de un gen. Las secuencias que se encuentran antes del pur:to de inicio se describen en flujo ascendente a e: aquellas que se encuentran despues del punto de iJi. cio (dentro de Ia secuencia transcrita) se encuentra: en flujo descendente a el. Convencionalmente, lc... secuencias se escriben de tal manera que Ia transcrir cion proceda de izquierda (en flujo ascendente ~ derecha (en flujo descendente). Esto corresponde a :.::. escritura del RJ."l"A.m en la direcci6n habitual 5'~3 La secuencia de DNA a menudo se escribe pa:-~ mostrar solo a Ia cadena codificadora, la cual tie ·la misma secuencia que el RNA. Las posiciones ulas bases se numeran en ambas direcciones lejos ci . punto de inicio, al cual se le asigna el valor+ l; lc numeros se incrementan a medida que avanzan eflujo descendente. A Ia base anterior a! punto de i __ cio se le asigna el numero -l, y los numeros neg=. tivos se incrementan en flujo ascendente. (No h.; ninguna base ala que se le asigne el numero 0. Al producto inmediato de Ia transcripcion se > denomina transcrito primario. Consiste en R ·.que se extiende desde el promotor hasta el tern· nador y posee los extremos originales 5' y 3'. s:. embargo, el transcrito prima rio casi siempre es ine. · table. En las procariotas, se degrada con rapidez ~ RNAm) o se divide para formar productos madur . (RNAr y RNAt). En las eucariotas, es modificado c.;: los extremos (RNAm) o dividido para formar pr .ductos maduros (todos los RNA). La transcripci6n es la primera etapa de la e· presion genica y el paso principal en el cual es c ' trolada. Las proteinas reguladoras determinan un gen particular esta disponible para ser transcf · por la polimerasa de RNA. El paso inicial (y c frecuencia el unico) en la regulaci6n es la decis· de transcribir o no a un gen. La mayorfa de los e sodios reguladores ocurren en Ia iniciacion de

=-;.cripcion, aunque en ocasiones son reguladas

_- as subsiguientes de la transcripcion (u otras eta·e la expresion genica) . .=n este contexto, surgen dos interrogantes ba_:: on respecto a la expresion genica: • e,Como encuentra la polimerasa de RNA a los promotores en el DNA? Este es un ejemplo particular de una pregunta mas general: e,Como distinguen las proteinas a sus sitios de union especfficos entre otras secuencias en el DNA? • e,Como interactuan las proteinas reguladoras con Ia polimerasa de RNA (y entre sf) para activar o reprimir pasos especfficos en Ia iniciacion, en la elongacion o en la tenninacion de la transcripcion? :::n este capitulo se analizan las interacciones de . limerasa de RNA bacteriana con el DNA des. ·..1 o inicial con un gen, a traves del · e la transcripcion, basta que es liberada cuan=- -ranscrito se ba completado. El Capitulo 12, El =- -n, describe los diversos medias par los cuales ::-::-oteinas reguladoras pueden facilitar o impedir : :a polimerasa de RNA bacteriana reconozca un - ;Jarticular para transcribirlo. En el Capitulo 13, := -A regulador, se abordan otros mecanismos ~=gulacion, como el usa de moleculas pequenas ?_ -A, y se analiza la manera como estas interac- ~s pueden ser conectadas en redes reguladoras . grandes. En el Capitulo 14, Estrategias de los o · • se estudia como las interacciones reguladoras _: :iduales pueden ser conectadas en redes . - omplejas . En el Capitulo 24, Promotores y .:':1ciadores, yen el Capitulo 25, Activacion de la - -cripci6n, se abordan las reacciones analogas en~ polimerasas de RNA eucari6ticas y sus moldes.

La transcripci6n ocurre por media de apareamiento de bases en una "burbuja" de DNA no apareado ::.:rceptos principales _a polimerasa de RNA aparta las dos cadenas de DNA :1 una "burbuja" transitaria y uti liza una cadena : )mo malde para dirigir la s\ntesis de una secuencia :)mplementaria de RNA. 2 langitud de la burbuja es -12 a 14 bp y la langitud ::l h\brida de RNA-DNA dentro de ella es de -8 a 9 bp.

·-anscripcion ocurre por media del apareamien:" bases complementarias. En la se ·-:::-a el principia general de transcripci6n. La :=sis de RNA sucede dentro de una "burbuja de

3' ..a.,;;a..&,.:L;J,.:II.:I~I.:&.~~..;&.ill..ilol~ll.il..&. El DNA es desnaturalizado

~

La sfntesis de RNA I inicia en Ia burbuja t

La cadena de RNA se extiende

Cadena codificadora

~ Cadena malde

Las cadenas de DNA se separan para formar una burbuja de transcripci6n . El RNA es sintetizado par apareamiento camplementaria de bases con una de las cadenas de DNA .

transcripcion", en Ia cual las cadenas individuales del DNA son separadas de manera transitoria y Ia cadena molde se utiliza para dirigir Ia sintesis de Ia cadena de RNA. La cadena de RNA se sintetiza del extrema 5' bacia el extrema 3'. El grupo 3'- OH del ultimo nucleotide agregado a la cadena reacciona con un nucleoside entrante 5' trifosfatado. El nucleoside entrante pierde dos de sus grupos fosfato terminales (-y y ~); su grupo a se utiliza en el enlace fosfodiester uniendolo ala caden a. La velocidad total de Ia reaccion es - 40 nucle6tidos/s a 37°C (para la polimerasa de RNA bacteriana); y es casi igual a Ia tasa de traduccion ( 15 aminoacidos/s), pero es mucbo mas lenta que la tasa de replicacion del DNA (800 bp/s) . La polimerasa de RNA crea Ia burbuja de transcripcion cuando se une a u n promotor. La muestra que a medida que Ia polimerasa de RNA se desplaza a lo largo del DNA, la burbuja se mueve con ella y la cadena de RNA crece. El proceso de apareamiento de bases y adicion de bases dentro de la burbuja es catalizado y escudrifiado par Ia enzirna. La estructura de la burbuja dentro de Ia polimerasa de RNA se muestra en Ia imagen amplificada de Ia . Conforme la polimerasa de RNA se desplaza a lo largo del molde de DNA.

11.2 La transcripci6n ocurre par medio de apareamiento de bases en una "burbuja" de DNA no apareado

259

ultimos 25 ribonucleotidos agregados a una cader.:. creciente se encu entran formando un complejo c o~ el DNA o con la enzima en un momenta dado.

1111

La reacci6n de la transcripci6r con siste en tres etapas

Conceptos principales • La polimerasa de RNA inicia la transcripci6n despues dE unirse a un sitio promotor en el DNA. • Durante La elongaci6n la burbuja de transcripci6n se despLaza a lo largo del DNA y la cadena de RNA se extiende en direcci6n 5'-3'. • Cuando La transcripci6n se detiene, el duplex de DNA se vuelve a formar y la poLimerasa de RNA se disocia e ~ un sitio de terminaci6n .

La transcripci6n tiene Lugar en una burbuja, en la cual se sintetiza RNA por media de apareamiento de bases con una cadena de DNA en la region desenrollada de mane ra transitoria. Conforme progresa la burbuja, el DNA duplex se reconstituye detras de ella, desplazando al RNA en forma de una cadena polinucleotidica individual.

Punta de enrollamiento

Sitio de union at RNA t Durante la transcripci6n, la burbuja se mantiene dentro de la polimerasa de RNA bacteriana, la cual desenrolla y enrolla aL DNA y sintetiza RNA.

desenrolla al DNA duplex frent e ala burbuja (en el punta de desenrollamiento) y enrolla al DNA por detras (en el punta de rebobinado) . La longitud de la burbuja de transcripcion es de -12 a 14 bp, pero Ia longitud de la region del hfbrido de RNA-DNA dentro de ella es mas corta. Hay un cambia importante en la topologfa del DNA que se extiende cerca de una vuelta, pero no es evidente que porcion de esta region esta de hecho pareada con el RNA en un momenta dado. Sin duda el hfbrido de RNA-DNA es cono yes transitorio. Conforme se desplaza Ia enzima, se reconstituye el DNA duplex y el RNA es desplazado como una cadena polinucleotidica libre. Aproximadamente los 260


La reaccion de la transcripcion puede dividirse las etapas que se ilustran en Ia , en lc.. cuale s se crea una burbuja, comienza Ia sfntesis c.: RNA, la burbuja se desplaza a lo largo del DNA por ultimo Ia burbuja es terminada: • El reconocimiento del molde comienza con '.:. union de Ia polimerasa de RNA a un pn. · motor localizado en el DNA de doble c.:dena para formar un "complejo cerrado Despues las cadenas de DNA se separapara formar el "complejo abierto" que de·: la cadena molde disponible para realizar ~ apareamiento de bases con los ribonucle 6c dos. La burbuja de transcripci6n se crea pc un desenrollamiento local que comienza e:el sitio en el que se une la polimerasa G~ RNA. • La iniciaci6n describe la sintesis de los pr' meros enlaces de nucle6tidos en el RNA. L enzima permanece en el promotor mier. . tras sintetiza los primeros nueve enlac de nucle6tidos, aproximadamente. La fa~ de iniciacion se prolonga por los episodi abortivos que tienen Iugar, en los cuales -' enzima forma transcritos cortos, los libe:y despues reinicia la sintesis de RNA . Lfase de iniciaci6n termina cuando la enzin- logra extender la cadena y Iibera a! pr motor. La secuencia de DNA necesaria pa ~ que la polimerasa de RNA se una al molde !ogre Ia reacci6n de iniciaci6n se denomina pr:motor. Es probable que Ia iniciacion ab o~ tiva comprenda Ia sintesis de una cadeL de RNA que abarque la totalidad del sir: activo. Si se Iibera al RNA, la iniciacion ecancelada y debe iniciar de nuevo . La ir: ciacion se logra siempre y cuando la enzi ~ se desplace a lo largo del molde para lle,·c

Ia siguiente region del DNA al interior del sitio activo. • Durante Ia elongaci6n Ia enzima se desplaza a lo largo del DNA y extiende Ia cadena creciente de RNA. A medida que Ia enzima se desplaza, desenrolla Ia helice de DNA para exponer un segmento nuevo del molde en una condicion de helice individual. Los nucleotidos son agregados de forma covalente a! extrema 3' de Ia cadena creciente de RNA lo que forma un hfbrido de RNA-DNA en Ia region desenrollada. Atras de Ia region desenrollada, la cadena de DNA que funciona como molde se aparea con su pareja original para volver a formar Ia doble helice. El RNA emerge como una cadena individual libre. La elongaci6n comprerzde el movimiento de la burbuja de transcripci6n por una interrupci6n de la estructura del DNA, en la cual la cadena molde de la region desenrollada de manera transitoria se aparea con el RNA naciente en el punta de crecimiento. • La terminaci6n implica el reconocimiento del punto en el cual no deben agregarse mas bases a Ia cadena. Para terminar Ia transcripcion, Ia formacion de enlaces fosfodiester debe cesar y el complejo de transcripcion debe separarse. Cuando se agrega Ia ultima base a Ia cadena de RNA Ia burbuja de transcripcion se colapsa a medida que el hfbrido de RNA-DNA se disocia, el DNA adquiere de nuevo su estado duplex y Ia enzima y el RNA son liberados. La secuencia de DNA necesaria para estas reacciones se denomina terminador. La elongacion tradicionalmente se aprecia como __ proceso monotono, en el cualla enzima se des.=..za bacia adelante un par de bases a lo largo del -:- ~A. por cada nucleotido agregado a Ia cadena de · . -..-\. En ciertas circunstancias ocurren cambios en :e patron, sobre todo cuando Ia polimerasa de - -_-\ hace una pausa. Un tipo de patron consiste en _e el "extrema frontal" de Ia enzima permanezca ~3 cionario mientras el "extrema posterior" con-:ll e moviendose, comprimiendo asf Ia impresion = Ia huella en el DNA. Despues del movimiento .a largo de numerosos pares de bases, el "extre frontal" es liberado, con lo que se restaura una .. resion de huella de longitud total. Esto da pie :-:nodelo de transcripcion de Ia "oruga geometra" · geometrino"), en el cual Ia enzima avanza de =~ era interrumpida, comprimiendo y liberando : manera alternada Ia impresion de huella del -..-\. Sin embargo, puede ser que estos episodios :scriban una situacion aberrante en vez de Ia trans::oon normal.

Recon ocimiento del molde: La polimerasa de RNA se une al DNA duplex

Elongaci6n: Ia polimerasa sintetiza RNA

La transcripcion sucede en cuatro etapas: la enzima se une al promotor y desnaturaliza al DNA, permanece estacionaria durante la iniciacion, se desplaza a lo largo del molde durante la elongacion y se disocia en la terminacion.

lilt

La polimerasa de RNA del fago T7 es un sistema de modelos Cttil

Conceptos pri ncipales • Las polimerasas de RNA de los fagos T3 y T7 son polipeptidos individuates con actividades minimas en el reconocimiento de un pequeiio numero de promotores de fagos. • Las estructuras cristalinas de la polimerasa de RNA T7 con DNA identifican la region de union al DNA y el sitio activo .

La existencia de polimerasas de RNA muy pequeiias, que constan de cadenas polipept:idicas individuates codificadas por ciertos fagos, ofrece una idea del mecanismo "mfnimo" necesario para Ia transcripcion. Estas polimerasas de RNA reconocen solo unos cuantos promotores en el DNA de los fagos, y no tienen la capacidad de cambiar el conjunto de promotores a los cuales responden. Proporcionan

11.4 La polimerasa de RNA del fago T7 es un sistema de modelos util

261

La lamina de especificidad ~ se une en un surco amplio

Movimiento de Ia enzima-----.. La polimerasa de RNA T7 tiene un lazo de especificidad que se une a las posiciones del promotor que se encuentran entre -7 y -11, mientras las posiciones -1 a -4 entran al sitio activo.

La polimerasa de RNA T7 reconoce su secuenc:..:. diana en el DNA uniendose a bases en el surco mayor en una posicion que se ubica en flujo ascendeJ: te desde el punto de inicio, como se muestra en : ~ F I 1. La enzima utiliza un lazo de especificida: que se forma por un Iiston ~· Esta caracterfstica c-· unica de Ia polimerasa de RNA (no se observa er las polimerasas de DNA). La cazacn:r:tstiEa ..C:.9m li ~ de todas las polimerasas de RN./<\ es que Ia enzirr:. =. reconoce bases especificas del DNA en el flujo as cendente de Ia secuencia que es transcrita . Cuando comienza Ia transcripci6n, la confo ~ maci6n de la enzima permanece esencialmem:igual mientras se agregan numerosos nucleotidos : Ia cadena molde transcrita es "triturada" en el si ti . activo. El sitio activo puede contener un transcrit. de seis a nueve nucleotidos. La transicion de lain:ciacion a Ia elongacion se define como el punto e ~ el cualla enzima comienza a desplazarse a lo larg del DNA. Esto ocurre cuando el transcrito naciem= rebasa el sitio activo e interactua con ellazo de esp ecificidad. El RNA emerge ala superficie de la enzin:c cuando se han sintetizado de 12 a 14 nucleotidoo Estas caracterfsticas son similares a aquellas exhib'das por Ia polimerasa de RNA bacteriana.

1111

La estructura cristalina sugiere un modelo de desplazamiento enzimatico

Conceptos principales Las subunidades ~ (en color azuloso) y W(en color rosa) de la polimerasa de RNA tienen un canal para el molde de DNA. La s\ntesis de un transcrito de RNA (en color cobre) acaba de iniciar; la cadena molde (en color rojo) y la cadena codificadora (en color amarillo) de DNA son separadas en una burbuja de transcripci6n. Fotografia cortes\a de Seth Darst, Rockefeller University.

sistemas de modelos simples para caracterizar Ia union de Ia polimerasa de RNA al DNA y Ia reaccion de iniciacion. Las polimerasas de RNA codificadas por los fagos relacionados T3 y T7 son cadenas polipeptfdicas individuales de <100 kD cada una . Sintetizan RNA a una velocidad de -200 nucle6tidos/s a 37°C, mayor que Ia de Ia polimerasa de RNA bacteriana. La polimerasa de RNA del fago T7 es hom6loga a las polimerasas de DNA y tiene una estructura similar, en Ia cual el DNA yace en una "palma" rodeada de "dedos" y de un "pulgar" (vease Ia Figura 18.7). Ahora se tiene una vista directa del sitio activo a partir de Ia estructura cristalina de una polimerasa de RNA del fago T7 realizando Ia transcripci6n.

262


• El DNA se desplaza por un surco de la polimerasa de RNA de las levaduras que forma una vuelta pronunciada en el sitio activo. • Un puente prote\nico cambia la conformaci6n para controlar la entrada de los nucle6tidos al sitio activo.

Ahora se tiene bastante informacion sobre la estructura y la funci6n de la polimerasa de RNA, como E. resultado de las estructuras cristalinas de las enzima..: de las bacterias y de las levaduras. Las dimensione , totale s de Ia polimerasa de RNA bacteriana son -9( x 95 x 160 A; Ia polimerasa de Rl'\l'A eucariotica e; mas grande pero menos alargada . El analisis estructural muestra que comparten un tipo de estructurc comun, en el cual hay un "canal" o surco en Ia superficie de -25 A de ancho que podrfa ser Ia ruta de . DNA. En la 1 tJ se muestra un ejemplo d<' este canal en Ia polimerasa de RNA bacteriana. L:. longitud del surco podrfa contener 16 bp en la enzima bacteriana y -2 5 bp en Ia enzima eucariotica pero esto representa solo una parte de Ia longitud. total del DNA unido durante la transcripci6n. Lc. superficie de Ia enzima tiene cargas negativas en se

r parte, pero el surco esta revestido con cargas j vas, lo que le permite interactuar con los gru: sfato del DNA cargados negativamente. ~a enzima de las levaduras es una estructura · ::::1.sa con 12 su bunidades (vease la seccion 24.2, olimerasas de RNA eucarioticas estan formadas ~ !lllmerosas subunidades). Se han localizado l 0 : ..: nidades de Ia polimerasa de RNA II de las le_J ras en la estructura cristalina, como se muestra .a FlliL . El sitio catalftico se forma por una --:: idura entre las dos subunidades grandes (#1 =- ), la cual sujeta a! DNA en flujo descendente =un par de "mandfbulas " a medida que entra .=. polimerasa de RNA. Las subunidades cuatro y : :e estan ausentes en esta estructura; forman un __ omplejo que se disocia de la enzima completa. · ~ lo general, la estructura es similar a la de la :imerasa de RNA bacteriana. Esto puede obser: :se con mayor claridad en Ia estructura cristalina ::. Ia m, . La polimerasa de RNA rodea al - :A, como se observa en la . En el siactivo se encuentra union catalftico de Mg 2+. El _ ~A es pinzado en posicion en el sitio activo por las _) unidades 1, 2 y 6. La muestra que - JNA es forzado a dar una vuelta en !a entrada al ~:o debido a Ia presencia de una pared adyacente :: protefna. La longitud del hfbrido de RNA esta _ ·rada por otra obstruccion proteinica, denomina' timon (o guia). Es probable que los nucleotidos : __rren al sitio activo desde abajo, por los poros que -:raviesan Ia estructura. La imagen ampliada del sitio activo en Ia 3 muestra que Ia burbuja de transcripcion inclu:: nueve pares de bases del hfbrido de RNA-DNA . ::.:1 donde el DNA da la vuelta, las bases que seen:- entran en flujo descendente giran hacia afu era de :. helice de DNA. A medida que la enzima se despla::.:~ a lo largo del DNA, la base que se encuentra en Ia ::Jdena molde a] inicio de la vuelta sera. girada para , e apunte al sitio de entrada de los nucleotidos. ::! extrema 5' del RNA es forzado a abandonar a! J NA cuando choca con el timon de protefna (vease ..= Figura 11.12). Una vez que el DNA ha sido desnaturalizado, .dS. cadenas individuales adquieren una estructura - exible en la burbuja de transcripcion. Esto permite :J DNA dar Ia vuelta en el sitio activo. No obstante, .illtes de que comience Ia transcripcion, el DNA de :loble cadena es una estructura recta rel_c: itivamente i gida . (.Como entra esta estructura a Ia ~etasa ;in ser bloqueada por la pared? La respuesta es que j ebe ocurrir un gran cambia de conformacion en :a enzima . Adyacente a la pared hay una pinza. :::n la forma libre de la polimerasa de Rl\l"A, esta pinza i e balancea para alejarse de Ia pared y permitir que ::1 DNA siga una ruta directa a traves de Ia enzima.

Mg++

-- 9 2

11

Sitio activo

Mandlbula

/

__.. Movimiento

8

A partir de la estructura cristalina de la polimerasa de RNA se ubican 10 subunidades. Los colores de las subunidades son los mismos que los de las estructuras cristalinas de las figuras siguientes.

La vista desde arriba de la estructura cristalina de la polimerasa II de RNA de las levaduras muestra que el DNA es sujetado en sentido descendente por un par de mand\bulas y es pinzado en la posicion adecuada en el sitio activo, el cual contiene un ion de Mg .... Fotograna cortes\a de Roger Kornberg, Stanford University School of Medicine.

La vista desde el extrema de la estructura cristalina de la polimerasa II de RNA de las levaduras muestra que el DNA es rodeado por prote\na en un area de -270° . Fotograna cortes\a de Roger Kornberg, Stanford University School of Medicine.

115 La estructura cristalina sugiere un modelo de desplazamiento enzimatico

263

Movimiento de Ia enzima

El DNA

entra a las

I I Se agrega una base nueva Y.~ rom pen los enlaces

Nucle6tidos El DNA es forzado a dar una vuelta en el sitio activo por una pared de proteina. Los nucle6tidos pueden entrar aL sitio activo a traves de un poro LocaLizado en La proteina.

EL movimiento de una polimerasa de acido _cleico requiere eL rompimiento y La reconstituci6n de enLac::. de acidos nucleicos en posiciones fijas en reLaci6n con La c.::tructura de La enzima. Los nucle6tidos que se encuentran ~ · estas posiciones cambian cada vez que la enzima se mueve u -~ base a lo largo del molde.

La vista ampLificada del sitio activo muestra la vueLta pronunciada que se encuentra en el camino del DNA.

Despues de que el DNA ha sido desnaturalizado para crear la burbuja de transcripci6n, Ia pinza debe balancearse y regresar a su posicion contra Ia pared. Uno de los dilemas de cualquier polimerasa de acido nucleico es que la enzima debe formar os estrechos con el sustrato de acido nucleico y con el producto, pero debe romper estos os y rehacerlos en cada ciclo de adici6n de nucle6tidos. Considerese la situacion que se ilustra en Ia . Una polimerasa hace una serie de os especfficos con las bases, en posiciones particulares. Por ejemplo, el o "l" se hace con la base que se encuentra en el extrema de la cadena creciente y el o "2" se hace con la base que se encuentra en Ia cadena molde que es complementaria a la siguiente base que sera agregada. Observese, sin embargo, que las bases que ocupan estas ubicaciones en las cadenas de acido nucleico cambian cada vez que se agrega un nucle6tido. 264

CAPiTULO 11 Transcripci6n

Los segmentos superior e inferior de la figu ~· muestran la misma situaci6n: una base esta por F. agregada a Ia cadena creciente. La diferencia es qt.; : esta cadena crecio una base en el segmento inferior de Ia figura. La geometrfa de ambos complejc es exactamente Ia misma, pero los os "l ,. · "2" en el segmento inferior se hacen con bases e las cadenas de acido nucleico que se localizan ur: posicion mas lejos a lo largo de la cadena. El seEmenta del centro muestra que esto debe significc.; que, despues de que la base es agregada (y antes que Ia enzima se mueva en relaci6n con el ack nucleico), los os establecidos con posicione-. especfficas deben romperse para que puedan rehc.cerse con las bases que ocupan dichas posicionedespues del desplazamiento. La estructura de la polimerasa de RNA sugiere una idea de como Ia enzima mantiene contaa con su sustrato mientras rompe y restaura enlac :: Una estructura ubicada en Ia protefna denominad.:. puente es adyacente a! sitio activo (vease Ia Figu r.:. 11 .12) . Est a caracterfstica se observa en las enzimai de las bacterias y de las levaduras, pero tiene forme. difere ntes en las estructuras cristalinas distintas. E:-:

=. esta doblada y en la otra es recta. La

sugiere que el cambio de conformaci6n de la -uctura del puente se relaciona de manera cerca:on la translocaci6n de la enzima a lo largo del _ nucleico. A.l inicio del ciclo de translocaci6n, el puente =- e una conformaci6n vertical y se encuentra ad:~nte al sitio de entrada de los nucle6tidos. Esto --::lite que el siguiente nucle6tido se una en el si:!.e entrada de los nucle6tidos. El puente esta en - :acto con el nucle6tido que acaba de agregarse. ues la protefna se desplaza un par de bases a lo ~ del sustrato. El puente cambia su conformaci6n ~ obla para mantener o con el nucle6tido · =~n agregado. En esta conformaci6n, el puente ~ ea el sitio de entrada de los nucle6tidos. Para - ~ ::zar el ciclo, el puente regresa a su conformaci6n ~..:.cal con lo que permite de nuevo el al sitio - ~:1.trada de los nucle6tidos. El puente actua como :rinquete que libera a las cadenas de DNA y de ·_..,_ para la translocaci6n al tiempo que se sujeta al = ~ mode la cadena creciente.

Silo de entrada de los nucle6tidos

La polimerasa de RNA bacteriana esta formada por mu ltiples subunidades ::_.-.cep:os principales .a.s polimerasas centrales de RNA bacterianas son :Jmplejos de subunidades multiples de -500 kD con _ a estructura general a.2 PP'. :. DNA esta unido en un canal y entra en o con .=s subunidades Py P'-

-:- limerasas de RNA mejor caracterizadas son las eubacterias, de las cuales Escherichia coli es un :lpico. Un solo tipo de polimerasa de RNA parece ~- arse de casi toda !a sfntesis de RNAm y de toda !a · .:cion de RNAr y de RNAt, en una eubacteria. Hay =..:edor de 7 000 moleculas de polimerasa de RNA __::a celula de E. coli. Muchas de ellas intervienen ~ :ranscripci6n; es probable que de 2 000 a 5 000 as esten sintetizando RNA en un momento pero el numero depende de las condiciones :-...:..:rivo. _,:: enzima completa o la holoenzima en ~ :. li tiene un peso molecular de - 46 5 kD. Las _;-~i dades que la componen se describen en la ~;

_:_as subunidades ~ y Wjuntas forman el centro :ico. Sus secuencias estan relacionadas con :...las de las subunidades mas grandes de las poli. ~-;a s de RNA eucari6ticas (vease la secci6n 24.2, J ·merasas de RNA eucari6ticas estan formadas :::'Jmerosas subunidades), lo cual sugiere que

El ciclo de elongaci6n de la polimerasa de RNA comienza con un puente recto adyacente al sitio de entrada de los nucle6tidos. Despues de la adici6n de los nucle6tidos, la enzima se desplaza un par de bases y el puente se dobla al tiempo que mantiene o con el nucleotide que acaba de agregarse. Cuando el puente es liberado, el ciclo puede comenzar de nuevo.

hay caracterfsticas comunes en las acciones de todas las polimerasas de RNA. La subunidad ~ puede entrecruzarse con el molde de DNA, con el producto de RNA y con los ribonucle6tidos de los sustratos; las mutaciones en rpoB afectan a todas las etapas de la transcripci6n. Las mutaciones en rpoC muestran que la subunidad Wtambien esta implicada en todas las etapas. La subunidad a es necesaria para el ensamblaje de la enzima centraL Cuando el fago T4 infecta a E. coli, la subunidad a es modificada por !a transferencia cl'fllna molecula ADP-ribosa a un residuo dearginina (lo\ que se conoce como ADP-ribosilaci6n de la arginipkt). La modificaci6n se relaciona con una meno~Eifinidad por los promotores que antes reconocia la holoenzima, lo cual sugiere que la subunidad a tiene cierta funci6n en el reconocimiento del promotor. La subunidad a tambien participa en !a in teracci6n de la polimerasa de RNA con algunos otros factores reguladores.

11.6 La polimerasa de RNA bacteriana esta formada por multiples subunidades

265

Gen

Producto

Funciones

rpoA

2 subunidades a (40 kD cada una)

rpoB

Subunidad ~ (155 kD)

ensamble enzimatico, reconocimiento del promotor y union a algunos activadores

rpoC

Subunidad (160 kD)

rpoD

W

t" '" " "';"

Subunidad a

(32-90 kD)

Enzima de

E. coli = 465 kD

Las polimerasas de RNA de las eubacterias tienen cuatro tipos de subunidades; a, ~ y Wtienen dimensiones bastante constantes en diferentes especies bacterianas, perc 0 varia de manera mas amplia.

ascendente

5' '3' 1\.IA0\.~~1 5'

descendente DNA RNA

La cadena molde y la cadena codificadora del DNA son adas par las subunidades ~ y Wsabre todo en la region de la burbuja de transcripci6n y en sentido descendente. El RNA es ado sobre todo en la burbuja de transcripci6n. No hay RNA en sentido descendente, excepto en el case especial que se presenta cuando la enzima se desplaza hacia atras.

La subunidad cr interviene de manera especffica en el reconocimiento del promotor, y se cuenta con mas informacion acerca de sus funciones que de las de cualquier otra subunidad (vease la secci6n 11.7, La polimerasa de RNA esta formada por la enzima central y por un factor cr). La estructura cristalina de la enzima bacteriana (vease la Figura 11.8) muestra que el canal para el DNA yace en la interfase de las subunidades ~ y V (Las subunidades a son invisibles en esta imagen.) El DNA esta desenrollado en el sitio activo, en donde una cadena de RNA esta siendo sintetizada. Los 266


experimentos de entrecruzamiento identifican l puntas en los cuales las subunidades de Ia polimerasa de RNA entran en o con el DNA. Estas :;. resumen en Ia . Las subunidades ~ y ~ entran en o con el DNA en numerosos pu:-:tos localizados en sentido descendente con respec a! sitio activo. Forman numerosos os con _ cadena codificadora en la region de la burbuja . transcripcion, lo qu e estabiliza las cadenas indi,-duales independientes. El RNA es ado sob, todo en Ia region de la burbuja de transcripcion. El medicamento rifampicina -(un miembro de familia de las rifamicinas) b)-{g_uea Ia transcripcicmediada por Ia polimerasa de RNA bacteriana. : :_ un medicamento important ara el tratamiento - la tuberculosis . La estructura cristallna de Ia po me rasa de RNA unida a Ia rifampicina explica o _ acci6n: se une a una hendidura de la silbunidad ~ a > 12 A de distancia del sitio activo, pero en uc.: posicion en la que bloquea la ruta del RNA en pr ... ceso de elongaci6n. AI impedir que Ia cadena :.RNA se extienda mas alla de dos o tres nucle6tid se bloquea la transcripci6n. Definida en un principia solo por su capacidc. : para incorporar nucleotidos en el RNA bajo la recci6n de un molde de DNA, la enzima polimera_ de RNA ahora se considera parte de un mecanisn:. mas complejo que interviene en la transcripcion. _:___ capacidad de catalizar la sintesis de RNA define al comrnente minima que puede describirse como polimerasa : RNA. Supervisa el apareamiento de bases de los r: bonucleotidos de los sustratos con el DNA y catali;:_: la formacion de enlaces fosfodiester entre ellos. Todas las subunidades de Ia polimerasa basic que participan en Ia elongacion son necesarias pa:: la iniciacion y para la terminacion. No obstante, 1:: unidades de transcripcion difieren en cuanto a ql' dependen de polipeptidos adicionales en las etap-c.:. de iniciacion y de terminacion. Algunos de estr_ polipeptidos adicionales son indispensables en todr los genes, mientras que otros se necesitan. de manera especifica para la iniciacion o para la terminaci ' en genes particulares. La analogfa con la division c Ia bores entre el ribosoma y los factores de la sfnte ~ protefnica es evidente. La polimerasa de RNA de Escherichia coli puec transcribir cualquiera de las muchas unidad de transcripcion (> 1 000). Por lo tanto, Ia enzi rr~ requiere Ia capacidad de interactuar con una variedad de funciones hospedadoras y de los fagos qv modifican sus actividades intrfnsecas de transcri:t:: . cion. Por lo tanto, la complejidad de la enzima, ;__ menos en parte, refleja su necesidad de interactuc. con factores reguladores, en vez de una demanc inherente en su actividad catalftica.

La polimerasa de RNA esta formada par la enzima central y par un factor cr ~n ceptos

La enzima central se une a cualquier secuencia de DNA

principales

• a polimerasa de RNA bacteriana puede dividirse en La enzima central a 2 ~W, la cual cataliza La transcripci6n, ye n la subunidad cr, que es necesaria solo para La iniciaci6n . El factor cr cambia las propiedades de union al DNA de La polimerasa de RNA de tal manera que su afinidad par el DNA general se reduce y su afinidad por los promotores aumenta . Las constantes de union de La polimerasa de RNA a diferentes promotores varia en alrededor de seis ordenes de magnitud, lo cual corresponde a La recuencia con la cualla transcripci6n es iniciada en cada promotor.

--.:.. ho loenzima (a 2 ~~ ' cr) puede separarse en dos 1ponentes, Ia enzima central (a2 ~Wl y el facm cr (el polipeptido cr). Solo la holoenzima puede ini· r fa transcripcion. El factor cr garantiza que la polime. ·a de RNA bacteriana se una de manera estable al DNA -- en los promotores. El "factor" cr suele ser liberado . _a odo Ia cadena de RNA alcanza ocho o nueve -=. ·es de longitud, lo que permite que el centro de Ia ::-.zima asuma Ia elongaci6n . La enzima central tiene - :apacidad de sintetizar RNA a partir de un molde de ~.-A, pero no puede iniciar la transcripcion en los sitios - ~cuados.

La enzima central tiene una afinidad general · r el DNA, en el cual la atracci6n electrostatica .. tre Ia protefna basica y el acido nucleico acido _-:-sempefia una funci6n muy importante. Cual: ..:ier secuencia (aleatoria) de DNA que se une a Ia · .imerasa central en esta reacci6n de union gene -=: se describe como sitio de union debil. Ningun ·:mbio ocurre en el DNA, el cual continua siendo . ::plex. El complejo en tal sitio es estable, con una _j a media de disociaci6n de Ia enzima del DNA de 50 min. La enzima central no distingue entre promoto-_·y otras secuencias del DNA . La fmuestra que el factor 0' intra: Jce uo cambia importante en Ia afinidad de Ia po_:nerasa de RNA por el DNA. La holoenzima tiene ;a capacidad drdsticamente reducida para reconocer los ::os de union debiles, es decir, para unirse a cualquier -:-cuencia general del DNA. La constante de asocia - ' n de la reacci6n disminuye -10 4 veces, y la vida -::.edia del complejo es <1 s. Por lo tanto, el factor cr - ::sestabiliza la capacidad general de union de forma _ uy considerable. Notese que el factor cr tambien conjiere la capaci;.,:d de reconocer sitios de union especijicos. La holoenzi-

El factor cr desestabiliza Ia union

La holoenzima se une al promotor

La enzima central se une en forma indiscriminada a cualquier secuencia de DNA . El factor cr reduce La afinidad de La union independiente de La secuencia y confiere especificidad par los promotores.

rna se une a los promotores de manera m u y firme, con una constante de asociacion incrementada (en promedio) l 000 veces con respecto a Ia de Ia enzima central y con una vida media de varias horas. La especificidad de las holoenzimas por los promotores en comparaci6n con otras secuencias es de -10 7, pero este s61o es un promedio debido a que hay una amp lia variacion en Ia velocidad con Ia cual la holoenzima se une a secuencias promotoras diferentes. Este es un para.metro importante para determinar la eficiencia de un promotor individual en la iniciaci6n de Ia transcripcion. Las constantes de uni on oscilan entre -l 0 2 y -10 6 Otros factores tam bien afectan Ia frecuencia de Ia iniciaci6n, Ia cual varfa de -lis (en los genes de RNAr) a -I /30 min (en el promotor lac!) .

1111

La asociaci6n con el fa ctor cr cambia en la iniciaci6n

Conceptos principales • Cuando La polimerasa de RNA se une a un promotor, sepa ra las cadenas de DNA para fo rmar una burbuja de transcripci6n e incorpora hasta nueve nucleotidos en el RNA.

• Puede haber un ciclo de iniciaciones abortivas antes de que la enzima avance a La siguiente fase. • El factor cr puede ser liberado de la polimerasa de RNA cuando la cadena naciente de RN A alcanza una longitud de ocho a nueve bases.

11.8 La asociaci6n con el factor cr cambia en la iniciacion

26 7

Holoenzima Constante de equilibria

.t-: ; Union al DNA

Ks = 106-109 M- 1

Complejo binario cerrado Constante de velocidad k2 = 10-3-10-1 s-1 C()mplejo binario abierto Constante de velocidad

k;- 10-3 s-1 Complejo ternario

Liberaci6n de cr

Despeje del promotor 1-2 s Comienza Ia sintesis de RNA

La polimerasa de RNA atraviesa par numerosos pasos antes de la elongaci6n. Un complejo binario cerrado se transforma en un complejo abierto y luego en un complejo ternario.

Ahora se pueden describir las eta pas de Ia transcripcion en terminos de las interacciones entre las diferentes formas de polimerasa de RNA y del molde de DNA. La reaccion de iniciacion puede describirse con los parametros que se resumen en Ia • La reaccion holoenzima-promotor comienza al formarse un complejo binario cerrado. "Cerrado" implica que el DNA sigue siendo duplex. La formacion del complejo binario cerrado es reversible; por lo tanto, suele describirse por una constante de equilibria (K8 }. Hay un intervalo amplio de valores de la constante de equilibria para formar el complejo cerrado. • El complejo cerrado se transforma en un complejo abierto cuando se "desnatura liza" una region corta de DNA dentro de la secuencia ala que se ha unido Ia enzima. La serie de eventos que conducen a la formacion de un complejo abierto se denomina union fuerte. En el caso de los promotores fuertes, la conversion a un complejo binario abierto es irreversible, por lo que esta reaccion se describ e por medio de una constante de velocidad (kJ. Esta reaccion es rapida. 268


El factor cr participa en la reaccion de des· naturalizacion (vease la seccion 11.16, l .=. sustitucion de los facto res cr puede controla~ la iniciacion). • El siguiente paso es incorporar los primerO' dos nucleotidos; entre ellos se forma un enlace fosfo diester. Esto genera un complej< ternario que contiene RNA, DNA y la en zima. La formacion del complejo ternario st: describe por medio de la constante de veloci· dad k.; esta es incluso mayor que la constal1 · te de ~elocidad k2 • Pueden agregarse mas nu· cle6tidos sin ningun movimiento enzimaticc para generar una cadena de RNA de hasrnueve bases. Despues de que se agrega cado. base, hay cierta probabilidad de que la enzi· rna libere a la cadena. Esto comprende un.;. iniciaci6n abortiva, despues de la cualla enzima comienza de nuevo con la primer.; base. Por lo gene ral, hay un ciclo de iniciaciones abortivas que generan una serie de oligonucleotidos muy cortos. • Cuando la iniciaci6n es exitosa, el factor G deja de ser necesario, y la enzima realiza lc: transicion al complejo ternario de elongacion de polimerasa central-DNA-RNA naciente. El parametro fundamental en este suceso es cuanto tiempo requiere la polimerasc: para dejar el promotor de modo que otra pGli· merasa pueda iniciar. Este parametro es e: tiempo de despeje del promotor; su valor minimo de 1 a 2 s establece que la frecuencia maxima de iniciaci6n es menor a un episodio por segundo. Luego la enzima se desplaza a lo largo del molde y la cadena de RNA se extiende mas alla de 10 bases. Cuando la polimerasa de RNA se une al DNA la dimension elongada de la protefna se extiende a lo largo del DNA, pero ocurren algunos cambios morfol6gicos interesantes durante la transcripci6n. Las transiciones de forma y de tamaiio originan tres I formas del complejo, como se ilustra en la • Cuando Ia polimerasa de RNA en forma de holoenzima se une en un inicio al DNA, cubre unas 75 a 80 bp y se extiende de -55 a +20. (La larga dimension de Ia polimerasa de RNA [160 A] podrfa abarcar -50 bp de DNA en forma extendida, lo cual implica que la union de un fragmento mas largo de DNA debe suponer algun plegamiento del acido nucleico. ) • La forma de Ia polimerasa de RNA cambia en la transici6n de la iniciacion a la elongacion. Esto se asocia ala perdida de os en la region que abarca de-55 a -3 5, lo que

deja solo -60 bp de DNA cubiertas por Ia enzima. Esto coincide con el concepto que indica que Ia parte que se encuentra mas distante del promotor en sentido ascendente interviene en el reconocimiento inicial por parte de la polimerasa de RNA, pero no es indispensable en las {tltimas etapas de la iniciaci6n (vease la secci6n 1 1.13, La efi ciencia de los promotores puede incrementar o disminuir por media de mutaciones). • Cuando la cadena de RNA se extiende de 15 a 20 bases, la enzima realiza una transici6n posterior para formar el complejo que se hace cargo de la elongacion; ahara abarca de 30 a 40 bp (de acuerdo con Ia etapa del ciclo de elongacion). Ha sido un dogma de la transcripcion, desde poco -:--·pues de su descubrimiento, que el factor a es licrado despues de Ia iniciaci6n. Es posible que esto sea del todo cierto. Las mediciones directas de ; complejos de polimerasa de RNA en proceso : elongaci6n muestran que -70% de ellos retiene - .actor a. Un tercio de las polimerasas en proceso 7 elongaci6n carecen de a; por lo tanto, Ia concluSn original, la cual afirma que no es indispensable ~ra la elongacion, es sin duda correcta. En los casos .-_los que permanece asociado a la enzima central, casi seguro que Ia naturaleza de la asociacion h a ...: mbiado (vease Ia seccion ll.ll , El factor a controla ..: ·1ni6n al DNA).

Una polimerasa de RNA varada puede rei niciar la transcri pci6n

El complejo de iniciaci6n incluye al factor cr y cubre de 75 a 80 b

-50 -40 - 30 -20 -1 0 1 +H) +20 +30 El complejo de elongaci6n inicial se forma cuando Ia cadena de RNA se ex1iende 10 bases, puede perder a cry deja de hacer os desde Ia posicion -35

h~

-50 -40 -30 -20 -10 1 +10 +20 +30 El complejo de elongaci6n general se forma cuando Ia cadena de RNA se extiende de 15 a 20 bases y abarca de 30 a 40 bp

- 50 -40-30-20 -10 1 +10 +20 +30

La polimerasa de RNA en un inicio hace o con la region -50 a +20. Cuando se disocia a , La enzima central hace o desde la posicion -30; cuando la enzima se desplaza pocos pares de bases, se organiza de forma mas compacta en el complejo de elongaci-on general.

Concepto principal • Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la transcripcion al separar el transcrito de RNA para generar un extreme 3' nuevo. _a polimerasa de RNA debe estar en condiciones de =:anejar situaciones en las que se bloquea Ia trans-- ·pci6n. Esto puede suceder, par ejemplo, cuando .: DNA ha sido dafiado. Un sistema modelo de di- .as situaciones Ia proporciona Ia interrupcion de ..:. elongacion in vitro a! omitir uno de los nucleoti~ s pre curs ores necesarios. Cuando el n ucle6tido =.!tante es restaurado, Ia enzima puede superar el : queo al dividir el extrema 3' del RNA para crear ....1 extrema 3' nuevo para la elongaci6n de Ia cade- a. La division implica a factores rios ademas --= Ia enzima. En el caso de la polimerasa de RNA de ~- coli, las proteinas GreA y GreB liberan ala poli-:erasa de RNA de Ia interrupci6n de la elongacion. ~:1 las celulas eucari6ticas, la polimerasa de RNA II :-=quiere un factor rio (TF 0 S), el cual permite

a Ia polimerasa separar unos cuantos ribon ucleotidos del extrema 3' del producto de RNA. El sitio catalltico de Ia polimerasa de RNA realiza Ia division en cada caso. Las funciones de GreB y de TF 0 5 son convertir el sitio catalftico de Ia enzimas en un sitio ribonucleolftico. Aunque no hay homologfa en Ia secuencia de los factores, las estructuras cristalinas de sus complejos con las polimerasas de RNA respectivas sugieren que funcionan de manera similar. Cada uno de los factores inserta un dominio proteinico angosto (en un caso una cinta de cine, y en el otro una helice superenrollada) de manera profunda en Ia polimerasa, en donde termina en el interior del sitio cata!ftico. El dominio insertado coloca dos aminoacidos acidos cerca del ion de magnesia catalitico primario del sitio activo; esto permite la introducci6n de un segundo ion de magnesia, el cual convierte el sitio catalftico en un sitio ribonucleolftico. Esta reacci6n puede deberse a que Ia demora provoca que el molde sea posicionado de manera

11.9 Una polimerasa de RNA varada puede reiniciar la transcripcion

269

incorrecta, de tal forma que el extremo 3' ya no se localiza en el sitio activo. La division y el retroceso son necesarios para colocar el extremo en Ia ubicaci6n correcta para la adicion de mas bases. Por lo tanto, se observa que Ia polimerasa de RNA tiene las capacidades de desenrollar y de rebo binar el DNA, de sujetar el producto de RNA y las cadenas del DNA separadas, de catalizar Ia adicion de ribonucle6tidos a la cadena creciente de RNA y de ajustarse a dificultades en el proceso al separar el producto de RNA y reiniciar la sfntesis de RNA (con Ia ayuda de algunos facto res rios) .

500-1 000

holoenzimas

-.,.J _~~1~~V~~~t~~b'1l~ en complejos promotores

- 2 500

enzimas centrales implicadas en Ia transcripci6n La enzima central y la holoenzima estan distribuidas en el DNA y muy poca polimerasa de RNA se encuentra en estado libre.

La constante de velocidad hacia delante de la union de la polimerasa de RNA a los promotores es mas veloz que la difusi6n aleatoria.

270


IlEa

(C6mo encuentra una polimerasa de RNA las secuencias promotoras?

Conceptos principales • La velocidad con la cualla polimerasa de RNA se une : los promotores es demasiado alta para que la justine_, la difusi6n aleatoria. • Es probable que la polimerasa de RNA se una a sitios aleatorios del DNA y los intercambie por otras secuencias con bastante rapidez hasta que encuentr2 un promotor.

(.Como se distribuye Ia polimerasa de RNA e . celula? Una imagen (un tanto especulativa) de l.:o tuacion de la enzima se ilustra en Ia 1 • El exceso de enzima central existe en r medida en forma de complejos cerrados biles porque Ia enzima entra en ellos c mucha rapidez y los abandona con lentir_ Hay muy poca enzima centrallibre, si es c:;· Ia hay. • Hay suficiente factor a para que cerca . un tercio de las polimerasas existan co:-:holoenzimas y estas se distribuyen e.-complejos debiles localizados en sitios :: especfficos y complejos binarios (en su c ...: yor parte cerrados) en los promotores. • Cerca de Ia mitad de las polimerasas de ~ consisten en enzimas centrales que inten~ nen en la transcripcion. • (.Que cantidad de holoenzimas se encu e~ tran en forma libre? Se desconoce Ia rc-. puesta, pero se sospecha que la cantidad muy pequefia. La polimerasa de RNA debe encontrar promo~ res dentro del contexto del genoma. Supongase cr-un promotor es un fragmento de -60 bp. (.Como "distingue de las 4 x l 06 bp que forman el genoc de E. coli? Las tres figuras siguientes ilustran el pr·-cipio de algunos modelos posibles. La muestra el modelo mas sencL para la union con el promotor, en el cual la po;_merasa de RNA se desplaza por difusion aleatof.~ Con rapidez, la holoenzima se asocia a los sitios cunion debiles y se disocia de ellos. De tal mane . :. puede continuar formando y rompiendo una ser. de complej os cerrados hasta que (por probabilidac encuentra un promotor, y el reconocimiento de :_c secuencia especffica permitira la union firme mediante la formacion de un complejo abierto. Para que la polimerasa de RNA se desplace ci:: un sitio de union del DNA a otro, debe disociarse del primer sitio, encontrar el segundo sitio y de ~ pues asociarse a el. El desplazamiento de un siti .

tro esta limitado por la velocidad de difusion a --o ves del medio. La difusion establece un lfmite . erior <1 08 M- 1 s- 1 para la constante de velocidad -:: asodacion a una secuencia diana de 60 bp. Sin bargo, Ia constante de velocidad real de algunos - motores in vitro parece ser de -10 8 M- 1 s- 1, en el ite de difusion o por encima de eL Si este valor : aplica in vivo, el tiempo necesario para los ciclos :-a1orios de asociacion y disociacion sucesivas en · sitios de union debiles es excesivo para justificar - ·orma en Ia cualla polimerasa de RNA encuentra _promotor. Por lo tanto, Ia polimerasa de RNA debe utilizar :ros medios para encontrar sus sitios de union. La R muestra que el proceso podrfa acele-~ rs e si la diana inicial deJa polimerasa de RNA es =- genoma completo, no solo una secuencia promo:ra especffica. AI incrementar las dimensiones de ..:. diana, la constante de velocidad para Ia difusion : ::1. el DNA incrementa proporcionalmente y deja de : r una limitante. Si esta idea es correcta, una polimerasa de RNA ":lre se une al DNA y despues permanece en contaccon el. ,:.Como se desplaza Ia enzima de un sitio _:: union aleatorio (debil) del DNA a un promotor? :::: modelo mas probable es suponer que !a secuen.::a de union es desplazada en forma directa por :Ta secuencia. Una vez sujeta al DNA, Ia enzima _.tercambia esta secuencia por otra secuencia muy ::-:ipido y continua intercambiando secuencias hasta ~ue encuentra un promotor. Luego Ia enzima for-:-.a un complejo abierto y estable, despues de lo cual JCede Ia iniciaci6n. El proceso de busqueda se hace ucho mas rapido debido a que Ia asociacion y Ia .Jsociacion son virtualmente simultaneas y no se : esperdicia tiempo intercambiando sitios. El des:lazamiento directo puede proporcionar un "movi::~iento dirigido", en el cual la enzima se desplaza de :-:1anera preferente de un sitio debil a un sitio mas

La polimerasa de RNA enfrenta un dilema para reconciliar sus necesidades para la iniciacion y Ia elongacion. La iniciacion requiere una union fuerte solo con secuencias particulares (promotores), mientras que Ia elongacion requiere una asociacion fuerte con todas las secuencias que la enzima encuentre durante Ia transcripcion. La ilustra como se resuelve el dilema por medio de Ia asociacion reversible entre el factor 0 y Ia enzima central. Como se m enciono antes (vease Ia seccion 11.8, La asociacion con el factor 0 cambia en Ia iniciacion), el factor 0 es liberado despues de Ia iniciacion o cambia su asociacion con la enzima central de tal manera que ya no participa en Ia union al DNA. Hay menos moleculas de factor 0 que de enzima central; por lo tanto, el uso de Ia enzima central requiere e] reciclaje de 0. Esto ocurre inmediatamente despues de Ia iniciacion (como se muestra en Ia figura) en cerca de un tercio de los casos; se supone que 0 y Ia enzima central se disocian en un momento posterior en los demas casos.

El intercambio con el promotor puede ser rapido

...: y. :?

.~ erte.

Otra idea supone que la enzima se desliza a lo .argo del DNA en una caminata aleatoria de una ~ !a dimension, como se muestra en Ja :· se detiene solo cuando encuentra un promotor. Sin embargo, no hay pruebas de que Ia polimerasa de RNA (u otra protefna de union a! DNA) pueda ~uncionar de esta manera .

La polimerasa de RNA se une de manera muy rapida a secuencias de DNA aleatorias y podr\a encontrar un promotor por desplazamiento directo de la secuencia de union del DNA.

El factor a controla la union al DNA Concepto principal • Un cambia en la asociaci6n entre el factor cr y la holoenzima modifica la afinidad de union par el DNA de tal manera que la enzima central puede desplazarse a lo largo del DNA.

FIGURA 11

La polimerasa de RNA no se desliza par el DNA. 11.11 El factor cr controla la union al DNA

2 71

Rapido~

t

Lento : Enzima central : almacenada en : el DNA

; El factor a se : asocia a Ia ; enzima central

Muy rapido

~ ; : : ;

La holoenzima se desplaza hacia los promotores

; La enzima :central ; sintetiza RNA

El factor a y la enzi ma central se reciclan en puntas diferentes durante la transcripci6n.

A pesar de Ia sincronizacion exacta de su liberacion de Ia enzima centraL el factor a interviene solo en la iniciacion. Se hace innecesario cuando la iniciacion abortiva concluye y la sfntesis de RNA ha logrado iniciarse. Se desconoce si el estado de la polimerasa cambia porque se supera Ia iniciacion abortiva o si, por el contrario, es el cambio de estado el que finaliza la iniciacion abortiva y p ermite que comience la elongacion. Cuando el factor a es liberado de Ia enzima centraL queda disponible de inmediato para ser utilizado por otra enzima central. Sin importar si el factor 0 es liberado o permanece aso ciado con mayor debilidad a Ia enzima centraL esta ultima esta unida con bastante fuerza al DNA en el complejo ternario. Esencialmente esta "encerrada" hasta que se completa !a elongacion. Cuando finaliza la transcripcion, Ia enzima central es liberada. Entonces se "almacena" uniendose a un sitio debil del DNA. Si ha perdido su factor a, debe encontrar otro para emprender un nuevo ciclo de transcripcion. La enzima central tiene una afinidad intrfnseca alta por el DNA, Ia cual se incrementa en la presen272


cia de un RNA naciente. Sin embargo, su afinido · por los sitios de union debiles es muy alta para per mitir que la enzima distinga de manera eficaz 1 promotores entre las otras secuencias. AI reducir ..:_ estabilidad de los complejos debiles, el factor a per. mite que el proceso ocurra mucho mas rapido; y : estabilizar la asociacion en los sitios de union fuertl"' el factor conduce la reaccion de manera irreversib:: bacia la formacion de complejos abiertos. Cuando ·~ enzima Iibera el factor 0 ( o cambia su asociacion c el), vuelve a tener una afinidad general por tod el DNA, sin importar la secuencia, que le permi: : continuar con Ia transcripcion. ;_Que controla Ia capacidad de Ia holoenzima pa;::. unirse de manera especffica a los promotores? E factor a tiene dominios que reconocen al DKpromotor. Como un polipeptido independiente, c factor 0 nose une al DNA. pero cuando Ia holoer.zima forma un complej o de union fuerte, a emE en o con el DNA en Ia region localizada e:sentido ascendente con respecto al pun to de inici Esta diferencia se debe a un cambio en la conform;:;cion del factor a cuando se une a Ia enzima centro... La region terminal N del factor a libre suprime ~ actividad de la region de union al DNA; cuando a S,: une a la enzima central, esta inhibicion es liberad: y puede unirse de manera espedfica a las secuer.cias promotoras (vease tambien la Figura 11.35 d _ Ia seccion 11.17). La incapacidad del factor 0 libr::de reconocer las secuencias promotoras puede s importante: si 0 pudiera unirse libremente a los promotores, podrfa bloquear Ia iniciacion de la tram cripcion mediada por la holoenzima.

111:1

El reco nocimiento del promotor depende de las secuencias de consenso

Conceptos principales • Un promotor es defi nido por la presencia de secuencias de consenso cortas en localizaciones espec\ficas. • Las secuencias de consenso promotoras estan formadas por una purina en el punta de inicio, por el hexamero TATAAT centrado en -10, y por otro hexamero centrado en -35. • Los promotores individuales suelen diferir del consenso en una o mas posiciones.

Al ser una secuencia de DNA cuya funcion es s.:reconocida por ciertas proteinas, un promotor difiere · ~ las secuencias cuyo papel es ser transcritas o traduc:das. La informacion para la funci6n del promotor:; proporciona de manera directa la secuencia de DN.-!_ su estructura es la senal. Este es un ejemplo clasic

· ..:n sitio de actuacion en cis, como se definio antes .a Figura 2.16 y en Ia Figura 2.17. En contras_as regiones expresadas adquieren su significado despues de que la informacion es transferida a - 3. forma de acido nucleico 0 protefna. Una pregunta fundamental en la exploracion de .::reraccion entre la polimerasa de RNA y su pro· :or es, (_Como reconoce la protefna una secuenromotora especffica? (.Tiene la enzima un sitio -:. ':o que distingue Ia estructura qufmica de una ~ encia particular de bases en el DNA de doble he.:. .., (_Que tan especfficos son sus requerimientos? Una manera de disefiar un promotor podria -:-istir en una secuencia particular de DNA que _ ceconocida por !a polimerasa de RNA. Cada pro:or estarfa formado por, o al menos incluirfa, esta .:.1 encia. En el genoma bacteriano, la longitud mf-,a que podria proporcionar una sefi.al adecuada .-:a de 12 bp . (Es probable que ocurra alguna se.o:'ncia mas corta, solo por casualidad, con suficienc :recuencia para proveer sefiales falsas. La longitud ima necesaria para el reconocimiento exclusivo - ""'1 enta con el tamafio del genoma.) La secuencia 12 bp no necesita ser contigua. Si un numero ~ cffico de pares de bases separa dos secuencias ~S!a ntes mas cortas, SU longitud combinada po.a ser menor a l2 bp, debido a que la misma dis:.·ia de separacion ofrece una parte de la sefial d uso si Ia secuencia intermedia es irrelevante). Los intentos por identificar las caracterfsticas del - ·_-\.que son necesarias para la union de la polime. ;;a de RNA iniciaron al comparar las secuencias de =-:intos promotores. Toda secuencia esencial de nu~ - tidos debe estar presente en todos los promotores; - :iice que clicha secuencia esta conservada. Sin em.-:go, no es necesario que una secuencia conservada _'lcida en cada una de las posiciones; se permite ~-:-ta variacion. (_Como se analiza una secuencia de _ -_-\para determinar siesta lo suficientemente con:-.-ada para constituir una sefi.al reconocible? Los presuntos sitios de reconocimiento del DNA _;>den definirse como una secuencia idealizada que resenta !a base que esta presente con mayor fre_-::-ocia en cada posicion. Una secuencia de con~::tso consiste en Ia alineacion de todos los ejemplos ;)Ocidos para aumentar a] maximo SU homo!ogfa . .:.::-a que una secuencia sea aceptada como consenada base particular debe predominar de mane~ ~azonable en su posicion y la mayor parte de los -::nplos debe relacionarse con el consenso por solo -.a o dos sustituciones. La caracterfstica sobresaliente de Ia secuencia de _ promotores de E. coli es que no hay una conserva : extensa de secuencia en los 60 bp asociadas a la
_

fragm entos cortos dentro del promotor estan conservados y son determinantes para su funcion. La conservacion solo de secuencias de consenso muy cortas es una caracterfstica tfpica de los sitios reguladores (como los promotores) en los genomas de los organismos procarioticos y eucari6ticos. Hay cuatro (tal vez cinco) caracteristicas conservadas en un promotor bacteriano: el punto de inicio, Ia secuencia -10, Ia secuencia-3 5, Ia separacion entre las secuencias -10 y -35 y (en ocasiones) el elemento UP: • El punto de inicio casi siempre (>90% de las veces) es una purina. Es frecuente que el punto de inicio sea Ia base central de Ia secuencia CAT, pero Ia conservacion de este triplete no es lo suficientemente representativa para considerarlo como una sefial obligatoria. • AI !ado del punto de inicio en sentido ascendente, en casi todos los promotores es reconocible una region de 6 bp. El centro del hexamero en general se localiza a unos 10 bp en sentido ascendente con respecto a! punto de inicio; en los promotores conocidos, la distancia varia de -18 a -9 . Debido a su localizacion, el hexamero a menudo es denominado sec uencia -1 0. Su secuencia de consenso es TATAAT y puede describirse de Ia siguiente manera: Tso A9s T4s A6o Aso T96 en donde el subfndice denota el porcentaje de apariciones de Ia base observada mas a menudo, el cual varia de 45 a 96%. (Una posicion en la cual no hay una preferencia discernible por ninguna base se indica con Ia letra N. ) Si !a frecuencia de apariciones indica una importancia probable en la union de Ia polimerasa de RNA, se esperarfa que las bases TA iniciales, altamente conservadas, y Ia base T final, casi por completo conservada, de la secuencia -10 fueran las bases mas importantes. • Otro hexamero conservado se centra a -3 5 bp en sentido ascendente desde el punto de inicio. A este se le denomina se cu encia -35. La secuencia de consenso es TTGACA; en forma mas detallada, Ia conservacion es: Ts2 Ts4 G7s A6s cs4 A4s • La dis tan cia que separa los sitios -10 y -3 5 es de entre 16 y 18 bp en 90% de los promotores; en los casos excepcionales, llega a ser de apenas 15 bp o de hasta 20 bp. Aunque fa secuencia de la region intermedia no es importante, Ia distancia es crucial para que los dos sitios consen'en la separacion adecuada para fa geometrfa de Ia polimerasa de RNA.

11.12 El reconocimiento del promotor depende de las secuencias de consenso

273

Punta de inicio -10

-35 TTGACA

16-19 bp

TATAAT

I

5-9 bp

Un promotor t\pico tiene tres componentes, que son las dos secuencias de consenso loca lizadas en -35 y en -10 y el punta de inicio.

• Algunos promotores tienen una secuencia abundante en A-T localizada mas lejos en sentido ascendente. A esta se le denomina elemento UP. Interactua con Ia subunidad a de Ia polimerasa de RNA. Suele encontrarse en los promotores que se expresan de manera amplia, como los promotores de los genes de RNAr. El promotor 6ptimo es una secuencia formada por el hexamero -35 , separada por 17 bp del hexamero -10, postrandose a 7 bp en sentido ascendente del punta de inicio. En Ia se ilustra Ia estructura de un promotor y muestra el intervalo de variacion permitido a partir de este parametro optima.

lllll

La eficiencia de los promotores puede incrementar o disminuir por medio de mutaciones

Conceptos principales • Las mutaciones lentificadoras que disminuyen la eficiencia de un promotor a menudo reducen la adaptaci6n a las secuencias de consenso, mientras que las mutaciones aceleradoras tienen el efecto contrario. • Las mutaciones que se presentan en la secuencia -35 suelen afectar la union inicial de la polimerasa de RNA. • Las mutaciones localizadas en la secuencia -10 a menudo influyen en la reacci6n de desnaturalizaci6n que convierte un complejo cerrado en uno abierto.

Las mutaciones son una fuente importante de informacion de Ia funci6n de los promotores. Las mutaciones de los promotores afectan el nivel de la expresion de los genes que controlan sin alterar los productos genicos. La ma yo r parte es identificada como mutantes bacterianos que perdieron, o redujeron en gran medida, Ia capacidad de transcripcion de los genes adyacentes. Se conocen como mutaciones lentificadoras. Con menor frecuencia, se encuentran mutantes en los que Ia transcripci6n aumenta por el promotor. Estas son mutaciones aceleradoras. Es importante recordar que las mutaciones "aceleradoras" y "lentificadoras" se definen de acuerdo 274


a Ia eficiencia habitual con la cual funciona un pm· motor particular. Esto varia mucho. Por lo tanto, us cambia identificado como una mutacion lentificado· ra en un promotor podrfa nunca haberse aislado e ·_ otro promotor (el cual en su estado silvestre podrfc ser incluso menos eficiente que Ia forma mutame del primer promotor). La informacion adquirida e::_ estudios in vivo tan solo identifica Ia direccion glob del cambia provocado por Ia mutacion . c.El promotor mas eficaz es aquel que tiene 1<15 secuencias de consenso reales? Esta expectativa su ge de Ia sencilla regia que afirma que las mutacion _ aceleradoras por lo general incrementan Ia homo! gia con una de las secuencias de consenso o acortar Ia distancia entre elias a 17 bp. Las mutaciones lentificadoras casi siempre disminuyen Ia semejanza de: cualquiera de los sitios con respecto a las secuenci<e de consenso o incrementan la distancia entre ellos :_ mas de 17 bp. Las mutaciones lentificadoras tiender a concentrarse en las posiciones mucho mas conservadas, lo cual confirma su importancia particulacomo el determinante principal de la eficiencia deo un promotor. Sin embargo, hay excepciones ocasiC'nales a estas reglas. Para determinar los efectos absolutos de las mutaciones de los promotores, se debe medir in vitro l2. afinidad de la polimerasa de RNA por los promotores mutantes y de tipo Silvestre. Hay una variaci6:-_ cercana a l 00 veces en Ia velocidad a la cualla polimerasa de RNA se une a promotores diferentes i-~ vitro, lo cual se correlaciona bien con las frecuencic.de Ia transcripci6n que se observa cuando sus gene' correspondientes se expresan in vivo. Si se profund:za mas en este analisis, se puede investigar Ia etap.:. en Ia cual una mutaci6n influye en la capacidad d promotor. (.Cambia la afinidad del promotor por h polimerasa de RNA? c. Queda Ia enzima con capacidad de unirse pero es incapaz de iniciar? c.Se altere Ia influencia de un factor rio? AI medir las constantes cineticas de la formacion de un complejo cerrado y de su conversion -: un complejo abierto, como se define en la Figure l L 19, se pueden analizar las dos eta pas de la rea cci6n de iniciaci6n : • Las mutaciones lentificadoras de la secuencia -35 reducen la ve locidad de Ia formaoi6r. de los complejos cerrados (reducen Ia K8 pero no inhiben su conversion en un corr.plejo abieno. • Las mutaciones lentificadoras en la secuenc' -10 no afeaanla formad6n inidal de un corr_plejo cerrado, pero hacen mas lenta su conversion en Ia forma abierta (reducen la k2 ). Estos resultados sugieren el modelo que se muestra en Ia ' '7 . La funcion de la secuencia-3= es proporcionar la sefial de reconocimiento para !c.

Complejo polimerasa de RNA-promotor parcial mente atacado par Ia DNAasa I

DNA aislado y desnaturalizado en cadenas j individuales !

/'1'/'11 .

I I'/ I I' • 2. El complejo cerrado se forma en una region promotora

• I .

3. La desnaturalizacion en Ia region

' / ' I /'1'1 .

-1 0 transforma el complejo a su forma abierta

~

J La secuencia -35 se utiliza para el reconoci- 'ento inicial y la secuencia -10 se utiliza en la reacci6n de :=.snaturalizaci6n que transforma un complejo cerrado en un :::nplejo abierto. ~l irnerasa de RNA, mientras que la secuencia -10 , rmite al complejo pasar de Ia forma cerrada a Ia : rma abierta . Se puede considerar que la secuencia - 35 constituye un "dominio de reconocimiento", -:.ientras que la secuencia - l 0 es un "dominio de _:>senrollamiento" del promotor. La secuencia de consenso del sitio -10 esta for -:::ada de manera exclusiva por pares de bases A-T, ~ a configuraci6n que ayuda ala desnaturalizaci6n .::.icial de las cadenas individuales del DNA duplex. -.a menor cantidad de energfa necesaria para sepa·.:.r los pares A-T en comparaci6n con la requerida -.u a romper los enlaces de los pares G-C indica que __ fragmento de pares A-T demanda Ia cantidad rni~ma de energfa para la separaci6n de las cadenas. La secuencia ubicada alrededor del pun to de ini :' influye en el episodio de la iniciaci6n. La region :-jcial transcrita (de +1 a +30) afecta la velocidad a . :. cualla polimerasa de RNA despeja al promotor por lo tanto, tiene cierto efecto sobre la fuerza · :>1 promotor. En consecuencia, Ia fuerza global de _'l promotor no puede predecirse por completo por s secuencias de consenso -35 y -10. Un promotor "tfpico" se vale de sus secuencias - :~ 5 y -10 para ser reconocido porIa polimerasa de :_'A, pero una de las dos secuencias esta ausente : .. ciertos promotores (excepcionales). En algunos ::: estos casos, el promotor no puede ser reconocido lo por la polimerasa de RNA; Ia reacci6n requiere - ~otefnas auxiliares, las cuales superan la deficien- a en la interacci6n intrfnseca entre la polimerasa .-: RNA y el promotor.

____.ELECTRO FOR ESIS / DNA etiquetado en __ _ un ex1remo de una -de las cadenas GEL EXPERIMENTAL

Las bandas ausentes identifican el sitio de union

; u: o mas distante con respecto al ex1remo etiquetado GELDE CONTROL

== El DNA no unido a == Ia polimerasa == presimta bandas == en las posiciones == correspondientes == a los cortes en cada uno de los == enlaces Punta mas cercano al ex1remo etiquetado

=

La impresi6 n de hu ellas identifica los sitios de uni on de las protelnas al DNA por su protecci6n contra la formaci6n de mellas .

La poli me rasa de RNA se une a una cara del DNA Conceptos principales • Las secuencias de consenso localizadas en - 35 y - 10 proporcionan la mayor parte de los puntas de o para la polimerasa de RNA en el promotor. • Los puntas de o se encuentran en una de las caras del DNA.

La capacidad de Ia polimerasa de RNA (o, de he cho, de cualquier proteina) para reconocer el DNA puede caracterizarse por medio de imp r esion de huellas. Una secuencia de DNA unida a Ia proteina es digerida de manera parcial con una endonucleasa que rompe los enlaces fosfodiester individuales en el interior del acido nucle ico. En condiciones apropiadas, un enlace fosfodiester particular se rompe en algunas moleculas de DNA, pero no en todas . Las posiciones que son cortadas se reconocen mediante 11.14 La polimerasa de RNA se une a una cara del DNA

275

Secuencia -1 o

Secuencia -35

~

~

~ ~ ii i

IDU~ U~

HJ-UHi

TTGACA

-

!!t!tlt AACTGT

H

Punta de inicio

A A TL'f.,'X::XA

T AT

Cadena

lJ!l !1 l ~~~:~~~~: ATA

tt

t t

t

i il ~

Cadena molde

TT AX X X X

tt

i

iento

t

It

La mayor parte de los puntas de o se encuentra en uha cara del DNA (en Ia cadena codificadora)

....

.!. Modificaciones que impiden

que se una Ia polimerasa de RNA

.!. Sitios en los cuales Ia polimerasa de RNA brinda protecci6n contra las modificaciones

t Mutaciones que eliminan o disminuyen Ia actividad del promotor Una cara del. promotor contiene los puntas de o para el RNA.

DNA etiquetado en una cadena en un solo extremo. El principia es el mismo que rige la secuenciacion del DNA: la division parcial de una molecula etiquetada en un extremo en un sitio susceptible crea un fragmento de longitud (mica. Como se puede observar en la despues del tratamiento con la endonucleasa, los fragmentos de DNA son recuperados y sometidos a electroforesis en un gel que los separa de acuerdo con su longitud. Cada fragmento que retiene un extrema etiquetado produce una banda radioactiva. La posicion de la banda corresponde al numero de bases que tiene el fragmento. Los fragmentos mas cortos se desplazan con mas rapidez, por lo que la distancia del extremo etiquetado se cuenta a partir del fondo del gel. En un DNA libre, cada posicion de enlace susceptible se rompe en una u otra molecula. Sin embargo, cuando el DNA forma un complejo con una proteina, la region cubierta por la proteina de union al DNA esta protegida en cada molecula. As!, dos reacciones corren en paralelo: un control de DNA solo y una mezcla experimental que contiene moleculas de DNA unidas a la protefna. Cuando una proteina unida bloquea el de la nucleasa al DNA, los enlaces de la secuencia unida nose rompen en la mezcla experimental. En el control se rompen todos los enlaces. Esto genera una serie de bandas, en donde una banda representa a cada base. Hay 31 bandas en la figura. En el fragmento protegido, los enlaces no pueden romperse en la region unida a Ia proteina, por lo que las bandas que representan los fragmentos de los tamafias correspondientes no se generan. La ausencia de las bandas 9-18 en la figura identifica un sitio de 276


union a la proteina que cubre la region localizada a 9-18 bases del extremo del DNA etiquetado. AI comparar las lineas de control y las expe rimentales por medio de una reaccion de secuenciacion que cone en paralelo, es posible "leer" en forma directa la secuencia correspondiente, e identificar asf la secuencia de nucleotidos del sitio de union. Como se describio antes (vease la Figura 11.20), la polimerasa de RNA se une en un inicio ala region de -50 a +20. Los sitios en los cuales la polimerasa de RNA sf entra en o con el promotor pueden identificarse cuando se modifica la tecnica de impresion de huellas para tratar los complejos promotor-polimerasa de RNA con agentes reactivos que modifican bases particulares. Se puede realizar el experimento de dos formas: • El DNA puede ser modificado antes de que se una ala polimerasa de RNA. Si la modificacion evita que la polimerasa de RNA se una, se habra identificado la posicion de una base en la cual el o es esencial. • El complejo DNA-polimerasa de RNA puede se r modificado. Despues se compara el patron de bandas protegidas con el del DNA libre y con el del complejo no modificado. Algunas bandas desparecen, lo que permite identificar sitios en los cuales la enzima protegio al promotor contra la modificacion. Otras bandas aumentan en intensidad, con lo que se identifican sitios en los cuales el DNA debe permanecer en una conformacion en la cual esta mas expuesto. Los cambios de sensibilidad revelan la geometria del complejo, como se resume en la , con un promotor tfpico. Las regiones -10 y -35 contienen la mayor parte de los sitios de o para Ia enzima. Denno de estas regiones, los mismos conjuntos de posiciones tienden a impedir la union si fueron modificados con anterioridad y a mostrar un incremento o una disminucion de la susceptibilidad a Ia modificacion despues de la union . Los puntas de o no coinciden por completo con los sitios de mutacion; no obstante, ocurren en la misma region limitada. Es notable que las mismas posiciones en diferentes promotores ofrezcan los puntas de o, aunque haya una base diferente. Esto indica que hay un mecanismo comun para la union de la polimerasa de RNA, aunque la reaccion no dependt> de la presencia de bases particulares en algunos d:: los sitios de o. Este modelo explica porq u~ algunos de estos puntas no son sitios de mutacioAdemas, no todas las mutaciones se encuentran e-un punto de o; las mutaciones pueden ic_fluir en la vecindad sin ser tocados por la enzima

Es especialmente significativo que los experintos con modificaciones previas identifican solo .:: s en la misma region que esta protegida por la --_zima contra la modificacion subsiguien te . Estos . :; experimentos evaluan cosas diferentes. La mocacion previa identifica a todos aquellos sitios que ~ enzima debe reconocer para unirse a! DNA. Los _c:perimentos de protecci6n reconocen todos los sis que en realidad hacen o en el complejo ·- aria. Los sitios protegidos incluyen todos los sis de reconocimiento e incluso algunas posiciones __:icionales, lo cual sugiere que la enzima primero ~conoce una serie de bases indispensable para que ~ ierrice" y luego extienda sus puntas de o tras bases. La region del DNA que esta desenrollada en el _ mplejo binario puede identificarse de manera di· :cta por medio de cambios qufmicos en su disponi. idad. Cuando se separa n las cadenas de DNA las 3ses no apareadas se hacen susceptibles a agentes :activos qu e no pueden alcanzarlas en Ia estructu-::. de doble h elice. Dichos experimentos implican siciones entre -9 y + 3 en la reacci 6n in icial de __ naturalizaci6n. La region desenrollada durante 2 iniciaci6n, por lo tanto, incluye el extrema dere_ _o de Ia secuencia -10 y se extiende justo despues _ ~I sitio de inicio. En una perspectiva tridimen sionaL todos los 1ntos de o que se encuentran en sentido - · -endente de la secuencia -10 se localizan en una ~ ~a del DNA. Esto puede observarse en el dibujo - :erior de la Figura 11.29, en donde los puntas de :nacto estan marcados en una doble helice vista _·de uno de los !ados. La mayor parte yace en la ca- .n a codificadora . Es probable que estas bases sean 7-:onocidas en Ia formacion inicial de un complejo _ ario cerrado. Esto permitirfa que la polimerasa de -_ -A se aproximara al DNA por un lado y recono-:ra dicha cara del DNA. A medida que comienza esenrollamiento del DNA mas sitios que origi' n ente yacen en la otra cara del DNA pueden ser : -onocidos y pu eden realizarse uniones con ellos.

El superenrollamiento es una caracteristica importante de la transcripci6n [ onceptos principaLes • El superenrollamiento negativo incrementa la eficiencia de algunos promotores al ayudar en La reacci6n de desnaturalizaci6n. • La transcripci6n genera superenrollamientos positivos delante de La enzima y superenrollamientos negativos detras de ella, y estos deben ser reti rados por la gi rasa y por la topoisomerasa.

(Superenrollamientos Transcripci6n Sobregirado del DNA (superenrollamientos negativos) positivos)

La topoisomerasa relaja los superenrollamientos negativos

!

La girasa introduce superenrollamientos positivos

DNA duplex (1 0.4 bp/vuelta) La transcripci6n genera DNA enrollado de forma mas compacta (superenrollado positivamente) por delante de la poLimerasa de RNA, mientras que el DNA que se encuentra detras de esta esta enrollado de forma mas laxa (superenrollado negativamente) .

La imponancia de la separaci6n de las cadenas en la reaccion de iniciacion sobresale por los efectos del superenrollamiento. Las polimerasas de RNA eucari6ticas y procari6ticas pueden iniciar la transcripci6n con mayor eficiencia in vitro cuando el molde esta sobregirado, al parecer porque la estructura superenrollada requiere menos energfa libre para la desnaturalizaci6n inicial del DNA en el complejo de iniciacion . La eficiencia de algunos promotores esta determinada por el grado de superenrollamiento. La relacion mas frecuen te es que el superenrollamiento negativo ayude a la transcripci6n. En principia, se entiende como esta situacion colabora en Ia reacci6n de iniciacion. Sin embargo, (.por que algunos promotores dependen de la extension del superenrollamiento en tanto qu e otros no? Una posibilidad es que sea su secu encia la que determine la dependencia de un promotor en el enrollamiento excesivo. Esto permitirfa pronosticar que algunos promotores tienen secuencias mas faciles de desnaturalizar (y, por lo tanto, m enos dependientes del superenrollamiento), a! tiempo que otros tienen secuencias mas complejas (y una necesidad mayor de estar superenrollados ). Una alternativa es que la localizaci6n del promotor puede ser importante si las regiones diferentes del cromosoma bacteriano tienen grados distintos de superenrollamiento. El superenrollamiento tambien tien e una participaci6n constante en Ia transcripcion. A medida que una polimerasa de RNA transcribe el DNA, ocurre desenrollamiento y enrollamientor como se ilustra en Ia Figura 11.4. Esto requiere que el complejo de transcripci6n completo gire en torno al DNA o que el DNA mismo gire sobre su eje h elicoidal. Las consecue n cias de Ia rotaci6n del DNA se ilustran en Ia en el modelo del bidominio para

11.15 El superenrollamiento es una caracteristica importante de la transcripci6n

277

Ia transcripcion. Conforme Ia polimerasa de RNA avanza por Ia doble helice, genera superenrollamiento positivo (DNA enrollado de manera mas compacta) por delante y produce superenrollamiento negativo (DNA enrollado de forma mas laxa) por detras. Por cada vuelta helicoidal recorrida por Ia polimerasa de RNA, se genera un giro +1 adelante y un giro -1 atras. Por lo tanto, Ia transcripcion tiene un efecto significativo en Ia estructura (local) del DNA. Como resultado, las enzimas girasa (que introduce superenrollamientos negativos) y topoisomerasa I (Ia cual retira los superenrollamientos negativos) son necesarias para rectificar la situacion adelante y detras de la polimerasa, respectivamente. El bloqueo de las actividades de Ia girasa y de Ia topoisomerasa provoca cambios importantes en el superenrollamiento del DNA. Por ejemplo, en las levaduras que carecen de una enzima que relaje superenrolla mientos negativos, Ia densidad del superenrollamiento negativo se duplica en una region transcrita. Una implicacion posible de estos resultados es que Ia transcripcion se encarga de generar una proporcion significativa del superenrollamiento que ocurre en la celula . En !a replicacion sucede una situaci6n similar, cuando el DNA debe ser desenrollado en una horquilla de replicacion en movimiento de modo que las cadenas individuales separadas puedan utilizarse como moldes para la sfntesis de cadenas hijas. (Mas adelante, en Ia Figura 19.20, se indican las solu ciones de las restricciones topologicas asociadas a dichas reacciones.)

La sustituci6n de los factores cr puede controlar la iniciaci6n Conceptos principales

• Escherichia coli tiene numerosos factores cr, cada uno de los cuales provoca que La polimerasa de RNA inicie en un conjunto de promotores definido por secuencias especlficas -35 y -10.

• cr 70 se utiliza en la transcripci6n general y los demas factores cr son activados por co ndiciones especiales. La division de labores entre Ia enzima central, que realiza la elonga cion de Ia cadena, y un factor cr, que interviene en Ia seleccion del sitio, de imnediato da origen a Ia pregunta de si hay mas de un tipo de factor cr, cada uno especffico para una clase diferente de promotores. La muestra el principia de un sistema en el cual una sustitucion del factor cr cambia la elecci6n de promotor. Escherichia coli utiliza facto res 0 alternativos para responder a cambios ambientales generales; estos se enlistan en Ia . (Reciben su nombre 278


La holoenzima que incluye a c;?D reconoce a un conjunto de promotores

La sustituci6n del factor a provoca que Ia enzima reconozca a un conjunto diferente de promotores

El factor cr asociado a La enzima central determina el conjunto de promotores en los cuales debe iniciarsE La transcripci6n .

por el peso molecular del producto o por el gen )_ El factor general, el cual se encarga de la transcripcion de la mayor parte de los genes bajo condicione~ normales, es 0 70 . Los factores a alternativos 0 5 , o 3= 54 oE y o son activados en respuesta a cambios ambientales; el factor 0 28 se utiliza para Ia expresi6 : de genes flagelares durante el crecimiento norma! pero su nivel de expresi6n responde a cambios er. el ambiente . Todos los factores a, excepto 0 54 pertenecen a Ia misma familia de protefnas y funcionar_ de Ia misma fo rma general. La fluctuacion de temperatura es un tipo fre cuente de cambia ambiental. Numerosos organi5mos, tanto eucari6ticos como procari6ticos, re ponden de manera similar. En presencia de u::. incremento de temperatura, Ia sfntesis de las protefnas que se estaban produciendo se interrumpc o disminuye y se sintetiza un nuevo conjunto de protefnas. Las protefnas nuevas son los product : de los genes de choque termico, cuyas funcioneson proteger a Ia celula contra el estres ambienta: Los genes de choque termico tambien se expresa::-. en respuesta a condiciones ajenas al choque temco. Varias de las protefnas de choque termico sor; chaperones. En E. coli, la expresi6n de 17 protein~ de choque termico es activada par cambios en I;; transcripci6n. El gen rpoH es un regulador necesc.rio para activar Ia respuesta al choque termico. s-_ producto es 0 32 , el cual funciona como un fact : 0 alternativo que provoca Ia transcripci6n de !c_ genes de choque termico. La respuesta a! choque termico se logra al ir:. crementar la cantidad de 0 32 cuando la temperatu:-_: aumenta y al disminuir su actividad cuando el cau.bio de temperatura se revierte. La senal basica q~=-

_ ce la producci6n de a 32 es la acumulaci6n de :einas desplegadas (desnaturalizadas en forma · :ial) que resultan del incremento de Ia tempe__: ra. La protefna a 32 es inestable, lo cual es im:-:ante porque permite que su cantidad aumente ! minuya con rapidez. Las protefnas a 70 y a 31 _:> den competir por la enzima central disponible, - :al manera que el conjunto de genes transcritos -.::-ante el choque termico depende del balance en: ellos. Los factores a cambiantes son un asunto :::'. o que repercute de manera generalizada en la . resi6n de los genes en las bacterias. Por lo tanto, es sorprendente que la producci6n de factores a _evos pueda ser el objetivo de numerosos circuitos = ~ !adores . El factor a 5 es inducido cuando !a bac: ·a transita de Ia fase de crecimiento ala fase est anaria y tambien en otras condiciones de estres. Es _ :1trolado en dos niveles. La traducci6n del RNAm :-:5 se incrementa con Ia reducci6n de Ia tempe .:.:ura o con Ia osmolaridad elevada. La prote6lisis .:<producto protefnico es inhibida por escasez de ~:bono (Ia sefial tfpica de !a fase estacionaria) y por · -emperatura alta. Otro grupo de genes regulados por cam bios ter-Jcos es controlado por el factor aE . Responde a .:.:.rnbios mas extremos de temperatura que 0 32 yes __ ucido por !a acumulaci6n de proteinas desple;.idas en el espacio periplasmico o en !a membrana :terna. Es controlado por el circuito intrincado que =resume en Ia . El factor aE se une a protefna (RseA) que se localiza en Ia membrana :-:terna. Como resultado, no puede activar Ia trans::ipci6n. La acumulaci6n de protefnas desplegadas ~ :tiva a una proteasa (DegS) en el espacio periplasico, Ia cual separa el extremo C de Ia protefna ? -eA. Est a separaci6n activa otra protefna localizada ::1 la membrana interna (YaeL), la cual divide ala ·::-gi6n terminal N de Ia RseA. Cuando esto sucede, :: factor aE es liberado y puede activar entonces la - anscripci6n. El resultado neto es que la acumula:i6n de protefnas desplegadas en Ia periferia de la :'acteria se encarga de la activaci6n del conjunto de ;-enes controlados por el factor a. Este circuito tiene dos similitudes interesantes ~ n otros circuitos reguladores. La respuesta a las "~rotefnas desplegadas en las celulas eucari6ticas :ambien utiliza una ruta en Ia cual una protefna :lesplegada (ubicada dentro del retfculo endoplas Jlico) activa una protefna de membrana. En este :aso, la protefna de membrana es una endonuclea ·a que divide a un RNA, lo que al final conduce a 1n cambia en el corte y empalme que ocasiona !a _roducci6n de un factor de transcripci6n (vease !a ;ecci6n 26.17, La respuesta a protefnas desplegadas se relaciona con el corte y empalme del RNAt) . Una ·imilitud mas directa se encuentra en el primer caso

_,a

en ser descubierto, en el cual Ia separaci6n de una proteina de membrana activa un factor de transcripci6n. En este caso, el propio factor de transcripci6n es sintetizado como una protefna de membrana y el nivel de esteroles en Ia membrana controla Ia activaci6n de las proteasas que liberan al factor de transcripci6n del dominio citos6lico de Ia protefna. Otro factor a se utiliza en condiciones de escasez de nitr6geno. Las celulas de E. coli contienen una pequefia cantidad de a 54 , el cual es activado cuando no hay amonio en el media. En estas condiciones, los genes son activados para permitir el uso de otras fuentes de nitr6geno. Las contrapartes de este factor a se han encontrado en una amplia variedad de bacterias, por lo que representa un mecanismo de respuesta que se ha conservado en Ia evoluci6n. Otro caso de conservaci6n evolutiva de los factores a es el del factor aF, el cual se presenta en pequefias cantidades y hace que Ia polimerasa de RNA

Gen

Factor

Usa

rpoD

(J70

general

rpoS

crs

estres

rpoH

(J32

choque termico choque termico

rpoE

crE

rpoN

(J54

escasez de nitr6geno

fliA

0 2a ( crF)

slntesis flagelar

Adem as de a 70 , E. coli tiene numerosos facto res a que son introducidos par condiciones ambientales particula-

res. (El supenndice del factor indica su masa.)

PERl PLASMA

c

Divisi6n por DegS

__...

RseA

N

CITOPLASMA

Division

''.,__ ()" cr liberado

Activa Ia transcripci6n

RseA es sintetizada como una proteina en la membrana interna. Su dominio citoplasmico se une al factor aE. RseA es dividida de manera secuencial en el espacio periplasmico y despues en el citoplasma. La division citoplasmica Libera crE.

11.16 La sustituci6n de los facto res a puede controlar la iniciaci6n

2 79

Secuencia -35 Separaci6n Secue ncia -10

Gen

Factor

rpoD

0"70

rpoH

0"32

rpoN

a54

fliA

0 2a (crF)

sigH

aH

TTGACA CCCTTGAA CTGGNA CTAAA AGGANPuPu

16-18 bp 13-15 bp 6 bp 15 bp 11-12 bp

TATAAT CCCGATNT TTGCA GCCGATAA GCTGAATCA

Los factores 0 de E. coli reconocen promotores con diferentes secuencias de consenso.

600 1.1 1.2 lmpide Ia union al DNA

I I 4.14.2

2.12.22.4 lnteracciones con el promotor

! !

••••••••••••••••••••••••••••

un a de Ia otra y se ubican en -24 y -12; vease !a seccion 11 .17, Los factores a entran en o de manera directa con el DNA.) Como se resume en Ia , las secuencias de consenso para cada conjunto de promotores son diferentes entre si en una de las posiciones -35 y -10, o en ambas. Esto significa que una enzima que contiene un factor a particular puede reconocer solo su propio conjunto de promotores, por lo que la transcripcion de los diferentes grupos es mutuamente excluyente. En consecuencia, la sustitucion de un factor a por otro desactiva la transcripcion del conjunto antiguo de genes y activa la transcripcion de un conjunto nuevo. (Algunos genes son expresados por polimerasas de RNA con factores a distintos debido a que tienen mas de un promotor, cada uno con un conjunto diferente de secuencias de consenso.)

11:11

I

1 -10 - 35 .,_ Gen - - - - - TAATAT•ACAGTT• 5'


Un mapa del factor 0 70 de E. coli identifica regiones conservadas. Las regiones 2.1 y 2.2 an ala polimerasa central, la region 2.3 es necesaria para la desnaturalizacion y las regiones 2.4 y 4.2 an a los elementos promotores de las secuencias -35 y -10. La region terminal Nimpide que 2.4 y 4.2 se unan al DNA en ausencia de la enzima central.

transcriba genes que intervienen en Ia quimiotaxis yen la estructura flagelar. Su contra parte en Bacillus subtilis es an, el cual controla los genes flagelares y de motilidad; en numerosas especies de bacterias hay factores con la misma especificidad promotora . Cada factor a provoca que Ia polimerasa de RNA inicie en un conjunto particular de promotores. Al analizar las secuencias de estos promotores, se puede demostrar que cada conjunto es identificado por elementos de secuencia unicos. De hecho, la secuencia de cada tipo de promotor asegura que sea reconocido solo por la polimerasa de RNA dirigida por el factor a apropiado. Se pueden deducir las reglas generales del reconocimiento de los promotares a partir de la identificacion de los genes que responden a los factores a que se encuentran en E. coli y de aquellos que participan en la esporulacion en B. subtilis (vease la seccion 11.19, La espo rulacion es controlada por facto res a). Una caracterfstica significativa de los promotores para cada enzima es que tienen el mismo tamaiio y localizaci6n relativa con respecto a! pun to de inicio y muestran secuencias conservadas solo alrededor de los centros usuales -35 y -10. (El factor cr 54 es una excepcion en Ia cuallas secuencias de consenso estan mas cerca 280

CAPiTULO 11 Transcripcion

Los factores cr entran en o de manera directa con el DNA

•

cambia su estructura para liberar sus regiones de union al DNA cuando se asocia a la enzima central. 0 70 se une a las secuencias -35 y -10. 0 70

La definicion de una serie de secuencias de consenso diferentes reconocidas en -35 y -10 por holoenzimas que contienen factores a diferentes (vease ~a Figura 11.34) conlleva Ia implicacion inmediata de que la subunidad a debe entrar en o con el DNA en estas regiones. Esto sugiere el principia general que afirma que hay un tipo comun de relacion entre el factor a y la enzima central, en la cual el factor a es colocado de una manera especifica para que establezca os cruciales con las secuencias promotoras en la vecindad de -35 y -10 . Las mutaciones del factor a que suprimen las mutaciones en las secuencias de consenso ofrecen indicios directos de que el factor a entra en o de manera directa con el promotor en las secuencias de consenso -35 y -10. Cuando una mutacion en una posicion particular del promotor impide que sea reconocido por la polimerasa de RNA y una mutacion compensadora en el factor cr permite que la polimerasa utilice el promotor mutante, la explicacion mas probable es que el par de bases relevante del DNA sea ado por el aminoacido que ha sido sustituido. Las comparaciones de las secuencias de numerosos factores cr bacterianos permiten identificar las regiones que se han conservado. Sus localizaciones en el factor cr 70 de E. coli se resumen en Ia 1.35.

snructura cristalina de un fragmento de factor cr :a bacteria Thermus aquaticus muestra que estas ~ : · nes se pliegan en tres dominios independientes .a proteina: el dorninio cr2 contiene a 1.2·2.4, cr 3 ::riene a 3.0- 1. 3 y cr4 contiene a 4.1-4.2. La Figura 11.35 muestra que dos partes peque-.: de las regiones dos y cuatro (nombradas 2.4 y · = participan en el o con las bases en los - :::nentos - 10 y -35 , respectivamente. Estas dos {ones forman fragmentos pequenos de helice ::-n la protefna. Los experimentos con moleculas . :eroduplex muestran que cr70 hace os con bases sobre todo en Ia cadena codi:ficadora, y =.ntiene estos comactos despues de que el DNA ha · desenrollado en esta region. Esto sugiere que :actor cr podria ser importante en la reaccion de . ·naturalizacion. El uso de elementos h elicoidales ex en las pro: ::-tas para reconocer secuencias de DNA duplexes -~ uente (vease Ia seccion 14.11 , El represor utili= un elemento helice-vuelta-helice para unirse a! _·A). Los aminoacidos separados por tres a cuatro siciones se encuentran en la misma cara de una . lice a y, por lo tanto, estan en una posicion en .:. que pueden establecer o con los pares de :ises adyacentes. La muestra que los _::J.inoacidos que se encuentran a lo largo de una :na de la region 2.4 de la helice ex an a las : 3Ses de las posiciones -12 a -10 de Ia secuencia -:om otora - 10. La region 2.3 es semejante a las protefnas que =u nen a acidos nucleicos de cadena individual y -.uticipa en la reaccion de desnaturalizacion. Las ·::giones 2.1 y 2.2 (las cuales forman Ia parte mas . nservada del factor cr) intervienen en Ia interac6n con la enzima central. Se asume que todos los actores cr se unen a las mismas regiones de Ia polierasa central, lo cual garantiza que las reacciones ·ean competitivas. La region terminal N de cr 70 tiene funciones re; tLladoras importantes. Si es retirada, la protefna : cortada adquiere Ia capacidad de unirse de manera ::·pecffica a secuencias promotoras. Esto sugiere que .a region terminal N actua como un dominio de au: inhibicion. Ocluye los dominios de union al DNA :uando cr70 esta libre. La asociacion con Ia enzima :entral cambia la conformacion de cr, de tal mane ~a que la inhibicion es liberada y los dominios de ..:nion al DNA pueden h acer o con el DNA La • esquematiza el cambia de con:ormacion del factor cr en Ia formacion de un comlejo abierto. Cuando el factor cr se une a Ia polime~asa central, el domino terminal N se balancea - 20 A y se aleja de los dominios de union al DNA, y los ominios de union a! DNA se separan uno de otro -15 A, al parecer para adquirir una conformacion ...2

Protefna

DNA

Posicion -1:}-12-11-1o-s-&-7

Los aminoacidos de la helice ex 2.4 de cr'" hacen o con bases especificas en la cadena codificadora de la secuencia promotora - 10.

Dominios de union al DNA La regi6n terminal N se une a los dominios de union al DNA en el factor cr libre Region terminal N

El DNA desplaza al extrema N cuando se forma el complejo con el DNA Regi6n terminal N

El extrema N de 0 impide que las regiones de union al DNA se unan al DNA. Cuando se forma un complejo abierto, el extrema Nse separa 20 Ay las dos regiones de union al DNA se alejan 15 A.

mas alargada, apropiada para hacer o con el DNA. Las mutaciones en cualqu iera de las secuencias -35 o -10 impiden que un factor cr70 (grupo terminal N eliminado ) se una al DNA, Io cual su-

giere que <J70 a ambas secuencias de manera simultanea. Esto implica que el factor cr debe tener una estructura bastante alargada, que rebase los -68 A de dos vueltas de DNA. En Ia holoenzima libre, el dominio terminal N se localiza en el sitio activo de los componentes de Ia enzima central, esencialmente imitando Ia Iocalizacion q u e el DNA ocupara cuando se form e un complejo de transcripcion. Cuando la holoenzima forma un complej o abierto en el DNA, el dominio terminal N cr es desplazado del sitio activo. Su relacion con el resto de la protefna es, por lo tanto, rnuy flexible; Ia relacion cambia cuando el factor cr se une a la enzima central y de n uevo cuando la holoenzima se une al DNA. Las comparaciones de las estructuras cristalinas de la enzima central y de la holoen zima muestran que el factor cr se encuentra sobre to do en la superfi-

11.17 Los factores

0

entran en o de manera directa con el DNA

281

<J-

Enzima central

El factor cr tiene una estructura alargada que se extiende por La superficie de las subunidades de La enzima central cuando se forma la holoenzima.

de transcripci6n dirigido por 0' 54 requiere que otros activadores se unan a sitios que estan bastante distantes del promotor. Esto contrasta con los otro tipos de promotores bacterianos, para los cuales los sitios reguladores estan siempre muy cerca del promotor. El comportamiento de cr 54 es diferente al de otros factores cr, sobre todo en lo que se refiere a su capacidad para unirse al DNA independientemente de la polimerasa central. En este aspecto, 0' 54 es rna_ parecido a los reguladores eucarioticos que se analizan en el Capitulo 24, Promotores y potenciadores. que a los reguladores procarioticos tipicos que se abordan en el Capitulo 12, El operon.

Los factores a pueden organizarse en cascadas Conceptos principales • Una cascada de factores cr se crea cuando un factor cr es necesario para transcribir al gen que codifica al siguiente factor cr. • Los genes tempranos del fago SPOl son transcritos por una polimerasa de RNA hospedadora. • Uno de los genes tempranos codifica un factor cr que hace que La polimerasa de RNA transcriba los genes intermedios. • Dos de los genes intermedios codifican subunidades de un factor cr que hacen que la polimerasa de RNA transcriba los genes tardios.

El DNA en un inicio entra en o con el factor cr (en color rosa) y con la enzima central (en color gris). Se desplaza mas hacia el interior de la enzima central para formar os con la secuencia -10. Cuando cr es liberado, la anchura del pasaje que contiene al DNA aumenta . Reproducida de Vassylyev, D. G., et al. Nature. 2002. 417: 712-719. Fotografia cortesia de Shigeyuki Yo koyama, The University of Tokyo.

cie de la enzima central. La muestra que tiene una estructura alargada que rebasa el sitio de union al DNA. Esto lo coloca en una posicion que le permite hacer o con el DNA durante la union inicial. La helice de DNA tiene que desplazarse unos 16 A a partir de la posicion inicial para entrar al sitio activo. La J ilustra este movimiento, visto en corte transversal a lo largo del eje helicoidal del DNA. En el factor cr 54 se observa una diferencia interesante de comportamiento. Esto provoca que la polimerasa de RNA recon ozca los promotores que tienen una secuencia de consenso distinta, con un elemento conservado en -12 y con otro en la cercania ubicado en - 24 (expuesto en la columna "-3 5" de la Figura 11.32). Por lo tanto, Ia geometrfa del complejo polimerasa-promotor es diferente bajo la direccion de este factor cr. Otra diferencia en el mecanismo de regulacion es que un nivel alto 282


Los factores cr se utilizan de manera amplia pare. controlar Ia iniciacion de la transcripcion en la bacteria B. subtilis, en Ia cual se conocen -10 facto res distintos. Algunos se encuentran en las celulas vegetativas; otros se producen solo en circunstancid5 especiales de infecciones por fagos o en el cambic de crecimiento vegetativo a esporulacion. La principal polimerasa de RNA observada en la5 celulas de B. subtilis que participan en el crecimientC" vegetativo normal tiene Ia misma estructura que Ia polimerasa de RNA de E. coli, <X2 ~Wcr. Su factor c (descrito como cr4 3 o crA) reconoce promotores cor: las rnismas secuencias de consenso utilizadas por !c. enzima de E. coli bajo la direccion de 0'70 . Mucha~ variantes de la polimerasa de RNA que contiene_ otros facto res cr se encuentran en cantidades much mas pequefias. Las enzimas variantes reconocer: promotores distintos con base en las secuencias de consenso localizadas en -35 yen -10. La transicion de la expresion de un conjumo de genes a la expresion de otro conjunto es unc: caracterfstica comun de la infecci6n por bacteriofagos. En todos las casos, excepto en los que son mu~ simples, el desarrollo del fago comprende cambi~ en el patron de transcripci6n durante el ciclo infec-

_ so. Estos cambios pueden logra rse gracias a la _resis de una polimerasa de RNA codificada por los ~ JOS o a los esfuerzos de los factores rios co-5cados por los fagos que controlan la polimerasa . :: RNA bacteriana. Un ejemplo bien caracterizado -~- control mediante Ia produccion de factores 0 · ·Jevos ocurre durante la infeccion por el fago SPO l _:' B. subtilis. El ciclo infeccioso de SPO l pas a por tres eta· 2s de expresion genica. En cuanto tiene Iugar la -::eccion se transcriben los genes tempranos del '"'-"'0. Despues de 4 a 5 min, cesa la transcripcion de ' genes tempranos y comienza la transcripcion -~ los genes intermedios. A los ocho a 12 min, la -::nscripcion de los estos genes es remplazada por · transcripcion de los genes tardios. Los genes tempranos son transcritos por la ho.:-nzima de la bacteria hospedadora. En esencia, __ imposible distinguirlos de los genes hospedado::s cuyos promotores tienen la capacidad intJ·fn; ra de ser reconocidos por Ia polimerasa de RNA

lntermedio La enzima central-gp28 transcribe a los genes intermedios del fago

Wcr43. La expresion de los genes de los fagos es indis_nsable para las transiciones a la transcripcion de >genes intermedios y tardfos. I res genes regulares, 28, 33 y 34, controlan el curso de la transcrip- · n. Sus funciones se resumen en la .:_ patron de regulacion crea una cascada, en la cual = enzima hospedadora transcribe un gen temprail cuyo producto es necesario para transcribir los nes intermedios. Despues de esta transcripcion, _ s de los genes intermedios codifican productos .dispensables para transcribir los genes tardfos. Los organismos con mutaciones en el gen tem::-ano 28 no pueden transcribir los genes interme- s. El producto del gen 28 (denominado gp28) _ una protefna de 26 kD que remplaza a! factor ::: hospedador en la enzima central. Esta sustituci6n . (l unico hecho requerido para hacer la transici6n de · expresi6n de los genes tempranos a la expresi6n de los :·tes intermedios. Esto crea una holoenzima que ya puede transcribir mas los genes del hospedador en cambio transcribe de manera especffica los ge·__s intermedios. No se sabe como el producto gp28 .=splaza a cr43 o que le sucede al polipeptido cr hos.dador. Dos de los genes intermedios participan en la ~uiente transicion. Las mutaciones en el gen 33 en el gen 34 impiden la transcripcion de los ge . es tardfos. Los productos de estos genes forman :1 dfmero que remplaza a gp28 en la polimerasa .::ntral. Una vez mas, se desconoce como gp3 3 y .. 34 excluyen a gp28 (o a cualquier a" 3 hospedador -::sidual), pero una vez que se han unido a la enzima _-ntral, esta es capaz de iniciar la transcripci6n solo en los ~omotores de los genes tard{os. 3

-

Tard io La enzima central-gp33-gp34 transcribe los genes tard fos del fago

La transcripci6n de los genes del fago SPOl es contro lada par dos sustituciones sucesivas del factor a que cambian la especificidad de la interacci6n.

los remplazos sucesivos del factor cr tienen consecuencias dobles. Cada vez que se cambia la subunidad, la polimerasa de RNA adquiere Ja capacidad de reconocer a una nueva clase de genes y deja de reconocer a la clase anterior. Por lo tanto, estos cambios constituyen cambios globales en la actividad de la polimerasa de RNA. Es probable que toda, o casi toda, Ia enzima central se asocie al factor cr de ese momento, y el cambio es irreversible.

La esporulaci6n es controlada por factores <5 Conceptos principales • La esporulaci6n divide a una bacteria en una celula madre que es desintegrada y una espora que es liberada. • Cada compartimiento avanza a la siguiente etapa de desarrollo al si ntetizar un factor a nuevo que desplaza al factor a anterior. • La comunicaci6n entre los dos compartimientos temporiza las sustituciones de los facto res a.

11.19 La esporulaci6n es controlada por factores a

283

..

.

. ..

l

llV•\q_

t ) -~11-'

Bacteria vegetativa

.<

El DNA se replica

VNi\:llVi\IJVNI

ViV.A6V7Vii./JVI

~

Se forma el tabique

VNAJlVJV,Vl\11 VJ'\UV. 't\ll\.IJ\/1

~

El DNA se transfiere al interior de Ia pre-espora

~

La espora es engullida

~

Se forma Ia cubierta de Ia espora

~

La celula madre se lisa

1\

VNA/A.Il\lAJI\/1

t~v; -;~

\IJV:v:V/VA.Il•..ll

VlVAilVJVlVAII

"'

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.

""~

:3

V.I'VJS'

\:lNMVNi\INI'

La espora se Iibera

La esporulaci6n comprende la dife renciaci6n de una bacteria vegetativa en una d~ lula madre que se lisa y en una espora que se libera.

Quiza el ejemplo mas extenso de cambios en los factores cr lo ofrece la esporulacion, otra forma de vida de disponer algun as bacterias. AI final de Ia fase vegetativa en un cultivo de bacterias, el crecimiento logarftmico es interrumpido debido a que los nutrientes en el medio se agotan. Esto activa Ia esporulaci6n, como se ilustra en Ia El DNA es replicado, un genoma es segregado en un extremo de la celula y a Ia larga el genoma es rodeado porIa cubierta rfgida de Ia espora. Cuando se forma el tabique, genera dos compartimientos independientes, el de Ia celula madre y el de Ia preespora. AI principia del proceso se adhiere un cromosoma a cada polo de Ia o§lula. El tabique creciente atrapa parte de un cromosoma en la pre-espora, y despues una translocasa (Spoi-UE) bombea al resto del cromosoma al interior de Ia pre-espora. La esporulaci6n sucede en unas 8 h. Puede con siderarse como un tipo primitivo de diferenciaci6n, en el cual una celula progenitora (la bacteria ve 284

CA PITULO 11 Transcripci6n

getativa ) da origen a dos celulas hijas distintas co:destinos diferentes: Ia celula madre ala larga se liSi. y la espora que es liberada tiene u na estructura p ~ completo diferente a la de la bacteria original. La esporulaci6n implica un cambio drastico e: las actividades biosinteticas de Ia bacteria, en el cue: participan n umerosos genes. El nivel basico de coL· trol su cede en Ia transcripci6n. Algunos de los gen _ que funcionaron en Ia fase vegetativa son apagad durante la esporu laci6n, pero la mayor parte com~ nua siendo expresado. Ademas, los gen es especffi . cos utilizados para la esporulaci6n se expresan s6! durante este periodo . AI final de Ia esporulaci6n -40% del RNAm bacteriano es especffico de la ~ porulaci6n. Las formas nuevas de polimerasa de RNA se activan en las celulas sometidas a esporulaci6n; esta.... contienen la misma enzima central que las celul
CELULA MADRE

l

~

La holoenzima contiene crH o cr 43

El fosforrelevador activa Ia sfntesis de crF y crPrD-E

l

PRE-ES PORA

l

C(

crF remplaza a cr 43 en Ia enzima central

crE es activado y des plaza a cr43

l

El complejo enzima central-crF transcribe a los genes tempranos de Ia esporulaci6n

Se crea el gen crK; es transcrito por crE

l

l

crG es el producto de un gen temprano de Ia esporulaci6n

1 - - Se activa crG y desplaza a crF

Se activa crK y des plaza a crE

l El factor crK activado promueve Ia transcripci6n de los genes tardfos

l

Vi' El factor crG activado promueve Ia transcripci6n de los genes tardfos

La esporulaci6n involucra cambios sucesivos en los factores que controlan la especificidad de la iniciaci6n de la polimerasa de RNA. Las cascadas de la celula madre (lad a izquierdo) y de la pre-espora (lad a derecho) estan vinculadas par seiiales que pasan a traves del tabique (indicadas con flechas horizontales). 0

~ominio

fosfatasa en la pre-espora. Desfosforila y, lo tanto, activa, al factor SpoiiAA, el cual a su ·ez desplaza al factor anti-a SpoiiAB del complejo ·poiiAB-crF. La liberaci6n de <JF lo activa. La activaci6n de <JF determina el inicio de la es _;)Orulaci6n. Bajo la direcci6n de aF, la polimerasa 'e RNA transcribe el primer conjunto de genes de =sporulaci6n en vez de los genes vegetativos que ~staba transcribiendo antes. Es probable que la reacjon de remplazo afecte solo a parte de la poblaci6n je polimerasa de RNA, debido a que 0F se produce ;6lo en pequefias cantidades. Una escasa cantidad je enzima vegetativa prevalece durante la esporula:l6n. El a4 3 desplazado noes destruido; puede ser reruperado de extractos de celulas en esporulaci6n . j>Or

Dos episodios reguladores siguen a Ia actividad de aF, como se detalla en la . En la preespora, otro factor, <JG, es el producto de uno de los genes tempranos de Ia esporulaci6n. El factor <JG hace que Ia polimerasa de RNA transcriba los genes de esporulaci6n tardios en la pre-espora. Otro producto genico temprano de la esporulaci6n se encarga de la comunicaci6n con el compartimiento de la celula madre. El factor ()F activa a SpoHR, el cual es secretado de la pre-espora. Despues activa a la protefna de union a la membrana SpoiiGA para transformar al precursor inactivo pro-<JE en el factor activo ()E en Ia celula madre. (C ualquier ()E producido en Ia pre-espora es degradado por funciones especfficas de Ia pre-espora.) 11.19 La esporulaci6n es controlada par factores

0

285

CELULA

PRE-ESPORA

MADRE

SpoiiGA

.....

SpoiiR

El factor d desencadena la sintesis del siguiente factor o en La pre-espora (oG) y activa a SpoiiR, que provoca que SpoiiGA divida a pro-oE.

CELULA

PRE-ESPORA SpolfE-SpoiiAA

....

MADRE

........

.....·

0

SpoiiGA-SpoiiR Prote61isis

crE ~

V

~

SpoiiiA

••

Prote61isis

~·

..·

La regulaci6n ent recruzada de La esporulaci6n coordina La cronologia de los episodios que suceden en La celula madre y en la pre-espora.

La cascada continua cuando aE es remplazado por aK. (De hecho, Ia producci6n de a Kes bastante compleja, debido a que primero su gen debe ser creado por un episodio de recombinaci6n.) Este factor tambien es sintetizado como un precursor inactivo (pro-aK) que es activado por una proteasa. Una vez que aK ha sido activado, desplaza a aE y provoca Ia transcripci6n de los genes tardfos en Ia celula madre. La cronologfa de estos su cesos en los dos compartimientos es coordinada por sefiales adicionales. La actividad de a Een Ia celula madre es necesaria para la activaci6n de aGen la pre-espora; en cambio, Ia actividad de aG es necesaria para generar una sefi.al que es transmitida a traves del tabiqu e para activar a aK De este modo, Ia esporula ci6n es controlada por dos cascadas, en las cuales los factores a de cada 286

CAPiTuLO 11 Transcripci6n

La polimerasa de RNA bacteriana termina en sitios discretos Concepto principal • La terminaci6n puede requerir el reconocimiento de la secuencia terminadora en el DNA y la formaci6n de urna estructura en forma de horquilla en el producto de RNA.

Y

···..~ro.. des~

y

crK

Factor

compartimiento son activados en forma sucesiva cada uno dirige la sfntesis de un conjunto particu:: de genes. La J L ,. ilustra Ia forma en Ia cu.:.. las dos cascadas esra.n conectadas porIa transmisir de sei'i.ales de un compartimiento al otro. A medi ~ que se activan los factores a nuevos, los facton: a antiguos son desplazados, de tal m anera que 1· tran siciones de los factores a apagan y enciendea los genes. La incorporaci6n de cada factor en ·' polimerasa de RNA determina cuando se expre:: su conjunto de genes diana, y Ia cantidad de fact disponible influye en el nivel de expresi6n geL ca. En un momento dado puede activarse mas c.un factor a, y las especificidades de algunos de ic factores a se superponen. Se desconoce de que depende Ia capacidad de cada factor a de remplazar ' su predecesor.

Una vez que Ia polimerasa de RNA ha iniciado :.: transcripci6n, la enzima se desplaza por el m olldt sintetizando RNA, hasta que encuentra una secuer.cia terminadora. En este punto, Ia enzima dej a c agregar nucle6tidos a Ia cadena creciente de RN.Iibera el producto terminado y se disocia del m _. de de DNA. La terminaci6n requiere que todos I puentes de hidr6geno que mantienen unido at corr. · plejo RNA-DNA se rompan, despues de lo cual ~ reconstituye el DNA duplex. Es dificil d efinir el sitio de terminaci6n ci: una molecula de RNA que ha sido sintetizada en ur:...:. celula viva. Siempre es posible que el extremo : de Ia molecula h aya sido generado por division dt transcrito primario y, por lo tanto, no representa c sitio real en el cual termin6 Ia polimerasa de RN; _ La mejor identificaci6n de los sitios de tern 'naci6n Ia ofrecen los sistemas en los cuales Ia p r limerasa de RNA termina in vitro. La capacidad ·: Ia enzima para terminar depende en gran med.i · ' de ciertos parametros como Ia fuerza i6nica; con: · resultado, su terminaci6n en un punto particulc._ in vitro no demuestra que este mismo punto sea Iii terminador natural. Sin embargo, se pueden ide ~: · tificar extremos 3' autenticos cuando se genera ~ . mismo extremo in vitro e in vivo. La 'i resume los dos tipos de caractcrfsticas en los terminadores bacterianos.

• Los terminadores de las bacterias y de sus fagos se han identificado como secuencias necesarias para la reaccion de terminacion (in vitro o in vivo). Las secuencias de los terminadores procarioticos no muestran similitudes mas alla del sitio en el cual se agrega Ia ultima base al RNA. La responsabilidad de la terminacion recae en las secuencias ya transcritas por la polimerasa de RNA. Por lo tanto, Ia terminacion se basa en la exploracion del molde o del producto que la polimerasa esta transcribiendo en este momento. • Muchos terminadores requieren que se forme una horquilla en la estructura secundaria del RNA que esta siendo transcrito. Esto indica que la terminaci6n depende de un producto de RNA y no esta determinada tan solo par la exploraci6n de la secuencia de DNA durante la transcripci6n . Los terminadores varian mucho en cuanto a su :-ficiencia de terminacion. En algunos terminado:es, el episodio de terminacion puede impedirse por ::nedio de factores rios espedficos que interac:Uan con la polimerasa de RNA. La antiterminad 6n hace que la enzima continue la transcripcion :::1as alla de la secuencia de terminacion, un suceso ·enominado ultrale ctura (el mismo termino uti·zado en la seccion 9.14, Los supresores pueden :ompetir con la lectura de tipo silvestre del codigo, _ara describir la supresion de los codones de termi ::~ acion de un ribosoma). Al examinar el hecho de la terminacion, se le J ebe considerar no solo como un mecanismo para senerar el extrema 3' de la molecula de RNA, sino .::omo una oportunidad de controlar la expresion genica. Por lo tanto, las etapas en las cuales la poirnerasa de RNA se asocia al DNA (iniciacion) o se disocia de el (terminacion) estan sujetas a un control especffico. Hay similitudes interesantes entre los sisemas empleados en Ia iniciacion y en la terminadon. Ambos requieren que se rompan los puentes de hidrogeno (desnaturalizacion inicial del DNA en Ia iniciacion y disociacion del complejo de DNA-RNA en la terminacion) , y ambos requieren la adicion de p:wtefnas para interactuar con la enzima central. De hecho, se logran por formas alternativas de la polimerasa. Mientras que la iniciacion se basa tan solo en la interaccion entre la polimerasa de RNA y el DNA duplex, el episodio de terminacion implica el reconocimiento de sefiales en el transcrito por parte de Ia polimerasa de Rl~A o de factores rios, asf como el reconocimiento de las secuencias del DNA.

liB

Hay dos tipos de termina dores en E. co[j

Concepto principal

• Los terminadores intrinsecos estan formados por una horquilla abundante en G-C localizada en el producto de RNA seguida por una region rica en U en la cual ocurre la terminacion .

En E. coli, los terminadores se distinguen por Ia necesidad de la polimerasa de RNA de algun otro factor para realizar la terminacion in vitro:

Todas las secuencias necesarias para Ia terminaci6n se encuentran en Ia regi6n transcrita

La hor-;;uilla que se localiza en el RNA puede ser necesaria

l

La polimerasa de RNA y el RNA son liberados

-

f.

~

I

Las secuencias de DNA necesarias para la terminaci6n se localizan en sentido ascendente con respecto a la secuencia terminadora. La formacion de una horquilla en el RNA puede ser necesaria.

AGUU U A G G A A UG G C

·G C C G

C

A

U

A ~

u Au

GC

Ac

&

AU AU AU

g~

Regi6n abundante en pares G·C c G localizada en el tallo CG u A Fragmento de cadena indtvtdual ~ ~ jncoenU GC UUUU

Los terminadores intrinsecos incluyen regiones de pallndromos que forman horquillas cuya longitud varla de 7 a 20 bp. La estructura tallo-lazo incluye una region rica en G-C y es seguida por un fragmento abundante en residuos de U. 11.21 Hay dos tipos de terminadores en E. coli

287

• La enzima central puede terminar in vitro en ciertos sitios en ausencia de algun otro factor. Estos sitios se denominan terminadores intrinsecos. • Los terminadores dependientes de p se definen por la necesidad de a nadir el factor rho (p) in vitro, y las mutaciones demuestran que el factor interviene en Ia terminadon in vivo. Los terminadores intrfnsecos tienen dos caracterfsticas estructurales mostradas enla una horquilla en la estructura secundaria y una region en el extremo de la unidad abundante en re siduos de U. Ambas caracterfsticas son indispensa bles para la terminacion. La horquilla casi siempre contiene una region rica en G-C cerca de Ia base del tallo. La distancia tfpica entre Ia horquilla y la region rica en U es de siete a nueve bases. Hay -1 100 secuencias en el genoma de E. coli que cumplen con estos criterios, lo cual sugiere que cerca de la mitad de los genes tiene terminadores intrfnsecos. Las mutaciones puntuales que impiden la terminacion ocurren dentro de la region del tallo de la horquilla. (. Cual es el efecto de una horquilla en Ia transcripcion? Es probable que todas las horquillas que se forman en el producto de RNA hagan que la polimerasa disminuya la velocidad de (y quizas detenga) Ia sfntesis de RNA. La pausa crea una oportunidad para que ocurra la terminacion. La pausa sucede en los sitios que se asemejan a los terminadores pero cuya separacion se ha incrementado (por lo general de 10 a 11 bases) entre la horquilla y la region abundante en U. Sin embargo, si el sitio de la pausa no corresponde a un terminador, la enzima suele seguir adelante para continuar Ia transcripcion. La longitud de la pausa varfa, pero un terminador tfpico dura -60 s. Una region rica en U localizada en sentido descendente desestabiliza el hfbrido de DNA-RNA cuando Ia polimerasa de RNA hace una pausa en Ia horquilla. El hfbrido rU-dA RNA-DNA tiene una estructura de apareamiento de bases inusualmente debil; requiere la menor energfa que cualquier hfbrido para romper la asociacion entre las dos cadenas. Cuando la polimerasa hace una pausa, el hfbrido de DNA-RNA se desenreda de la region terrninal rU-dA unida de manera debit. Con frecuencia, el episodio determinacion sucede en una de las numerosas po siciones que se dirigen bacia el extremo de la region rica en u o en eL como si la enzima "tartamudeara" durante la terminacion. La region rica en U del R.!'JA corresponde a una region rica en A-T del DNA, por lo que puede observarse que las regiones ricas en A-T son importantes en la terrninacion intrfnseca y en la iniciacion. La secuencia de Ia horquilla y la longitud del segmento rico en U determinan la eficiencia de la 288


terminacion. Sin embargo, la eficiencia de Ia terminacion in vitro varfa de 2% a 90% y no se correlaciona de manera sencilla con la constitucion de la horquilla o con el numero de residuos de U en la region rica en U. Por lo tanto, la horquilla y la region abundante en U son necesarias, aunque insuficientes, y otros parametros influyen en la interaccion con la polimerasa de RNA. En particular, las secuencias que se encuentran en sentido ascendente y descendente con respecto al terminador intrfnseco afectan su eficiencia. Se conoce menos aun sobre las senates y sobre los factores rios involucrados en la terminacion de las polimerasas eucarioticas. Cada clase de polimerasa utiliza un mecanismo diferente (vease e· Capitulo 26, Corte, empalme y procesamiento dei RNA).

lEE

tC6mo funciona el factor p?

Concepto principal • El factor p es una proteina terminadora que se une a un sitio rut ubicado en un RNA naciente y viaja por el RNA para liberarlo de la estructura del hibrido de RNA-DNA en la polimerasa de RNA.

El factor p es una protefna esencial en E . coli que funciona solo en la etapa de Ia terminacion. Actua en terminadores dependientes de p, los cuales representan cerca de Ia mitad de los terminadores de E. coli. La ~ I muestra como funciona p. Primero se une a una secuencia dentro del transcrito en sentido ascendente con respecto a! sitio de terminacion. A esta secuencia se le denomina sitio rur (por sus siglas en ingles: rho utilization). El p despue_ viaja por el RNA hasta que encuentra una polimerasa de RNA. Cuando la polimerasa de RNA alcanza el sitio de terminacion, p actua sobre el hfbrido de RNA-DNA en la enzima para provocar la liberacior. del RNA. La pausa que hace Ia polimerasa en el si.tio de terminacion proporciona tiempo para que e: factor p se transfiera a! fragmento hfbrido, lo cual e~ una caracterfstica importante de Ia terminacion. Se observa aquf un principia general importante. Cuando se conoce el sitio del DNA en el cua~ alguna protefna ejerce su efecto, no puede asumirse que coincide con la secuencia de DNA a Ia que reconoce en un inicio. Pueden estar separados y n es necesario que haya una relacion estable entrt ellos. De hecho, los sitios rut en diferentes unidade_ de transcripcion se encuentran a distancias variables precediendo a los sitios de terminacion. En los factores antiterminadores se hace una distinci6r. similar (vease la seccion 11.24, La antiterminacio1:

_~ - iere sitios que sean independientes de los ter~_a dores ).

La polimerasa de RNA transcribe al DNA

Las caracterfsticas comunes de los sitios rut son ..:e Ia secuencia tiene una alta concentracion de :: un anillo discontinuo, pero la union del RNA lo ~ nvierte en un anillo cerrado. Despues de Ia union al sitio rut, p utiliza su ac_:\idad helicasa, conducida porIa hidrolisis de ATP, a.ra transferirse a lo largo del RNA hasta que al:anza al fragment o hfbrido de RNA-DNA en Ia po_:merasa de RNA Despues desenrolla Ia estructura ~ , plex. No se sa be si esta accion es suficiente para . .: erar el transcrito o si p tambien interactua con Ia ::-<Jlimerasa de RNA para ayudar a liberar el RNA . :::1factor p actua como factor rio de Ia poli! erasa de RNA; por lo general, su actividad maxi_,a in vitro se exhibe cuando esta presente en una :oncentracion de -10% de Ia concentracion de la yolimerasa de RNA

..

•

La polimerasa de RNA hace una pausa en Ia horquilla y se agrega el factor p

El factor p desenrolla al hibrido de RNA-DNA

El factor p se une al RNA en un sitio rut y se transfiere a lo largo del RNA hasta que encuentra un h1brido de RNA-DNA en la polimerasa de RNA, en donde libera al RNA del DNA .

'I

AUCGCUACC UCAUAU CC GCACC UCC UCAAACGC UACC UC GACC AGAAAGGCGUC UC UU

Bases 41% .,_La deleci6n impide Ia terminaci6n---. 25% u 20% G 14%

C A

Un sitio rut tiene una secuencia rica en C y deficiente en G que precede al sitio, o a los sitios, de terminaci6n. La secuencia corresponde al extrema 3' del RNA.

11.22 ~Como funciona el factor p?

289

..

-:

..... .

dependiente de p, del mismo modo que en Ia terrninaci6n intrfnseca, porque hay tiempo de que ocurran los demas sucesos necesarios. La idea de que p se desplaza por el RNA conduce a una predicci6n importante con respecto c. Ia relaci6n entre Ia transcripci6n y Ia traducci6n. Rho primero debe tener a una secuencia de union en el RNA y despues deber ser capaz de desplazarse a lo largo del RNA. Una o ambas condiciones pueden ser impedidas si los ribosomas esta traduciendo un RNA. Por lo tanto, Ia capacidad de: factor p para alcanzar a Ia polimerasa de RNA er. un terminador depende de lo que esta sucediendc en Ia traducci6n. Este modelo explica un fen6meno desconcertante. En algunos casos, una mutaci6n sin sentidC' en un gen de una unidad de transcripci6n impide Ia expresi6n de los genes subsiguientes en Ia unidad. Este efecto se denomina polaridad . Una causa frecuente es la ausencia del RNAm que corresponde a las partes subsiguientes (distales) de Ia unidad. Sup6ngase que hay terminadores dependiente<; de p dentro de Ia unidad de transcripci6n, es decir antes del terminador que se utiliza de manera habitual. Las consecuencias se ilustran en Ia - J A 11.5 . En general, estos terminadores mas tempranos no son utilizados debido a que los ribosomas impider. que p alcance a Ia polimerasa de RNA. Sin embargo. una mutaci6n sin sentido Iibera a los ribosomas, de tal manera que p es libre de adherirse a! RNAm c desplazarse por eJ, lo que le permite actuar sobre lc.

El mon6mero p tiene dos dominios de union al RNA

El anillo hexamerico sa une al RNA

3'

El factor p tiene un dominic terminal N de union al RNA y un dominic terminal C con actividad ATPasa . Un hexamero en forma de anillo discontinue se une al RNA a lo largo del exterior de los dominies terminales N. El extreme 5' del RNA se une a un sitio de union secundario en el interior del hexamero.

Es necesario para p transferirse a lo largo del RNA desde el sitio rut basta ellugar de Ia terminaci6n. Esto requiere qu e el factor se desplace mas rapido que Ia polimerasa de RNA. La enzima hace una pausa cuando alcanza un terminador y Ia terminaci6n ocurre si p lo captura ahi. Por lo tanto, hacer una pausa es importante en Ia terminaci6n

. TIPO SILVESTRE

..

•

I

....

MUTANTE SIN SENTIDO

Los ribosomas empaquetan al RNAm detras de Ia polimerasa de RNA

Los ribosomas impiden Ia adhesion o el movimiento del factor p

Los ribosomas se disocian en Ia mutaci6n

p se adhiere pero los ribosomas impiden su movimiento

p obtiene a Ia polimerasa de RNA

La transcripci6n continua

~ I La accion del factor p puede crear un vinculo entre la transcripcion y la traduccion cuando el terminador dependiente de p se encuentra enseguida de una mutacion sin sentido.

290

CAPITULO 11 Transcripcion

- ::-Fasa de RNA en el terminador. Como resul.a enzima es liberada y las regiones distales de _, ad de transcripcion nunca son expresadas. -que debe haber terminadores internos? Quiza :_;,_n s6lo secuencias que por coincidencia irni-=~ terminador dependiente de p usuaL) Algunas : ::ulas estables de RNA que tienen una estructu:-::undaria extensa son protegidas de los efectos =-::'s, al parecer debido a que la estructura irnpide ~'lesion o el movimiento de p. :..as mutaciones del gen rho influyen de muy ::->as maneras en la terminaci6n. La naturaleza . · del efecto es !a incapacidad de realizar la ter-__:Ki6n. Sin embargo, la magnitud de esta impo_:_ ad, como se observa en el porcentaje de ultra-- .::ra in vivo, depende del locus diana particular. - :orma similar, !a necesidad de factor p in vitro es . _::Jble. Algunos terminadores (dependientes de p) . ..:ieren concentraciones relativamente altas de p, -:::mas que otros funcionan muy bien con nive~ajos. Esto sugiere que terminadores diferentes ::-Jieren niveles distintos de factor p para la termi-:::6n y, por lo tanto, responden de forma diferente : s niveles residuales de factor p en los mutantes ~ mutantes p suelen ser permeables) . Algunas mutaciones del gen rho pueden ser su- lidas por mutaciones en otros genes. Este me:io ofrece una manera excelente para identificar · proteinas que interactuan con p. La subunidad _ .:ie Ia polimerasa de RNA participa en dos tipos : mutaciones. En el primero, las mutaciones en el ::t rpoB pueden reducir Ia terminaci6n en un sitio ~- endiente de p. En el segundo, las mutaciones del -7TI rpoB pueden restaurar la capacidad de terminar - :ranscripci6n en sitios dependientes de p en bac::::ias con rho mutantes. Sin embargo, se desconoce .:e funcion tiene Ia interaccion.

La antiterminaci6n es un episodio regulador

TERMINACION

S61o se transcribe Ia regi6n 1

•---Regi6n 1 - - • • - - - - R e g i 6 n 2 - - - - • Promotor

Terminador

El RNA es s61o de Ia regi6n 1 ANTITERMINACION

Se transcriben las regiones 1 y 2

La polimerasa de RNA continua

El RNA representa las regiones 1 y 2

La antitermi naci6n puede cont rolar la transcripci6n al determinar si la polimerasa de RNA termina o lee la siguiente region atravesando un terminador particular.

La polimerasa de RNA transcribe desde el promotor hasta el terminador

La proteina antiterminaci6n permite a Ia polimerasa de RNA dejar atras al terminador

Conceptos principales • La terminaci6n es inhibida cuando las prote\nas amtiterminaci6n actuan sobre la polimerasa de RNA para provocar que esta lea a traves de un terminador espec\fico o de varios de ellos. • El fago A. tiene dos prote\nas antiterminaci6n, pN y pQ, Las· cuales actuan en diferentes unidades de transcripci6n.

_a antiterminaci6n sirve como un mecanismo de :ontrol en los circuitos reguladores de los fagos yen .os operones bacterianos. La ,~ A 11 muestra que la antiterminaci6n controla la capacidad de la _nzima para leer a traves de un terminador a los ge-

Las proteinas antiterminaci6n actuan en terminadores especificos Unidad de transcripci6n Temprana inmediata Temprana inmediata Tardia

Promotor

Terminador

PL

tl

PR1

tR1

p R.

lA·

Proteina antiterminaci6n pN pN pQ

Una prote\na antiterminaci6n puede actuar sobre la polimerasa de RNA para permitirle la ultralectura de un t erm i nador espec\fico.

11.23 La antitermi naci 6n es un episodic regulador

291

nes que yacen mas alla. En el ejemplo que se muestra en Ia figura , la ruta predeterminada establece que las polimerasas de RNA terminen a! final de Ia region l ; sin embargo, Ia antiterminacion le permite continuar Ia transcripcion a traves de Ia region 2. El promotor no cambia, por lo que ambas situaciones producen un RNA con las mismas secuencias 5'; Ia diferencia es que despues de la antiterminaci6n el RNA se extiende para incluir secuencias nuevas en el extrema 3'. La antiterminaci6n se descubri6 en las infecciones por bacteri6fagos. Una caracterfstica frecuente en el control de Ia infecci6n por fagos es que muy pocos de los genes de estos virus (los genes "tempranos") pueden ser transcritos porIa polimerasa de RNA hospedadora. No obstante, entre estos genes hay reguladores cuyos productos permiten que se exprese el siguiente conj unto de genes de los fagos (vease la secci6n 14.4, Dos tipos de episodios reguladares con troJan la cascada lftica). Uno de estos tipos de regulador es una proteina antiterminaci6n. La muestra que esta permite que Ia polimerasa de RNA lea a traves de un terminado r, lo que extiende el transcrito de RNA. En ausencia de la protefna antiterminaci6n, la polimerasa de RNA termina en el terminador (segmento superior de la figura). Cuando la proteina antiterminaci6n esta presente, continua mas alla del terminador (segmento medio de la figura). El ejemplo de antiterminacion mejor caracterizado lo proporciona el fago A, en el cual se descubri6 el fen6meno. Se utiliza en dos etapas de Ia expresi6n del fago. La protefna antiterminaci6n producida en cada etapa es especffica para las unidades de transcripcion particulares que se expresan en esa etapa, como se resume en el segmento inferior de la Figura 11.52. La polimerasa de RNA hospedadora transcrib e en un inicio dos genes, los cuales se denominan genes tempranos inmediatos. La transici6n a Ia siguiente etapa de expresi6n se controla al impedir Ia terminaci6n en los exrremos de los genes tempranos inmediatos, lo cual da como resultado Ia expresi6n de los genes tempranos retrasados. (Se abord6la regulaci6n general del desarrollo de Aen el Capitulo 14, Estrategias de los fagos.) El gen regulador que controla el cambia de Ia expresion temprana inmediata a la expresion temprana retrasada se identifica por medio de mutaciones en el gen A N que transcribe solo los genes tempranos inmediatos; no siguen su curso en el ciclo infeccioso. Hay dos unidades de transcripci6n de genes tempranos inmediatos (transcritos a partir de los promotores PL y PR). La transcripci6n por la polimerasa de RNA de E. coli se detiene en los terminadores localizados en los extremos de estas unidades de transcripci6n (tu y t Rt' respectivamente). 292


Ambos terminadores dependen de p; de hecho, esL fueron los terminadores con los cuales se identific a p en un principia. La situacion cambia porIa e:.presion del gen N. El producto pN es una protefantiterminaci6n que actua en las dos unidades -: transcripci6n temprana inmediata y permite que .: polimerasa de RNA lea a traves de los terminadorea los genes tempranos retrasados que se encuentrc.::. mas alla de ellos. Como sucede en otros fagos, es necesario c control mas para expresar los genes tardfos q·-codifican los componentes de Ia particula del fag Este cambia es regulado por el gen Q, uno de lc genes tempranos retrasados. Su producto, pQ, c otra proteina antiterminaci6n, una que permite C.: manera especffica que Ia polimerasa de RNA inic : en otro sitio, el promotor tardio PR, para la ultrale~ tura de un terminador que se encuentra entre diet promotor y los genes tardfos. Las distintas especificidades de pN y de pQ e-stablecen un principia general importante: la polim:rasa de RNA interactua con las unidades de transcripci,de talmanera que un factor rio puede promover · antiterminaci6n especificamente de algunos transcritr. La terminaci6n puede ser controlada con Ia misn:_: precision que la iniciaci6n.

La antitermi naci6n requiere sitios que son independientes de los terminadores Conceptos principales • El sitio en el cual una prote\na antiterminaci6n actua se encuentra en sentido ascendente al sitio de terminaci6n en la unidad de transcripci6n. • La localizaci6n del sitio antiterminaci6n varia en casas diferentes y puede ubicarse en el promotor o dentro de la unidad de transcripci6n. 2. Que sitios intervienen en el control de Ia especficidad de Ia antiterminaci6n? La actividad antiterminaci6n de pN es muy especffica, pero el episod: .de la antiterminaci6n no esta determinando por los ternc nadores tu y tR 1; el sitio de reconocimiento necesario par.: fa antiterminaci6n se encuentra en sentido ascendente ccrespecto ala unidad de transcripci6n, es decir, en U71lugr:distinto a! sitio de terminaci6n en el cual concluye al fin: fa acci6n. La muestra las ubicacion . de los sitios necesarios para la antiterminaci6n e:_ el fago /... Los sitios de reconocimiento necesarios par'" la acci6n de pN se denominan nut (par sus siglas en ingles: N utilization) . Los sitios encargados de determinar Ia antiterminaci6n hacia la izquierd~

· acia Ia derecha se describen como nutL y nutR, :-::pectivamente. El mapeo de las mutaciones nut :aliza a nutL entre el punta de inicio de PL y el -:cio de Ia region codificadora deN. En contraste, - =R se encuentra entre el extremo del gen cro y tu. :: ··o significa que los dos sitios nut se encuentran ::. posiciones diferentes en relacion con la organi-~ cion de sus unidades de transcripcion. Mientras - e nutL esta cerca del promotor, nutR esta ubicado =~rca del terminador. (De nuevo qut es diferente y "' encuentra dentro del promotor.) (.C6mo ocurre la antiterminacion? Cuando pN -econoce el sitio nut, debe actuar sobre la pol.imerasa e RNA para garantizar que Ia enzirna no pueda res- nder mas a! terminador. Las localizadones variables :e los sitios nut indican que este episodio no esta liga::. a la inidaci6n ni a la terminaci6n, pero que puede :urrir conforme la pol.imerasa de RNA alarga la ca_ena de RNA mas alla del sitio nut. Como se ilustra en ' 1G , Ia pol.imerasa despues se transforma ::-:1. una fuerza inexorable que rebasa al terrninador, ::n prestar atendon a su sefial. (Esta reacci6n implica ~ antiterrninaci6n en los terminadores dependientes ::.e p, pero pN tarnbien suprime Ia terrninaci6n en los ~ =nninadores intrinsecos.) (.ES la capacidad de pN para reconocer una -f cuencia corta dentro de Ia unidad de transcrip:·an un ejemplo de un mecanismo de antitermi__aci6n mas utilizado? Los fagos que estan relaciona]os con A, tienen genes N diferentes y especificidades ..:e antiterminaci6n clistintas. La region del genoma iel fago en Ia cual se encuentran los sitios nut tiene .:na secuencia diferente en cada uno de estos fagos :· cada fago debe, por lo tanto, tener sitios nut carac:eristicos reconocidos de manera espedfica por su . ropio pN. Cada uno de estos productos pN debe :ener Ia misma capacidad general para interactuar :on el mecanismo de transcripci6n y provocar la i ntiterminaci6n, pero tambien tienen una especifij dad diferente para Ia secuencia de DNA que activa : >1mecanismo.

La polimerasa de RNA transcribe desde el promotor hasta el terminador

t

Promotor PL 0 PR

o PR'

Terminador

pN actua en nutL para permitir que Ia polimerasa de RNA deje atras tL

--+-

pN actua en nutR para permitir que Ia polimerasa de RNA deje atras tR1

--+-

La polimerasa de RNA hospedadora transcribe los genes A y termina en los sitios t. pN le permite la ultralectura de los terminadores en las unidades L y R1; pQ le permite la ultralectura del terminador R'. Los sitios en los cuales actua la proteina pN (nut) y en los cuales actUa la proteina pQ (qut) se localizan en posiciones relativas distintas en las unidades de transcripci6n.

Los factores de terminaci6n y de antiterminaci6n interactuan con la polimerasa de RNA Conceptos pri nci pales • Numerosas proteinas bacterianas son necesarias para que la pN de A interactue con La polimerasa de RNA. • Estas proteinas tambien participan en la antiterminaci6n en los operones rrn de la bacteria hospedadora . • El antiterminador pQ de A tiene un mecanisme de acci6n diferente que comprende La union al DNA en el promotor.

{

Los factores actuan sobre Ia polimerasa de RNA

®

p no puede realizar Ia terminacion

Los factores rios se unen a La polimerasa de RNA a medida que pasa por el sitio nut. Impiden que p ocasione la terminaci6n cuando la polimerasa llega al terminador.

11.25 Los factores de terminaci6n y de antiterminaci6n interactuan con la polimerasa de RNA

293

Promotor

Terminador

Sitionut

boxA

boxB

CGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCA GCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyT TCCC GT

Q NusB-810 se une a boxA

NusG facilita pN se el ensamblaje une a del complejo boxB

NusA Factor de terminaci6n general

IG J A L.rr; Los factores rios se unen a la polimerasa de RNA a medida que pasa par ciertos sitios. El sitio nut esta formado par dos secuencias. NusB-510 se une a la enzima central cuando pasa par boxA. Despues, NusA y la proteina pN se unen conforme la polimerasa pasa par boxB. La presencia de pN le permite a la enzima la ultralectura del terminador, lo que produce un RNAm unificado que contiene secuencias tempranas inmediatas adheridas a las secuencias tempranas retrasadas.

La terminacion y la antiterminacion estan conectadas de manera cercana e involucran a protefnas bacterianas y de los fagos que interactuan con la polimerasa de RNA. Numerosas proteinas implicadas en la terminacion han sido identificadas al aislar mutantes de E. coli en los cuales pN es ineficiente. Muchas de estas mutaciones se encuentran en el gen rpoB. Esto demuestra que pN (como el factor p} interactua con la subunidad ~de la enzima central. Otras mutaciones en E. coli que obstaculizan la funcion de pN identifican los loci nus: nusA, nusB, nusE y nusG. (El termino "nus" es un acronirno de "sustancia utilizada porN", por sus siglas en ingles: N utilization substance) Un sitio nut A esta formado por dos elementos de secuencia denominados boxA y boxB. Los elementos de secuencia relacionados con boxA tambien se encuentran en los operones bacterianos. boxA es necesario para la union de protefnas bacterianas que son indispensables para la antiterminacion en los operones de los fagos y de las bacterias. boxB es especffico del genoma de los fagos, y las mutaciones en boxB elirninan la capacidad de pN para provocar la antiterrninacion. Los loci nus codifican proteinas que forman parte del mecanismo de transcripcion, pero que no se afslan con la enzima polimerasa de RNA. Las fun ciones de nusA, nusB y nusG tienen que ver solo con la terminacion de la transcripcion. nusE codifica la protefna ribosomica SlO; la relaci6n entre su ubicaci6n en la subunidad 30S y su funci6n en la terminacion no es clara. Las protefnas Nus se unen a la 294


polimerasa de RNA en el sitio nut, como se resume en la fiG II 1 r;s . NusA es un factor general de transcripcion que incrementa la eficiencia de la terminaci6n, tal vez al aumentar la tendencia de la polimerasa de RNA de hacer pausas en los terminadores (y de heche en otras regiones de la estructura secun daria; vease mas adelante). NusB y SlO forman un dfmero que se une de manera espedfica al RNA que contiene una secuencia boxA. NusG puede estar relacionado con el ensamblaje general de todos los factores Nu~ en un complejo con la polimerasa de RNA. Los terminadores intrfnsecos y dependiente ~ de p tienen diferentes requerimientos de factore~ Nus. NusA es necesario para la te rminaci6n en lo~ terminadores intrfnsecos y Ia reacci6n puede se impedida por pN. En los terminadores dependientes de p son necesarias las cuatro protefnas Nus, y una vez mas pN por sf solo puede inhibir la reaccion. La caracterfstica comun de pN en ambos tipo5 de terminadores es impedir la funcion de NusA er: la terminaci6n. La union de pN a NusA inhibe !c. capacidad de NusA para unirse al RNA, lo cual e5 necesario para la terminaci6n. La antiterminacion ocurre en los operones m: (RNAr) de E. coli y comprende las mismas funcione~ nus. Las regiones lfderes de los operones rrn contienen secuencias boxA; los dfmeros NusB-S 10 reconocen estas secuencias y se unen a la polimerasa de RNA a medida que se alarga mas alla de boxA. Esto altera las propiedades de Ia polimerasa de RNA de tal manera que puede realizar ahara Ia ultralectura de los terminadores dependientes de p que estar. dentro de la unidad de transcripcion. La secuencia boxA del RNA Anose une a NusBS l 0 y es probable que la presencia de Nus A y de pK le permitan hacerlo; la secuencia boxB podrfa ser necesaria para estabilizar la reaccion. Por lo tanto, las variaciones en las secuencias boxA pueden determinar que conjunto particular de factores se requiere para la antiterminacion. Las consecuencias son las mismas: cuando la polimerasa de RNA pasa del sitio nut, es modificada por la adicion de factore s apropiados y es incapaz de terminar cuando se encuentran despues los sitios de terminacion. La antiterminacion en A requiere pN para unirse a la polimerasa de RNA en una forma que depende de la secuencia de la unidad de transcripcion. (,Re conoce pN el sitio boxB en el DNA o en el transcrito de RNA? No se une de forma independiente a ningun tipo de secuencia, pero sf se une a un complejo de transcripci6n cuando la enzima central pasa de. sitio boxB. pN tiene dominios separados que reconocen la secuencia boxB del RNA y Ia protefna NusA. Despues de unirse al complejo de transcripcion, pK permanece asociado a Ia enzima central y se trans-

::na en efecto en una subunidad adicional cuya -=-sencia cambia el reconocimiento de los termina::-es. Es posible que pN de hecho continue unien- ~ se a Ia secuencia boxB del RNA y a Ia polimerasa _ ~RNA, Ia cual mantiene un lazo en el RNA; de este =Jdo, Ia funcion de Ia secuencia boxB del RNA sera ::.parte sujetar a pN en Ia vecindad e incrementar . : manera eficaz su concentracion local. El producto pQ, el cual inhibe Ia terminacion ::>pues en la infeccion por fagos a! actuar en qut, ·_7ne un mecanismo de accion distinto. La secuencia ; se encuentra en el inicio de Ia unidad de transcrip_")n tardfa. La region ubicada en sentido ascendente --= qut esta en el interior del promotor, mientras ..:e Ia parte que se localiza en sentido descendente ~ce en el inicio de Ia region transcrita. Esto indi_.:. que Ia accion de pQ implica el reconocimiento ~ o:l DNA; tambien significa que su mecanismo de ~ ion, al menos con respecto a Ia union inicial al mplejo, debe ser diferente del de pN. pQ interac..:a con Ia holoenzima durante Ia fase de iniciacion. ::: ~ becho, cr70 es necesario par Ia interaccion con pQ. ~'to refuerza Ia idea de que Ia polimerasa de Rl\fA es _ a estructura interactiva en Ia cuallos cambios de . ~nformacion inducidos en una fase pueden afectar .: actividad en una fase posterior. La accion basica de pQ es interferir con las ~ iusas . Una vez que pQ ha actuado sabre Ia poli= erasa de RNA, Ia enzima muestra una capacidad - y reducida para hacer pausas en todos los sitios, _-:cluidos los dependientes de p y los terminadores ::::-rfnsecos. Esto significa que pQ no actua par sf -::::ismo de manera directa en Ia terminacion, sino ~:1 e permite que Ia enzima pase a! terminador con - ayor rapidez, con lo que despoja a Ia polimerasa : ::ntral o al factor rio de Ia oportunidad de - ::-ovocar Ia terminacion. El principia general es que Ia polimerasa de -=~\1 A puede existir en formas que son competentes ~ ~a emprender etapas particulares de Ia transcrip:: 'n, y sus actividades en estas eta pas pueden ser :...:eradas solo si se modifica Ia forma apropiada. Par ~ tanto, las sustituciones de los factores cr pueden ::=mbiar una forma de iniciacion competente a otra; las adiciones de los factores Nus pueden cambiar ;s propiedades de las formas determinacion com~e tentes.

La terminacion parece relacionarse muy de cercon Ia forma de elongacion. En su forma basica ~c transcripcion, Ia polimerasa central esta sujeta a ~uchas pausas durante la elongacion y realizar una : 3.Usa en un sitio de terrninacion es un prerrequisito - :na que ocurra Ia terminacion. Bajo Ia influencia : e factores como NusA, las pausas se extienden, J que incrementa la eficiencia de Ia terminacion; ::::::tientras que bajo la influencia de pN o de pQ, las .:.:1

pausas son mas breves, lo que disminuye la eficacia de Ia terrninacion. Los sitios de reconocimiento para estos factores se encuentran solo en ciertas unidades de transcripcion, y como resultado las pausas, y en consecuencia Ia terminacion, son alteradas solo en dichas unidades.

DID

Resumen

Una unidad de transcripcion esta formada por el DNA que se encuentra entre un promotor, en donde inicia Ia transcripdon, y un terminador, en donde finaliza. Una cadena de DNA en esta region sirve como molde para Ia sfntesis de una cadena complementaria de RNA. La region del hfbrido de RNADNA es cona y transitoria, conforme Ia "burbuja" de transcripcion se desplaza por el DNA. La holoenzima polimerasa de RNA que sintetiza el RNA bacteriano puede separarse en dos componentes. La enzima central es un multfmero de estructura o:2 0~' que se encarga de alargar Ia cadena de RNA. El factor cr es una subunidad individual indispensable en la etapa de Ia iniciacion para el reconocimiento del promotor. La enzima central tiene afinidad general por el DNA. La adicion del factor cr reduce Ia afinidad de Ia enzima por Ia union no espedfica a! DNA, pero incrementa Ia afinidad por los promotores. La velocidad con Ia cualla polimerasa de RNA encuentra sus promotores es demasiado alta para que Ia justifiquen Ia difusion y los os aleatorios con el DNA; tal vez haya un intercambio directo de las secuencias de DNA sujetas porIa enzima . Los promotores bacterianos son identificados par dos secuencias cortas conservadas, centradas en - 35 y -10 en relacion con el punta de inicio . La mayor parte de los promotores tiene secuencias que estan muy relacionadas con las secuencias de consenso en estos sitios. La distancia que separa las secuencias de consenso es de 16 a 18 bp. La polimerasa de RNA en un inicio "aterriza" en Ia secuencia -35 y luego extiende sus os ala region -10. La enzima abarca -77 bp del DNA. El complejo binario "cerrado" inicial es transformado en un complejo binario "abierto" a! desnaturalizar una semencia de -12 bp que se extiende de Ia region - 10 al punta de inicio. La composicion rica en pares de bases A-T de Ia secuencia -1 0 puede ser importante en Ia reaccion de desnaturalizaci6n. El complejo binario es transformado en un complejo ternario par Ia inserci6n de precursores ribonucleotfdicos. Hay multiples ciclos de iniciacion abortiva, durante los cuales Ia polimerasa de RNA sintetiza y Iibera cadenas de RNA muy cortas sin desplazarse del promotor. Al final de esta etapa, hay 11.26 Resumen

295

un cambia en Ia estructura y la enzima central se contrae para cubrir -50 bp. El factor 0 es liberado (en 30% de los casos) o cambia su forma de asociacion con Ia enzima central. La enzima central despues se desplaza por el DNA, sintetizando RNA. Una region del DNA desenrollada de manera local se mueve con Ia enzima. La enzima se contrae mas para cubrir tan solo de 30 a 40 bp cuando Ia Cadena naciente ha alcanzado una longitud de 15 a 20 nucleotidos; despues continua hasta el final de la unidad de transcripcion. La "fuerza" de un promotor describe la frecuen cia con la cualla polimerasa de RNA inicia Ia transcripcion; se relaciona con la cercanfa con Ia cual sus secuencias -35 y -10 se ajustan a las secuencias de consenso ideales, pero tambien influyen en ella las secuencias que se localizan enseguida del pun to de inhibicion en sentido descendente. El superenrollamiento negativo incrementa Ia fuerza de ciertos promotores. La transcripcion genera superenrollamientos positivos delante de la polimerasa de RNA y deja superenrollamientos negativos detras de Ia enzima. La enzima central puede ser dirigida a reconocer promotores con diferentes secuencias de consensa por medio de otros factores 0. En E. coli estos factores 0 son activados por condiciones adversas, como un choque termico o escasez de nitrogeno. B. subtilis contiene un solo factor 0 importante con Ia misma especificidad que el factor 0 de E. coli y tambien contiene una variedad de factores 0 menores. Otra serie de factores es activada cuando se inicia Ia esporulacion; la esporulacion es regulada por dos cascadas en las cuales los remplazos de los factores 0 ocurren en la pre -espora y en Ia celula madre. Asimismo, el fago SPO 1 utiliza una cascada para regular la transcripcion por medio de la sustitucion de factores 0. La geometrfa del reconocimiento entre Ia po limerasa de RNA y el promotor es similar para las holoenzimas que contienen a todos los factores 0 ( excepto al factor 0 54 ). Cad a factor 0 hace que la polimerasa de RNA inicie Ia transcripcion en un promotor que se ajusta a un consenso particular en -35 y -10. Los os directos entre 0 y el DNA en estos sitios se han demosnado en el factor 0 70 de E. coli. El factor 0 70 de E. coli tiene un dominio autoinhibidor terminal N que impide que las regiones de union al DNA reconozcan al DNA. La region de autoinhibicion es desplazada por el DNA cuando Ia holoenzima forma un complejo abierto. La polimerasa de RNA bacteriana forma Ia transcripcion en dos tipos de sitios. Los terminadores intrfnsecos contienen una horquilla rica en G-C seguida por una region rica en U. Son reconocidos in vitro porIa enzima central sola. Los terminadores

296

CAPiTULO 11 Transcripci6n

dependientes de p necesitan el factor p in vitro e i1: vivo; p se une a los sitios rut que son abundantes en C y deficientes en residuos de G y que preceden a: sitio real de Ia terminacion. p es una helicasa hexamerica dependiente de ATP cuya actividad es transferirse a lo largo del RNA hasta que alcanza Ia regioc del hfbrido de RNA-DNA en la burbuja de transcripcion de Ia polimerasa de RNA, en donde disocia a: RNA del DNA. En ambos tipos de terminacion, la5 pausas que realiza Ia polimerasa de RNA son importantes para que tenga Iugar la terminacion. Los fa ctores Nus son indispensables para Ia terminacion . NusA es necesario para los terminadore intrfnsecos y ademas NusB-S 10 es necesario para lo5 terminadores dependientes de p. El dfmero NusBS 10 reconoce Ia secuencia boxA de un sitio nut de: RNA en proceso de elongacion; NusA se une de manera subsiguiente. La antiterminacion es aprovechada por alguno~ fagos para regular Ia progresion de una etapa de Ia expresion genica a Ia siguiente. El gen N A. codifica una protefna antiterminacion (pN) que es necesaria para permitir que Ia polimerasa de RNA lea a trave<; de los terminadores localizados en los extremos dt los genes tempranos inmediatos. Otra protefna antiterminacion , pQ, es necesaria despues en Ia infeccion por fagos. pN y pQ actuan sobre Ia polimerasc. de RNA cuando pasa por sitios especfficos (nut \ qut, respectivamente). Estos sitios estan localizado< en posiciones relativas diferentes en sus unidacl.e' de transcripcion respectivas . pN reconoce a la polimerasa de RNA que transporta a NusA cuando Ia enzima pasa a la secuencia boxB. Luego, pN se une al complejo e impide Ia terminacion al antagoniza: Ia accion de Nu sA cuando la polimerasa alcanza
Referencias

IIIJ

La transcripci6n ocurre por media de apareamiento de bases en una "burbuja" de DNA no apareado

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1111

La reacci6n de la transcripci6n consiste en tres eta pas

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•

La polimerasa de RNA esta formada por la e nzima central y por un factor cr

1111

La asociacion con el factor cr cambia en la iniciacion

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•

Una polimerasa de RNA varada puede reinicia r la transcripcion

IIIII

El factor cr controla la union al DNA

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Referencias

297

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El reconocimiento del promotor depende de las secuencias de consenso

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EIIIJ

La eficiencia de los promotores puede increme ntar o disminuir por media de mutaciones

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m

El superenrollamiento es una caracter\stica importante de la transcri pcion

La sustitucion de los factores cr puede controlar la iniciacion

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298

11:11

Los factores cr entran en o de manera direct: co n el DNA

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~~~~~ La esporulacion es controlada por factores cr

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IE

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CAPITULO 11 Transcripcion

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La polimerasa de RNA bacteriana termina en sitios discretos

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Referencias

299

El Operon ESQUEMA DEL CAPITULO I ---~)

1611 Introducci6n

11601

liB La regulaci6n puede ser positiva o negativa

• Las mutaciones localizadas en el operador provocan la expresion constitutiva de los tres genes estructurales lac. • Estas mutaciones actuan en configuracion cis y afectan solo a aquellos genes que se encuentra n en el frag mento contiguo de DNA.

• En la regulacion negativa, una proteina represora se une a un operador para evitar que se exprese un gen . • En la regulacion positiva es necesario que se una un factor de transcripcion al promotor para permitir a la polimerasa de RNA iniciar la transcripcion.

1601

Los agrupamientos de genes estructurales son controlados de manera coordinada

m;J

• Los genes que codifican proteinas que funcionan en la misma ruta pueden ser adyacentes y ser controlados como una unidad individual que se transcribe en un RNAm policistronico.

•

• La transcripcion del agrupamiento de genes laclYA es controlada por una proteina represora que se une a un operador que se superpone al promotor en el inicio del agrupamiento. • La proteina represora es un tetramero formado par subunidades identicas codificadas por el gen loci.

•

El operon lac puede ser inducido

•

• Las moleculas pequeiias que inducen a un operon son identicas al sustrato en to que se refiere a sus enzimas, o estan relacionadas con el. • Los galactosidos p son los sustratos para las enzimas codificadas par lacZYA. • En ausencia de galactosidos p, el operon lac se expresa solo en un nivel (basal) muy bajo. • La adicion de galactosidos p especificos induce la transcripcion de los tres genes del operon. • El RNAm laces muy inestable; como resultado, la induccion puede revertirse con rapidez. • Los mismos tipos de sistemas que permiten a los sustratos inducir a los operones que codifican enzimas metabolicas pueden ser utilizados para permitir a los productos fin ales reprimir a los operones que codifican las enzimas biosi nteticas.

111!111

El represor es controlado por una pequeiia molecula inductora • Un inductor funciona al convertir a la protein a represo ra en una forma con menor afinidad por el operador. • El represor tiene dos sitios de union, uno para el operador y otro para el inductor. • El represor es desactivado por una interaccion alosterica en la cualla union del inductor a su sitio cambia las propiedades del sitio de union al DNA.

300

Las mutaciones de actuaci6n en trans identifican el gen regulador •

1fD Los genes lac son controlados por un represor

lf:lil

Las mutaciones constitutivas de actuaci6n en cis identifican al operador

•

~g)

Las mutaciones localizadas en el gen lac! actuan en configuracion trans y afectan la expresion de todos los agrupamientos lacZYA en la bacteria. Las mutaciones que eliminan la fun cion de laci provocan expresion constitutiva y son recesivos. Las mutaciones que se encuentran en el sitio de union al DNA del represor son constitutivas debido a que el represor no puede uni rse at operador. Las mutaciones que se localizan en el sitio de union al inductor del represor le impiden ser desactivado e im piden la inducibilidad. Las mutaciones de los promotores son no inducibles y de actuacion en cis.

Las prote1nas multimericas tienen propiedades geneticas especiales • Un represor activo es un tetramero formado par subu nidades identicas. • Cuando se presenta n subunidades mutantes y silvestres, una sola subunidad mutante lacrd puede inactivar a un tetramero cuyas subunidades restantes sean silvestres. • Las mutaciones lacJ"d ocurren en el sitio de union al DNA. Su efecto se explica porque la actividad del represor requiere de todos los sitios de union al DNA en el tetramero para que sea activo.

II!II!J

El mon6mero represor tiene numerosos dominies • Una subunidad represora individual puede ser dividida en un dominic terminal N de union al DNA, una bisagra y el nucleo de la proteina. • El dominic de union al DNA contiene dos regiones helicoidales a cortas que se unen al surco mayor del DNA. • La region de la bisagra se inserta en el surco menor como una he lice a. corta y plegada. • El sitio de union al inductor y las regiones responsab les de la formacion de los multimeros se localizan en el nucleo.

• La induccion reduce la afinidad por el operador a 10' veces la de los sitios de baja afinidad, par lo que solo 3% de los operadores estim unidos. • La induccion provoca que el represor se mueva del operador a un sitio de baja afinidad por desplazamiento directo. • Estos parametres podrian cambiarse con un incremento o reduccion de la concentraci6n efectiva de DNA in vivo.

Un represor es un tetramero formado par dos dimeros • Los monomeros forman un dimero al hacer os entre los domi nies nucleares 1 y 2, y es posible que entre las helices de oligomerizaci6n. • Los dimeros forman un tetramero par media de interacciones entre las helices de oligomerizacion.

La union al DNA es regulada par un cambia alosterico en la conformacion • El dominic de union al DNA de cada monomero dentro de un dimero se inserta en el surco mayor del DNA. • La helice bisagra se inserta en el surco menor del DNA operador. • Un represor activo tiene una conformacion en la cuallos dos dominies de union al DNA de un dimero pueden insertarse en vueltas sucesivas de la doble helice. • La union del inductor interrumpe la helice bisagra y cambia la conformacion de tal manera que los dos sitios de union al DNA nose encuentran en la geometria correcta para hacer os simultaneos.

161m IWi)

lfB)

La proteina represora se une al operador

lfm La traducci6n puede ser regulada • Una proteina represora puede regular la traduccion al impedir que un ribosoma se una a un codon de iniciacion. • La accesibilidad a los codones de iniciacion en un RNAm policistronico puede ser controlada par medio de cambios en la estructura del RNAm, los cuales ocurren como resultado de la traduccion.

La union del inductor libera al represor del opera dar

El represor se une a tres operadores e interactua con la polimerasa de RNA • Cada dimero localizado en un tetramero represor puede unirse a un operador, de tal manera que el tetramero puede unirse a dos operadores de forma simultanea. • La represion total requiere que el represor se una a un operador adicionallocalizado en flujo descendente o ascendente asi como al operador en el promotor lacl. • La union del represor al operador estimula la union de la polimerasa de RNA al promotor, pero impide la transcripcion.

lfB)

La s\ntesis de las prote\nas res controlada par media de regulaci6n autogena • La traduccion de un operon de proteina r puede ser controlada por un producto del operon que se une a un sitio localizado en el RNAm policistronico.

lf:ID

La p32 del fa go T4 es controlada par un circuito aut6geno • p32 se une a su propio RNAm para impedir la iniciacion de la traduccion.

~

El represor siempre esta unido al DNA • Las proteinas que tienen gran afinidad par una secuencia especifica de DNA tambien tienen una afinidad baja por otras secuencias del DNA. • Cada par de bases localizado en el genoma bacteria no es el inicio de un sitio de union de baja afinidad para el represor. • El gran numero de sitios de baja afinidad garantiza que toda la proteina represo ra este unida al DNA. • El represor se une al operador al desplazarse desde un sitio de baja afinidad en vez de hacerlo al equilibrarse en la solucion.

El factor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos • CRP introduce un giro de 90° en el DNA en su sitio de union. • Los sitios de union al CRP se encuentran en ubicaciones muy variables con respecto al promoto r. • CRP interactua con la polimerasa de RNA, pero los detalles de la interaccion dependen de las ubicaciones relativas del sitio de union al CRP y del promotor.

• Diferentes tipos de mutaciones ocurren en dominies distintos de la subunidad del represor.

• La union del inductor provoca un cambia en la conformacion del represor que reduce su afinidad por el DNA y lo Libera del operador.

El AMP dclico es un efector que activa al factor CRP para que actue en multiples operones • CRP es una proteina activadora que se une a una secuencia diana en un promotor. • Un dimero de CRP es activado par una sola molecula de AMP ciclico.

Los fenotipos mutantes se correlacionan con la estructura del dominio

• La proteina represora se une a la secuencia de DNA de doble cadena del operador. • El operador es una secuencia palindromica de 26 bp. • Cada repeticion invertida del operador se une al sitio de union al DNA de una subunidad represora.

La represi6n puede suceder en multiples loci • Un represor actuara en todos los loci que tengan una copia de su secuencia operadora diana.

La regulaci6n autogena se utiliza a menudo para controlar la s\ntesis de ensambles macromoleculares • El precursor de los microtubulos, la proteina tubulina libre, inhibe la traduccion del RNAm de la tubulina.

IW!)

Resumen

El operador compite con los sitios de baja afinidad para unirse al represor • En ausencia de inductor, el operador tiene una afinidad por el represor que es 107 veces mayor que la de un sitio de baja afinidad. • El nivel de 10 tetrameros represores por celulas asegura que el operador este unido al represor 96% del tiempo.

CAPITULO 12 El operon

301

1f11

Introducci6n

La expresi6n genica puede ser controlada en cualquiera de las multiples etapas, las cuales se dividinin en terminos generales en transcripci6n, procesamiento y traducci6n: • La transcripci6n a menudo es controlada en la etapa de iniciaci6n. La transcripci6n casi nunca se controla en Ia elongaci6n, pero puede ser controlada en Ia terminaci6n para determinar si a la polimerasa de RNA se le permite dejar atras un terminador y avanzar al gen o a los genes que se encuentran despues de et. • En las celulas eucari6ticas, el procesamiento del producto de RNA puede ser regulado en Ia etapa de modificaci6n, en Ia de corte y empa lme, en Ia de transporte o en Ia de estabilidad. En las bacterias, un RNAm en principia esta disponible para Ia traducci6n tan pronto ha sido sintetizado, e incluso durante su sintesis, pero durante este periodo las etapas de control no estan disponibles. • La traducci6n puede ser regulada, por logeneral en las eta pas de iniciaci6n y de terminaci6n (como la transcripci6n). La regulaci6n de Ia iniciaci6n es formalmente analoga a la regulaci6n de la transcripci6n: el sistema de circuitos puede ilustrarse en terminos similares para regulaci6n de Ia iniciaci6n de Ia transcripci6n en el DNA o de la iniciaci6n de Ia traducci6n en el RNA. El concepto bdsico que explica c6mo se controla Ia transcripci6n en las bacterias lo proporcion6 Ia formulaci6n clasica del modelo para el control de Ia expresi6n genica elaborado por Jacob y Monod en l 961. Ello s distinguieron dos tipos de secuencias en el DNA: las secuencias que codifican los productos de actuaci6n en trans y las secuencias de actuaci6n en cis que funcionan de manera exclusiva dentro del DNA. La actividad genica es regulada por las interacciones especfficas de los productos de actuaci6n en trans (por lo general protefnas) con las

Gen regulador

! RNAm

!

-

Protefna reguladora

Sitio diana

Gen estructural

Un gen regulador codifica una protelna que actua en un sitio diana del DNA.

302

CAIPiTULO 12 El Operon

secuencias de actuaci6n en cis (por lo general sitio' en el DNA) . En terminos mas formales: • Un genes una secuencia de DNA que cadifica un producto capaz de difundirse . Est producto puede ser una proteina (com en Ia mayor parte de los genes) o puede ser RNA (como en los genes que codificar; RNAt y RNAr). La caracteristica fundamenta : es que el producto se difunde lejos del sitio de s1, sintesis y actua en otra ubicaci6n. Cualquie producto genico que es libre de difundirse para encontrar su objetivo se describe como de actuaci6n en trans. • La descripci6n del concepto actuaci6n er_ cis se aplica a cualquier secuencia de DNA que no es transformada a ninguna otra forma, pero que funciona de manera exclusiva como una secuencia de DNA in situ, qu e afecta s6lo a! DNA al cual esta ffsicamente ligado. (En algunos casos, una secuencia de actuaci6n en cis funciona en un RNA en vez de hacerlo en una molecula de DNA.) Para ayudar a distinguir entre los componentes de los circuitos reguladores y los genes a los cuales regulan, en ocasiones utilizamos los terminos ger: estructural y gen regulador. Un gen estructural e_ tan solo un gen que codifica un producto proteinico (o un RNA). Los genes estructurales representan una enorme variedad de funciones y estructuras proteinicas, como las proteinas estructurales, las enzimas con actividades cataliticas y las proteinas reguladoras. Un gen regulador simplemente describe a u n gen que codifica una proteina (o una molecula de RNA) que interviene en Ia regulaci6n de la expresi6n de otros genes. La forma mas sencilla del modelo regulador se ilustra en Ia : un gen regulador codifica una protefna que controla la transcripci6n al unirs2 a un sitio particular del DNA, o a varios. Esta interacci6n puede regular a un gen diana de forma positiva (la interacci6n activa a! gen) ode forma negativa (la interacci6n desactiva al gen). Los sitios del DNA casi siempre (pero no de forma exclusiva) se localizan enseguida del gen diana, en sentido ascendente. Las secuencias que indican el inicio y el fin de Ia unidad de transcripci6n, el promotor y el terminador, son ejemplos de sitios d e actuaci6n en cis. Un promotor sirve para iniciar la transcripci6n solo de: gen 0 de los genes que estlm conectados jfsicamente a el eJ: el mismo fragmento de DNA . En !a misma forma, Uf:' terminador puede finalizar la transcripci6n s6lo por medio de una polimerasa de RNA que ha atravesado al gen o a los genes precedentes. En su forme: mas simple, los promotores y los terminadores so . elementos de actuaci6n en cis que son reconoddos por la misma especie de actuaci6n en trans, es decir,

~

la polimerasa de RNA (aunque otros factores participan en cada sitio). Hay otros sitios reguladores de actuaci6n en cis . : e a menudo estan yuxtapuestos al promotor o . ·eminados en el. Un promotor bacteriano puede ~!1 er uno o mas de dichos sitios localizados en Ia ::: ~canfa, es decir, en la vecindad inmediata del punde inicio. Un promotor eucari6tico es probable . -'e tenga un numero mayor de sitios dispersos en -•a distancia mas larga . -~ bien

La regulaci6n puede ser positiva o negativa Conceptos principales En La regulaci6n negativa, una proteina represora se une .a un operador para evitar que se exprese un gen. En la regulaci6n positiva, es necesario que se una un factor de transcripci6n al promotor para permitir a la potimerasa de RNA iniciar la transcripci6n.

:..-n modelo clasico del control en las bacterias es .cgativo: una protefna represora impide que un gen ~-=a expresado. La muestra que el "esta: predeterminado " de dicho gen es ser expresado .:: rraves del reconocimiento de su promotor por la limerasa de RNA. Cerca del promotor se encuen:::-a otro sitio de actuaci6n en cis denominado operador, el cual es el objetivo de la protefna represora. .::uando el represor se une al operador, se le impide ::. la polimerasa de RNA iniciar la transcripci6n y, • or lo tanto, !a expresi6n ginica es desactivada. Hay un modelo alternative de control positivo. .:=ste se utiliza en las bacterias (probablemente) con _na frecuencia casi igual a la del control negativo ·· es Ia forma de control mas comun en las eucario:as. Un factor de transcripci6n es necesario para ::yudar a la polimerasa de RNA en la iniciaci6n en :-I promotor. La muestra que el estado . redeterm inado tfpico de un gen eucari6tico es in::.ctivo : la polimerasa de RNA no puede iniciar por sf ::1isma Ia transcripci6n en el promotor. Numerosos :actores de actuaci6n en trans tienen sitios diana calizados en la vecindad del promotor y !a union .:~ algunos ode todos estos fact ores permite a !a polimerasa .:eRNA iniciar !a transcripci6n. El tema uruficador es que las protefnas regulado: -as son factores de actuaci6n en trans que reconocen :-lementos de actuaci6n en cis (por lo general) locali:ados en senti do ascendente con respecto a! gen. Las .::onsecuencias de este reconocimiento sonIa activaj6n o la represi6n del gen, segun el tipo individual ie protefna reguladora. Una caracterfstica tfpica es ue Ia proteina funciona al reconocer una secuencia :nuy corta localizada en el DNA, casi siempre con

Promotor/operador de actuaci6n en cis precede a los genes estructurales Promotor operador Gen(es) estructural(es)

Gen encendido: Ia polimerasa de RNA inicia en el promotor

El gen es apagado cuando el represor se une al operador Represor

I En el control negativo un represor de actuaci6n en trans se une al operador de actuaci6n en cis para apagar la transcripci6n.

GEN APAGADO EN FORMA PREDETERMINADA Punta de inicio

,....--..,•~ Gen

Promotor I

GEN ENCENDIDO POR LOS ACTIVADORES Los facto res interactuan con Ia polimerasa de RNA

-

RNA

En el control positivo, los factores de actuaci6n en trans deben unirse a los sitios de actuaci6n en cis para que la polimerasa de RNA inicie la transcripci6n en el promotor.

una longitud <10 bp, aunque la protefna de hecho se une a un fragmento del DNA un tanto mayor. El promotor bacteriano es un ejemplo: la polimerasa de RNA cubre >70 bp del DNA en la iniciaci6n, pero las secuencias cruciales a las cuales reconoce son los hexameros centrados en las posiciones -35 y -10. Una diferencia significativa en la organizaci6n de los genes entre las procariotas y las eucariotas es que los genes estructurales de las bacterias estan organizados en agrupamientos, mientras que los de las eucariotas se presentan de manera individual. El agrupamiento de los genes estructurales les permite ser controlados de forma coordinada por medio de interacciones en un solo promotor: como resul12.2 La regulaci6n puede ser positiva o negativa

303

tado de estas interacciones, el conjunto completo de genes se transcribe o no se transcribe . En este capitulo se analiza esta forma de control y su uso por parte de las bacterias. Los medios empleados para coordinar el control de los genes eucari6ticos dispersos se abordan en el Capitulo 25, Activaci6n de la transcripci6n.

Ill

lactosa. Las funciones de los tres genes estructurales son: • El gen lacZ codifica la enzima galactosidasa ~, cuya forma activa es un tetramero de -500 kD. La enzima separa un galact6sido ~ en sus azucares constitutivas. Por ejemplo, la lactosa es dividida en glucosa y galactosa (las cuales son metabolizadas posteriormente) . Esta enzima tambien elabora un subproducto importante, Ia alolactosa ~-1,6, Ia cual tiene cierta funci6n en Ia regulaci6n. • El gen lacY codifica Ia permeasa de galact6sido ~ . una proteina de -30 kD unida a la membrana, componente del sis tema de transporte. Esta transporta a los galact6sidos ~ al interior de la celula. • El gen lacA codifica la transacetilasa de galact6sido ~. una enzima que transfiere un grupo acetilo de la acetil-CoA a los galact6sidos ~ · Las mutaciones en lacZ o en lacYpueden crear el genotipo lac, en el cuallas celulas no pueden utilizar Ia lactosa. (La descripci6n genotipica "lac" sin un calificativo indica perdida de la funci6n.) Las mutaciones lacZ elirninan Ia actividad enzimatica e impiden de manera directa el metabolismo de la lactosa. Los mutantes lacY no pueden absorber Ia lactosa del medio. (Ningun defecto es identificable en las celulas lacA. lo cual es desconcertante. Es posible que la reacci6n de acetilaci6n proporcione una ventaja cuando las bacterias crecen en presencia de ciertos analogos de los ga lact6sidos ~ que no pueden ser metabolizados. debido a que la m odificaci6n da origen ala desintox.icaci6n y la excreci6n.) El sistema completo, incluidos los genes estructurales y los elementos que controlan su expresi6n. forma una unidad comun de regulaci6n denominada operon . La actividad del operon es controlada por el gen o los genes reguladores cuyos productos protefnicos interactuan con los elementos de control de actuaci6n en cis .

Los agrupamientos de genes est ructura les so n controlados de manera coordin ada

Concepto principal • Los genes que codifican proteinas que funcionan en La misma ruta pueden ser adyacentes y ser controlados como una unidad individual que se transcribe en un RNAm policistronico.

Los genes estructurales bacterianos con frecuencia estan organizados en agrupamientos que incluyen genes que codifican protefnas cuyas funciones estan relacionadas . A menudo los genes que codifican las enzimas de una ruta metab6lica estan organizados en uno de estos agrupamientos. Ademas de las enzimas que intervienen en la nna, la unidad de control coordinado puede incluir otras actividades relacionadas; por ejemplo, la protefna encargada de transportar Ia molecula pequei'ia (s ustrato) al interior de la celula. El agrupamiento de los tres genes estructurales lac, lacZYA, es tfpico . La resume la organizaci6n de los genes estructural es, sus elementos reguladores asociadas de actuaci6n en cis y el gen regulador de actu aci6n en trans. La caracterfstica principal es que el agrupamiento se transcribe en un solo RNAm policistr6nico a partir de un promotor en el cual se regula !a iniciaci6n de !a transcripci6n. Los productos protefnicos permiten a las celulas absorber y metabolizar los galact6sidos ~, como la

. lac/

.

.

' lA~ 82

3 510

.

lacY

lacZ

DNA

1 040

... ..

.. . . . . ~ 780

825

l

l

RNAm

l Proteina

Represor

l

Galactosidasa ~

Permeasa Transacetilasa

El operon lac ocupa -6 000 bp del DNA . En el lado izquierdo el gen loci tiene su propio pro motor y su propio terminad or. El extrema de la region lac es adyacente al pro moto r, P. El operador, 0, ocupa los primeros 26 bp de la unidad de transcripcion. El gen largo lacl comienza en la base 39 y es seguido par los genes lacY y lacA y par un terminador.

304

CAPITULO 12 El Operon

Los genes lac son controlados por un represor Conceptos principales La transcripcion del agrupamiento de genes laclYA es controlada por una prote\na represora que se une a un operador que se superpone al promotor en el inicio del agrupamiento. La prote\na represora es un tetramero formado por subunidades identicas codificadas por el gen loci. ~-= pueden distinguir los genes estructurales de los ;enes reguladores por los efectos de las mutaciones. -_·aa mutaci6n en un gen estructural priva a Ia celula Ia proteina particular a !a cual codifica el gen. ~ ~ n embargo, una mutaci6n en un gen regulador _ fluye en !a expresi6n de todos los genes estructu~ales a los cuales controla. Las consecuencias de una _ utaci6n en un gen regulador revelan el tipo de -egulaci6n. La transcripcion de los genes lacZYA es controda por una protefna reguladora sintetizada por el =en lacl. Sucede que lac! esta localizado allado de los ;enes estructurales, pero comprende una unidad de ::-anscripcion independiente con su propio promo: r y con su propio terminador. En principia, lac! no - ecesita localizarse cerca de los genes estructurales .:.ebido a que especifica a un producto que se difun::e. Puede funcionar muy bien si es transponado a ::-.talquier otro sitio, o puede estar contenido en una ~10lecula de DNA independiente (Ia prueba clasica •ara un regulador de actuacion en trans). Los genes lac son controlados por medio de re5ulaci6n negativa: son transcritos a menos que sean .:pagados par la protefna reguladora. Una mutacion ::ue desactiva al regulador hace que los genes es.. ucturales permanezcan en Ia condicion expresada. ::: 1producto de lac! se denomina represor Lac, debido ~. que su funcion es impedir Ia expresion de los ge ~ es estructurales. El represor es un tetra.rnero de subunidades .denticas de 38 kD cada una. Hay - 10 tetrameros 7n una celula de tipo silvestre. El gen regulador no controlado porIa disponibilidad de Ia lactosa. Se _anscribe en un RNAm monocistronico a una velo·ctad que parece ser gobernada tan s6lo por la afini.;ad de su promotor porIa polimerasa de RNA. El represor funciona uniendos e a un operador ::uyo sfrnbolo formal es o ,.J localizado al inicio del .:.gr.upam iento lacZYA. El operador se ubica en tre el ""~romotor (P1.J y los genes estructurales (lacZYA). ~uando el represor se une al operador, impide que la po:merasa de RNA inicie la transcripci6n en el promotor. La .JUR amplia nuestra vision de Ia region que

Desenrollamiento

- ..

-50 -40 -30 -20 -10

I

1--·-·-10 20 30~

+ - - - Promotor - - - + se une a Ia polimerasa de RNA + Operador+ se une al represor El represor y la polimerasa de RNA se unen a sitio s que se superpone n alrededor del punta de inicio de la transcripcion del operon lac .

se encuentra al principia de los genes estructurales lac. El operador se extiende desde la posicion -5 justo en sentido ascendente del pun to de inicio del RNAm hasta la posicion +21 localizada dentro de Ia unidad de transcripcion; por lo tanto, se superpone al extrema derecho del promotor. Se anali za Ia relacion entre el represor y la polimerasa de RNA con mayor detalle en !a seccion 12.14, La protefna represora se une al operador, y en Ia secci6n 12.16 El represor se une a tres operadores e interactua con Ia polimerasa de RNA.

1f11

El operon lac puede ser inducido

Conceptos principales • Las moleculas pequeiias que inducen a un operon son identicas al sustrato en lo que se refiere a sus enzimas, o esta n relacionadas con el. • Los galactosidos ~ son los sustratos para las enzimas codificadas por lacZYA. • En ausencia de galactosidos ~, el operon lac se expresa solo en un nivel (basal) muy bajo. • La adicion de galactosidos ~ espec\ficos induce la transcripcion de los tres genes del operon. • El RNAm laces muy inestable; como resultado, la induccion puede revertirse con rapidez . • Los mismos tipos de sistemas que permiten a los sustratos inducir a los operones que codifican enzimas metabolicas pueden ser utilizados para permitir a los productos finales reprimir a los operones que codifican las enzimas biosinteticas .

Las bacterias necesitan responder con rapidez a los cambios que surgen en su ambiente. Las fluctuaciones en el abastecimiento de los nutrientes pueden ocurrir en cualquier momenta y Ia supervivencia depende de la capacidad de cambiar el metabolismo de un sustrato por el de otro. Sin embargo, !a econo12.5 El operon lac puede ser inducido

305

Adici6n del inductor

l

0

2

4

6

8

iO

Nivel de RNAm lac Periodo

~

Periodo

~ 3------1 Nivel inducido

0

2

4 6 8 iO Nivel de galactosidasa fl

i2

min

La adici6n del inductor propicia la rapida inducci6n del RNAm lacy es seguida despues de un breve lapso par la sfntesis de las enzimas; al retiro del inductor le sigue la interrupci6n rapida de la s\ntesis.

mia tambien es importante: una bacteria que destina mucha energfa para satisfacer las demandas del ambiente tiende a estar en desventaja. Por lo tanto, una bacteria evita sintetizar las enzimas de una ruta en ausencia del sustrato, pero esta preparada para producir las enzimas si el sustrato vuelve a aparecer. La sintesis de las enzimas en respuesta ala aparici6n de un sustrato especif:ico se denomina induecion. Este tipo de regulaci6n es generalizado en las bacterias y tambien ocurre en las eucariotas unicelulares (como las levaduras) . El sistema de Ia lactosa de E. coli proporciona el modelo de este tipo de mecanisme de control. Cuando las celulas de E. coli son cultivadas en ausencia de un galact6sido ~ no hay necesidad de galactosidasa ~. y contienen muy pocas moleculas de la enzima, menos de cinco. Cuando se agrega un sustrato apropiado, la actividad enzimatica aparece en forma muy rapida en las bacterias . En 2 a 3 min hay cierta cantidad de enzima, y pronto aparecen -5 000 moleculas de la enzima en cada bacteria. (En condiciones adecuadas, Ia galactosidasa ~ puede representar de 5 a 10% del total de protefna soluble de Ia bacteria.) Si se retira el sustrato del medio, Ia sfntesis de la enzima se detiene con Ia misma rapidez con que comenz6. La resume las caracterfsticas esenciales de Ia inducci6n. El control de Ia transcripci6n de los genes lac responde con mucha rapidez al inductor, como se muestra en Ia parte superior de la figura. En ausencia del inductor, el operon se trans306


cribe en un nivel basal muy bajo. La transcripci6 __ es estimulada en cuanto se agrega el inductor; 1 ~ cantidad de RNAm lac aumenta de manera n1pidc: a un nivel inducido que refleja un balance entre lc. sfntesis y Ia degradaci6n del RNAm. El RNAm laces muy inestable y se degrada despues de una vida media de apenas unos 3 min. Estc. caracterfstica permite que Ia inducci6n sea revertida con rapidez. La transcripci6n cesa en cuanto se retira al inductor, y en un periodo muy corto tod0 el RNAm lac habra sido destruido y el contenid<' celular regresara al nivel basal. La producci6n proteinica se observa en Ia parte inferior de la f:igura. La traducci6n del RNAm la: produce galactosidasa ~ (y los productos de los otro: genes lac) . Hay un rezago corto entre Ia aparici6 del RNAm lacy el surgimiento de las primeras moleculas enzimaticas completas (Ia concentraci6n d protefna comienza a aumentar unos 2 min despue~ del incremento del nivel basal de RNAm). Hay ur. rezago similar para alcanzar los niveles inducido: maximos de RNAm y de protefna. Cuando se retira al inductor, Ia sfntesis de Ia enzima cesa casi de inmediato (a medida que el RNAm es degradado ) pero la galactosidasa ~que se encuentra en la celulc: es mas estable que el RNAm, de tal manera que Ia actividad de Ia enzima permanece en el nivel indu· cido durante mas tiempo. Este tipo de respuesta rapida a los cambios en e: abastecimiento de nutrientes no solo proporciona 1.: capacidad de metabolizar sustratos nuevas, sino quctambien sirve para desactivar la sfntesis endogene. de compuestos que aparecen de manera subita er: el medio. Por ejemplo, E. coli sintetiza el aminoacido tript6fano por medio de Ia acci6n de la enzima sintetasa de tript6fano. Sin embargo, si el medio en e: cuallas bacterias son cultivadas proporciona el tript6fano, la producci6n de la enzima es interrumpid<: de inmediato. A este efecto se le llama represi6n Permite ala bacteria evitar que sus recursos se destinen a actividades sinteticas innecesarias. La inducci6n y Ia represi6n representan el mismo fen6meno. En un caso la bacteria ajusta su capacidad para utilizar un sustrato determinado (com la lactosa) para el crecimiento; en el otro, ajust· su capacidad para sintetizar un intermediario me· tab6lico particular (como un aminoacido esencial El desencadenante de cualquier tipo de ajuste ~ una molecula pequeii.a que es el sustrato, o que esta relacionada al sustrato de la enzima, o que ~ el producto de Ia actividad enzimatica, respectivemente. Las moleculas pequeii.as que provocan 1::. producci6n de las enzimas capaces de metaboliza~ las se denominan inductores . Aquellas molemla... que impiden la producci6n de enzimas capaces d: sintetizarlas se llaman correpresores.

El represor es controlado por una pequena molecula inductora I

_..,ceptos principales

El tetramero se une al operador

y bloquea Ia transcripci6n

Jn inductor funciona al convertir a La prote1na ·epresora en una forma con menor afinidad por el )perador. :t represor tiene dos sitios de union, uno para el Jperador y otro para el inductor. :t represor es desactivado por una interaccion alosterica en la cualla union del inductor a su sitio :ambia las propiedades del sitio de union al DNA.

..::. :apacidad de actuar como un inductor o como un ~epresor es muy especffica . Solo sirven el sustra~roducto o una molecula muy relacionada. Sin __i: J argo, en Ia mayor parte de los casos la actividad .--? molecula pequeiia no depende de su interacci6n con =·nzima diana. No obstante, para el sistema lac el _~u ctor natural es un subproducto de Ia enzima --z, Ia alolactosa ~-1 ,6, producida porIa transglico .5.cion de Ia ligadura ~-1 , 4 en Ia lactosa. La alolac-5.1 tam bien es un sustrato de Ia enzima lacZ, por lo _e no persiste en la celula. Algunos inductores se ::mejan a los inductores naturales del operon lac, -:::-o no pueden ser metabolizados por la enzima. El : ::mplo por excelencia es el isopropiltiogalactosido .:?TG), uno de los numerosos tiogalactosidos que ::entan esta propiedad. El IPTG no es reconocido :- Ia galactosidasa ~; de cualquier manera, es un -: ·uctor muy eficiente de los genes lac. A las moleculas que inducen Ia sfntesis enzima :3. pero que no son metabolizadas, se les denomi=. inductores gratuitos. Son muy (!tiles porque =rmanecen en Ia celula en su forma original. (Un - ::uctor real serfa metabolizado, interfiriendo asf _!1 el estudio del sistema.) La existencia de induc~e s gratuitos revela un punto importante . El sis- :a debe poseer algun componente, distinto a Ia enzima :na, que reconozca a! sustrato apropiado, y su capacidad J a reconocer sustratos potenciales relacionados es dife_- :re a lade la enzima. El componente que responde al inductor es Ia - :utefna represora codificada por lacl. Los genes es:-Jcturales lacZYA se transcriben en un solo RN Am _ !)artir de un promotor adyacente a lacZ que se .::-.cuentra en sentido ascendente. El estado del -:' :;J resor determina si este promotor es activado o .:: -activado: • La A muestra que en ausencia de un inductor los genes nose transcriben, debido a que Ia protema represora se encuentra en una forma activa que esta unida a! operador. • La , muestra que cuando se agre ga un inductor, el represor muta a una for -

j''"' \;:.~:;' (/~f.

!

-

Mon6mero

lacZ

lacY

lac A

El gen lac/ sintetiza al mon6mero represor que forma al tetramero Tetramero

El represor mantiene al operon lac en co ndicion inactiva al unirse al operador. La forma del represor se representa como una serie de dominios conectados segun lo revela su estructura cristalina (vease mas adelante).

INDUCTOR - •

t A A. I

t

f

El inductor transforma al represor lac en una forma inacliva que no puede unirse al operador

f

La adicion del inductor transform a al represor en una forma inactiva incapaz de unirse al operador. Esto permite a la polimerasa de RNA iniciar la transcripcion.

rna sin afinidad menor por el operador o es convertido a una forma con menor afinidad que abandona a! operador. Despues inicia Ia transcripcion en el promotor y procede a naves de los genes hasta un terminador localizado despues del extrema 3' del gen lacA. Las caracterfsticas mas importantes del circuito de control residen en las propiedades dobles del represor: puede impedir Ia transcripcion y puede reconocer Ia pequefia molecu la inductora. El represor tiene dos sitios de union; uno para el operador y uno para el inductor. Cuando el inductor se u ne a su sitio, cambia Ia conformacion de la protefna de ta l forma que influye en la actividad del sitio de union al operador. La capacidad de un sitio localiza12.6 El represor es controlado par una pequeiia molecula inductora

307

do en la protefna para controlar la actividad de otro se llama control alosterico. La induccion logra una regulacion coordinada: todos los genes se expresan (o no) al unfsono. El RNAm es traducido de forma secuencial desde su extrema 5' , lo cual explica porque Ia induccion siempre provoca Ia aparicion de galactosidasa ~ , de permeasa de galactoside ~ y de transacetilasa de ga lactoside ~, en ese orden. La traduccion de un RNAm comun explica porque las cantidades relativas de las tres enzimas siempre permanecen iguales en condiciones variables de induccion. La induccion provoca un cambio que ocasiona que los genes sean transcritos. La eficacia de los inductores varfa, y hay otros factores que influyen en el nivel absoluto de Ia transcripcion o de Ia traduccion, pero Ia re lacion entre los tres genes esta predeterminada por su organizacion. Se observa una posible paradoja en la constitucion del operon. El operon de Ia lactosa contiene el gen estructural (lacZ) que codifica Ia galactosidasa ~ con Ia actividad necesaria para metabolizar a! azucar; tambien incluye el gen (lacY) que codifica Ia protefna indispen sable para transportar el sustrato al interior de Ia celula. Sin embargo, si el operon se encuentra en un estado reprimido, (,COmo entra el inductor a Ia celula para iniciar el proceso de induccion? Dos caracterfsticas garantizan que siempre h aya una cantidad mfnima de protefna en Ia celula, suficiente para iniciar el proceso. Hay un nivel basal de expresion del operon: incluso cuando no es inducido, se expresa en un nivel residual (0.1% del nivel inducido). Ademas, cierta cantidad de inductor entra de cualquier forma por otro sistema de transporte .

1111

afectan Ia expresi6n de todos los genes estructurales y qut· elaboran el mapeo fuera de ellos. Se dividen en do~ clases. El promotor y el operador son identificados como dianas para las proteinas reguladoras (Ia polimerasa de RNA y el represor, respectivamente por mutaciones de actuaci6n en cis. Ellocus lac! e5 identificado como el gen que codifica Ia protefna represora por medio de mutaciones que eliminar. el producto de actuacion en trans. El operador fue identificado en un inicio po~ mutaciones constitutivas, a las que se les asigno e: sfmbolo oc, cuyas propiedades distintivas ofrecieror: la prim era prueba de un elemento que funciona sin se ~ representado en un producto que se difunde. Los genes estructurales contiguos con una mutacion oc se expresan en terminos constitutivos porqu la mutacion cambia el operador de tal manera que e: represor ya no es capaz de unirse a el. Por lo tanto, el represor no puede impedir que Ia polimerasa d RNA inicie la transcripcion. El operon se transcribe en te rminos constitutivos, como se ilustra en Ia l

El operador puede controlar solo los genes la c adyacentes a el. Si un segundo operon lac es introducido en una bacteria en una molecula de DNA indepen diente, tiene su propio operador. Ninguno de los operadores recibe la influencia del otro operador. Por lo tanto, si un operon tiene un operador de tip o silvestre, sera reprimido en las condiciones habituales, en tanto que un segundo operon con una mutacion ocsera expresado en su forma caracterfstica. Estas propiedades definen a! operador como un tipico sitio de actuacion en cis, cuya funcion depende del reconocimiento de su secuencia de DNA por alg un factor de actuacion en trans. El operador con-

Las mutaciones co nstitutivas de actuaci6n en cis identifican al operador

Conceptos principales • Las muta ciones localizadas en el operador provocan La expresion constitutiva de los tres genes estructurales lac. • Estas mutaciones actuan en configuracion cis y afectan so lo a aquellos genes que se encuentran en el fragmento contiguo de DNA .

Las mutaciones que tienen Iugar en el circuito regulador pueden inhibir la expresion del operon o provocar una expresion no regulada. Los mutantes que no pueden ser expresados en absoluto se llaman no inducibles . La expresion continua de un gen que no responde a Ia regulacion se denomina expresion genica constitutiva, y los mutantes con esta propiedad se conocen como mutantes constitutivos. Los componentes de un circuito regu lador del operon pueden identificarse por las mutaciones que 308


t t

I

1 1 I

,

#f

, El represor no puede unirse a un ope:;dor mutante

, ,'

El oper6n es tran scrito

y traducido

Las mutaciones operadoras son constitutivas debido a que el operador es inca paz de unirse a la prote1na represora; esto permite que la polimerasa de RNA tenga sin restricciones al promotor. Las mutaciones 0' actuan en cis parque afectan solo al conjunto contiguo de genes estructurales.

:a los genes adyacentes a pesar de la presencia de :::- s alelos del sitio en la d~ lula . Una mutacion en -~ de estos sitios (p. ej ., la mutacion o c) se describe : :nanera formal como dominante en cis. Una mutacion en un sitio de actuacion en cis puede ser asignada a un grupo de complemen-~:6 n. (La capacidad de complem entar defin e a los _::les que se expresan como productos qu e se di_:1den.) Cuando dos sitios de actuacion en cis se -~ :uentran cerca uno del otro (p. ej ., un operador y -_promotor) nose pueden clasificar las mutaciones __una prueba de complementacion. Solo es posi~ distinguirlos por sus efectos sobre el fenotipo. La dominancia en configuracion cis es una ca: ::erfstica de cualquier sitio fisicamente contiguo a las -~ rencias a las cuales controla. Si un sitio de control _x iona como parte de un RNAm policistronico, - mutaciones en el exhibiran exactamente el mismo ·:ron de dominancia en cis que m os trarfan si fun--!laran en el DNA. El factor determinante es que _ sitio de control no puede separarse en terminos -~co s de los genes a los cuales regula . Desde el punj e vista genetico, no importa si el si tio y los genes _J n juntos en el DNA o en el RNA.

Las mutaciones de actuaci6n en trans identifican el gen regulador ;:onceptos principales Las mutaciones localizadas en el gen laci actCtan en configuracion trans y afectan la expresion de todos los agrupamientos lacZYA en la bacteria. Las mutaciones que eliminan la funcion de laci provocan expresion constitutiva y son recesivos. • Las mutaciones que se encuentran en el sitio de union al DNA del represor son constitutivas debido a que el represor no puede unirse al operador. • Las mutaciones que se localizan en el sitio de union al inductor del represor le impiden ser desactivado e 'mpiden la inducibilidad. Las mutaciones de los promotores son no inducibles y de actuacion en cis.

de un gen lacJ+ normal restablece el controL a pesar de la presencia del gen laci- defectuoso . Las mutaciones que se presentan en el operon que son no inducibles se dividen en los mismos dos tipos de clases geneticas que los mutantes constitutivos: • Las mutaciones de los promotores son de actuacion en cis. Si impiden qu e la polimerasa de RNA se una a P1ac' producen un operon no funcional debido a qu e no puede ser transcrito. • Las mutaciones que inhiben la capacidad del represor para unirse a! inductor se describen como lacJS. Son de actuacion en trans. El represor queda "bloqueado" en la forma activa que reconoce al operador y que impide Ia transcripcion. La adici6n de inductor no tiene efecto alguno debido a que su union es impedida o no puede propiciar el cambia alosterico y, por lo tanto, es imposible convertir a! represor a la forma con baja afinidad por el operador. El represor mutante se une a todos los operadores lac de la celula para evitar su transcripcion y no puede ser eliminado, a pesar de las propiedades de cualquier protefna rep res ora de tipo silvestre que pueda estar presente, por lo que es geneticamente dominante. Los dos tipos de mutaciones en el gen lacl permiten identificar los sitios activos individuales de Ia protefna represora. El sitio de union al DNA reconoce la secuencia del operador. Es identificada por mutaciones puntuales constitutivas que impiden que el represor se una al DNA para bloquear Ia polimerasa de RNA . El sitio de union al inductor es identificado por mutaciones puntuales que imposibilitan la induccion, debido a que el inductor no puede unirse para desencadenar el cambia alosterico en el sitio de union al DNA.

1f11 Las prote1nas multimericas tienen propiedades geneticas especiales Conceptos principales

.....:. :ranscripcion constitutiva tambien es ocasionada :- rnutaciones de tipo laci-, las cuales son provoca--'.i por perdida de !a funcion (incluidas las deleciones :: gen). Cuando el represor es inactivo o esta ausen: ~ a transcripcion puede iniciar en el promotor. La 12 ( muestra que los mutantes laci~ expresan : genes estructurales to do el tiempo (constitutiva_:-:lte), sin importar si el inductor esta presente o ausente, _Jido a que el represor esta inactivo. Ambos tipos de mutaciones constitutivas pueden d nguirse en terminos geneticos. Los mutantes o c :::! dominantes en cis, en tanto que los mutantes ..:.~ son recesivos. Esto significa que !a introduccion

• Un represor activo es un tetramero formado par subunidades identicas. • Cuando se presentan subunidades mutantes y silvestres, una sola subunidad mutante lacJ-d puede desactivar a un tetramero cuyas subunidades restantes sean silvestres. • Las mutaciones lacJ-d ocurren en el sitio de union al DNA. Su efecto se explica porque la actividad del represor necesita todos los sitios de union al DNA en el tetramero para que sea activo.

Una caracteristica importante del represor es que es multimerico . Las subunidades del represor se asocian de manera aleatoria en la celula para formar el

12.9' Las prote\nas multimericas tienen propiedades geneticas especiales

309

giro Helice-giro-helice -

hEilice u

hEilice a.

BisagraEl gen lac/- sintetiza al represor defectuoso que no se une al DNA

t El operon es transcrito y traducido

Las mutaciones que desactivan al gen loci provocan que el operon sea expresado constitutivamente, debido a que la proteina represora mutante no puede unirse al operador.

tem1mero activo. Cuando hay dos alelos diferentes del gen lacl, las subunidades formadas por cada uno pueden asociarse para formar un heterotetramero, cuyas propiedades son diferentes a las del homotetramero. Este tipo de interaccion entre las subunidades es una caracteristica distintiva de las protefnas multimericas y se describe como complementaci6n interalelica. Entre algunos mutantes represores ocurre cmnplementaci6n negativa, como se observa en Ia combinacion de los genes fact-
El mutante lacl-
La estructura de un monomero de represor L= identifica numerosos dominios independientes. Estructura -: presentada a partir del archivo PDB 1lbg de Hangli Zhar proporcionada por Kathleen S. Matthews, Rice University.

cion de un represor que no puede unirse a! operad y, por lo tanto, es constitutiva, como los alelos lac.~ La mutacion de tipo lacJ- desactiva al represor; e:. consecuencia, suele ser recesiva con respecto al ti silvestre. Sin embargo, e! superfndice -d indica qt.: ~ esta variante del tipo negativo es dominante cuan se aparea con un alelo de tipo silvestre. Dichas mute.· ciones se denominan dominantes negativas. La explica este fenomeno. La rc: zon de la dominancia es que el alelo lacJ-d produ una subunidad "mala", Ia cual noes solo incapaz unirse por sf misma a! DNA operador, sino que, dtbido a que es indispensable como parte del sitio
El mon6mero represor tiene numerosos domi nios Conceptos principales Un mutante /aci-d crea un monomero que tiene un sitio daiiado de union al DNA (simbolizado por un circulo rojo). Cuando se presenta en la misma celula como un gen de tipo silvestre, los represores multimericos son ensamblados en forma aleatoria a partir de ambos tipos de unidades. Solo se requiere que una de las subunidades del mult\mero sea de tipo /aci-d para bloquear la funcion del represor. Esto explica el comportamiento dominante negativo de la mutacion /aci-d.

310

CA IiULO l 2 El Operon

• Una subunidad represora individual puede dividirse en un dominio terminal N de union al DNA, una bisagra y el nucleo de la prote\na. • El dominio de union al DNA contiene dos regiones helicoidales a cortas que se unen al surco mayor del DNA. • La region de la bisagra se i nserta en el surco menor como una helice a corta y plegada.

:_ sitio de union al inductor y las regiones encargadas de -~ formacion de los multimeros se localizan en el nucleo.

_ ~:' presor tiene numerosos dominios. El dominio - ..:nion al DNA ocupa los residuos 1-59 y se co:-: como casco. Puede diviclirse del resto del mo_ero, conocido como nucleo, por Ia tripsina. La .:-Jctura cristalina en Ia muestra una ~:pectiva mas detallada de estas regiones. El extrema N del monomero esta formado por - helices a separadas por un giro. Este es un ele:_ to comun de union a! DNA denominado HTH ~ 'ce-giro-helice); las dos helices a caben en el sur:Jlayor del DNA, en donde forman os con _-,s especificas (vease Ia seccion 14.11, El represor _j_za un elemento helice-giro- he lice para unirse al -A). Esta region esta conectada por una bisagra a! ::po principal de la proteina. En Ia forma unida ::>~A del represor, Ia bisagra forma una helice a _:_uefia (como se muestra en Ia figura), pero cuanel represor no esta unido al DNA esta region esta -~ rdenada. El elemento HTH y Ia bisagra juntos :-:-esponden a! domino de union a! DNA. El volumen del nucleo esta formado por dos re:les con estructuras similares (los dorninios nu:~res l y 2). Cada uno cuenta con una lamina ~ pa: .. -." Ia de seis cadenas emparedada entre dos helices .:. cada !ado. El inductor se une a una hendidura _: :cada entre las dos regiones. En el extrema C, hay -= ~ helice a que contiene dos septetos de leucina . = .e es el dominio de oligomerizacion. Las helices -:- oligomerizacion de cuatro monomeros se asocian .:.:a mantener la estructura tetramerica.

ro (centro) que se mantiene unido por un conjunto terminal C formado por cuatro helices. Los sitios de las mutaciones se ilustran en forma de abalorios localizados en Ia estructura de Ia parte inferior. Las mutaciones lacJS hacen que el represor no reaccione ante el inductor, de tal manera que el operon noes inducible. Se mapean en dos grupos: en color gris se muestran las localizadas en Ia henclidura de union al inductor, y en color amarillo se muestran aquellas que afectan Ia interfase del dimero del domino nuclear l. El primer grupo inh.ibe el sitio de union al inductor; el segundo grupo evita que los efectos de la union del inductor se transrnitan al sitio de union al DNA. Las mutaciones lacJ-d que afectan Ia oligomerizacion se mapean en dos grupos. En color blanco se muestran las mutaciones en el dorninio nuclear 2 que impiden Ia formaci6n del dimero. En color morado se sefialan aquellas ubicadas en la helice de oligomerizacion que impiden la formacion del tetramero a partir de los dfmeros. -+

-+ lnteracciones en el dfmero N

Dos dimeros forman un tetramero

Un represor es un tetramero formado par dos d1meros c.Jnceptos plincipales • Los monomeros forman un d\mero al hacer os entre los dominios nucleares 1 y 2, yes posible que entre las helices de oligomerizacion . Los dimeros forman un tetramero por media de interacciones entre las helices de oligomerizacion.

La 1 J

muestra la estructura del ntlcleo ::~america (con un sistema de modelado diferente j e la Figura 12.12). De hecho, esta formado por _: ~ dimeros. El cuerpo del dfmero contiene una in::-=ase laxa entre las regiones terminales N de los - )nomeros nucleares, una hendidura a Ia cual se -e el inductor, y un nucleo hidrofobo (parte supe- : r . Las regiones terminales C de cada monomero Jresalen como helices paralelas. (El casco se unira .35 regiones terminales N en Ia parte superior.) Los -=:1eros juntos interactt'lan para formar un tetrame1

Conjunto de cuatro helices

Las mutaciones idel'ltifican los sitios funcionales

/Senla---interfase del dfmero

IS en Ia hendidura--inductora Oligomerizaci6n - - - Oligomerizaci6n

c c La estructura cristalina de La region nuclear del represor Lac identifica las interacciones entre los monomeros en el tetramero. Cada monomero es identificado por un color diferente. Las mutaciones estan coloreadas de la siguiente manera: interfase del dimero =amarillo; union al inductor= azul; oligomerizacion = blanco y purpura. Fotografias cortesia de Benjamin Wieder and Ponzy Lu , University of Pennsylvania. 12.11 Un represor es un tetramero formado por dos dimeros

311

Con estos datos se puede deducir el esquema que se muestra en !a , Ia cual muestra !a forma en Ia que estan organizados los monomeros en el tetramero. Dos monomeros forman un dfmero por medio de os en el dominio nuclear 2 y en Ia helice de oligomerizacion. El dfmero tiene dos dominios de union al DNA en un extrema de la estructura y a las helices de oligomerizacion en el otro extremo. Despues, dos dfmeros forman un tetramero mediante interacciones en Ia interfase de oligomerizacion.

Sitios de uni6n al DNA

Dominies nucleares 2

Oligomerizaci6n 2

El tetramero represor esta formado por dos d\meros. Estos se mantienen unidos por media de os que involucran a los dominies 1 y 2 y por la helice de oligomerizacion. Los d1meros estan ligados en el tetramero por la interfase de oligemerizacion.

Los cascos se unen a giros sucesivos en el surco mayor

Nucleo

La union del inductor cambia Ia conformaci6n en Ia bisagra, por lo que los cascos no embonan en el surco

lfiE

Conceptos principales • El dominic de union al DNA de cada monomero dentro de un d1mero se inserta en el surco mayor del DNA. • La helice bisagra se inserta en el surco menor del DNA operador. • Un represor activo tiene una conformacion en la cual los dos dominies de union al DNA de un d1mero pueden insertarse en vueltas sucesivas de la doble helice. • La union del inductor interrumpe la helice bisagra y cambia la cenformacion de tal manera que los dos sitios de union al DNA no se encuentran en la geometr\a correcta para hacer os simultaneos.

Trabajos anteriores sugirieron un modelo en el cu.a: el casco es relativamente independiente del nucleo. Puede unirse al DNA operador a! formar el mism patron de os con una mitad de sitio com represor intacto. Sin embargo, su afinidad por e: DNA es numerosas ordenes de magnitud menor que Ia del represor intacto. La razon de Ia diferencia es que Ia forma dimerica del represor intacto permite que dos cascos entren en o con el operadar de manera simultanea y cada uno se enlaza a una mitad de sitio. La _ muestra que lo5 dos dominios de union al DNA de una unidad dimerica hacen o con el DNA a! insertarse en giros sucesivos del surco mayor. Esto incrementa en grar. medida la afinidad por el operador. Un element clave de la union es la insercion de la helice bisagra corta en el surco menor del DNA operador, lo que une a! DNA por -45°. Este doblez orienta al surco mayor para !a union del elemento HTH. La union del inductor ocasiona un cambia de conformacion inmediato en Ia protefna represora. La union de dos moleculas de inductor al tetramer represor es adecuada para liberar Ia represion. La union del inductor deteriora las helices bisagra y cambia !a orientacion de los cascos en relacion con el nucleo, lo cual ocasiona que los dos cascos de U I~ dfmero ya no puedan unirse de manera simultanea a! DNA. Esto elimina !a ventaja del represor multimerico y reduce Ia afinidad por el operador.

Ef!ll El inductor cambia la estructura del nucleo de tal manera que la helice bisagra se desdobla y las regiones HTH del d\mero represor ya nose encuentran en una orientacion que permita la union al DNA.

312


La umon al DNA es regulada por un cambia alosterico en la conformaci6n

Los fenoti pos mutantes se correlacionan con la estructura del dominic

Concepto principal • Diferentes tipes de mutacienes ocurren en dominies distintos de la subunidad del represor.

m utaciones en el represor Lac identificaron ::5:istencia de diferentes dominies incluso antes . ~ 1e se conociera Ia estructura. Ahora se puede :icar de manera mas cabal Ia naturaleza de las _:aciones gracias a Ia referencia de Ia estructura, · se resume en Ia l as mutaciones recesivas de tipo Zaer- pueden . - ~ir en cualquier Iugar de la protefna. En esencualquier mutacion que desactive ala proteina · _ ra este fenotipo. El mapeo mas detallado de , mutaciones que se observa en Ia estructura __alina de Ia Figura 12. 13 identifica los dafios es: :-:rrcos de algunas de estas mutaciones, como las :: afectan Ia oligomerizaci6n. l a clase especial de mutaciones lacJ-d dominan· :1egativas se encuentra en el sitio de union al ·_ de la subunidad represora (vease la seccion _ 9, Las protefnas multimericas tienen propiedades ; eticas especiales). Esto explica su capacidad para - ~ dir que los tetrameros mjxtos se unan a! ope_.:._ r; una reduccion del numero de sitios de union ::-~inuye la afinidad especffica por el operador. La -:cion de Ia region termjnal N en Ia union especf. -=. al DNA tambien se demu estra por su localiza:: como el sitio donde tienen Iugar mutaciones : union fuerte". Estas incrementan la afirudad del -- :-esor por el operador, en algunas ocasiones tanto _-: no puede ser liberado por el inductor. Ocurren .. poca frecuencia. las mutaciones no inducibles lacl5 se mapean ~ran medida en Ia region del domiruo nuclear l :: extienden desde el sitio de union a! inductor .:.::a Ia bisagra. Un grupo se ubica en los aminoaci~ que entran en o con el inductor, y estas _:adones funcionan al impedir la union del indue~ l as mutaciones restantes se encuentran en sitios -:- deben participar en la transmision del cambio :cerico de la conformacion ala bisagra cuando se -: -:- el inductor.

La proteina represora se une al operador I

=.:-:ceptos principales _a proteina represo ra se une a la secuencia de DNA de :oble cadena del operador. :. opera.dor es una secuencia palindr6mica de 26 bp. :ada repetici6n invertida del operador se une al sitio :e union al DNA de una subunidad represora.

-::presor se aisl6 en un principia mediante Ia pu:::acion del componente capaz de unir al inductor _: ito IPTG. (La cantidad de represor que se en: .. tra en la celula es demasiado pequefia para ob. : er suficiente material; fue necesario utilizar una

Extrema N

Sitios de las mutaciones

}

/ac/-d (dominante negativa; no puede unirse al DNA)

l

/ac!•

/act· (recesiva; no puede reprimir)

(dominante; no puede unirse al inductor)

Extrema C

Las ubicaciones de los tres tipos de mutaciones en el represor de la lactosa se mapean en la estructura de la proteina. Los mutantes recesivos laci- que no pueden reprimir pueden mapearse en cualquier lugar de la proteina. Los mutantes dominantes negativos lacJ·d que no pueden reprimir se mapean en el dominio de union al DNA. Los mutantes dominantes lacJS que no pueden inducir debido a que no se unen al inductor o que no pueden experimentar el cambio alosterico se mapean en el dominio nuclear 1.

mutacion aceleradora [ promotora] para incrementar la transcripcion lacl y para colo car a este locus lacl en una molecula de DNA presente en numerosas copias por celula. Esto da como resultado una sobreproduccion total de I 00 a 1 000 veces mayor. ) El represor se une a! DNA de doble cadena que contiene Ia secuencia del operador lac de tipo silvestre. El represor nose une al DNA de un mutante oc. La adicion de IPTG Iibera al represor del DNA operadar in vitro. La reaccion in vitro entre Ia protefna represo ra y el DNA operador, por lo tanto, exhibe las caracteristicas del control inferido in vivo; de este modo, puede servir para establecer las bases de Ia represi6n. ;,_Como reconoce el represor la secuencia especffica del DNA operador? El operador tiene una caracterfstica que es comun a muchos sitios de reconocimiento para las protefnas reguladoras bacterianas: es u n palindrome. Las repeticiones invertidas se resaltan en la . Cada repetici6n puede considerarse como una mjtad de sitio del operador. Se puede recurrir a los mismos m etodos utilizados en el analisis de Ia interacci6n polimerasapromotor para definir los puntos con los que hace o el represor en el operador (vease la seccion ll .14, La polimerasa de RNA se une a una cara del DNA). Las deleciones de material en cualquiera de los !ados definen los puntos termjnales de Ia region; las m utaciones puntuales constitutivas identifican 12.14 La proteina represora se une al operador

313

-10

+1

-5

+5

+10

+15

+20

+25

I

Eje de simetria

El operador lac tiene una secuencia simetrica. La secuencia se numera en relaci6n con el sitio de inicio de la transcripci6n en +1. Las flechas rosas a ambos lados identifican las dos repeticiones diadas. Los bloques verdes indican las posiciones de identidad.

Mutaciones constitutivas

~ rgrr~

~ ~HH

Bases que entran en o con el represor

g ~

~ ~ ~ H~ ~H

T

A

~ ~HH

TGTTGTGTGGAATTGTG~G£GGATAACAATTTCACACA ACAACACACCTTAACACTCGCCT A T ~ GTTAAA GTG TG"

tttt . t t-ttttt

t

-5

+1

+5 RNAm

+10

+15

+20

+25

~ Eje de simetria

Las bases que hacen o con el represor pueden identificarse mediante entrecruzamiento qu\mico o par media de experimentos que permitan observar si la modificaci6n impide la union . Identifican posiciones en las dos cadenas del DNA que se extienden desde +1 hasta +23. Las mutaciones constitutivas ocurren en ocho posiciones en el operador entre +5 y +17.

los pares de bases individuates que deben ser cruciales. Los experimentos en los cuales se compara el DNA unido al represor con el DNA no unido en lo que se refiere a su susceptibilidad a Ia metilacion o al entrecruzamiento con luz UV identifican las bases que estan protegidas o que son mas susceptibles cuando estan asociadas a la proteina. La · muestra que la region del DNA protegida de las nucleasas por el represor unido se encuentra dentro de Ia region de simetria, que abarca una region de 26 bp desde -5 hasta +21 . El area identificada por mutaciones constitutivas es incluso mas pequefia. Dentro de una region centraL que se extiende 13 bp desde +5 hasta +17, hay ocho sitios en los cuales las sustituciones de pares de bases individuales provocan constitutividad. Esto subraya Ia misma afirmacion hecha en torno a las mutaciones promotoras y que se resume antes en Ia Figura 11.29 . Unnumero pequeiio de os espedficos esenciales ubicados dentro de una region mas extema puede encargarse de la asociaci6n de secuencia espedfica del DNA con la prote{na.

314


La union del inductor Libera al repre or del operador Concepto principal

.,._ _ Protegidas par el represor unido ____..

-10

La simetria de la secuencia de DNA refleja Ia simetria en la proteina. Cada una de las subunidade' identicas de un tetramero represor tiene un sitio de union al DNA. Dos de estos sitios hacen con el operador de tal manera que cada repeticior_ invertida del operador forma el mismo patron de os con un mon6mero represor. Esto se demuestra por la simetria en los os que haec el represor con el operador (el patron entre + 1 y +c es identico a aquel que se encuentra en +21 y +16 y por Ia concordancia de las mutaciones constitutivas en cada repeticion invertida . (Sin embargo, e. operador no guarda una simetria perfecta; el lade izquierdo se une con mayor fuerza al represor que ellado derecho. Se crea un operador mas fuerte po:una duplicacion invertida perfecta della do izquierdo y se elimina del par de bases central.)

• La union del inductor provoca un cambia en la conformacion del represor que reduce su afinidad par el DNA y lo libera del operador.

Varios inductores provocan reducciones caracteristicas de Ia afinidad del represor por el operador i· vitro. Estos cambios se correlacionan con Ia eficacic de los inductores in vivo. Esto sugiere que Ia induecion es el resultado de una reduccion de Ia atracci6L entre el operador y el represor. Por lo tanto, cuand el inductor entra a Ia celula, se une a represor libres y de hecho impide que encuentren a sus operadores. Sin embargo, si se considera un tetramer : represor que ya se encuentra unido con fuerza a_ operador. <'.Como provoca el inductor que este represor sea liberado? En Ia f se ilustran dos modelos de l.o. accion del represor: • El modelo del equilibria (!ado izquierd o exige que el represor unido al DNA se en cuentre en rapido equilibria con el represo.:libre. El inductor se uniria ala forma librc del represor y asi romperia el equilibria c. evitar Ia reasociaci6n con el DNA. • Sin embargo, la velocidad con la que se disocia el represor del operador es demasiadl lenta para ser compatible con este model · (la vida media in vitro en ausencia del iJ> ductor es >15 min). Esto significa que m.i bien el inductor debe unirse de manera direa.:

a la protefna represora que forma U11 comple·: con el operador. Como se indica en el model· de la derecha, la union del inductor debe

producir un cambio en el represor que lo haga liberar al operador. De hecho, Ia adicion de IPTG ocasiona una desestabilizacion inmediata del complejo represor-operador in vitro. ::._.;, union del complejo represor-IPTG al ope: puede estudiarse con concentraciones muy ~e la protefna en el analisis de proteccion/po. = ion de Ia metilacion. La gran cantidad de · ::.'1a compensa Ia baja afinidad del complejo ~ - :epresor por el operador. El complejo forma ~-...a mente el mismo patron de os con el -. que el represor libre. Un resultado analogo _:iene con represores mutantes cuya afinidad . . DNA operador se incrementa; estos tambien -:an el mismo patron de os. :=n general, una serie de variantes de represores .:. · afinidades por el operador se extienden siete __nes de magnitud hacen los mismos os el DNA. Los cambios en la afinidad del represor par -. 'A de ben ocurrir, par lo tanto, al influir en la confor- .ingeneral de la proteina en la union del DNA, no al _ o deshacer uno o algunos enlaces individuales.

El inductor se une al represor libre para alterar el equilibria con el represor unido

El inductor se une de manera directa para liberar al represor del operadar

u

(Se une el inductor al represor libre para alterar un equilibria (izquierda) o de manera directa al represor unido al operador (derecha)?

El represor se une a tres operadores e interactua con La poli me rasa de RNA ·-t:eptos principales ::ada dimero localizado en un tetramero represor puede _1irse a un operador, de tal manera que el tetramero : Jede unirse a dos operadores de forma simultanea. _a represion total requiere que el represor se una a : :ro operador localizado en senti do descendente o =scendente, as! como al operador en el promotor /acl. _a union del represor al operador estimula la union :e la polimerasa de RNA al promotor, pero impide la ::anscripcion.

Si los dos d!meros de un tetramero represor se unen al DNA, el DNA que se encuentra entre los dos sitios de union se mantiene en un lazo.

_ ansicion alosterica que se deriva de la union !nductor tiene Iugar en el dimero represor. En- :es, (_por que se necesita un tetramero para es..ecer Ia represion total? Cada dimero puede unirse a una secuencia ope.:.ora. Esto le permite al represor intacto unirse _ s sitios operadores de manera simultanea. De :.:llo, hay dos sitios operadores mas en la region _jal del operon lac. El operador original, 01, se ~; ·za justo en el inicio del gen lacZ. Tiene la afi_s.d mas fuerte por el represor. Las secuencias .:::-adoras mas de biles (en ocasiones denorninadas . _ o-operadores) se localizan a ambos !ados; 02 se 3liza 410 bp en sentido descendente del punto : ::Ucio en lacZ y 03 se encuentra 88 bp en senti do :::ndente con respecto a el en lacl.

La muestra lo que sucede cuando una proteina de union al DNA puede adherirse en forma simultanea a dos sitios distintos en el DNA. El DNA que se encuentra entre los dos sitios forma un lazo desde una base en donde Ia proteina ha unido a los dos sitios. La longitud del lazo depende de la distancia entre los dos sitios. Cuando el represor Lac se une de forma simultanea a OJ y a uno de los otros operadores, hace que el DNA localizado entre ellos forme un lazo bastante corto, lo que restringe de manera significativa la estructura del DNA. En la se muestra un modelo a escala de Ia union de un represor tetramerico a dos operadores. La union a los operadores adicionales afecta el nivel de Ia represion. La eliminacion del operador que se encuentra en sentido descendente (02) o del

12.16 El represor se une a tres operadores e interactua con la polimerasa de RNA

315

Cuando un tetramero represor se une a dos operadores, el fragmento de DNA que se encuentra entre ellos forma un lazo ajustado. (La estructura azul localizada en el centro del lazo de DNA representa la CAP, la cual es otra prote\na reguladora que se une a esta region). Imagen reproducida con autorizacion de Lewis, M., et al. 1996. Science. 271: cover. © 1996 AAAS. Fotografia cortes\a de Ponzy Lu, University of Pennsylvania.

operador localizado en senti do ascendente (03) reduce la eficiencia de Ia represion de dos a cuatro veces. Sin embargo, si se eliminan 02 y 03, la eficacia de la represion se reduce 100 veces. Esto sugiere que la capacidad del rep resor para unirse a uno de los dos otros operadores, as£ como a 0 I, es importante para estabilizar la represi6n. Los experimentos in vitro con plasmidos superenrollados que contienen multiples operadores demuestran una estabilizacion significativa del complejo lac!-DNA. No obstante, estas moleculas de DNA en forma de lazo son liberadas con rapidez por Ia union de lac! a IPTG. Tambien se conocen los efectos directos de la union del represor al operador (01) . En un principia se pensaba que Ia union del represor obstrufa la union de Ia polimerasa de RNA al promotor. Ahora se sabe que estas dos protefnas pueden unirse a! DNA de forma simultanea y que la union del represor de hecho potencia la union de la polimerasa de RNA. Sin embargo, a Ia enzima unida se le impide iniciar Ia transcripcion. La constante de equilibria de la polimerasa de RNA que se une sola al promotor lac es de l. 9 x l 07 M- 1 . La presencia del represor incrementa est a constante dos ordenes de magnitud a 2.5 x 109 M- 1• En terminos de los lfmites de valores de Ia constante de equilibria K8 dada en Ia Figura 11.20, la protefna represora convierte de manera eficaz la fonnacion de los complejos cerrados porIa polimerasa de RNA en el promotor lac de una interaccion debil a una interaccion fuerte. (.Que significa esto para la induccion del operon? El valor mas alto de Ia KB significa que, cuando 316


esta ocupado por un represor, el promotor es lOC veces mas propenso a unirse a una polimerasa d RNA. Ademas, al permitir que Ia polimerasa de RNA se una a! mismo tiempo que el represor, es posible que !a transcripcion comience en cuanto tiene Iugar la induccion en vez de esperar a que una polimerasa. de RNA sea capturada . El represor en efecto provoca que Ia polimerasa. de RNA sea almacenada en el promo tor. El complejo polimerasa de RNA-represor-DNA es bloqueadc en el estado cerrado. Cuando se agrega el inductor, el represor es liberado y el complejo cerrad se transforma en un complejo abierto que inicia Ia transcripcion. El efecto global del represor consiste en acelerar el proceso de induccion. (.ES posible aplicar este modelo a otros sistemas? La interaccion entre Ia polimerasa de RNA, el represor y Ia region promotora /operadora es distinta en cada sistema, debido a que el operador no siempre se superpone en Ia misma region del promotor (vease !a Figura 12.26). Por ejemplo, en el fago, e: operador se encuentra en !a region ubicada en sentido ascendente con respecto a! promotor y Ia unio del represor obstruye !a union de la polimerasa de RNA (vease el Capitulo 14, Estrategias de los fagos). Por Io tanto, un represor unido no interactua cor: la polimerasa de RNA de la misma forma en todo~ los sistemas.

lfl&

El represor siem pre esta unido

al DNA Conceptos principales • Las proteinas que tienen gran afinidad por una secuencia espedfica de DNA tambien tienen una afinidad baja por otras secuencias del DNA. • Cada par de bases localizado en el genoma bacteriano es el inicio de un sitio de union de baja afinidad para el represor. • El gran numero de sitios de baja afinidad garantiza que toda la prote\na represora este unida al DNA. • El represor se une al operador al desplazarse desde un sitio de baja afinidad en vez de hacerlo al equilibrarse en la solucion.

Es probable que todas las protefnas con gran afinidad por una secuencia especffica tambien posear. una baja afinidad por cualquier secuencia (aleatoria) de DNA. Un gran numero de sitios de baja afinidad competiran tan bien por un tetramero represo~ como un pequefi.o numero de sitios de alta afinidad Hay solo un sitio de alta afinidad en el genoma de E . coli: el operador. El resto del DNA proporciona. sitios de baja afinidad. Cada par de bases del genoma comienza un nuevo sitio de baja afinidad.

" - •

·

•

I

•

• - •

·

•

I

•

El equilibria de Ia union del represor al DNA (aleatorio) se describe con Ia ecuaci6n: KA =

(Represor-DNA] [Represor libre] [DNA]

La proporci6n de represor libre se obtiene al despejar Ia ecuaci6n: [Represor libre] [Represor-DNA]

KAx [DNA]

RA 1-1.22 La union del represor a sitios aleatorios se rige . · una ecuaci6n de equilibria.

_ )Jo moviendose un par de bases por el genoma, _-:-ra de fase con el operador mismo, crea un sitio . " aja afinidad.) Por lo tanto, hay 4.2 x 10 6 sitios --::- baja afinidad. El gran numero de sitios de baja afinidad signi.:;,. que, incluso en ausencia de un sitio de union . ~ e cifico, todos, o casi todos, los represores estan --dos al DNA y ninguno se encuentra libre en so2 ? muestra como la ecuacion j on. La fiG -=meada para describir el equilibria entre el re:--:-sor libre y el represor unido al DNA puede rees-.:. -rurarse para proveer Ia proporcion de represor --:e.

Si se aplican los parametros del sistema lac, se que: • La constante de union de equilibria no especffica es K A = 2 x 10 6 M- 1 • • La concentracion de los sitos de union no especfficos es 4 x 106 en un volumen bacteriano de 10-15 L, lo cual corresponde a una [DNA] = 7 x 10- 3 M (una concentracion demasiado alta). Al sustituir estos valores se obtiene: repre- j bre/unido = 1Q-4 _ Por lo tanto, todo el represor, excepto el 0.01 %, esta ;' al DNA (aleatorio). Puesto que hay - 10 mole;,- de represor por cad a celula, esto es equivalen. = decir que no hay protefna represora libre. Esto .:::e una repercusion importante en la interaccion . ~epresor con el operador: significa qu e hay un : _--:o por la partici6n del represor en el DNA, en la ..:.: el sitio de alta afinidad individual del opera: :ompite con un gran numero de sitios de baja ~:e rva

~d ad.

En esta competencia los valores absolutos de las ..itantes de asociacion para el operador y el DNA :"':orio no son importantes; lo que es importante .i. proporcion de K,P (Ia constante de union a un . especffico) con respecto a K nsp (la constante de ~ n a cualquier secuencia de DNA aleatoria), es · :::-. la especificidad.

111m

El operador compite con los sitios de baja afinidad para unirse al represor

Conceptos pri ncipales • En ausencia de inductor, el operador tiene una afinidad por el represor que es 10 7 veces mayor que la de un sitio de baja afinidad. • El nivel de 10 tetrameros represores por celulas asegura que el operador este unido al represor 96% del tiempo. • La inducci6n reduce La afinidad por el operador a 10' veces la de los sitios de baja afi nidad, por lo que s6lo 3% de los operadores estan unidos. • La inducci6n hace que el represor se mueva del operador a un sitio de baja afinidad por desplazamiento directo . • Estos parametres podrian cambiarse con un incremento o reducci6n de La concentraci6n efectiva de DNA in vivo.

Se pueden definir los parametros que influyen en Ia capacidad de una protefna reguladora de saturar su sitio diana si se comparan las ecuaciones de equilibria de Ia union especffica y de la union no especffica. Como puede deducirse de manera intuitiva, los parametros importantes son: • El tamafio del genoma disminuye la capacidad de una proteina para unirse a sitios diana especfficos . • La especificidad de la protefna contrarresta el efecto de Ia masa del DNA. • La cantidad de proteina necesaria aumenta con Ia cantidad total de DNA en el genoma y disminuye con la especificidad. • La cantidad de protefna tambien debe exceder de un modo razonable el numero total de sitios diana especificos, por lo que se espera encontrar reguladores con numerosas dianas en cantidades mucho mayores que los reguladores con pocas dianas. com para las constantes de equiLa F GJ A ' hbrio de la union operador/represor lac con la union represor/DNA general. A partir de estas constantes, se p u ede deducir como se divide el represor entre el operador y el resto del DNA y que sucede con el represor cuando el inductor hace que se disocie del operador. El r epresor se u n e - 10 7 veces mejor a! DNA operador que a cualquier secuencia aleatoria de DNA de la misma longitud. Por lo tanto, el operador comprende un solo sitio de alta afinidad que competira por el represor 10 7 veces mejor que cualquier sitio de afinidad baja (aleatorio) . c:_ Como garantiza esto que el represor pueda mantener un control eficaz del operon ?

12.18 El operador compite con los sitios de baja afinidad para unirse al represor

317

Represor

DNA Operador

2 x 1o

Otro DNA

2

Represor + inductor

13

X

106

X

2

1010

X

107

Especificidad Operadores unidos El operon es:

2

106 104

96%

3%

reprimido

inducido

El represor Lac se une con fuerza y de manera espec\fica a su operador, pero es liberado por el inductor. Todas las constantes de equilibria estan en M-'.

MANTENIMIENTO DE LA REPRES16 N El represor esta unido al operador \

Represor en exceso unido a cualquier otro\ Iugar del DNA

Inductor •

INDUCC16N El represor es liberado del operador y todos los represores estan unidos a sitos -« • 'aleatorios en el DNA

Retiro del inductor------ -- - -...

':i " '

El represor regresa a Ia forma · """' activa y se desplaza de un sitio aleatoric al operador por medio de deslizamiento o de

t'

Casi todo el represor que se encuentra en la celula esta unido al DNA.

Si se recurre a Ia especificidad, se puede calcular Ia distribucion entre los sitios aleatorios y el operador y expresarse en terminos de ocupaci6n del operador. Si hay 10 moleculas de rep res or lac por celula, con una especificidad por el operador de 107 , el operador estara unido al represor 96% del tiempo. La funcion de Ia especificidad explica dos caracterfsticas de Ia interaccion operador-represor lac: • Cuando el inductor se une al represor, Ia afinidad por el operador se reduce - 10 3 veces. La afinidad por las secuencias generales 318


del DNA permanece sin alteraciones. Por lo tanto, Ia especificidad ahara es de solo l 04 , la cual es insuficiente para capturar a! represor contra Ia competencia con el exceso de 4.2 x 10 6 de los sitios de baja afinidad. Solo 3% de los operadores estarfan unidos en estas condiciones. • Las mutaciones que reducen 20 o 30 veces Ia afinidad del operador por el represor tienen el efecto suficiente para ser constitutivas. Dentro del genoma, los operadores mutantes pueden ser superados por la preponderancia de los sitios aleatorios. La ocupaci6n del operador disminuye a - 50% si Ia especificidad del represor se reduce -10 veces. La consecuencia de estas afinidades es que, en una celula no inducida, un tetramero represor suele estar unido al operador. Todos, o casi todos, los tetrameros restantes estan unidos de manera aleatoria a otras regiones del DNA, como se ilustra en Ia . Es probable que haya muy pocos o ningu n tetramero represor libre dentro de Ia celula. La adicion del inductor inhibe la capacidad de! represor para unirse de manera especffica al operadar. Aquellos represores unidos a! operador son liberados y se unen a sitios aleatorios (de baja afinidad) . Por lo tanto, en una celula inducida, los tetrameros estan "almacenados" en sitios aleatorios del DNA. En una celula no inducida, un tetramero esta unido al operador, mientras que las moleculas represoras restantes se unen a sitios no especfficos. Par lo tanto, el efecto de La inducci6n es cambiar La distribuci61: del represor en el DNA, en vez de generar represor lib7·e. Cuando el inductor es retirado, el represor recupera su capacidad para unirse en forma especffica al operador y lo hace con mucha rapidez. Esto debe involucrar su desplazamiento a partir de un sitio de "almacenaje" no espedfico en el DNA. (.Que mecanisme se utiliza para este desplazamiento rapido? La capacidad de unirse al operador en forma rapida no es congruente con el tiempo que se necesitara para realizar multiples ciclos de disociacion y de reasociaci6n con los sitios no espedficos del DNA. La discrepancia excluye a los mecanismos de impactos aleatorios para encontrar al operador, lo cuai sugiere que el represor puede moverse de manera directa desde un sitio aleatorio del DNA basta e: operador. Esta es la misma situacion que se observ6 antes con la capacidad de la polimerasa de RNA pare. encontrar sus promo to res (veanse la Figura 11.22 y la Figura 11.23) . La misma solucion es probable: e. movimiento puede lograrse si se reduce Ia dimensionalidad de la busqueda al deslizarse a lo largo de: DNA o por desplazamiento directo de un sitio a otr

~amo se indica en Ia Figura 12.24). Una reaccion _: desplazamiento puede facilitarse con Ia presen....3 de mas sitios de union por tetramero (cuatro) de ~ qme son de hecho necesarios para ar a! _ ;A en un momento dado (dos) . Los parametros implicados en Ia localizacion de - operador de alta afinidad en competencia con __chos sitios de baja afinidad plantean un dilema :o.:a el represor. En condiciones de represion, debe c-:>er una especificidad alta por el operador. Sin -:-.bargo, en condiciones de induccion, esta espe_cidad debe eliminarse . Por ejemplo, sup6ngase _e hay l 000 moleculas de represor por celula: solo ~ -!%de los operadores estarfan libres en condicio- :; de represion. No obstante, tras Ia inducci6n solo - _ = o de los operadores estarfan desocupados. Por :.anto, se observa una correlacion inversa entre ::apacidad de lograr Ia represion completa y Ia _ acidad de liberar !a represion de manera eficaz. _ asume que el numero de represores sintetizados :·vo ha estado sujeto a fu erzas selectivas que equi~a n estas demandas. La diferencia in vivo en Ia expresion del operon : ~a lactosa entre su estado inducido y su estado - :imido es de 10 3 veces. En otras palabras, incluso ::.:1do el inductor esta ausente, hay un nivel basal : t xpresion de - 0.1% del nivel inducido. Dicho ·e! disminuirfa si hubiera mas protefna represora • crementarfa si hubiera menos. Por lo tanto, serfa osible establecer una represion contu n dente si _ iera menos represores que los 10 que se en:-ntran en cada celula, y podrfa dificultarse Ia in_:ci6n del operon si hubiera demasiados. Es posi- introducir el sistema represor-operador lac en el .an. Cuando el operador laces conectado a un gen -_ rtero de tirosinasa, Ia enzima es inducida porIa j on de IPTG. Esto significa que el represor esta :ontrando su diana en un genoma 10 3 veces mas .:.__ de que el de E. coli. La inducci6n ocurre aproxi~ amente con Ia misma concentracion de IPTG ~ en las bacterias. Sin embargo, se desconoce Ia :::.centraci6n del represor Lacy Ia eficiencia con .:"Ja! se induce Ia diana. Para extrapolar in vivo a partir de Ia afinidad de ~ interaccion DNA-protefna in vitro, es necesario - cer Ia concentracion efectiva de DNA in vivo. .::oncentraci6n efectiva" difiere de Ia masa /volu: ~ debido a numerosos facto res. La con centracion = ~ci va aumenta, por ejemplo, por el hacinamien:c.olecular, el cual ocurre cuando los cationes _·:a]entes neu tralizan a -90% de las cargas del -'"' y el acido nucleico se colapsa en estructu ras --: i ensadas. La fuerza principal qu e disminuye Ia - :entraci6n efectiva es Ia inaccesibilidad del DNA -· ada de la oclusion o del secuestro por parte de ::-!'otefnas de union al DNA.

Una manera de determinar Ia concentracion efectiva es comparar Ia velocida d de una reaccion in vitro e in vivo que dependa de Ia concentracion de DNA. Esto se ha realizado utilizando recombinaci6n intermolecular entre dos moleculas de DNA. Para proporcionar un controL Ia misma reaccion es seguida como una recombinaci6n intramolecular, es decir, los dos sitios recombinantes son presentados en Ia misma molecula de DNA. Se asume q ue Ia concentracion es la misma in vivo e in vitro para Ia reaccion intramolecular y por lo tanto cualquier diferencia en la proporcion de las velocidades de recombinacion interm olecular/intramolecular puede atribuirse a un cambio de Ia concentracion efectiva in vivo . Los resultados de dicha comparaci6n sugieren que Ia concentracion efectiva del DNA disminuye mas de l 0 veces in vivo. Esto podrfa afectar Ia velocidad de las reacdones que dependen de Ia concentracion de DNA, como Ia recombinaci6n del DNA y la union protefna-DNA. Esta situacion destaca el problema que enfrentan todas las protefnas de union a! DNA para encontrar sus dianas con Ia velocidad suficiente y refuerza Ia conclusion de que Ia difusion noes adecuada (vease Ia Figura 11.22).

IE

La represi6n puede suceder en multiples loci

Concepto principal • Un represor actuara en todos los loci que tengan una copia de su secuencia operadora diana.

El represor lac actua solo en el operador del agrupamiento lacZYA . Sin embargo, algunos represores controlan los genes estructurales dispersos si se unen a mas de un operador. Un ejemplo es el represor trp, el cual controla tres conj untos de genes n o vinculados: • Un operador localizado en el agrupamiento de los genes estructurales trpEDBCA contro la Ia sfntesis coordinada de las enzimas que sintetizan el triptofano a partir del acido corfsmico . • Un operador que se encuentra en otro locus controla el gen aroH, el cual codifica una de las tres enzimas que catalizan Ia reacci6n inicial de Ia ruta comun de Ia biosfntesis de arninoacidos aromaticos . • El gen regulador trpR es reprimido por su propio producto, el represor trp. Por lo tanto, Ia protefna represora actua para reducir su propia s!ntesis. Este circuito es un ejemplo de control aut6geno. Dichos circuitos 12.19 La represi6n puede suceder en multi ples loci

319

. .. .. . .. .

~

.

;

.

.

Regi6n op eradora -----.

___..

aroH GGGGAAT6T ACT AGAGAACT AGTGC8LIAGGC..I.IALII.:U l GI..T AICAffiC_IAA

RNAm

----------------~ trpR

RNAm

TGCTATCGT ACTCTT TAGCGAGT ACAACO ---------......j~

RNAm

El represor trp reconoce a los operadores en los tres loci. Las bases conservadas se muestran en color rojo. La localizaci6n del punto de inicio del RNAm varia, como lo indican las flechas negras.

Punta de inicio

gal

aroH

trp

trpR

lac

-Promotor • ..,.._ Ubicaciones del ____,.. ope radar

Los operadores pueden estar en varias posiciones con respecto al promotor.

son bastante comunes en los genes reguladores y pueden ser negativos o positivos (vease la secci6n 12.23, La sintesis de las proteinas r es controlada por medio de regulaci6n aut6gena, y !a secci6n 14.15, El represor mantiene un circuito aut6geno). Una secuencia operadora relacionada de 21 bp esta presente en cada uno de los tres loci en los cuales actua el represor trp. La conservaci6n de !a secuencia se indica en la . Cada operadar tiene una simetria diada apreciable (pero no identica). Las caracteristicas conservadas en los tres operadores incluyen los puntos importantes de o para el represor trp. Esto explica la manera de actuar de una proteina represora en numerosos loci: cada locus posee una copia de una secuencia de union al 320


DNA especifica reconocida por el rep res or (del mismC' modo como cada promotor comparte secuencias dt: consenso con otros promo to res). La resume !a variedad de relaciones entre los operadores y los promotores. Una caracteristica notoria de los operadores dispersos reconoc:dos por TrpR es su presencia en diferentes localizaciones dentro del promotor en cada locus. En trpR e operador se encuentra entre las posiciones -12 y +9 en tanto que en el operon trp ocupa las posicione, -23 a -3. En ellocus aroH se encuentra mas lejos e1: sentido ascendente, entre -49 y -29. En otros cas o ~ el operador se encuentra en sentido descendente con respecto a! promotor (como en lac) o al parec e~ justo en sentido ascendente del promotor (como er.. gal, del cualla naturaleza del efecto represivo no e:c muy clara). La capacidad que tienen los represorc para actuar en operadores cuyas posiciones son dj ferentes en cada promotor diana sugiere que podric: haber diferencias en !a forma exacta de represi6n; k caracteristica com lines que se impide a !a polimera sa de RNA iniciar !a transcripci6n en el promotor.

E

El AMP ciclico es un efector que activa al factor CRP para que actC1e en multiples operones

Conceptos principales • CRP es una proteina activadora que se une a una secuencia diana en un promotor. • Un dimero de CRP es activado por una sola molecula de AMP ciclico.

Hasta ahora se ha considerado a! promotor com · una secuencia de DNA capaz de unirse ala polimerasa de RNA, la cual inicia entonces la transcripci6r.

:>mbargo, hay algunos promotores en los cuales - limerasa de RNA no puede iniciar Ia transcrip~ sin la asistencia de una protefna auxiliar. Dichas :emas son reguladores positivos, debido a que :->resencia es necesaria para activar la unidad de ~ cripci6n. Por lo general, el activador supera una -2ciencia en el promotor, por ejemplo, una mala :-.;encia de consenso localizada en -35 o en -10 . Uno de los activadores de actuaci6n mas amplia -_:ua proteina denominada activador CRP que - rola Ia actividad de un gran conjunto de ope::es en E. coli. La protefna es un factor de control ~'tivo cuya presencia es necesaria para iniciar la ~:1 scripci6n en promotores dependientes. La CRP 3.cttiva solo en presencia de AMP dclico, el cual actua :no una peq uefia molecula inductor a clasica para :ontrol positivo (vease Ia F 1; parte de- ·ha superior). El AMP dclico es sintetizado por Ia enzima ci..asa de adenilato . La reacci6n utiliza el ATP como ~ rato e introduce una ligadura 3'-5' por medio de -_:aces fosfodiester, el cual genera la estructura de _ GU . Las mutaciones que se presentan en ' :1en que codifica la ciclasa de adenilato (cya-) no :>ponden a cambios en los niveles de glucosa. El nivel de AMP dclico se relaciona de manera -;·ersa con el nivel de glucosa. La base de este efecradica dentro del mismo componente del sistema --..s que se encarga del control de la absorci6n de la - .:to sa. La forma fosforilada de la protefna IIA GJc es~ - ula la ciclasa de adenilato. Cuando la glucosa es ~.portada , la desfosforilaci6n de IIA Gic conduce a un ~ _scenso de la actividad de la ciclasa de adenilato. La ., muestra que la reducci6n del el del AMP dclico hace que la protefna (tipo sil=stre) sea incapaz de unirse ala region de control, =- cual a su vez impide que la polimerasa de RNA ~i cie la transcripci6n. Por lo tanto, el efecto de la =-:· cosa en Ia reducci6n de los niveles de AMP deli- es privar a los operones relevantes de un factor -= control indispensable para su expresi6n.

El factor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos Co1ceptos principales • CRP introduce un giro de 90° en el DNA en su sitio de union. • Los sitios de union al CRP se encuentran en ubicaciones muy variab les con respecto al promotor. • CRP interactua con la polimerasa de RNA, pero los detalles de la interaccion dependen de las ubicaciones relativas del sitio de union al CRP y del promotor.

z

·O

0(.)

::J 0 ~

l l Represor

REPRIMIDA

RNA polimerasa

I

~

Represor Inductor

ActivadoT Activador inactive activo ~ Inductor

INDUCIDA

REPRIMIDA

~ inactive

INDUCIDA

z

-o (i)

w

a:

ll.

w

a: Represor Represor inactive activo Correpresor INDUCIDA

REPRIMIDA

Activador activo INDUCIDA

in activo Correpresor REPRIMIDA

Los circuitos de control son versati les y pueden crearse para permitir el control positivo o negativo de la inducci6n o de la represion.

El AMP ciclico tiene un solo grupo fosfato conectado a las posiciones 3' y 5' del anillo de azucar.

El factor CRP se une a! DNA y los complejos de AMP dclico-CRP -DNA pueden ser aislados en cada promotor en el cual funciona. El factor es un dfmero de dos subunidades identicas de 22.5 kD, el cual puede ser activado por una sola molecula de AMP ciclico. Un monomero de CRP contiene una region de union al DNA y una region activadora de la transcripci6n. Un dfmero de CRP se une a un sitio de -22 bp en un promotor reactivo. Los sitios de union incluyen variaciones de la secuencia de consenso que se

12.21 El factor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos

321

•

•

• t

Glucosa

l l

AMPc reducido

CRP activa

CRP inactiva

Transcripci6n ausente Al reducir el nivel de AMP ciclico, la glucosa inhibe la transcripcion de los operones que requieren la actividad de la CRP.

T ranscripci6n ~

N NN ~ANNN Pentamero con un nivel alto de conservaci6n

Pentamero menos conservado

La secuencia de consenso de la CRP contiene el pentamero bien conservado TGTGA y (en ocasiones) una inversion de esta secuencia (TCANA).

Centro de simetria diada

1

La CRP dobla el DNA >90° alrededor del centro de simetria.

muestra en Ia . Las mutaciones que im piden Ia accion de Ia CRP suelen localizarse dentro del pentiimero bien conservado TGTGA , el cual paACACT rece ser el elemento esencial en el reconocimiento. El factor CRP se une con mayor fuerza a los 322


sitios que contienen dos versiones (invertidas) de. pentamero debido a que esto permite a las dos subunidades del dimero unirse al DNA. Sin embargo. numerosos sitios de union carecen del segund pe ntamero y en estos la segunda subunidad debe unirse a una secuencia diferente (si se une al DNA . La jerarquia de las afinidades de union por Ia CRP ayudan a explicar porque genes diferentes son activados por niveles distintos de AMP dclico in vivo. La CRP introduce un gran dobl ez cuando se une al DNA. En el promotor lac, este punto se encuentra en el centro de Ia simetria diada. El doblez es bastante pronunciado, >90°, como se ilustra er. el modelo de Ia . Por lo tanto, hay u -. cambio drastico en Ia organizacion del DNA de doble helice cuando se une Ia CRP. El mecanismo de doblamiento consiste en introducir un doblez agudo en Ia secuencia de consenso TGTGA. Cuandc hay repeticiones invertidas del consenso, los do; dobleces en cada copia presentes en un palfndromo provocan el doblez general de 90°. Es posiblc que el pliegue tenga algun efecto directo sobre lc: transcripcion, pero podrfa ser que se necesitara tar. solo para permitir que Ia CRP hiciera o con Ia polimerasa de RNA en el promotor. La accion de Ia CRP tiene Ia caracterfstica nota ble de que sus sitios de union se encuentran en ubicaciones distintas en relacion con el pun to de inicic en los diversos operones que regula. El pentamer TGTGA puede encontrarse en cualquier orienta cion Los tres ejemplos que se resumen en Ia ,t 2.• abarcan el intervalo de las localizaciones. • El sitio de union a Ia CRP es adyacente a ~ promotor, como en el operon lac, en el cua: Ia region de DNA protegida por Ia CRP se centra en -61 . Es posible que dos dimero_ de CRP esten unidos. El patron de union e: congruente con Ia presencia de CRP sobre todo en una cara del DNA, Ia cual es Ia misma cara a Ia cual se adhiere Ia polimerasa de RNA. Esta localizacion ubicara una protein.: justo a! alcance de Ia otra. • En algunas ocasiones el sitio de union o. Ia CRP se encuentra dentro del promotm como en el locus gal, en donde el sitio de union a Ia CRP esta centrado en Ia posici6r. -41. Es probable que solo un dimero de CR.:: este unido, tal vez en o muy cercan con Ia polimerasa de RNA, debido a que e sitio de union a Ia CRP se extiende profundamente en Ia region protegida en genera_ por Ia polimerasa de RNA. • En otros operones, el sitio de union a Ia CR.:: se encuentra bastante lejos del promotor er: sentido ascendente. En Ia region ara, el sitir de union para una sola CRP esta lomas lej o:.

posible del punta de inicio, centrado en la posicion -92. La dependencia de la CRP se relaciona con Ia : fi ciencia intrinseca del promotor. Ningun pro::notor dependiente de la CRP tiene una secuencia uena -35 y algunos tambien carecen de secuen_ias buenas -10. De hecho, se puede afirmar que -:-1 control efectivo provisto por la CRP seria dificil .;: el promotor tuviera regiones efectivas -35 y -10 ~ ue interactuaran de manera independiente con la oiimerasa de RNA. En principia hay dos formas en las cuales la ::RP puede activar la transcripcion: podrfa interac:uar en forma directa con la polimerasa de RNA o :;>odrfa actuar en el DNA para cambiar su estructura j e una manera tal que ayudara a Ia polimerasa de .:\NA a unirse. De hecho, la CRP tiene efectos en la . olimerasa de RNA y en el DNA. Los sitios de union para la CRP en la mayor . arte de los promotores se asem ejan a lac (centrado -:o n la posicion - 6 1) o a gal (centra do en la posicion -41) . La diferencia basica entre ellos es que en el ;>rimer tipo (denominado clase I) el sitio de union a Ia CRP se encuentra completamente en sentido :~sce ndente con respecto al promotor, mientras que en el segundo tipo (denominado clase II) el sitio e uni on a Ia CRP se superpone al sitio de union e la polimerasa de RNA. (Las interacciones en el . romotor ara pueden ser diferentes .) En ambos tipos de promotor, el sitio de union a :a CRP se centra en un numero integral de vueltas e la doble helice desde el punta de inicio. Esto sugiere que la CRP esta unida ala misma cara del DNA que la polimerasa de RNA. Sin embargo, la natura:eza de la interaccion entre la CRP y Ia polimerasa e RNA es diferente en los dos tipos de promotor. Cuando Ia subunidad a de Ia polimerasa de RNA presenta una delecion en el extrema C, Ia transcripcion parece ser normal excepto porque pierde la capacidad de ser activada por la CRP. Esta ultima tiene una "region activadora" que es necesaria para activar sus dos tipos de promotores. Esta region aciivadora, Ia cual esta formada por un lazo expuesto de -10 aminoacidos, es un parche pequeno que in:eractua de manera directa con Ia subunidad a de ia polimerasa de RNA para estimular a la enzima. En los promotores de clase I esta interaccion es suficiente. En los promotores de clase II se requiere una segunda interaccion, la cual involucra otra region de Ia R y Ia region terminal N de la subunidad a de la polimerasa de RNA. Los experimentos qu e se han realizado con dfmeros de CRP en los cuales solo una de las sub·,.midades tiene una region funcional de transcrip cion-activacion muestran que cuando la CRP esta unida al promotor lac, solo es necesaria la region

-Promotor+ ..,.. Localizaciones de Ia ....,. union a Ia CRP

La proteina CRP puede unirse a diferentes sitios en relaci6n con la polimerasa de RNA.

activadora de la subunidad mas cercana al pun to de inicio, al parecer debido a que hace o con la polimerasa de RNA. Esto explica que no haya una dependencia de la orientacion del sitio de union: la estructura dimerica de la CRP garantiza que una de las subunidades este disponible para hacer o con la polimerasa de RNA, sin importar que subunidad se una al DNA y en que orientacion. El efecto ejercido sabre la union de la polimerasa de R1\l'A depende de las localizaciones relativas de las dos protefnas. En los promotores de clase I, en donde la CRP se une adyacente al promotor, aumenta la velocidad de la union inicial para formar un complej o cerrado. En los promotores de clase I1, en donde la CRP se une dentro del promotor, aumenta la velocidad de la transicion del complejo cerrado al complejo abierto .

Ef1D

La traducci6n puede ser regulada

Conceptos principales • Una prote\na represora puede regular la traducci6n al impedir que un ribosoma se una a un codon de iniciaci6n. • La accesibilidad a los codones de iniciaci6n en un RNAm policistr6nico puede ser controlada por media de cambios en la estructura del RNAm los cuales ocurren como resultado de la traducci6n.

El control de la traduccion es una caracterfstica notoria de los operones que codifican componentes del mecanismo de la sfntesis de protefnas. El operon proporciona un arreglo para Ia regula cion coordinada de un grupo de genes estructurales. Sin embargo, controles posteriores superpuestos en el operon , como los del nivel de la traduccion, pueden crear dlferencias en el grado al cual se expresan los genes individuales. 12.22 La traducci6n puede ser regulada

323

Se utiliza un rnecanismo similar para lograr el control de la traduccion en numerosos sistemas. La funcion del represor !a proporciona una proteina que se enlaza a una region diana del RNAm para impedir que los ribosomas reconozcan la region de !a iniciacion. En

terminos formales esta situacion es equivalente ala de una protefna represora que se une al DNA para evitar que la polimerasa de RNA utilice un promotor. La , I , i! .,3 ilustra la forma mas frecuente de esta interaccion, en Ia cualla protefna reguladora se une de manera directa a una secuencia que incluye al codon de iniciacion AUG, lo que irnpide Ia union del ribosoma. En la ~ A2 ~4 se ofrecen algunos ejernplos de represores de la traduccion y de sus dianas. Un ejemplo clasico es la protefna de envoltura del fago de RNA Rl7; esta se une a una horquilla que se extiende sobre el sitio de union a! ribosorna en el RNArn del fago. De forma similar, la proteina RegA T4 se une a una secuencia de consenso que incluye al codon de iniciacion AUG en numerosas rnoleculas ternpranas de RNArn T4, y Ia polimerasa de DNA T4 se une a una secuencia en su propio RNArn que incluye el elernento Shine-Dalgarno indispensable para la union de los ribosomas.

Otra forma de control de la traduccion ocurre cuando la traduccion de un cistron requiere cambios en la estructura secundaria que dependen de la traduccion de un cistron precedente. Esto sucede durante Ia traduccion de los fagos de RNA, cuyo_ cistrones siernpre se expresan en un orden predeterminado. La FTG J A 12.35 muestra que el fago de RNA adquiere una estructura secundaria en Ia cua: solo es accesible una secuencia de iniciacion; Ia se-

S61o un sitio de iniciaci6n esta disponible en un principia El segundo sitio de iniciaci6n esta bloqueado

/. AUG

I

La traducci6n expone el segundo sitio de iniciaci6n Los ribosomas desestabilizan Ia estructura secundaria

I# ....... ....... .

.,_ Sitio de union al ribosoma~

...

.

Una proteina reguladora puede bloquear la traduccion al unirse a un sitio del RNAm que se superpone al sitio de union al ribosoma en el codon de iniciacion.

'" U A 1 L La estructura secundaria puede controlar la iniciacion. Solo un sitio de iniciacion esta disponible en los fagos de RNA, pero la traduccion del primer cistron cambia la conformacion del RNA para que otro u otros sitios de iniciacion esten disponibles.

1' Represor

Gen diana

Sitio de acci6n

Proteina de envoltura R17 replicasa R17

Ia horquilla que incluye el sitio de union ribosomica

RegA T4

RNAm T4 tempranos

varias secuencias que incluyen el codon de iniciacion

Polimerasa de DNA T4

polimerasa de DNA T4 secuencia Shine-Dalgarno

p32 T4

gen 32

lider 5' de cadena individual

I C •:J.' Las protein as que se unen a las secuencias que se encuentran en el interior de las regiones de iniciacion de las moleculas de RNAm pueden funcionar como represores de la traducci6n.

3 24


_..:nda no puede ser reconocida por los ribosomas -::· ido a que esta apareada con otras regiones del - ·A. Sin embargo, la traduccion del primer cistron - ierrumpe la estructura secundaria, lo que permi:- a los ribosomas unirse a! sitio de iniciacion del .guiente cistron. En este RNA.m, la estructura se.:-.rndaria controla la traducibilidad.

La sintesis de las proteinas r es cantrolada par media de regulaci6n aut6gena

rpsL rpsG fusA tufA_

81-o EF-G EF-Tu rp/N rp!X rp!E rp§N rpsH rp/F rp/R rpsErp/D rpmO secY-X

L14 L24 L5 814 88

t

• La traduccion de un operon de prote\na r puede ser controlada por un producto del operon que se une a un sitio localizado en el RNAm policistronico.

Y X

rpsJ rp!C'rp/B rplb rpjW rp/S rp/V rpsC rpsQ rplf" rpmC

810 L3

L2 L4 L23 819 L22 83 817 L16 L29

t

I

rpsfoj1 rpsK rpsD rpoA rp/Q

813

Concepto principal

L6 L18 85 L30 L15

I

811

84

t

a

L17

I

JpiK . rp/A L 11 l1

LJ rp/J rp/LrpoBrpoC

·_·nas 70 protefnas constituyen el aparato de la ex genica bacteriana. Las protefnas riboso-:.1icas son el componente principaL junto con las c-otefnas rias involucradas en Ia sintesis pro·efnica. Las subunidades de la polimerasa de RNA y 1s factores rios integran el resto. Los genes ~ e codifican las protefnas ribosomicas, a los facto::'s de Ia sfntesis protefnica y a las subunidades de ~ polimerasa de RNA todos estan entremezclados · organizados en un pequeiio numero de operones. ~ mayor parte de estas protefnas estan representa_as solo por genes individuales en E. coli. Los controles coordinados garantizan que estas ;n otefnas sean sintetizadas en cantidades apropia~as para las condiciones de crecimiento: cuando las . acterias crecen con mayor rapidez, dedican una ::1ayor proporci6n de sus esfuerzos a la produccion iel mecanismo para Ia expresion genica. Se utiliza .:n conjunto de mecanismos para controlar Ia ex:'resion de los genes que codifican este mecanismo ~- para garantizar que las protefnas sean sintetizadas .n niveles comparables que se relacionan con los .. ·veles de las moleculas de RNAr. La organizacion de seis operones se resume en _a FIGURA 1 J . Cerca de Ia mitad de los genes de las :;>rotefnas ribosomicas (proteinas r) mapean en cua. o operones que se encuentran cerca uno del otro denominados str, spc, S I 0 y (J.. tan solo por la primera ..:e las funciones que han sido identificadas en cada .::aso). Los operones rif y Lll se encuentran juntos :>n otra ubicacion. Cada operon codifica una variedad de funcio'les. El operon str tiene genes que codifican las pro:efnas de la subunidad ribosomica pequeiia, asf ·omo EF-Tu y EF-G. Los operones spc y SIO tienen ~enes diseminados para las protefnas de las sub ·. midades ribosomicas pequeiia y grande. El ope-

10L7 ~ 13'

- ~esion

J:I • _.. o Los genes de las prote\nas ribos6micas, los facto res de La s\ntesis prote\nica y las subunidades de la polimerasa de RNA estan esparcidos en un pequefio numero de operones que se reg ulan de manera autonoma. El regulador se indica en color violeta; las proteinas que son reguladas se muestran sombreadas en color rosa.

ron (J.. tiene genes para las protefnas de ambas subunidades ribosomicas y para la subunidad (J.. de la polimerasa de RJ.~A. Ellocus riftiene genes para las protefnas de la subunidad ribosomica grande y para las subunidades ~ y Wde la polimerasa de RNA. Todas, excepto una de las protefnas riboso micas, son necesarias en cantidades equimolares, las cuales deben estar coordinadas con el nivel de RNAr. La dispersion de los genes cuyos productos deben ser equimolares y su mezcla con los genes cuyos productos se necesitan en cantidades diferentes plantean algunos problemas interesantes para la regulacion coordinada . Una caracterfstica com(m en todos los operones descritos en la Figura 12.36 es Ia regulacion de algunos de los genes por uno de los productos. En cada caso, el gen que codifica el producto regulador es una de las dianas de Ia regulacion. La regulacion aut6gena ocurre siempre que una protefna (o RNA) regula su propia produccion. En el caso de los operones de las protefnas r, Ia protefna regula dora inhibe la expresion de un conjunto contiguo de genes dentro del operon, por Io que este es un ejemplo de regulacion autogena negativa. En cada caso, la acumulaci6n de la protefna inhibe la sfntesis posterior de sf misma y de algunos otros productos genicos. El efecto con frecuencia es ejercido en

12.23 La sintesis de las prote\nas res controlada por media de regulacion autogena

325

Cuando hay RNAr disponible, las protefnas r se asocian a el. La traducci6n del RNAm continua

l

\ lJ\.Q ~ RNAm

RNAr

l

Proteinas r Cuando no hay RNAr disponible, las proteinas r se acumulan. Una proteina r se une al RNAm e impide Ia traducci6n

1 La traducci6n de los operones de proteinas res controlada de manera aut6gena y responde al nivel del RNAr.

individual y continua siendo sintetizada en presencia de sus sitios de uni6n

En ausencia de DNA de cadena individual, Ia p32 se une a una regi6n rica en A-T alrededor del codon de iniciaci6n del RNAm e impide que los ribosomas inicien

del RNAm para inhibir Ia traduccion de S l 0 y c.los genes subsiguientes. La inhibicion puede prrvenir de un simple bloqueo del al riboson~.o como se ilustra antes en Ia Figura 12. 34, o puecinhibir alguna otra etapa subsiguiente de la tradu -cion. En dos casos (que incluyen S4 en eloper ' ~ a), la proteina reguladora estabiliza una estructu~ ' secundaria particular en el RNAm que impide q6la reaccion de iniciacion continue despues de que : c ha unido la subunidad 30S . El uso de las proteinas r que se unen al RN_~_ para establecer la regulacion autogena de mane: inmediata sugiere que esto ofrece un mecanism para vincular la sfntesis de proteina r ala sintesis C.: RNAr. Un modelo generalizado se ilustra en la Fir . Supongase que los sitios de union para k protefnas r reguladoras autogenas en el RNAr s o~ mucho mas fuertes que aquellos de las molecu l~ de RNAm. Siempre que haya un RNAr libre disponible, las protefnas r que acaban de sintetizarse s~ asociaran a el para iniciar el ensamble del ribosom.: No habra protefna r libre para unirse al RNAm, polo que su traduccion continuara. Sin embargo, e::cuanto disminuye de velocidad la sfntesis de RNA.:o se detiene, las proteinas r libres comienzan a acumularse. Despues estaran disponibles para unirse ~ sus moleculas de RNAm, y reprimir asi la traducci6::. posterior. Este circuito garantiza que cada opero::de protefna r responda de la misma manera al nive del RNAr: tan pronto haya un exceso de proteina ~ en relacion con el RNAr, la sintesis protefnica sere reprimida.

La p32 del fa go T4 es controlada por un circuito aut6geno Concepto principal

El exceso de la proteina del gen 32 (p32) se une a su propio RNAm para impedir que los ribosomas inicien La traducci6n .

el nivel de Ia traducci6n del RNAm policistr6nico. Cada uno de los reguladores es una protefna ribos6mica que se une en forma directa al RNAr. Su efecto sabre la traducci6n es el resultado de su capacidad para unirse tambien a su propio RNAm. Los sitios ubicados en el RNAm a los cuales se unen estas proteinas se superponen a la secuencia en la cual se inicia la traducci6n o se encuentran cerca y tal vez influyen en la accesibilidad al sitio de iniciaci6n al inducir cambios de conformaci6n. Por ejemplo, en el operon S l 0, la proteina L4 actua en el inicio preciso 326


• p32 se une a su propio RNAm para impedir La iniciacion de La traducci6n.

La regulacion autogena se ha establecido en una bas cuantitativa para el gen 32 del fago T4. La proteina (p32) tiene una funcion fundamental en Ia recombinacion genetica, la reparacion del DNA y la replicacion, en Ia cual su funcion se ejerce por virtud de su capacidad de unirse al DNA de cadena individual. Las mutaciones sin sentido hacen que Ia proteina inactiva se produzca en demasfa. Por lo tanto, cuandt se impide La funci6n de La proteina, se produce mas de ella_ Este efecto ocurre en el nivel de Ia traduccion; e: RNAm del gen 32 es estable y permanece asia pesa del comportamiento del producto protefnico.

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Otros RNAm p32 RNAm

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Concentraci6n (molar) protefnica___. -' ? La protelna del gen 32 se une a varios sustratos : - afinidades distintas, en el siguiente arden: DNA de cadena -:'vidual, su propio RNA m y otras moleculas de RNAm. La -=onde dicha protelna a su RNAm impide que incremente el el de p32 a mas de 10-6 M.

La

presenta un modelo del circuito del gen 32. Cuando hay DNA de cadena Jividual en ]a celula infectada por el fago, secues:::_ Ia p32. Sin embargo, en ausencia de DNA de _:_dena individual, o a! menos en condiciones en c s cuales hay un remanente de p32, Ia protefna ~pide la traduccion de su propio RNAm. El efecto ~ mediado en forma directa por la union de p32 al - -Am para inhibir la iniciacion de la traduccion. Es ·~obable que esto onura en una region rica en A-T _:e rodea al sitio de union ribosomico. Para que ellazo de control funcione de mane-=. eficiente son necesarias dos caracterfsticas de la _'lion de p32 al sitio del RNAm: • La afinidad de p32 por el sitio Iocalizado en el RNAm del gen 32 debe ser significativamente mas baja que su afinidad por el DNA de cadena individuaL La constante de equilibria de Ia union del RNA esta, de hecho, casi dos ordenes de magnitud por debajo de Ia del DNA de cadena individuaL • No obstante, la afinidad de la protefna p32 por el RNAm debe ser significativamente mayor que la afinidad por otras secuencias de RNA. Esta determinada por Ia composicion de las bases y por la estructura secundaria; un aspecto importante de la union al RNAm del gen 32 es que la region reguladora tiene una secuencia extendida que carece de estructura secundaria. Utilizando las constantes de equilibrio conoci..35, se puede realizar un diagrama de la union de -: 32 a sus sitios diana en funcion de Ia concentracion -, otefnica. La I muestra que en concen~aciones por debajo de 1o-6 M, la protefna p32 se _ne al DNA de cadena individuaL En concentra:iones mayores a I0-6 M, se une al RNAm del gen ; 2. En concentraciones incluso mayores se une a 35 otras secuencias de RNAm, con un intervalo de .:..Snidades. ~ : control

Estos resultados implican que el nivel de p32 debe estar autorregulado para ser < 1o-6 M, lo cual corresponde a -2 000 moleculas por bacteria. Esto corresponde apropiadamente al nivel medido de 1 000 a 2 000 moleculas /celula. Una caracterfstica del control autogeno es que cada interaccion reguladora es {mica: una protefna actua solo en el RNAm encargado de su propia sfntesis. El fago T4 constituye un ejemplo de un regulador de la traducci6n mas generaL codificado por el gen regA, el cual reprime la expresion de numerosos genes que se transcriben durante el inicio de lainfeccion. La protefna RegA impide la traduccion de las moleculas de RNAm de estos genes al competir con las subunidades 30S por los sitios de iniciacion del RNAm. Su accion es una contraparte directa de la funci6n de una protefna represora que se une a operadores multiples.

IE

La regulaci6n aut6gena se utiliza a menudo para controlar la si ntesis de ensambles macromoleculares

Concepto principal • El precursor de los microtubulos, la protelna tubulina li bre, inhibe la traducci6n del RNAm de la tubulina.

La regulacion autogena es un tipo frecu ente de control entre las protefnas que son incorporadas en ensambles macromoleculares. La particula ensamblada puede ser inadecuada como regulador porque es demasiado grande, muy numerosa o bastante restringida en cuanto a su localizacion. Sin embargo, la n ecesidad de sintetizar sus componentes puede reflejarse en el banco de subunidades precursoras libres. Si se bloquea la ruta de ensamble por cualquier motivo, las subunidades libres se acumulan y apagan Ia sfntesis innecesaria de mas componentes. Las celulas eucari6ticas tienen un sistema comun en el cual tiene lugar Ia regulaci6n autogena de este tipo. La tubulina es el monomero del cual se sintetizan los microtubulos, un sistema filamentoso importante de todas las celulas eucari6ticas. La producci6n del RNAm de Ia tubulina es controlada por el banco de tubulina libre. Cuando este banco alcanza cierta concentraci6n, la produccion de mas RNAm de Ia tubulina se inhibe. Una vez mas, el principio es el mismo: Ia tubulina secuestrada en su ensamble macromolecular no tiene ninguna funcion en la regulacion, pero el nivel de precursores libres en el banco determina si se agregaran mas monomeros. El sitio diana para la regulacion es una secuencia corta localizada en el inicio de la region codifi-

12.25 La regulaci6n aut6gena se utiliza a menudo para controlar la slntesis de ensambles macromoleculares

327

La tubulina libre se une

RNAm Protefna naciente

La tubulina es ensamblada en microtubulos

El RNAm es! degradado == = ==== ======::: 4 La tubulina se ensambla en microtCtbulos cuando es sintetizada. La acumulacion del exceso de tubulina libre induce inestabilidad en el RNAm de la tubulina al actuar en un sitio localizado en el inicio del marco de lectura en el RNAm o en la posicion correspondiente en la proteina naciente.

cadora. Todavia nose conoce que funcion tiene esta secuencia, pero se ilustran dos modelos en la r:u • 40 . La tubulina puede unirse de manera directa al RNAm o puede unirse al polipeptido naciente que representa a esta region. Cualquiera que sea el modelo que se aplica, el exceso de tubulina hace que el RNAm de la tubulina que se localiza en los polisomas sea degradado, por lo que la consecuencia de la reaccion es hacer inestable al RNAm de la tubulina. El control autogeno es un sistema intrfnsecamente auto-limitante, en contraste con el control extrfnseco que se analizo antes. La capacidad de una proteina represora de unirse a un operador puede ser controlada por el nivel de una pequefia molecula extrafia, la cual inhibe o facilita su actividad. En el caso de la regulacion autogena, sin embargo, el parametro determinante es la concentracion de la proteina misma.

Ef!D

Resumen

La transcripcion es regulada por la interaccion entre los factores de actuacion en trans y los sitios de actuacion en cis. Un factor de actuacion en trans es el producto de un gen regulador. Casi siempre es una proteina, pero tambien puede ser RNA. Se difunde en la celula yen consecuencia puede actuar en cualquier gen diana apropiado. Un sitio de actuacion en cis en el DNA (o en el RNA) es una secuencia que 3 28


funciona al ser reconocida in situ. No tiene funcio c codificadora y puede regular solo aquellas secuencias a las cuales es contigua fisicamente. Los gene ~ bacterianos codifican proteinas cuyas funciones estan relacionadas, como las enzimas sucesivas de un< ruta, y pueden ser organizadas en un agrupamientc que se transcribe en un RNAm policistronico a partir de un solo promotor. El control de este promoto; regula la expresion de toda la ruta. La unidad de regulacion, la cual contiene genes estructurales y elementos de actuacion en cis, se denomina operon. La iniciacion de la transcripcion es regulada po: interacciones que tienen lugar en la vecindad de' promotor. La capacidad de la polimerasa de RN,.. ._ para iniciar en el promotor es inhibida o activadc. por otras proteinas. Los genes que son activos a menos que sean apagados se dice que se encuentrar. bajo control negativo. Los genes que son activo: solo cuando son encendidos de manera especifi ca se dice que estan bajo control positivo. El tip de control puede determinarse por las relaciones de dominancia entre los genes de tipo silvestre y los genes mutantes que son constitutivos/no reprimid o~ (encendidos de forma permanente) o no inducibles superreprimidos (apagados de manera perpetua). Una proteina represora impide que la polimerasa de RNA se una al promotor o que active 1.: transcripcion. El represor se une a una secuencic. diana, el operador, que por lo general se encuentrc. alrededor o en sentido ascendente con respecto c;_ punto de inicio. Las secuencias operadoras son cortas y con frecuencia son palindromicas. El repres o~ a menudo es un homomultimero cuya simetrfa refleja la de su diana. La capacidad de la proteina represora para unirse a su operador es regulada por una molecula pequefia. Un inductor impide la union de un represo. un correpresor lo activa. La union del inductor ~ del correpresor a su sitio produce un cambio en :,:: estructura del sitio de union al DNA del represo~ Esta reaccion alosterica ocurre en las proteinas represoras libres y de manera directa en las proteina.s represoras que ya se encuentran unidas al DNA. La ruta de la lactosa opera por medio de induecion, cuando un galactosido ~inductor impide qucel represor se una a su operador; la transcripcion : la traduccion del gen lacZ despues producen galactosidasa ~, la enzima que cataboliza galactosidos ~ La ruta del triptofano opera por represion; el cc' represor (triptofano) activa la proteina represorc. por lo que se une al operador e impide la expres i6~ de los genes que codifican las enzimas que biosir.tetizan el triptofano. Un represor puede controla.: multiples dianas con copias de una secuencia d~ consenso operadora.

Una proteina con alta afinidad por una secuen.: diana particular del DNA tiene menor afinidad ~ todo el DNA. La proporci6n define la especi ~ ad de la proteina . Hay muchos mas sitios no - cificos (cualquier secuencia de DNA) que sitios :na especfficos en un genoma; en consecuencia, _a proteina de union al DNA como un represor ·Jna polimerasa de RNA es "almacenada" en el . -A. (Es probable que no exista protefna en for ~ libre, o que sea muy poca.) La especificidad por secuencia diana debe ser lo suficientemente alta ~a contrarrestar el exceso de sitios no especfficos n respecto a los sitios especfficos. El equilibria de '· proteinas bacterianas es ajustado de tal mane~ que la cantidad de protefna y su especificidad _rmitan el reconocimiento especffico de la diana . - condiciones "encendidas", pero permitan una Jeraci6n casi cornpleta de la diana en condiciones ' pagadas".

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Eflli1

El monomero represor tiene numerosos dominios

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EfJI

Los fenotipos muta ntes se correlacionan con la estructura del dominio

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lfJm

La proteina represora se une al operador

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Efll

El represor se une a tres operadores e interactua con la polimerasa de RNA

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Ef!l\l

El operador compite con los sitios de baja afinidad para unirse al represor

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I!IJl

El factor CRP funciona de formas diferentes en operones diana distintos

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La sintesis de las proteinas res controlada por media de regu lacion autogena

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330


lfll

La regulacion autogena se utiliza a menudo para controlar la sintesis de ensambles macromolecu lare-:

Articulo de revision Gold, L. ( 1988). Posttranscriptional regulatory mechanisn: in E. coli. Annu. Rev. Biochem. 57, 199-223.

A regulador ESQUEMA DEL CAPITULO

J liD

Introducci6n • El RNA funciona como regulador al formar una region de estructura secundaria (intermolecular o intramolecular) que cambia las propiedades de una secuencia diana .

Las estructuras secundarias alternativas controlan la atenuaci6n • La terminaci6n de la transcripci6n puede atenuarse si se controla la formacion de la estructura de horquilla necesaria en el RNA. • Los mecanismos mas directos de la atenuacion incluyen proteinas que estabilizan o que desestabilizan a la horquilla.

• Los genes antisentido bloquean la expresi6n de sus dianas cuando son introducidos en las celulas eucari6ticas.

IW

IDmJ Las bacterias contienen RNA reguladores • Las moleculas de RNA reguladoras bacterianas se denom inan sRNA. • Muchas de las moleculas de sRNA estan unidas a la protei na Hfq, la cual incrementa su efectividad. • El sRNA OxyS activa o reprime La expresi6n de mas de 10 loci en el nivel postraduccional.

• Una proteina termi na dora denominada TRAP es activada por el triptofano para impedir la transcripcion de los genes trp.

1m Los microRNA son reguladores en numerosas eucariotas

El operon tript6fano de Eschen'chia coli es controlado par media de atenuaci6n

• Los genomas de los anima tes y de las plantas codifican numerosas moleculas cortas de RNA (de -22 bases) denominadas microRNA. • Los microRNA reg ulan la expresi6n genica por media de apareamiento de bases con secuencias complementarias en los RNAm diana.

• Un atenuador (terminador intrinseco) se localiza entre el promotor y el primer gen del agrupamiento trp. • La ausencia de tript6fano suprime la terminaci 6n y ocasiona que la transcripcion aumente 10 veces.

La atenuaci6n puede ser controlada por la traducci6n • La region lider del operon trp tiene un marco de lectura abierto de 14 codones que incluye dos codones de tript6fano. • La estructura de RNA localizada en el atenuador depende de la traduccion de este marco de lectura. • En presencia de tript6fano, ellider es traducido y el atenuador es capaz de formar la horquilla que provoca la terminaci6n. • En ausencia de triptofano, el ribosoma se atasca en los codones de tript6fano y la estructura secundaria alternativa impide la formacion de la horquilla, por lo que la transcripcion continua.

Las moleculas pequefias de RNA son capaces de regular la traducci6n • Un RNA regulador funciona al formar una region duplex con un RNA diana. • La estructura duplex puede bloquear la iniciaci6n de la traducci6n, provocar la terminaci6n de la transcripci6n o crear una diana para una endonucleasa.

La terminaci6n de los genes trp de Bacillus subtilis es controlada por el tript6fano y por el RNAtTrp

• La actividad de la TRAP es inhibida (de manera indirecta) por el RNAt"P no cargado.

El RNA antisentido puede ser utilizado para desactivar la expresi6n genica

111m

La interferencia de RNA esta relacionada con el silenciamiento de los genes • La interferencia de RNA desencadena la degradaci6n de los RNAm complementarios a cualquier cadena corta de dsRNA. • El dsRNA puede provocar el silenciamiento de los genes hospedadores.

BID

Resumen

Continua en Ia siguiente pdgina

331

1111

Introducci6n

Concepto principal • El RNA funciona como regulador al formar una region de estructura secundaria (intermolecular o intramolecular) que cambia las propiedades de una secuencia diana .

El principia basico de Ia regulacion en las bacterias consiste en que Ia expresion genica es controlada por un regulador que interactua con una secuencia o con una estructura especffica del DNA o del RNArn en alguna etapa anterior ala sfntesis protefnica. La etapa de la expresion que es controlada puede ser la transcripcion, cuando la diana de regulacion es el DNA, o el control puede ocurrir en Ia traduccion, cuando la diana de la regulacion es el RNA. Cuando el control sucede durante la transcripcion, puede ocurrir en la iniciacion o en la terminacion . El regulador puede ser una protefna o un RNA. El termino "controlado" puede significar que el reguladar apaga (reprime) la diana o que la enciende (que Ia activa). La expresion de numerosos genes puede ser controlada de manera coordinada par un solo gen regulador bajo el principia de que cada diana contiene una co pia de Ia secuencia o de la estructura a Ia cual reconoce el regulador. Los reguladores pueden a su vez ser regulados, mas a menudo en respuesta a moleculas pequenas cuyo abastecimiento responde a condiciones ambientales. Los reguladares pueden ser controlados por otros reguladores para formar circuitos complejos. A continuacion se compara la forma en la que trabajan los diferentes tipos de reguladores.

RNA diana

t

RNA regulador

"V

l Region duplexl

1J Un RNA regulador es un RNA pequefio con una region de cadena individual que puede aparearse con una region de cadena individual en un RNA diana. f L 1

332

CAPITULO 13 RNA regulador

Los reguladores protefnicos siguen principia~ alostericos. La protefna tiene dos sitios de union uno para una diana de acido nucleico y el otro para una molecula pequena . La union de Ia molecule. pequefia a su sitio cambia Ia conformacion de ta. manera que altera la afinidad del otro sitio por e: acido nucleico. La forma en la cual sucede esto se conoce en detalle en el caso del represor Lac. Los reguladores proteinicos a menudo son multimericos con una organizacion simetrica que permite que dos subunidades hagan o con una diana palin dromica del DNA. Esto puede generar efectos de union cooperativos que crean una respuesta rna· sensible a la regulaci6n. La regulacion por media del RNA utiliza cambios en la estructura secundaria como principic rector. La capacidad de un RNA para cambiar de: conformaci6n con consecuencias reguladoras es lc alternativa del acido nucleico a los cambios alostericos de Ia conformaci6n protefnica. Los cambios dt estructura pueden provenir de interacciones intramoleculares o intermoleculares. La funcion mas frecuente de los cambios intra· moleculares es que una molecula de RNA asuma las estructuras secundarias alternativas at utilizar diferentes esquemas de apareamiento de bases . Las propiedades de las conformaciones alternativas puede~ ser diferentes . Los cambios en la estructura secundaria de un RNArn pueden modificar su capacidai. de ser traducido. La estructura secundaria tambie:-_ sirve para regular la terminaci6n de la transcripci6r_ cuando la diferencia entre las estructuras alternativas radica en que permitan la terminaci6n o n( lo hagan. En las interacciones intermoleculares, un regulador de RNA reconoce su diana por el principi familiar de apareamiento de bases complementa· rias. La FIGUrA 13.1 muestra que el regulador suek ser una molecula pequefia de RNA con estructurc. secundaria extensa, pero con una region (o algun a ~ regiones) de cadena individual complementaria "una region de cadena unica ubicada en su diana. Lc. forma cion de una region de doble helice entre el regulador y Ia diana puede tener dos consecuencias: • La formacion de la estructura de doble h elice puede ser suficiente por si misma. EL algunos casas, Ia protefna (o las protefnas puede unirse solo a Ia forma de cadena individual de Ia secuencia diana y, par lo tam la formaci6n duplex le impide actuar. E:-. otros casas, la region duplex se transformc en Ia diana para Ia union; par ejemplo, en e_ caso de las nucleasas que degradan el RN_-_ y, por lo tanto, impiden su expresion. • La formaci6n duplex puede ser importan· ~ debido a que secuestra una region del RN.~_

terminaci6n de La transcripci6n puede atenuarse si controla La formaci6n de La estructura de horquilla -ecesaria en el RNA.

y los genes son expresados. Se utilizan diferentes mecanismos en sistemas distintos para controlar la estructura del RNA. Las protefnas que se unen a! RNA pueden regular Ia atenuacion para estabilizar o para desestabilizar la formacion de Ia horquilla necesaria para Ia terminacion. La muestra un ejemplo en el cual una protefna impide Ia formacion de Ia horquilla terminadora. La actividad de dicha protefna puede ser intrfnseca o responder a una molecula pequefi.a de Ia misma manera que una protefna represora responde a un correpresor.

_Js mecanismos mas directos de La atenuaci6n incluyen :·oteinas que estabilizan o que desestabilizan a La -orqui lla.

1111

diana que de otra manera participarfa en alguna estructura secundaria alternativa.

Las estructuras secundarias alternativas controlan la atenuaci6n Y;::eptos principales 2

~=

~ tructura del RNA ofrece una oportunidad para :-egulacion en las procariotas y en las eucariotas. - :·mci6n mas comun se ejerce cuando Ia molecu.:e RNA puede adquirir estructuras secundarias :::nativas mediante diferentes esquemas para el ~ !"eamiento de bases intramolecular. Las propie:es de las conformaciones alternativas pueden ser ·=~entes. Este tipo de mecanismo puede servir para . :: Jar Ia terminacion de Ia transcripcion, cuando · ·ferencia entre las estructuras alternativas radi- ::n que permitan Ia terminacion. Otro medio de :-.. rol de Ia conformacion (y, por lo tanto, de la - ·on) lo ofrece Ia division del RNA; a! retirar un =-:-· 1ento de una molecula de RNA, la conformacion :_ resto puede alterarse. Asimismo, es posible que ""..3. molecula de RNA (pequefi.a) controle la activi_:j de un RNA diana al aparearse con el; Ia funcion : ~ R1'{A minusculo es directamente analoga a Ia de ::>roteina regula dora (vease Ia seccion l3. 7, Las - leculas pequefi.as de RNA son capaces de regu- · Ia traducci6n). La capacidad que tiene un RNA .: ::a cambiar de conformaci6n con consecuencias :cJUladoras es Ia alternativa del acido nucleico a los " bios alostericos de conformaci6n que regulan Ia cion protefnica. Estos dos mecanismos permiten __a interaccion en un sitio de Ia molecula para afec..:: Ia estructura de ono sitio. Numerosos operones son regulados por ate. aci6n, un mecanismo que controla Ia capaci. . .=.d de Ia polimerasa de RNA de leer a traves de - atenuador, el cual es un terminador intrfnseco ::alizado al inicio de una unidad de transcripcion. ~:principia de la atenuaci6n consiste en que algun suceso .erno controle !a formaci6n de !a horquilla necesaria -..:ra !a terminaci6n intrfnseca. Si se permite Ia forma- ' n de la horquilla, Ia terminacion impide que Ia limerasa de RNA transcriba los genes estructu -31es . Si se impide Ia formaci6n de Ia horquilla, Ia limerasa de RNA se alarga a traves del terminador

-

La terminaci6n de los genes trp de Bacillus subtilis es controlada por el tript6fano y por el RN AtTrp

Conceptos principales • Una proteina terminadora denominada TRAP es activada por el tript6fano para impedir La transcripci6n de los genes trp. • La actividad de La TRAP es inhibida (de manera indirecta) por el RNAtTrp no cargado .

El sistema de circuitos que controla Ia transcripcion por medio de Ia terminacion puede utilizar medios directos e indirectos para responder al nivel de sustratos o productos de moleculas pequefias.

Horquilla de terminaci6n

La protefna se une para bloquear Ia horqu illa

La atenuaci6n tiene Lugar cuando se impide La formaci6n de una horquilla terminadora en el RNA.

13.3 La terminaci6n de los genes trp de Bacillus subtilis es controlada por el tript6fano y por el RNAtTrp

333

Tript6fano presente

Gen antiTRAP Tript6fano ausente RNAtTrp no cargado

l

- - Horquilla ausente ::_____ Estructura alternativa

La TRAP es activada par el tript6fano y se une al RNAm trp. Esto permite que se forme la horquilla de terminaci6n, lo cual da como resultado la terminaci6n de la polimerasa de RNA y la falta de expresi6n de los genes. En ausencia de tript6fano, la TRAP nose une y el RNAm adopta una estructura que impide que se forme La horquilla de terminaci6n.

antiTRAP

l TRAP

En B. subtilis, una protefna denominada protefna atenuadora de union al RNA en presencia de tript6fano (TRAP, tryptophan RNA-binding attenuation protein) (antes denominada MtrB) es activada por el tript6fano (Trp) para unirse a una secuencia en el Ifder del transcrito naciente. La TRAP forma un multfmero de 11 unidades. Cada subunidad se une a un solo tript6fano y a un trinucle6tido (GAG o UAG) de RNA. El RNA se enrolla en un cfrculo alrededor de Ia protefna. La 1 muestra que el resultado es garantizar Ia disponibilidad de las regiones necesarias para formar la horquilla terminadora. Despues, la terminaci6n de la transcripci6n impide la producci6n de las enzimas biosinteticas de tript6fano. En efecto, Ia TRAP es una proteina terminadora que responde al nivel de tript6fano. En ausencia de TRAP, una estructura secundaria alternativa impide Ia formaci6n de la horquilla terminadora. Sin embargo, la TRAP, a su vez, tambien es conJ + muestra que el trolada por el RNAtTrp_ La RNAtTrp no cargado se une al RNAm de una protefna denorninada antiTRA.P (AT). Esta suprime Ia formacion de una horquilla de terminaci6n en el RNAm. El RNAtTrp no cargado tambien incrementa la traducci6n del RNAm. El resultado combinado de estas dos acciones incrementa la sfntesis de antiTRAP, Ia cual se une a la TRAP y le impide reprimir al operon de tript6fano. Por medio de esta serie de sucesos complejos, Ia ausencia de tript6fano genera RNAt 334


t En condiciones normales (en presencia de ·- : t6fano) la transcripci6n termina antes que el gen antiT -Cuando no hay tript6fano, el RNAtT•P se aparea con el R -antiTRAP, lo que impide la formaci6n de la horquilla termi-dora y provoca la expresi6n de antiTRAP.

no cargado, el cual provoca Ia sfntesis de antiTR.-..: Este a su vez impide Ia funci6n de Ia TRAP, la a::. provoca !a expresi6n de los genes del tript6fano. Por lo tanto, Ia expresi6n de los genes t.rp .: B. subtilis es controlada por el tript6fano y po: RNAtTrp_ Cuando hay tript6fano, no necesita ser .,-tetizado. Esto se logra cuando el tript6fano ace la TRAP e inhibe asf la expresi6n de las enzi ~ que sintetizan el tript6fano. La presencia de RNA:. no cargado indica que hay escasez de tript6fano. ::: RNAt no cargado activa !a antiTRAP y, por lo tar:activa Ia transcripci6n de los genes trp.

El operon tript6fano de Escherichia coli es controlado por medio de atenuaci6n I

TRADUCCION + TERMINACION ~

Uder

Promotor...,._

~

S61o se transcribe el lfder

+ - - Region codificadora ----. Terminador 1

Terminador 2

::Onceptos principales Un at enua dor (terminador intrinseco) se localiza entre el promotor y el pri mer gen del agrupamiento trp. La ausencia de triptofano suprime la terminacion y ocasiona que la transcri pcion aumente 10 veces. Horquilla de terminaci6n

::..:-. E. coli se utiliza un sistema regulador complejo : __el cual se descubrio por primera vez la atenua- o) . Los cam bios de la estructura secundaria que . - ~ rrolan la atenuacion son determinados por Ia -icion del ribosoma en el RNAm. La --:"Jestra que Ia terminacion requiere que el riboso.. i pueda traducir un segmento lider que precede a los . .es trp en el RNAm. Cuando el ribosoma traduce : region lider se forma una horquilla de termina- ' n en el terminador l . Sin embargo, cuando se le __pide al ribosoma traducir ellfder, la horquilla de : nninadon no se forma y la polimerasa de RNA --anscribe la region codificadora. En consecuencia, este : canismo de antiterminaci6n depende de la posibilidad -_·que las circunstancias externas influyan en el movi.:.ento del ribosoma en la region lider. El operon trp esta fo rmado por cinco genes es<Jcturales ordenados en una serie contigua, los _CJales codifican las tres enzimas qu e transforman el : ;:ido corismico en triptofano. La roues-a que Ia transcripcion inicia en un promotor que 7 encuentra en el extrema izquierdo del agrupa- iento. La expresion del operon trp es controlada r dos mecanismos independientes. La represion · e la expresion la ejerce una protefna represora ·odificada por el gen trpR no ligado) que se une a :.m operador adyacente al promotor. La atenuacion :: ntrola el progreso de la polimerasa de RNA en el peron al regular la posibilidad de que la termina_·on ocurra en un sitio que precede al primer gen :structural. La atenuacion se descubrio por primera vez ,::uando se observo que la delecion de una secuenj a localizada entre el operador y la region codi:icadora trpE puede aumentar la expresion de los ~enes estructurales. Este efecto es independiente ·e la represion: los n iveles de transcripcion basal :· deprimida se incrementan. Por lo tanto, este sitio :.nfluye en los sucesos que tienen Iugar despues de ue la polimerasa de RNA ha salido del promotor a pesar de las condiciones que prevalecen en Ia :niciacion). Entre el promotor y el gen trpE se localiza un atenuador (terrninador intrfnseco) . Este proporciona

TRADUCCION y TERMINACION AUSENTES Se ~r~nscribe Ia regi6n codtftcadora Terminador 1 ...,._ Terminador 2 Promotor...,._

Ia estructura secundaria del RNAm

La terminaci6n puede controlarse con los cambios en la estructura secundaria del RN A det erminados por el movimiento ribos6mico.

Sintetasa de antranilato trpE tipO

Lider

Atenuador

Horquilla rica en G-C/cadena individual rica en U

El operon trp esta formado por cinco genes estructurales contiguos precedidos por una region de control que incluye el promotor, el operador, la region codificadora del peptide lider y el atenuador.

una barrera a la transcripcion en los genes estructurales. La polimerasa de RNA termina ahi, in vivo o in vitro, para producir un transcrito de base 140. La terminacion en el atenuador responde al nivel de triptofano, como se ilustra en la La terminacion es ef.iciente en presencia de cantidades suficientes de triptofano . Sin embargo, en

13.4 El operon t riptofano de

Escherichia coli es controlado par media de atenuacion

335

TRANSCRIPCI6N DE LA REGI6 N LiDER

Promotor

Pausa

Atenuador

trpE

La polimerasa inicia

Ia atenuacion permite que casi todas las polimerasas continuen. Junto con el incremento de 70 veces en la iniciacion de Ia transcripcion que se deriva de la liberacion de Ia represion, esto permite un intervalo de regulacion del operon de unas 700 veces.

1111

La atenuaci6n puede ser controlada por la traducci6n

Conceptos principaLes TRIPT6FANO AUSENTE: LA TRANSCRIPCI6 N CONTINUA EN EL OPER6 N

• La region Lider del operon trp tiene un marco de leotura abierto de 14 codones que incluye dos codones de tri ptofano. • La estructura de RNA LocaLizada en eL atenuador depende de La traduccion de este marco de Lectura. • En presencia de triptofano, ellider es traducido y eL atenuador es capaz de formar La horquilla que provoca la terminacion.

TRIPT6 FANO PRESENTE: LA TRANSCRIPCI6 N TERMINA EN EL ATENUADOR

La polimerasa termina

J Un atenuador controla La progresi on de La polimerasa de RNA en los genes trp . La polimerasa de RNA inicia en el promotor y despues prosigue a La posicion 90, en donde hace una pausa antes de seguir adelante hasta el atenuador que se encuentra en La posicion 140. En ausencia de triptofano, la polimerasa de RNA continua en los genes estructurales (trpE comienza en +163). En presencia de triptofano hay una probabilidad de - 90% de que la terminacion libere el RNA l\der de la base 140.

ausencia de triptofano, Ia polimerasa de RNA puede continuar en los genes estructurales. La represion y la atenuacion responden de la misma manera a! nivel de triptofano. Cuando este esta presente, el operon es reprimido y Ia mayor parte de las polimera sas de RNA que escapan del promotor termina despues en el atenuador. Cuando el triptofano es retirado, Ia polimerasa de RNA tiene libre al promotor y tambien deja de ser obligada a terminar en forma anticipada. La atenuacion tiene un efecto de aproximadamente 10 veces sobre la transcripcion. Cuando el triptofano esta presente, la terminacion es efectiva y el atenuador permite que solo -1 0 % de las polimerasas de RNA prosigan. En ausencia de triptofano, 336


• En ausencia de triptofano, el ribosoma se atasca en los codones de triptofano y la estructura secundaria alternativa impide La formaci6n de La horquiLLa, por Lo que la transcripcion continua.

(,De que fo rma puede responder la terminacion de Ia transcripcion en el atenuador al nivel de triptofan o? La secuencia de Ia region lfder sugiere un mecanismo. Tiene una secuencia codificadora corta que podrfa representar a un peptido lider de 14 aminoacidos. La Figura 13.6 muestra que contiene un sitio de union ribosomica cuyo codon AUG es seguido por una region codificadora corta que contiene dos codones sucesivos de triptofano. Cuando ala celula se le termina el triptofano, los ribosomas inician la traduccion del peptido lfder, pero se detienen cuando alcanzan los codones de triptofano. La secuencia del RNAm sugiere que esta detencion de los ribosomas influye en Ia terminacion en el atenuador. La secuencia lider puede escribirse en estructuras apareadas de manera alternativa. La capacidad del ribosoma de proseguir porIa region lfder controla las transiciones entre estas estructuras. La estructura determina si el RNAm puede proporcionar las caracterfsticas necesarias para Ia terminacion. La ilustra estas estructuras. En Ia primera, Ia region uno se aparea con la region dos, y Ia region tres se aparea con la region cuatro. El apareamiento de las regiones tres y cuatro genera Ia horquilla que precede a Ia secuencia U8 : esta es Ia sefial esencial de Ia terminacion intrfnseca. Es probable que el RNA adquiera esta estructura en ausencia de cualquier intervencion externa. Si se le impide a Ia region uno aparearse con Ia region dos, se forma una estructura diferente. En

Las regiones tres y cuatro ESTRUCTURAS ALTERNATIVAS Las regiones dos y !res se se aparean para forrnar Ia La regi6n dos es complementaria de las regiones uno y tres aparean; Ia region terminadora horquilla terminadora La region tres es complementaria de las regiones dos y cuatro es de cadena individual

R La region llder trp puede existir en otras conformaciones apareadas. El centro muestra las cuatro regiones que :_eden aparearse. La region uno es complementaria de la region dos, la cual es complementaria de la region tres, que a su ~z es complementaria de la region cuatro. En ellado izquierdo se encuentra la conformacion que se produce cuando la re?on uno se aparea con la region dos y la region tres se aparea con la regio n cuatro. En ellado derecho esta la confo rmaci6n :: : quirida cuando la region dos se aparea con la region tres y deja las regiones uno y cuatro sin aparear.

::: .e caso, la region dos es libre de aparearse con la -fi6n tres. Entonces, Ia region cuatro no tiene un _ ;:npafiero de apareamiento disponible, por lo que - obligada a permanecer como cadena individual. ~ consecuencia, Ia horquilla terminadora no podra :marse. La muestra que Ia posicion del ri- oma puede determinar que estructura se forma, _: :al manera que la terminacion es atenuada solo -=ausencia de triptofano. La caracterfstica crucial .a posicion de los cod ones de Trp en la secuencia -_:.ificadora del peptido lfder. Cuando hay triptofano, los ribosomas son capa-:s de sintetizar el peptido lider. Aquellos continuan · ~ Ia seccion lfder del RNAm al codon UGA, el cual : encuentra entre las regiones uno y dos. Como se 1estra en Ia parte inferior de la figura, al progre-- a este punto, los ribosomas se extienden a Ia =~·on dose impiden que se realice el apareamiento -~ · ases. El resultado es que Ia region tres queda sponible para aparearse con Ia region cuatro, lo ...a.: genera la horquilla terminadora. Por lo tanto, - _ tas condidones, Ia polimerasa de RNA termina en ~:enuador.

Cuando no hay triptofano, los ribosomas se de::::en en los codones de Trp, los cuales son parte =.a region uno, como se muestra en Ia parte su=- ·or de la figura. Por lo tanto, la region uno es _~ CJestrada dentro del ribosoma y no puede formar _:-::>s de bases con la region dos. Esto significa que :-egiones dos y tres se aparean antes de que se --=..::lscriba la region cuatro. Esto obliga a la region

TRIPTOFANO AUSENTE

ll"u A

u

G

u c

G A

Trp Trp

A G 8 c UGGUGGCGAACUUCCUGAAAC G g

uuuuuu

c

G G G

\

gUAAU.

El ribosoma se detiene en los codones Trp

TRIPTOFANO PRESENTE El ribosoma avanza

r c

-+-

Gi!l!

~U

Trp Trp

A A U

_

UGGUGGCGAACUUCCUGAAACGGGCAGU~ ~

I

El movimiento del ribosoma interrumpe el apareamiento 2:3

~ uuuuuu

g G: c c

G

C .G~ El apareamiento 3:4 forma ___ tf~ Ia horquilla de terminaci6n AA

Las alternativas de la polimerasa de RNA en el atenuador dependen de la localizaci6n del ribosoma, el cual determina si las regio nes tres y cuatro se pueden aparear para formar la horquilla terminadora. 13.5 La atenuacion puede ser controlada por la traducci6n

337

Tript6fano presente

Trp

1 Tript6fano ausente

En presencia de RNAt tript6fano, los ribosomas traducen el peptido l\der y son liberados. Esto permite la formaci6n de la horquilla, por lo que la polimerasa termina. En ausencia de RNAt tript6fano, el ribosoma es bloqueado, la horquilla de terminaci6n no puede formarse y la polimerasa de RNA continua.

cuatro a permanecer en forma de cadena individual. En ausencia de la horquilla terminadora, la polimerasa de RNA continua la transcripcion mas alia del atenuador. El control por medio de atenuacion requiere una organizacion cronologica precisa de los sucesos. Para que el movimiento ribosomico determine la formacion de estructuras secundarias alternativas que controlen Ia terminacion, Ia traducci6n del lfder debe ocurrir a! mismo tiempo que la polimerasa de RNA se aproxima a! sitio terminador. Un episodio determinante para el control cronologico es Ia presencia de un sitio que ocasione que la polimerasa de RNA haga una pausa a 90 bases a lo largo del peptido lfder. La polimerasa de RNA permanece en pausa hasta que un ribosoma traduce el peptido lfder. Despues, Ia polimerasa es liberada y se mueve hacia el sitio de atenuacion. Cuando llega ahf, Ia estructura secundaria de Ia region de atenuacion ha sido determinada. resume Ia funcion del RNAt-Trp La en el control de Ia expresion del operon. AI proporcionar un mecanisme para detectar fa insuficiencia del abastecimiento de RNAt-Trp, Ia atenuaci6n responde de manera directa a fa necesidad de tript6fano de la celula e11 la sintesis proteinica. ,;.Que tan generalizado esta el uso de la atenuacion como mecanismo de control de los operones 338


bacterianos? Se usa en al menos seis operones que codifican enzimas implicadas en la biosintesis de aminoacidos. Por lo tanto, la retroalimentacion desde el nivel de aminoacido disponible para la sintesi5 proteinica (como lo representa la disponibilidad de: RNAt aminoacilado) hasta Ia produccion de las enzimas puede ser comun. El uso del ribosoma para controlar Ia estructura secundaria del RNA en respuesta a Ia disponibilidad de RNAt aminoacilado establece una relaci6e inversa entre Ia presencia de RNAt aminoacilado \ la transcripci6n del operon, la cual es equivalente a la situaci6n en la cual el RNAt aminoacilado funciona como correpresor de la transcripcion . E mecanismo regulador es mediado por cambios er. Ia formacion de regiones duplex; por lo tanto, Ia atenuaci6n proporciona un ejemplo sobresaliente de la importancia de Ia estructura secundaria en !2. terminaci6n y de su u so en la regulacion. De este modo, E. coli y B. subtilis utilizan el mismo tipo de mecanismo, el cual comprende el contra: de la estructura del RNAm en respuesta ala presencia o ala ausencia de un RNAt, pero han combinadc las interacciones individuales de maneras distintas. El resultado final es el mismo: inhibir Ia producci6n de las enzimas cuando hay un exceso en e: abastecimiento del aminoacido y activar Ia produccion cuando se indica escasez por la acumulacior. de RNAtTrp no cargado.

liD

El RNA antisentido puede ser utilizado para desactivar la expresi6n genica

Concepto principal • Los genes antisentido bloquean la expresi6n de sus dianas cuando son introducidos en las celulas eucari6ticas.

El apareamiento de bases es un medio eficaz para que un RNA controle Ia actividad de otro. Hay num erosos casos en las procariotas y en las eucariotas en donde un RNA de cadena individual (porI general bastante corto) se aparea con una regi6r.. complementaria de un RNAm y como resultado impide la expresion del RNAm. Uno de los primero~ ejemplos de este efecto lo proporcion6 la situaci6r: artificial en Ia cual los genes antisentido fueror: introducidos en celulas eucarioticas. Los genes antisentido se construyen al reverti.:la orientacion de un gen con respecto a su promotor, de tal manera que la cadena "antisentido" eo transcrita, como se ilustra en la F 13 L . La sintesis de RNA antisentido puede desactivar un RNA

- =. en las celulas eucari6ticas 0 en las celulas pro-:icas. Un RNA antisentido es en efecto un RNA __ador sintetico. Un gen antisentido de cinasa de iina inhibe la sfntesis de la cinasa de timidina _arte del gen end6geno. La cuantificaci6n del :::o no es por completo confiable, pero parece :- uede ser necesario un exceso (quizas consi.:· le) de RNA antisentido. ;_A que nivel inhibe la expresion el RNA anti- .:do? En principia podrfa impedir Ia transcrip - del gen autentico, el procesamiento de su pro-::o de RNA o la traduccion del mensajero. Los ..: tados de diferentes sistemas muestran que la ~:oici6n depende de la formaci6n de moleculas ~ A-RNA duplex, pero esto puede ocurrir en :::.ucleo o en el citoplasma. En el caso de un gen :::: entido establemente acarreado por una celula j vada, los duplex de RNA con sentido -RNA an~ntido se forman en el nucleo, lo que impide el · .:::esamiento normal o el transporte del RNA con - .iido. En otro caso, la inyeccion de RNA en el in::-: r del citoplasma inhibe Ia traduccion a! formar ·A duplex en Ia region 5' del RNAm. Esta tecnica ofrece una metodologfa eficaz para .;,gar los genes a voluntad; por ejemplo, Ia funci6n :- :JD gen regulador puede investigarse si se intro_:e una version antisentido. Una extension de esta :: ::llca es colocar el gen antisentido bajo el control . m promotor que esta sujeto a regulaci6n. El gen =aa puede despues ser encendido y apagado al re- _:arIa produccion de RNA antisentido. Esta tecni..: ? ermite investigar Ia irnportancia de Ia cronologfa :: Ia expresion del gen diana.

Las moleculas pequefias de RNA son capaces de regular la traducci6n w nceptos principales Un RNA regulador funciona al formar una region duplex con un RNA diana. La estructura duplex puede bloquear la iniciaci6n de la traducci6n, provocar la terminaci6n de la transcripci6n o crear una diana para una endonucleasa.

- JS represores y los activadores son protefnas de : :ruacion en trans, no obstante el sistema de circui- formal de una red reguladora podrfa construirse __uy bien a! utilizar un RNA como regulador. De : _cho, el m odelo original del operon dejo abier.2 Ia pregunta de si el regulador puede ser RNA o - :-otefna. En efecto, resulta que Ia construccion de -::oleculas sinteticas de RNA antisentido imita a una

Promotor

Gen antisentido

5'

3'

Transcrito antisentido

fl\. v3'

3' '

RNA-RNA duplex El RNA antisentido puede generarse si se revierte la orientaci6n de un gen con respecto a su promotor y puede asociarse con el t ranscrito de tipo silvestre para formar RNA duplex.

clase de reguladores de RNA cuya importancia ha ido en aumento. Igual que una protefna regula dora, un RNA regulador pequefio es una molecula sintetizada de manera independiente que se difunde a un sitio diana formado por una secuencia de nucleotidos especffica. La diana de un RNA regulador es una secuencia de acido nucleico de cadena individual. El RNA regulador funciona por complementariedad con su diana, en Ia cual puede formar una region de doble cadena . Es posible imaginar dos mecanismos generales para Ia accion de un RNA regulador: • La fo rmacion de una region duplex con el acido nucleico diana inhibe en forma directa su capacidad para funcionar al formar o secuestrar un sitio especffico. La 1 ilustra una situacion en la cual a una protefna que se une a un RNA de cadena individual se le impide actuar a traves de Ia formacion de un duplex. La m u estra Ia relacion opuesta, en Ia cual Ia formacion de una region de doble cadena crea un sitio diana para una endonucleasa que destruye Ia diana de RNA. • La formacion de una region dttplex en una parte de Ia molecula diana cambia la conformacion de otra region , lo que afecta de manera indirecta su funcion. La 1 ilustra un ejemplo. El m ecanismo es en esencia similar a! uso de Ia estructura secundaria en Ia atenuacion (vease la secci6n 13 .2, Las estructuras secundarias alternativa s controlan Ia aten uacion) , excepto que las regiones que interactttan se encuentran

13.7 Las moleculas pequeiias de RNA son capaces de regular la traducci6n

339

La protefna se une a una region de cadena individual en Ia diana

Una prote1na que se une a una region decadena individual en un RNA diana podria ser excluida por un RNA regulador que forma un duplex en esta region.

Al unirse a un RNA diana para formar una region duplex, un RNA regulador puede crear un sitio que es atacado por una nucleasa.

.

.

.

~

La estructura secundaria se forma en ausencia del regulador

El apareamiento de bases con un RNA regulador puede impedir la formaci6n de la estruct ura secundaria surgi da por el apareamiento de bases entre dos regiones del RNA diana. En este ejemplo, la capa cidad del extremo 3' del RNA de aparearse con el extremo 5' es inhibida por el regulador.

340


en moleculas diferentes de RNA en vez .:. ser pane de Ia misma molecula de RNA. La caracterfstica comun de ambos tipos de regulaci_mediada por el RNA es que los cambios en la estructz.secundaria de la diana controlan su actividad. Un regulador de RNA pequeiio casi siemp: puede ser encendido al controlar Ia transcripci6n -su gen o ser apagado por una enzima que degra el producto de regulador de RNA. Por lo generaL ::: imposible regular de otra manera Ia actividad de RNA regulador. De hecho, antes se pensaba que L era posible que un RNA tuviera propiedades al .tericas; a diferencia de las protefnas represoras qc.. _ controlan los operones, un RNA por lo general :_ puede responder a moleculas pequeiias con camb'_:_ su capacidad para reconocer su diana. El descubrimiento del ribointerruptor con~· tuye una excepci6n a esta regia. La 3 45 r: sume Ia regulaci6n del sistema que produce el me:-"bolito GlcN6P. El genglmS codifica una enzima q:.: : sintetiza GlcN6P (glucosamina-6-fosfato) a partir .:: · fructosa-6-fosfato y glutamina. El RNAm contie::_una larga region 5' no traducida (untranslated regi ~ UTR) antes del marco codificador. Dentro de Ia ~~ hay una ribozima (una secuencia de RNA que tie:_actividad catalftica) (vease Ia secci6n 27 .4, Las ri . zimas tienen varias actividades catalfticas) . En escaso, la actividad catalftica Ia proporciona una e:donucleasa que divide su propio RNA. Es activaporIa union del metabolito, GlcN6P, a Ia ribozi.Jr:..= La consecuencia es que Ia acumulaci6n de GlcKt: activa Ia ribozima, Ia cual divide el RNAm, el cua; su vez evita Ia traducci6n. Este es un analogo exac del control alosterico de una protefna represora c el producto terminal de una ruta metab6lica. He. numerosos ejemplos de dichos ribointerruptores e las bacterias. Otro mecanismo regulador que comprenc la transcripci6n de RNA no codificador trab<>:de manera indirecta . La iniciaci6n en un promo: diana puede ser suprimida por Ia transcripci6n L. otro promotor localizado en sentido ascendente el, como se muestra en Ia . La cal;:_ de Ia inhibici6n es que Ia polimerasa de RNA q· inicia en el promotor que se encuentra en senti~ ascendente hace Ia ultralectura del promotor que encuentra en sentido descendente, lo cual imp; que los factores de transcripci6n y la polimera.: · de RNA se unan a eJ. Este tipo de efecto se ha d. mostrado en sistemas eucari6ticos y puede depeder de Ia interrupci6n de Ia estructura cromos6nr en el promotor diana. El RNA que se transcribe <:promotor (regulador) que se encuentra en sendo ascendente no tiene funci6n codificadora. E> puede explicar Ia presencia de algunos de los R. · no codificadores en los nucleos eucari6ticos; no s -

-_ -_-\ reguladores, sino que son productos indirectos _ •Jn sistema regulador.

Las bacterias contienen RNA reguladores

Ribozima

RNAm g/mS

Region codificadora

5' - - - - -

~ traducci6n

Conceptos principales Las moleculas de RNA reguladoras bacterianas se denominan sRNA.

Enzima glmS

~ actividad enzimatica

• Muchas de las moleculas de sRNA estan unidas a la proteina Hfq, la cual incrementa su efectividad. El sRNA OxyS activa o reprime la expresi6n de mas de 10 loci en el nivel postraduccional.

Fru6P

~__.~I

~~NH

~ --r

]as bacterias, los RNA reguladores son molecu.:s cortas que se conocen en conjunto como sRNA . · ort RNA, RNA corto); E. coli contiene al menos 17 3 .N!A diferentes. Algunos de los sRNA son regula~ )res generales que afectan numerosos genes diana. =-ws funcionan por apareamiento de bases con los ::L~A diana (por lo general moleculas de RNAm) -;::ra controlar su estabilidad o su funci6n. Un ejemplo de control de estabilidad lo ofrece el - :::queiio regulador antisentido RyhB, el cual regula _.=is moleculas de RNAm que codifican protefnas _-::lplicadas en el almacenaje del hierro en E. coli. :::: regulador RyhB se aparea con cada uno de los ?::-.lAm diana para formar regiones de doble cadena ~e son sustratos para la RNAasa E. Una caracterfs:: -a interesante del circuito es que Ia ribonucleasa =~struye el RNA regulador y el RNAm. El estres oxidativo proporciona un ejemplo de ~:1 sistema de control general en el cual el RNA es :: regulador. Cuando son expuestas a especies reac_: 'as del oxfgeno, las bacterias responden inducien.:o genes antioxidantes de defensa. El per6xido de :_:dr6geno enciende el activador de la transcripci6n _ xyR, el cual controla Ia expresi6n de numerosos .,.enes inducibles. Uno de estos genes es oxyS, el cual :odifica un RNA pequeiio. La muestra dos caracterfsticas so-:-esalientes del control de la expresi6n del gen oxyS. :=n una bacteria silvestre que se encuentra en con:::ciones normales, nose expresa. El par de geles del 3 do izquierdo de Ia figura muestran que se expresa =n niveles altos en una bacteria mutante con un ~en constitutivo oxyR activo. Esto identifica a oxyS :omo diana para Ia activaci6n por oxyR. El par de ;::eles en ellado derecho de la figura muestran que c>l RNA OxyS se transcribe en l min de exposici6n il per6xido de hidr6geno. El RNA OxyS es una secuencia corta (de 109 : -_ucte6tidos) que no codifica una protefna. Es un :egulador de actuaci6n en trans que afecta la expre-

GlcN6P

Division

c ._

2

EJ RNAm es desactivado

La region 5' no traducida del RNAm de la enzima que sintetiza GlcN6P contiene una ribozima que es activada por el producto metab6lico. La ribozima desactiva el RNAm al dividi rlo.

Promotor regulador

Ausencia de terminadores

Promotor diana

""" RNA no codificador La ausencia de iniciaci6n permite que los factores de transcripci6n se unan al promotor diana

RNA codificador

La transcripci6n a partir de un promotor en sentido ascendente puede inhibir la iniciaci6n en un promotor que se encuentra en sentido descendente a el, debido a que la lectura a traves del promotor que se encuentra en sentido descendente impide que los factores de transcripci6n necesarios se unan a el. El RNA transcrito del promotor localizado en sentido ascendente no tiene funci6n codificadora.

13.8 Las bacterias contienen RNA regulado res

341

Tipo

Adici6n de H2 0 2

Mutante

\

silvestre oxyR

RNAm oxyR

RNA oxyS (1 09 nts)

•

I Los geles del lado izquierdo muestran que el RNA oxyS es inducido en un mutante constitutive oxyR. Los geles del lado derecho muestran que el RNA oxyS es inducido en un minuto a partir de La adici6n de per6xido de hidr6geno a un cultivo de tipo silvestre. Reproducida de Cell, vol. 90, Altuvia, S., et al., A small stable RNA .. . , pp. 44-53. Copyright 1997, con autorizaci6n de Elsevier. Fotografia cortes\a de Gisela Storz, National Institutes of Health.

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•

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don de iniciacion del RNAm FlhA. El apareamiento de bases entre RNA OxyS y RNA FlhA impide que el ribosoma se una a! codon de iniciacion y, por lo tanto, reprime la traduccion. Asimismo, hay una segunda interaccion de apareamiento que comprende una secuencia localizada dentro de Ia region codificadora de FlhA. Otra diana de oxyS es rpoS, ei gen que codifica un factor alternativo (el cual activa una respuesta de estres general). AI inhibir Ia produccion del factor <J. oxyS garantiza que Ia respuesta especifica al estres oxidativo no desencadene Ia respuesta apropiada. para otras condiciones de estres. El gen rpoS tambien es regulado por otros sRNA (el DsrA y el RprA), los cuales lo activan. Estos tres sRNA parecen ser lo5 reguladores globales que coordinan las respuestas a varias condiciones ambientales. Las acciones de los tres sRNA son asistidas p o~ una protefna de union a! RNA denominada Hfq. Esta protefna fue identificada en un principia com un factor hospedador bacteriano indispensable para. Ia replicacion del bacteriofago de RNA Q~. Esta relacionado con las protefnas Sm de las eucariotas que se unen a muchos de los snRNA (small nuclear RNA RNA nucleares pequefios) que tienen funcione~ reguladoras en Ia expresion genica (vease Ia seccion 26.5, Los snRNA son necesarios para el corte y empalme) . Las mutaciones de este gen tienen numerosos efectos, los cuales Ia identifican como una. prote(na pleiotropica. Hfq se une a muchas de las moleculas de sRNA de E. coli e incrementa Ia efectividad del RNA OxyS a! potenciar su capacidad de unirse a sus RNAm diana. Es probable que el efecto de Ia protefna Hfq este mediado porIa provocacion de un pequefio cambio en Ia estructura secundaria. del RNA OxyS que mejora Ia exposicion de las secuencias de cadena individual que se aparean cor. los RNAm diana.

11J

Los microRNA son reguladores en numerosas eucariotas

5'

Conceptos principales EL RNA oxyS inhibe La traducci6n del RNAm flhA por el apareamiento de bases con una secuencia localizada j usta en sentido ascendente del codon de iniciaci6n AUG.

sion genica a niveles postraduccionales. Tiene mas de 10 loci diana; en algunos de ellos activa Ia expresion; en otros Ia reprime . LA IC:.JR muestra el mecanismo de represion de una diana, el RNAm FlhA. Tres estructuras tallo-lazo sobresalen en Ia estructura secundaria del RNAm OxyS y ellazo que se encuentra cerca del extremo 3' es complementario a una secuencia que precede justamente a! co342


• Los genomas de los animales y de las plantas codifican numerosas moleculas cortas de RNA (de -22 bases) denominadas microRNA. • Los microRNA regulan La expresi6n genica por media de apareamiento de bases con secuencias complementarias en los RNAm diana.

Los RNA muy pequefios son reguladores de gene;: en numerosas eucariotas. El primer ejemplo se descubrio en el nematodo Caenorhabditis elegans come resultado de Ia interaccion entre el gen regulado~

-.; y su gen diana, lin14. La 1 ilustra el de este sistema regulador. El gen .:.aa lin1 4 regula el desarrollo larvario. La expren de linl4 es controlada por el gen lin4, ei cual :iifica un transcrito pequeii.o de 22 nucleotidos. : transcritos del gen lin4 son complementarios a - secuencia de 10 bases que se repite siete veces Ja region no traducida 3' de lin14. La expresion . .·in4 reprime Ia expresion de lin14 despues de Ia : scripcion, sobre todo debido a que Ia reaccion : :~pareamiento de bases entre los dos RNA pro 3 la degradacion del RNAm. Este sistema es en :-:icular in teresan te po r Ia implicacion del extre3' como un sitio de regulacion . El RNA lin4 es un ejemplo de un microRNA · NA). Hay -80 genes en el genoma de C. elegans _:: codifican molecu las de m iRNA con una longide 21 a 24 nucleotidos. Tienen patrones varia:') de expresion durante el desarrollo y tienden a - . eguladores de Ia expresion genica . Mu chos de ::niRNA de C. elegans estan contenidos en una :- 'cula ribonucleoprotefnica extensa (de 15S) . .'vluchos de los miRNA de C. elegans tienen ho_ogos en los mamiferos, por lo que el mecanismo . 7de ser propagado. Tambien se encu entran en plantas. De las 16 moleculas de miRNA que se .:'Jentran en Arabidopsis, ocho es tan por comple :onservadas en el arroz, lo cual sugiere qu e se _ropagado la conservaci6n de este mecanismo · :-Jlador. El virus SV40 codifica moleculas de miRNA que ~ complementarias a los RNAm producidos du-_:e el periodo temprano de la infeccion virica. Los _ _:"l'A son transcritos desp u es en el ciclo vfrico, :..:Zan apareamiento de bases con los RNAm tem:.__os.y provocan su degradacion en este pun to del _ _ vital, cuando dejan de ser necesarios. El mecanismo de la produccion de los miRNA -:bien se ha conservado de manera generaliza:=:n el ejemplo de lin4, el gen es copiado en un _scrito que forma una region de doble cadena . : se convierte en diana para una nucleasa deno -=:.ada Dicer. Esta tiene actividad helicasa terminal . cualle permite desenrollar la region de doble -..:.=na, y dos dominios de nucleasa que estan rela __ ados con la ribonucleasa III bacteriana. En las : as, en los gusanos y en las plantas se encuen-~ enzimas relacionadas . La divisi on del transcrito _: at genera el miRNA activo . La interferencia de ~ - jvidad enzimatica bloqu ea !a produccion de los _.._~A y provoca defectos del desarrollo. :=:u las plantas se ha descrito otro paso en !a -=:~ acion de los miRNA; en ellas, la ribosa del - ~:eo tido terminal 3' es metilada por la enzima : _]transferasa HEN l. La metilacion estabiliza el ::~portamiento

_-::.. A.

A

'1\1\/V\

~ lin4 codifica un RNA que desactiva lin14

C\fA.f/ ~

lin4

Protefna ausente J El RNA lin4 regula la expresi6n de /in14 cuando se une a la region no traducida 3'.

liD

La interferencia de RNA esta relacionada con el silenciamiento de los genes

Conceptos principales • La interferencia de RNA desencadena la degradaci6n de los RNAm complementarios a cualquier cadena corta de dsRNA. • El dsRNA puede provocar el si lenciamiento de los genes hospedadores.

La regulacion de lo s RNAm por los rniRNA es emulada por el fenomeno de interferencia del RNA (RNA interference, RNAi). Este fen omeno se descubrio cuando se observo que los RNA con sentido y los RNA ant isentido pu eden inhibir Ia expresion genica con Ia misma eficacia. La razon es que las preparacion es de cualquier tipo de RNA de cadena individual (al parecer) estan de hecho contaminada s por pequeiias cantidades de RNA de doble cadena (double stranded RNA, dsRNA). Las investigaciones con un sistema in vitro muestran que el dsRNA es degradado por medio de la division dependiente de ATP para formar oligonucleotidos de 21 a 23 bases . El RNA corto en ocasiones se denomina RNA corto interferente (short

13.10 La interferencia de RNA esta relacionada con el silenciamiento de los genes

343

El siRNA que media la interferencia del RNA se genera cuando se divide el dsRNA en fragmentos mas pequeiios. La reaccion de division tiene Lugar a una distancia de 21 a 23 nucleotidos a partir del extremo 3'. El producto de si RNA tiene bases sobresalientes en sus extremos 3'.

. .. .

:...

.

.

La nucleasa divide el dsRNA en siRNA dsRNA

/fi:YA~/'-YA._~

~ El siRNA se aparea con el RNAm RNAm Helicasa ~

La nucleasa divide el RNAm

La RNAi se genera cuando un dsRNA es dividido en fragmentos que dirigen la division del RNAm correspondiente.

interfering RNA, siRNA). La muestra que el mecanismo de division comprende Ia realizacion de cortes en relacion a cada extrema 3' de un dsRNA largo para generar fragmentos de siRNA con extremos cortos sobresalientes 3' (de dos bases). La misma enzima (el Dicer) que genera los miRNA se encarga de Ia division. La RNAi ocurre despues de Ia transcripcion cuando un siRNA induce Ia degradacion de un RNAm complementario. La sugiere que el siRNA puede proporcionar un molde que lleva a una nucleasa a degradar moleculas de RNAm que son complementarias a una o a ambas cadenas, quiza por medio de un proceso en el cual el RNAm se aparea con los fragmentos. Es probabl e que se 344


necesite una helicasa que ayude en Ia reaccion de apareamiento. El siRNA dirige la division del RNArr. en Ia mitad del segmento apareado. Estas reaccione" tienen Iugar dentro de un complejo ribonucleoprotefnico denominado RISC (RNA-induced silencin:· complex, complejo de silenciamiento inducido poRNA). Las protefnas de Ia familia Argonauta sor componentes de este complejo y son indispensable<para Ia reaccion de Ia division. La metilacion de ic. ribosa 3' puede ser necesaria para que el miRNA se=. incorporado al complejo. Todavfa hay incertidumbre con respecto a si e. complejo RISC silencia la expresi6n genica (vease != secci6n 31.1, La heterocromatina depende de in tee-acciones con las histonas). La actividad de la pol:merasa de RNA es necesaria para Ia interferencia de. RNA, pero no queda claro si es directa (debido a qt:.:: forma transcritos que son necesarios) o indirect:. (porque participa en la union del RNA interferen [RNAi] a los transcritos o debido a que separa lili. cadenas de DNA durante la transcripci6n, lo qu7 permite una interaccion con el RNAi). La RNAi se ha convertido en una tecnica efica::: para eliminar Ia expresi6n de un gen diana especffco en las celulas de los invertebrados, sobre todo e_;:_ C. elegans y en Drosophila melanogaster. Sin embargo Ia tecnica ha tenido escasa aplicaci6n en las celulc.: de los mamfferos, los cuales tienen una respues:-=. mas generalizada al dsRNA que consiste en apaga· Ia sfntesis protefnica y degradar el RNAm. La L muestra que esto sucede debido ados reacci nes. El dsRNA activa la enzima PKR, la cual desactiva el factor de iniciaci6n de Ia traducci6n eiF2a fosforilarlo. Tambien activa la ciclasa de oligoaden•lato 2'5', cuyo producto activa la RNAasa L, la cudegrada todos los RNAm. No obstante, resulta qu:: estas reacciones necesitan dsRNA cuya longitud e-· mayor a 26 nucle6tidos. Si se introduce dsRNA mi corto (de 21 o 23 nucle6tidos) a las celulas de I mamfferos, desencadena Ia degradaci6n espedfic de los RNA complementarios tal como sucede cor la tecnica de RNAi en los gusanos y en las moscas Con este avance, parece probable que la RNAi s: transforme en el mecanismo universal de elecci 'para desactivar la expresi6n de un gen especffico. Como ejemplo del progreso que se ha realizac con dicha tecnica, ha sido posible utilizar la RN.!_ para un analisis sistematico de la expresi6n geni --=en C. elegans. Los fenotipos de perdida de la funci6pueden ser generados al alimentar gusanos con bacterias que expresan un dsRNA que es hom6logo : un gen diana. Al hacer una genoteca de bacteri- . en la cual cada bacteria expresa un dsRNA que C{ rresponde a un gen distinto, los gusanos han siri. tamizados por los efectos de la desactivaci6n de :.-=. mayor parte de los genes ( 86%) .

La interferencia del RNA se relaciona con pro..: os naturales en los cuales la expresi6n genica es enciada. Las plantas y los hongos exhiben silen-.:amiento de RNA (algunas veces denominado enciamiento genico postranscripcional), en el cual -· dsRNA inhibe Ia expresi6n de un gen. La fuente :::as comun de RNA es un virus en replicaci6n. Este __ecanismo pudo haber evolucionado como defensa . ntra infecciones vfricas. Cuando un virus infecta _:la celula vegetaL la formaci6n de dsRNA desenca: ':na Ia supresi6n de la expresi6n del genoma de Ia -:anta. El silenciamiento de RNA tiene, ademas, c:. caracterfstica notable de que no esta Jimitado ala :~lula en la cual ocurre la infecci6n vfrica: puede :.:seminarse por toda la planta de forma sistemica. -J parecer, la propagaci6n de Ia sefial comprende :: paso de RNA o de fragmentos de RNA . Puede · ~q ueri r alguna de las mismas caracterfsticas que : 5tan implicadas en el desplazamiento del virus :1ismo. Es posible que el silenciamiento de RNA volucre una amplificaci6n de Ia sefial por un pro:~ so de sfntesis de RNA dependiente de RNA en el :-:1al una polimerasa novedosa utiliza siRNA como :ebador para sintetizar mas RNA en un molde de :- A complementario. Un proceso relacionado es el fen6meno de Ia co;upresi6n, en el cual la introducci6n de un trans; en h ace que el gen end6geno correspondiente sea :J.enciado. Esto se ha descrito de manera amplia :-:1 las plantas. El efecto es que el transgen debe for:nar las copias de RNA antisentido y de RNA con sen_do, que inhiben la expresi6n del gen end6geno. El silenciamiento sucede por medio de inter~:ciones RNA-RNA . Tambien es posible que e l -RNA inhiba la expresi6n genica al interactuar con :: DNA. Si una copia de DNA de una secuencia de ::- ~A viroide es insertada en el genoma de una plan.3., se metila cuando el RNA viroide se replica. Esto 'lgiere que Ia secuencia de RNA podrfa estar indu·endo Ia metilaci6n de Ia secuencia de DNA. En las : elulas de las plantas se ha detectado una direcci6n .:milar de Ia metilaci6n del DNA qu e corresponde : las secuencias representadas en el dsRNA. La me.Jaci6n del DNA esta asociada a la represi6n de Ia ::-anscripci6n, por lo que esta podrfa ser otra forma _e silenciar los genes representados en el dsRNA ·_,ease Ia secci6n 24.18, La expresi6n genica esta ~s ociada a Ia desmetilaci6n). Nose sabe nada sobre :-1mecanismo .

Resumen =.a expresi6n genica puede experimentar una re; ulaci6n positiva por parte de los factores que acj van un gen o negativa por parte de los factores

ffiVJ't!~.l~.lftlft!

__.....

dsRNA>26 nucle6tidos

~

2',5'AS

~

~

eiF2a

~

~~

A

! ,_

A/\

RNAm degradado

RNAasa L

~

!

/~.lJ~.

siRNA se dirige al RNAm complementario

~

PKR

~-

/

X La slntesis protelnica no puede iniciarse Degradaci6n de todo el RNAm

El dsRNA inhibe la s\ntesis prote\nica, desencadena la degradaci6n de todos los RNAm en las celulas de los mam\feros y tambien tiene efectos espec\ficos de secuencia.

que reprimen un gen. El primer nivel de controL y el mas frecuente, tiene Iugar en la iniciaci6n de la transcripci6n, pero Ia terminaci6n de Ia transcripci6n tambien puede ser controlada. La traducci6n puede ser regida por medio de regulado res qu e interactuan con el RNAm. Los productos reguladores pueden ser protefnas, las cuales son controladas a menudo por interacciones alostericas en respuesta a! ambiente, o moleculas de RNA, las cuales funcionan al aparearse con el RNA diana para cambiar su estructura secundaria. Las redes reguladoras pue den crearse alligar reguladores de tal manera que la producci6n, o la actividad, de un regulador es controlada por otro . La atenuaci6n es un mecanismo que se sustenta en la regulaci6n de la terminaci6n para controlar Ia transcripci6n a naves de los operones bacterianos. Se utiliza a menudo en los operones que codifican las enzimas implicadas en la biosfntesis de u n aminoacido. El RNAm policistr6nico del operon comienza con una secuencia que p uede formar estructuras secundarias alternativas. Una de las estructuras tiene una h orquilla que constituye un terminador intrfnseco localizado en sentido ascendente con respecto a los genes estructurales; la estructura alternativa carece de la horquilla. Varios tipos de interacci6n determinan si se forma la horquilla. Una interacci6n sucede cuando una protefna se une a! RNAm para impedir Ia formaci6n de la estructura alternativa. En el operon trp de B. subtilis la TRAP tien e esta funci6n; es controlada por el a ntiTRAP cuya producci6n es controlada a su vez por el nivel de RNAt1 rp arninoacilado sin carga. En los operones 13.11 Resumen

345

trp (yen otros operones) de E. coli, Ia eleccion de Ia estructura que se forma es controlada por el progreso de la traduccion a naves de una secuencia lfder corta que incluye los codones del aminoacido, o de los aminoacidos, que so n el producto del sistema. En presencia de RNAt aminoacilado que porta dicho aminoacido (o dichos aminoacidos), los ribosomas traducen el peptido lfder, el cual permite que se forme una estructura secundaria que respalda Ia terminacion. En ausencia de este RNAt aminoacilado el ribosoma se detiene, lo cual da como resultado una estructura secundaria nueva en Ia cualla horquilla indispensable para Ia terminacion no puede formarse. El abastecimiento del RNAt aminoacilado, por lo tanto, controla (de manera inversa) la biosfntesis de los aminoacidos. Los RNA reguladores pequefios se encuentran en las bacterias y en las eucariotas. E. coli tiene -17 especies de sRNA . El sRNA oxyS controla unos 10 loci diana en el nivel postraduccional; algunos de ellos son reprimidos en tanto que otros so n activados. La represion es provocada cuando el sRNA se une a un RNAm diana para formar una regio n duplex que incluye el sitio de union al ribosoma. Los microRNA tienen una longitud de -22 bases y se producen en numerosas eucariotas por medio de Ia division de un transcrito mas largo. Funcionan al realizar apareamiento de bases con los RNAm diana para formar regiones duplex que son susceptibles a Ia division mediada por las endonucleasas. La degradacion del RNAm impide su expresion. La tecnica de Ia interferencia del RNA se ha convertido en el metoda de eleccion para desactivar los genes eucarioticos. Dicha tecnica utiliza Ia introduccion de secuencias cortas de dsRNA con una cadena complementaria al RNA diana y funciona al inducir Ia degradacion de las dianas. Este metoda puede estar relacionado con un sistema de defensa natural de las plantas denominado silenciamiento de RNA.

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.<\rticulo de investigaci6n

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strategias de los fagos ESQUEMA DEL CAPITULO • pQ es el producto de un gen temprano retrasado yes un antiterminador que permite a la polimerasa de RNA transcribir a los genes tardios. • El DNA A forma un circulo despues de la infecci6n; como resultado, los genes tardios constituyen una sola unidad de transcripcion.

Introducci6n El desarrollo litico se divide en dos periodos • El ciclo infeccioso de un fago se divide en periodo temprano (antes de la replicaci6n) y periodo tardio (despues del comienzo de la replicacion). • Una infecci6n por fagos genera un banco de genomas fagicos descendientes que se replican y se recombinan.

ID!lll

El desarrollo litico es controlado par una cascada • Los genes tempranos transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora despues de la infeccion incluyen, o comprenden, reguladores necesarios para la expresi6n del conjunto intermedio de genes fagicos. • El conjunto intermedio de genes incluye reguladores para transcribir los genes tardios. • Esto da como resultado la expresion ordenada de los grupos de genes durante la infeccion fagica.

l:mJ

La cascada lltica es controlada par dos tipos de sucesos reguladores • Las proteinas reguladoras utilizadas en las cascadas de los fago s pueden facilitar la iniciacion en promotores nuevas (de fagos) o provocar la ultralectura de los terminadores de la transcripci6n por parte de la polimerasa hospedadora. Los genomas de los fagos T4 y T7 presentan

191m

agrupacion funcional

• El fago A tiene dos genes tempranos inmediatos, N y cro, los cuales son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora. • El gen N es necesario para expresar los genes tempranos retrasados. • Tres de los genes tempranos retrasados son reguladores. • La lisogenia necesita los genes tempranos retrasados cii y ciii. • El ciclo litico requiere el gen temp rano inmediato cro y el gen temprano retrasado Q.

El represor y sus operadores definen la region de inmunidad • Numerosos fagos de tipo A tienen diferentes regiones de inmunidad . • Un fago lisogenico confiere inmunidad contra infecciones posteriores por cualquier otro fago con la misma region de inmunidad.

La forma de union al DNA del represor es un dimero • • • •

Un monomero represor tiene dos dominies distintos. El dominic terminal N contiene el sitio de union al DNA El dominic terminal Cse dimeriza . La union al operador requiere la forma dimerica para que los dos dominies de union al DNA puedan establecer o con el operador de manera simultanea. • La division del represor entre los dos dominies reduce la afinidad por el operador e induce un ciclo litico.

• Los genes implicados en funciones relacionadas a menudo estan agrupados. • Los fagos T4 y T7 son ejemplos de casas en los que se presentan cascadas reguladoras en las cuales la infecci6n por fagos se divide en tres periodos.

Los genes A. tempranos inmediatos y tempranos retrasados son indispensables para la lisogenia y para el ciclo litico

La lisogenia la mantiene una proteina represora • Los mutantes con mutaciones en el gen ci son inca paces de mantener la lisogenia. • El gen ci codifica una proteina represora que actua en los operadores 0, yo, para bloquear la transcripci6n de los genes tempranos inmediatos. • Los genes tempranos inmediatos activan una cascada reguladora; como resultado, su represion impide que el ciclo litico prosiga.

laD

El represor utiliza un elemento helice-giro-helice para unirse al DNA • Cada region de uni on al DNA localizada en el represor a a una mitad de si tio en el DNA . • El sitio de union al DNA del represor incluye dos ·regiones cortas de helice a que embonan en giros sucesivos del su rco mayor del DNA. • Un sitio de union al DNA es una secuencia (en parte) palindromica de 17 bp.

El ciclo litico depende de La antiterminacion

La helice de reconocimiento determina la especificidad par el DNA

• pN es un factor de antiterminaci6n que permite a la polimerasa de RNA continuar la transcripcion mas alla de los extremes de los dos genes tempranos inmediatos.

• La secuencia de aminoacidos de la helice de reconocimiento hace os con bases particulares en la secuencia operadora a la cual reconoce.

Bf)

Continua en Ia siguiente p6gina 349

• cii actua de manera directa en el promotor y ciii protege a cii de La degradacion. • La transcripcion a partir del PRE provoca La s1ntesis de. represor e incluso bloquea la transcripcion del gen ere

Los dimeros represores se unen en colaboraci6n al operador • La union del represor a un operador incrementa la afinidad de union de un segundo d1mero represor al operador adyacente. • La afinidad es 10 veces mayor por a,1 y por a,1 que por otros operadores, por lo que la union sucede pri mero en ellos. • La colaboracion permite al represor unirse a los sitios a1;az en concentraciones mas bajas.

IDID

El represor en OR2 interactua con la polimerasa de RNA en el PRM

III!.IE)

• El promotor PRE tiene secuencias at1picas en -10 yen -35. • La polimerasa de RNA se une al promotor solo en presencia de cii. • cii se une a secuencias cercanas a la region -35.

Dim La lisogenia requiere numerosos sucesos • cii y ciii provocan que se establezca la s1ntesis del represor y tam bien desencadenan la inhibicion de la transcripcion de los genes tard1os. • El establecimiento del represor apaga la expresion de los genes tempranos inmediatos y retrasados. • El represor activa el circuito de mantenimiento para s_ propia s1ntesis. • El DNA A se integra al genoma bacteriano en la etapc final del establecimiento de la lisogenia.

• La region de union al DNA del represor en a,z a ~ la polimerasa de RNA y estabiliza su union alP,,. • Esta es la base del control autogeno del mantenimiento del represor.

IBOil

El represor mantiene un circuito aut6geno • La union del represor a a, bloquea la transcripcion del gen N del P,. • La union del represor a a, bloquea la transcripcion de cro, pero es indispensable para la transcripcion de cJ. • Por lo tanto, la union del represor al operador bloquea la entrada al ciclo lltico al tiempo que facilita su propia s1ntesis.

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Introducci6n Algunos fagos tienen una sola estrategia de supervivencia. Al infectar un solo hospedador susceptible, subvierten sus funciones con el fin de producir una progenie de fagos mas numerosa. Como resultado de esta infeccion litica, Ia bacteria hospedadora muere. En el ciclo litico caracteristico, el DNA (o el RNA) del fago entra a Ia bacteria hospedadora, sus genes se transcriben en un orden predeterminado, el material genetico del fago se replica y los componentes proteinicos del fago se producen. Por ultimo, Ia bacteria hospedadora se rompe (se lisa) para liberar las partfculas ensambladas de Ia progenie por el proceso de Iisis. Otros fagos tienen una existencia doble. Pueden perpetuarse mediante el mismo tipo de ciclo lftico utilizando una estrategia abierta para producir el mayor numero de capias tan rapido como sea posi350

CAPITULO 14 Estrategias de los fagos

(_Que determina el balance entre la lisogenia. el ciclo l\tico? • La etapa temprana retrasada cuando Cro y el represor estan siendo expresados es comun en la lisogenia y eel ciclo l1tico. • El evento critico ocurre si cii provoca la s1ntesis suficiente de represor para superar la accion de Cro.

Los genes cii y ciii son necesarios para establecer la lisogenia • Los productos de los genes tempranos retrasados cii y cUI son necesarios para que la polimerasa de RNA inicie la transcripcion en el promotor PRE.

El represor Cro es necesario para la infecci6n l\tica • Cro se une a los mismos operadores que el represor, pero con afinidades distintas. • Cuando Cro se une al sitio 0,3 , impide que la polimerasa de RNA se una a P," y bloquea el mantenimiento del represor. • Cuando Cro se une a otros operadores en 0, o en 0,, impide que la polimerasa de RNA exprese a los genes tempranos inmediatos, lo cual bloquea (de forma indirecta) el establecimiento del represor.

Las interacciones de colaboraci6n incrementan la sensibilidad de la regulaci6n • Los d1meros represores unidos a a,1 y a a,z interactuan con los d1meros unidos a a,1 y a a,z para formar octameros. • La formacion del octamero aproxima a a,3 a a,3, lo que permite interacciones entre los d1meros unidos a dichas regiones. • Estas interacciones de colaboracion incrementan la sensibilidad de la regulacion.

Un mal promotor requiere prote\na cii

IIDfa

Resumen

ble. No obstante, tambien tienen otra forma de exi.s· tencia en Ia cual el genoma del fago esta presente c Ia bacteria de un modo latente que se conoce com profago. Esta forma de propagaci6n se denorni1 .:. lisogenia. En una bacteria lisogenica, el profago se inser~ en el genoma bacteriano y se hereda de Ia misn:..c manera que los genes bacterianos. El proceso por c cual se transforma de un genoma independiente c: fago en un profago que es parte lineal del genOIE bacteriano se describe como integracion. Debid que posee un profago, una bacteria lisogenica tiec : inmun.idad contra infecciones provocadas por fag _ del mismo tipo . La inmunidad Ia establece un sol· profago integrado, por lo que, en general, un gene rna bacteriano contiene solo una copia de un profag de cualquier tipo particular. Entre las formas de existencia litica y lisogenic~ ocurren transiciones. La G 1 muestra qu.

-do un fago producido par un ciclo litico entra a •. ueva celula bacteriana hospedadora, repite el .itico o entra en estado lisogenico . El resultado _:1de de las condiciones de Ia infecci6n y del ge del fago y del genotipo de Ia bacteria. ::_·n profago es liberado de las re stricciones de _·;Jgenia por media de un proceso denominado u cci6n. Primero el DNA del fago es liberado :::-omosoma bacteriano por escisi6n; despues el -- libre continua porIa ruta lltica. ::..as otras formas de propagarse de estos fagos "~- determinadas por Ia regulaci6n de la trans ..:.~6n. La lisogenia se mantiene porIa interacci6n n fago represor con un operador. El ciclo lftico : _iere una cascada de controles de Ia transcrip:-: . La transici6n entre los dos estilos de vida se ;:;;, por el establecimiento de Ia represi6n (de ciclo : a lisogenia) o porIa liberaci6n de Ia represi6n :.-xci6n de fa go lisogenico a fa go litico). Otro tipo de existencia en las bacterias lo re:-jentan los plasmidos. Estos son unidades au-: _mas que existen en la celula como genomas acromos6micos . Los plasmidos son moleculas ::!lares de DNA que se autorreplican y que se ~ tienen en la celula en un numero de capias es : .e y caracterfstico, es decir, el numero permanece =stante de una generaci6n a la otra. Algunos plasmidos tambien tienen otros estilos - ·ida. Pueden existir en estado extracromos6mico -' nomo o pueden estar insertados en el cromo~ a bacteriano; en este ultimo caso, son trans -:ados como parte del cromosoma de Ia misma ~:-~ e ra que cualquier otra secuencia. Dichas unida-: -e conocen como episomas, pero en ocasiones ~erminos "plasmido" y "episoma" se utilizan de ~"l era indistinta. En cuanto a los fagos lisogenicos, los plasmidos ~ s episomas mantienen una posesi6n egofsta de _ :.acteria y con frecuencia hacen imposible que se --...:lblezca otro elemento del mismo tipo. Este efecto .=::bien se denomina inmunidad, aunque Ia base

de Ia inmunidad por plasmidos es diferente a Ia de Ia inmunidad lisogenica . (Se aborda el control de !a perpetuaci6n de los plasmidos en el Capitulo 15, El replic6n.) La resume los tipos de unidades geneticas que pueden propagarse en la s bacterias como genomas independientes. Los fagos lfticos pueden tener genomas de cualquier tipo de acido nucleico; se transfieren entre las celulas por Jibe-

.

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DNA del fago es integrado al "bacteriano; Ia bacteria tiene un final feliz• •

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La progeni: es liberada • • .,._ de Ia bacteria lisada

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La bacteria lisogenica es ; inmune a infecciones : posteriores

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INDUCCION

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El DNA del fago es liberado y entra al ciclo litico

El desarrollo litico comprende la reproducci6n de las particulas del fago con la destrucci6n de la bacteria hospedadora, pero la existencia lisogenica permite que el genoma del fago sea transportado como parte de la informacion genetica bacteriana.

Estructura gen6mica

Forma de propagaci6n

Consecuencias

Fago litico

lnfecta a un hospedador susceptible Secuencia lineal en el cromosoma hospedador

Suele malar al hospedador

Fago lisogenico

DNA o RNA ds o ss lineal o circular dsDNA

Plasmido

Circulo de dsDNA

Se replica en un numero definido de capias Puede ser transmisible

lnmunidad contra plasmidos del mismo grupo

Episoma

Circulo de dsDNA

Circulo libre o lineal integrado Puede transferirse al DNA hospedador

1 .

I

\

Tipo de unidad

FIGU

I

~

lnmunidad contra Ia infecci6n

En las bacterias hay numerosos tipos de unidades geneticas independientes.

14.1 Introducci6n

3 51

raci6n de particulas infecciosas. los fago s lisogenicos tienen genoma s de DNA de doble cadena, igual qu e los plasmidos y qu e los episomas. Algunos plasmidos y episomas se transfieren entre las celulas por un proceso de conjugaci6n (que comprende el o directo entre la celula receptora y la celula donadora). Una caracteristica del proceso de transferencia en amb os ca sos es que en ocasi one s algunos genes bacterianos ho spedadores son transferidos con el DNA del fa go o del plasmido, por lo qu e estos sucesos ti en en una funci6n importante al permitir el intercambio de informacion genetica entre las bacterias.

Partfcula del fago

~

J,

El DNA es inyectado al interior de Ia bacteria Desarrollo temprano Se fabrican las enzimas necesarias para Ia sfntesis del DNA Comienza Ia replicaci6n

111J El desa rrollo l1tico se divide en dos periodos

D esarrollo tard fo Se fabrican los genomas, las cabezas y las colas El DNAes empacado en las cabezas; se adhieren las colas

Conceptos principales • El ciclo infeccioso de un fago se divide en periodo temprano (antes de la replicaci6n) y periodo tardio (despues del comienzo de la replicaci6n) . • Una infecci6n par fagos genera un banco de genomas fagicos descendientes que se replican y se recombinan.

lo s genomas de los fagos son pequenos por necesidad. Como sucede con todos los virus, esti:'in restringidos por la necesidad de empaquetar el acido n u cleico en el interior de una envoltura de protefna. Esta limitaci6n dicta muchas de las estrategias viricas de reproducci6n. Por lo general, un viru s toma control del mecanismo de Ia celula hospedadora , el cuallue go replica y expresa los ge nes del fago en vez de lo s genes bacterianos. En la mayor parte d e los casos, el fago incluye gen es cuya funci6n es garantizar la replicaci6n preferencial del DNA del fag o. Estos genes tienen que ver con la iniciaci6n de la replicaci6n e incluso pued en contener una nu eva p oli me rasa de DNA. Se introducen los cambios en la capa cidad de la celula h ospedadora para desempefi.ar la transcripci6n. Involucran el remplazo de la polimerasa de RNA o la m odifi cacion de su capacidad de iniciacion o de termin a ci6n. El resultado siempre es el mismo: las m oleculas de RNAm del fago se transcriben de man era preferente. En cuanto a Ia sfntesis protefnica, en su mayor parte el fago se satisface utilizando el mecanism o del hospedador y r edirige las actividades de este, sobre todo al remplazar el RNAm bacteriano p or el RNAm del fago. El d esarrollo litico se logra a trave s de una ruta en la cuallos genes del fag o se expresan en un orden particular. Esto garantiza que ha ya Ia cantidad correcta de cada componente en el tiempo adecuado. El ci clo puede dividirse en la s dos partes generales qu e se ilustran en Ia

352


lnfecci6n El fago se adhiere a una bacteria

Lis is La celula se rompe para liberar Ia progenie del fago

El desarrollo l\tico tiene lugar cuando se prC'::._ cen genomas del fa goy part\culas prote\nicas que son ens.= blados en los fagos de la progenie.

• La m fecci6n temprana describe el peri _ que abarca desde la entrada del DNA ha!·_ el inicio de su replicacion. • La infecci6n tardia define el periodo q transcurre desde el inicio de la replicaci hasta la etapa final, que consiste en la I' de Ia celula bacteriana para liberar la prog: nie del fago. La fa se temprana esta dedicada a la produce' d e la s enzimas implicadas en la reproducci6n DNA . Estas incluyen las en zimas que participan ~ Ia sfntesis del DNA en la recombinacion y, a - ces, en Ia modificacion. Sus actividades provoc: Ia acumulaci6n de un banco d e genomas fagic En es te banco, los genomas se estan replicand recombinando de manera continua, por lo que episodios de un solo ciclo litico involucran a una poblac

de genomas de fagos. Durante la fase tardia se sintetizan los conr nentes proteinicos de las particulas fagicas. A c nudo son necesarias numerosas proteinas distir.· para formar las estructuras de la cab eza y de lac

:o que la mayor parte del genoma del fago con: en funciones tardfas. Ademas de las protefnas -zturales, las "protefnas de ensamblaje" son inensables para ayudar a construir Ia partfcula, ~u e nose incorporen a ella. Mientras los com-:-ntes estructurales se estan ensamblando en ca=-:s y colas, Ia replicacion del DNA ha alcanzado ~.isa maxima. Luego, los genomas se insertan en .::abezas de protefna vacfas, se agregan las colas - .::elula hospedadora se lisa para permitir la libe- · n de las nuevas partfculas vfricas.

El desarrollo lltico es controlado por una cascada

Tipos de productos genicos Gen(es) regulador(es): polimerasa de RNA, factor o o factor de antiterminaci6n

Etapa intermedia el producto temprano provoca Ia transcripci6n de los genes intermedios

::-.ceptos pri nci pales

Gen(es) regulador(es): factor o o factor de antiterminaci6n Genes estructurales: enzimas de replicaci6n, etc.

_os genes tempranos transcritos por La polimerasa de ;NA hospedadora despues de la infecci6n incluyen, o :omprenden, reguladores necesarios para la expresi6n :el conjunto intermedio de genes fagicos.

:t conjunto intermedio de genes incluye reguladores :ara transcribir los genes tardios. :sto da como resultado la expresi6n ordenada de los ; rupos de genes durante la infecci6n fagica.

: rganizacion del mapa genetico del fago a menu:-efleja la secuencia del desarrollo lftico. El con-- :o del operon se lleva a una clase de extrema, en _:.1allos genes que codifican protefnas con fun..es relacionadas son agrupados para permitir su =~ro-l con Ja maxima economfa. Esto permite que . :.Ita del desarrollo lftico sea controlada con un :Jefio numero de interruptores reguladores. El ciclo litico se encuentra bajo control positivo, : ~al manera que cada grupo de genes del fago _:-de expresarse solo cuando se proporciona Ia seadecuada. La muestra que los genes : o-:ladores funcionan en una cascada, en Ia cual - ~en que se expresa en una etapa es indispensable -.:.-a Ia sintesis de los genes que se expresan en Ia =-_.iente etapa. La. primera etapa de Ia expresion genica tiene _:: valerse del mecanismo de transcripcion de la : ~I a hospedadora. En general, solo se expresan =:mos genes en esta etapa. Sus promotores son :.:.stinguibles de los de los genes hospedadores. ::!ombre de esta clase de genes depende del fago. ~- :a mayor parte de los casos, se conocen como ; n es ternpranos. En el fago A., se les llama ge: : ternpranos inrnediatos. A pesar del nombre, ~ stituyen solo un conjunto preliminar de genes - _ representan apenas la parte inicial del periodo -__ prano. En ocasiones se dedi can de manera ex - -iva a controlar la transici6n al siguiente periodo.

Etapa tardia: el producto intermedio provoca Ia transcripci6n de los genes tardios

-

Genes estructurales: componentes del fago El desarrollo l\tico del fago avanza por una cascada reguladora, en la cual un producto genico es necesario en cada etapa para la expresi6n de los genes de la siguiente etapa.

En todos los casos, uno de estos genes siempre codifica

una protefna indispensable para la transcripci6n de la siguiente clase de genes. Esta segunda clase de genes se conoce como el grupo de genes tempranos retrasados o intermedios. Su expresi6n suele comenzar en cuanto esta disponible Ia protefna reguladora codificada por un gen t emprano, o por mas de uno . De acuerdo con la naturaleza del circuito de controL el conjunto inicial de gen es tempranos puede continuar expresandose en esta etapa o no hacerlo. Si el control tiene lugar en la iniciacion, los dos sucesos son independientes (vease la ) y los genes tempranos pueden ser desactivados cuando se transcriben los genes intermedios. Si el control sucede en Ia terminaci6n, los genes tempranos deben seguir expresandose (vease Ia ) . A menudo, la expresion de los genes hospedadores disminuye. En conjunto, los dos grupos de genes tempranos representan todas las funciones requeridas por el fago, excepto aquellas necesarias para el ensamblaje de la envoltura y para Ia lisis de la celula. Cuando Ia replicacion del DNA del fago comienza, es el momento indicado para que los genes 14.3- El desarrollo litico es controlado por una cascada

353

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_Region.,. temprana siguiente Terminador Promotor

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SIGUIENTE INICIACION

El control en la iniciaci6n utiliza unidades de transcripci6n independientes, cada una con su propio promotor y con su propio terminador, las cuales producen moleculas de RNAm independientes. Las unidades de transcripci6n no necesitan localizarse cerca una de la otra.

presentes en esta etapa). La segunda etapa consis en la transcripci6n de los genes bajo Ia direcci6n c. regulador producido en Ia primera etapa (la rna_ parte de estos genes codifican enzimas indispen _o bles para la replicaci6n del DNA del fago). La et a. ~ final consiste en Ia transcripci6n de los genes q codificanlos componentes del fago bajo la direcc' de un regulador sintetizado en la segunda etapa . El uso de estos controles sucesivos, en los cuales Cfi · conjunto de genes contiene un regulador que es necesa para !a expresi6n del siguiente conjunto, ere a una case~< en !a cual los grupos de genes son activados (y en ocas nes desactivados) en momentos determinados. Los meet utilizados para construir cada cascada fagica son ;:___ ferentes, pero los resultados son similares, como _ muestra en las secciones siguientes.

B1J

La cascada lftica es controladc por dos tipos de sucesos reguladores

Concepto principal

-Region siguiente-.

ANTITERMINACION

El control en la terminaci6n requiere unidades adyacentes, de modo que la transcripci6n pueda leer desde el primer gen hasta el interior del siguiente gen. Esto produce un solo RNAm que contiene ambos conjuntos de genes.

tardios sean expresados. Su transcripci6n en esta etapa por lo general se organiza al incrustar un gen regulador mas dentro del conjunto de genes previa (temprano retrasado o intermedio). Este regulador puede ser otro factor de antiterminaci6n (como en A.) o puede ser otro factor a (como en SPO 1). Una infecci6n lftica a menudo se divide en tres eta pas, como se muestra en la Figura 14.4. La primera etapa consiste en Ia transcripci6n de los genes tempranos por la polimerasa de RNA hospedadora (en ocasiones los reguladores son los unicos productos 3 54


• Las prote1nas reguladoras utilizadas en las cascadas de los fagos pueden facilitar la iniciaci6n en promotores nuevos (de fagos) o provocar la ultralectura de los terminadores de la transcripci6n por parte de la polimerasa hospedadora.

En cada etapa de la expresi6n fagica, uno o mas c.: los genes activos es un regulador indispensable pa;: Ia etapa siguiente. El regulador puede adquirir - ~ forma de una polimerasa nueva, de un factor a q t:: redirige Ia especificidad de la polimerasa de R -_hospedadora (vease la secci6n 11.18, Los factore s ~ pueden organizarse en cascadas) o de un factor C.: antiterminaci6n que le permite leer un nuevo grul'de genes (vease la secci6n 11.23, La antiterminacioes un even to regulador). En las dos figuras que o: mencionan a continuaci6n se compara el uso del ir_ tercambio en Ia iniciaci6n o en la terminaci6n pa r: controlar Ia expresi6n genica. Un mecanismo para el reconocimiento de prC' motores fagicos nuevas consiste en remplazar el factor a de Ia enzima hospedadora por otro factor qk redirija su especificidad en la iniciaci6n (vease ::. Figura ll. 31). Otro mecanismo consiste en sinter: zar una polimerasa de RNA fagica nueva. En ambc casas, la caracteristica fundamental que distingue "nuevo conjunto de genes es que poseen promotor,·_ diferentes a los reconocidos en un principia por la polinErasa de RNA hospedadora. La Figura 14.5 muestra qu:los dos conjuntos de transcritos son independiente< en consecuencia, la expresi6n de los genes tempra. nos puede cesar despues de que se haya produci ct ~ Ia polimerasa o el factor a nuevas.

La antiterminacion constituye un mecanismo :-:rnativo para que los fagos controlen el cambio _ genes tempranos a la siguiente etapa de expre n . El uso de Ia antiterminacion depende de una -ganizacion particular de genes. La Figura 14.6 -estra que los genes tempranos se ubican allado _ .os genes que deben expresarse despues, pero · · n separados de ellos por sitios terminadores. Si :pide la terminaci6n en estos sitios, la polimerasa hace .!tralectura y llega hasta los genes que se encuentran :. otro !ado. Por lo tanto, en la antiterminacion ·nismos promotores continuan siendo reconocidos ~ la polimerasa de RNA. Como resultado, los ge:: nuevos se expresan solo a! extender la cadena - ::\NA para formar moleculas que contienen las : ~-J encias de los genes tempranos en el extremo 5' ._: secuencias de los genes nuevos en el extremo =..os dos tipos de secuencias permanecen ligados _ r lo tanto, la expresion de los genes tempranos :-. ·nua de manera inevitable. El gen regulador que controla el cambio de la ~ resion temprana inmediata a temprana retrasacn el fago A es identificado por medio de muta es en el gen N que pueden transcribir solo a los :-es tempranos inmediatos; no avanzan mas en el _o infeccioso (vease la Figura 11.53). El mismo -: cro se observa cuando se muta el gen 28 del fago = ) 1 para impedir Ia produccion de a gP28 (vease ?igura 11.40) . Desde el pun to de vista genetico, . mecanismos de iniciacion y de antiterminacion -:vos son similares. Ambos son con troles positivos en :uales el producto de un gen temprano debe ser ere ado el fago para expresar el siguie11te conjunto de genes . cmplear los factores CJ o las protefnas de anti·:ninacion con diferentes especificidades, puede •. truirse una cascada para Ia expresion genica.

Los genom as de los fagos T4 y T7 presentan agrupaci6n funcional :1nceptos principales Los genes implicados en funciones relacionadas a menudo estan agrupados. Los fagos T4 y T7 son ejemplos de casas en los que se presentan cascadas reguladoras en las cuales la infecci6n por fagos se divide en tres periodos.

: ,enoma del fago T7 tiene tres clases de genes, 'ja uno de los cuales constituye un grupo de loci :·acentes. Como se muestra en Ia , los -- es de clase I son de tipo temprano inmediato y . expresados por la polimerasa de RNA hospeda_ra en cuanto entra el DNA del fago ala celula.

'

.. 5 genes

7 genes

13 genes

Polimerasa de RNA lnterferencia del • • • • ~ • • • • • • • • •• hospedador •

.

y

Sintesis de DNA Lisozima

.

y

Cabezas y colas Maduraci6n del DNA

EL fago T7 contiene tres clases de genes que se expresan de forma secuenciaL EL genoma mide ~38 kb.

Entre los productos de estos genes se encuentran una polimerasa de RNA fagica y las enzimas que interfieren con Ia expresion genica del hospedador. La polimerasa de RNA fagica se encarga de la expresion de los genes de clase II (los cuales intervienen sobre todo en las funciones de Ia sfntesis de DNA) y de los genes de clase Ill (los cuales tienen que ver con el ens amble de Ia partfcula fagica madura). El fago T4 tiene uno de los genomas fagicos mas largos (16 5 kb), el cual est a organizado en agrupamientos funcionales extensos de genes. La presenta su mapa genetico. Los genes esenciales estan numerados: una mutacion en cualquiera de estos loci impide que se complete el ciclo litico. Los genes no esenciales se indican con abreviaturas de tres letras. (Se definen como no esenciales conforme a las condiciones habituales de la infeccion. En realidad nose entiende porque se incluyen tantos genes no esenciales, pero al parecer confieren una ventaja selectiva en algunos de los habitat del fago T4. En genomas fagicos mas pequeiios, la mayor parte 0 todos los genes son esenciales.) Hay tres fases de expresion genica. En la se muestra un resumen de las funciones de los genes expresados en cada etapa. Los genes tempranos los transcribe la polimerasa de RNA hospedadora . Los genes intermedios tambien son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora, pero tam bien se necesitan dos productos fagicos codificados, MotA y AsiA. Los promotores intermedios carecen de secuencia de consenso en Ia posicion -30 y en cambio tienen una secuencia de union para el producto MotA. La protefna fagica es un activador que compensa la deficiencia del promotor al ayudar en la union de la polimerasa de RNA hospedadora. (Este mecanismo es similar al utilizado por el fago A, el cual se ilustra despues en Ia Figura 14.30). Los genes tempranos e intermedios representan casi todas las funciones del fago implicadas en la sfntesis de DNA, Ia modificacion de Ia estructura celular y Ia transcripcion y traduccion de los genes del fago.

14.5 Los genomas de Los fagos T4 y T7 presentan agrupaci6n funcional

355

tk cinasa de timidina denV endonuclease V ip/1, ip/11 protein as internas e lisozima 57 libra de Ia cola 7 cinasa de dNMP 3 terminador de Ia lamina 2 conclusion de Ia cabeza 50 conclusion de Ia cabeza 65 conclusion de Ia cabeza 5 conector de Ia plataforma

42 43 62 44 polimerasa de DNA, etc. 58 61 41 primasa de DNA topoisomerasa 3!; ri/A, r/18 topoisomerasa 52

38 37 36 35 34 Iibras de Ia cola

6 7 8 9 10 12 cuiia de Ia plataforma

160

3 14 16 17 waccabeza 33 RNA tardio sintetasa de dTMP ligasa de DNA 30 plataforma 54 48

120 18 lamina 19 cola

27 51 26 26 conector de Ia

20 67 68 21 22 23 24 hoc inh cabeza

plataforma

El mapa del fago T4 es circular. Hay un agrupamiento extenso de los genes que codifican los componenteo _ procesos del fago, como la replicaci6n del DNA, pero tambien hay dispersion de los genes que codifican una variedad de fu n:-· enzimaticas, entre otras. Los genes esenciales se indican con numeros. Los genes no esenciales estan representados con letr-o_~ el mapa se muestran solo algunos genes representatives del fago T4.

Los dos genes esenciales dentro de Ia categorfa de Ia "transcripcion" ejercen una funcion reguladora: sus productos son necesarios para Ia expresion de los gen es tardfos. La infeccion por el fago T4 depende de una relacion mecanica entre Ia replicacion y Ia expresion de los genes tardfos. Solo el DNA que esta siendo replicado en forma activa puede utilizarse como molde para Ia transcripcion de los genes tardfos . La conexion se genera al introducir un facto r cr nuevo y tambien al hacer otras modificaciones en Ia polimerasa de RNA hospedadora, de modo que sea activa solo con un molde de DNA en replicacion. Este vfnculo establece una correlacion entre Ia sfntesis de los componentes protefnicos del fago y el numero de genomas disponibles para el empaquetamiento .

1111

Los genes A tempranos inmediatos y tem pranos retrasados son indispensables para la lisogenia y para el ciclo litico

Conceptos principales • El fago A tiene dos genes tempranos inmediatos, N y era, los cuales son transcritos por la polimerasa de RNA hospedadora. • El gen N es necesario para expresar los genes tempranos retrasados. • Tres de los genes tempranos retrasados son reguladores. • La lisogenia necesita los genes tempranos retrasados eli y ciii.

356


• El ciclo l\tico requiere el gen tem prano inmediato c: el gen temprano retrasado Q.

Una d e las cascadas mas intrincadas se obsen·~ el fago 'A. La cascada para el desarrollo lftico de cho es bastante sencilla, con dos reguladores : controlan las etapas sucesivas del desarrollo embargo, el circuito del ciclo lftico esta entrela~..: con el circuito utilizado para establecer Ia lisogecomo se resume en la Cuando el DNA del fago 'A entra a una nue\·_:. lula h ospedadora, las rutas lftica y lisogenica in : de Ia misma manera. Ambas requieren Ia expr de los genes tempranos inmediatos y tempran : · trasados, pero desp ues divergen: el desarrollo i.:_ continua si los genes tardfos son expresados, lisogenia tiene Iugar si se establece Ia sfntesL represor. El fago 'A tiene solo dos genes temprano· mediatos, los cuales transcribe de manera indediente Ia polimerasa de RNA hospedadora: • El gen N codifica el factor de antiterrr · cion cuya accion en los sitios nut permite : proceda Ia transcripcion en los genes z. pranos retrasados (vease Ia seccion l : ~ La antiterminacion requiere sitios que independientes de los terminadores). • El gen cro tiene dos fu nciones : impic: sfntesis del represor (una accion nece. si procede el ciclo lftico) y desactiva lc. presion de los gen es tempranos inmed:" (los cuales no son necesarios despues e. ciclo lftico) .

CASCADA LiTICA

L....•........ ~ .• ~~~~~~~~~~

ETAPAS TEMPRANA E INTERMEDIA SiNTESIS DE DNA ~ Replicaci6n

17 genes esenciales 7 genes no esenciales Modificaci6n 3 genes no esenciales Z>RECURSORES DE DNA Rompimiento del DNA hospedador 2 genes esenciales 5 genes no esenciales tabolismo de nucle6tidos 3 genes esenciales 10 .genes no esenciales ::STRUCTURA CELULAR =- ciones de Ia membrana 12 genes no esenciales Lis is 2 genes no esenciales EXPRESION GENICA Traducci6n

ESTABLECIMIENTO

r

represlon

:

Tempranos inmediatos FASE TARDiA ENSAMBLE DE LA CABEZA Cabeza y cuello 2 genes esenciales 1 gen no esencial Componentes de Ia capside 7 genes esenciales 1 gen no esencial Ensamble de Ia capside 5 genes esenciales 4 genes no esenciales Empaque del DNA 3 genes esenciales 2 genes no esenciales ENSAMBLE DE LA COLA Componentes de Ia plataforma 13 genes esenciales Ensamble de Ia plataforma 5 genes esenciales 2 genes no esenciales Tubo y lamina

=

ero regulador negative. N = antiterminador

• • •• represi6n :

y Tempranos retrasados

ell, ell/ reguladores 7 genes de recombinaci6n 2 genes de replicaci6n Q antiterrninador

'ac;tivaci6n ' ' ' ' ' ·>-

•••

... ... ....·

represor e,.••

y Tardfos 10 genes de Ia cabeza 11 genes de Ia cola 2 genes de lisis

MANTENIMI ENTO LISOGENICO

PROGENIE DEL FAGO

2 genes no esenciales

4 genes esenciales

La ca scada litica del fago A esta entrelazada con el circuito de la lisogenia .

Transcripci6n 2 genes esenciales 5 genes no esenciales

Fibras de Ia cola 7 genes esenciales 1 gen no esencial

111J

La cascada litica del fa go T4 se divide en dos .~:;: las funciones tempranas se relacionan con la sintesis y

=- Jresi6n del DNA; las funciones tardias tienen que ver con o-samble de la particula.

::..os genes tempranos retrasados incluyen dos de replicaci6n (indispensables para la infec- lftica), siete genes de recombinaci6n (algunos - .icados en Ia recom binaci6n durante !a infecci6n ~"' y dos necesarios para integrar el DNA A en el osoma bacteriano para !a lisogenia) y tres ge:-eguladores. Los reguladores tienen funciones arias: • Los reguladores cii y eliI son necesarios para establecer Ia sintesis del represor. • El regulador Q es un factor de antiterminaci6n que permite que la polimerasa de RNA hospedadora transcriba los genes tardfos. ?or lo tanto, los genes tempranos retrasados _plen dos prop6sitos: algunos son necesarios para ~ elfago entre en Iisogenia y los demas tienen que =on el control del orden del ciclo lftico.

- t: S

El ciclo lftico depende de la antiterm·inaci6n

Conceptos principales • pN es un factor de antiterminaci6n que permite a la polimerasa de RNA continuar la transcripci6n despues de los extremos de los dos genes tempranos i nmediatos. • pQ es el producto de un gen temprano retrasado y es un antiterminador que permite a la polimerasa de RNA transcribir los genes tardios. • El DNA A forma un drculo despues de La infecci6n; como resultado, los genes tardios constituyen una sola unidad de transcripci6n.

Para desenredar las dos rutas, se considerara primero solo el ciclo lftico. La muestra el mapa del DNA del fago A. Un grupo de genes que intervienen en la regulaci6n es rodeado por los genes necesarios para la recombinaci6n y para la replicaci6n. Los genes que codifican los componentes estructurales del fa go estan agrupados. Todos los genes necesarios para el ciclo lftico se expresan en transcritos policistr6nicos a partir de los tres promotores. 14.7 El ciclo litico depende de La antiterminaci6n

357

"' •

• •

• .

• •

• ..

~'j;.

• •

• • • •

..

Promotores del ciclo litico Genes de Ia cabeza Genes de Ia cola Recombinaci6n Reg ulaci6n Replicaci6n Lisis

AWBCNu3DEF,F11ZUVGTHMLKIJ attintxisa~yclll N cl era cliO P QSR Indispensables para: lisogenia ell/ m'antiene oil lisogenia Y lisis N activa los tempranos retrasados c/ es un represor lisogenico lisogenia lisis cro apaga el represor lisogenia ell enciende el represor Iisis Q activa los tardios

=-

- ~

• U 14 1 El mapa del fago A, muestra el agrupamiento de funciones relacionadas. El genoma mide 48 514 bp.

A. tiene unidades de transcripci6n a Ia derecha y a Ia izquierda

'IJ1WA:U

PR

R1

- lnmediata •

•Retrasada,....

_ Unidad de transcripci6n derecha

+

Etapa temprana inmediata: solo N y era son transcritos RNAmN

cro

YJWA¥/ RNAm cro pN extiende Ia transcripci6n a los genes tempranos retrasados

® ········.·····~~·········

t

t IJ\./]\j i"""'

..

N

El fago A, tiene dos unidades de transcripci6n temprana. En la unidad "que se dirige ala izquierda", la cadena "superior" se t ra nscribe hacia la izquierda; en la unidad "que se dirige a la derecha", la cadena "inferior" se transcribe hacia la derecha. Los genes N y cro son los elementos tempranos inmediatos y estan separados de los genes tempranos retrasa dos par los t erminadores. La s\ntesi s de la prote\na N permite que la polimerasa de RNA deje atras a los terminadores t L1 a la izquierda y a los tR 1 a la derecha.

La muestra que los dos genes tempranos inmediatos, N y cro, son transcritos por Ia polimerasa de RNA hospedadora. El gen N se transcribe hacia Ia izquierda y el gen era h acia Ia derecha. Cada transcrito es terminado en el extremo del 358


gen. El regulador pN permite que la transcripci6r: continue en los genes tempranos retrasados. Es factor de antiterminaci6n que suprime el uso dt los terminadores tL y tR (vease Ia secci6n 11 .25, L . factores de terminaci6n y de antiterminaci6n interactuan con Ia polimerasa de RNA). En presenci-= del regulador pN, Ia transcripci6n continua hacia 1-" izquierda del gen N dentro de los genes de recon:binaci6n y hacia la derecha del genera dentro de I · genes de replicaci6n. El mapa que se muestra en Ia Figura 14. L muestra Ia organizaci6n del DNA A como exis:-:: en Ia partfcula del fago . No obstante, poco despu ~ de Ia infecci6n los extremos del DNA se unen par,: formar un cfrculo. La flGURA 1 .13 muestra el vedadero estado del DNA A durante Ia infecci6n. L . genes tardios estan soldados en un solo grupo, e cual contiene los genes de !isis S-R a partir del extrema derecho del DNA lineal y los genes de Ia cabeu y de Ia cola A -J a partir del extremo izquierdo. Los genes tardfos se expresan como una so:.o. unidad de transcripci6n, comenzando desde un pr . motor PR, que se encuentra entre Q y S. El promot .· tardfo se utiliza de manera constitutiva. Sin emba:go, en ausencia del producto del gen Q (el cual es .: ultimo gen hacia Ia derecha de Ia unidad temprar.; retrasada), la transcripci6n tardfa termina en un > tio t R3 • El transcrito que surge de este episodio c: terminaci6n tiene una longitud de 194 bases; se :-:: conoce como RNA 6S. Cuando pQ queda dispOI:.:.ble, suprime la terminaci6n en tR 3 y el RNA 6S _ extiende, lo cual da como resultado Ia expresi6n G.~ los genes tardfos. La transcripci6n de los genes tardios no parec terminar en un sitio especffico, sino que continc por todos los gen es tardfos hasta la region que -= encuentra despues. On episodio similar tiene lug.: en la transcripci6n temprana retrasada hacia la i;:quierda, la cual continua mas alla de las funcionc-

........

Ell

Etapa y actividad

La lisogenia la mantiene una proteina represora

Conceptos principales Temprana

• Los mutantes con mutaciones en el gen ci son incapaces de mantener la lisogenia. • El gen ci codifica una prote1na represora que actua en los operadores ol y OR para bloquear la transcripci6n de los genes tempranos inmediatos. • Los genes tempranos inmediatos activan una cascada reguladora; como resultado, su represi6n impide que el ciclo lltico prosiga.

La polimerasa de RNA hospedadora transcribe N y cro desde PL y PR

Temprana retrasada pN permite Ia transcripci6n desde los mismos promotores para continuar despues deNy de cro

Tardia La transcripci6n inicia en PR' (entre Q y S) y pO le permite continuar por todos los genes tardfos

I

El DNA A forma un circulo durante la infecci6n,

~ :3l manera que el agrupamiento de genes tard\os esta intac~n una unidad de transcripci6n.

: :-ecombinaci6n. Es probable que la transcripci6n _ . cada direcci6n termine antes de que las polime-:.sas choquen entre sf.

AI analizar Ia cascada Iftica del fago A, se ve que el programa completo es puesto en movimiento por Ia iniciaci6n de Ia transcripci6n en los dos promotores PLy PR para los genes tempranos inmediatos N y cro. El fago A utiliza Ia antiterminaci6n para proceder a Ia siguiente etapa de expresi6n (temprana retrasada); por lo tanto, los mismos dos promotores siguen utilizandose durante el periodo temprano. El mapa expandido de Ia region reguladora que se ilustra en Ia muestra que los promotares PLy PR se encuentran a ambos !ados del gen cl. A cada promotor se asocia un operador (OL y OR) al cual se une Ia protefna represora para impedir que Ia polimerasa de RNA inicie la transcripci6n. La secuencia de cada operador se superpone a! promotor que controla y debido a que esto ocurre con tanta frecuencia estas secuencias se describen como las regiones de control PJ OL y PRIOR. Como resultado de la naturaleza secuencial de Ia cascada lftica, las regiones de control constituyen un sitio de presion en el cual puede controlarse Ia entrada a todo el ciclo. Al denegar el de la polimerasa de RNA a estos promotores, una protefna represora impide que el genoma del fago entre al ciclo litico. El represor funciona de Ia misma forma que los represores de los operones bacterianos: se une a operadores especfficos.

tR,

ell/

N

Regulador Antiterminador positivo

Represor

Antirrepresor

Elementos de actuaci6n en cis Genes

Regulador Funciones positivo

+--Region de inmunidad ..__......

F en

La region reguladora de A contiene un agrupamiento de funciones de actuaci6n de actuaci6n en cis.

trans y elementos

14.8 La lisogenia la mantiene una prote\n a represora

359

Los fagos A silvestres pueden distinguirse de los mutantes virulentos por sus tipos de placas. Reproducida de Virology, val. 1, Kariser, D., pp. 423-443. Copyright 1955. Con autorizaci6n de Elsevier. Fotografias cortesia de Dale Kaiser, Stanford University School of Medicine.

La proteina represora es codificada por el gen cl. Los fagos con mutaciones en este gen no pueden

mantener la lisogenia, pero siempre entran al ciclo litico. Desde el aislamiento original de la proteina represora, su descripci6n ha demostrado como esta mantiene el estado lisogenico y proporciona inmunidad a un lis6geno contra infecciones por nuevos genomas del fago 'A. Cuando se infecta un cultivo bacteriano con un fago, las celulas se lisan y generan regiones que pueden observarse en una caja de cultivo como areas diminutas de aclaramiento denominadas placas. En los fagos silvestres las placas son turbias o estan nubladas porque contienen algunas celulas que han establecido la lisogenia en vez de ser lisadas. El efecto de una mutacion cl es impedir la lisogenia, de modo que las placas solo contienen celulas lisadas. Como resultado, una infeccion de estas caracterfsticas genera solo placas claras, y tres genes (cl, ell yell!) se nombraron por su implicacion en este fenotipo. La compara las placas silvestres y mutantes. El gen cl se transcribe desde el promotor PRM que se encuentra en su extrema derecho. (El subindice "RM" significa repressor maintenance, mantenimiento del represor.) La transcripcion termina en el extrema izquierdo del gen. El RNAm comienza en el codon de iniciacion AUG; debido ala ausencia del sitio de union de ribosomas habitual, el RNAm se traduce en forma ineficiente y produce un nivel muy bajo de proteina represora.

111J

El represor y sus operadores definen la region de in munidad


• Numerosos fagos de tipo A tienen diferentes regiones de inmunidad. • Un fago lisogenico confiere inmunidad contra infecciones posteriores por cualquier otro fago con la misma region de inmunidad.

360


La presencia del represor explica el fenomeno de la inmunidad. Si un segundo DNA de fago lc entra a. la celula lisogenica, la proteina represora sintetizado. a partir del genoma del profago residente de inmediato se unira al 0 1 y al OR en el genoma nuevo. Esto impide que el segundo fago entre al ciclo litico. Los operadores se identificaron en un principio como dianas para la accion represora por medio de mutaciones virulentas (/..vir). Estas mutaciones impiden que el represor se una al 0 1 o al OR, con e: resultado de que el fago entra de manera inevitable a la ruta litica cuando infecta a una nueva bacteric hospedadora. N otese que los mutantes 'A vir puedeL crecer en lisogenos debido a que las mutaciones virulentas en el 0 1 y en el OR permiten que el fag entrante ignore al represor residente y, por lo tanto entre al ciclo litico. Las mutaciones virulentas en lcr' fagos son equivalentes a las mutaciones constitutivas del operador en los operones bacterianos. El profago es inducido a entrar al ciclo litic . cuando se rompe el circuito lisogenico. Esto tieoc Iugar cuando el represor es desactivado (vease lz seccion 14.1 0, La forma de union a! DNA del represor es un dimero). La a us en cia de rep res or permite que la polimerasa de RNA se una a! P1 y a! PR, COL lo que se inicia el ciclo litico como se muestra en lc. parte inferior de Ia Figura 14.26. La naturaleza autogena del circuito de mantenimiento del represor crea una respuesta sensible La presencia de un represor es indispensable para s L propia sintesis; por lo tanto, Ia expresion del gen .:. se detiene en cuanto se destruye el represor exister_te. En consecuencia, nose sintetiza ningun repres o ~ para remplazar a las moleculas que han sido daiiadas. Esto le permite al ciclo litico comenzar sin inte ferencia del circuito que mantiene Ia lisogenia. La region que incluye los operadores izquierd y derecho, el gen cl y el gen cro determina Ia inmt;nidad del fago. Cualquier fago que posea esta regi 6;~ tendra el mismo tipo de inmunidad debido a que especifica a la protefna represora y a los sitios en los cual.c actua el represor. En consecuencia, a esta se le denon~ na region inmunitaria (como se seiiala en la Figu · ra 14.14). Cada uno de los cuatro fagos lambdoides 80, 21, 434 y 'A tiene una region inmunitaria unica. Cuando se indica que un fago lisogenico confiert inmunidad contra otro fago del mismo tipo, lo qucse quiere decir con mayor precision es que la inmhnidad actua frente a cualquier otro fago que ten g::: Ia misma region inmunitaria (a pesar de que hay; diferencias en otras regiones).

La forma de union al DNA del represor es un d1 mero 1

:Unceptos principales Un monomero represor tiene dos dominies distintos. El dominic terminal N contiene el sitio de union al DNA. El dominic terminal C se dimeriza. _a union al operador requiere La forma dimerica Jara que los dos dominies de union al DNA puedan establecer o con el operador de manera simultanea. l a division del represor entre los dos dominies reduce .a afinidad par el operador e induce un ciclo l\tico.

..2

subunidad represora es un polipeptido de 27 kD -:-: dos dominios distintos, los cuales se ilustran en

u • El dominio terminal N, que abarca del residua 1 al 92, proporciona el sitio de union al operador. • El dominio terminal C, formado por los residuos 132-236, se encarga de la formacion de dimeros. Los dos dominios estan unidos por un corrector .: +0 residuos. Cuando el represor es digerido por ..::a proteasa, cada dominio es liberado como un _gmento separado . Cada dominio es capaz de ejercer su funcion con : ependencia del otro. El fragmento terminal C pue. : rmar oligomeros. El fragmento terminal N puede : .rse a los operadores, aunque con menor afinidad _:: el represor intacto. Por lo tanto, la informacion - -~ pensable para establecer o especffico con ::INA esta contenida dentro del dominio terminal _ero la eficiencia del proceso mejora con la adhe .. del dominio terminal C. La estructura dim erica del represor es crucial en el ··1tenimiento de !a lisogenia. La induccion de un :ago lisogenico a entrar al ciclo lftico la provoca i!vision de la subunidad represora ubicada en la :.,. ·on conectora, localiza da entre los residuos lll _: 3. (Esta es la contra parte del cambio alosterico :a conformaci6n que ocurre cuando una peque.:. :nolecula inductora desactiva al represor de un -::ron bacteria no, una capacidad que no tiene el - ::-esor lisogenico. ) La induccion ocurre bajo cier~o ndiciones adversas, como la exposicion de las ~ e rias lisogenicas a radiacion UV, lo que conduce o desactivacion proteolftica del represor. En el estado intacto, la dimerizacion de los do- ios terminales C garantiza que cuando el re:-,or se une al DNA, sus dos dominios terminales en de manera simultanea. N6tese, sin :>argo, que la division Iibera los dominios ter-

.

c 236 132

Dimerizacion

''

c

c

Conector

92 11

'.

Union al DNA

N

N

N

Las regiones terminal N y terminal C del represor forman dominies independientes. Los dominies terminales C se asocian para formar d1meros; los dominies terminates N se une al DNA .

Los monomeros se encuentran en equilibrio con los dfmeros, los cuales se unen al DNA LISOG ENIA

La division de los monomeros altera el equilibria, por lo que los dfmeros se disocian INDUCCION

·=

'. '.

A

Los d1meros represores se unen al operador. La afinidad de los dominies terminates N par el DNA es controlada par la dimerizacion de los dominies terminates C.

minales C de los domini os terminales N. Como se ilustra en la · , esto significa que los dominios terminales N ya no pueden formar dfmeros, lo cual altera el equilibria entre monomeros y dimeros. Como resultado, el represor se disocia del DNA, lo cual permite qu e inicie la infeccion Utica. (Otro para metro relevante es la perdida de efectos cooperativos entre los dimeros adyacentes.) 14.10 La forma de union al DNA del represor es un d1mero

361

El balance entre la lisogenia y el ciclo lltico depende de la concentracion de moleculas de represor. El represor intacto esta presente en una celula lisogenica a una concentracion suficiente para garantizar que los operadores esten ocupados. No obstante, si el represor es divido, esta concentracion sera inadecuada, debido a Ia baja afinidad del domino terminal N (separado) por el operador. Una concentracion muy alta de represor hara imposible inducir el ciclo litico de esta manera; un nivel muy bajo, por supuesto, imposibilitara el mantenimiento de la lisogenia.

1111J El represor utiliza un elemento helice-giro-helice para umrse al DNA Conceptos principales • Cada region de union al DNA localizada en el represor a a una mitad de sitio en el DNA. • El sitio de union al DNA del represor incluye dos regiones cortas de helice a que embonan en giros sucesivos del surco mayor del DNA. • Un sitio de union al DNA es una secuencia (en parte) palindr6mica de 17 bp.

TACCTCTGGCGGTGATA ATGGAGACCGCCACTAT ~u El operador es una secuencia de 17 bp que tiene un eje de simetria en el par de bases central. Cada mitad de sitio se marca en color azul clara. Los pares de bases que son identicos en cada mitad del operador est<3n coloreados en azul oscuro.

Un dfmero represor es Ia unidad que se une al DR-. Reconoce una secuencia de 17 bp que exhibe s:. metria parcial con respecto a un eje formado p · el par de bases central. La 1 .· muestra c ejemplo de un sitio de union. Las secuencias que _: encuentran a ambos !ados del par de bases centr en ocasiones se denominan "mitades de sitio". Ca = region terminal N individual a a una mira.:. de sitio. Numerosas protefnas de union a! DNA qt:: regulan Ia transcripcion bacteriana comparten c modo similar de sujecion del DNA, en el cual .:dominio activo contiene dos regiones cortas de helice ex. que hacen o con el DNA. (Algun factores de transcripcion de las celulas eucarioticG. utilizan un elemento similar; vease la seccion 25.1Los homeodominos se unen a dianas relacionad:.. en el DNA. ) El dominio terminal N del represor A contier: numerosos fragmentos de helice ex., los cuales esta organizados como se ilustra en el diagrama de _; . Dos de las regiones helicoidales se e!' cargan de la union a! DNA. El modelo helice-girohelice para el o con el DNA se ilustra en I . En cada monomero, la helice ex. 3 es-...:. formada por nueve aminoacidos, cada uno de ! cuales forma un angulo con Ia region helice ex. 2, siete aminoacidos, que Ia precede. En el dfmero, :;. dos regiones de helice ex. yuxtapuestas estan sepa:-=das una distancia de 34 A, lo cualles permite calY~ en surcos mayores sucesivos del DNA. Las regiou · de helice 2 forman un angulo que las coloca a tr.:ves del surco. La union simetrica del dfmero al si· significa que cada dominio terminal N del dfm ~ hace o con un conjunto similar de bases t:su mitad de sitio.

Se desconoce Ia estructura del dominio terminal C

El domino terminal N esta formado por cinco helices a

Mitad de sitio

I . 4 Los dominios terminales N de los represo res de A. contienen cinco fragmentos de helice a; las helices 2 y 3 se unen al DNA.

362

CAPiTULO 14 Estrategias de los fagos

Mitad de sitio

1 En el modelo de dos helices para la unio- DNA, la helice 3 de cada mon6mero yace en el surco mayo· = la misma cara del DNA, y la helice 2 atraviesa el surco.

La helice de reconocimiento determina la especificidad por el DNA 1 :'Jncepto principal • La secuencia de aminoacidos de la helice de reconocimiento hace os con bases particulares en la secuencia operadora a la cual reconoce.

~::-

formas reladonadas de los motivos helicoidales _mpleados en el elemento helice-giro-helice del ~-::>resor Ase encuentran en numerosas protefnas de ; 'n a! DNA, como Ia protefna receptora de AMP :.:.ico (cyclic AMP receptor protein, CRP), el represor · muchos otros receptores de los fagos . AI com~::ar Ia capacidad de union al DNA de estas protef, >. se pueden definir las funciones de cada he lice: • Los os entre Ia helice 3 y el DNA se basan en puentes de hidrogeno que se realizan entre las cadenas de aminoacidos y las posiciones expuestas de los pares de bases. Esta helice se encarga de reconocer la secuencia especffica de DNA diana y, por lo tanto, tambien se le conoce como helice de reconoci.Iniento. • Los os que se establecen entre Ia helice 2 y el DNA adquieren la forma de puentes de hidrogeno que se conectan al esqueleto de fosfato. Estas interacciones son necesarias para la union pero no controlan Ia especificidad del reconocimiento de la diana. Ademas de estos os, una gran parte de toda la energfa de la interaccion con el DNA la proporcionan las interacciones ionicas con el esqueleto de fosfato. (.Que sucede si se manipula Ia secuencia coclifi_j ra para construir una nueva protefna al susti- : Ia helice de reconocimiento en un represor con _ ,ecuencia corresp ondiente de un represor que - ::elacione de cerca? La especificad de Ia protefna ~- :ida es Ia de su nueva helice de reconocimiento.

_- :ecuencia de aminoacidos de este tipo de region de:ina las especificidades de secuencia de las proteinas -:·:iduales y puede actuar en conjunto con el resto de la ·?Jza polipeptfdica. La FIGU , muestra los detalles de la union J NA de dos protefnas que se unen a secuencias ; J NA similares. El represor A y la protefna Cro tie~-.. una organizacion similar en el elemento helice-helice, aunque sus especificidades individuales : el DNA no son identicas: • Cada protefna utiliza interacciones similares entre los aminoacidos hidrofobos para mantener las relaciones entre la helice 2 y

Ia helice 3: el represor tiene una conexion Ala-Val y Cro tiene una asociacion Ala-lie. • Los aminoacidos que se encuentran en Ia helice 3 del represor forman os con bases especfficas en el operador. Tres aminoacidos localizados en el represor reconocen tres bases del DNA; los aminoacidos que se encuentran en estas posiciones, y tambien en otras posiciones de Ia protefna Cro, reconocen cinco (o quiza seis) bases en el DNA. Otros dos aminoacidos que participan en el reconocimiento espedfico son identicos en el represor yen Cro (Gin y Ser en el extremo N de la helice), en tanto que los otros os son diferentes (Ala en el represor frente a Lis y el Asn adicional en Cro). Ademas, una Treo en Ia helice 2 de Cro entra en o directo con el DNA. Las interacciones que se muestran en Ia Figura 14.21 representan Ia u nion a Ia secuencia de DNA que cada protefna reconoce con mayor firmeza . Las secuencias que se muestran en Ia parte inferior de Ia figura con los puntos de o en color azul difi eren en tres de los nueve pares de bases. El uso de os superpuestos, pero no identicos, entre los aminoacidos y las bases muestra como h elices de reconocimiento relacionadas reconocen secuencias de DNA relacionadas. Esto le permite al represor y a la protefna Cro reconocer el mismo conjunto de secuencias, pero con afinidades relativas diferentes por miernbros determinados del grupo . Las bases adas por Ia helice 3 del represor o de Cro se encuentran en una cara del DNA, como puede observarse por las posiciones indicadas en el cliagrarna helicoidal de Ia Figura 14.21. N otese, sin embargo, que el represor h ace un o mas

CRO-OA3 0 '1,.

Y-e''G

.

0-~ "\{cO<:>\(' ,.~

0 -\,.,o~ Leu GQ

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Gli

t

Helice 3

Helice 3

TATCTCTT ATAGGGAAC

... . Dos prote\nas que utilizan la estructura de doble helice para establecer o con el DNA reconocen a los operadores /... con afinidades determinadas par la secuencia de aminoacidos de la helice 3.

14.12 La helice de reconocimiento determina la especificidad par el DNA

363

• La afinidad es 10 veces mayor por OLl y por ORl que por otros operadores, por lo que la union sucede primero en ellos. • La colaboracion permite al represor unirse a los sitios 01/02 en concentraciones mas bajas.

Una vista posterior muestra que el volumen del represor entra en o con una cara del DNA, pero sus brazos terminates N rodean el DNA y alcanzan la otra cara.

con Ia otra cara del DNA. AI retirar los ultimos seis aminoacidos terminales N (los cuales sobresalen de la helice l) se eliminan algunos de los os. Esta observacion fundamenta la idea de que el volumen del dominio terminal N entra en o con una cara del DNA, rnientras que los ultimos seis arninoacidos terminales N forman un "brazo" que se extiende alrededor del DNA porIa parte posterior. La muestra una vista desde la parte posterior. Los residuos de lisina que se encuentran en el brazo hacen o con los residuos de G localizados en el surco mayor y tambien con el esqueleto de fosfato. La interaccion entre el brazo y el DNA contribuye de manera importante ala union a! DNA; la afinidad de un represor sin brazo por el DNA disminuye -1 000 veces. Las bases que no son adas en forma directa por la proteina represora pueden tener un efecto importante en la union. El represor del fago 434 se une a! DNA por medio de un elemento helicegiro-helice y la estructura cristalina muestra que las helices 3 estan colocadas en cada mitad de sitio para ar a los cinco pares de bases externos, pero no a los dos internos. Sin embargo, los operadores con pares de bas es A-T en las posiciones internas se unen al represor 434 con mayor fuerza que los operadores con pares de bases G-C en las mismas posiciones. La razon es que Ia union del represor 434 tuerce ligeramente a! DNA en el centro del operadar, lo cual amplfa el angulo entre las dos mitades de sitio del DNA -3°. Es probable que esto se requiera para permitir que cada monomero del clfmero represor haga os optimos con el DNA. Los pares de bases A-T permiten que esta torsion suceda con mayor facilidad que los pares G-C, lo cual afecta !a afinidad del operador por el represor.

EE

Los dimeros represores se une n en colaboraci6n al operador

Conceptos principales • La union del represor a un operador incrementa la afinidad de union de un segundo d1mero represor al operador adyacente.

364


Cada operador contiene tres sitios de union a! reprt sor. Como puede observarse en !a 3, lc seis sitios de union al represor individuales no s idtnticos, pero todos se adaptan a una secuencia c: consenso. Los sitios de union localizados en ca C:: operador estan separados por espaciadores de 3 : 7 bp ricos en pares de bases A-T. Los sitios de cad: operador estan numerados, de tal manera que el C: esta formado por una serie de sitios de union 0 R · . OR2-0R3, rnientras que el 0 1 esta formado por laser. 0 1 l-0 1 2-01 3. En cada caso, el sitio l se encuent:.: mas cerca del pun to de inicio de la transcripcion en promotor y los sitios 2 y 3 se encuentran mas lejos e:sentido ascendente. De acuerdo con la triplicacion de los sitios ·: union en cada operador <..como decide el represor edonde iniciar la union? En cada operador, el sitio : tiene mayor afinidad (unas 10 veces superior) q : los otros sitios por el represor. Por lo tanto, el reprcsor siempre se une primero al 0 1 l y al OR l.

El represor 'A se um a sitios subsiguientes dentro .:. cada operador de manera colaboradora. La presencia un dfmero en el sitio l incrementa en gran medi ~ la afinidad con la cual un segundo dimero pue unirse a! sitio 2. Cuando los sitios 1 y 2 estan ocupc.. dos, esta interaccion nose extiende a! sitio 3. En lc. concentraciones habituales de represor observaden cada lisogeno, los sitios 1 y 2 de cada opera dt.estan ocupados, pero el sitio 3 esta libre. Si el sitio l es desactivado (debido a una m ur·. cion), el represor se une con fines de colaboraci ':: a los sitios 2 y 3. Es decir, la union al sitio 2 ayuda ' otro dfmero a unirse al sitio 3. Esta interaccion oc~ rre de manera directa entre los dfmeros represor y no por un cambia de conformacion en el DN.-. El dominio terminal C se encarga tanto de la int > accion colaboradora entre los dimeros, como de ' formacion del dfmero entre subunidades. La L muestra que involucra a ambas subunidad · de cada dfmero, es decir, cada subunidad contac: ' a su contraparte en el otro dfmero y se forma U L estructura tetramerica. Una consecuencia de !a union colaboradora el incremento d e la afinidad efectiva del repres : por el operador en concentraciones fisiologicas. Es: permite Ia presencia de una concentraci6n men de represor para lograr !a ocupacion del operad : Esta es una consideracion importante en un siste n-~ en el cualla liberaci6n de !a represion tiene conse-

I

I

•

;

e

....,_sitio de union de Ia polimerasa de RNA PRM - - : : :eina represora -~

- reo Ser Met NH 2 CACGAGUAppp m de cl

~GTGCTCATACGTTAAATCTATCACCGCAAGGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGACTAnnTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC

-AAACACGAGTATGCAATTTAGATAGTGGCGTTCCCTATTTATAGATTGTGGCACGCACAACTGATAAAATGGAGACCGCCACTATTACCAACG

-

pppAUG RNAm de cro Sitio de union de Ia polimerasa de RNA PR ---..

CAGATAACCATCTGCGGTGATA AATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATA CTGAGCACATCA GTCTATTGGTAGACGCCACTAT TTA ATAGAGACCGCCACAACTGTATTTATGGTGfioCC0CCACTATGACTCGTGTAGT pppAUCA RNAm de N

-

Sitio de union de Ia polimerasa de RNA

PL~

Cada operador contiene tres sitios de union al represor y se superpone al promotor al cual se une la polimerasa de -- Se ha invertido la orientacion de OL con respecto a lo habitual para facili tar la co mparacion con OR.

111

El represor en OR2 interactua con la polimerasa de RNA en el P RM

Conceptos principales • La region de union al DNA del represor en OR2 a a la polimerasa de RNA y estabiliza su union al PRW • Esta es la base del control autogeno del mantenimie nto del represor. Cuando los dos dimeros represores de A, se unen :olaboracion, cada una de las subunidades de un dimero _::: o con una subunidad del otro dimero.

:-ncias irreversibles . En un operon que coclifica ..=mas metab6licas, Ia imposibilidad de reprimir - 6lo permitira Ia sfntesis innecesaria de enzimas. embargo, Ia incapacidad de reprimir al profago rovocara Ia inducci6n del fago y Ia !isis de Ia .. Ia. Por las secuencias ilustradas en Ia Figura 14 .23, :' ede observar que 0 1 l y OR l se encuentran mas ..enos en el centro de los sitios de union de Ia .rmerasa de RNA de P1 y de PR, respectivamente. ~ lo tanto, Ia ocupaci6n de 0 1 1- 0 12 y de ORI-OR2 _uea en terminos fisicos el de Ia poli me - de RNA a los promotores correspondientes.

En Ia transcripcion de cl, se observa una relacion diferente entre OR y el promotor PRM' El sitio de union de Ia polimerasa de RNA es adyacente a OR2. Esto explica Ia manera en Ia que el represor regula de forma aut6gena su propia sfntesis. Cuando dos dfmeros estan unidos a OR l-OR2, el dfmero que se encuentra en OR2 interactua con Ia polimerasa de RNA (vease Ia Figura 14.26 de Ia seccion 14.15, El represor mantiene un circuito autogeno). Este efecto reside en el dominio amino termina l del represor. Las mutaciones que eliminan el control positivo se mapean en el gen cl. Los rniembros de una clase interesante de mutantes mantienen la capacidad de unirse al operador para reprimir Ia transcripcion, pero no pueden estimular a Ia polimerasa de RNA para que transcriba desde PRM' Se mapean entre un

14.14 El represor en OR2 interact ua con la polimerasa de RNA en el PR1•1

365

Las mutaciones de control positivo identifican una region minuscula de la helice 2 que interactua de manera directa con la polimerasa de RNA.

...................

................... ..

LISOGENIA

dimero represor

t mon6mero represor

dio de una interaccion electrostatica con una rea· basica en Ia polimerasa de RNA. La ubicacion de estas "mutaciones de com :positivo" en el represor se indica en Ia URA 14 Se encuentran en un sitio localizado en el repre ~ que esta cerca de un grupo fosfato del DNA, el c tambien esta cerca de la polimerasa de RNA. P lo tanto, el grupo de aminoacidos del represor ~ _participa en el control positivo se encuentra en c posicion que le permite entrar en o co _ polimerasa. El principia importante es que las in:_ acciones proteina-proteina pueden liberar energia qz~< aprovecha para ayudar a iniciar La transcripci6n. El sitio diana de la polimerasa de RNA que co tacta el represor esta en Ia subunidad cr70, den:__de la region que hace o con la region - : : del promotor. La interaccion entre el represor \polimerasa es indispensable para que Ia polimer.:: efectue la transicion de un complejo cerrado a __ complejo abierto (vease tambien Ia Figura 14.3 ! Esto explica la manera como los niveles bajos _ represor regulan en forma positiva su propia sin·c sis. Siempre que haya suficiente represor para ller:.:.. a OR2, la polimerasa de RNA continuara transc biendo al gen cl de PRM '

E ~~

~ OJPL

·

....__.....~,......

El represor impide que Ia polimerasa de RNA se una a PL RNAmdeN

Conceptos principales OR/PR La polimerasa de El represor impide RNA se une a PAM que Ia polimerasa de y transcribe c/ RNA se una aPR CICLO LfTICO

t

La polimerasa de RNA no puede iniciar en PAM en ausencia del repre sor

-

La polimerasa de RNA inicia en PR

La polimerasa de RNA inicia en PL RNAm de cro

La lisogenia se mantiene por media de un circuito autogeno (seccion superior). Si este circuito es interrumpido, el ciclo litico comienza (seccion inferior).

pequefio grupo de aminoacidos que se localizan en el exterior de Ia helice 2 o en la vuelta que se encuentra entre la helice 2 y Ia helice 3. Las mutaciones reducen Ia carga negativa de la region; por el contrario, las mutaciones que incrementan la carga negativa intensifican la activacion de la polimerasa de RNA. Esto sugiere que el grupo de aminoacidos constituye una "zona acida" que funciona por me366

El represor mantiene un circuito aut6geno


• La union del represor a Ol bloquea la transcripcion de _ gen N del PL. • La union del represor a ORbloquea la transcripcion de cro, pero es indispensable para la transcripcion de cl. • Por lo tanto, la union del represor al operador bloque: la entrada al ciclo litico al tiempo que facilita su pro ~-;_ s\ntesis.

El represor se une de manera independiente a : dos operadores. Tiene una sola funcion en 0 1 2, t tiene funciones dobles en OR. Estas se ilustran ·n region superior de la 1 En 0 1 , el rep res or tiene el mismo tipo de efe :: que se analizo en muchos otros sistemas: imp : ~ que Ia polimerasa de RNA inicie Ia transcripc: en PL. Esto detiene Ia expresion del gen N P u tilizado en todos los episodios de transcripci-On los genes tempranos ala izquierda; como resulta esta accion imp ide la expresion de toda Ia unida - · transcripcion temprana a la izquierda . Por lo tm~ el ciclo lftico es bloqueado antes de que pueda prosegzc las fases posteriores a la etapa temprana_ En OR l , la union del represor impide el uso _ PR. De este modo, cro y los otros genes tempra_:--_ a Ia derecha no pueden ser expresados. (Mas a

se analizara porque es importante impedir la de cro durante el mantenimiento de la ; cnia.) :l in embargo, la presencia del represor en OR ..::: otro efecto. El promotor de la sintesis del rer, PRM' es adyacente al operador OR a la dere:.. Resulta que la polimerasa de RNA puede iniciar :.?nera eficiente en PRM solo cuando el represor esta _:.·_, a OR. El represor actua como una proteina o ~ladora positiva necesaria para la transcripcion · gen ci (vease la seccion 14.14, El represor en ~ !nteractua con la polimerasa de RNA en el PRM). -:vresor es el producto del gen cl; por lo tanto, esta _,...._w;i6n crea un circuito aut6geno positivo, en el cual ~-:sencia del represor es indispensable para respaldar . -,•pia sfntesis continua. ::.a naturaleza de este circuito de control explica ~aracterfsticas biologicas de la existencia lisoge.::. La lisogenia es estable debido a que el circuito · ~ontrol garantiza que siempre que el nivel de ~e sor sea adecuado, habra una expresion contio del gen cl. El resultado es que OL y OR perma. .:.::n ocupados de manera indefinida. Al reprimir ..2scada lftica completa, esta accion mantiene el :ilgo en su estado inerte. _.z

~e sion

Las ·interacciones de colaboraci6n incrementan la sensibilidad de la regulaci6n ::.:--.ceptos principales

. os. d1meros represores unidos a OLl y a OL2 interactuan : :m los d1meros unidos a ORl y a OR2 para formar : ctameros. formaci6n del octamero aproxima OL3 a OR3, y permite ' teracciones entre d1meros unidos a dichas regiones. :Stas interacciones de colaboraci6n incrementan la ;ensibilidad de la regulaci6n. 3

. !.nteracciones de colaboracion entre los dfmeros ·- :esores tienen lugar en el operador izquierdo y el operador derecho, por lo que su condicion -::nal cuando estan ocupados por el represor es · - :r dfmeros en los sitios de union 1 y 2. En efec:ada operador tiene un tetramero de represor. - embargo, este no es el fin de la historia. Los tetrameros interactuan entre sf para formar un ~mero. La interaccion ocurre entre los dominios -:-:~.inales C, los cuales pueden formar un octamero -.-.o una estructura cristalina. La FIGU muestra la d.istribucion de los re:"'>Ores en los sitios operadores que estan ocupados . :.n lisogeno. Los represores estan ocupando OL 1, OR1 y OR2, y el represor ubicado en el ultimo de

, WW.-..:r."""'.......'-' . ...-.- OR3 OR2 OR1 ~ PAM

En el estado lisogenico, los represores unidos a OL 1 y a OL2 interactuan con aquellos unidos a ORl y a OR2. La polimerasa de RNA se une a PRM (el cual se superpone a OR3) e interactua con el represor unido a OR2 .

Estado del gen c/: apagado

OL3 y OR3 se aproximan por la formaci6n del octamero represor y un incremento de la concentraci6n de represor permite que los dimeros se unan a estos sitios e interactuen.

estos sitios esta interactuando con la polimerasa de RNA, la cual esta iniciando la transcripcion en PRM. La interaccion entre los dos operadores tiene multiples consecuencias. Estabiliza la union del represor, lo que permite al represor ocupar operadores en concentraciones mas bajas. La union a OR2 estabiliza la union de la polimerasa de RNA en PRM' lo cual permite que concentraciones bajas de represor estimulen de forma autogena su propia produccion. El DNA localizado entre los sitios OL y OR (es decir, el gen cl) forma un lazo extenso, el cual se mantiene unido por el octamero represor. El octamero aproxima a los sitios OL3 y OR3. En consecuencia, dos dfmeros represores pueden unirse a estos sitios e interactuar entre sL como se muestra en la l . La ocupacion de OR3 impide que la polimerasa de RNA se una a PRM y, por lo tanto, desactiva la expresion del represor. Esto muestra de que manera la expresion del gen ci se hace en extrema sensible a la concentracion del represor. En las concentraciones mas bajas, forma el octamero y activa a !a polimerasa de RNA

14.16 Las interacciones de colaboraci6n incrementan la sensibilidad de la regulaci6n

367

en una regula cion autogena positiva. Un incremen to de !a concentracion permite !a union a 0 1 3 y a OR3 y desactiva la transcripcion en una regulacion autogena negativa. El umbra! de los niveles de represor necesarios para cada uno de estos episodios se reduce por las interacciones de colaboracion, lo cual hace a todo el sistema regulador m u ch o m as sensible. Cualquier cambio en el nivel de represor desencadena !a respuesta reguladora apropiada para restaurar el nivellisogenico. El nivel global de represor se ha reducido (unas tres veces con respecto al nivel que serfa necesario si no hubiera efectos de colaboraci6n) y como resultado hay menos represor que tiene que ser eliminado cuando se hace necesario para inducir al fago. Esto incrementa Ia eficiencia de !a induccion.

Los genes cii y ciii son necesarios para establecer la lisogenia Conceptos principales • Los productos de los genes tempranos retrasados ell y cUI son indispensables para que la polimerasa de RNA inicie la transcripci6n en el promotor PRE' • ell actua de manera directa en el promotor y clli protege a cii de la degradaci6n. • La transcri pci6n a partir del PRE provoca la s\ntesis del represor e incluso bloquea la transcripci6n del gen era.

El circuito de control para mantener la lisogenia plantea una paradoja. La presencia de la protefna represora es indispensable para su propia s{ntesis. Esto explica como se perpetua la condicion lisogenica. Ahora bien, (,como comienza la sfntesis del represor en primer Iugar? Cuando un DNA A entra a una nueva celula h ospedadora, Ia polimerasa de RNA es incapa z de

J

t

t

Protefna Cll

La s\ ntesis del represor se est ablece par la acci6 n de la prote\na cii y de la polimerasa de RNA en PRE para iniciar la tra nscripci6n que se extiende desde la cadena antisentido de era hasta el gen cl.

368


transcribir el gen cl debido a que n o hay represor que le ayude a unirse a PRM ' Sin embargo, esta misma ausencia de represor significa que P1 y PR estan disponibles. Por lo tanto, el ptimer suceso despues de que el DNA A infecta una bacteria tiene Iugar cuando los genes N y cro se transcriben. Despues, pN permit que se extienda Ia transcripci6n. Esto permite que ciii (y otros genes) sean transcritos en ellado izquierdo, mientras que cii (y otros genes) son transcritos en ellado derecho (vease !a Figura 14.14). Los genes cii y ciii comparten con c1 la propiedad de que las mutaciones en ellos dan Iugar a placas claras. No obstante, hay una diferencia. Los mutantes cl n o pueden establecer ni mantener Ia lisogenia. Los mutantes cii y c11I tienen ciertas dificultades para establecer la lisogenia, pero una vez que se ha establecido, son capaces de mantenerla por medio del circuito aut6geno cl. Esto implica que los genes cii y c111 son reguladares positivos cuyos productos son necesarios para un sistema alternative para la sfntesis de represor. El sistema es necesario solo para iniciar la expresion de ely superar !a incapacidad del circuito autogeno de comenzar la sfntesis de novo. No son necesarios para la expresi6n continua. La protefna cii actua de manera directa en la expresion genica. Entre los genes cro y cii se localiza otro promotor denominado PRE ' (El subfndice "RE " significa repressor establishment, establecimiento de: represor.) Este promotor puede ser reconocido por !a polimerasa de RNA solo en presencia de la protefna ell, cuya acci6n se ilustra en Ia La protefna ell es en extrema inestable in vivo. debido a que es degradada como resultado de Ia actividad de una protefna hospedadora denominada HflA. La funci6n de cUI es proteger a ell contra esta degradaci6n . La transcripci6n a partir de PRE facilita Ia lisogenia de dos man eras. Su efecto directo con siste en Ia traducci6n de c1 en !a protefna represora. Un efect indirecto consiste en que la transcripci6n prosigue por el gen cro en !a direcci6n "incorrecta" . De este modo, la region 5' del RNA corresponde a un transcrito antisentido de cro; de hecho, se hibrida con el RNAm cro autentico, el cual inhibe su traducci6n. Esto es importante porqu e la expresion de cro es necesaria para entrar al ciclo lftico (vease Ia seccion 14.20, El represor cro es necesario para la infeccion lftica) . La region codificadora c1 en el transcrito PRE se traduce de manera muy eficiente, en contraste con Ia traducci6n debil del transcrito PRM ' De hecho, el represor es sintetizado con una eficacia unas siete a ocho veces mayor con la expresi6n a partir de P RE que de PRM . Esto hace evidente el hecho de que el

~a nscrito PRE tiene un sitio eficiente de union a! -:":::>osoma, mientras que el transcrito PRivl carece de .:io de union a! ribosoma y en realidad comienza _ n el codon de iniciacion AUG.

Union de Gil sola Union conjunta de Gil y polimerasa

Un mal promotor requiere protef na eli -50 -40 -30 -20

Conceptos principales El promotor P RE tiene secuencias at\picas en -10 y en -35.

• La polimerasa de RNA se une al promotor solo en presencia de ell. • elise une a secuencias cercanas a la region -3 5.

:.. promotor PRE se ajusta mal a Ia secuencia de con·:-nso localizada en Ia posicion -10 y carece de una .:-cuencia de consenso en -35. Esta deficiencia ex. :ica su dependencia de eli. In vitro, el promotor no - 1ede ser transcrito porIa polimerasa de RNA sola, ero puede ser traducido cuando se agrega eli. El -:-gulador se une a una region que se extiende mas menos desde -25 hasta -45. Cuando se agrega pomerasa de RNA se protege una region mas, Ia cual :- extiende des de -12 hasta + 13. Como se resume 7:1 la , las dos protefnas se unen a sitios -Jperpuestos. La irnponancia de las regiones - 35 y -10 para ~ funcion del promotor, a pesar de la carencia de emejanza con el consenso, Ia indica !a existencia .:.e las mutaciones cy. Estas mutaciones tienen efec. s similares a los de las mutaciones ell y eli! en la ..:.hibicion del establecimiento de Ia lisogenia; no !:lstante, actuan en cis en vez de h acerlo en trans. =e clasifican en dos grupos, cyL y cyR, los cuales se calizan en las posiciones de consenso -10 y -35. Las mutaciones cyL se localizan alrededor de
Secuencia habitual en -35

Secuencia habitual en - 10

TTGACA

TATAAT

GCAACGCAAACAAACGTGCTTGGTATACATTCATAAAGGAATCTA CGTTGCGTTTGTTTGCACGAACCATATGJAAGTATTTCCTTAGAT *** ** * ***

Mutaciones cyR

Mutaciones cyl

• union de Ia polimerasa afecta Ia union de ell

union de Ia polimerasa

La polimerasa de RNA se une a P RE solo en presencia de eli, que entra en o con la region localizada en la posicio n -3 5.

Promotor REGULADOR Union de Ia polimerasa Conversion cerrado-abierto

(constante de equilibria, K8 ) represor

ningun efecto

Gil

1oox

(constante de velocidad, k2) 11;{ 10ox

La regulacion positiva puede influir en la polimerasa de RNA en cualquier etapa del inicio de la transcri pcion .

transcripcion. La indica que una o las dos etapas de Ia interaccion entre el promotor y Ia polimerasa pueden ser el objetivo de !a regulacion. La union inicial para formar un complejo cerrado o convertirlo en un complejo abieno puede intensificarse.

E

La lisogenia requiere numerosos sucesos

Conceptos principales • eli y ciii provocan que se establezca la sintesis del represor y tam bien desencadenan la inhibicion de la transcripcion de los genes tard\os . • El establecimiento del represor apaga la expresion de los genes tempranos inmediatos y retrasados . • El represor activa el circuito de mantenimiento para su propia sintesis. • El DNA /.., se integra al genoma bacteria no en la etapa final del establecimiento de la lisogenia.

14.19 La lisogenia requiere numerosos sucesos

369

La ru~lisogenica ci)nducejt)a sintesis del represo~ ETAPA TEMPRANA INMEDIATA

t

N y cro son transcritos

ell/

N

t

ETAPA TEMPRANA RETAASADA

el cro ~

N produce antiterminaci6n; ell yell/ son ~ transcritos

ell

ESTABLECIMIENTO DE LA LISOGENIA

I

ell actua en PRE: el es transcrito

ero ~

ell

MANTENIMIENTO DE LA LISOGENIA el

t

El represor se une a OL y a OR: e/ es transcrito desde PAM

Para establecer la lisogenia se requiere una cascada, perc este circuito es desactivado despues y es remplazado per el circuito aut6geno de mantenimiento del represor.

Ahora se puede ver como se establece la lisogenia durante una infeccion. La recapitula las etapas tempranas y muestra lo que sucede como resultado de Ia expresion de los genes ciii y ell. La presencia de eli permite que PRE se aproveche para extender el transcrito a traves de cl. La protefna represora se sintetiza en grandes cantidades a partir de este transcrito y de inmediato se une a 0 1 y a OR. Al inhibir en forma directa la transcripcion a partir de P1 y PR, Ia union del represor apaga Ia expresion de todos los genes del fago. Esto detiene la 3 70

CAPiTULO 14 Estrategias de los fagos

sintesis de cii y de ciii, las cuales son inestables; :i:: degradan con rapidez, lo cual ocasiona que PREy~ no pueda ser utilizado. As!, la sintesis del represor ~ traves del circuito de establecimiento se detiene. No obstante, ahora el represor esta presentee:· 0 R" Este activa el circuito de mantenimiento para I.e expresion de PRM. El represor continua siendo sintetizado, aunque al nivel mas bajo tfpico de Ia funcio;: de PRM" Por lo tanto, el circuito de establecimieminicia Ia sfntesis de represor en un nivel alto. Lueg el represor desactiva todas las demas funciones ~

· .. o que activa el circuito de mantenimiento, el :_ :unciona en el nivel bajo adecuado para man:': la lisogenia. i:n este momenta no se abordaran con detalle _emas funciones indispensables para establecer sogenia, pero se subrayara de manera breve que -:=' :"{A A infeccioso debe ser insertado en el genoma . ::-:eriano (vease la seccion 19.17, La recombina:-0 especializada comprende sitios espedficos). La . rcion necesita el producto del gen int, el cual se . resa desde su propio promotor Pv en el cual tames necesaria Ia proteina cU. La secuencia de P1 ·be homologia con Ia de PRE en el sitio de union -n (aunque no en Ia region -1 0). Las funciones :esarias para establecer el circuito de controllii ' nico se encuentran, por lo tanto, bajo el mismo trol que las funciones necesarias para integrar :::)NA del fago a! genoma bacteriano. En conse~ ncia, el establecimiento de la lisogenia esta bajo - control que garantiza que todos los episodios - ·ispensables tengan Iugar en sincronfa. Con enfasis en la cualidad truculenta de la casd a intricada de A, ahora se sabe que en facilita la genia de otra forma indirecta. Respalda la trans.::-:pcion a partir de un promotor denominado Pami·Q' _ cual se localiza en el gen Q. Este transcrito es una ::rsion antisentido de Ia region Q, y se hibrida con :. RNAm Q para impedir Ia traduccion de Ia proteina · cuya sfntesis es esencial para el desarrollo litico. -:.:>r lo tanto, los mismos mecanismos que facilitan _ modo directo !a lisogenia al provocar la transcrip.:: 'n del gen represor ci tam bien ayudan de manera directa a la lisogenia al inhibir Ia expresion de los .:-enes era (vease antes) y Q, los genes reguladores - cesarios para la ruta litica antagonica. -

0

0

El represor Cro es necesario para la infecci6n l1tica Conceptos principales • Cro se une a los mismos operadores que el represor, pero con afinidades distintas. • Cuando Cro se une al sitio OR3' impide que la polimerasa de RNA se una a PR1, y bloquea el mantenimiento del represor. • Cuando Cro se une a otros operadores en OR o en OL, impide que la polimerasa de RNA exprese los genes tempranos inmediatos, lo cual bloquea (de forma indirecta) el establecimiento del represor.

Lambda tiene como alternativas entrar en lisogenia o comenzar una infeccion litica. La Jisogenia se inicia cuando se establece un circuito de mantenimiento autogeno que inhibe la cascada lftica com-

pleta a! ejercer presion en dos puntas. El programa para el establecimiento de Ia lisogenia pasa por algunos de los mismos episodios necesarios para Ia cascada lftica (es necesaria Ia expresion de los genes tempranos retrasados a traves de la expresion del gen N). Ahora surge un problema. i. Como entra el fago a! ciclo lftico? La influencia clave en el ciclo lftico es Ia fun cion del genera, el cual codifica otro represor. Crase encarga de evitar la sintesis de la proteina represara; esta accion elimina Ia posibilidad de establecer la lisogenia. Los mutantes era suelen establecer la lisogenia en vez de entrar ala ruta litica, debido a que carecen de Ia capacidad de desviar los sucesos y alejarlos de Ia expresion del represor. Cro forma un dfmero pequeiio (la subunidad es de 9 kD) que actua dentro de Ia region de inmunidad. Tiene dos efectos: • Impide la sintesis del represor a naves del circuito de mantenimiento; es decir, impide Ia transcripcion por medio de PRM' • Tambien inhibe Ia expresion de los genes tempranos a partir de PLy de PR. Esto significa que, cuando un fago entra a Ia ruta Htica, Cro se encarga de evitar la sintesis del represor y (de manera subsecuente) de inhibir la expresion de los genes tempranos. Cro ejerce su funcion al unirse a los mismos operadores que la protefna represora (cl). Cro incluye una region con Ia misma estructura general que el represor; una helice 2 forma un angulo con respecto a la helice 3 de reconocimiento. (El resto de !a estructura es diferente, lo cual demuestra que el elemento helice-giro-helice puede operar en varios contextos.) Igual que el represor, Crose une en forma simetrica a los operadores. Las secuencias de Cro y del represor en Ia region helice-giro-helice estan relacionadas, lo cual explica su capacidad de establecer o con las mismas secuencias de DNA (vease Ia Figura 14.21). Cro forma os similares a los que hace el represor, pero se une a una sola cara del DNA; carece de los brazos terminales N por medio de los cuales el represor rodea Ia estructura duplohelicoidal. i. Como pueden dos protefnas tener los mismos sitios de accion y tener efectos tan opuestos? La respuesta se encuentra en las afinidades diferentes que cada proteina tiene por los sitios de union individuales dentro de los operadores. Se analizara solo el operador OR, del cual se tiene mayor conocimiento yen donde Cro ejerce sus dos efectos. La serie de sucesos se ilustra en la . (N otese que las primeras dos etapas son identicas a aquellas del circuito lisogenico que se muestra en la Figura 14.32.) 14.20 El represor Cro es necesario para la infecci6n l\tica

371

IETAPA TEMPRANA I NMEDIATA

t

N y ero son ..-..-r_,.,,-,..,,..- ;r ,,.:-?,,.,.- , transeritos ell

ETAPA TEMPRANA RETRASADA N produce antiterminaci6n; ell y ell/ son transcritos

ell

~

t

CONTINUACION DE LA ETAPA TEMPRANA RETRASADA

t

Crose une a OL ya OR

ell

~ ETAPA DE EX PRESION TARDiA Cro rep rime a el y ell pR, a todos los genes tempranos; pQ acttva Ia expresi6n tardia

~

La cascada litica necesita la prote1 na Cro, la cual impide de manera directa el mantenimiento del represor a traves de PR1•1, as1 como la desactivaci6n de la expresi6n de los genes tempranos retrasados, lo que impide de manera indirecta el establecimiento del represor.

La afinidad de Cro por OR3 es mayor que su afinidad por OR2 o que por OR 1. Por lo tanto, se une primero a OR3 . Esto inhibe Ia union de Ia polimerasa de RNA a PRM' Como resultado, la primera acci6n de Cro es impedir !a participaci6n del circuito de mantenimiento de Ia lisogenia. Despues Cro se u ne a OR2 o a OR l. Su afinidad por estos sitios es similar y no hay efecto de colaboraci6n. Su presencia en cualquier sitio es suficiente para impedir que !a polimerasa de RNA utilice PR. Esto a su vez detiene la elaboraci6n de los produc372


tos tempranos (incluso Cro) . Como resultado de l;: inestabilidad de cii, se inhibe cualquier uso de PR:=.Asi, las dos acciones de Cro juntas bloquean toda l;; producci6n del represor. En cuanto a! ciclo lftico, Cro inhibe Ia expresi6n de los genes tempranos (aunque no !a elimina. por completo). Su efecto incompleto lo ex plica su afinidad por OR l y por OR2, !a cual es unas och veces menor que !a del represor. Este efecto de Cr no ocu rre hasta que los gen es tempranos se har vuelto mas o menos superfluos, debido ala presen-

~

e pQ; en este momenta, el fago ha comenzado :::(})res ion de los genes tardios y se concentra en Ia duccion de Ia progenie del fago .

(Que determina el balance entre la Lisogenia y el cido

Cro y el represar se expresan en Ia etapa temprana retrasada El represar actua sabre OL y sabre OR

t

litico? ::J!lCEptos principales

t

ell/ tL N . ~./l\.1.:\.Q.

_a etapa temprana retrasada cuando Cro y el represor estan siendo expresados es frecuente en la lisogenia y en el ciclo l\tico. :l episodio determinante ocurre si eli provoca la s\ntesis suficiente de represor para superar la acci6n de Cro.

1

PJ OL

IAC\.""i1

1

1

ell actua en PRE

t

cl PAM PRE IJ\..C\.~i'.\.1;\.u f2t.F,\l.;\~C' ' PRIOR cro rR ell

f

Cra actua sabre OL y sabre OR

/

La lisagenia requiere que el represor ocupe OL y OR

_ : programas de Ia ruta lisogenica y de Ia ruta _:a se relacionan tan de cerca que es imposible :decir el destino de un genoma fagico individual --=.ndo entra a una nueva bacteria hospedadora (,Se _·olvera el antagonismo entre el represor y Cro al -:3.blecer el circuito de mantenimien to autogeno . ? se muestra en Ia Figura 14.32, o al desactivar ::ntesis del represor y entrar a Ia etapa tardfa del ::'.:l rrollo que se muestra en la Figura 14.33? En ambos casas se sigue la misma ruta hasta :nomento de Ia decision. Las dos rutas implican _ i'Xpresi6n de los genes tempranos inmediatos .:; extension en los genes tempranos retrasados. _: j iferencia entre ellos radica en Ia pregunta de -~ n obtendra la ocupacion de los dos operadores, : epresor o Cro. La fase temprana durante Ia cua l se toma Ia de-' n tiene una duracion limitada en ambos casas. ~ importar cual ruta siga el fago , Ia expresion de .: s los genes tempranos sera interrumpida, dado .: ? 1 y PR son reprimidos y, como consecuencia : :a desaparicion de ell y de cUI, Ia produccion del : _ resor a traves de PRE cesara. La pregunta determinante es si a Ia interrupcion _ :a transcripcion desde PRE le sigue la activacion de y el establecimiento de la lisogenia, o si PRM es :apaz de activarse y el regulador pQ obliga al fago jesarrollo lftico . La muestra Ia etapa - .:cial, en la cual el represor y Cro estan siendo _:etizados. El episodio inicial en el establecimiento de Ia genia es la union del represor a 0 1 1 o a OR l. La - ion en los primeros sitios es seguida con rapidez - :- Ia union colaboradora de mas dfmeros represo -_ a 0 1 2 y a OR2. Este suceso desactiva la sfntesis de = ~ e inicia la sfntesis del represor a traves del PM l" El episodio inicial en Ia entrada al ciclo litico es :m i6n de Cro a OR3. Esto detiene el inicio en PRM _: circuito de mantenimiento lisogenico. Despues,

ell/

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(\;1';\/.:.\.

PL/OL

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\

\

~t

t

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"\,.C~t:< -~r;'\.

El ciclo lftico requiere que Cro acupe OL y OR e/

N

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La etapa determinante cuando se decide entre lisogenia y lisis tiene lugar durante la expresi6n de los genes tempranos retrasados. Si ell provoca la s\ntesis suficiente de represor, habra lisogenia porque el represor ocupa los operadores. De otro modo, Cro ocupa los operadores, lo cual da como resultado la expresi6n del ciclo l\tico.

Cro debe unirse a OR l o a OR2, y a 0 1 1 o a 0 1 2, para inhibir Ia expresi6n de los genes tempranos. La sus pension de Ia produccion de eli y de ern conduce a la interrupcion de la sfntesis del represor desde PRE . El establecimiento del represor se desactiva cuando las protefnas inestables ell y ern son degradadas. La influencia determinante sabre el cambia entre lisogenia y ciclo litico Ia ejerce Ia protefna eli. Si esta esta activa, la sfntesis del represor desde el promotor de establecimiento es eficaz, y como resultado, el represor logra ocupar los operadores. Si ell esta inactiva, el establecimiento del represor fracasa y Cro se une a los operadores. Los niveles de protefna eli bajo cualquier circunstancia particular determinan el resultado de una infeccion. Las mutaciones que incrementan la estabilidad de cii aumentan la frecuencia de la lisogenizacion. Dichas mutaciones ocurren en el gen ell o en otros genes. La causa de la inestabilidad de ell es su susceptibilidad ala degradacion par las proteasas hospedadoras. Su nivel en la celula lo determina eill y las funciones hospedadoras.

14.21 'Que determina el balance entre la lisogenia y el ciclo l\tico?

373

El efecto de la protefna ciii de A es secundario: ayuda a proteger a ell contra la degradacion. La presencia de ciii no garantiza la supervivencia de ell; sin embargo, en ausencia de ciii, ell es desactivada casi siempre. Los productos genicos del hospedador actuan en esta ruta. Las mutaciones en los genes hospedadores hjlA y hjlB incrementan la lisogenia (hfl significa high frequency lysogenization, lisogenizacion de alta frecuencia). Las mutaciones estabilizan Ia protefna ell porque desactivan la proteasa o las proteasas hospedadoras que la degradan. La influencia de la celula hospedadora sabre el nivel de cii ofrece una ru ta para que la bacteria interfiera en el proceso de las decisiones. Par ejemplo, las proteasas hospedadoras que degradan a ell se activan par crecimiento en un media rico. De esta manera, A tiende a lisar las celulas que crecen de manera adecuada, pero es mas probable que entre en lisogenia en las celulas so metidas a escasez de nutrientes (las cuales carece n de los componentes necesarios para un crecimiento litico eficiente).

IE

Resumen

Los fagos tienen un ciclo de vida litico, en el cual ala infeccion de una celula hospedadora le sigue la produccion de un gran numero de partfculas fagicas, la !isis de la celula y la liberacion de los virus. Algunos fagos tambien pueden existir en forma lisogenica, en Ia cual el genoma del fago se integra al cromosoma bacteriano y se hereda de esta forma latente, e inerte, como cualquier otro gen bacteriano. En general, Ia infeccion litica se divide en tres fases. En la primera un pequefi.o numero de genes del fago es transcrito par Ia polimerasa de RNA del hospedador. Uno o mas de estos genes es un regulador que controla la expresion del grupo de genes que estan activados en Ia segunda fase. El patron se repite en la segunda etapa, cuando un gen, o mas, constituye un regulador necesario para Ia expresion de los genes de la tercera fase. Los genes de las dos primeras etapas codifican las enzimas indispensables para reproducir el DNA del fago ; los genes de la ultima fase codifican los componentes estructurales de la partfcula fagica. Es comun que los genes muy temprano s esten apagados durante las etapas posteriores. En el fago A, los genes estan organizados en grupos cuya expresion es controlada par ep isodios reguladores individuates. El gen temprano inmediato N codifica un antiterminador que permite la transcripcion de los grupos a Ia izquierda y a Ia derecha de los genes tempranos retrasados a partir de los promotores tempranos PRy P1 . El gen temprano 3 74


retrasado Q tiene una funcion de antiterminac: similar que permite la transcripcion de todos genes tardfos desde el promotor PR .. Se reprime ciclo litico y se mantiene el estado lisogenico ; la expresion del gen ci cuyo producto es una p~ tefna represora que actua en los operadores C 0 1 para impedir el usa de los promotores PR y : respectivamente. El genoma de un fago lisoger expresa solo el gen ci desde su promotor, piR;\ \ " transcripcion desde este promotor comprende c regulacion autogena positiva, en la cual el repre ~ unido a OR activa la polimerasa de RNA' en PRM. Cada operador esta formado par tres sitios union para el represor. Cada sitio es palindrorr. . y esta formado par mitades de sitio simetricas. :. represor funciona como un dfmero. Cada mitaci _ sitio de union es ada par un monomero ~ ~ presor. El dominio terminal N del represor contie= un elemento helice-giro-helice que entra en com<. to con el DNA. La helice 3 es Ia helice de reconc. miento y se encarga de hacer os especifi( con los pares de bases localizados en el operad La helice 2 interviene en el posicionamiento d helice 3; tambien participa en el o de la P~ limerasa de RNA en PRM. El dominio terminal C necesario para la dimerizacion. La induccion es p ~ vocada par la division entre los dominios termina: :C y N, la cual impide que las regiones de unior: .:. DNA funcionen de forma dimerica, lo que redt:. ~ su afinidad par el DNA e imposibilita el mant e ~ miento de la lisogenia. La union represor-opera ~ es de colaboracion, de tal manera que una vez q-_ un dfmero se ha unido al primer sitio, un segu n dimero se une con mayor facilidad al sitio ad :: cente. El elemento helice-giro -helice es utilizado r otras protefnas de union al DNA, como Ia protei:::..._ Cro del fa go A. Esta ultima se une a los mismos Of - . radores, pero tiene una afinidad diferente par : ~ sitios operadores individuates, que esta determina ~ par Ia secuencia de la helice 3. Cro se une de rr__:nera individual a los sitios operadores, co men zan con OR3, en una forma que no es de colaboracioEs indispensable para continuar par el ciclo Htic Su union a OR3 impide primero Ia sfntesis del r= presor desde p RM' y luego su union a OR2 y a oi ~ evita Ia expresion continua de los genes tempran . un efecto tambien observado en su union a 0 1 l a 0 1 2. El establecimiento de la sfntesis del represor rfquiere el usa del promotor PRE' el cual es activa · par el producto del gen ell. El producto del gen ~ es necesario para estabilizar el producto ell y prottgerlo contra Ia degradaci6n. Al apagar Ia expresi ' de ell y de elii, la proteina Cro impide la lisogen:=

iesactivar todas las transcripciones excepto lade propio gen, el represor irnpide el ciclo lftico . En - a infecci6n particular, la decision entre lisis y li=enia depende de la ocupaci6n de los operadores : el represor o par Cro . La estabilidad de la pro 2la ell en la celula infectada es un determinante wrdial del resu ltado.

: eferencias La cascada lltica es controlada por dos tipos de sucesos reguladores --: :u lo de revision -::e nblatt, J., Nodwell, J. R., and Mason, S. W. (1993). Transcriptional antitermination . Nature 364, 401-406. Los genes 'A. t empranos inmediatos y tempranos retrasados son indispensables para la lisogenia y para el ciclo lltico ,· te de revision ..c:hne, M. (2004). The Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Press.

La lisoge ni a la mantiene una protelna represora ~ = ~los

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-~otta,

El represor y sus operadores definen la region de inmunidad =-te de revision -~ man, D. I. and Gottesman, M. (1982). Lambda II. Cambridge, MA: Cell Press . La forma de union al DNA del represor es un d\mero .' :ulo de in vestigaci6n C. 0. and Lewis, M. (1982). The operator-binding domain of lambda repressor: structure and DNA recognition. Nature 298, 443-447.

• JO,

BE

La helice de reconocimiento determina la especificidad par el DNA

Artlculos de inves tiga cion Brennan, R. G. et al. (1 990 ). Protein -DNA conformational changes in the crystal structure oi a lambda eraoperator complex. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 87, 8165-8169. Wharton, R. L.. Brown, E. L., and Ptashne, M. (1984). Substituting an a -helix switches the sequence specific DNA interactions of a repressor. Ce/138, 36 1-369.

~~~~ Los dlmeros represores se unen en colaboraci6 n al operador Artlculos de invest igacion Bell. C. E., Frescura, P., Hochschild, A., and Lewis, M . (2000). Crystal structure of the lambda repressor ( -termina l domain provides a model for cooperative operator binding. Cell 101 , 801-811. Johnson. A. D., Meyer, B. J., and Ptashne, M. (1979). Interactions between DNA-bound repress ors govern regulation by the phage lambda repre ssor. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 76, 5061-5065 . El represor en OR2 interactua con la polimerasa de RNA en el PR:·t Art\culos de investiga cion Hochschild, A., Irwin, N ., and Ptashne, M. ( 1983). Repressor structure and th e mechanism of positive control. Cel/32, 319-325. LL M., Moyle, H., and Susskind, M. M. (1994 ). Target of the transcriptional activation function of phage lambda ci protein. Science 263, 75- 77.

IJID

Las interacciones de colaboracion incrementan la sensibilidad de la regulacion

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El rep resor utiliza un elemento he li ce-giro -h elice para unirse a l DNA -:-'culo de investigacion .:.er, R. T. et al. ( 1982). Homology among DNA-binding proteins suggests use of a conserved super-secondary structure. Nature 298, 447-451.

-~

Refere ncias

3 75

El replic6n ESQUEMA DEL CAPITULO

11m

Introducci6n Los replicones pueden ser lineales o circulares • Una rcgi6n replicada aparece como un ojo dentro del DNA no replicado • En el origen inicia una horquilla de replicacion y despues se desplaza de forma secuencial por el DNA. • La replicaci6n es unidirectional cuando se crea ura sola horquilla de replication en un origen. • La replication es bidirectional cuando '-" origen c-ea dos horquiUas de replicaci6n aue se desplazan en duecciones opuestas.

IW Es posible elaborar el mapa de los origenes con autorradiografia y electroforesis • El desplazamierto de la horquilla de replication puede detectarse por medio de autorradiografia utili zando pulses radioactivos. • Las horquillas de replication crean estructt.ras en forma de Y que alteran Ia m1gracion electroforetica de los fragnentos de DNA.

liB (.Regula la metilaci6n del origen a la iniciaci6n? • oriC contienc 11 repeticiones ~~J~ que estan metiladas en

Ia adcnina en ambas cadenas La replicaci6n produce DNA hemimetilado, el cuat es incapal de iniciar la replicaci6n. • Hay Ul) relraso de 13 mi n antes de que las repeticiones ~~~~_sean metiladas de nuevo.

Los ongenes pueden ser secuestrados despues de la replicaci6n SeqA sc une al DNA hemimetilado y es necesaria para el retraso de Ia replicaci6n. SeqA puede interactuar can DnaA. Puestn qut> los origenes estan hemimetilados, se ur1en a !a membrana celular y en ocasiones no escan a disposici6n de las metilasas. La naturaleza de La conexi6n entre el origen y La membrana aun no es clara.

Cada cromosoma eucari6tico contiene numerosos replicones Los replicones eucarioticos tienen una lor.gitud de 40 a 100 kb.

Un cromosoma se divide en numerosos replicones. los replicones individuates se ac:ivar en mementos caracteristicos durante Ia fase S. Los patrones de activaci6n regional sugieren que los replicones cercanos entre si son activados al mismo tiempo.

376

IW

En las levaduras pueden aislarse los origenes : replica cion Los origenes de 5. cerevisiae son secuencias cortas rice_ A- que tienen una secuencia esencial de 11 bp. El DRC cs un complejo de seis prateinas que se une a ARS.

mil EL factor de competencia controla la replicac-. eucari6tica • El factor de competencia es indispensable para La ini:; de La replicacion en cada origen. • Estc'i presente ef" el nticleo antes de La replicaci6n, p~ desactivado o destruido porta replicacion. • La iniciaci6n de otro ciclo de repticacion es posible ~ despues de que el racwr de competencia entra de n.~ nucleo despues de Ia mitosis.

El factor de competencia esta formado por proteinas MCM • El ORC es un complejo de proteinas que esta asociac: origenes de las levaduras dura nte lodo el ciclo celuL: • Cdc6 es una proteina inestable que se sintetiza solo : • Cdc6 se une al DRC y permite la union de las proteinl MCM. • Cuando Ia replicaci6n se inicia, las proteinas Cdc6 y MCfJ1 son desplazadas. La degradacion de Cdc6 impiv. rei niciacion. • Algunas proteinas MCM se encuentran en el nGdeo c el ciclo, pero otras pueden entrar solo despues de La mitosis.

Bll!l Los lazos D mantienen a los orfgenes mitocondriales • Las mitocondrias utilizan diferentes secvencias de v para iniciar La replicacion de cada cadena del DNA. • La replicaci6n de Ia cadena H inicia en un lazo D. La repliGtci6n de ,a cadena l inicia cuando su orige· expuesto por el movimiento de La primera horquilla • replicaci6n.

Ull Resumen

Introducci6n .:elula tienc un solo crornosoma (como e n las -;otas) o varios (como en las eucariotas), el ge,_ompleto debe ~er replicado predsameme una cada divisi6n celular (.De que manera se vincu=•isodio de la replicaci6n tOn cl ciclo celular? :: utilizan dos conceptos generales para comet estado de rlicaci6n con Ia condici6n del ~elular:

La iniciaci6n de Ia replicaci6n del DNA abliga a Ia ce/u/a (procari61ica o eucariocica) a experrmentar una divisi611 posterior. Desde este punta de

vista, cl numero de descendiemes que genera una celula esta determ inado por una serie de dedsiones en c uamo a inJciar o no Ia repli cad6n dd ON/\. Esta sc controla en Ia e rapa de Ia inlciaci6n. Una vez que Ia replicacion ha comenzado, continua has/a G/Ue se haya duplirado

e/ genonw completo. • Si Ia replicad6u prosiguc, nose puede perrnitir que ocurra Ia division consiguieme hasta que Ia 1epJicaci6n haya sido completada. De hecho, Ia conclusion de Ia replicaci6n puede desencadcnar Ia cfivisi6n celular. Dco;pue-;, los genomas duplicados son segregados en cada c(!lula hija. La unidad de segregaci6n cs el cromosoma. ~'lias procariota!>, Ia i11iriaci6n de Ia replicad6n isodiu individual que involucra a lill sitio uniel cromosoma bacteriano. El proceso de Ia divi- logra mediante cl desarroUo de un tabique que k la pared celular y qlle divide a Ia celula en _n las celu las eucari6ticas, la iniciaci6n de Ia re_.6n se idemi{ica por cl comienzo de Ia fase S. un ..lo prolongado durante el cual ocurre Ia sfntesis :A y que comprendc n umerosos episodios i.ndi-les de in idacl6n. La division se logra porIa rcor.ac.:i6n de la c<.!luld en Ia m itosis. En este capirulo _ •rda ra Ia regulad6n de la xeplicad6n del DNA. ~a in ida un ciclo dc:- replicaci6n? c:. Que conn·ola . lgreso y como se senaliza su lerminad6n? ...a unidad de DNA t:n Ia que liene Iugar u11 solo Je replicaci6n se denomina r e plic6n . Cada re'1 Hse activa" una sola vcz. solo una, en cada ddo -:H. El repllc6n se define por poseer los elementos nrrol nccesario!> para la repUcad6n. Iiene un ;.en en el cual se inicia Ia repliLaci6n. Asimismo, e tcner un Lerm ino en el cual se detiene la re· cion. .::ualquicr secuencia adherida a un origen o. ~rminos mas precisos, no separada de un ori~or un t<~ rmino, se replica como parte de ese c6n. El origen es un sirio de actuad6n en cis, ~z de a teci
(La concepcion original del rep Iicon [en las procatiotasllu vi:,ualitaba como una unidad que posefa el origen y el gen que codifica Ja prorefna regula dora. Sin embaJgo, en la actualida replicaci6n se denomina de una sola copia . Las bacterias puedct t contener mas informacion geneLica en Ia forma de plasmidos. Un phismido es

un genomn aur611omo de DNA czrcltlar tfW~ constituye un rep/icon independimte (vease Ia Pigura l4.2). Dl replic6n de un p lasmido puede ser controlado por una sola copia, lo que significa que se replica una sola vez cada vez que se replica <:1 cromosoma bacteriano. o pucdc estar bajo control de capias multip les, cuando esta presenre en un nuruero de capias mayor que el cromosoma bacteriano. Cada !ago o D_ A de los virus ramhi en comlituye un replicon y, por lo tanto, es capaz de inidar numerosas veces durante un ddo infeccioso. Quiza una mejor manera de considerar un replic6n procari6tico, por lo tanto, sea invenir Ia definicion: cualquier molecula de DNA que comiene till ,1rige11 puede ser replicada de fonna

aut6noma en Ia ct/ula. En Ia replicaci6n se observa una cliferencia fun damental en la organi1.nci6n de los genomas bacre rianos y eucari6 ticos. Cada cromosoma e ucari6tico conriene un gran n(lmCnJ de replicones: por lo tan to, 1a un idad de segregaci6n incluye muchas un idades de replicad6n. E!>to agrcga otra dimension at problema del control: wdos los replicones que se encuenlran en un cromosoma deben ser activados dura me un ciclo celular. Sin embargo, nose activan de man era simultanea. Cada replic6n debe ser r~cti vado en un periodo bastante prolongado y cada uno debe ser activado 110 nuis de lma vez en cada cic/o c:e/ular. Alguna sefial debe distinguir entre los replicones replicados y los no rlicados para garantizar que los 1eplicones nose ac1iven una segunda ocasion. Numerosos repliconcs son anivados de rnanera indepenclienre, por lo que debe existir otra sefial que indique el momcnto en t'l cual se ha completado el proceso de Ia rlicaci6 n de rodos los replicones. Ahara se ha comenzado a reunir informacion sobre la consmtcci6n de los replicones individuales, pew todav(a St.: ticn<: poca informaCion sobre Ia re-

15.1 lntroducci6n

377

laci6n que ex isle entre eUos. Nose sabe si el patron de replicaci6n es el mismo en cada cido celular i.Se utilizan siempre todos los origenes o algunos son silentes en algunas ocasiones? (.LOs origenes siempre se activan en el mismo arden? Si hay diferentes tipos de orfgenes. (.que los distingue? En comraste con los cromosomas nucleares. los cuales son comrolados por una sola copia, el D A de las rnitocondrias y de los cloroplasws puede ser regulado mas como plasrnidos que exisren en copias multiples por bacteria. Hay numerosas copias de cada DNA de los organelos por celula y el control de su repticacion debe relacionarse con el dclo celular. En todos estos sistemas. Ia cuestion fundamental es dcl1nir las ~ecuencias que fundonan como origenes y determinar c6mo son reconocidas por las protefnas adecuadas del mecanisme de replica ci6n. Se comienza ror considerar la construcci6n basica de los replicones y las diversas formas que adqu icren; despues de Ia consideraci6n del origen. se plan tea Ia pregunta de como Ia replicad6n del genoma se coordina con Ia division bacteriana y que se encarga de scgregar los genomas a Ia bacteria hija.

Los replicones pueden ser Lineales o circulares Conceptos principales • Una regi6n replicada aparece como un ojo dentro del DNA no replicado. • En el origen inicia una horquilla de replicadon y despues se desplaza de forma secuencial por el DNA. • La replicacion es unidirecdonal cuando se crea una sola horquilla de replicacion en un origen. • La replicacion es bidireccional cuando un origen crea dos horquillas de replicaci6n que se desplazan en direcciones opuestas.

Una molecula de DNA comp rometida en la rep caci6n tiene dos tipos de regiones. La mucstra que cuando se observa el DNA en rep cad6n mediante microscopia electr6nica, Ia regh replicada aparece como un ojo de replicacio dentro del D. A no replicado. La region no rer cada consistc en el duplex progenitor; este se ab en Ia region replicada en dondc sc han formado dos duplex hijos. El sitio dondc tiene Iugar Ia replicaci6n se ~ nomina h orqu illa de repJicaci6n (en ocasior tambien se le conoet: como p u nto de crecimie to). Una horquilla de replicaci6n se desplaza de foTT secu11ncial pore/ DNA desde su punlo de inicio en e/ gen . .El origen pucdc aprovecharse para comen:.. Ia replicaci6n unidireccional o la replicac.ic. bidireccion al. Ill tipo de episodio esta determina porIa tormaci6n de una ode dos horquillas de r~ caci6n en <.: I origen. En Ia replicaci6n un id trecci01r una horquilla de replicaci6n abando na el origer continua por el DNA. En Ia replicaci6n bidirecc nat. se forman dos horquillas de replicaci6n; esta~ alejan del origen en direcciones opuestas. La aparici6n del ojo de replicaci6n no disn:gue cmrc replicaci6n unidirecdooal y bidirecc nat. Como se ilustra en Ia c:. • el ojo pucrepresentar cualquiera de las dos esuucturas. Sx genera por media de replicaci6n unidireccional

REPLICAC16N UNIDIRECClONAL ORlGEN

J \

DNA no replicado

Ojode repllcaci6n Aspecto

DNA no replicado

Horquilla~ticaci6n

'NAD'Y/YJ{\fAf/\ DNA

replicado

~r~~en1to~JV~~

l

JYA

REPUCAC16N BIDIRECClONAL ORIGEN

Horquitla de

repticaoi6n

._

Horquilla de

replicaci6n ~

.1'\.NfiY/ . ~t\J~

Estructura molecular

/}~\

LV'\

\Jj~~·

El DNA replicado se observa como un ojo de replicacion flanqueado por DNA no replicado. 378

CAPiTULO 15 El replic6n

Los replicones pueden ser unidirecdona,=-. bidireccionales, segun la formacion de una o de dos horqL de replicacion en el origen.

represenLa un origen fljo y una horquilla de cad6n movible. Si se genera por replica don bi• ..:donal. cl ojo represcnta un par de horquHias eplicaci6n. En cualquier caso, el avance de Ia cad6n expande el ojo hasra que Lermina por _~car todo el rlic6n. :uando un replicon es circular. Ia presencia de jo forma Ia esrrucmra e. la cual se muesLra en . Las era pas sucesivas de Ia replicad6n ::>NA circular del virus del polioma seven a rraJe microscopia elecrr6nica en Ia

Estructura de rephCQCIOO 9

Apanencia de Ia estructura a por medio de microscopia electr6mca

Un ojo de replicaci6n forma una estructura 9 en : •A circular.

Ill

Es posible elaborar el mapa de los origenes con autorradiografia y electroforesis

Conceptos principales • El desplazamiento de Ia horquilla de replicaci6n puede detectarse por medio de autorradiografia utilizando pulsos radioactivos. • Las horquillas de replicaci6n crean estructuras en forma de Yque alleran la migraci6n electroforetica de los fragmentos de DNA.

La cantidad de horquillas de replica cion que hay e n un ojo de rl ica<.:i6n puede delermi narse de dos fonnas. La eleccion del mewdo depende de que el DNA sea una molecu la definida o una region no idemificada de u n gcnoma eelular. Con una molecula lineal definida se puede uti lizar microscopia eleru6nica para medir la distancia entre cada exrremo del ojo y el exrremo del DK A y luego comparar las posiciones de los extremos de los ojos en las moleculas que rienen ojos de diferenrcs tamanos. Si la replicaci6n es unidireccional, solo uno de los exrremos se moverci: el orro es el origen fijo. Si Ia replicaci6n es bidirecdonal, ambos se desplazaran; el origen es el pumo meclio entre ellos. Con regiones no definidas de genomas exren sos se pued('n utiUzar dus pulsos de radioactividad sucesivos para eriquetar el desplazamienro de las horquillas de replicaci6n. Si un pulso tiene una etiqueta mas intensa que el OlrO. plteden clisLinguirse por las inrensidades relarivas del eriquetamienro.

REPLICACION UNIDIRECCIONAL

REPLICACION BIDIRECCIONAL

EL ojo de replicaci6n se agranda a med1da que norquillas de replicacion prosiguen por el replicon. Notese =e_ Mojo" se hace mas grande que el segmento no replicado. -= dos lados del ojo pueden definirse porque ambos tienen ;isma longitud. Fotografia cortc.sfa de Bernard Hirt. Swiss --::itute for Experimental Cancer Research (ISREC).

E11que1a oe densidad pesaoa (mcorporada pnmero) Et1queta de densidad hgera (incorporada en segundo Iugar) Sin euqueta (inv1sible en Ia autorradiografia) Pueden utilizarse diferentes densidades de etiquetamiento radioactive para distinguir entre la replicacion unidireccional y la replicaci6n bidireccional.

15.3 Es posible elaborar el mapa de los origenes con aulorradiografia y elect roforesis

3 79

~M~

•........-r.'lcrn

ll~t.q!_~

Y simple

Buttlllja

Y doble

Burbuja asimetrica

--< >--< --<>--

--o-

>< c:>

__.J..._

-< >--< -o- -o -< >-< -c>- -<

El tamai'io del tragmento se duplica durante Ia replicaci6n

__.J..._

~

~~,~· 1

dlmensr6n exagera Ia contribuci6n de Ia forma de Ires dimensiones

2 kb

2 kb

\ C)

2kb

1 kb

1 kb

1 kb

1kb

La primera dimensi6n separada por masa ____.

La posicion del origen y el numero de horquillas en replicacion determinan la forma de un fragmento de restricci6n en replicaci6n, la cual puede deducirse por su ruta electroforetica (linea continua) . La linea punteada muestra la ruta del DNA lineal.

DNA

DNA

rnetllado

hemimetilado

G AT c CTAG

GATC CTAG Replicacf6n

llll Mettlasa Dam

GATC C TA G

La replicaci6n del DNA metilado origina DNA hemimetilado, el cual mantiene su esrado en los sitios GATC hasta que la metilasa Dam restaura la condici6n metilada por completo.

Estas pueden visualizarse por medio de aurorradiografla . La muesrra que la replicaci6n uniclireccional hace que a una edqueta le siga la o Lra en un extrerno del ojo. La replicaci6n bidirecdonal produ ce un patron (simetrico} en ambos excremos del ojo. Este pau6u se observa por lo general en los replicones de los cromosomas eucari6dcos. Un metodo mas redente para elaborar el mapa de los orige nes con mayor resolu d6n se vale de los efectOs que tienen los cambios de Ia forma del DNA sobre la m igraci6n electroforerica. La ilusrra la u~cnica de mapeo bidimensionaL en la cual los fragmenros de restricci6 n del DNA en replicaci611 son somelidos a electroforesis en una 380

CAPiTULO 15 El replicon

primera dim ens ion que los separa por masa y e una segunda dimension en dolJ.de el movimlen• es determinado sobre todo por la morfologfa. l diferentes tipos de moleculas en replicaci6n sigut" rutas caracteristicas, meclidas por su desvlacion t:.: Ia linea qu e seg uhia una molecula lineal de D.l\ del doble de tamai'lo. Una simple estructura Y, en la cual una horqui se desp laza por un fragmemo lineaL sigue una ru continua. Cuando las tres ramas tienen tlna misf' longitud oeture un punto de in0exi6n y la estn lura se desvla mas del DNA lmeal. Consideracioramuogas determ inan las rufas de las estrucLUras d bles en forma de Y o de las burbujas. Una burb ja asimeuica sigue un11 ruta imerrumpida con u rorura en eJ sitio donde la burbuja se conviene estructura en forma deY a medicla que una horqu abandona el extrema. J un tas, las djferentes [ecnicas para describir DNA en replicacio n muestran que los orfgenes ~t tilizan con mayor frecuencia para iniciar episod; de replicaci6n bidireccional. A partir de este nlve: resoluci6n, se debe avanzar ahora al JJ.i.vel molecu para idemificar las secueucias de actuacion eu que forman el origen y los factores de actuad6n trans que lo reconocen.

GRegula la metilaci 6n del origen la iniciaci6n?


• oriC contiene 11 repeticiones ~~I~ que estiw metilada: en Ia adenina en ambas cadenas. La replicaci6n produce DNA hemimeti lado, el cual es incapaz de iniciar La replicaci6n. Hay un retraso de 13 min antes de que las repeticione; ~1~ sean metiladas de nuevo.

(.Que caracteristica de un origen bacLeriano (o p ~ miclo} garanriz.a que sea utilizado para iniciar la plicaci6n solo una vez en cada ciclo? (.La inidac se asoda a aJgun cambio que marca el origen de manera que un origen replicado pueda distingrr de un origen no replicado? Algunas secuenclas que se utiliza o para t: prop6sito esuin induidas en el origen. oriC con: ne l l copias de la secuencia g¢J~, la cual cs

t.

6

cliana de metilad6n en la posici6n N de Ia aden: por Ia melilasa Dam. La reacci6n se ilustra er: Antes de la replicad6n, el sirio diana palind. mico es metilado en las adeninas de ambas cade1 La repUcaci6n inserta las bases normales (no me

as) en las cadenas hijas. Esto genera DNA be-

metilado. en cl cual una cadena csta metilada otra no. Por lo tanto. Ia replicadon conviene tios diana Dam de melilados por completo a Jlletilados. :Cual es Ia consecl.iencta de Ia replicad6n? La :ddad que tiene un pl por compJeto. ' tios GATC localizados en el origen permanecen •• metilados -13 nun despues de Ia replicadon. . argo periodo noes habitual porque en los sitios --:-c tfpicos en cualquier otro Iugar del genoma. ::netilaci6n comiema de inmediato (<1.5 min) ues de Ia replicaci6n. Otra region acu.ia como el promotor del gen dnaA tambien muesrra reamcc; de que com1enct' Ia remetilacion. ~1 promotor del gen duaA L'Stan1 reprimido mras este hemimetilado, lo cual reduce el nivel .1 protc ma DnaA. Por lo tanto. el origen esta -c y Ia producci6n de la proteina iniciadora crues r rim ida durilnre este perioclo.

Los origenes pueden ser secuestrados despues de la replicaci6n ' ~eptos principales 5eqAse une al DNA hemimetilado y es necesaria para :1 retraso de la replicaci6n. SeqA puede interactuar con DnaA. ~uesto que los origenes estan hemimetilados, se -nen a Ia membrana celular y en ocasiones no estan a :tsposici6n de las metilasas. _a naturaleza de Ia conexi6n entre el origen y la .,embrana aun no es clara.

'1ue se debe cl retraso de Ia remetiladon en oriC . dnaA? La explicaci6n mas probable es que est.aS -.~ones son secuestradas en una forma en Ia cuaJ inaccesibles a Ia menlasa Da111.

•

'\.~(JOO't~ Ongen actJVo Rep1icaci6n

!

Orfgenes inactives

Met1lasa Dam

!

•

~¥J\:IJ\.i.IJY/ Ot~gen activo

Solo los origenes metilados por completo pueden iniciar Ia replicaci6n; los origenes hijos hemimetilados no pueden utilizarse de nuevo hasta que hayan rccuperado su estado de metilaci6n completa.

Un circuito encargado de controlar Ia reutitizaci6n de los origencs C!> identiflcado pur mmadones en el gen \eqA. Los mutantes reducen el rerraso de Ia remetilaci6n en oriC yen dnaA. Como resultado, ini cian Ia replicaci6n del DNA demasiado promo. con lo que se acumula un numero exces1vo de origenes . Esto sugiere que seqA forma parte de un circuito re gulador negarivo que impide que los origenes sean metilados de nuevo. La proteina SeqA se une con mayor fuerza al DNA hemimclilado que aJ D :rA metilado por complero. Puedc inidar la union cuando el DNA es hemimetilado. mnmenw en que su presencia continua impide Ia formacion de un complejo abieno en d origen. ScqA no tiene especificidad por Ia secuencia oriC y parece probable q ue esta sea confericla por !a prordna DnaA. Esto explicarla las interacciones genthica:. en tre seqA y d11aA. La hemin 1etilaci6n de l d!> ~ecu endas GATC del origeo es indispe nsable para su asociaci6n con Ia membranv celu lar in vitro. El DNA oriC hemimetilado se une a las membrana:.. pero el DNA que esu1 me1ilado por cnmpkto, no. Una posibilidad es q ue Ia asodaci6n a Ia membrana tenga que ver en el control de !a actividad del orig<:n. Esta fund6n podria ser independientt' de cualquier funci6n que Lenga la membrana en Ia segregacion (vease Ia Figura 17.4). La asociaci6n a lil membrana podria impedir que ocurTiera Ia reiniciacion de manera premarura. de forma indirecta por el ~ecuestro de los orfgenes. o dtrecta por Ia inhibici6n de Ia reacci6n por pane de algtin componente en ta membrana. Las propicdades de Ia fracci6n de Ia membrana sugicren GUe incluye componente:> que regulan Ia replicaci6n. Un inhibidor observado t·n esta fracd6n compile con Ia proreina Dna A. J;sre inhibidor puede impt>d.Lr la in iciaci6n de Ia rlicadon solo si es

l5.5 Los origenes pueden ser secuestrados despues de la replicaci6n

381

'II

GATC IHLNNtHUI C T A G N N llll\IJII NJi

G AT C N N N 1\1 N.N N CTAG NNNNNNN

El inhibidor unido a Ia membrana se adhiere at DNA hemimetitado

El DNA es metilado de nuevo y IIbera at inhib1dor

•1

~GATC

NNN N NN N

C T A G N N N N_N N N

DnaA se une a oriC

~-

Un inhibidor unido a la membrana se adhiere at DNA hemimetilado en et origen y puede funcio nar at impedir la union de DnaA. Es Uberado cuando el DNA es rnetilado de

nuevo.

agregado antes que Ja proreina DnaA a un sistema in vitro. bsro sugiere el modelo que se muestra en Ia • en el cual el inhibidor reconoce de manera especftica el DNA hemimetilado e impidc que se und Ia prmeina DnaA. Cllando el DNA es metilado de nuevo, el inhibidor es liberado y la protefna DnaA es libre de iniciar Ia rephcadon. Si el inhibidor esta asociado a Ia membrana, es posible que la asociacion y Ia disodaci6n del DNA ala membrana tengan que ver con el control de Ia replicaci6n. La extension completa del sistema utilizado para conrrolar Ia reiniciaci6n no es clara, pero es po~ible que partidpco numerosos mecanismos: el secuestro Hsico del origen, el retraso de Ia remerilaci6n, La inhibicion de la union de Ia prorefna DnaA y la represi6n de l<1 t.ranscripci6n del gen dnaA. No cs evidentc cual de estos episodios ocasiona los demils. y si sus efectos en lu inidaci6n son directos o indircctos. Aun se debe resolver el rema central de cual caracterisrica Liene ci encargo fundamental de sincronizar los sucesos. Una posibilidad es que la adhesion ala membrana ocurre en la iniciad6n y que sea necesario el cnsamble de alguna estructura exterua para liberar el DNA. El periodo de secuestro parece aumemar con Ia longitud del cido celular, lo cual sugicrc que rcOcja de manera indirecta el reloj que comrola Ia reinkiacion. Como (mica integrame del mecanismo de replicaci6n indispensable solo en el origen, la protefna DnaA ha atraido mucha atencion. Esta protefna es Ia diana de numerosos !>istemas reguladores. F.s posible que ninguno de estos sistemas sea suficiente por sl solo para controlar la frecuencia de la ini382


ciaci6n. pero que cuando se combinen logren resultado esperado. Algunas mut.adoues en el gt dnaA provocan replicacion asincronica. lo cual s giere que Dna A podrfa ser el •nrulador" o eJ ''relo que mide eJ numero de origenes en relaci6n con masa celular. La sobreproducci6n de DnaA da lug.: a re)ultados <.onOietivos, los cuales pueden vari;~ dcsde no tener ningun efecto hasta causar que inidacion suceda en una masa reducida. lla sido d.iffcil idenrificar los componentes pr teinicos que median Ia adhesion a Ia membrana. l indicio de que csta es una funci6n de la protelr Dna/\ Jo consliwyc su respuesta a los fosfolipid E~lOs facilitan el intercambio de ATP con el ALunido ala protcfna DnaA. Se desconoce Ia fund• que tiene esto en el control de La actividad de Dna (Ia cual requiere AT.P). pero Ia reacci6n implica q. es probable que DnaA interactue con Ia membran: l:!sto significarfa que mas de un isocliu Lienc q ver en Ia asociaci6n a la membrana. Quiza un ogct1 hemimr.tilado esH~ unido al inhibidor asocia a Ia membrana, pero cuando el origen se metila r completo, el inhibidor es desplazado porIa protei!' DnaA asociada a Ia membrana . Si DnaA es el iniciador que desencadena un c do de rlicacion, el suceso principal serla su ac_ mulaci6n en el origen en un nivel critico. No ha variaciones dclicas en Ia expresi6n o en Ia concetraci6n global de Ia protefna DnaA. lo cual sugie:que los sucesos locales deben ser los rcsponsable Para que !lea act iva en la iniciaci6n de la replicadcDnaA del>e em:ontrarse en su forma unida a ATP.::.. protefna DnaA tiene una actividad inu·fnseca d€: que transforma el ATP en ADP. Esta actividad intensifica Ia subunidad ~ de la polimerasa de D~ ru. Cuando la replicasa es incorporada al comptede replicaci6n, esta iuteracci6n ocasiona la hidr61L del ATP uniJo a DnaA, lo que desactiva Ia protei DnaA e impidc que comience otro ciclo de replic= cion. Es1a reacci6n ha sido denominada RlDA (re:-~ /a tory inactivation of DnaA, desactivaci6n regu lade: de DnaA). cs potenciada por una protelna llama Hda. Todavfa no sc sabc que conLrola la cronolog, de la reactivaci6n de Ia proLcina DnaA. Otro ranor que controla la disponibilidad Dna/\ en el origen es Ia comperencia pot unirla otros sitios del DNA. En particular, un locus den minado dar riene una gran concentraci6n de siL de union a Ia prote1na DnaA. Se le une unas oc veces mas OnaA que al origcn. La delcci6n de .• hace que Ia iniciacion ocurra con mayor frecuena Esto retlucc de mant>ra sign.ificativa Ia camidad Dna A uisponible para el origen, pero nose sabe C\exactilud que funci6n pueda tener en el conrrol _ Ia cronologfa de la iniciad6n.

Cada cromosoma eucari6tico contiene numerosos replicones -"'1!::.:-ptos principales _;,; replicones eucari6ticos lienen una longitud de 40 a :· kb . • - cromosoma se divide en numerosos replicones. ~:o replicones individuates se activan en momentos racteristicos durante Ia fase S. ••5 patrones de activaci6n regional sugieren que los == .icones cercanos entre s1 son aclivados al mismo ~m po .

celulas eucari6ticas Ia replicaci6n del DNA :onfinada a una parte del ciclo ce lular. La fase de durar unas cuan tas horas en 1111 a celu la eurka superior. La replicaci6n de Ia gran canridad ~1\ con tcnido en u n cromosoma eucari6rico ~ra al dividirlo en numerosos replicones indivi cs. Solo algunos de estos replicones panicipan ..::. replicacion en un momenta dado de Ia fase S . .arecer cada replic6n es activado en un momen'!ledfico durante Ia fase S. aunque los datos que sabre el tema no son deci~ivos. !:I ioicio de Ia fase S lo senala Ia aaivaci6n de ,:"rimcro!> replicones. En las pocas horas siguien•os episodios de iniciaci6n tiencn Iugar en mros cones de manera ordenada ..\llucho de lo que .abe sabre las propiedades de los replicones in_duales proviene de e•audios au1orradiograficos ~ recurren en general a los tipos de protocolos srrado<: en la Figura 15.5 yen Ia Figura 15.6. Los jcones cromos6micos suelen mostrar rJicaci6n .Jeccion al. i,Qu e tan grande es el replic6n promedio y amos hay en el genoma? Unn dili cu ltad para -:'cribir la urlidad individual es que los replicones :·acemes pueclen fus ionarse y formar ojos replios extensos. como se ilu<;Lra en l<1 - metodologia utilizada en genera l para distinguir -:re los replicone~ individua les y los ojos fusio~dos consiste e n u ti lizat fragmentos de D.:\A en cuales puedan observarse numerosos replicones :::ivos, caplllrados al parecer en una etapa en Ia al todos han iniciado casi at mismo tiempo, pero res de que se rell.nan las horquillas de las unida.::s adyacemes. En grupos de replicones actives. el ramano pro-:.cdio de Ia unidad se mide por Ia distancia que .J.Y entre los orfgcncs (cs decir. enrre los puntas edios de los replicones adyacen tes). La velocidad em Ia cual sc t.ksplaza Ia horquilla de replicad6n .tede estimarse a partir de Ia distancia maxima que .::corren los ram·os autorradiognHicos durante un criodo detcrminado. .h

=

Para medir el tamaiio del replicon se necesita un fragmento de DNA en el cuallos replicones adyacentes esten activos .

Los replicones indtvidualcs de los gcnomas eucari6ticO!> son relativameme pequenos. por lo ge neral de -40 kb en las levacluras o en las moscas y de -I 00 kb en las celulas animates. Sin embargo• pueden variar m,i!, de 10 veces en longitud demro de un genoma. La velocidad de repticaci6n es de -2 000 bp/mio. Ia cual es mucho menor que Ia del desplazamicnto de Ia horquilla de replicaci6n bacreriana (50 000 bp/min). Por Ia veloddad de replicac16n, cs evideme que el genoma de un mamifero podlia replicarse en cerca de 1 h si todos los repliconcs Juncionaran de manera simultanea. Sin embargo. 1a fase S dura m 1icnd en a esrru: actives en un tnomemo dado. Hay casos cxccionales. como las divisiones embrionarlas tempranas de los embriones de Drosophrla. en dondc Ia du raci6n de Ia lase s se comprime por el runcionamiento simultaneo de un gran numero de replicones. t.C6mo se seleccionan los origenes para Ia inidaci6n en momentos distimos durante Ia fase S? En Saccharomyce~ cereviSitU, parece ser que estci predeterminado que los orfgcnc~ ~e repliquen temprano. pero que las secuencias de actuaci6n en cu puedan hacer que los orfgcnes ligados a elias se repliquen despues . Los dato!> disponibles sugieren que los replicones cromos6milos no rienen terminales en las cuales las horquillas de replicaci6n interrumpan el desplazamiento y (al parecer) se disocicn del DNA . Parece mas probable que la horquilla de replicacion continue dcsde su origen basta que encuemre una

15.6 Cada cromosoma eucari6tico conticne numerosos replicones

383

Las horqu illas de replicaci6n se organizan en rocos dentro del nucleo. Las celulas fueror etiquetadas con BrdU. E1 segmento izquierdo de la figura se ti16 con yoduro de propidio para identificar La masa de ON/\. El derecho se tilio con un anticuerpo contra BrdU para identificar el DNA en replica· cion. Fotografia cortesia de Anthony D. Mills and Ron Laskey, Hutchinson/MRC Research Center, University of Cambridge. horquilla que avanre hacia ella desde el replic6r. adyacentc. Ya ~e ha mencionado el posible problema topol6gico de unir cl DNA que acaba de simetizarse en Ia union de las horquillas de replicaci6n. J a predi-sposici6n de los rep1icones vecinos a cstar activo!> de n'a11era simulranea podrfa cxplicarse porIa presencia de comroles "regio!lales .. , en los cuales to~ grupos de replicones son iniciados de modo mas o menos coorojnado, al comrario ne un mecanismo rn el cual los replicones individtiales son activado~ uno por uno en areas dispersas del genoma. Dos caracterfsticas estructurales sugieren Ia posibilida ci de u r~a organizaci6n a gran escala. Regiones bastame exLt::Jtsas del a-omosoma pueden de6nir~e como Nde replicaci6n tem prana" o "de re· plicacion tardia'', lo cual implica que hay poca diseminad6n de replicones que sc acLivan enmomemoc; temprano::, o tardfos. La visualizaci6n de las horquilla!> de replicaci6n pur me-clio de etiquetamiemo con prenmore~ de Ot A idenrifica de 100 a 100 "focos" en vez de una ti11ci6n uniforme; es probable que cnda roco que se muestra en Ia con tell· ga >300 hurqtli lla~ de replicacion. Los focos podrian represenrar esrrucwra!i fijas a craves de las cuales debe n10verse el DNA en replicaci6n.

En las levaduras pueden aislarse los origenes de replicaci6n Conceptos principales Los origenes de S. cerevisioe son secuencias cortas ricas en A-T que ticnen una secuencia esencial de 11 bp. El ORC es un complejo de seis proteinas que se une a una ARS.

384

CAPITULO 15 El replic6n

Cualquier segmemo de DNA que Lenga un origeL debe estar en condiciones de replicarse: por lo tanto, aunque los plasmidos son muy poco Erecuemeen las eucariota~. puede ser posible consLn.llrlos pr media de una manipulaci6n apropiada in vitro. Est sc ha logrado en las lcvaduras, aunque no en Ia eucariota~ superiores. Los mU£antes de S. cerevisiae pueden ser Ntran. forma<.! us" en su fenotipo silvestre con ta adid6n d DNA que rranspone una copia silvesrre del gen. -;: descubrimiemo de los orfgenes de las levaduras tu· iugar cuando se observ6 que algunos fragmenLos DNA de las h•vaduras (cuando forman un drcu: SOI1 Lapaces de tran~formar las celulas defectuO. · con mucha eficicncia. Estos frngmemos pueden >< brevivir en Ia celula en estado no integrado (am nomo), es decir, como plasmidos aULorreplicamc Uu !ragm en to transtonname de alta Erecuen~. posee una secuencia que le da la c<Jpacidad de rer cru·se eficicmernente en las levaduras. Esre segmen sc clenomina ARS (atllOitOmously replicating seq lit?! secuencia de replicacion aut6noma). Los elemer ARS se derivan de origenes de replicacion. [n los casos en los que los elementos AR: han mapeado de manera sistematica en regit.cromos6micas l''Xtensas, parece que SOlO algL de ello!> en realidad se aprovechan para inida· replicaci6n. Los otros son silendosos o quiza se !teen con poca (recuencia. Si es verdad que alg'.;orfgenes tienen probabilidades variables de ser lizados, tam poco podrla haber rem1inales fijas e:los rcrlicones. En estc caso, una region dada d _ cromosoma podrfa ser replicada desde orfgenes
~ntes de Ia replicaci6n, el nucleo contiene factor de oompetencia activo

Fase G1 temprana

ORC

DV/\DVNJ , · '!tflWfi\fi"VA ~ ··:

.

Cdc6

~···

!"-

Despues de Ia replicaci6n, el factor de competencia : que se encuentra en el nucleo es inactivo; el factor de competencia del citoplasma no puede entrar al nucleo

/NNJ~

!

~

FaseS

/A(;V/YA'\. La disoluci6n de Ia membrana nuclear durante Ia mitosis permite que el factor de competencia se asocie al material nuclear

Complejo de pos(eplic;ac16n

/~

/W~ Fase G2

/N.IVNTVJ

\!At)~

J'VA~ \

ORC \{AVfi\1)~

I

ORC

........................ La division celula r genera nucleos hijos competentes para respaldar Ia replicaci6n

El factor de competencia que se encuentra en -,jcleo es desactivado despues de La replicaci6n . Un nuevo : stecimiento de factor de competencia puede entrar solo -E-do se rompe La membrana nuclear en La mitosis.

erdese que el ORC es un complejo de 400 kD _e se une a la ARS de S. cerevisiae (vease !a secci6n ~ - , En las levaduras pueden aislarse los orfgenes -= <eplicaci6n). El origen (ARS) esta formado por _ secuencia de consenso A y por t.res elementos vease la Figura 15.12). El ORC de seis protef,;.s (de las cuales todas son codificadas por genes :::tciales) se une a la secuencia A y al elemento ·acente B 1. Se necesita ATP para la uni6n, pero .:e no es hidrolizado basta alguna etapa posterior. : !actor de transcripci6n ABFl se une al elemento - ;- esto ayuda a la iniciaci6n, pero son los sucesos _e tienen lugar en los elementos A y B1 los que en ::alidad provocan la iniciaci6n. La mayor parte de orfgenes estan ubicados en las regiones que se -:cucntran entre los genes, lo cual indica que quiza -a importanre para que Ia estructura de la cromati-_; local em~ en una cond.ici6n no transcrita. La ca ractens r.ica sobresali ente es que el ORC -manece unido al origen en todo el ciclo celu ~ No obstante, los cambios ocurren en el patron ;; protecd6n del DNA como resultado de Ia union

/../¥JWF\bYI

.(

....

' YAVJ'YIYA

Las proteinas del origen controlan la susceptibilidad a La iniciaci6n.

de otras protdnas al complejo ORC-origen. La resume el ciclo de los sucesos que tienen Iugar en el origen. AI final del cido celuJar, el Ol~C esta unido a ABl y genera un patron de protecd6n in vivo similar al que se observa cuando se une a! DNA libre in vitro. En u~rminos basicos, la region que atraviesa A-B l esti!i proregida contra la DNAasa, pero hay un sirio hipersensible en el centro de Bl. Durante Gl este patron cambia, mas notablememe por Ia perdida del sitio hipersensible. Esto se debe ala union de la proteina Cdc6 a! ORC. En las levadu ras, Cdc6 es una prot.eina muy inestable, con una vida media de menos de 5 min. Se sin teliza duranre G1 y suele unirse al ORC entre Ia salida de Ia mitosis y Ia etapa Gl tardia. Su rapida degradaci6n significa que no hay protein a d.isponible despues eo el ciclo. En las celulas de los mamfferos, se comrola de manera djsti.nta; esta fosforilada durante la fase S y como resultado es exportada desde el nucleo. La protefna Cdc6 proporciona Ia conexi6n entre el ORC y un complejo de proteinas que partidpa en la competencia y en la inidad6n. Cdc6 tiene actividad ATPasa indispensable para que respalde la inidaci6n. 15.9 El factor de competencia esta formado por proteinas MCM

387

Cienos mutantes de levaduras nospermiten conocer el sistema que controla la disponibilidad del factor de competencia. Las mmaciones que se pre sentan en el factor de competenci.a pueden impedir Ia iniciaci6n de Ia replicaci6n. Asi' es como las mll· tadones actuan en las protefnas de mantcnimiento del miniuomosoma (mil'tichromosome maintenance, MCM) 2, 3 y 5. T.as mutaciones que ocurren en el sistema que desacriva el faaor de competencia despues del inicio de la repli<.:aci6n del>ett perm ili r la acumulaci6n de camidades excesivas de DNA, parque la presencia continua de facror de compewncia penniTe que suceda la replicaci6n. Dichas mUlaciones sc observan en los genes que codifican los componemes del sistema de ubiquirlnad6n encargado de Ia Jegradaci6n de cienas protefnas. Esto sugiere que el factor de competencia puede ser desn·uido despues del inicio del ciclo de replicaci6n . Las protefnas MCM2, 3 y 5 son necesarlas para Ia replicad6n y entran al nudeo SOl() duranle Ia mitosis. En las celulas ani males. se encuenrran homologos, en donde MCM3 esra unida al matetial cromosomico ames de la replicaci6n, pero es liberada despues de Ia replicaci6n. El compJejo MCM2, 3, 5 de Ia celula animal permanece en el mkleo dura11te el cido celular, lo cual sugiere que puede ser un componente del factor de competencia. Otro componenre, capaz de emrar solo en la mirosis, puede requerirse para que el complejo MC.'\12, 3, Sse asocie al marerial cromos6mico. En las lcvadu ras, Ia presencia de Cdc6 en el origen permite que las protefnas MCM se uuan a l complejo. Su presencia es indispensable para que ocurra la iniciad6n en el origl.'n. En consecuencia, el origen entra a la fase S como un com plejo de prerrepllcaci6n, el cual comlene el ORC y las protefnas Cdc6 y MCM. Cuando oc1.nre Ia iniciaci6n, Cdc6 y MCM son desplazadas y e! origen regrt"sa a l estado de complejo de posreplicaci6u, el cual conriene solo e1 ORC. La proteina Cdc6 f'S degradada con rapidez durante Ia fase 5; por lo tanto, no est
CAPITULO 15 El replic6n

en forma de anillo alrededor del D.· Algunas de las prorefnas del ORC tienen si mili ~ ues con las prmelnas de repli\aci6n que cargan DNA con la polimerasa de DNA. Rs posible q el ORC ulilice Ia hidr6lisis de ATP para cargar DNA coo el anillo MCM. En los extractos de Xeo ptts, Ia replicaci6n puede iniciarse si el ORC es elim nado despues de que ha cargado las proteinas CG, y MCM. Esto muestra que Ia funci6n principal u ORC es identificar el origen a las prmefnas CdccMCM que controlan Ia iniciaci6n y Ia competenc. Las protefnas MCM son indispensables para elongaci6n y para la lniciaci6n, y continuan func nando en la horquilla de replicacion. Su particip cion exacta en Ia elongaci6n no es clara, pero ur posibilidad es que cont ribuyan a Ia actividad de l1elicasa que desenrol la el DNA. OLra posibilidad que anucn como u11a defe-nsa avanzada que aa t:n Ia cromatina para pennitir que una helicasa ::. tue en el DNA.

Los lazos D mantienen los origenes mitocondriales Conceptos principales • Las rnitocondrias utilizan diferentes secuencias de origen para iniciar Ia replicaci6n de cada cadena del DNA • La replicaci6n de la cadena H inicia en un lazo D. La repticaci6n de Ia cadena Linicia cuando su origeh queda expuesto por el rnovimiento de la primera horquilla de replicaci6n .

Los orfgent::S de los replicones en los cromosorr eucari6ticos y procari6ricos son estructuras esta· cas: estan formadas por secucncias de DNA que s reconocidas en su [orma duplex y son uTiliza nal del DNA. En las mitocondrias se observa umganizaci6n difereme. La rep1icaci6n comienza en un origen especw~ localizado en el DNA duplex circular. Sin embarE en u.n inicio solo una de las dos cadenas progel"': 1 oras (la cadena H en el DNA mirocondrial de ~ mamiieros) sirve C(>mo rnolde para Ia slntesis de u: cadena nueva. La sfmesis continua solo una disra~ cia corta y desplaza a la cadena compafi.era origil' (L) , la cual permanece como cade na ind ividua. como se ilustra en Ia . La condici6n esta region da origen a su nombre, lazo de desplrc miento, o lazo D. Las po lirncrasas de DNA no pueden inldar sfmesis, sino que requieren un exrremo 3' con ac

lnyocct6n del nucleo al ovocito

El DNA en el nucleo tiene una densldad ngera

denstdad

.,._

El DNA so replica en presencia de precursores pesados

La replicaci6n semiconservadora genera DNA de densidad hibrida

Permeabilizaoi6n oe Ia onvoltura nuclear

El segundo ciclo de replicaci6n genera DNA pesado y DNA hlbrido

Un nuc.eo inyectado en un ovodto de Xenopus puede replicarse solo una vez a menos que la membrana nuclear sea permeabilizada para permitir cidos subsiguientes de rlicadon. porIa presencia ck un reprc~or que impida la replicacion repeLida en los orlgenes que han sido urilizados. Las preguntas cruciales con respecto a Ia n aturaleza de esLe sisLc ma regulador son: c.c6mo determina el sistema si un o rigcn particular ha sido replicado? y c_quc componen tes procefnicos imervienen? Se ha conocido un poco Ia naturalez.a de los componemes protefnicos al utihzar un sistema en e l cual un DNA susrrato experimema un solo ciclo de replicaci6n. Los ovocitos de Xenopus tienen todo~ los componcnres necesarios para replicar el D 'A (en las primrras horas posteriores a la ferti lizaci6n realizan ll ciclos de division sin Ia expresi6n de genes nuevos) y pueden replicar el DNA en un nucleo que co; inyt'clado al ovoci10. La resume las caracterfsticas de este sistema. Cuando un espermatozoide o nudeo en interfa~c e~ i11yeC£ado a un ovociro, su DNA se replica s6lo una vez (cste episodio puede rastrearsl' con una eriqueta de densidad, del mismo modo que en eJ t.:Xpt·rimemo original en e~ que se defini6 La re· plicaCI6n semiconscrvadora, mostrado ames en Ia 386

CAPITULO 15 El reolicon

Figura I .12). Si en el ovociro se bloquea Ia sfntesis de protefnas, Ia membrana al redcdor del material in yecrado permanece intacta y el DNA no puede replicarse de nuevo. No obstame, en presencia de simesis proreinica, la membrana nuclear se rompe del mismo modo como lo harfa en una division celular normal, y en este caso pueden ocurrir ciclo~ subsiguientes de replicaci6n. El mismo resultad pucdc lograrsc con agentes qut: permeabilicen la membrana nuclear. Esto sugiere que el nucleo couticne una protdna (o prorefnas) indispensable para Ia replicaci6n que sc consume de alguna maner.:; por un ciclo de replicaci6n, por lo que aunque haya mas protefna en cl ciLoplasma del ovocito, esta s61 puede enrrar al nucleo si Ia memb rana nuclear sc rom pe. En principia eJ sis tema puede ser llevad aun mas lejos si sc desarroll a in vitro un extract que respalde la replicaci6n nuclear y pennita asf e aislaruien Lo de los compo nemes del ex rracto y 1.:. identificaci6n de los facLOrCS relevantes. La explica el conrrol de la reinida cion al proponer que esta pro[eina es un factor d e compctcn cia. EsL.cl prcsc111e e n el nucleo ames de ;;. replicaci6n. Un cido de replicad6n desactiva o de•truye el factor. y no puede ocurrir otro dclo h ast: que se prororcione mas factor. El factor localizaa en el ciroplasma puede acceder al material nuclea solo en Ia mitosis subsiguicnte cuando se rompa ~ envolrura nuclear. Este sistema regulador cumr dos prop6sitos. AJ elirninar un componeme necesar: despues de Ia replicaci6n. i.mpide que ocurra mas.:: un dclo de replicad6n. Tambien constituye un l~ de retroalimenraci6n C]Ue hace quf' Ia iniciaci6n de replicaci6n dependa del paso porIa division celula

B1J

El factor de competen cia est: formado por prote1nas MCM

Conceptos principales • El ORC es vn complejo de protelnas que esta asociado a los origenes de las levaduras durante todo el ciclo celular. • Cdc6 es una proteina inestable que se sintetiza solo e-G1.

• Cdc6 se une al ORC y permite Ia union de Las protelno~ M( M. Cuando La rlicacion se inicia, las proteinas Cdc6 y MCMson despla1adas. La degradacion de Cdc6 impide Ia reiniciad6n. • Algunas proteinas MCM se encuentran en el nudeo durante el ciclo, pero otras pueden entrar solo desp1.1o. de Ia mitosis.

El episodic fundamental en el control de Ia recaci6n es Ia actuaci6n del ORC en el origen. -:-

llad cebadora (vease la secci6n 18.8. La acrividad !:ladora es nccesaria para comenzar Ia slotesis de _"A) . La replicacion en el origen deJa cadcna H ~nici a cuando la polimerasa de RNA transcribe . . , ceb<1dor. Los exrremos 3 · son generados en el bador por medio de una endonucleasa que diJe el hfbrido de DNA-RNA en numerosos sitios crelOs. La endonucleasa es espedfica para la es--::aura triple fonnada por el hfbrido de DiM -RNA as la cadena Individual de DKA desp~azada. Des .a!s, Ja polimerasa de DNA extiende el extrema 3' in terior del DNA. En las mitocondrias de los mamiferos se eucuena un solo lazo Den forma de una abertura de 500 oOO bases. La cadena cona q1.Je mantiene ella70 _ es inestablc y se volrea; a men udo es degradada y ntetizada de nuevo para mantener Ia abenura del Jplex en esle sitio. Algunas mo!eculas de DNA mi-cood rial poseen numerosos lazos D, lo cua l refleja • uso de multiples orfgenes. El mismo mecanismo .= emplea en eJ DNA de los cloroplasLOs. en donde ay dos lazos D (en las plantas superiores}. Para replicar el DNA milocondrial de los rna-Heros, Ia cadena cona localizada en ellazo D se --:tiendc. La region rlesplazada de Ia cadena L ariz nal se alarga y amplfa el lazo D. Esta expansion . ontimia hasta llegar a unos dos tercios del txayecto rededor del cfrculo. La replicaci6n de esta region <pone un origen en la cadena L desplazada . La :mesis de una cadena H inida en esre sitio. el cual :-s utilizado poi una prirnasa especial que simeriza .....t1 RNA cono. Despues, el RNA es extendido por la olimerasa de DNA y avanza alrededor del molde _e Ia cadena individual L desplazada en Ia direcci6n puesta a Ia sfmesis de Ia cadena L. Como resultado del rezago en su inicio, la sfn·esis de Ia cadena H habra avanzado solo un terdo lel trayecro alrededor del cfrculo cuando Ia sfmesis _e Ia caclena L finaiJce. Esto libera un circulo duplex rompleto y un cfrculo hendido, el cual permancce ardalmente en forma de cauena individuaJ hasta -ue la sfmesis de la cadena H concluye. Por ultimo, as cadenas nuevas se sellan para formar estructuras ..rnactas en term.inos covalemes. La existencia de los lazos D da Iugar a un prind"'io general: Un origen p11ede ser una secuencia de DNA.

El cebador de RNA inicia Ia repllcaci6n en el origen en Ia cadena H

lnicio de Ia sfntesis de RNA

I Cadena H 3' 1-- RNA dividido

Cadena L

-

La sinlesis de una cadena L nueva crea un lazo 0 al desplazar a Ia cadena progenitora

'

El DNA es sintetizado

Ellazo D se expande

l

Cuando Ia cadena desplazada pasa at origen en Ia cadena L, lnicia Ia slntesls de Ia nueva cadena H

~ Origen de Ia cadena L

La conclusion de Ia cadena L nueva llbera los genomas hijos

I

\

La conclusion El genoma llberado es genera un ClfCUIO duplex parcialmente repllcado

I

La conclusion genera un circulo duplex ..

"" Se sellan las separaciones de las cadenas nuevas

l '

~

El lazo D mantiene una abertura en el DNA mitocondrial de los mamiferos, la cual separa los origenes para la replicacion de cada cadena.

secci6n 16.4, Los cfrculos rodantes protlucen mulr.lmeros de un repUcon).

·ue sirve para iniciar fa sfntesis de DNA wilizando una -.rdena como molde. La abenura del duplex no siem-

£EIIl

"re conduce a la in.idad6n de la repJicaci6n en la ·tra cadena . En el caso de la replicacion del DNA mitocondrial, los orfgenes para replicar las cadenas .::omplementarias se encuentran en localizadones .iiferentes. Los origenes que faciliran la replica::ion de solo una cadena tambien se encuentran en .a [on:na de replicad6n del drculo roclante (vcase la

El cromosoma complete se replica una vez en cada cido de division celular. La inidaci6n de Ia replicaci6n obliga a la celula a experimemar un cido de divisi6n; Ia conclusion de Ia replicaci6n puede desencadenar el proceso de division en sf. El cro roosoma bacteriano esta formado por un solo replicon, pero un cromosoma eucari61ico se divide

Resumen

15.11 Resumen

389

en nurnerosos replicones que Iuncionan duran1 e el prolongad o perioclo de la fase S. El problema de replicar los exrremos de un replic6n lineal se resuelve en una variedad de formas. con mayor frecuenda al convertir el replic6n en una forma drcular. Algunos virus ticnen protctnas espedales que reconocen los extremes- Los cromosomas eucari6ticos confrontan este problema eo sus replicones terminales. El origen mfnimo de E. coli esta fonnado por -245 bp e inicia Ia replicad6n de forma bid.ireccional. Cualqu ier molecula de DNA con esta secuencia puede replicarsr e n E. coli. Dos horquillas de replicad6n abandonan el o rigen y se desplazan alrededor del cromosoma. al pa recer hasta que se encuentran, aunque se han identifkado las secucncias terque ha rlan que las horquillas rerminaran despues de e nron trarse. Las unidadcs de transcripci6n estan. organizadas de tal manera que Ia transcripci6n prosigue casi siempre en Ia m.lsma direcd6n que la replicacion. La replicacio n cucariori<:a es al menos un arden de magnitud m as lema que la rlicaci6n bacteriana. Los origeues facilitan Ia replicad6n bidireccio nal y tal vez se u tili cen ('II un orden predetenninado durante la fase S. Los orfgencs deS. cerevisiae tienen una secuencia nuclear de consenso formada por 11 pares de bases, en su mayor pane A-T. Despues de Ia d.lvisi6n celular, los nucleos de las cclulas eucari6ticas tienen un factor de competeoda indispensable para iniciar Ia rllcaci6n. Su destrucci6n de~pues de Ia in.lciad6n de Ia replicaci6n impide que ocurran ciclu!> clc replicad6n posteriores en las levaduras. El factor de competencia no puede ser itnportau<J al interi or del mkleo desde el ciroplasma y puede ser remplazaclo solo ruando Ia membrana nuclear se rompe duranre la mitosis. En las lcvaduras, e l origen es reconoddo por las prorelnas del ORC. las cuales permantcen unida~ durante cl ciclo celular en las levaduras. La protelna Cdc6 esta disponible solo en Ia £ase S. En las levaduras es sintetizada durante la fa se S y se degrada con rapid ez. En las celulas animales se o:;intetiza de manera rontinun, peru es ex.portada desde e l nudeo durame Ia fase S. La presenda de Cdc6 permite que las protcinas MCM se unan al origen. Las proteinas MCM son indispensables para Ia iniciaci6n. La acci6n de las proteinas Cdc6 y MCM constituyen Ia funci 6n de compctencia.

Referencias

1111

Introducci6n

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390


IIIJ

Los replicones pueden ser lineales o circulares

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IIIJ

Es posible elaborar el mapa de los origenes con autorradiograna y electroforesis

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lllil

Cada cromosoma eucari6tico contiene numerosos replicones

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1111

En las levaduras pucden aislarse los origenes de replicaci6n

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llJI!l

Los lazos D mantienen los origenes mitocondriales

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Referencias

391

Replicones extracromos6micos ESQUEMA DEL CAPITULO

Ifill Introducci6n 11ft

lnm)

Los extremos del DNA lineal representan un problema para la replicaci6n

• La infecci6n por la bacteria A. tumejaciens puede transformar las celulas de las plantas en tumores. • El agente infeccioso es un plasmido transportado par la bacteria . • El plasmido tambien porta genes para sintetizar y metabolizar las opinas (derivados de la arginina) que utiliza la celula tumoral.

• Para replicar la cadena de DNA con un extrema 5' se necesitan arreglos especiales.

11m

Las prote\nas terminates permiten la iniciaci6n en los extremos de los DNA v\ricos • Una proteina terminal se une at extrema 5' del DNA y proporciona un nucle6tido de citidina co n un extrema 3'-0H que ceba ala replicaci6n.

liD

1m El T-DNA porta los genes necesarios para la infecci6n

Los c\rculos rodantes producen mult\meros de un rreplic6n

• Parte del DNA del plasmido Ti se transfiere at nucleo de .; celula de la planta. • Los genes vir del plasmido Ti se localizan fuera de la region transferida y son necesarios para el proceso de transferencia. • Los genes vir son inducidos por compuestos fen6licos liberados por las plantas en respuesta a lesiones. • La proteina de membrana VirA se autofosforila en la histidina cuando se une a un inductor. • La proteina VirA activa a la proteina VirG at transferirle ~ grupo fosfato. • VirA-VirG es uno de los numerosos sistemas bacterianos de dos componentes que utilizan un regulador de fosfohistidi na.

• Un circulo rodante genera multimeros de las cadenas de la secuencia original.

IIR

Los c\rculos rodantes se utilizan para replicar los genomas de los fagos • La proteina X A es una relaxasa de actuaci6n en cis que genera circulos de cadena individual a partir de la cola producida por la replicaci6n por circulos rodantes.

IDI!I

El plasmido F es transferido por conjugaci6n entre bacterias • Un factor F libre es un replic6n que se mantiene en el nivel de un plasmido por cromosoma bacteriano. • Un factor F puede integrarse al cromosoma bacteriano, en cuyo caso, su propio sistema de replicaci6n es suprimido. • El factor F codifica a pili especificos que se forman en la superficie de la bacteria. • Un pilus F permite que una bacteria F positiva e a una bacteria F negativa y se inicie la conjugaci6n.

lmfll

La conjugaci6n transfiere DNA de cadena individual • La transferencia de un factor F inicia cuando la replicaci6n por circulos rodantes empieza en oriT. • El extrema 5' inicia la transferencia en la bacteria receptora . • El DNA transferido se hace bicatenario en la bacteria receptora. • Cuando un factor Festa libre, la conjugaci6n "infecta" a la bacteria receptora con una copia del factor F. • Cuando se integra un factor F, la conjugaci6n provoca la transferencia del cromosoma bacteriano hasta que el proceso es interrumpido por rotura (aleatoria) del o entre el donador y la bacteria receptora.

392

El plasmido bacteriano Ti provoca la enfermeda de agalla de Crown en las plantas

Dl!J

La transferencia del T-DNA es semejante a la conjugaci6n bacteriana • El T-DNA se genera cuando una hendidura en la fronter2 derecha crea un cebador para la sintesis de una nueva cadena de DNA. • La cadena individual preexistente que es desplazada po· la nueva sintesis es transferida al nucleo de la celula d~ planta. • La transferencia termina cuando la sintesis de DNA lleg;; ' una hendidura en la frontera izquierda. • El T-DNA es transferido co mo un complejo de DNA de cadena indi vidual con la proteina de union a la cadena individual VirE2. • El T-DNA de cadena indi vidual es transformado en DNA bicatenario e integrado al genoma de la planta. • Se desconoce el mecanisme de integraci6n. El T-DNA pL ~> ser utilizado para transferir genes al interior del nucleo : =. una celula vegetal.

1m1D Resumen

Introducci6n :-.a bacteria puede ser el hospedador de unidades -- er.icas de replicacion independiente, ademas de su - :nosoma. Estos genomas extracromosornicos son : os tipos, plasrnidos y bacteriofagos (fagos). Algu;. plasmidos y todos los fagos tienen la capacidad de _!1sferirse de una bacteria donadora a un receptor :- un proceso infeccioso. Una distincion importante - :re ellos es que los plasmidos existen solo como ge :nas de DNA libres, mientras que los bacteriofagos ;) virus que empacan un genoma de acido nucleico -- una envoltura de protema y son liberados de la .:.:teria al final de un ciclo infeccioso. Los plasmidos son moleculas circulares de ::. _-A autorreplicantes que se mantienen en la celula =-·_ un nCtmero de capias estable y caracterfstico, es .ecir, que se mantiene constante de generaci6n en _:-neraci6n. Los plasmidos de copia individual man::nen la misma cantidad respecto del cromosoma ~cteriano hospedador, uno por cada unidad bacte-:ana, y como el cromosoma hospedador, se basan c:--. un mecanismo especffico para ser segregados _;: manera equivalente en cada division bacteria-:a. De los plasmidos de capias multiples hay varias r unidad bacteriana y pueden ser segregados a las : Kterias hijas de forma estocastica (es decir, hay _·Jficientes capias para que cada celula hija siempre d quiera algunas en una distribucion aleatoria). Los pliisrnidos y los fagos se definen por su capa.:! ad para residir en las bacterias como unidades ge_ ' ticas independientes. No obstante, algunos plas:::::lidos y ciertos fagos tambien pueden existir como -ecuencias en el genoma bacteriano, cuyo caso, la ::1isma secuencia que constituye al plasmido indeendiente o al genoma del fago se encuentra dentro iet cromosoma yes heredada como cualquier otro ;en bacteriano. Se dice que los fagos que forman arte del cromosoma bacteriano ex hi ben lisogenia, ~n tanto que los plasmidos con capacidad de comoortarse de esa manera se denominan episomas. ~os fagos y los episomas utilizan procesos relacio:-~ados para insertarse en el cromosoma bacteriano -.- ser escindidos de eL · Una similitud entre los fagos lisogenicos, los lasmidos y los episomas es que mantienen una posesion egofsta de su bacteria y con frecuencia impiien que otro elemento del mismo tipo se establezca. Este efecto se denomina inmunidad, aunque la base molecular de la inmunidad por plasmidos es diferente de Ia lisogenica y es consecuencia del sistema de control de la replicacion. En la Figura 14.2 se resumen los tipos de unidades geneticas que pueden ser propagadas en las bacterias como genomas independientes. Los fagos 'ticos pueden tener genomas de cualquier tipo de

acido nucleico y se transfieren entre las celulas por la liberacion de partfculas infecciosas. Los fagos lisogenicos tienen genomas de DNA de doble cadena, igual que los plasmidos y los episomas. Algunos plasmidos se transfieren entre las celulas mediante un proceso de conjugacion (con o directo entre las celulas donadoras y receptoras) . Una caracterfstica del proceso de transferencia en ambos casas es que ocasionalmente algunos genes hospedadores bacterianos son transferidos con el DNA del plasrnido o con el fago, de modo que la funci6n de estos eventos es permitir el intercambio de informacion genetica entre las bacterias . La caracterfstica fundamental en la determinacion del comportamiento de cada tipo de unidad radica en como se utiliza su origen. En un cromosoma bacteriano o eucari6tico, un origen permite iniciar un solo evento de replicacion que abarca el replicon, sin embargo, los replicones tambien pueden ser utilizados para fomentar otras formas de replicacion. La alternativa mas com(m es utilizada por las pequefias unidades de replicacion independiente de los virus. El objetivo de un ciclo de replicacion virica es producir muchas capias del genoma vfrico antes de que Ia celula hospedadora sea lisada para liberarlas. Algunos virus se replican de Ia misma forma que un genoma hospedador, con un evento de iniciaci6n que da Iugar ala produccion de capias duplicadas, cada una de las cuales vuelve a replicarse despues, y as( sucesivamente. Otros utilizan una forma de replicacion en la cual se producen numerosas capias a manera de matriz en tandem despues de un solo evento de iniciaci6n . Los episomas activan un evento similar cuando el DNA de un plasmido integra do deja de ser inerte e inicia un ciclo de replicaci6n. Muchos replicones procarioticos son circulares, caracteristica necesaria para las formas de replicacion qu e producen multiples capias en tandem. Sin embargo, algunos replicones extracromosomicos son lineales, en cuyo caso se tiene que considerar la capacidad de replicar el extrema del replic6n. (Obviamente, los cromosomas eucarioticos son lineales, de modo que en los replicones existe el mismo problema en cada extrema, aunque dichos replicones tienen un sistema especial para resolverlo.)

Los extremos del DNA lineal representan un problema para la replicaci6n Concepto principal • Para replicar La cadena de DNA con un extrema 5' se necesitan arreglos especiales.

16.2 Los extremos del DNA Lineal representan un problema para la replicaci6n

393

5' -

3'

Cadena nueva sintetizada en direcci6n 5'-3' 5' 3jSalida

La replicaci6n podria salir del extrema 3' de una cadena lineal recien sintetizada, pero (podria iniciar en el extrema 5'?

Ninguno de los replicones analizados hasta ahora tiene un extrema lineal, todos son circulares (como en los genomas de E. coli o de las mitocondrias) o forman parte de unidades mas largas de segregacion (como en los cromosomas eucarioticos), pero sf hay replicones lineales, en algunos casas como unidades extracromosomicas individuales y, por supuesto, en los extremos de los cromosomas eucarioticos. La capacidad de todas las polimerasas conocidas de los acidos nucleicos, DNA o RNA, para proceder solo en direcci6n 5'-3', constituye problema para sintetizar el DNA en el extrema de un replicon lineal. Considerense las dos cadenas progenitoras ilustradas en !a I U .1 ; !a cadena inferior no tiene problema, puede actuar como molde para sintetizar una cadena h ija qu e llega directamente a! extrema, donde presumiblemente se desprende la polimerasa. Sin embargo, para sintetizar un complemento en el extrema de la cadena superior, la sintesis debe comenzar justa en la ultima base, de lo contrario, esta cadena se h ara mas corta en los ciclos sucesivos de replicacion. Se desconoce si la iniciacionjusto en el extrema del DNA lineal es posible, en gen eral se piensa que una polimerasa se une a un sitio que rodea a !a posicion en Ia cual debe incorporarse una base, de modo que debe emplearse un mecanismo especial para la replicacion de los extremos de los replicones lineales. Es posible imaginar numerosas soluciones para dar cabida a !a necesidad de copiar un termino: • El problema puede ser evadido transformando un replicon lineal en una molecula circular o multimerica, mecanismos u tiliza dos por fagos como T4 o 'A (vease la seccion 16.4, Los drculos rodantes producen multfmeros de un rep!icon). • El DNA puede formar una estructura inusuaL por ejemplo, a! crear una horquilla en el termino, de manera que no h ay un extrema libre. La formacion de una ligadura cruzada esta implicada en la replicacion del DNA mitocondriallineal de Paramecium. 394

CAPITULO 16 Rep licones extracromos6micos

• El extrema puede ser variable y no dete·minado con precision. Los cromosomas e _ carioticos suelen adoptar esta soluci6n, ela cual cambia el numero de capias de u- , unidad corta repetitiva, localizada en el e- tremo del DNA (vease la secci6n 28 .18, L: telomeros son sintetizados por una enzir:: ribonucleoprotefnica ). Un mecanismo pa;: agregar o eliminar unidades hace innece ' ria !a replicacion hasta el extrema. • Una protefna puede intervenir para haec posible !a iniciacion en el extrema. Numer ~ sos acidos nucleicos vfricos tienen protem~ ligadas de manera covalente a la base termi;: · 5 '. Los ejemplos mejor caracterizados sL~ el DNA del adenovirus y el del fago
Las prote1nas terminales permiten la iniciaci6n en los extremos de los DNA v1ricos Concepto principal • Una prote\na terminal se une al extrema 5' del DNA y proporciona un nucle6tido de citidina con un extrema 3'-OH que ceba a la replicaci6n.

El DNA del adenovirus y el del fago q>29 son ejerr_plos de iniciaci6n en un extrema lineal, que de hecho se replican desde los dos extremos utilizando e. m ecanismo de desplazamiento de cadena que so:ilustra en !a r J . En cualquiera de los extremos pueden tener Iugar de manera independiem~ los mismos eventos. La sfntesis de una cadena nueva empieza en un extrema y desplaza a Ia cade1 ~ homologa qu e previamente estaba apareada con e duplex. Cuando la horquilla de replicacion llega ~ otro extrema de !a molecula, la cadena desplazadc. se libera como una cadena individual libre, event que requiere de !a formacion de un origen duple_: por apareamiento de bases entre algunas secuencias complementarias cortas de los extremos de !2 molecula. En varios virus que utilizan dichos mecanismos hay una protefna adherida de forma covalente 2 cada extrema 5' . En el caso de los adenovirus, una. proteina terminal esta ligada con el DNA vfrico maduro mediante un enlace fosfodiester con la serina, como se indica en la • J c:.Como supera la adhesion de Ia protefna el problema de la iniciacion? La proteina terminal tiene dos actividades, transportar la citidina que proporciona el cebador y estar asociada con Ia polimeras2 de DNA . De hech o, Ia ligadura de una protefna terminal a un nucleotido es llevada a cabo por la poli-

Serina o H I

II

H

C

/ N '-...._ 1/

Polipeptido

"

C

Polipeptido

5' ~~~~. .~~~~~~~ 3' -.wu~~aw-.~~w..w_.~~ 5'

La

horqui\la avanza

5'c;opr,.,..~~IJ'Illll'""-

s·.......i"i":i'=i"'"!'l"!!"f'T.P

• ~~"""!1"'!1"!,-pJI!'!I"!l!"P''',.,.,

3'

3··~~~~ww~~~~ww.-~~~ 5·

0

OH

I

3' 5' "rrTT.'i'TJ"YYIII":t'T~FF.i~~FT.i'~i"'.i'l'T:T~

3' 4r..WW::i!:il:iY=IIWOI:I:il::il::iloi!::loi!::!:ij!:.i!:l!::i!:lo!.ill:il::illlo~ 5'

~ Los terminos se aparean para formar un origen duplex

I

DNA del adenovirus

El fosfato terminal 5' de cada extrema del DNA del adenovirus esta ligado de manera covalente a una serina de la proteina de union al Ad de 55 kD.

5'

3'

5' 3··.1AiloolloOI.W.W...................................................,;. 5'

JR 2 La replicaci6n del DNA del adenovirus se inicia aradamente en ambos extremos de la molecula y procede : : - desplazamiento de la cadena. -~

"''I"'"'J~I'I'I"P!I"''I'I"'P'7 3'

.............w.:..wo.:.....t:4ilblolo...... 5' ~ erasa

de DNA en presencia del DNA del adenovifenomeno que sugiere el modelo ilustrado en la URA ~ . El complejo formado por la polimerasa ~e DNA y ra proteina terminal, que porta el nu:...eotido C cebador, se une al extremo del DNA del :denovirus. El extremo 3'-0H libre del nucleotido = se utiliza para cebar la reaccion de Ia elongacion ediante la polimerasa de DNA, lo cual genera una - :..teva cadena cuyo extremo 5' se liga de manera : valente con el nucleotido C iniciador. (De hecho, ~ reaccion implica el desplazamiento de la protei- a del DNA y no una nueva union. El extremo 5' :el DNA del adenovirus esta unido a la proteina . ;:rminal utilizada en el ciclo previo de replica cion. ....a protefna terminal antigua es desplazada por la -ueva en cada nuevo ciclo de replicacion.) La proteina terminal se une a la region que se ' Caliza entre los pares de bases 9 y 18 des de el ex::-emo del DNA. La region adyacente, localizada en- .!S,

,:>,I"PP,.""''I"''''...,~ 3' ....WO.W.:~d.W.w.IIOiW.:w.ilo...... 5'

•••• pppA -Ser·C-OH 3'-HO-GpTpApGpT----------La proteina terminal del adenovirus se une al extrema 5' del DNA y proporciona un extrema C-OH para cebar la sintesis de una nueva cadena de DNA.

tre las posiciones l 7 y 48, es esencial para la union de una protefna hospedadora, el factor nuclear I, que tambien es necesario para la reaccion de ini-

16.3 Las proteinas terminates permiten la iniciaci6n en los extremos de los DNA viricos

395

ciaci6n. Por consiguiente, el complejo de iniciaci6n puede formarse entre las posiciones 9 y 48, distancia fija a partir del extrema del DNA.

Bit

Los circulos rodantes producen multlmeros de un replic6n

Concepto pri ncipal • Un circulo rodante genera mult\meros de cadena individual de la secuencia original.

Las estructuras generadas por el replic6n dependen de la reacci6n que se produzca entre el molde y !a horquilla de replicaci6n. Las condicionantes fundamentales son si el molde es circular o lineal y si la horquilla de replicaci6n esta comprometida con la sfntesis de las dos cadenas del DNA o s6lo de una.

Eol molde es DNA duplex circular

r

La iniciaci6n ocurre en una cadena

(~ 3'-0H !

~

. , - - Hendidura en 5 -P el origen

El alargamiento de Ia cadena creciente desplaza a Ia cadena antigua

Q

Cadena creciente

La replicaci6n de una sola cadena permite ge1:: rar copias de algunas moleculas circulares. Una h didura abre una cadena y posteriormente el extrer:3'-OH genera do por !a hendidura es ampliado J: _ !a polimerasa de DNA. La cadena recien sintetiza · desplaza a la cadena progenitora original. Los eve: tos resultantes se describen en !a 'i . Este tipo de estructura se denomina eire rodante porque puede considerarse que el pu :u~ de crecimiento rueda en torno a Ia cadena eire lar que funciona como molde; en principia pod.-. hacerlo indefinidamente. Conforme se desplaza. horquilla de replicaci6n extiende la cadena extec · y desplaza al compafiero anterior. Vease !a micr. graffa electr6nica de !a El material recien sintetizado esta ligado de n ..onera covalente al material original, de modo que _ cadena desplazada contiene al genoma original esu extrema 5'. La unidad original va seguida de cue-quier numero de copias del genoma sintetizadas revoluciones cominuas del molde. Cada revoluci -desplaza al material sintetizado en el ciclo previo. El cfrculo rodante tiene varios usos in vivo; ela se muestran algunas de las rutas u· .lizadas para replicar el DNA. La division de una unidad de cola genera u ...:. copia del replic6n circular original en forma linea... La estructura lineal puede mantenerse como cadt· na individual o ser transformada en un duplex p medio de Ia sfntesis de la cadena complementaf : (cuya secuencia es identica ala de la cadena mol del circulo rodante original). El cfrculo rodante proporciona el medio pa::-: amplificar el replic6n (Ia unidad) originaL mec nismo que se utiliza para generar DNA ribos6mic(DNAr) amplificado en el ovocito de Xenopus. l genes del RNA ribos6mico (RNAr) se organizan ~

5'

I

Cadena desplazada Despues de una revoluci6n, Ia cadena desplazada llega a Ia longitud de una ' unidad

La elongaci6n continua genera una Cadena desplazada de multiples unidades

~

. .

r-'

t

/ • EL circulo rodante genera una cola multimerica de cadena individual.

396

CAPITULO 16 Replicones extracromos6micos

En las imagenes par microscop\a electr6nica, _c\rculo rodante seve como una molecula circular de cola line: . Cortesia de Ross B. Inman, Institute of Molecular Viroloc Bock Laboratory and Department of Biochemistry, Univers=:. of Wisconsin, Madison, Wisconsin, USA.

: . genoma como un gran numero de repeticiones :ontiguas. Una sola unidad repetitiva del genoma se ::-ansforma en un cfrculo rodante. La cola desplaza: a, que contiene numerosas unidades, se con vie rte -:-:1 DNA duplex; posteriormente se separa del cfrcude manera que los dos extremos pueden unirse :::.ra generar un gran cfrcu lo de DNAr amplificado, -:or lo tanto, el material amplificado consta de gran -.umero de unidades repetitivas identicas.

Los c1rculos ro dantes se utilizan para replicar los genomas de los fagos Concepto principal

perspectiva mas detallada de un ciclo de replicaci6n fagico centrado en el cfrculo rodante. El fago qJX174 esta formado por un DNA circular de cadena individual conocido como cadena positiva (+ ); por otra parte, se sintetiza una cadena complementaria denorninada cadena negativa (-). Por esta acci6n se genera el cfrculo duplex que aparece en !a parte superior de la figura, el cual es replicado posteriormente por un mecanismo de circu lo rodante . El circulo diiplex se transforma en una estructura cerrada de manera covalente, la cual se superenrolla. Una proteina codificada por el genoma del fa go, la proteina A, hace una hendidura en la cadena ( +) del DNA duplex en un sitio especifico que define el origen de la replicaci6n. Despues de que se forma

• La prote\na
La protefna A hace una hendidura en el origen

y se une al extrema 5' ~.a

replicaci6n por media de cfrculos rodantes es : mun entre los bacteri6fagos. Los genomas uni..;:rios pueden ser separados de !a cola desplazada generar mon6meros que es posible empacar en rticulas de fagos o utilizar para ciclos de replica::6n posteriores . En la se muestra una

Division de los multfmeros

d

......... Cadena+ : La replicacion del cfrculo rodante desplaza : a Ia cadena negativa

Sfntesis de DNA

Division en Ia unidad

I

/

Cadena individual multimerica

Duplex multimerico

'

La horquilla de replicacion rebasa el origen; • Ia protefna A hace una hendidura en el DNA : y se une a un extrema 5' nuevo

'

Unidad de cadena individuay I •

La cadena positiva liberada forma un cfrculo covalente Cadena individual circular

/

Duplex circular

J El destino de la cola desplaza da determina el tipo : :o productos generados por los c\rculos rodantes. La division de --3 unidad genera monomeros, que pueden ser convertidos en :..- :ructuras duplex o circulares. La di vision de los muLt\meros ;~1e ra una serie de capias repetidas en tandem de La unidad : -'ginal. Notese que la conversion a cadena doble podria ocurrir : -:es de que la cadena se desprenda del c\rcuLo rodante .

El RF del DNA de
16.5 Los c\rculos roda ntes se utili zan para replicar los genomas de los fagos

397

la hendidura en el origen, la proteina A se mantiene conectada con el extrema 5' que genera, mientras que el 3' es extenclido por la polimerasa de DNA. La estructura del DNA tiene una funcion importante en esta reaccion, pues solo puede ser hendido cuando este superenrollado negativamente (p. ej., enrollado en su eje espacial en sentido opuesto ala direccion de la doble he lice; vease la seccion 19 .12, El superenrollamiento afecta a la estructura del DNA). La protefna A es susceptible de unirse a un fragmento decamero de cadena individual de DNA que rodea al sitio de hendidura, lo cua l sugiere que el superenrollamiento es necesario para facilitar Ia formacion de una region de cadena individual que proporciona ala proteina A su sitio de union. (Una actividad enzimatica en la cualla proteina clivide al DNA duplex y se une a un extrema 5' liberado se denomina, en ocasiones, relaxasa.) La hendidura genera un extrema 3'-0H y uno 5'-fosfato (adheri do de manera covalente ala proteina A), los cuales tienen un papel que desempefi.ar en la replicacion de

"antiguo"; despues se liga a Ia cadena desplazada en un circulo. Una vez formada la estructura circular, la cadena (+) desplazada puede tener dos destinos. Durante la fase de replicacion de la infeccion virica puede ser utilizada como molde para sintetizar lc: cadena (-) complementaria; el cfrculo duplex puede ser utilizado despues como drculo rodante pare: generar mas progenie . Por otra parte, durante la morfogenesis del fago, la cadena (+) desplazada se empaqueta en el virion fagico.

DD

El plasmido Fes transferido por conjugaci6n entre bacterias

Conceptos principales • Un factor F libre es un replic6n que se mantiene en el nivel de un plasmido par cromosoma bacteriano. • Un factor F puede integrarse al cromosoma bacteriano, en cuyo caso, su propio sistema de rep licaci6n es suprimido. • El factor F codifica a pili espec\ficos que se forman en la superficie de la bacteria. • Un pilus F permite que una bacteria F positiva e a una bacteria F negativa y se inicie la conjugaci6n.

Otro ejemplo de conexi6n entre la replicaci6n y L: propagacion de una unidad genetica es la conjugaci6n bacteriana, en la cual el genoma de un plasmido o un cromosoma hospedador es transferido de una bacteria a otra . La conjugacion depende del plasmido F, que constituye un ejemplo clasico de episoma, elemenr que puede existir como plasmido circular libre o se integrado al cromosoma bacteriano como secuenci.: lineal (como un bacteriofago lisogenico). El plasmido F es una gran molecula de DNA circular con un.: longitud de -100 kb. El factor F puede integrarse en numerosos siti : del cromosoma de E. coli, a menudo por eventos de recombinacion que involucran a ciertas secuencia: (denominadas secuencias IS; vease Ia seccion 21. 5 Los transposones provocan Ia reestructuracion d e ~ DNA) presentes en el cromosoma hospedador y er: el plasmido F. En su forma libre (de plasmido), e plasmido F utiliza a su propio origen de replicaci6L (oriV) y a su propio sistema de control, y se mantiene una copia por cada cromosoma bacterian Cuando se integra a este, dicho sistema es suprimid y el DNA F se replica como parte del cromosoma. La presencia del plasmido F, libre o integradc tiene consecuencias importantes para la bacte rio hospedadora. Las bacterias F positivas son suscep-

-'bVes de conjugarse (o aparearse) con las bacterias = negativas. La conjugacion implica un o :::nre la bacteria donadora (F positiva) y la bacte-:a receptora (F negativa), el cual va seguido de la ~ ansferencia del factor F. Si el factor F existe en rma de plasmido libre en la bacteria donadora, es -:-ansferido como plasmido y el proceso infeccioso ::-ansforma al receptor F negativo en F positivo. Por ~ 1 contrario, si el factor F esta presente en forma _ntegrada en el donador, el proceso de transferencia :ambien puede provocar que una parte o todo el ~ omosoma bacteriano sea transferido. Numerosos plasmidos tienen sistemas de conjugacion que ope-:-an de forma similar, sin embargo, el factor F fue el nrimero en ser descubierto y prevalece como parad.igma de este tipo de transferencia genetica. Para la conjugacion se necesita una region r xtensa (de -3 3 kb) del plasmido F denominada region de transferencia, Ia cual contiene -40 ~ e.nes necesarios para la transmision del DNA; su organizacion se resume en la . Los ge:1es se Haman locus tra y locus trb, y la mayor parte se expresa de forma coordinada, como parte de una sola unidad de transcripcion de 32 kb (la unidad :raY-I). traM y traJ se expresan separadamente. traJ es un regulador que enciende a traM y a traY-I. En Ia cadena opuesta, finP es un regulador que codifica a un pequefio RNA antisentido que apaga a traJ. Su actividad requiere de la expresion de otro gen, finO. Solo cuatro de los genes tra de la unidad de transcripcion mayor estan implicados directamente en la transferencia del DNA casi todos tienen que ver con las propiedades de la superficie de la celula bacteriana y con el mantenimiento de os entre las bacterias en proceso de apareamiento. Las bacterias F positivas poseen apendices de superficie denominados pili (singular pilus) que son codificados por el factor F. El gen traA codifica ala subunidad proteinica individual, la pilina, que es polimerizada en el pilus. Cuando menos 12 genes tra son necesarios para la modificacion y el ensamblaje die la pilina en el pilus. Los pili F son estructuras similares a cabellos, de 2 a 3 pm de largo, que sobresalen de la superficie bacteriana. Una celula F positiva tfpica tiene dos o tres pili. Las subunidades de pilina se polimerizan en un cilindro hueco de -8 nm de diametro, con un agujero axial de 2 nm. El apareamiento se inicia cuando la punta del pilus F entra en o con la superficie de la celula receptora. En la tl ) se muestra un ejemplo de celulas de E. coli que han empezado a aparearse. Una celula donadora no a a otras celulas que portan el factor F porque los genes traS y traT codifican a proteinas de "exclusion de superficie" que convierten a la celula en un receptor deficiente en dichos os, lo cual restringe efi-

Region reg uladora

~----------------------------~

• • ••,• •, TraY Formaci6n de Ia hendidura y desenrollado del DNA Tral • TraJ • : ~ : Exclusion Pilina de superficie i,Canal?

...

...

~ ~--_.------------------------~--_.--~

oriTtraMJYALEKBPVR CWU NtrbCDEtraFtrbBtraHGST 0

1/Z

finP ~

La region tra del plasmido F contiene los genes necesarios para la conjugaci6n bacteriana.

El o inicial de las bacterias en proceso de apareamiento tiene lugar cuando los pili F del donador an a la bacteria receptora. Imagen cortes1a de Ron Skurray, School of Biological Sciences, University of Sydney.

cientemente el apareamiento entre celulas donadoras y celulas F negativas. (La presencia de pili F tiene consecuencias secundarias, proporcionan los sitios a los cuales se adhieren los fagos de RNA y algunos de DNA de cadena individual, de modo que las bacterias F positivas son susceptibles de infeccion por estos fagos, mientras que las bacterias F negativas son resistentes.) El o inicial entre las celulas donadoras y las receptoras se interrumpe facilmente, sin embargo, otros genes tra estabilizan dicha asociacion, lo cual aproxima a las celulas en proceso de apareamiento. Los pili F son esenciales para que se inicie el apareamiento, pero se retraen o desensamblan como parte del proceso por el cuallas celulas en apareamiento se acercan una a otra. Debe haber un canal de transferencia del DNA, sin embargo, el pilus no parece proporcionarlo. TraD es una protefna de membrana interna en las bacterias p+ necesaria para el transporte del DNA que puede proporcionar el canal o ser parte de d

16.6 El plasmido F es transferido por conjugaci6n entre bacterias

399

1111

La conjugaci6n transfi ere DNA de cadena individual


• La transferencia de un factor F inicia cuando la replicaci6n par c1rculos rodantes empieza en oriT. • El extrema 5' inicia la transferencia en la bacteria receptora. • El DNA transferido se hace bicatenario en la bacteria receptora. • Cuando un factor Festa libre, la conjugaci6n "infecta" a la bacteria receptora con una copia del factor F. • Cuando se integra un factor F, la conjugaci6n provoca la transferencia del cromosoma bacteriano hasta que el proceso es interrumpido par rotura (aleatoria) del o entre el donador y la bacteria receptora.

DONADOR

RECEPTOR

TraY/1 crea una hendidura en oriT del DNA

G

~·

5'

El multfmero TraY/1 migra en torno al clrculo, desenrollando el DNA

La cadena individual entra al receptor

~

c ~

Se sintetizan cadenas complementarias

0 0 ~

Se cierra Ia hendidura del donador

~

El receptor forma el cfrculo

0 La transferencia del DNA ocurre cuando el factor F es hendido en on"T y una cadena individual es conducida por el extrema 5' al interior del receptor. S6lo un tramo de la unidad es transferido. La cadena individual que permanece en el donador y la cadena transferida al interior del receptor son sintetizadas con una cadena complementaria.

400


La transferencia del factor F inicia en un sitio llamado oriT, u origen de Ia transferencia, que se loca Li z~ en uno de los extremos de la region de transferencia. El proceso puede iniciarse cuando TraM ident:fica que se ba formado una pareja; a continuacion TraY se une en las cercanias de oriT e induce 1 ~ union de Trai. Esta ultima proteina es una relaxasa, como la proteina A de X174. Tral bace u n,: bendidura en on"T, en un sitio {mico (llamado nic y despues forma una ligadura covalente con el e:-tremo 5' que se ba generado. Trai tambien cataliz: el desenrollamiento de -200 bp de DNA (activida belicasa; vease Ia seccion 18.7, El sistema del m O· delo X muestra la forma en que se genera DN.-. de cadena individual por replicacion). En la uU se muestra que el extrema 5' liberado muestr' el camino a! interior de la bacteria receptora, en 1: cual se sintetiza un complemento de la cadena i r~ dividual transferida, que como resultado de ello, ' " transforma en F positiva. En la bacteria donadora debe sintetizarse un;;. cadena complementaria para remplazar a la que he. sido transferida. Si esto sucede de forma concomi tante con el proceso de transferencia, el estado de_ pL'ismido F sera. semejante al circulo rodante de ic: Figura 16.5 (y no generara las regiones extens a~ de cadena individual que se muestran en Ia Figur" 16.11). En general, el DNA en proceso de conjugacion aparece como un circulo rodante, sin embargo la replicacion como tal no es necesaria para proporcionar la energia de conduccion, ademas de que Ia. transferencia de la cadena individual es indeper> diente de la sintesis de DNA. Una sola unidad de factor F es transferida a la bacteria receptora, lo cu ih implica que el proceso termina con alguna caracte· ristica (no identificada) despues de una revolucio.• al cabo de lo cual se restaura la integridad covalem " del plasmido F. Cuando un plasmido F integrado inicia la conjugacion, Ia orientacion de la transferencia es alej ada de la region de transferencia, bacia el interior de: cromosoma bacteriano. En la · se muestra que el DNA bacteriano es transferido siguiendo c. una corta secuencia lider de DNA F y que el proces · continua basta que es interrumpido por la roturG de los os formados entre las bacterias que st: a pare an. Se necesitan -100 minutos para transferi; el cromosoma bacteriano completo, y en condiciones normales, el o suele romperse antes de Ia culminacion de la transferencia. El DNA donador que entra a una bacteria receptora se torna bicatenario y puede recombinarse cor. el cromosoma receptor. (Notese que son necesari o: dos eventos recombinantes para insertar el DNr-. donador.) Asi pues, Ia conjugacion proporciona ur. medio de intercambio de material genetico entre

.;cterias (a diferencia de su crecimiento asexual ha- ual). Una cepa de E. coli con un factor F integrado : ·palda dicha recombinacion con bastante frecuena {respecto de las cepas que carecen de factores F -:tegrados); estas cepas se definen como Hfr (high ?quency recombination, de recombinacion de alta ~ cuencia). Cada posicion de integra cion para el ·ctor F origina una cepa diferente de Hfr, con un tr6n caracterfstico de transferencia <;le marcadores -acterianos a un cromosoma receptor. El o entre las bacterias en proceso de _ njugacion suele romperse antes de que haya :erminado Ia transferencia del DNA, de modo que ..a probabilidad de que una region del cromosoma ~ acteriano sea transferida, depende de su distancia ~el onT. Los genes bacterianos localizados cerca del ~tio de integracion de F (en direccion de Ia transfe :-encia) entran primero a Ia bacteria receptora y se -:ncuentran con frecuencias mucho mayores que los . calizados mas lejos y que entran despues. Esto da .:.~gar a un gradiente de frecuencias de transferencia _n torno al cromosoma, que declina a partir de Ia posicion de integracion de F. Las posiciones de los :-narcadores localizadas en el cromosoma donador pueden ser analizadas en funcion del tiempo que arda la transferencia, lo cual da Iugar a Ia descripcion estandar del cromosoma de E . coli como un mapa dividido en 100 m.inutos. El mapa se refiere a los tiempos de transferencia de una cepa especffica de Hfr; el punto de inicio del gradiente de transferencia es diferente en cada una porque depende del sitio en el cual el factor F se ha integrado al genoma bacteria no.

Ill

El plasmido bacteriano Ti provoca la enfermedad de agalla de Crown en las plantas

Conceptos principales • La infecci6n por la bacteria A. tumefaciens puede transformar las celulas de las plantas en tumores. • El agente infeccioso es un plasmido transportado par la bacteria. • El plasmido tambien porta genes para sintetizar y metabolizar las opinas (derivados de la arginina) que utiliza la celula tumoral.

La mayorfa de los eventos en que el DNA es reestructurado o amplificado tienen Iugar dentro de un genoma, sin embargo, Ia interaccion entre las bacterias y ciertas plantas implica Ia transferencia de DNA del genoma bacteriano a! genoma de Ia planta. La enfermedad de agalla de Crown, que se muestra en Ia , puede ser inducida en Ia mayorfa

BACTERIA DONADORA

BACTERIA RECEPTORA

FACTOR F oriT

region tra

El factor F es

...

..

El extrema 5' dirige a Ia cadena individual al interior .._ ___ _ _del5'receptor

Las cadenas individuales son transformadas en cadenas dobles en ambas bacterias

,.... '"'

=~

:: :.................·:.

...............

~... ......r' ·:::::::.l ::::.:::··

• ' El DNA del donadar se recombina con el genoma, ; •. d;l receptor •

La transferencia del DNA cromos6mico ocurre cuando un factor F integrado es hendido en oriT. La transferencia del DNA se inicia con una secuencia corta de DNA F y continua hasta que lo impide la perdida de o entre las bacterias.

de las plantas dicotiledoneas par Ia bacteria de tierra Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria es un parasito que hace un cambio genetico en la celula eucariotica hospedadora, con consecuencias tanto para el parasito como para el hospedador, pues mejora las condiciones de supervivencia de aquel y provoca que Ia celula de Ia planta crezca como un tumor. Las agrobacterias son necesarias para inducir la formacion del tumor, pero las celulas de este no requieren de la presencia continua de las bacterias. Igual que en los tumores animales, las celulas de las plantas han adquirido un estado en el cual nuevas mecanismos rigen el crecim.iento y Ia cliferenciacion; la transformacion dentro de la celula es provocada por la expresion de la informacion genetica transferida de Ia bacteria. El principia de induccion tumoral de Agrobacterium reside en el plasmido TI, perpetuado como un replicon independiente en Ia bacteria. El plasmido transporta a genes implicados en varias actividades

16.8 El plasmido bacteriano Ti provoca la enfermedad de agalla de Crown en las plantas

401

Un Agrobacterium que porta un plasmido Ti de nopalina induce la formaci6n de un teratoma, en el cual se desarrollan estructuras diferenciadas. Imagen cortesia de La sucesi6n de Jeff Schell. Reproducida con autorizaci6n de ~~ax Planck Institute for Plant Breeding Research, Cologne.

Locus

Funci6n

Plasmido Ti

vir

todas

shi roi

transferencia del DNA a Ia planta inducci6n de brotes inducci6n de rafces

todas todas

nos noc ocs occ

sfntesis de nopalina catabolismo de nopalina sfntesis de octopina catabolismo de octopina

nopalina nopalina octopina octopina

tra

genes de transferencia bacteriana genes de incompatibilidad origen de Ia replicaci6n

todas

Inc oriV

todas todas

Los plasmidos Ti transportan a genes implicados en las funciones de las bacterias y las plantas.

de las bacterias y de las celulas vegetales, incluidas las necesarias para generar el estado transformado, y un conjunto de genes implicados en la sfntesis o Ia utilizaci6n de las o pinas (derivados novedosos de Ia arginina). Los plasmidos Ti (y por tanto las Agrobacteria en que residen) pueden dividirse en cuatro grupos, segun el tipo de opinas que producen: • Los plasmidos de nopa lina portan genes para la sfnt esis de esta en los tumores y para utiliza rla en la bacteria. Los tumores de nopalina pu eden diferenciarse en brotes con estructuras anormales. Se les ha denominado teratomas, por su analogfa con ciertos tumores de los mamiferos que retienen Ia capacidad de diferenciarse en estructuras embrionarias tempranas.

402


• Los plasmidos de octopina son similares a los de nopalina, pero la opina pertinente n es Ia misma. Sin embargo, los tumores d octopina en general no estan diferenciado ~ y no forman brotes de teratoma. • Los plasmidos de agropina portan gene: para el metabolismo de esta; los tumore~ no se diferencian, su desarrollo es pobre : mueren pronto. • Los plasmidos Ri pueden inducir la enfermedad de rafces vellosas en algunas plant ~ y la de agalla de Crown en otras. Sus gene ~ son de tipo agropina y pueden tener segmentos derivados de los plasmidos de n opalina y de octopina. Los tipos de genes que transporta el plasmido 'TI se resumen en la .~. . Los genes utilizado: en la bacteria codifican Ia replicaci6n y la incompatibilidad del plasmido, Ia transferencia entre bacterias, la sensibilidad a los fagos y la sintesis de otro: compuestos, algunos de los cuales son t6xicos para otras bacterias de tierra. Los genes utilizados en la5 celulas de las plantas codifican la transferencia de: DNA a! interior de Ia planta, Ia inducci6n de estado transformado y la inducci6n de brotes y rakes. La especificidad de los genes de las opinas depende del tipo de plasrnido. Los genes necesarios para Ia. smtesis de las opinas estan vinculados con otros cuyos productos catabolizan ala rnisma opina, de modo qu cada cepa de Agrobacterium provoca que las celula_ tumorales de agalla de Crown sinteticen opinas utile~ para Ia supervivencia del parasito. Las opinas pueden ser utilizadas como {mica fuente de nitr6geno o de carbono de la cepa de Agrobacterium inductora. E! principia es que la celula vegetal transformada sintetiza a las opinas que la bacteria puede utilizar.

IIlii

El T-DNA porta los genes necesarios para la i nfecci6n

Conceptos principales • Parte del DNA del plasmido Ti se transfiere al nucleo de La celula de la planta . • Los genes vir del plasmido Ti se localizan fuera de La region transferida y son necesarios para el proceso de transferencia. • Los genes vir son inducidos por compuestos fen6licos liberados por las plantas en respuesta a lesiones. • La prote\na de membrana VirA se autofosforila en la histidina cuando se une a un inductor. • La prote\na VirA activa a la prote\na VirG al transferirle el grupo fosfato. • VirA-VirG es uno de los numerosos sistemas bacterianos de dos componentes que utilizan un regulador de fosfohistidina .

interaccion entre Agrobacterium y una celula vegeLa bacteria no entra c :a celula de Ia planta, sino que transfiere parte del - _asmido Ti at nucleo de Ia celula vegetal. La porcion _: -nsferida del genoma Ti se denomina T-DNA, que :- integra a! genoma de la planta, en donde expresa , - funciones necesarias para sintetizar opinas y para -ansformar a Ia celula de Ia planta. La transformacion de las celulas de Ia planta -:quiere de tres tipos de funciones transportadas =.:l. la Agrobacterium: • Para Ia etapa inicial de Ia union de la bacteria con Ia celula de la planta se necesitan tres loci del cromosoma de Agrobacterium, chvA, chvB y pscA, los cuales son responsables de la sfntesis de un polisacarido en Ia superficie celular de Ia bacteria. • La region vir, que el plasmido Ti saca de la region T-DNA, permite liberar e iniciar Ia transferencia del T-DNA. • El T-DNA es necesario para transformar la eel ula de la planta. La organizacion de los dos tipos principales de ~.asmidos Ti se ilustra en la . Aproxi.:adamente el 30% del genoma Ti de - 200 kb es : mun a los plasmidos de nopalina y octopina. Las -=giones comunes incluyen genes implicados en to_as las etapas de la interaccion entre Agrobacterium una planta hospedadora, sin embargo, la rees=-ucturacion de secuencias entre los plasmidos es _msiderable. La region T ocupa -23 kb, de las cuales, unas : _b son iguales en los dos tipos de plasmidos. Los - :asmidos Ti portan genes para Ia sfntesis de opinas _·as u Ocs) en Ia region T, en tanto que los genes : rrespondientes al catabolismo de las opinas (Noc .:. Occ) residen en otras regiones del plasmido. Los .asmidos codifican funciones morfogeneticas siilares, pero no identicas, como se observa en Ia __ duccion de tipos caracteristicos de tumores. Las funciones que afectan a Ia oncogen)cidad, · capacidad para formar tumores, no se limitan a la ·_gion T, pues los genes ajenos a esta deben rela~o narse con el establecimiento del estado tumori~enico, si bien sus productos no son necesarios para -erpetuarlo. Por otra parte, podrfan estar implica- s en la transferencia del T-DNA a! nucleo de Ia anta, o quizas con funciones subsidiarias, como el =_uilibrio hormonal de la planta en el tejido infec-'ldo. Algunas de las mutaciones son especificas del - spedador, e impiden Ia formacion de tumores en ~gu na s especies de plantas, pero no en otras. Los genes de virulencia codifican a las funciones - cesarias para el proceso de transferencia. Seis loci ·-irA, B, C. D, E y G) residen en una region de 40 kb . :..~era del T-DNA, cuya organizacion se resume en Ia _a

= se ilustra en la I

4

.

Celula de Ia planta

Agrobacterium ~ Piasmido

Ti

v - T-DNA

:La bacteria transfiere :el T-DNA a Ia planta

•••••••••••••• ·>-

@

T-DNA Las celulas ' de Ia planta desarrollan un tumor

El tumor sintetiza opinas en las cuales puede crecer Ia bacteria

~

•••

El T-DNA es transferido a partir de un Agrobacque transporta un plasmido Ti al interior de una celula de la planta, donde se integra al genoma nuclear y ejerce funciones que transforman a la celula hospedadora. ten'um

Los plasmidos Ti de nopalina y de octopina transportan una variedad de genes, incluidas las regiones T con funciones que se traslapan.

. Cada locus se transcribe como una sola unidad, si bien algunos incluyen mas de un marco de lectura abierto. El proceso de transformacion puede dividirse cuando menos en dos etapas: • Agrobacterium entra en o con una celula vegetal y son inducidos los genes vir. • Los productos genicos vir dan Iugar a que el T-DNA sea transferido al nucleo de Ia celula de Ia planta, donde se integra al genoma . 16.9 El T-DNA porta los genes necesarios para la infecci6n

403

Locus

virA

virB

virG

virC

Proteinas

VirA

VirB1-11

VirG

VirC1-2 VirD1 ,02 VirE2

Nivel basal bajo Nivel inducido

virE

bajo alto

Localizaci6n mem. mem. Funci6n

virD

•

Acetosiringona

VirA (sensor)

alto

alto

alto

alto

cito.

cito.

nucleo

nucleo

receptor de acetilsiringona

•• • • • • ~

"'

induce Ia transcripci6n de otros genes vir

. ................... ., ....... .. . .

,.

implicado en Ia conjugaci6n

y

Y' se une al DNA de sabre marcha

,.

Ia nucleasa 02 hace una hendidura en el T-DNA

Y' proteina de uni6 con el ssDNA

La region vir del plasmido Ti tiene seis loci responsables de transferir el T-DNA a una planta infectada .

VirG (elector)

La proteina fosforilada activa Ia transc ripci6n

0 II C-CH3

OH La acetosiringona (4-acetil-2,6-dimetoxifenol) es producida par N. tabacum en respuesta a lesiones; induce la transferencia del T-DNA de Agrobacten'um .

Los genes vir se clasifican en dos grupos qu e corresponden a estas e tapas. virA y virG son reguJadores que responde n a cambios de la planta a! inducir los otros genes, de modo que, en ellos, las mutaciones producen mutantes avirulentos que no pueden expresar a los genes vir restantes. Los genes virB, C, D y E codifican a protefnas implicadas en Ia transferencia del DNA. Las mutaciones en virB y virD producen mutantes avirulentos en todas las plantas, si bien sus efectos en virC y en virE varian en funcion del tip o d e planta hospedadora. virA y virG se expresan constitutivamente (en un nivel ba stante bajo). Las sefiales a las cuales responden provienen de compuestos fenolicos generados por la s plantas como respuesta a las lesiones.

404


El sistema de dos componentes de VirA-Vi -:responde a sefiales fen6licas al activar la transcripci6n de •g':nes diana.

Vease el ejemplo de la . Nicotiana tabr cum (planta del tabaco) genera las moteculas acet siringona e hidroxiacetosiringona a. La exposicio a estos compuestos activa al gen virA, que actua er el virG, que a su vez induce la expresion de novo d7 virB, C, D y E. Esta reaccion explica porque la in feccion por Agrobacterium ocurre solo en las plantas lesionadas. VirAy VirG son ejemplo de un sistema bacteriano clasico en el cualla estimulacion de una protein.;_ sensora da Iugar a la a utofosforilacion y transferencia del fosfato a Ia segunda protefna. La relaci6n se ilustra en la . El sistema Vir A- VirG scasemeja al EnvZ-OmpR que responde a la osm olaridad. La secuencia de virA esta relacionada cor Ia de envZ, en tanto que las de virG y ompR estk estrechamente relacionadas, lo cual sugiere que la5 protefnas efectoras funciona n de manera similar. VirA forma un homodfmero localizado en 1.: membrana interna que puede responder a compuestos fenolicos en el espacio periplasmico. La exposicion a estos compue stos provoca qu~ VirA se

'lUtOfosforile en !a histidina, y mas tarde, e! grupo :osfato es transferido a un residuo de Asp en VirG. El producto VirG fosforilado se une a los promotores de : s genes virB, C, D y E para activar Ia tril_nscripcion. _uando virG es activado, su transcripcion es induj da desde un nuevo punto de inicio, diferente del · tilizado por la expresion constitutiva, lo cual resulta -:n el incremento de Ia cantidad de protefna VirG. De los loci vir restantes, virD es el mejor carac:erizado; tiene cuatro marcos de lectura abiertos. ~os de las protefnas codificadas en virD, VirD 1 y VirD2, proporcionan una endonucleasa que inicia el proceso de transferencia a! hacer una hendidura :'nun sitio especffico del T-DNA.

La transferencia del T-DNA es semejante a la co njugaci6n bacteriana

TGACAGGATATATTGNNGGTAAAC

TGGCAGGATATATTGNNTGTAAAC

Repetici6n derecha

Repetici6n izquierda

Plasmido Ti

Transferencia e integraci6n del T-DNA

I

Plasm ida Ti

t

....

• ••••••••

•• ••• ••• •

DNA de Ia planta I La union se encuentra a <1 00 bp de Ia repetici6n izquierda

~

.... .... ..

1 DNA de Ia planta

Sa mantienen 1 a 2 bp de Ia repe tici6n derecha

El T-DNA tiene repeticiones casi identicas de 25 bp en cada extrema del plasmido Ti. La repeticion de la derecha permite la transferencia e integracion al genoma de una planta. El T-DNA que se integra al genoma de una planta tiene una union precisa que retiene 1 o 2 bp de la repeticion de la derecha, pero la union de la izquierda var\a y puede estar a una distancia de hasta 100 bp de la repeti cion de la izquierda.

Conceptos principaLes • El T-DNA se genera cuando una hendidura en La frontera derecha crea un cebador para La slntesis de una nueva cad'e na de DNA. • La cadena individual preexistente que es desplazada por la nueva slntesis es transferida al nucleo de la celuLa de la planta. • La transferencia termina cuando La slntesis de DNA llega a una hendidura en la frontera izquierda. • El T-DNA es transferido como un complejo de DNA de cadena individual con la prote\na de union a la cadena individua l VirE2. • El T-DNA de cadena individual es transformado en DNA bicatena rio e integrado aL genoma de La planta. • Se desconoce el mecanismo de integracion. El T-DNA puede ser utiLizado para transferir genes al interior del nucleo de una celula vegetal.

! Primera hendidura /r Endonucleasa

SSB E2Sintesis de DNA

I

Segunda hendidura

De hecho, el proceso de transferencia selecciona a la region T para entrar a la planta. En la 6.2 se muestra que el T-DNA de un plasmido de nopalina es delimitado de las regiones flanqueantes el plasmido Ti por repeticiones de 25 bp, las cuales difieren en solo dos posiciones entre el extremo izquierdo y el derecho. Cuando el T-DNA es integrado al genoma de una planta, Ia union derecha esta bien definida, !a cual retiene l o 2 bp de !a repeticion derecha. La union izquierda es variable; Ia frontera del T-DNA en el genoma de la planta puede localizarse en la repetici6n de 25 bp o en alguno de los sitios e una serie que cubre una longitud de -100 bp en el T-DNA. En ocasiones, en un solo sitio se integran copias multiples de T-DNA en tandem. En Ia se ilustra un modelo para Ia transferencia. En la repetici6n de 25 bp dellado derecho se forma una hendidura que proporciona

J

T-D NA

!

liberado !

Hacia el nucleo de Ia celula de Ia planta El T-DNA se genera por desplazamiento cuando su slntesis empieza en una hendidura formada en la repeticion de la derecha y termina con una hendidura ubicada en la repeticion de la izquierda.

un extremo cebador para Ia sfntesis de un DNA de cadena individual. La sfntesis de Ia cadena nueva desplaza ala antigua, Ia cual se utiliza en el proceso

16 .W La transferencia del T-DNA es semeja nte ala conjugacion bacteriana

405

de transferencia. La transferencia termina cuando Ia sfntesis de DNA llega a una hendidura en Ia re peticion del !ado izquierdo. Este modelo explica la razon de que Ia repeticion derecha sea esencial y represente Ia polaridad del proceso. Sino se produce una hendidura en Ia repeticion dellado izquierdo, Ia transferencia podria rebasar al plasmido Ti. El proceso de transferencia implica Ia produccion de una sola molecula de DNA de cadena individual en Ia bacteria infecciosa, Ia cual es transferida como un complejo formado por DNA y una protefna que suele llamarse complejo T. El DNA es cubierto porIa protefna de union a Ia cadena individual VirE2, Ia cual tiene una seiial de localizacion nuclear yes responsable del transporte del T-DNA a! interior del nucleo de Ia celula de Ia planta. Una sola molecula de Ia subunida d D2 de Ia endonucleasa permanece unida al extrema 5'. El operon virB codifica a ll productos implicados en Ia reaccion de transferencia. Fuera del T-DNA, pero justo allado del borde derecho, se encuentra otra secuencia corta, denominada de sobremarcha, !a cual estimula en gran medida el proceso de transferencia. Dicha secuencia funciona como potenciador, debe encontrarse en Ia misma molecula de DNA, pero hace mas eficiente Ia transferencia, incluso si esta separada del borde por muchos miles de pares de bases. VirC l y posiblemente virC2 podrfan actuar en Ia secuencia de sobremarcha. Los plasmidos de octopina poseen un patron mas complejo de T-DNA integrado que los plasmidos de nopalina, ademas de que el patron de las cadenas T tambien es mas complejo, y pueden encontrarse muchas especies discretas que correspondeD a elementos de T-DNA, lo cual sugiere que el de octopina tiene numerosas secuencias que proporcionan dianas para Ia realizacion de hendiduras o Ia terminacion de la sfntesis de DNA. Este modelo de transferencia del T-DNA se asemeja bastante a los eventos implicados en Ia conjugacion bacteriana, en los cuales el cromosoma de E. coli es transferido de una celu la a otra en forma de cadena individual. Los genes del operon virB son homologos a los genes tra de ciertos plasmidos bacterianos implicados en la conjugacion (vease Ia seccion 16.7, La conjugacion transfiere DNA de cadena individual) pero una diferencia es que Ia transferencia del T-DNA suele estar limitada porIa frontera de Ia repeticion del !ado izquierdo, mientras que Ia transferencia del DNA bacteriano es indefinida. No se sabe como se integra el DNA transferido a! genoma de Ia planta . En alguna etapa, Ia cadena recien generada debe ser transformada en DNA duplex. Los cfrculos de T-DNA de las celulas de las plantas infectadas parecen ser generados por recom406


binacion entre las repeticiones izquierda y derech::. de 25 bp, pero no se sabe si son intermediarias; t"'" probable que el evento real implique una recomb:nacion no homologa, debido a que no hay homologfa entre el T-DNA y los sitios de integracion. 2_Se integra el DNA a! genoma de la planta com . unidad integral? (. Cuantas capias son integradas : (.Que sitios del DNA de Ia planta estan disponiblepara Ia integracion? (.LOs genes que se encuentra ~ en el T-DNA son regulados exclusivamente por fur:.ciones del segmento integrado? Estas preguntas sor. fundamentales para definir el proceso por medio d . cual el plasmido Ti transforma una celula de un.: planta en un tumor. 2_Cuat es la estructura del sitio diana? Las secuencias que flanqu ean a! T-DNA integrado tienden a ser ricas en pares de bases A-T (caracterfstic.::. que exhiben los sitios diana de algunos element~ transponibles). Las reestructuraciones de secuencic. que ocurren en los extremos del T-DNA integradc dificultan el analisis de Ia estructura; se desconoce '-· el proceso de integracion genera en el DNA secuen cias nuevas comparables con las repeticiones diane. creadas en Ia transposicion. El T-DNA se expresa en este sitio de integracion. La region contiene numerosas unidades d.: transcripcion, cada una de las cuales probablememc contenga un gen expresado a partir de un solo promotor cuyas funciones se relacionan con el estadc de Ia celula de Ia planta, el mantenimiento de su: propiedades tumorigenicas, el control de Ia formacion de brotes y tallos, y en Ia supresion de Ia diferenciacion en otros tejidos; ninguno de estos gen ~ es necesario para Ia transferencia del T-DNA. El plasmido Ti presenta una interesante organizacion de funciones. Fuera de Ia region T, porte genes necesarios para iniciar Ia oncogenesis, de lo_ cuales, cuando menos algunos estan involucrados en Ia transferencia del T-DNA, y serfa interesante saber si otros funcionan en Ia celula de Ia plant.: para influir en su comportamiento de esta etapa . Por otra parte, fuera de Ia region T se encuentran lo_ genes que permiten a Agrobacterium catabolizala opina que producira Ia celula de Ia planta. En Ia region T hay genes que controlan el estado transformado de la planta, asf como a los genes que provocan la sfntesis de las opinas que beneficiaran a: Agrobacterium que originalmente proporciono elIDNA. / Desde un pun to de vista practico, Ia capacidad de Agrobacterium para transferir el T-DNA a! genome: de Ia planta hace posible Ia introduccion de gene~ nuevos en las plantas. La transferencia/integracior_ y las funciones oncogenicas son independientes, de modo que es posible diseiiar plasmidos Ti nuevos er. los cuales dichas funciones hayan sido remplazada_

r otros genes cuyo efecto en Ia planta nos gustaria :··aluar. La existencia de un sistema natural para ansmitir genes al genoma de Ia planta facilitaria ::tormemente Ia ingenieria genetica de las plantas.

Resumen :::~

circulo rodante es una alternativa de replicaci6n - <" las moleculas circulares de DNA en las cuales un :igen es hendido para proporcionar un extrema :ebador. Desde este extrema se sintetiza una cadena _e DNA que desplaza a Ia cadena compaiiera ori= nal, la cual es extraida en forma de cola. Muchos 0 enomas se producen por revoluciones continuas _el circulo. Los cfrculos rodantes permiten replicar algunos .:gos. La protefna A que hace una hendidura en el :igen q>Xl74 tiene la propiedad inusual de actuar :,. cis, y lo hace s6lo en el DNA del cual fue sinteti:.ada; se mantiene adherida a la cadena desplazada .asta que se haya sintetizado una cadena comple·a y despues vuelve a hacer una hendidura en el :igen, con lo cuallibera a Ia cadena desplazada y :::Ipieza otro ciclo de replicaci6n. Los cfrculos rodantes tambien son caracterfs. ,os de Ia conjugaci6n bacteriana, Ia cual ocurre ::. ando un plasmido F es transferido de un donador , una celula receptora despues de la iniciaci6n del . ntacto entre las celulas por medio de los pili F. _·n phismido F libre infecta a celulas nuevas por .:te medio; un factor F integrado crea una cepa de .-.fr que podrfa transferir DNA cromos6mico. En Ia njugaci6n, Ia replicaci6n permite sintetizar los : mplementos de la cadena que permanece en el nador y de Ia que es transferida al receptor, pero -_ proporciona la fuerza motriz. Las agrobacterias inducen la formaci6n de tuores en las plantas lesionadas. Las celulas Jasti~ adas secretan compuestos fen6licos que activan a · genes vir que porta el plasrnido Ti de la bacteria. :_ s productos de dichos genes hacen que una mo:cula de DNA de cadena individual de la region _._,.l T-DNA del plasrnido sea transferida al n{Icleo de .: celula de Ia planta. La transferencia se inicia en a frontera del T-DNA, pero termina en diferentes

sitios. La cadena individual es convertida en una cadena doble e integrada al genoma de la planta. Los genes que estan en el T-DNA transforman a Ia celula de la planta y hacen que produzcan opinas especfficas (derivados de la arginina). Los genes del plasmido Ti permiten que las Agrobacteria metabolicen las opinas producidas por la celula transformada de la planta. El T-DNA ha sido utilizado para desarrollar vectores de transferencia de genes a las celulas de las plantas.

Referencias

ll!IJ

Los clrculos rodantes producen multimeros de un replic6n

Articul::> de investigaci6n Gilbert, W. and Dressler, D. ( 1968). DNA replication: the rolling circle modeL Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 33, 473-484.

~~~ El plasmido F es t ra nsferido por conjugaci6n entre bacterias Articulo de investigaci6n Ihler. G. and Rupp, W. D. ( 1969). Strand-specific transfer of donor DNA during conjugation in E. coli. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 63, 138-143.

IIIJ

La conjugaci6n transfiere DNA de cadena individual

Fuentes de revision Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., and Skurray, R. A. ( 1994). Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. M icrobial. Rev. 58, 162-210. Ippen-Ihler. K. A. andJ\IUnkley, E. G. (1986). The conjugation system ofF, the fertility factor of E. coli. Annu. Rev. Genet. 20, 593-624. Lanka, E. and Wilkins, B. M. (1995). DNA processing reactions in bacterial conjugation. Annu. Rev. Biochem. 64, 141 - 169. Willens, N. and Skurray, R. ( 1987). Structure and function of the F factor and mechanism of conjugation. In Neidhardt, F. C., ed. Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Washington, DC: American Society for J\IUcrobiology, pp. 1110-11 3 3.

Referencias

407

La replicaci6n bacteriana

esta conectada con el ciclo celular ESQUEMA DEL CAPITULO

11m1 llfD

j

Introducci6n La replicaci6n esta conectada con el ciclo celular • El tiempo de duplicaci6n de E. coli puede fluctuar en un rango de hasta 10 veces, dependiendo de las condiciones de crecimiento. • El cromosoma bacteriano tarda 40 min en replicarse (a temperatura normal) . • La culminaci6n del ciclo de replicaci6n desencadena una division bacteriana 20 min despues. • Si el tiempo de duplicaci6n es menor a 60 min, se inicia un ciclo de replicaci6n antes de la division resultante del ciclo de replicaci6n previa. • Por lo tanto, las altas velocidades de crecimiento producen cromosomas de horquillas multiples. • Un ciclo de replicaci6n es iniciado en una proporci6n constante de masajnumero de origenes cromos6micos. • Hay un origen par celula unitaria de 1. 7 ~m de longitud.

IJJD

IJR

El producto FtsZ es necesario para la formaci6n del septa • El producto de jtsZ es necesario para la formaci on del septa en sitios preexistentes • FtsZ es una GTPasa que forma un anillo en el interior de la envoltura bacteriana y que esta conectada con otros componentes del citoesqueleto.

408

1fD

La segregaci6n cromos6mica puede requerir de recombinaci6n especifica de sitio • El sistema de recombinaci6n especifica de sitio Xer actua en una secuencia diana ubicada cerca del termino del cromosoma para recrear mon6meros si un evento de recombinaci6n generalizada ha transformado al cromosoma bacteriano en un dimero.

lfD

La partici6n implica la separaci6n de los cromosomas • Los origenes de Los repLicones pueden estar adheridos a La membrana interna de La bacteria. • Los cromosomas reaLizan movimientos abruptos del centro a las posiciones que se encuentran a lf• y a 3/• de la longitud total de la celula.

-

Los plasmidos de una sola copia tienen un sistema de partici6n • Los pLismidos de una sola copia existen a raz6n de una copia de plasmido par cada origen de cromosoma bacteria no. • Los plasmidos de copias multiples existen en mas de una copia de plasmido par cada origen de cromosoma bacteria no. • La recombinaci6n hom6loga entre los plasmidos circulares genera dimeros y multimeros superiores. • Los plasmidos tienen sistemas de recombinaci6n especificc de sitio que llevan a cabo la recombinaci6n intramolecular para regenerar mon6meros. • Los sistemas de partici6n garantizan que los plasmidos duplicados sean segregados a ceLulas hijas distintas producidas par una division.

Las mutaciones de la division o la segregaci6n modifican la forma de la cetula • Los mutantes jts forman filamentos Largos debido a que eL septa no se forma y no divide a La bacteria hija. • Las minicelulas se forman en los mutantes que producen demasiados septos; son pequeiias y carecen de DNA. • Las celulas anucleadas de tamaiio normal son generadas par mutantes de partici6n en los cuales los cromosomas duplicados no logran separarse.

Los genes min regulan la localizaci6n del septa • La ubicaci6n del septa es controlada por min[, -D y -E. • El numero y La localizaci6n de los septos depende de la proporci6n de MinE/MinC,D. • El septa se forma en donde MinE puede formar un anillo. • A concentraciones normales, MinC/D permite la formaci6n de un anillo central, pero impide que se formen anillos adicionales de MinE en los palos.

El septa divide una bacteria en bacterias hijas que contienen cada una un cromosoma • La formaci on del septa inicia en el anillo localizado en torno a la celula donde se modifica la estructura de la envoltura. • Nuevas anillos son iniciados a media distancia entre el septa y los extremos de la bacteria. • Cuando la bacteria se divide, cada hija posee un anillo en la porci6n central. • La formaci on del septa empieza cuando la celuLa llega a una Longitud predeterminada. • El septa esta forma do par los mismos peptidoglucanos que constituyen la envoltura bacteriana.

IIJD

1f1!1

lmi!)

La incompatibilidad de los plasmidos depende det replic6n •

Los plasmidos que se encuentran en un solo grupo de compatibilidad tienen origenes regulados par un sistema control comun.

c~

El sistema de compatibilidad ColE1 es controlado par un regulador de RNA • La replicaci6n de ColE1 exige que la transcripci6n pase par el origen, don de el transcrito es dividido par la RNAasa H para generar un extrema cebador. • El RNA I regulador es un RNA corto antisentido que se aparea con el transcrito e impide la division que genera el extrema cebador. • La prote\na Rom potencia el apareamiento entre el RNA I y el transcrito .

Introducci6 n forma de controlar y vincular Ia replicacion con :. ciclo celular constituye una cliferencia importante 7. tre procariotas y eucariotas. En las segundas, aplica lo siguiente: • los cromosomas residen en el n1icleo • cada cromosoma esta formado por numerosos replicones • la replicacion requiere de Ia coordinacion de estos replicones para reproducir el DNA durante un periodo discreto del ciclo celular • Ia decision de realizar o no Ia replicacion depende de una ruta compleja que regula el ciclo celular y • los cromosomas duplicados son segregados a las celulas hijas durante Ia mitosis por un mecanismo especial. En Ia se muestra que en las bac~e rias , la replicaci6n es activada en un solo origen _ ando Ia masa celular se incrementa mas alia del lffibral y Ia segregaci6n de los cromosomas hijo s ~· ene Iugar cuando se garantiza que se encuentren ~ n !ados opuestos del septo que crece para dividir .a bacteria en dos. LComo sa be Ia eel ula cuando iniciar el ciclo de ~eplicaci6n? El evento de iniciaci6n ocurre en una proporci6n constante de masa celular respecto del !"ltlmero de origenes cromosomicos. Las celulas que :recen mas rapido son mas grandes y poseen un !1umero mucho mayor de orfgenes. El crecimiento j e E. coli puede describirse en funci6n de Ia celula unitaria, una entidad de 1.7 flm de largo. Una J acteria contiene un origen por celula unitaria; una -elula condos orfgenes que crece rapidamente, tiene una longitud de 1.7 a 3.4 flm. (.C6mo se titula la masa celular? Una proteina !n iciadora podrfa ser sintetizada continuamente du_ante todo el ciclo celular y la acumulacion de una cantidad crftica activarfa la iniciacion, lo cual explica _orque se necesita Ia sfntesis protefnica para eleven:o de iniciaci6n. Otra posibilidad es que una protefna inhibidora pudiera ser sintetizada en un punto fijo y diluida por debajo de un nivel efectivo por el incremento del volumen celular. ......i.

lmfJ (C6mo se replican y segregan las mitocondrias? • La replicaci6n y la segregaci6n del DNAmt a las mitocondrias hijas son eventos estocasticos. • La segregaci6n mitocondrial a las celulas hijas tam bien es un evento estocastico.

1611)

Resumen

Algunos de los eventos de la partici6n de los cromosomas hijos son consecuencia de la morfologfa circular del cromosoma bacteriano. Se dice que los cromosomas circulares estan encadenados cuando uno pasa a traves de otro, conectandolos; para separarlos son necesarias las topoisomerasas. Un tipo de estructura alterno se forma cuando ocurre un evento de recombinacion, una sola recombinacion entre dos mon6meros los convierte en un solo dfmero . Esto se resuelve por un sistema de recombinaci6n especializado que recrea los monomeros independientes. En esencia, el proceso de particion es m anej ado por sistemas enzirnaticos que actuan directarnente en secuencias discretas de DNA.

Una celula unitaria tiene un cromosoma circular

La replicaci6n inicia cuando Ia celula rebasa un tamano crftico La replicaci6n genera cromosomas hijos encadenados Los cromosomas hijos se separan

El septa divide a Ia celula

Las celulas hijas se separan La replicaci6n inicia en el origen bacteriano cuando una celula rebasa un umbral cr\tico de tamaiio. La culminaci6n de la replicaci6n produce cromosomas hijos que pueden ser ligados par recombinaci6n o encadenados y que se separan y desplazan a lados opuestos del septa antes de que la bacteria se divida en dos.

17.1 Introducci6n

409

111J

La replicaci6n esta conectada con el ciclo celular

Conceptos principales • El tiempo de duplicacion de f. coli puede fluctuar en un rango de hasta 10 veces, dependiendo de las condiciones de crecimiento. • El cromosoma bacteriano tarda 40 min en replicarse (a temperatura normal). • La culminacion del ciclo de replicacion desencadena una division bacteriana 20 min despues. • Si el tiempo de duplicacion es menor a 60 min, se inicia un ciclo de replicacion antes de la division resultante del ciclo de replicacion previa. • Par lo tanto, las altas velocidades de crecimiento producen cromosomas de horquillas multiples. • Un ciclo de replicacion es iniciado en una proporcion constante de masajnumero de origenes cromosomicos. • Hay un origen por celula unitaria de 1. 7 1-l m de longitud.

Las bacterias tienen dos vfnculos entre la replicacion y el crecimiento celular: • La frecuencia de Ia iniciacion de los ciclos de replicacion esta ajustada para corresponder con la velocidad a Ia cualla celula esta creciendo. • La culminacion de un ciclo de replicacion esta conectada a la division de !a celula. La velocidad del crecimiento bacteriano se evaIlia mediante el tiempo de duplicaci6n, que es el

.. -

n.

.. ,..

Origen

""~I

~

~ ~

~

\

~

Division

1 30 ==:J)

Termino

'-

~

35/0 5

lniciasion 10

25

20

~

~ ~

15

~ ~

\

5'--P=

I T

...

erm1nac1on

~ El intervalo fijo de 60 min entre la iniciacion de la replicacion y la division celular produce cromosomas con horquillas multiples en las celulas que crecen rapidamente. Notese que solo se muestran las horquillas de replicacion que se desplazan en una direcci6n; de hecho, el cromosoma es replicado simetricamente por dos conjuntos de horquillas que se mueven en direcciones opuestas en cromosomas circulares.

410

periodo necesario para que el numero de celulas ~ duplique. Entre mas corto sea, mayor sera Ia vel · cidad de crecimiento. Las celulas de E. coli pued :. crecer a tasas que oscilan entre 18 y 180 min. cromosoma bacteriano es un replicon individual, cmodo que Ia frecuencia de los ciclos de replicaci6~ es controlada por el numero de eventos de inicia· cion en el origen unico. El ciclo de replicacion pue · ~ ser definido en funcion de dos constantes: • C es el tiempo fijo , -40 min, necesario paro replicar el cromosoma bacteriano complet Esta duracion corresponde a una velocida: de desplazamiento de Ia horquilla de rep:.: cacion de -50 000 bp /minuto. (La velocida .:: de Ia sfntesis de DNA es mas o menos inva.riable a temperatura constante, procede : la misma velocidad a menos que el abastecimiento de los precursores constituya UIE limitante, y hasta que ello suceda.) • Des el tiempo fijo, -20 min, que transcuru entre la culminacion de un ciclo de replicc.cion y Ia division de Ia celula con la cual est<. conectado. Este periodo puede representru el tiempo necesario para ensamblar los con:ponentes requeridos para la division. (Se puede considerar que las constantes C y D representan !a velocidad maxima a !a cualla bacteric. puede llevar a cabo estos procesos; dichas constante<: se aplican en todas las velocidades de crecimientr cuyo tiempo de duplicacion se encuentra entre l t y 60 min, si bien las dos fases constantes se alarga1~ cuando el ciclo celular ocupa >60 min.) Un ciclo de replicacion cromosomica debe ser iniciado en un tiempo fijo de C + D = 60 min ante: de una division celular. En las bacterias que se dividen a una frecuencia mayor de 60 min, un ciclo de replicacion debe ser iniciado antes del final del cicl de division precedente; podrfa decirse que una cduIa ha nacido preiiada con Ia siguiente generaci6n. Consicterese un ejemplo de cetulas que se dividen cad a 3 5 min. El ciclo de replicacion conectado c. una division debio haberse iniciado 25 min antes de Ia division precedente, situacion que se ilustra en Ia. ., , en la cual se muestra a! complement cromos omico de una celula bacteriana a intervalo. de 5 min durante el ciclo. En Ia division (35/0 min), la celula recibe un cromosoma parcialmente replicado. La horquilla d replica cion sig ue avanzando. A los 10 min, cuando esta horquilla de replicacion "antigua " aun n ha llegado a termino, Ia iniciacion ocurre en ambo. orfgenes del cromosoma parcialmente replicado. E inicio de estas "nuevas" horquillas de replicacion do. Iugar a un cromosoma de horquillas multiples. A los 15 min, esto es, 20 min antes de Ia siguiente division, la antigua horquilla de replicacio-

CAPITULO 17 La replicacion bacteriana esta conectada con el ciclo celular

~ "'a a termino . Su llegada permite que los dos cro- somas hijos se separen ; cada uno de ellos ya ha ·o replicado parcialmente por las nuevas horqui~ . de replica cion (las cuales ahora son las unicas . rquillas de replicacion) y siguen avanzando. En el punto de division, los dos cromosomas :ircialmente replicados se segregan, con lo cual se -::crea el punto en que se inicio. La horquilla de -=-licacion individual se torna "antigua", termina _c: 15 min y 20 despues tiene Iugar una division. _~ observa que eleven to de iniciacion ocurre F 5 / 3 5 =clos celulares antes del evento de division con el ~·..; al esta asociado. El principia general del vinculo entre la inicia::6n y el ciclo celular es que, conforme se acelera :~ crecimiento de las celulas (el ciclo se acorta), el :··ento de iniciacion ocurre a un numero mayor de .:::cios antes de la division relacionada, de modo que ·.ay mas cromosomas en Ia bacteria individu al. Esta ~ ~ Iacion puede verse como la respuesta de Ia celula .:. su incapacidad para reducir los periodos de C y de J para mantener el paso del ciclo mas corto.

El septo divide a una bacteria en bacterias hijas que contienen cada una un cromosoma

de la celula y constituye el sitio en que las dos celulas hijas finalmente se separan por completo. Dos preguntas relacionadas sefl.alan Ia fun cion del septo en la division: c.Que determina Ia ubicacion en Ia cua l se forma? c. Que garantiza que los cromosomas hijos se encuentren en !ados opuestos a el? La formaci on del septo va precedida porIa organizacion del anillo periseptal, que en E. coli o en Sa lmonella typhimu rium se observa como una zona en Ia cual se modifica Ia estructura de Ia envoltura, de manera que Ia membrana interna se conecta mas estrechamente con Ia pared celular y Ia capa de la membrana externa. Como sugiere su nombre, el an illo rodea a Ia celula. En Ia ·u se resume su desarrollo . La formacion del anillo empieza en el centro en una celula nueva. Conforme Ia celula crece, ocurren dos eventos, se forma un septo en Ia mitad de la celula cuya posicion es definida por el anillo, y se forman anillos nuevos a ambos !ados del anillo inicial. Estos nuevos anillos son desplazados del centro y se trasladan a lo largo de Ia celula a posiciones ubicadas a un cuarto y tres cuartos de Ia Iongitud de Ia celula, que seran las posiciones centrales de esta despues de Ia division siguiente. El desplazamiento del anillo periseptal a Ia posicion correcta puede ser el evento crucial que garantice la division de la

Conceptos principales • La formaci6n del septo inicia en el anillo localizado en torno a la celula donde se modifica la est ructura de la envoltura. • Nuevas anillos son iniciados a media dista ncia entre el septo y los extremes de la bacteria. • Cuando la bacteria se divide, cada hija posee un anillo en la porci6n central. • La formaci6n del septo empieza cuando la cHula llega a una longitud predeterminada. • El septo esta formado por los mismos peptidoglucanos que constituyen la envoltura bacteriana.

::..a segregacion cromosomica de las bacterias es t>specialmente interesante debido a que el DNA esta :mplicado en el mecanismo de Ia particion, lo cual contrasta con las celulas eucarioticas, en las cuales Ia segregacion se logra mediante el complejo mecanismo de Ia mitosis. El mecanismo bacteriano es bastante preciso, pero las celulas anucleadas constimyen <0.03% de una poblacion bacteriana. La division de una bacteria en dos celulas hijas se logra por la formacion de un septo, estructura formada en el centro de la celula a manera de una invaginacion de Ia envoltura circundante. El septo forma una barrera impenetrable entre las dos partes

,

-.

I •

La celula empieza con un anillo en el centro Se generan nuevos anillos Los anillos nuevos se desplazan hacia los poles Los anillos nuevos dejan de moverse El anillo central se transforma en un septo

- - - - - • La celula se divide La vista lateral muestra que el anillo abarca Ia circunferencia de Ia celula El corte transversal muestra que el anillo conecta a las membranas

Membrana externa Pared celular Membrana interna

CJ La duplicaci6n y el desplazamiento del anillo periseptal dan origen a la formaci6n de un septo que divide a la celula.

17.3 El septo divide a una bacteria en bacterias hijas que contienen cada una un cromosoma

411

orrgenes de los cromosomas en proceso de replicaci6n adheridos a Ia membrana Cromosomas hijos adheridos a Ia envoltura

El septo crece entre los cromosomas

El septo divide a Ia celula

Cromosomas distribuidos en las celulas hijas

I La adhesion del DNA bacteriano a la membrana podr1a proporcionar un mecanismo para la segregaci6n.

cetula en celulas hijas de dimensiones equivalentes. (Se desconoce el mecanismo de desplazamiento.) La formacion del septo empieza cuando Ia celula alcanza una longitud fija (2L) y Ia distancia entre los nuevos anillos siempre sera L. No sabemos como mide Ia celula Ia longitud, pero el parametro pertinente parece ser Ia distancia lineal como tal (no el area ni el volumen). El septo consta de los mismos componentes que la envoltura celular, una capa rfgida de peptidoglucano en el periplasma, entre Ia membrana interna y la membrana externa. El peptidoglucano esta formado por polimerizacion de unidades disacarido-tripeptido 0 disacarido-pentapeptido en una reaccion que implica conexiones entre ambos tipos de subunidades (transpeptidacion y transglicosilacion). La forma de varilla de la bacteria se mantiene merced a un par de elementos, PBP2 y RodA, que son protefnas que interactuan y son codificadas por el mismo operon . RodA es un miembro de Ia familia SEDS (por sus siglas en ingles, forma, elongacion, division y esporulacion [shape, elongation, division and sporulation]), presente en todas las bacterias, que tiene una pared celular de peptidoglucano. Cada protefna SEDS funciona con una transpeptidasa qu e cataliza Ia formacion de los enlaces cruzados del peptidoglucano. La PBP2 (protefna de union ala penicilina 2, penicillin-binding protein 2) es Ia transpeptidasa que interactua con RodA. Las mutaciones del gen de cualquiera de las dos protefnas provocan que Ia bacteria pierda su forma alargada y se tor412

ne redonda, demostracion del importante principio que asevera que la forma y Ia rigidez pueden ser determinadas por la simple extension de Ia estructura polimerica. Otra enzima es responsable de generar al peptidoglucano en el septo (vease Ia seccion 17.5. El producto FtsZ es necesario para la formacion de: septo). AI principia, el septo se forma con una cap a doble de peptidoglucano y la protefna EnvA es necesaria para dividir los enlaces covalentes formado entre las capas, de modo que las celulas hijas puedan separarse. El comportamiento del anillo periseptal sugiere que el mecanismo utilizado para medir Ia posicion se relaciona con Ia envoltura celular. Es plausible suponer que Ia envoltura podrfa tambien ser utilizada para garantizar Ia segregacion de los cromosomas. Un enlace directo entre el DNA y Ia membrana podrfa explicar Ia segregacion. Si los cromosomas hijos estan adheridos a Ia membrana, se separarfan fisicamente al formarse el septo. En Ia 4 se muestra que Ia forma cion de un septo podrfa segregar a los cromosomas en las diferentes celulas hijas si los orfgenes estan conectados con sitios que se encuentran a ambos lados del anillo periseptal.

1111

Las mutaciones de la division o la segregaci6n modifican la forma de la celula

Conceptos principales • Los mutantes fts forman filamentos largos debido a que el septo no se forma y no divide a la bacteria hija. • La s minicelulas se forman en los mutantes que producen demasiados septos; son pequenas y carecen de DNA. • La s celulas anucleadas de tamano normal son generadas por mutantes de partici6n en los cuales los cromosomas duplicados no logran separarse.

Una dificultad para aislar a los mutantes que afectan Ia division celular es que, en las funciones crfticas, las mutaciones pueden se r letales o pleiotropicas. Por ejemplo, si Ia formacion del anillo tiene Iugar en un sitio esencial para el crecimiento general de la envoltura, serfa diffcil distinguir entre las mutaciones que interfieren especfficamente con Ia formacion del anillo y las que inhiben el crecimiento general de Ia envoltura . La mayorfa de las mutaciones del mecanismo de division han sido identificadas como mutantes condicionales (en cuya division inciden condiciones no permisibles; habitualmente son sensibles a Ia temperatura). Las mutaciones que afectan a Ia division celular o a Ia segregacion de los cromosomas provocan cambios fenotipicos

CAPiTULO 17 La replicaci6n bacteriana esta conectada con el ciclo celular

superior: celulas de tipo Silvestre. _:erior: la fa lla de la division celular a temperaturas no per-

-\ibles genera filamentos multinucleares. Imagenes cortesia ::: Sota Hiraga, Kyoto University.

llamados por su filamentacion sensible a la temperatura, temperature sensitive filamentation) que identifican los defectos que yacen en el proceso de division mismo . • Las minicelulas se crean cuando el septa se forma con demasiada frecuencia o en un Iugar no adecuado, de modo que a una de las celulas hijas le falta un cromosoma. La minicelula es bastante pequefia y carece de DNA, pero por otra parte parece morfol6gicamente normal. Las celulas anucleadas se forman cuando la segregacion es aberrante, y como las minicelulas, carecen de cromosoma, pero como !a formacion del septa es normal, su tamafio no sufre modificaciones. Este fenotipo es provocado por los mutantes par, de particion (asf llamados por sus defectos en Ia segregacion cromosomica).

1111

El producto FtsZ es necesario para la formaci6n del septo

Conceptos principales • El producto de ftsl es necesario para la formacion del septo en sitios preexistentes. • FtsZ es una GTPasa que forma un anillo en el interior de la envoltura bacteriana y que esta conectada con otros componentes del citoesqueleto.

U f. coli genera celulas anucleadas cuando la se;·egacion cromosomica falla . Las celulas con cromosomas se ::- -en de azul, a diferencia de las celulas hijas que carecen de :- ~ mosomas . Este campo muestra celulas del mutante mukB; : ede observarse la division normal y la a normal. Imagen cor:_::..;ia de Sota Hi raga, Kyoto University.

'·ombrosos. En las y se ilustran ~s consecuencias opuestas de falla en el proceso de _:vision y de falla en Ia segregaci6n: • Los filamentos largos se forman al inhibirse la formacion del septo, pero Ia replicacion cromosomica no resulta afectada. La bacteria sigu e creciendo, incluso sigue segregando a sus cromosomas hijos, pero no se forma el septo. Asf pues, la celula consiste en una estructura filamentosa bastante larga con los nucleoides (cromosomas bacterianos) distrib uidos regularmente a lo largo de !a misma. Este fenotipo es el de los mutantes fts (asf

El gen ftsZ tiene un papel fundamental en la division; sus mutacion es bloquean la formacion del septo y generan filamentos. La expresion excesiva induce la forma cion de minicelulas al incrementarse el numero de eventos de formacion septal por masa de celula unitaria. Los mutantes ftsZ actuan en etapas que van del desplazamiento de los anillos periseptales a la morfogenesis septal, de modo que un FtsZ es un producto necesario para la utilizacion de los sitios preexistentes para Ia formacion del septa , pero en sf. no afecta !a formacion de los anillos periseptales o su localizacion. FtsZ funciona en una de las primeras etapas de la formacion del septa. AJ principia del ciclo de division se localiza en todo el citoplasma, y conforme se alarga la celula y empieza a constrefiirse en el centro, se localizara en un anillo en torno a la circunferencia. En ocasiones, a la estructura se le llama anillo Z. En la se muestra que se encuentra en la posicion del anillo central de la Figura 17. 3. La formacion de este anillo es el paso que limita !a velocidad de formacion del septo. En un ciclo de division celular tfpico, se forma en el centro de la celula de 1 a 5 min despues de la division, perdura durante 15 min y despues se constrifie para dividir a Ia celula en dos. 17.5 El producto FtsZ es necesario para la formacion del septo

413

"' La inmunofluorescencia con un anticuerpo contra FtsZ muestra que se localiza en el centro de la celula. Imagen cortesia de William Margolin, University of Texas Medical School at Houston.

La estructura de FtsZ es semejante a la de la tubulina, lo cual sugiere que el ensamble del anillo puede parecerse ala formacion de los microtubulos de las celulas eucarioticas. FtsZ tiene actividad GTPasa y la division por GTP se utiliza para respaldar Ia oligomerizacion de sus monomeros en la estructura anular. El anillo Z es una estructura dinamica en la cual hay un intercambio continuo de subunidades con acervo citoplasmico. Otras dos protefnas necesarias para la division, ZipA y FtsA, interactuan directamente y de forma independiente con FtsZ. ZipA es una proteina integral de membrana localizada en la membrana interna de las bacterias que proporciona los medios para ligar a FtsZ con la membrana. Esta ultima es una proteina citosolica, pero suele estar asociada con la membrana. El anillo Z puede formarse en ausencia de ZipA o de FtsA, pero no si ambas estan ausentes, lo cual sugiere que sus funciones se traslapan con la estabilizacion del anillo z y quiza con la vinculacion con la membrana. Los productos de muchos otros genesfts se unen al anillo Z en un orden definido despues de que la proteina FtsA ha sido incorporada, todas son proteinas transmembrana. A Ia estructura final suele llamarsele anillo septal, y esta formado por un complejo multiproteinico que se presume tiene la capacidad de constreiiir Ia membrana. Uno de los ultimos componentes en ser incorporado al anillo septal es FtsW, una proteina que pertenece ala familia SEDS.ftsWse expresa como parte de un operon con ftsl. el cual codifica a una transpeptidasa (tambien conocida como PBP3 [proteina de union a la penicilina 3, penicillin-binding protein 3] ), protefna unida a la membrana cuyo sitio catalitico se encuentra en el peri plasma. FtsW es responsable de incorporar a Ftsi en el anillo septal, lo cual sugiere un modelo para la formacion del septo en el que Ia actividad transpeptidasa provoca que el peptidoglucano crezca hacia adentro, empujando asf a la membrana interna y jalando a Ia externa. FtsZ es el principal componente del citoesqueleto para la formacion del septo; es comun en las bacterias y tambien se encuentra en los cloroplas-

414

1 La inmunofluorescencia con anticuerpos cont-: las protei nas FtsZ1 y FtsZ2 de Arabidopsis muestra que se l ·· calizan en el punto medio del. cloroplasto ( superior). L, imagen de campo brillante ( inferior) muestra el esque mo. del cloroplasto con mayor claridad. Fotograftas cortesia de K=therine Osteryoung, Michigan State University.

.

., se muestra Ia localizacion d: tos. En Ia los homologos de las plantas en un anillo, en e punto medio del cloroplasto. Los cloroplastos tan-.bien tienen otros genes relacionados con los de :: division bacteriana. Aparentemente se ha consevado el mecanismo de division, y coincide con l orfgenes evolutivos comunes de las bacterias los cloroplastos. Las mitocondrias, que tambien comparten u:origen evolutivo con las bacterias, usualmente c.c..recen de FtsZ; en cambio, utilizan una variante ala protefna dinamina involucrada en el estrang~ lamiento de las vesiculas desde las membranas d~ citoplasma eucariotico, Ia cual funciona desde :exterior del organelo, comprimiendo Ia membrar.: para generar una constriccion. Asf pues, Ia caracterfstica comun en Ia divisi ·de las bacterias, los cloroplastos y las mitocondri-o.. es el uso de una protefna citoesqueletica que fon:~..:. un anillo en torno al organelo y jala o empuja a :_ membrana para formar una constriccion.

CAPITULO 17 La replicaci6n bacteriana esta conectada con el ciclo celular

Los genes min regulan la localizaci6n del septo

I

~

Anillos


/\

• La ubicaci6n del septo es controlada par minC, -Dy-E.

I 11 I

• El numero y la localizaci6n de los septos depende de la proporci6n de MinE/MinC,O.

~

\

Palos derivados del septa

• El septo se forma en donde MinE puede formar un anillo.

~e_ Ia division anterior a Ia

r

ult1ma

• A concentraciones normales, MinC/ 0 permite la formaci6n de un anillo central, pero impide que se formen anillos adicionales de MinE en los palos.

::..as minicelulas mutantes proporcionan informaj on respecto de Ia localizacion del septo. La mu:J.cion original de las minicelulas se encuentra en :-1 locus minE, cuya delecion genera minicelulas a! . ermitir que tenga Iugar Ia separacion en los polos ·· (o en vez de) a mitad de Ia celula; esto sugiere que .!il celula posee la capacidad de iniciar la formacion :!el septo ala mitad o en los polos, y que Ia funcion J ellocus minE de tipo silvestre es suprimir Ia for: lacion de septos en estos iiltimos. En funcion de s eventos ilustrados en Ia Figura 17.3, esto implica _ue una celula recien nacida tiene sitios potenciaes de formacion de septos asociadas con el anillo .:entral y con los polos. Uno de los polos se formo iel septo de Ia division previa, mientras que el otro :epresenta al septo de Ia division anterior a ella. .}uiza los polos retienen remanentes de los anillos _e los cuales fueron derivados y estos remanentes • ueden nuclear la formacion del septo. Ellocus minE esta formado por tres genes, minC, 1inD y minE cuyas funciones se resumen en la ' ~ . Los productos de minC y de minD forman .in inhibidor de la division. MinD es necesaria para 5Ctivar a MinC, que impide que FtsZ se polimerice ,n el anillo Z. La expresion de Min CD en ausencia de MinE, o a expresion excesiva incluso en presencia de MinE, • rovoca una inhibicion generalizada de Ia division. :::1 resultado es que la celulas crecen como filamen: s largos, sin septo. La expresion de MinE en ni··d es comparables a MinCD confina la inhibicion a .35 regiones polares, restaurando asf el crecimiento ormal. MinE protege de la inhibicion a los sitios de :::Utad de la celula. La expresion excesiva de MinE .::J.duce Ia formacion de minicelulas porque el exceso e la misma contrarresta la inhibicion en los polos :· a mitad de la celula, permitiendo que se formen .us septos en ambas ubicaciones. El determinante de Ia formacion de los septos :'U el sitio adecuado (a mitad de Ia celula) es, por lo -:.1nto, la proporcion de MinCD respecto de MinE.

Septa

Palos derivados del septa de Ia ultima division

l

( 1 )~( 11) Capacidad de formacion del septa

..... . ·! · .••• MinE

Formacion del septa

lnhibidor MinC/D

Capacidad de formacion del septa

MinC/ 0 es un inhibidor de la division cuya acci6n se limita a los sitios polares par MinE .

El nivel silvestre impide la formacion de septos en los polos, pero Ia permite a mitad de Ia celula. Los efectos de MinC /D y de MinE estan relacionados inversamente; la ausencia de MinCD o el exceso de MinE provoca Ia formacion indiscriminada de septos, creandose minicelulas; asimismo, una gran cantidad de MinCD o Ia ausencia de MinE inhibe los sitios de mitad de la celula y los de los polos, lo cual resulta en filamentacion . MinE forma un anillo en Ia posicion septal, pero su acumulacion suprime la accion de MinCD en las cercanias, permitiendo asi la forma cion del anillo septal (el cual incluye FtsZ y Zip A). Curiosamente, para Ia formacion del anillo MinE, se necesita MinD.

1111

La segregaci6n cromos6mica puede requeri r de recombinaci6n especifica de sitio

Concepto principal • El sistema de recombinaci6n espedfica del sitio Xer actua en una secuencia diana ubicada cerca del termino del cromosoma para recrear mon6meros si un evento de recombinaci6n generalizada ha transformado al cromosoma bacteriano en un dimero.

17.7 La segregaci6n cromos6mica puede requerir de recombinaci6n especifica de sitio

415

.........

;

Cfrculo dimerico

1

Rewmbio.ci6':_

Ci""'" mocom6ciw'

)

La recombinaci6n intermolecular fusiona mon6meros para formar dimeros, en tanto que la recombinaci6n intramolecular libera unidades indi viduates de los olig6meros.

La celula tiene un solo cromosoma circular

Empieza Ia replicaci6n bidireccional

La replicaci6n se mueve en torno al cromosoma

/

Sin recombinaci6n Los cromosomas hijos se alejan

Los cromosomas hijos se segregan

Recombinaci6n general El movimiento es constrenido

La recombinaci6n especffica de sitio Iibera a los cromosomas

X Los cromosomas hijos se segregan

Un cromosoma circular se replica para producir dos hijos monomericos que se segregan a las celulas hijas. Sin embargo, un evento de recombinaci6n generalizada crea una sola molecula dimerica que puede separarse en dos mon6meros par una recombinaci6n especifica de sitio.

416

Las multiples copias de un plasmido en una bacteri.:. constan de las mismas secuencias de DNA, de mod que son capaces de recombinarse. En la -l 17. se demuestran las consecuencias. Un solo event de recombinacion intermolecular entre dos cfrcu · los genera un cfrculo dimerico, y la recombinaci6r_ posterior puede generar formas multimericas superiores. Un evento de tales caracteristicas reduce e: n{Imero de unidades fisicamente separadas. En el caso extrema de un plasmido de una sola copia. recien replicado, la formacion de un dimero por recombinacion significa que Ia celula solo tiene una unidad para segregar y, por lo tanto, el plasmid debe ser eliminado inevitablemente de una celula hija . Para contrarrestar este efecto, los plasmidos suelen tener sistemas de recombinacion especifica de sitio que actuan en secuencias particulares para promover una recombinacion intramolecular que restablece Ia condicion monomerica . Los mismos eventos pueden ocurrir con el cromosoma bacteriano. En la se muestra Ia forma en que afectan a su segregacion . Sino hay recombinacion, no hay problema, y los cromosoma hijos pueden segregarse a las celulas hijas, pero en caso de recombinacion homologa entre los cromosomas hijos producidos por un ciclo de replicacion, se producira un dimero. Si ha ocurrido uneven to de replicacion de estas caracteristicas, los cromosomas hijos no podran separarse, en cuyo caso se requiere de un segundo evento de recombinacion para lograr la resolucion de Ia misma forma que un dimero de plasmido. La mayor parte de las bacterias con cromosomas circulares cuenta con el sistema de recombinacion especifica de sitio Xer. En E. coli esta formado por dos recombinasas, XerC y XerD, las cuales actuan en un sitio diana de 28 bp, denominado dzf, que se localiza en la region terminal del cromosoma. El uso del sistema Xer se relaciona con Ia division celular de manera interesante. Los eventos destacados se muestran en Ia . XerC puede unirse a un par de secuencias dify formar una union Holliday. El complejo puede formarse poco despues de que Ia horquilla de replicacion pase por la secuencia dif, !o cual explica Ia forma en que las dos copias de Ia secuencia diana pueden encontrar otra de forma consistente. Sin embargo, Ia resolucion de Ia union para producir recombinantes, ocurre solo en presencia de FtsK, una proteina localizada en el septo que es necesaria para Ia segregacion de los cromosomas y Ia division celular. Ademas, la secuencia diana dzf debe localizarse en una region de -30 kb, pero si es desplazada fuera de esta, no podra respaldar la reaccion. Asi pues, hay una recombinacion especifica de sitio disponible cuando la secuencia termina l


del cromosoma esta cerca del septo. No obstante, :a bacteria desea tener una recombinacion solo cuando ya ha tenido Iugar un evento de recombinacion para generar un dfmero (ide otra man era Ia recomb ina cion especffica de sitio crearfa el dimero!) i Como sa be el sistema si un cromosoma hij o existe en forma de monomeros independientes o ha sido recombinado en un dfmero? La respuesta puede ser que Ia segregacion de :os cromosomas empieza poco despues de Ia replicacion. Sino ha habido recombinacion, los dos cromosomas se alejan uno del otro. Sin embargo, Ia ca;Jacidad de las secuencias pertinentes para apartarse una de otra, puede ser constreiiida si se ha formado un dimero, lo cuallas fuerza a permanecer cerca del septo, donde estan expuestas al sistema Xer. Las bacterias con sistema Xer siempre tienen un homologo de FtsK y viceversa, lo cual sugiere que el sistema ha evolucionado de manera tal, que Ia reso!ucion esta conectada al septo. FtsK es una protefna :ransmembrana extensa cuyo dominio terminal N esta asociado con la membrana y hace que esta se localice en el septo. Su dominio terminal C tiene dos funciones, provocar que Xer separe a un dfmero en dos monomeros, ademas de una actividad ATPasa que puede utilizar para transferirse a lo largo del DNA in vitro, que podrfa utilizarse para bombear el DNA a traves del septo, de Ia misma forma en que SpoiiiE transporta al DNA del compartimiento madre ala pre-espora durante la esporulacion. (Vease Ia seccion 17 .8, La particion implica a la separacion de los cromosomas.)

La partici6n implica la separaci6n de los cromosomas Conceptos principales • Los origenes de los replicones pueden estar adheridos a la membrana interna de la bacteria. • Los cromosomas realizan movimientos abruptos del centro a las posiciones que se encuentran a 1/4 y a 3/4 de la longitud total de la celula.

La particion es el proceso por el cuallos dos cromosomas hijos se ubican uno a cada ]ado de la posicion en que se forma el septo, y para que sea adecuada, se necesitan dos tipos de eventos: • Los dos cromosomas hijos deben ser liberados uno del otro para que puedan segregarse despues de Ia terminacion, para lo cual es necesario el desenrollado de las regiones del DNA enrolladas una con otra cerca del termino. La mayor parte de las mutaciones incide en el map eo de los genes que codifi-

Los cromosomas son ligados en el sitio de recombinaci6n

1 t

La recombinasa Xer forma I una union en dif ~

~a

"'"";, 1:5 FtsK es necesaria para Ia

I

Un evento de recombinacion crea dos cromosomas ligados. Xer crea una union Holliday en el sitio dif, pero puede separarla solo en presencia de FtsK.

can a las topoisomerasas con capacidad para pasar de una cadena de DNA a otra. Las mutaciones impiden que los cromosomas hijos se segreguen, con el resultado de que el DNA se localice en una sola masa extensa, a mitad de la celula. Posteriormente, con la formacion del septo se Iibera una celula anucleada y una que incluye ambos cromosomas hijos, indicia de que Ia bacteria debe ser capaz de desenrollar sus cromosomas de forma topologica para poder segregarlos en diferentes celulas hijas. • Las mutaciones que afectan el proceso de particion son raras, pero suelen encontrarse dos clases; las mutaciones de actuacion en cis deben ocurrir en las secuencias de DNA que fungen como diana para el proceso de particion, en tanto que las mutaciones de actuacion en trans se presentaran en los genes que codifican a las protefnas que provocan la segregacion, los cuales pueden incluir protefnas que se unen al DNA o a actividades que controlan la localizacion en 17.8 La partici on i mplica la separacion de los cromosomas

417

Ia envoltura, a las cuales puede adherirse el DNA. Ambos tipos de mutaciones han sido encontrados en los sistemas responsables de Ia particion de los plasmidos, pero en el cromosoma bacteriano solo se han encontrado las funciones de actuacion en trans. Por otra parte, las mutaciones en los sistemas de recombinacion especffica de sitio de plasmidos incrementan la perdida del plasmido (de bido a que la celula en proceso de division tiene solo un dfmero para la particion, y no dos monomeros), de modo que su fenotipo es similar al de los mutantes de particion. La forma original del modelo de segregacion cromosomica que se muestra en la Figura 17.8 sugiere que Ia envoltura crece por insercion de material entre los sitios de adhesion de los dos cro mosomas, apartandolos. De hecho, la pared celular y Ia membrana crecen de forma heterogenea en toda la superficie celular. Mas aun, los cromosomas replicados son capaces de moverse abruptamente a sus posiciones finales localizadas a un cuarto y a tres cuartos de la longitud total de la celula. Si se inhibe Ia sfntesis protefnica antes de Ia terminacion de Ia replicacion, los cromosomas no pueden segregarse y permanecen cerca de Ia mitad de la celula. Sin embargo, cuando a la sfntesis protefnica se le permite reiniciar, los cromosomas se mueven a las posiciones ubicadas en uno y tres cuartos de la longitud en ausencia de cualquier elongacion posterior de la envoltura, lo cual sugiere que un proceso activo, es decir, que requiere de Ia sfntesis proteinica, puede desplazar a los cromosomas a ubicaciones especfficas. La segregacion es interrumpida por mutaciones de clase muk, las cuales originan una progenie anucleada cada vez con mayor frecuencia y los dos cromosomas hijos permanecen en el mismo !ado del septo, en vez de segregarse. Las mutaciones que suceden en los genes muk no sonletales y permiten identificar a los componentes del m ecanismo que

El DNA de un solo nucleoide progenitor se descondensa durante la replicaci6n . El mukB es un com ponente esencial del mecanismo que condensa de nuevo los nucleoides hijos.

418

segrega a los cromosomas. El gen mukA es identic al de una protefna de membrana externa conocda (to/C), cuyo producto podrfa estar implicado co:la adhesion del cromosoma a la envoltura. El ge:::_ mukB codifica a una protefna globular ex tens a ( 18: kD) que tiene el rnismo tipo general de organizaci ' que los dos grupos de proteinas de mantenimie to estructural de los cromosomas (SMC, structur· maintenance of chromosomes) involucrados enla cor:densacion y el mantenimiento de la union de 1 ~ cromosomas eucarioticos (vease la seccion 31.6, L::. condensacion de los cromosomas es provocada p o~ las condensinas). En otras bacterias tambien ha sido encontradas proteinas de tipo SMC. El conocimiento de la funcion de MukB se derivo del descubrimiento de que algunas mutacion~ en mukB pueden ser suprimidas por mutaciones e tapA, gen que codifica a Ia topoisomerasa I. MukB forma un complejo con otras dos protefnas, MukE y MukF, de modo que se considera que el complej MukBEF es un analogo de la condensina para k condensinas eucarioticas. Utiliza un mecanismo de superenrollamiento para condensar al cromosoma. Un defecto de esta funcion es la causa de la incapacidad para segregar apropiadamente, el cual puede compensarse al impedir que las topoisomerasas relajen los superenrollados negativos; el incrementc resultante en la densidad del superenrollado ayud<: a restaurar el estado de condensaci6n apropiado y por lo tanto, permite la segregacion. Todavia se desconoce como se posicionan lo genomas en Ia celula, pero el proceso puede esta~ relacionado conla condensacion. En la GJ 17 1 se muestra un modelo actual. El genoma progenitor esta en el centro, y debe ser descondensado para. atravesar el mecanismo de replicacion. Los cromosomas hijos emergen de la replicacion, son desenrollados por las topoisomerasas y despues, en ur_ estado no condensado, pasan a MukBEF, de mod que formen masas no condensadas en posicione~ que llegaran a ser los centros de las ce!ulas hijas. Durante aiios se ha sospechado que existe un vinculo ffsico entre el DNA de las bacterias y la membrana, pero las evidencias siguen siendo ambiguas _ El DNA bacteriano suele encontrarse en fracciones de membrana, las cuales tienden a ser abundante5 en marcadores geneticos cerca del origen, la horquilla de replicacion y el termino. Las proteinas presentes en dichas fracciones de membrana pueder. ser afectadas por mutaciones que interfieren cor: el inicio de Ia replicacion. El sitio de crecimiento podria ser una estructura de la membrana a la cua~ debe adherirse el origen para la iniciaci6n. Durante la esporulacion en Bacillus subtilis, ur cromosoma hijo debe ser segregado en el peque-


- compartimiento de la pre-espora (vease la Fig. _Al). Se trata de un proceso in usual que implica - :ransferencia del cromosoma a traves del septo - ~ iente. Uno de los genes de esporulacion, spoiiiE, _ necesario para el proceso. La protefna SpoiDE se :aliza en el septo y probablemente tiene una fun, n de translocacion que bombea el DNA a traves --:-I compartimiento de Ia pre-espora.

Los plasmidos de una sola co pia tienen un sistema de partici6n Conceptos principales • Los plasmidos de una sola copia existen a raz6n de una copia de plasmido por cada origen de cromosoma bacteria no. • Los plasmidos de capias multiples existen en mas de una copia de plasmido por cada origen de cromosoma bacteriano. • La recombinaci6n hom6loga entre los plasmidos circulares genera dimeros y multimeros superiores. • Los plasmidos tienen sistemas de recombinaci6n especifica de sitio que llevan a cabo la recombinaci6n intramolecular para regenerar mon6meros. • Los sistemas de partici6n garantizan que los plasmidos duplicados sean segregados a celulas hijas distintas producidas por una division.

::1 tipo de sistema que utiliza un plasmido para ga :antizar que se distribuya entre las dos celulas hias en la division depende del tipo de sistema de :eplicacion. Cada tipo de plasmido conserva en su _ospedador bacteriano un numero de copias ca:acterfstico: • Los sistemas de control de una sola copia son semejantes al del cromosoma bacteriano y resultan en una replicacion por division celular. Un plasmido de una sola copia conserva de manera efectiva Ia paridad con el cromosoma bacteriano. • Los sistemas de control de copias multiples permiten varios eventos de iniciacion por ciclo celular, lo cual resulta en numerosas copias del plasmido por bacteria, siempre un numero caracterfstico (tfpicamente de 10 a 20) por cromosoma bacteriano. El numero de capias se debe principalmente al tipo de mecanismo de control de la replicacion . El -is.tema responsable de iniciar la replicacion determina cuantos orfgenes puede haber en Ia bacteria . Cada plasmido esta formado por un solo replicon, e modo que el numero de origenes es igual al numero de moleculas de plasmido.

Los plasmidos de una sola copia cuentan con un sistema para el control de la replicacion cuyas consecuencias son similares a las del sistema de replicacion que gobierna al cromosoma bacteriano. Un origen individual puede ser replicado una sola vez y los orfgenes hijos son segregados a las diferentes celulas hijas. Los plasmidos de capias multiples tienen un sistema de replicacion que permite que exis ta un acervo de orfgenes. Si el numero es suficientemente grande (en Ia practica, mas de l 0 por bacteria), no se necesita un sistema de segregacion acti va, pues incluso una distribucion estadfstica de los plasmidos respecto de las celulas hijas resultarfa en Ia perdida de plasmidos a frecuencias de < l0-6 • Los plasmidos se mantienen en las poblaciones bacterianas con rangos de perdida muy bajos (tfpicamente < l o-7 por division celular, incluso para los plasmidos de una sola copia) . Los sistemas que controlan !a segregacion de los plasmidos se pueden identificar por mutaciones que incrementan Ia frecuencia de Ia perdida, pero que no inciden en la replica cion misma. Para garantizar !a supervivencia de un plasmido en la poblacion bacteriana se utilizan diversos mecanismos. Es comun que el plasmido porte numerosos sistemas, a menudo de diferente tipo, que actuan de manera independiente para garantizar su supervivencia. Algunos lo hacen de manera indirecta, mientras que otros participan directamente en la regulacion del evento de particion. Sin embargo, en funcion de Ia evolucion, todos tienen el mismo fin: ayudar a garantizar la perpetuacion del plasmido en el ntlmero maximo de bacterias de progenie. Los plasmidos de una sola copia requieren de sistemas de partici6n para asegurar que las copias duplicadas se ubiquen en !ados opuestos del septo en Ia division celular, de modo que son segregados a una celula hij a distinta. De hecho, las funciones involucradas en Ia particion fueron identificadas por primera vez en los plasmidos. En Ia se ilustran los componentes de un sistema comun; en general hay dos loci de actuacion en trans (pa rA y · ·

·ParA·y ParB actuan·en pa

parA

para

I( Un sistema de segregaci6n comCtn esta formado por los genes parA y parB y por el sitio diana parS.

17.9 Los plasmidos de una sola copia tienen un sistema de partici6n

419

Sitio de union

aiiHF

El complejo de partici6n se forma cuando el IHF se une al DNA en parS y lo dobla para que ParB pueda unirse a los sitios que se encuentran a ambos lados. El complejo es iniciado por un heterodimero de IHF y un dimero de ParB y despues se unen mas dimeros de ParB.

parE) y un elemento de actuacion en cis (parS ) lo calizados justo en flujo descendente respecto de los dos genes. ParA es una ATPasa que se une a ParB, y esta, a su vez, con el sitio parS del DNA. Una delecion en cualquiera de los tres loci impide la particion adecuada del pLismido. Se han caracterizados sistemas de este tipo en los pL:J.smidos F. Pl y R l. A pesar de sus similitudes generales, no hay homologia de secuencia significativa entre los genes correspondientes ni entre los sitios de actuacion en cis. La funcion de parS en el plasmido equivale a la del centromero en una celula eucariotica. Su union con Ia protefna ParB crea una estructura que segrega las capias del plasmido a celulas hijas opuestas. Una protefna bacteriana, IHF, tambien se une con este sitio para integrarse a la estructura. El complejo formado por ParB e IHF con parS se denomina complejo de particion. parS es una secuencia de 34 bp que contiene el sitio de union con IHF y esta flanqueada en ambos !ados por secuencias denominadas boxA y boxB, unidas por ParB. IHF es el fa ctor hospedador de integracion (integration host factor), asf llamado por la funcion en Ia cual se descubrio (formando una estructura implicada en la integraci6n del DNA del fago A al cromosoma hospedador). IHF es un heterodimero con capacidad para formar una estructura grande en la cual envuelve el DNA en la superficie. La funcion del IHF es doblar el DNA para que ParB pueda unirse simultaneamente a los sitios boxA y boxB separados, como se indica en Ia La formacion del complejo se inicia cuando parSes unida por un heterodfmero de IHF con un d!mero de ParB, lo cual permite que mas dfmeros de ParB se unan de forma cooperativa. La interaccion de ParA con la estructura del complejo de particion es esencial, pero transitoria. El complejo protefna -DNA que se ensambla en el IHF durante Ia integracion del fago 'A se une ados 420

moleculas de DNA para permitirles recombinaE : (vease la secci6n 19.19, La recombinacion del fag 'A ocurre en un intasoma) . La fun cion del compl . de particion es diferente, garantizar que dos molcculas de DNA se segreguen separadas una de OlE Aun se desconoce de que manera Ia formaci6n d~ complejo individuallogra ll evar a cabo dicha tare~ Una posibilidad es que adhiere el DNA a un sit: ffsico, por ejemplo, la membrana, y despues los _:. tios de adhesion sean segregados por crecimien: del septo. En numerosas bacterias se encuentran prote nas relacionadas con ParA y ParB; en B. subtilis _: denominan Soj y SpoOJ, respectivamente. Las m t:taciones de estos loci impiden la esporulaci6n de ' · do a una falla de segregacion de un cromosoma hf · dentro de la pre-espora (vease la Fig. 11.42). En Ia._ ce!ulas en proceso de esporulaci6n, SpoOJ se loc2. liza en el polo y podr!a ser responsable de locali:za. a hi el origen. SpoOJ se une a una secuencia preser.teen multiples capias dispersas en -20% del crom soma, cerca del ori.gen. Por otra parte, es posible ql.;e se una a orfgenes nuevas y antiguos, mantenienc un estado equivalente al apareamiento cromos ' mico, hasta que los cromosomas sean segregados ~ los polos opuestos. En Caulobacter crescentus, ParA : ParB localizan a los polos de la bacteria y ParB u : secuencias cercanas al origen, de modo de localiz.r al origen en el polo. Estos resultados sugieren qu:un mecanismo especffico es responsable de ubica; el origen en el polo. La siguiente etapa del analis' consistira en identificar los componentes celulare-: con los cuales interactua el mecanismo. La importancia del plasmido para garantizar que todas las ce!ulas adquieran replicas del plasmido St subraya porIa existencia de multiples sistemas independientes en plasmidos individuales que garantiza~ Ia partici6n apropiada. Los sistemas de adiccion cuya operacion se basa en Ia expresion "andam . juntos o andamos separados", garantizan que un.:. bacteria que porta un plasmido pueda sobrevi\-:::solo mientras lo retenga. Hay muchas formas degc.rantizar que una celula muera si es "curada" de u::. plasmido, las cuales comparten el principia ilustrad en la de que el plasmido produce e. veneno y el ant!doto. El veneno es una sustanci-::. asesina relativamente estable, mientras que el anr:doto consta de una sustancia que bloquea la acci6;::, asesina, pero cuyo lapso de vida es relativamente: corto. Cuando el plasmido se ha perdido, el antidOi se degrada, de mod o que Ia sustancia asesina pr voca Ia muerte de Ia celula. As! pues, las bacteric: que pierden el plasmido mueren inevitablemente · la poblaci6n esta condenada a retener el plasmid de manera indefinida. Estos sistemas asumen varia.· formas. Una de las especificadas por el plasmido :


0

Cicio celular de un plasmido ~ :n: El plasmido crea al ___. '~ Asesino I) asesino y ; ~ -~ al antfdoto Anildoto

Cicio celular de plasmidos incompatibles

..... . . ..

La celula crece 1: pero los plasmidos f no se replican porque ya hay dos origenes

I La celula crece y f el plasmido se ~ ~'l:IC Asesino ~ J )

La perdida del plasmido deja a un asesino y a un antfdoto

~;; 0 -.r-

An!ldoto

replica

'• II ~

0

0 ' La celula se divide

El antfdoto es degradado

'

La celula se divide

1:1

Cada celula tiene una copia del mismo pl<1smido

El asesino destruye a Ia celula

Los plasmidos incompatibles se han distribuido en celulas diferentes

Dos plasmidos son incompatibles (pertenecen al mismo grupo de compatibilidad) si sus origenes nose diferencian en la etapa de iniciaci6n. El mismo modelo podria aplicarse a la segregaci6n.

Asesino

Los plasmidos podrian asegurar que las bacte; as no sobrevivan sin ellos al sintetizar a un asesino de larga ~day a un antidoto de vida corta.

El modelo de control negative para Ia incompatibilidad de los plasmidos se deriva de Ia idea de que el numero de copias logra controlarse al sintetizar un represor que mide Ia concentraci6n de orfgenes. (Formalmente, es el mismo que el modelo de titulaci6n para Ia replicaci6n regulad ora del cromosoma bacteriano.) La introducci6n de un nuevo origen como segundo plasmido del mismo grupo de compatibilidad imita el resultado de Ia replicaci6n del plasmido residente, de modo que habra dos orfgenes. Por tanto, se impide cualquier replicaci6n posterior basta que los dos plasmidos hayan sido segregados a celulas diferentes para crear el n(tmero correcto de copias previas a Ia replicaci6n, como se ilustra en Ia

.::onsiste en proteinas asesinas y bloqueadoras. El asmido Rl tiene un asesino que es el RNAm para _na proteina t6xica; el antfdoto es un RNA antisen:ido pequefio que impide Ia expresi6n del RNAm.

La ·incom patibilidad de los plasmidos depende del replic6n Concepto principal • Los plasmidos que se encuentran en un solo grupo de compatibilidad tienen origenes regulados por un sistema de control comun.

::1fen6meno de Ia incompatibilidad de los plasrnidos ~sta relacionado con la regulaci6n del numero de :opias del mismo y con Ia segregaci6n. Un grupo de compatibilidad se define como un conjunto de plasmidos cuyos rniembros son incapaces de coexis:·r en Ia misma celula bacteriana. La raz6n de esta :n compatibilidad es que noes posible distinguir uno del otro en alguna etapa esencial para el manteni~iento del plasrnido; esto seria aplicable en Ia repli:aci6n y segregaci6n del DNA.

El efecto serfa similar si el sistema de segregaci6n de los productos a las celulas hijas no pudiera distinguir entre dos plasmidos. Por ejemplo, si dos plasmidos tienen los mismos sitios de partici6n de actuaci6n en cis, Ia competencia entre ellos aseguraria que fueran segregados a celulas diferentes, y no podrian sobrevivir en la misma lfnea. La presencia de un miembro de un grupo de compatibilidad no afecta directamente la supervivencia de un plasmido perteneciente a un grupo diferente. Solo un replic6n de un grupo de compatibilidad dado (plasmido de una sola copia) puede ser mantenido en la bacteria, pero no interactua con los replicones de otros grupos de compatibilidad.

17.10 La incompatibilidad de los plasmidos depende del replic6n

421

IIIII El sistema de compatibilidad ColE1 es controlado por un regulador de RNA Conceptos principales • La replicaci6n de ColE1 exige que la transcripci6n pase por el origen, donde el transcrito es dividido por la RNAasa H para generar un extrema cebador. • El RNA I regulador es un RNA corto antisentido que se aparea con el transcrito e impide la division que genera el extrema cebador. • La prote\na Rom potencia el apareamiento entre el RNA I y el t ra nscrito.

El numero de copias y el sistema de incompatibilidad mejor caracterizados son los del pl.ismido ColE1, plasmido de capias multiples que se mantiene en un nivel estable de - 20 capias por cada celula de E. coli. El sistema para conservar el numero de capias depende del mecanismo para iniciar Ia replicacion en el origen Co!El, como se ilustra en la l 1. La replicacion empieza con la transcripdon de un RNA que inicia 55 5 bp de flujo ascendente del origen. La transcripcion continua a traves del ori-

l

La transcripci6n rebasa al origen

La RNAasa H divide al RNA

gen. La enzima RNAasa H (cuyo nombre refleja st. especificidad por un sustrato de RNA hibridado cor. DNA) divide al transcrito en el origen, lo cual genera un extrema 3'-0H que se utiliza como "cebador· en el cual inicia la sfntesis de DNA (el uso de lo' cebadores se discute con mayor detalle en Ia secci6r. 18.8, La imprimacion es necesaria para iniciar lei sfntesis de DNA) . El RNA cebador forma un hfbridC' persistente con el DNA. El apareamiento entre e: RNA y el DNA ocurre justa en flujo ascendente partir del origen (mas o menos en Ia posicion -20 y tambien mas lejos, en flujo ascendente (cerca de Ia posicion -265). Dos sistemas reguladores ejercen sus efectos e el cebador de RNA, uno involucra la sfntesis de u .. RNA complementario al cebador y el otro implica una protefna codificada por un locus cercano. La especie reguladora de RNA I es una molecule. de -180 bases coclificada por la cadena opuesta a lc. especffica del cebador de RNA. La relacion entre e~ RNA cebador y el RNA I se ilustra en la ll A 7.1 La molecula de RNA I inicia en la primera region : termina cerca del sitio en que inicia el RNA cebador de modo que el RNA I es complementario de Ia region terminal 5' del RNA cebador. El apareamient~ de bases entre las dos moleculas de RNA control.?. Ia disponibilidad del RNA cebador para iniciar u ciclo de replicacion. Una molecula de RNA, como el RNA I, que funciona gracias a su complementariedad con otr RNA codificado en la misma region, se denomina contratranscrito. Este tipo de mecanismo, por supuesto, es otro ejemplo del uso del RNA antisentid (vease Ia seccion 13.7, Las moleculas pequefias d ~ RNA son capaces de regular la traduccion). Las mutaciones que reducen o eliminan Ia compatibilidad entre plasrnidos pueden obtenerse al seleccionar a plasrnidos del rnismo grupo por su capacida ~ para coexistir. Las mutaciones de incompatibilidad e _ ColE 1 se mapean en Ia region de superposicion entre el RNA I y el RNA cebador. Esta region se represent::. en dos RNA distintos, de tal manera que uno o amb ~ podrfan estar involucrados en el efecto. Cuando el RNAI es agregado a un sistema par.: replicar DNA ColE I in vitro, inhibe Ia formacion de RNA cebador activo, pero Ia presencia de RNA I nc

.. . . .... .

r:• La replicacion del DNA ColE1 se inicia al dividir el RNA cebador para generar un extrema 3'-0H. El cebador forma un hibrido persistente en la region de origen.

422

.

H !R "i 1 La secuencia del RNA I es complementaria la region 5' del RNA cebador.

CAPiTULO 17 La replicacio n bacteriana esta conectada con el ciclo celular

c~

ibe Ia iniciacion ni Ia elongacion de Ia sintesis .:el RNA cebador, lo cual sugiere que el RNA I im- 'd e que Ia RNAasa H genere a! extremo 3' del RNA ~ -bador. Este efecto se basa en el apareamiento de ~a ses entre el RNA I y el RNA cebador. Las dos moleculas de RNA tienen la misma es-::-uctura secundaria potencial en esta region, con ~ es horquillas duplex que terminan en lazos de :adena individual. Las mutaciones que reducen la __ compatibilidad se localizan en dichos lazos, lo cual _;giere que el paso inicial del apareamiento de ba:s entre el RNA I y el RNA cebador es un o 7:-ttre los lazos no apareados. c.De que manera el apareamiento con el RNA I ..:npide Ia division para formar el RNA cebador? En = JGUR 20 se ilustra un modelo. En ausencia .:: RNA I, el RNA cebador forma su propia estruc_ra secundaria (que involucra lazos y tallos). Sin :-:nbargo, cuando el RNA I esta presente, las dos oleculas se aparean y forman una estructura de .:. ble cadena a todo lo largo del RNA I. La nueva :::;rrl!lctura secundaria impide la formacion del ceba::. r, probablemente porque afecta Ia capacidad del ~~A para formar el hfbrido persistente.

SIN APAREAMI ENTO

Cebador de RNA

APAREAMIENTO RNA I

ruin

El modelo se asemeja al mecanismo implicado en la atenuacion de la transcripcion, en el cual los aparearnientos alternativos de una secuencia de RNA perrniten o impiden la formacion de la estructura secundaria necesaria para la terminacion por la polimerasa de RNA (vease la seccion 13.2, Las estructuras secundarias alternas controlan la atenuacion). La accion del RNA I es ejercida por su capacidad para afectar a regiones distantes del precursor del cebador. Formalmente, el modelo equivale a postular un circuito de control que implica dos especies de RNA. Un precursor de un RNA cebador de gran tamafio es un regulador positivo, necesario para iniciar la replicacion. El RNA I pequefio es un regulador negativo susceptible de inhibir la accion del regulador positivo. Por su capacidad para actuar en cualquier plasrnido presente en Ia celula, el RNA I proporciona un represor que impide que funcione el DNA recientemente inducido, funcion analoga a la del represor lisogenico de A (vease Ia seccion 14.9, El represor y sus operadores definen Ia region de inmunidad). En vez de una proteina represora que se une al DNA nuevo, un RNA une al precursor recien sintetizado al cebador de RNA. La union entre el RNA I y el RNA cebador puede ser influida por la proteina Rom, la cual es codificada por un gen que se encuentra en flujo descendente respecto del origen. La proteina Rom potencia la union entre los transcritos de RNA I y de RNA cebador de >200 bases. El resultado es Ia inhibicion de la formacion del cebador. c. Como afectan las mutaciones de los RNA a la incompatibilidad? En la -t se muestra una

......

.lnicia el apareamiento de bases

El RNA I actua en cualquier cebador de RNA codificado por su propio genoma

.....

Tipo I

Ill Ill Ill

iJ~O~

Tipo II

liiliilff ..... ~

·-

La transcripci6n continua

I

El RNA I con secuencia diferente no puede actuar en el cebador de RNA

.....

Tipo I + tipo II

El apareamiento de bases con el RNA I pue: ~ cambiar la estructura secundaria de la secuencia del RNA ..:: :ador y, por lo tanto, impedir la division para generar un '-::' emo 3'-0H.

JRA 11. 2

·I

Division

GU 1 L Las mutaciones de la region que codifica al RNA I y al precursor del cebador no necesitan incidir en su capacidad para aparearse; sin embargo, pueden impedir el apareamiento con el RNA complementario codificado par un plasmido diferente.

17 .11 El sistema de com patibilidad ColEl es controlado por un regulador de RNA

423

situacion en que una celula contiene dos tipos de secuencia RNA I/RNA cebador. El RNA I y el RNA cebador creados a partir de un tipo de genoma pueden interactuar, pero el RNA I de un genoma no interactua con el RNA cebador del otro genoma. Esta situacion se ariginaria cuando una mutacion en la region comun al RNA I y al RNA cebador ocurriera en una ubicacion implicada en el apareamiento de bases entre ellos. Cada RNA I seguiria apareandose con el RNA del cebador codificado par el mismo plasmido, pero podria ser incapaz de aparearse con el RNA cebador codificado par el otro, lo cual provocaria que el plasmido original y el mutante se comportaran como de grupos de compatibilidad diferentes.

E11fJ (C6mo se rep lican y segregan las mitoco ndrias?

Una mitocondria se divide al desarrollar u:: anillo en torno al arganelo que lo estrangula paro. dividirlo .en dos mitades. En principia, el mecanism es similar al implicado en la division de las bacterias El mecanismo que se utiliza en las mitocondrias de las cetulas vegetates es similar al de las bacterias : utiliza un homologo de la proteina bacteriana Ftsl (vease la seccion 17.5, El producto FtsZ es necesaric para la formacion del septa). El mecanismo molecular es diferente en las mitocondrias de las celula3 animates, y utiliza la proteina dinamina, implicadc: en la formacion de vesiculas membranosas. Un organelo individual puede tener mas de una copia de su genoma. Se desconoce si hay un mecanismo de particior para segregar las moleculas de DNAmt del interior de la mitocondria, o si son simplemente heredada ' par las mitocondrias hijas, segun la mitad de la mitocondria en que se encuentren. En la 7.2

Conceptos principales • La replicaci6n y la segregaci6n del DNAmt a las mitocondrias hijas son eventos estocasticos. • La segregaci6n mitocondrial a las·celulas hijas tambien es un evento estocastico.

Las mitocondrias deben duplicarse durante el ciclo celular y segregarse a las celulas hijas, se entiende una parte de la mecanica de este proceso, pero no su regulacion. En cada etapa de la duplicacion de las mitocondrias, replicacion y segregacion del DNA para duplicar las mitocondrias, asi como a segregacion de los organelos a las celulas hijas, el proceso parece ser estocastico, regido par una distribucion aleatoria de cada co pia. En este caso, Ia teo ria de la distribucion es anciloga a la de los plasmidos bacterianos de capias multiples, con la misma conclusion de que > l 0 capias son necesarias para garantizar que cada celula hija adquiera al menos una copia (vease la seccion l 7. 9, Los plasmid as de una sola copia tienen un sistema de particion). Cuando hay moleculas de DNArnt con variaciones alelicas (par herencia de progenitores distintos o par mutaciones), la distribucion estocastica puede generar celulas con solo uno de los alelos. La replicacion del DNAmt puede ser estocastica porque no hay un control par el cual se repliquen capias especificas, de manera que en un ciclo, algunas moleculas de DNArnt pueden replicarse mas veces que otras. El numero total de capias del genoma puede ser controlado par titulacion de masa en una forma similar a las bacterias (vease la seccion 17 .2, La replicacion esta conectada con el ciclo celular).

424

Nucleoides de DNAmt

El DNA mitocondrial se replica al incrementarst el numero de genomas respecto de la masa mitocondrial, perc sin garantizar que cada genoma se replique el mismo numero d<: veces, lo cual puede provocar cambios en la representaci 6de los alelos de las mitocondrias hijas.


_-: muestra que Ia combinaci6n de los mecanismos : _ replicaci6n y de segregaci6n puede resultar en Ia ' ·ignaci6n estocastica del DNA en cada una de las : pias, es decir, que Ia distribuci6n de uno de los ; enomas mitocondriales a Ia mitocondria hija no :epende de sus orfgenes progenitores. La asignaci6n de las mitocondrias a las celulas ~ijas tambien parece ser aleatoria. De hecho, fue Ia _bservaci6n de Ia variaci6n somatica en las plantas a que sugiri6 inicialmente Ia existencia de genes ~ue podrian perderse de una de las celulas hijas orque no se heredaban segun las !eyes de Mendel vease Ia Fig. 4.15). En algunas situaciones, una mitocondria tiene .l ielos de ambos progenitores, lo cual tiene dos con:licionantes: que ambos padres proporcionen alelos _:;J cigoto (que por supuesto noes el caso cuando hay i erencia materna. Vease la secci6n 4 .9, Los organe_os contienen DNA), y que los alelos progenitores se encuentren en la misma mitocondria. Para ello, :as mitocondrias de los progenitores deben haberse ~usionado.

El tamafio de una mitocondria podrfa no definirse con precision. De hecho, hay una interro:>ante sin resolver respecto de que una mitocondria individual represente a una copia (mica y discreta del organelo o se encuentre en un flujo dinamico en que puede fusionarse con otras mitocondrias. Se sabe que las mitocondrias pueden fusionarse en las levaduras debido a que despues de que se han apareado dos cepas haploides de levaduras para producir una cepa diploide, pueden ocurrir eventos de recombinaci6n entre las moleculas de DNAmt, lo cual implica que los dos DNAmt deben haber estado expuestos uno al otro en el mismo compartimiento mitocondrial. Se han hecho intentos de evaluaci6n de Ia incidencia de eventos similares en celulas animales en pos de una complementaci6n entre alelos despues de que dos celulas se han fusionado, pero los resultados no son contundentes.

Ill

Resumen

Para replicar al cromosoma de E. coli se necesita un tiempo fijo de 40 min, ademas de que deben transcurrir otros 20 antes de que Ia celula pueda dividirse. Cuando las celulas se dividen en menos de 60 min, se inicia un ciclo de replicaci6n antes del final del ciclo de division precedente, lo cual da Iugar a cromosomas con horquillas multiples. El evento de iniciacion depende de Ia titulacion de Ia masa celular, probablemente al acumular una proteina iniciadora. La iniciaci6n puede tener Iugar en Ia membrana de Ia celula debido a que el origen tiene relacion con Ia m embrana durante un periodo corto posterior a la iniciacion.

El septo que divide a Ia celula crece en una ubicacion definida por al anillo periseptal preexistente; un locus de tres genes (minC, D y E) codifica a los productos que regulan el uso del anillo periseptal de Ia mi tad de Ia celula o los sitios polares derivados de anillos previos para la formacion del septo. El que no se forme un septo, genera filamentos multinucleares; un exceso en Ia formacion de septos genera minicelulas anucleadas. Muchas protefnas transmembrana interactuan para formar el septo. ZipA se localiza en la membrana interna de la bacteria y se une a FtsZ, que es una protefna tipo tubulina que puede polimerizarse en una estructura filamentosa denominada anillo Z. FtsA es una protefna citosolica que se une a FtsZ. Muchos otros productos fts, todos protefnas transmembrana, se unen a! anillo Z en un proceso ordenado que genera un anillo septal. Las ultimas protefnas que se unen SEDS FtsW, y la transpeptidasa ftsi (PBP3), las cuales funcionan en conjunto para produ cir los peptidoglucanos del septo. Los cloroplastos utilizan un mecanismo de division relacionado que tiene una protefna tipo FtsZ, a diferencia de las mitocondrias, que utilizan un proceso diferente en el cualla membrana es constrefiida por una protefna del tipo de Ia dinamina. Los plasmidos y las bacterias tienen sistemas de recombinacion especffica de sitio que regeneran pares de mon6meros a! separar a dimeros creados por recombinaci6n general. El sistema Xer actua en u na secuencia diana localizada en Ia region del termino del cromosoma. El sistema se activa solo en presencia de la protefna FtsK del septa, lo cual puede garantizar que actue solo cuando un dfmero necesite ser separado. La particion implica la interaccion de Ia protefna ParB con el sitio diana parS para construir una estructura que incluya la protefna IHF. Este complejo de partici6n garantiza que los cromosomas replicados se segreguen a celulas hijas distintas. El mecanismo de segregacion puede implicar el desplazamiento del DNA, posiblemente por Ia accion de MukB en la condensaci6n de cromosomas en masa en diferentes ubicaciones conforme emergen de Ia replicacion. Los plasmidos tienen una variedad de sistemas que garantizan Ia partici6n, o que colaboran para que tenga Iugar, y un plasmido individual puede portar sistemas de muchos tipos. El nt1mero de capias de un plasmido describe si se presenta en el mismo nivel que el cromosoma bacteriano (uno por celula unitaria) o en cantidades mayores. La incompatibilidad de los plasmidos puede ser consecuencia de los mecanismos implicados en Ia replicacion o Ia partici6n (para plasmidos de una sola copia). Dos plasmidos que comparten el mismo sistema de con17 .13 Resumen

425

trol para la replicaci6n son incompatibles, debido a que el numero de eventos de replicaci6n garantiza que haya un solo plasrnido para cada genoma bacteriano.

Referencias

lfiJ

La replicacion esta conectada al ciclo celular

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llliJ

Los genes min reg ulan la localizacion del septo

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lfiJ

IIIJ

El

El septo divide a una bacteria en bacterias hijas que contienen cada una un cromosoma

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Las mutaciones de la division o en la segregacion modifican la forma de la celula

Articulo de investig aci on Adler, H. I. et al. ( 196 7). Miniature E. coli cells deficient in DNA. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 57, 321-326.

1111

El producto FtsZ es necesario para la formacion del septo

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426

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La segregaci6n cromosomica puede requerir de recombinacion espec\fica de sitio

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IIIJ

La particion involucra la separacion de los cromosomas

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CAPITULO 17 La replicacion bacteriana esta conectada con el ciclo celular

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Los plasmidos de una sola copia tienen un sistema de particion -1:iculos de revision :>raper, G. C. and Gober, J. W. (2002). Bacterial chromosome segregation. Annu. Rev. Microbial. 56, 567-597. :;ordon, G. S. and W right, A. (2000). DNA segregation in bacteria. Annu. Rev. Microbial. 54, 68 1-708. :iiraga, S. ( 1992). Chromosome and plasmid partition in E. coli. Annu. Rev. Biochem. 6 1, 283-306.

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111m

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Referencias

427

eplicaci6n del DNA ESQUEMA DEL CAPITULO

____ ./

D1 Introducci6n liB Las polimerasas de DNA son enzi mas que sintetizan DNA

• La combinaci6n de helicasa, SSB y proteina A separa un duplex de
lED

• EL DNA se sintetiza por replicaci6n semiconservadora y en reacciones de reparaci6n. • Una bacteria o una celula eucari6tica tiene va rias polimerasas de DNA diferentes. • Una polimerasa de DNA bacteriana realiza replicaci6n semiconservadora; las otras intervienen en reacciones de reparaci6n. • Los nucleos eucari6ticos, las mitocondrias y los cloroplastos tienen una po limerasa de DNA individual necesaria para la replicaci6n, asi como otras poli merasas de DNA que participan en actividades auxiliares a de reparaci6n.

lal

IBD

• Todas las polimerasas de DNA requieren un extrema cebador 3'- 0H para iniciar la sintesis de DNA. • El extrema cebador puede ser proporcionado por un cebador de RNA, por una hendidura en el DNA o por una proteina cebadora. • Para La replicaci6n del DNA, una polimerasa de RNA especialllamada primasa sintetiza una cadena de RNA que proporciona el extrema cebador. • E. coli tiene dos tipos de reaccio nes cebadoras, las cuales ocurren en el origen bacteriano (oriC) yen el origen
Las polimerasas de DNA tienen varias actividades de nucleasa • La polimerasa de DNA I tiene una actividad exonucleasa 5'- 3' individual que puede combinarse con la sintesis de DNA para realizar el desplazamiento de hendidura.

BU

Las polimerasas de DNA controlan la fidelidad de la replicaci6n

Las polimerasas de DNA tienen una estructura comun • Muchas polimerasas de DNA tienen una gran hendidura com puesta par tres dominies que se asemejan a una mana. • El DNA yace en La "palma de la mana", en un surco creado por los "dedos" y el "pulgar".

~

Him

• La replicasa del DNA avanza en forma continua cuando sintetiza la cade na lider (en sentido 5'- 3'), pero sinteti za la cadena retrasada al form ar pequenos frag mentos que se unen unos a otros despues.

428

La pinza controla la asociaci6n de la enzima central co n el DNA • El nucleo en la cadena lider es procesivo debido a que su pinza lo mantiene en el DNA. • La pinza asociada al nucleo en la cadena retrasada se disocia al fi nal de cada fragmento de Okazaki y se ensambla de nuevo para el siguiente fragmento. • La helicasa DnaB se encarga de interactuar con La primasa DnaG para inicia r cada fragmento de Okazaki.

La s1 ntesis de DNA es semidiscontinua

BD El modelo
La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres subcomplejos • La replicasa de E. coli polimerasa de DNA III es un complejo de 900 kD co n una estructura dimerica. • Cada unidad monomerica tiene un nucleo catalitico, una subunidad de dimerizaci6n y un componente de procesividad. • Un cargador de pi nza coloca las subunidades de procesividad en el DNA, en donde forman una pi nza circular alrededor del acido nucleico. • Un nucleo catalitico esta asociado a cada una de las cadenas de molde.

• Las polimerasas de DNA a menudo tienen activida d exonucleasa 3'-5' que es utilizada para escindir bases apareadas de manera incorrecta. • La fidelidad de La replicaci6 n mejora con La correcci6n en un factor de -100.

IJR

La actividad cebadora es necesaria para iniciar la s1ntesis de DNA

IDIJ

cadena individual para la replicaci6n

Coordinaci6n de la s1ntesis de la cadena l1der y de la cadena retrasada

• La replicaci6n requiere que una helicasa separe las cadenas de DNA con La energia que proviene de la hid r6lisis de ATP. • Una proteina de union a La cadena individual es necesaria para mantener las cadenas separadas.

• Se requieren diferentes unidades enzimaticas para sintetizar las cadenas lideres y retrasadas. • En E. coli, ambas unidades contienen la misma subunidad catalitica (DnaE) .

•

ml6

• •

• •

•

• •

Una horquilla de replicaci6n tiene un complejo formado por polimerasa de DNA a j primasa y dos complejos de polimerasa de DNA 8 o E. El complejo polimerasa de DNA ajprimasa inicia la sintesis de las dos cadenas del DNA. La polimerasa de DNA 8 alarga la cadena lider y una segunda polimerasa de DNA 8, o polimerasa de DNA£, alarga la cadena retrasada.

El fa go T4 proporciona su propio mecanismo de replicaci6n, que esta formado por una polimerasa de DNA, por el gen 32 SSB, por una helicasa, por una primasa y por proteinas rias que incrementan la velocidad y la procesividad.

Introducci6n

La replicacion del DNA d{tplex es un proceso complejo que comprende un conglomerado de actividades enzimciticas. Diferentes actividades tienen Iugar en las etapas de iniciacion, elongacion, y terminacion. • La iniciacion implica el reconocimiento de un origen por un complejo de protefnas. Antes de que Ia sfntesis de DNA empiece, las cadenas progenitoras deben separarse y (de man era transitoria) estabilizarse en el estado de una sola cadena. Despues de esta etapa, Ia sintesis de las cadenas hijas puede iniciarse en Ia horquilla de replicacion. • La elongacion la realiza otro complejo de proteinas. El replisoma existe solo como un complejo de protefnas asociado a la estructura particular que asume el DNA en Ia horquilla de replicacion. No existe como una unidad independiente (p. ej., como un ribosoma). A medida que el replisoma se mueve por el DNA, las cadenas progenitoras se desenrollan y las cadenas hijas son sintetizadas. • Al final del replicon, las reacciones de union o de terminacion son indispensables. Despues de la terminacion, los cromosomas

La iniciaci6n en oriC requiere el ensamble secuencial de un gran complejo de proteinas. DnaA se une a secuencias cortas repetitivas y forma un complejo oligomerico que desnaturaliza el DNA. Seis mon6meros de Dna( se unen a cada hexamero de DnaB, y este complejo se une al origen. Un hexamero de DnaB forma la horquilla de replicaci6n . La girasa y la SSB tambien son necesarias.

10m Sucesos comunes en el cebamiento de la replicaci6n en el origen

• • •

laD

• •

•

liB.

El principia general de la iniciaci6n bacteriana es que el origen es reconocido en un inicio por una proteina que forma un gran complejo con el DNA. Una region corta de DNA enriquecida con A-T es desnaturalizada . DnaB se une al complejo y crea la horquilla de replicaci6n .

El primosoma es necesario para reiniciar la replicaci6n

•

El fa go T4 proporciona su propio mecanismo de replicaci6n

•

1111

Cada fragmento de Okazaki inicia con un cebador y se detiene antes del siguiente fragmento. La polimerasa de DNA I elimina el cebador y lo remplaza con DNA en una acci6n semejante al desplazamiento de hendidura. La ligasa de DNA realiza el enlace que conecta el extrema 3' de un fragmento de Okazaki al inicio 5' del siguiente fragmento.

Creaci6n de las horquillas de replicaci6n en el origen

•

Polimerasas de DNA eucari6ticas independientes realizan la iniciaci6n y la elongaci6n

•

miD

10111

Los fragmentos de Okazaki estan unidos por la ligasa

.

mDJ

En otros organismos pueden necesitarse diferentes subunidades cataliticas para cada cadena.

La iniciaci6n de la replicaci6n de
Resumen

duplicados deben separarse uno del otro, lo cual requiere la manipulacion de la estructura compleja del DNA. La incapacidad para replicar el DNA es leta! para el crecimiento de Ia celula. Por lo tanto, los mutantes afectados en la replicacion solo pueden obtenerse como letales condicionales. Estos son capaces de lograr la replicaci6n bajo condiciones permisivas (provistas por Ia temperatura normal de incubacion), pero son defectuosos en condiciones no permisivas (temperaturas mayo res de 42°C). Una serie extensa de dichos mutantes sensibles a Ia temperatura en E. coli permite identificar un conjunto de loci llamados genes dna. Los mutantes dna permiten distinguir dos etapas de replicacion por su componamiento cuando la temperatura se incrementa: • La clase mayor de mutantes de detencion rapida interrumpe la replicacion en cuanto aumenta la temperatura . Presentan defectos en los componentes del mecanismo de replicacion, por lo general en las enzimas necesarias para la elongaci6n (pero tambien incluyen defectos en el suministro de precursores esenciales). • La clase mas pequena de mutantes de detendon lenta concluyen el ciclo de replicacion actuaL pero no pueden iniciar otro. 18.1 Introducci6n

429

Tienen defectos en los episodios comprendidos en el inicio de un ciclo de replicacion en el origen. Un analisis importante utilizado para identificar los componentes del mecanismo de replicacion se llama analisis de complementaci6n in vitro. Se prepara un sistema para la replicacion in vitro a partir de un mutante dna y se pone en marcha en condiciones en las cuales el producto genico mutante es inactivo. Se evalua Ia capacidad de los extractos de celulas de tipo Silvestre para restaurar la actividad. La protefna codificada por el locus dna puede purificarse si se identifica el componente activo del extracto. Cada uno de los componentes del mecanismo de replicacion bacteriana queda ahora en condiciones de ser estudiado in vitro como producto bioqufmicamente puro, yes implicado in vivo por mutaciones en sus genes. Los sistemas de replicacion eucariotica estan altamente purificados y en general tienen componentes analogos a las protefnas bacterianas, pero eso no significa que hayan alcanzado la etapa en la que cada uno de los componentes ha sido identificado.

! La replicaci6n semiconservadora sintetiza dos cadenas nuevas de DNA.

Base dafiada

La s\ntesis reparadora remplaza un fragmento corto de una cadena de DNA que contiene una base dafiada.

430

CAPITULO 18 Replicaci6n del DNA

11J

Las polimerasas de DNA son enzimas que sintetizan DNA

Conceptos principales • El DNA se sintetiza par replicaci6n semiconservadora y en reacciones de reparaci6n. • Una bacteria o una celula eucari6tica tiene varias polimerasas de DNA diferentes. • Una polimerasa de DNA bacteriana realiza replicaci6n semiconservadora; las otras intervienen en reacciones de reparaci6n. • Los nucleos eucari6ticos, las mitocondrias y los cloroplastos tienen una polimerasa de DNA individual necesaria para la replicaci6n, as\ como otras polimerasas de DNA que participan en actividades auxiliares o de reparaci6n.

Existen dos tipos basicos de sintesis de DNA. La muestra el resultado de la replicaci6n semiconservadora. Las dos cadenas del duplex progenitor son separadas y cada una sirve como molde para la sintesis de una nueva cadena. El duplex progenitor es remplazado por dos duplex hijos, cada uno de los cuales tiene una cadena progenitora y una cadena recien sintetizada. La muestra las consecuencias de una reaccion de reparaci6n. Una cadena de DNA ha sido daii.ada. Es escindida y se sintetiza nuevo material para remplazarla. Una enzima que puede sintetizar una nueva cadena de DNA a partir de una cadena molde se denomina polimerasa de DNA. Las celulas procarioticas y eucarioticas contienen actividades multiples de polimerasa de DNA. Solo algunas de estas enzimas en realidad experimentan la replicacion; aquellas que lo hacen en ocasiones se denominan replicasas de DNA. Las demas enzimas desempeii.an funciones subsidiarias en Ia replicacion o participan en Ia sintesis reparadora. Todas las polimerasas de DNA procarioticas y eucarioticas comparten el mismo tipo fundamental de actividad sintetica. Cada una puede extender una cadena de DNA al agregar nucleotidos, uno a Ia vez, a un extremo 3'-0H, como se ilustra en Ia FJ U A . La eleccion del nucleotido que sera agregado a Ia cadena depende del apareamiento de bases con Ia cadena molde. Algunas polimerasas de DNA funcionan como enzimas independientes, pero otras (sobre todo las replicasas) son incorporadas en ensambles de proteinas mas extensos. La subunidad sintetizadora de DNA es solo una de varias funciones de la replicasa, la cual por lo general tiene muchas otras actividades relacionadas con el desenrollamiento del DNA, el inicio de Ia sfntesis de nuevas cadenas, etc.

' .

Enzima

El molde tiene un extrema 3'-0H libre

Gen

II

po!B

enzima importante de reparaci6n reinicio de Ia replicaci6n

Ill

po!C

replicasa

IV

dinB

replicaci6n translesi6n

v

umu0'2 C

replicaci6n translesi6n

polA

El nucle6tido entrante tiene tres grupos fosfato en Ia posicion 5' 5' PPP

I

Funci6n

OH 3'

p

p

Solo una polimerasa de DNA es la replicasa. Las otras participan en la reparaci6n del DNA dafiado y reinician las horquillas de replicaci6n varadas o eluden el dafio en el DNA.

5'

El DNA es sintetizado al agregar nucle6tidos alextremo 3'-0H de la cadena creciente, de tal manera que la cadena nueva crece en direcci6n 5'~3'. El precursor para la slntesis de DNA es un nucle6sido trifosfatado, el cual pierde los dos grupos fosfato termina les en la reacci6n .

La resume las polimerasas de DNA que se han definido en E. coli. La polimerasa de DNA III, una proteina con multiples subunidades, es Ia replicasa encargada de la sfntesis de novo de cadenas nuevas de DNA. La polimerasa de DNA I (codificada por polA) participa en Ia reparaci6n del DNA dafiado y, en una funci6n subsidiaria, en la replicaci6n semiconservadora. La polimerasa de DNA II es indispensable para el reinicio de una horquilla de replica cion cuando su progreso es bloqueado por dafio en el DNA. Las polimerasas de DNA IV y V permiten que la replicaci6n pase por alto ciertos tipos de dafio. Cuando se evalua la capacidad de los extractos de E. coli para sintetizar DNA, la actividad enzirnatica predominante es Ia de la polimerasa de DNA I. Su actividad es tal que impide detectar las actividades de las enzimas que en realidad se encargan de la replicaci6n del DNA. Para desarrollar sistemas in vitro en los cuales la replicaci6n pueda estudiarse, los extractos se preparan a partir de celulas con mutaciones en polA. Algunos fagos codifican polimerasas de DNA. Entre estos se encuentran los fagos T4, T5, T7, y SPO 1. Todas las enzimas pose en actividades sinteticas 5'-3' y actividades de correcci6n de exonucleasa 3'-5' (vease Ia secci6n 18.3, Las polirnerasas de DNA tienen varias actividades de nucleasa). En cada caso, una mutaci6n en el gen que codifica un solo poli-

peptido del fago impide que este se desarrolle. Cada polimerasa del fago se asocia a otras protefnas, del propio fago o del hospedador, para hacer la en zima intacta. Varias clases de polimerasas de DNA eucari6ticas han sido identificadas. Las polimerasas de DNA oy c: son indispensables para la replicaci6n nuclear; la polimerasa de DNA a tiene que ver con el proceso de cebamiento (iniciaci6n) de Ia replicaci6n. Otras polimerasas de DNA intervienen en Ia reparaci6n del DNA nuclear dafi.ado (~ e incluso c:) o Ia replicaci6n del DNA mitocondrial (y).

1111

Las polimerasas de DNA tienen varias actividades de nucleasa

Concepto principal • La polimerasa de DNA I tiene una actividad exonucleasa 5'- 3' individual que puede combinarse con la s1ntesis de DNA para reali zar el desplazamiento de hendidura.

Las replicasas a menudo tienen actividades de nucleasa ademas de la capacidad para sintetizar DNA. Una actividad de exonucleasa 3'- 5' se u tiliza por lo general para recortar bases que han sido agregadas al DNA de manera incorrecta. Esto ofrece un sistema de "correcci6n" para el control de errores (vease la secci6n 18.4, Las polimerasas de DNA controlan la fidelidad de Ia replicaci6n) . La primera enzima sintetizadora de DNA que se describi6 fue la polimerasa de DNA I, que es un polipeptido unico de 103 kD. La cadena puede dividirse en dos partes por tratamiento proteolftico. Dos tercios de Ia protefna se encuentran en el extremo C y contienen el sitio activo de la polimerasa; el tercio restante de la protefna esta en el extremo N y contiene Ia exonucleasa de correcci6n. El producto mas grande de Ia division (de 68 kD) se llama fragmento Klenow. Se utiliza en reacciones

18.3 Las polimerasas de DNA tienen varias actividades de nucleasa

431

ldespla~ehendid~

5'

3'

3'

5' La hendidura genera los grupos 3'-0H y 5'-P

1111

Las polimerasas de DNA controLan La fidelidad de La replicaci6n


~ 5'

3'

3'

5' La sintesis de DNA extiende el extrema 3'; Ia cadena antigua es degradada

• Las polimerasas de DNA a menudo tienen actividad exonucleasa 3'-5' que se utiliza para escindir bases apareadas de manera incorrecta. • La fidelidad de la replicaci6n mejora con la correcci6n en un facto r de - 100.

\ 5'

3'

3'

5'

El desplazamiento de hendidura remplaza una parte de la cadena preexistente de DNA duplex con material recien sintetizado.

sinteticas i11 vitro. Contiene la polimerasa y las actividades de exonucleasa 3'-5'. Los sitios activos estan separados de la proteina -30 A, lo cual indica que existe una separaci6n espacial entre la base que se agrega y Ia que se elimina. El fragmento pequefio (de 35 kD) posee actividad exonucleolitica 5'-3' que desprende pequ efios grupos de n ucle6tidos, hasta -10 bases a Ia vez. Esta actividad se coordina con Ia actividad sintetica/correctora. Proporciona polimerasa de DNA I con una habilidad exclusiva para iniciar la replicacion i11 vitro en una h endidura en el DNA. (Ninguna otra polimerasa de DNA tiene esta capacidad.) En el sitio donde se ha roto un enlace fosfodiester en un DNA de doble cadena, la enzima extiende el extrema 3'-0H. A medida que se sintetiza el nuevo segmento de DNA, desplaza la cadena homologa existente en el dtiplex . Este proceso de desplazamiento de hendidura se ilustra en la . La cadena desplazada es degradada por Ia actividad exonucleolitica 5'-3 ' de Ia enzima. Las propiedades del DNA nose alteran, excepto que un segmento de una cadena ha sido remplazado con material recien sintetizado y la posicion de la mella h a sido desplazada a lo largo del duplex. Esto tiene un gran uso practico; el desplazamiento de hendidura h a constituido una tecnica importante para introducir nucle6tidos con marcas radioactivas en el DNA i11 vitro. La accion 5'-3 ' sintetica /3'-5' exonucleolftica es probable que sea utilizada i11 vivo sabre todo para rellenar regiones cortas de cadena individual en el DNA de doble cadena. Estas regiones emergen durante la replicacion y cuando las bases dafiadas son eliminadas del DNA.

432


La fidelidad de Ia replicaci6n plantea el mismo problema que se observa cuando se tiene en cuenta, por ejemplo, Ia precision de la traduccion. Se basa en la especificidad del apareamiento de bases. Sir1 embargo, cuando se consideran las interacciones comprendidas en el apareamiento de bases, se espera que ocurran errores con una frecuencia de - 1o-3 por pares de bases replicadas. La tasa actua l en las bacterias parece ser de - 1o-s a 10-10 . Esto corresponde a -1 un error por genoma por l 000 ciclos de replicacion bacteriana, 0 - 1o-6 por gen por generacion. Se pueden dividir los errores que Ia polimerasa de DNA comete durante la replicacion en dos clases: • Los cambios del marco de lectura ocurren cuando un nucleotido extra es insertado u omitido. La fidelidad con respecto a! cambio del marco de lectura se altera con la procesividad de la enzima: la tendencia a permanecer en un solo molde en vez de disociarse y reasociarse . Esto es en particular importante para Ia replicaci6n de un fragmento homopolimerico (p. ej., una secuencia larga de dT":dAn, en Ia cual "el deslizamiento de la replicacion" puede cambiar la longitud del segmento homopolimerico. Como regia generaL un incremento de Ia procesividad reduce Ia probabilidad de tales episodios. En las polimerasas de DNA multimericas, la procesividad su ele aumentar por una subunidad particular que n o es necesaria para Ia actividad catalitica per se. • Las sustituciones ocurren cuando se incorpora un nucleotido equivocado (apareado de manera erronea). El nivel de error lodetermina Ia eficiencia de la correccion, en do nde Ia enzima explora los pares de bases que acaban de fonnarse y elimina el nucle6tido si esta apareado de forma err6nea. Todas la s enzimas bacterianas poseen actividad exonucleolitica 3'-5 ' que procede en direcci6n inversa a la sfntesis de DNA. Esto proporciona Ia

funci6n de correcci6n ilustrada en el esquema de la . En el paso de la elongaci6n de la cadena, un nucle6tido precursor entra en la posicion loca lizada al final de la cadena creciente. Se forma un enlace. La enzima se desplaza un par de bases y entonces esta lista para que entre el siguiente nucle6tido precursor. No obstante, si ocurre un error Ia enzima utiliza la actividad exonucleolftica para escindir la tlltima base que fue agregada. Diferentes polimerasas de DNA manejan la relaci6n entre las actividades de polimerizaci6n y de correcci6n de distintas maneras. En algunos casas las actividades son parte de la misma subunidad, pero en otros estan contenidas en diferentes sub unidades. Cada polimerasa de DNA tiene una tasa de error caracterfstica que se reduce por su acti vidad correctora . La correcci6n suele disminuir la tasa de error de la replicaci6n de -1 o- 5 a - 1o-7 por par de bases replicado. Los sistemas que reconocen los errores y los corrigen despues de Ia replicaci6n eliminan entonces algunos de los errores y !levan Ia tasa global a 10 3 veces.

Ill

La enzima agrega una base a Ia cadena creciente

5'

3'

La enzima se desplaza si Ia base nueva es correcta

La base es hidrolizada y expulsada si es incorrecta

Las polimerasas de DNA bacterianas exploran el par de bases en el extrema de la cadena creciente y escinden el nucle6tido agregado en caso de un desajuste.

Las polimerasas de DNA tienen una estructura comun

Conceptos pri nci pales • Muchas polimerasas de DNA tienen una gran hendidura compuesta por tres dominios que se asemejan a una mano. • El DNA yace en la "palma de la mano", en un surco creado por los "dedos" y el "pulgar''.

La 1 muestra que todas las polimerasas de DNA comparten algunos rasgos estructurales comunes. La estructura de la enzima puede dividirse en varios dominios independientes, los cuales se describen por la analogfa con una mano derecha humana . El DNA se une a una extensa hendidura compuesta por tres dominios. El dominio de Ia "palma" tiene importantes elementos de secuencias conservadas,

La organizaci6n comun de las polimerasas de DNA tiene una palma que contiene el sitio catalitico, un pulgar que se une al DNA y que es importante en la procesividad, un dominio de exonucleasa con su propio sitio activo y un dominio terminal N.

secuencias que forman el sitio catalftico activo. Los "dedos " intervienen en la colocaci6n correcta del molde en el sitio activo. El "pulgar" se une al DNA a medida que sale de la enzima y es importante en Ia procesividad . Las regiones conservadas mas im18.5 Las polimerasas de DNA tienen una estructura co mun

433

La estructura cristalina de la polimerasa de DNA del fago T7 muestra que la cadena molde da un giro agudo que la expone al nucle6tido entrante. Fotografia cortes1a de Charles Richardson and Thomas Ellenberger, Washington University School of Medicine.

portantes de cada uno de estos tres dominios convergen para formar una superficie continua en el sitio catalitico. La actividad exonucleasa reside en un dominio independiente con su propio sitio catalitico. El dominio terminal N se extiende dentro del dominio de la nucleasa. Las polimerasas de DNA se dividen en cinco familias con base en la homologfa de sus secuencias; la palma esta bien conservada entre ellas, pero el pulgar y los dedos ofrecen elementos analogos de estructura secundaria de diferentes secuencias. La reaccion catalftica en una polimerasa de DNA ocurre en un sitio activo en el cual un nucleotido trifosfatado se aparea con una cadena individual de DNA (no apareada). El DNA yace a naves de Ia palma de la mano en un surco creado por el pulgar y los dedos. La f1 URA 1 muestra Ia estructura cristalina de Ia enzima T7 formando un complejo con el DNA (en Ia forma de un cebador asociado a una cadena de molde) y un nucleotido entrante que esta a punto de ser agregado al cebador. El DNA se encuentra en la forma B duplex clasica hasta los dos ultimos pares de bases en el extrema 3' del cebador, las cuales se encuentran en Ia forma A mas abierta. Una vuelta aguda en el DNA expone la base molde al nucleotido entrante. El extrema 3' del cebador (al cual se agregan las bases) es anclado por los dedos y porIa palma. AI DNA lo mantienen en su posicion los os que se forman sobre todo con el esqueleto de fosfodiesteres de la cadena (lo que permite que la polimerasa funcione con DNA de cualquier secuencia). En las estructuras de las polimerasas de DNA de esta familia que estan formando complejos solo con el DNA (es decir, que carecen del nucleotido entran-

434


te), la orientacion de los dedos y del pulgar en relacion con la palma de la mano es mas abierta, con la helice 0 (0, 01, 02; vease la Figura 18.8) girada hacia afuera de la palma. Esto sugiere que el giro hacia adentro de la helice 0 ocurre para capturar el nucle6tido entrante y crear el sitio activo catalftico. Cuando un nucleotido se une, el dorninio de los dedos gira 60° hacia la palma de la mano y las puntas de los dedos se mueven 30 A. El dorninio del pulgar tambien gira hacia la palma 8°. Estos cambios son dclicos: se revierten cuando el nucleotido es incorporado a la cadena de DNA la cual despues se transfiere a traves de la enzima para recrear un sitio vado. La actividad exonucleasa se encarga de eliminar las bases apareadas de manera erronea. No obstante, el sitio catalftico del dominio de exonucleasa se encuentra lejos del sitio activo del dominio catalitico. La enzima alterna entre las modalidades de polimerizacion y edicion, segun lo determine Ia competencia entre los dos sitios activos por el extrema cebador 3' del DNA. Los aminoacidos en el sitio activo entran en o con la base entrante de tal manera que la estructura de la enzima es afectada por una base apareada en forma erronea. Cuando una base mal apareada ocupa el sitio catalftico, los dedos no pueden girar hacia la palma. Esto deja el extrema 3' libre para unirse al sitio activo en el dominio de exonucleasa, lo cual se logra por un giro del DNA en Ia estructura de la enzima.

1111 La sintesis de DNA es semidisconti nua Concepto principal • La replicasa del DNA avanza en forma continua cuando sintetiza la cadena l1der (en sentido 5'-3'), pero sintetiza la cadena retrasada al formar pequeiios fragmentos que se unen unos a otros despues.

La estructura antiparalela de las dos cadenas del DNA duplex plantea un problema para la replicacion. A medida que la horquilla avanza, las cadenas hijas de ben ser sintetizadas en las dos cadenas individuates progenitoras expuestas. La horquilla se mueve en direccion 5'-3' en una cadena yen direccion 3'-5' en la otra. No obstante, los acidos nucleicos se sintetizan solo a partir de un extrema 5' hacia un extrema 3'. El problema se resuelve con la sfntesis de la cadena que crece en general de 3'-5' en una serie de pequefios fragmentos, cada uno de los cuales se sintetiza en realidad en la direccion "opuesta", es decir, con la polaridad convencional 5'-3'. Considerese la region que se encuentra inmediatamente detras de la horquilla de replicacion, como se ilustra en la . Los sucesos se describen

• t -

•

•

•

,

-

I

•

Sfntesis de Ia cadena lfder Nucle6tidos agregados de manera continua al extrema 3'

5' ........__,_,.,.................o.....:.:..........,.......,_.__,.......__,'--'--, 3' 5' ....J.J.-~U.........t...L....-.!.iL..-......""-........___.....,

Fragmento anterior Ultimo fragmento Cadena individual DNA progenitor Sfntesis de Ia cadena retrasada La cadena l\der se sintetiza de forma continua, mientras que la cadena retrasada se sintetiza de manera discontinua.

en tt~rminos de las propiedades diferentes de cada W1a de las cadenas que acaban de sintetizarse: • En Ia cadena lider la sfntesis de DNA puede proceder en forma continua en direcci6n 5'-3' a medida que el d{lplex progenitor es desenrollado. • En Ia cadena retrasada un fragmento de cadena individual de DNA progenitor debe ser expuesto y despues un segmento es sintetizado en direcci6n inversa (en relaci6n con el movimiento de Ia horquilla). Una serie de estos fragmentos se sintetiza, cada uno en direcci6n 5'-3'; y despues son unidos para crear una cadena retrasada intacta. La replicaci6n discontinua puede ser rastreada por el destino de una marca radioactiva muy breve. La etiqueta entra al DNA recien sintetizado en forma de fragmentos cortos, que sedimentan en los llmites de 75 a ll S, lo cual corresponde a una longitud de -1 000 a 2 000 bases. Estos fragmentos de Okazaki se encuentran en el DNA en proceso de replicaci6n en las procariotas y en las eucariotas. Despues de largos periodos de incubaci6n, Ia marca entra a segmentos mas largos de DNA. La transici6n es resultado de Ia formaci6n de enlaces covalentes entre los fragmentos de Okazaki. La cadena retrasada debe ser sintetizada en forma de fragmentos de Okazaki. Durante mucho tiempo no quedaba claro si la cadena lfder se sintetizaba de Ia misma forma ode manera continua. Todo el DNA recien sintetizado se encuentra como fragmentos cortos en E. coli. Visto de un modo superficial, esto sugiere que ambas cadenas se sintetizan de manera discontinua. Sin embargo, resulta que no toda la poblaci6n de los fragmentos representa fragmentos de Okazaki autenticos, algunos son seudofragmentos que han sido generados por rompimiento en una cadena de DNA que de hecho fue sintetizada como una cadena continua . Lafuente de esta rotura es Ia incorporaci6n de algunos uracilos dentro del DNA en Iugar de timina. Cuando el uracilo es elimina-

do por un sistema de reparaci6n, la cadena lider se rompe hasta que una timina es insertada. Por lo tanto, Ia cadena retrasada se sintetiza de manera discontinua y Ia cadena lfder se sintetiza de forma continua. Esto se llama replicaci6n semidiscontinua.

El modelo
A medida que avanza Ia horquilla de replicaci6n, desenrolla el DNA duplex. Una de las cadenas molde es convertida de inmediato en DNA duplex a medida que la cadena lfder hija es sintetizada. La otra permanece en forma individual hasta que se ha expuesto la longitud suficiente para iniciar la sfntesis de un fragmento de Okazaki de Ia cadena retrasada en la direcci6n contraria. Por lo tanto, Ia generaci6n y el mantenimiento de un DNA de cadena individual es un aspecto crucial de la replicaci6n. Se requieren dos tipos de funci6n para convertir el DNA de doble cadena en cadenas individuales: • Una helicasa es una enzima que separa las cadenas de DNA y que por lo general utiliza la hidr6lisis del ATP para proporcionar Ia energfa necesaria. • Una proteina de union ala cadena individual (SSB, single-strand binding protein) se

18.7 El modelo
435

Cadena+ La helicasa rodea una sola cadena

La helicasa se une al DNA duplex

Los pares de bases se

3'

e 0 c l

5'

Una helicasa hexamerica se desplaza a to largo de una cadena de DNA. Es probable que cambie de conformaci6n cuando se une at duplex, utilice hidr6lisis de ATP para separar las cadenas y despues regrese a la conformaci6n que ten\a cuando estaba unida s6lo a una cadena individual.

une a! DNA de cadena individual e impide que se vuelva a formar el duplex. La SSB se une como un monomero, pero por lo general de una forma colaboradora en la cual Ia union de otros monomeros al complejo existente se incrementa. Las helicasas separan las cadenas de un acido nucleico duplex en una variedad de situacion es, que oscilan desde la separacion de las cadenas en el sitio de crecimiento de una horquilla de replica cion hasta la catalisis de la migracion de las uniones Holliday (de recombinacion) a lo largo del DNA. Hay 12 helicasas diferentes en E. coli. Una helicasa casi siempre es multimerica. Una forma comun de helicasa es un hexamero. Este por lo general se transfiere a lo largo del DNA utilizando su estructura multimerica para proporcionar multiples sitios de union al DNA. La 1 muestra un modelo esquematico generalizado para la accion de una helicasa hex america. Es probable que tenga una conformacion que se una a! DNA duplex y otra que se una al DNA de cadena individual. La alternancia entre ellas conduce el motor que disgrega al duplex y requiere Ia hidrolisis de ATP; en general se hidroliza unA TP por cada par de bases que es desenrollado. Una helicasa suele iniciar el desenrollamiento en una region de cadena individual adyacente a un d{lplex. Puede funcionar con una polaridad particular y prefiere el DNA de cadena individual con un extremo 3' (helicasa 3'-5 ') o con un extrema 5' (helicasa 5'-3'). La conversion del DNA de doble cadena

3' -0H - - Protefna A

l

Pmtefoa SSB

Protefna Rep

+

El DNA
La reaccion puede ocurrir en ausencia de Ia sintesis de DNA cuando las tres protefnas apropiadas son provistas in vitro. La protefna A fagica mella Ia cadena viral (+) en el origen de replicacion . En Ia presencia de dos proteinas hospedadoras (Rep y SSB) y de ATP, el DNA mellado se desenrolla. La protefna Rep proporciona una helicasa que separa las cadenas; Ia SSB las atrapa en forma de cadena individual. La SSB de E. coli es un tetramero de 74 kD que se une en colaboracion al DNA de cadena individual. La importancia de la forma colaboradora de union es que la union de una molecula protefnica h ace mucho mas facil Ia union de otra. Entonces, una vez que ha empezado Ia reaccion de union en una molecula de DNA particular, se extiende con rapidez hasta que todo el DNA de cadena individual esta cubierto por la protefna SSB. Notese que esta protefna noes una protefna que desenrolla el DNA; su funcion es estabilizar el DNA que ya se encuentra en forma de cadena individual.

En circunstancias normales in vivo, las reaccio nes de desenrollamiento, recubrimiento y replicacion proceden en tandem. La SSB se une a! DNA a medida que avanza la horquilla de replicacion, manteniendo las dos cadenas progenitoras separa das para que se encuentren en la condicion apropiada para actuar como moldes. La SSB se necesita en cantidades estequiometricas en la horquilla de replicacion. Se requiere en mas de una etapa de la replicacion; los mutantes ssb tienen un fenotipo de detencion rapida y son defectuosos en la reparacion, en la recombinacion yen la replicacion (algunos fagos usan diferentes protefnas SSB, sobre todo T4; esto demuestra que pueden existir interacciones especfficas entre los componentes del mecanismo de re plicacion y las SSB, vease la seccion 18.14, Elfago T4 proporciona su propio mecanismo de replicacion).

Molde de cadena individual

' Una polimerasa de DNA requiere un extrema 3'-0H para iniciar la replicaci6n.

uchas formas d Las polimerasas de DNA no pueden iniciar Ia sfntesis de DNA en moleculas de DNA duplex o de cadena individual sin un cebador

5'

1111

La actividad cebadora es necesana para m1c1ar la sintesis de DNA

3'

3'

5' 0

5'

3' El cebador de RNA es sintetizado (o propmcionado por apareamiento de bases)

Cenceptes principales

5'

• Tedas las pelimerasas de DNA requieren un extreme cebader 3'-0H para iniciar la sintesis de DNA.

3'

• El extreme ce bader puede ser prepercienade per un cebader de RNA, per una hendidura en el DNA e per una proteina cebadera. • Para la replicaci6n del DNA, una pelimerasa de RNA especialllamada primasa sintetiza una cadena de RNA que preperciena el extreme cebader.

~

3'

5' -RNA ·-DNA . .

5'

El DNA duplex es mellado para proporcionar un extrema libre para Ia polimerasa de DNA Hendidura ~

y

• E. coli tiene des tipes de reaccienes cebaderas, las

cuales ocurren en el origen bacteriano (oriC) y en el erigen
Un nucle6tido cebador es proporcionado por una protefna que se une al DNA

Una caracterfstica comun en todas las polimerasas de DNA es que no pueden iniciar la sfntesis de una cadena de DNA de novo. La muestra las caracterfsticas necesarias para Ia iniciacion. La sfntesis de la cadena nueva puede iniciar solo desde un extremo 3'-0H preexistente y la cadena molde debe ser convertida en una cadena individual. El extremo 3'-0H se denomina cebador. Este puede adoptar varias formas. Los tipos de reacciones de cebamiento se resumen en Ia • Una secuencia de RNA se sintetiza en el molde, de modo que el extremo 3'- 0H li bre de la cadena de RNA se extiende por la

5'

........----.,.

'

Hay muchos metodos que proporcionan el extreme 3'-0H que necesita la polimerasa de DNA para iniciar la sintesis de DNA.

polimerasa de DNA. Esto suele utilizarse en la replicacion del DNA celular y por algunos virus (vease la Figura 17.18 de Ia seccion

18.8 La actividad cebadora es necesaria para iniciar la sintesis de DNA

431

17.11, El sistema de compatibilidad ColE1 es controlado por un regulador de RNA). • Un RNA preformado se aparea con el molde, lo que permite que su extremo 3' -OH sirva para cebar la sintesis de DNA. Este mecanismo es usado por los retrovirus para cebar la transcripcion inversa del RNA (vease Ia Figura 22.6 en la secci6n 22.4, El DNA viral se genera por transcripci6n inversa) . • Un extremo cebador se genera dentro del DNA duplex. El mecanismo mas comun es la introduccion de una henclidura, utilizada para iniciar Ia replicacion del circulo rodante (vease Ia Figura 16.5). En este caso, la cadena preexistente es desplazada por Ia nueva sintesis. (Notese !a diferencia con respecto a! desplazarniento de henclidura que se muestra en Ia Figura 18. 5, en el cualla polimerasa de DNA I de manera si.multanea sintetiza y degrada DNA desde una hendidura). • Una proteina ceba la reacci6n en forma directa al presentar un nucle6tido ala polimerasa

SSB protefna de uni6n a Ia cadena individual ( -60/horquilla)

PriA (s61o q>X) reconoce el sitio de ensamblaje del primosoma y desplaza a Ia SSB

Primasa DnaG sintetiza RNA

t La iniciaci6n requiere numerosas actividades enzimaticas, como helicasas, proteinas de union a la cadena individual y la sintesis del cebador.

438


de DNA. Esta reacci6n es utilizada por ciertos virus. (Vease !a Figura 16.4 en la seccion 16.2, Los extremos del DNA lineal representan un problema para la replicaci6n.) La actividad cebadora es indispensable para proporcionar extremos 3'-0H que inicien !a sfntesis de las cadenas de DNA en !a cadena lfder yen Ia cadena retrasada. La cadena lfder requiere solo uno de estos episodios de iniciacion, el cual ocurre en el origen. No obstante, debe haber una serie de sucesos de iniciaci6n en !a cadena retrasada porque cada fragm ento de Okazaki requiere su propio inicio de novo. Cada fragmento de Okazaki empieza con una secuencia cebadora de RNA de -1 0 bases de largo que proporciona el extremo 3'-0H para la extension mediada por !a polimerasa de DNA. Se requiere una primasa para catalizar la reaccion cebadora. La proporciona una actividad especial de polimerasa de RNA, el producto del gen dnaG . La enzima es un polipeptido individual de 60 kD (mucho mas pequefio que Ia polimerasa de RNA). La prirnasa es una polimerasa de RNA que se utiliza solo en circunstancias especificas, es decir, para sintetizar fragmentos cortos de RNA que sirven de cebadores para la sintesis de DNA. La primasa DnaG se asocia en forma transitoria al complejo de replicaci6n y en general sintetiza un cebador de 11 o de 12 bases. Los cebadores comienzan con !a secuencia pppAG colocada allado contrario de Ia secuencia 3'-GTC-5 ' en el molde. Algunos sistemas utilizan elementos alternativos a Ia primasa de DnaG. En los ejemplos de los dos fagos Ml3 y G4, los cual es se utilizaron en los primeros trabajos sobre !a replicaci6n, surgio una cliferencia interesante. El cebamiento en G4 usa DnaG, en tanto que el cebarniento en M13 utiliza polimerasa de RNA bacteriana. Estos fagos tienen otra caracterfstica poco comun: el sitio de cebamiento esta indicado por una region de estructura secundaria. Existen dos tipos de reacciones de cebamiento en E. coli: • El sistema oriC, llamado asf por el origen bacteriano, comprende en terminos generales Ia asociacion de Ia prirnasa DnaG con el complejo protefnico en la horquilla de replicaci6n. • El sistema
Los tipos de actividades comprendidas en la reacci6n de iniciaci6n se resumen en la J 1 Aunque otros replicones en E. coli pueden tener alternativas para algunas de estas protefnas particulares, se necesitan los mismos tipos generales de actividad en cada caso. Una helicasa es indispensable para generar cadenas individuales, una proteina de union a la cadena individual es necesaria para mantener el estado de cadena individual y la primasa sintetiza el cebador de RNA. DnaB es el componente central en los replicones
1111

La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres subcomplejos

• Hay dos copias de Ia pinza, que se encarga de mantener los nucleos catalfticos sobre sus cadenas molde. Cada pinza esta formada por un homodimero de las subunidades ~ que se unen alrededor del DNA y garantiza la procesividad. • El complejo yes un grupo de cinco protefnas que forman el cargador de piliZa; este coloca la pinza en el DNA. En la e ::> se muestra un modelo para el ensamble de la polimerasa de DNA III. La holoenzima se ensambla en el DNA en tres etapas: • Primero el cargador de pinza usa la hidrolisis del ATP para unir las subunidades ~ al complejo molde-cebador. • La union al DNA cambia la conformacion del sitio en ~que se une al cargador de pinza, y como resultado ahora tiene mayor afinidad por el nucleo de Ia polimerasa. Esto permite al nucleo de Ia polirnerasa unirse y este es el medio por el cual el nucleo de la polimerasa es llevado al DNA.

El cargador de pinza rompe ATP para cargar el DNA con Ia pinza . <>~ Cargador de pinza{ 0

Conceptos principales • La replicasa de f. coli polimerasa de DNA III es un complejo de 900 kD con una estructura dimerica. • Cada unidad monomerica tiene un nucleo catal\tico, una subunidad de dimerizaci6n y un componente de procesividad. • Un cargador de pinza coloca las subunidades de procesividad en el DNA, en donde forman una pinza circular alrededor del acido nucleico. • Un nucleo catal\tico esta asociado a cada una de las cadenas de molde.

Ahara se puede relacionar la estructura de Ia subunidad de la polimerasa de DNA III de E. coli con las actividades requeridas para la sfntesis de DNA y proponer un modelo para su accion. La holoenzima es un complejo de 900 kD que contiene 10 protefnas organizadas en cuatro tipos de subcomplejos: • Existen dos copias del nucleo catalitico. Cada nucleo catalftico contiene la subunidad a (la actividad de polimerasa de DNA), la subunidad £ (la exonucleasa de correccion 3'-5') y la subunidad 8 (la cual estimula ala exonucleasa). • Hay dos copias de Ia subunidad de dimerizaci6n, -r, que unen a los dos nucleos cataliticos .

Pinza - - - La enzima central se une

~-

Enzima central{

Ct.

tau + segundo nucleo se une para formar un dimero simetrico Sfntesis de Ia

Ct.

E

E

8

8

Ct.

Las subunidades 1: mantienen Ia estructura di merica La holoenzima polimerasa de DNA III se ensambla en etapas y genera un complejo enzimatico que sintetiza el DNA de Las dos cadenas nuevas.

18 .9 La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres subcomplejos

439

• Un dfmero 1 se une al nucleo de la polimerasa y proporciona una funci6n de dimerizaci6n que une un segundo nucleo de polimerasa (asociado a otra pinza ~). La holoenzima es asimetrica porque solo tiene un cargador de pinza. Este se encarga de agregar un par de dimeros ~ a cada cadena progenitora de DNA. Cada uno de los complejos nucleares de la holoenzima sintetiza una de las cadenas nuevas de DNA. El cargador de pinza es tambien necesario para descargar el complejo ~ del DNA; como resultado, los dos nucleos tienen diferentes habilidades para disociarse del DNA. Esto corresponde a la necesidad de sintetizar una cadena lfder continua (en donde la polimerasa permanece asociada al molde) y una cadena retrasada discontinua (en donde la polimerasa se disocia y reasocia de manera repetida). El cargador de pinza esta asociado al nucleo de la polimerasa que sintetiza la cadena retrasada y tiene una funci6n clave en la capacidad para sintetizar fragmentos de Okazaki individuales.

1m

La pin za controla la asociaci6n de la enzima central con el DNA

Conceptos pri nci pales • El nucleo en La cadena l\der es procesivo debido a que su pinza lo mantiene en el DNA. • La pinza asociada al nucleo en La cadena retrasada se disocia al final de cada fragmento de Okazaki y se ensambla de nuevo para el siguiente fragmento. • La helicasa DnaB se encarga de interactuar con La primasa DnaG para iniciar cada fragmento de Okazaki.

El dfmero ~ hace ala holoenzima altamente procesiva. La subunidad ~ esta unida con fuerza al DNA, pero se puede deslizar a lo largo de una molecula duplex. La estructura cristalina de ~ muestra que crea un dfmero en forma de anillo. El modelo que se muestra en Ia muestra el anillo ~ en relaci6n con una doble helice de DNA. El anillo tiene un diametro externo de 80 A y una cavidad interna de 35 A. casi el doble del diametro de la doble he lice de DNA (20 A). El espacio entre el anillo protefnico y el DNA se llena de agua. Cada una de las subunidades ~ tiene tres dominios globulares con una organizaci6n similar (aunque sus secuencias son diferentes). Como resultado, el dfmero tiene una simetrfa sextuple que se refleja en 12 helices a que se alinean en el interior del anillo. El dimero rodea el duplex y da origen a la "pinza deslizante" que le permite a la holoenzima

440


La subunidad ~ de La holoenzima polimerasa de DNA III esta formada por un d\mero, en donde La cabeza de un mon6mero se une a La cola del otro (las dos subunidades se muestran en color rojo y en color naranja), que forma un anillo que rodea por completo a un DNA duplex (se ilustra en el centro). Reimpresi6n de Cell, vol. 69, Kong, X. P., et al., pp. 425-437. Copyright 1992, con autorizaci6n de Elsevier. Fotograftas cortes\a de John Kuriyan, University of California, Berkeley.

deslizarse por el DNA. La estructura explica la alta procesividad, no hay manera de que la enzima se desprenda. Las helices a localizadas en el interior tienen algunas cargas positivas que pueden interactuar con el DNA a traves de las moleculas de agua intermediarias. La pinza protefnica no hace o directo con el DNA. por lo que puede "patinar" por el DNA. formando y rompiendo os por media de las moleculas de agua. (.De que forma aborda la pinza al DNA? La pinza es un circulo de subunidades que rodea al DNA; por lo tanto, su ensamblaje o eliminaci6n requiere un proceso dependiente de energfa por parte del cargador de pinza. El cargador de pinza yes una estructura pentamerica circular que se une a una forma abierta del anillo ~ inductor para cargarlo al DNA. En efecto, el anillo es abierto en una de las interfases entre las dos subunidades ~ por medio de la subunidad 8 del cargador de pinza. Este se une en la parte superior de una pinza circular cerrada, con su sitio de ATPasa yuxtapuesto ala pinza, y utiliza la hidr6lisis de ATP para proporcionar la energia

necesaria para abrir el anillo de Ia pinza e inserta DNA dentro de la cavidad central. La relaci6n entre Ia pinza ~ y el cargador de pinza yes un paradigma para sistemas similares utilizados por las replicasas de DNA que van desde los bacteri6fagos hasta las celulas animales. La pinza es un heter6mero (o puede ser un dfmero o un trfmero) que forma un anillo alrededor del DNA con un conjunto de 12 h elices ex que forman una simetrfa sextuple para la estructura en su conjunto. El cargador de pinza tiene algunas subunidades que hidrolizan ATP para proporcionar energfa a Ia reacci6n. El principio basico que establece el modelo de Ia polimerasa dimerica afirma que, mientras una subunidad de polimerasa sintetiza Ia cadena lider de manera continua, la otra inicia y termina en forma cfclica los fragmentos de Okazaki de la cadena retrasada dentro de un Jazo extenso de cadena individual formado por su cadena de molde. La muestra un modelo generico de la operaci6n de tal replicasa. La horquilla de replicaci6n es creada por una helicasa (Ia cual forma por lo general un anillo hexamerico) que transfiere en direcci6n 5 '- 3' en un molde para la cadena retrasada. La helicasa se conecta a dos subunidades cataliticas de polimerasas de DNA, cada una de las cuales esta asociada a una pinza deslizante. Se puede describir este modelo de la polimerasa de DNA III en terminos de los componentes individuales del complejo enzimatico, como se ilustra en la . Un nucleo catalitico esta asociado a cada cadena molde del DNA. La holoenzima se desplaza de manera continua por el molde para Ia cadena Ifder; el molde para Ia cadena retrasada es "ernp uj ado", lo que crea un lazo en el DNA. DnaB crea el punto de desenrollamiento y se transfiere a lo largo del DNA hacia "adelante". DnaB entra en o con la(s) subunidad( es) 't del cargador de pinza. Esto establece una conexi6n directa entre el complejo h elicasa-primasa y los nu cleos cataliticos. Esta union tiene dos efectos. Uno es que incrementa la velocidad de la sfntesis de DNA a! aumentar l 0 veces Ia velocidad del movimiento del nucleo de Ia polimerasa de DNA. El segundo es que impide que la polimerasa de la cadena llder se desprenda, es decir, incrementa su procesividad. La sfntesis de la cadena lider crea un lazo de DNA de cadena individual que proporciona el molde para la sfntesis de Ia cadena retrasada, y este lazo se agranda a rnedida que el pun to de desenrollamiento avanza. Despues de Ia iniciaci6n de un fragmento de Okazaki el complej o nuclear de la cadena retrasada jala el m olde de caden a individual a traves de la pin za ~ mientras sintetiza !a caden a nueva . El molde de cadena individual se debe extender a todo lo largo de al rnenos un fragmento de Okazaki antes de que

Ia polimerasa retrasada complete un fragmen to y este lista para empezar el siguiente. (_Que pasa cuando el fragmento de Okazaki se completa? Todos los componentes del mecanismo de replica cion funcionan de man era procesiva (es decir, permanecen asociados al DNA), excepto por la primasa y por la pinza ~ · La li muestra que se disocian cuando la sfntesis de cada fragmento concluye y se Iibera el lazo. Una pinza ~ nueva es entonces reclutada por el cargador de pinza para iniciar el proximo fragmento de Okazaki. La polimerasa de la cadena retrasada se transfiere de una pinza ~ala siguiente en cada ciclo, sin disociarse del complejo de replicaci6n. (.Que se encarga de reconocer los sitios para iniciar la sfntesis de los fragmentos de Okazaki? En los replicon es oriC, la conexi6n entre el cebamiento y la horquilla de replicaci6n la proporcionan las propiedades dobles del producto DnaB : es la helicasa que propulsa la horquilla de replica cion e interactua con Ia prima sa DnaG en un sitio apropiado. Despues de la sfntesis del cebador, se Iibera la primasa. La longitud del RNA cebador es de apenas unas ocho a 14 bases. AI parecer, la polimerasa de DNA III se encarga del desplazamiento de la primasa.

La helicasa desenralla ~ "' el DNA

'"

El canectar une\ a Ia helicasa a das unidades de palimerasa

Q~l::~=======:::::::::

Subunidades cataliticas de Ia palimerasa de DNA

Sitia de iniciaci6n Fragmenta para el de Okazaki siguiente actual fragmenta de Okazaki

La pinza deslizante , radea al DNA

5'3' Las puntas de las flechas indican el 3'5' extrema 3'

Cargadar de pinza

~

,.. La helicasa en proceso de farmaci6n de la harquilla de replicaci6n esta conectada a das subunidades cata liticas de la palim erasa de DNA, cada una de las cuales es mantenida en el DNA par una pinza deslizante. La polimerasa que sintetiza la cadena lider se desplaza de forma continua . La polimerasa que sintet iza la cadena retrasada se disocia al final de un fragmenta de Okazaki y despues se reasocia con un cebador ubicado en ellazo molde de cadena individual para sintetizar el sig uiente fragment o.

18.10 La pinza controla la asociaci6n de la enzima central con el DNA

441

Extrema 5' del fragmento de Okazaki anterior

3'

5'

3'

5'

J l Cada nucleo catal1tico de Pol III si ntetiza una cadena hija. DnaB se encarga del movimiento hacia adelante en la horquilla de replicaci6n.

DID

Coordinaci6n de ta sintesis de la cadena lider y de la cadena retrasada

Conceptos principales • Se requieren diferentes unidades enzimaticas para sintetizar las cadenas l1deres y retrasadas. • En f . coli, ambas unidades contienen la misma subunidad catal1tica (DnaE). • En otros organismos pueden necesitarse diferentes subunidades catal1ticas para cada cadena.

Cada cadena de DNA nueva es sintetizada por una unidad catalitica individual. La muestra que el comportamiento de estas dos unidades es diferente porque las nuevas cadenas de DNA estan creciendo en direcciones contrarias. Una unidad enzimatica se desplaza con el punto de desenrollamiento y sintetiza Ia cadena lfder en forma continua. La otra unidad se mueve hacia "atras" en relaci6n con el DNA, a lo largo de Ia cadena individual expuesta. Solo segmentos cortos de molde estan 442


expuestos en un momenta dado. Cuando Ia sintesis de un fragmento de Okazaki ha concluido, es necesario que Ia sfntesis del siguiente fragmento de Okazaki comience en una nueva localizaci6n mas o menos en !a vecindad del punto de crecimiento de Ia cadena lfder. Esto requiere una translocaci6n relativa al DNA de Ia unidad enzimatica que esta sintetizando Ia cadena retrasada. Con el U~rmino "unidad enzimatica" se evita el problema de si la polimerasa de DNA que sintetiza Ia cadena lfder es el mismo tipo de enzima que Ia polimerasa de DNA que sintetiza Ia cadena retrasada. En el caso mejor conocido, E. coli, existe un solo tipo de subunidad catalftica de polimerasa de DNA usada en Ia replicaci6n, Ia protefna DnaE. La replicasa activa es un dimero y cada mitad del dfmero contiene DnaE como subunidad catalftica. La DnaE recibe el apoyo de otras protefnas (que difieren entre las cadenas lfder y retrasada). Sin embargo, el uso de un solo tipo de subunidad catalftica puede ser atfpico . En Ia bacteria Bacillus subtilis hay dos subunidades catalfticas diferentes. Pole es Ia hom61oga de DnaE de E. coli y se encarga de Ia sfntesis de la cadena lfder. Una proteina relacionada, DnaE 8 5, es Ia subunidad catalftica que sintetiza Ia cadena retrasada. Las polimerasas de DNA eucari6ticas tienen Ia misma estructura generaL y diferentes unidades enzimaticas sintetizan las cadenas lider y retrasada, pero no se sabe con certeza si se utilizan los mismos tipos, o tipos distintos, de subunidades cataliticas (vease Ia secci6n 18.13, Polimerasas de DNA eucari6ticas independientes realizan Ia iniciaci6n y !a elongaci6n) . Un problema importante del modo discontinue de replicaci6n surge del uso de diferentes unidades enzimaticas para sintetizar cada cadena de DNA nueva: (,Como se coordina Ia sfntesis de Ia cadena retrasada con Ia sfntesis de Ja cadena lider? A medida que el replisoma se desplaza por !a cadena de DNA y desenrolla las cadenas progenitoras, una unidad enzimatica extiende Ia cadena lider. De manera peri6dica, la actividad primosoma inicia un fragmento de Okazaki en Ia cadena retrasada y Ia otra unidad enzimatica debe, entonces, moverse en la direcci6n contraria para sintetizar el DNA. La 21 propane dos tipos de modelos para lo que le sucede a esta unidad enzimatica cuando completa !a sfntesis de un fragmento de Okazaki. El mismo complejo puede reutilizarse para !a sfntesis de fragmentos de Okazaki sucesivos. Otra posibilidad es que el complejo podrfa disociarse del molde, por lo que tendrfa que en samblarse un nuevo complejo para alargar el sigu iente fragmento de Okazaki. En Ia secci6n 18. 10, La pinza controla Ia asociaci6n de la enzima central con el DNA, se ve que es el primer modelo el que se aplica.

DIE

Los fragmentos de Okazaki estan unidos por la ligasa

.

.. . .. .

1. lnicio del fragmenio de Okazaki

2. Terminaci6n del fragmento de Okazaki

Conceptos principales • Cada fragmento de Okazaki inicia con un cebador y se detiene antes del siguiente fragmento. • La polimerasa de DNA I elimina el cebador y to rem plaza con DNA en una acci6n semejante at desplazamiento de hendidura. • La ligasa de DNA realiza el enlace que conecta el extrema 3' de un fragmento de Okazaki at inicio 5' del siguiente fragmento. 3. La pinza ~ se disocia

Ahara se conoce mejor lo que ocurre en la union de los fragmentos de Okazaki, como se ilustra en la 1 . El arden completo de los sucesos es incierto, pero debe involucrar la sintesis del cebador de RNA, su extension con el DNA, la eliminacion del cebador de RNA, su sustitucion por un fragmento de DNA y la union covalente de los fragmentos de Okazaki adyacentes. La figura indica que Ia sfntesis de un fragmento de Okazaki termina justa antes del inicio del cebador de RNA del fragmento precedente. Cuando el cebador es eliminado, se forma un espacio . Este espacio se llena con Ia polimerasa de DNA I; los mutantes polA no consiguen unir sus fragmentos de Okazaki de manera apropiada. La actividad exonucleasa 5'-3' elimina el cebador de RNA al tiempo que lo remplaza con una secuencia de DNA extendida desde el extrema 3'-0H del siguiente £ragmento de Okazaki. Esto equivale al desplazamiento de hendidura, excepto que el DNA nuevo remplaza un fragmento de RNA en vez de un tramo de DNA. En los sistemas de los mamfferos (en don de Ia polimerasa de DNA no tiene una actividad exonucleasa 5'-3'), los fragmentos de Okazaki se conectan por un proceso de dos pasos . La sintesis de un fragmento de Okazaki desplaza al cebador de RNA del fragmento anterior en la forma de un "aleron". La I 1 muestra que Ia enzima FENl divide Ia base del aleron . En esta reaccion FENl funciona como una endonucleasa, pero tambien es una enzima con actividad de 5'-3 ' exonucleasa. En las reacciones de reparacion del DNA, FENl puede realizar Ia division cerca de un nucleotido desplazado y luego usar su actividad exonucleasa para eliminar el material adyacente. La imposibilidad de eliminar un aleron con rapidez puede tener consecuencias importantes en regiones de secuencias repetidas. Las repeticiones directas pueden ser desplazadas y alineadas en forma incorrecta con el molde; las secuencias palindromicas pueden formar horquillas . Estas estructuras pueden cambiar el numero de repeticiones (vease

3'5'

3'5'

3'5'

I

3'5'

El nucleo de la polimerasa y La pinza ~ se disocian cuando concluye la sintesis del fragmento de Okazaki y se reasocian al inicio.

La enzima retrasada comienza fragmentos nuevas U Las polimerasas de la cadena lider y de la cadena retrasada se mueven de manera independiente.

Ia Figura 6.28). La importancia genera l de FENl radica en que impide que los alerones del DNA generen estructuras que pueden provocar deleciones o duplicaciones del genoma. Una vez que el RNA ha sido retirado y remplazado, los fragmentos de Okazaki cercanos deben unirse. El extrema 3'-0H de un fragmento es adyacente al extrema 5'-fosfato del fragmento anterior. La responsabilidad de sellar esta hendidura recae en Ia enzima ligasa de DNA. Las ligasas estan presentes en las procariotas y en las eucariotas. En los mutantes lig- persisten los fragmentos desconectado s porque son incapaces de unir los fragmentos de Okazaki . Las ligasas de E. coli y de T4 comparten la propiedad de poder sellar las hendiduras que tienen 18.12 Los fra gmentos de Okazaki estan unidos por la ligasa

443

La misma subunidad catalftica es reutilizada

Se utiliza una subunidad catalitica diferente

El modelo para la acci6n de la polimerasa de la cadena retrasada, que aparece en la parte superior de la figura, muestra que cuando una unidad enzimatica completa un frag mento de Okazaki, se des plaza a una posicion nueva para sintetizar el siguiente fragmento. El modelo inferior muestra que la polimerasa de la cadena retrasada se disocia cuando completa un fragmento de Okazaki y una nueva unidad enzimatica se asocia al DNA para sintetizar el siguiente fragmento de Okazaki.

extremos 3'-0H y 5'-fosfato, como se muestra en la '· . Ambas enzimas emprenden una reacci6n de dos pasos en Ia que participa un complejo AMP-enzima. (Las enzimas de E. coli y de T4 utilizan cofactores diferentes. La enzima de E. coli utiliza el NAD [nicotinamida adenina dinucle6tido] como cofactor, en tanto que Ia enzima de T4 utiliza ATP.) El AMP del complejo enzimatico se une al fosfato 5' de la hendidura y despues se forma un enlace fosfodiester con el grupo terminal 3'-0H de Ia hendidura, con lo que se Iibera la enzima y el AMP.

Ill

PoLimerasas de DNA eucari6ticas independientes reaLizan La iniciaci6n y La eLongaci6n

Conceptos pri ncipales • Una horquilla de replicaci6n tiene un complejo formado por polimerasa de DNA a.jprimasa y dos complejos de polimerasa de DNA oo £ . • El complejo polimerasa de DNA a.jprimasa inicia la sfntesis de las dos cadenas del DNA. • La polimerasa de DNA o alarga la cadena lfder y una segunda polimerasa de DNA o, o polimerasa de DNA E, alarga la cadena retrasada.

Las celulas eucari6ticas tienen un gran numero de polimerasas de DNA . Estas pueden dividirse a grandes rasgos en aquellas indispensables para la replicaci6n semiconservadora y aquellas que intervie444


nen en la sfntesis de material para reparar el DNA dafiado. La replicaci6n del DNA nuclear requiere las polimerasas de DNA a, y c.. Las polimerasas de DNA nuclear remanentes participan en la sfntesis de fragmentos nuevos de DNA para remplazar el material dafiado. La I, .. ~ muestra que todas las replicasas nucleares son enzimas heterotetramericas grandes. En cada caso, una de las subunidades se encarga de Ia catalisis y las demas estan relacionadas con funciones auxiliares, como la actividad cebadora, Ia procesividad o la correcci6n. Todas estas enzimas replican DNA con alta fidelidad, igual que la enzima mitocondrial un poco menos compleja. Las polimerasas reparadoras tienen estructuras mucho mas sencillas, las cuales a menudo consisten en una sola subunidad monomerica (aunque puede funcionar en el contexto de un complejo de otras enzimas reparadoras) . De las enzimas que participan en la reparaci6n, solo Ia polimerasa de DNA ~ tiene una fidelidad cercana a Ia de las replicasas: todas las demas tienen tasas de error mucho mayores. Toda Ia sfntesis del DNA mitocondrial, incluidas las reacciones de reparaci6n, de recombinaci6n y de replicaci6n, la realiza Ia polimerasa de DNA y. Cada una de las tres replicasas de DNA nuclear tiene una funci6n distinta: • La polimerasa de DNA a inicia Ia sintesis de cadenas nuevas. • Las polimerasa de DNA 8 alarga Ia cadena lfder. • La polimerasa de DNA c. puede intervenir en Ia sfntesis de Ia cadena retrasada, pero tambien tiene otras fun ciones. La polimerasa de DNA a es poco comun porque tiene Ia capacidad de iniciar una cadena nueva. Se utiliza para iniciar tanto la cadena lider como Ia cadena retrasada. La enzima existe como un complejo formado por una subunidad catalftica de 180 kD, que esta asociada a la subunidad B que parece ser necesaria para el ensamble, y por dos protefnas mas pequefias que proporcionan una actividad primasa. Por su capacidad doble de cebar y extender las cadenas, en ocasiones se le denomina primasa pol a. La enzima primasa /pol a se une al complejo de iniciaci6n en el origen y sintetiza una cadena corta formada por -10 b ases de RNA seguidas de 20 a 30 bases de DNA (algunas veces llamada iDNA) . Luego es remplazada por una enzima que extendera la cadena. En Ia Cadena lider, esta es ]a polimerasa de DNA o. A este suceso se le denomina intercambio de pol. Comprende interacciones entre numerosos componentes del complejo de iniciaci6n. La polimerasa de DNA es una enzima muy procesiva que sintetiza de manera continua Ia cadena lider. Su procesividad se debe a su interacci6n con otras dos protefnas, RF-C y PCNA.

o

o

Las funciones de RF-C y del PCNA son analogas a las de la unidad ~ de procesividad y del cargador de pinza y de E. coli (vease la secci6n 18.1 0, La pinza controla la asociaci6n de la enzima central con el DNA). RF-C es un cargador de pinza que cataliza una carga del PCNA al DNA. Se une al extremo 3' de la cadena iDNA y utiliza la hidr6lisis de ATP para abrir el anillo de PCNA de tal forma que pueda crear la estructura circular alrededor del DNA. La procesividad de la polimerasa de DNA 8 la mantiene el PCNA, que amana ala polimerasa de DNA 8 al molde. (La proteina PCNA es llamada antigeno nuclear de celulas en proliferaci6n [por sus siglas en ingles: prolzferating cell nuclear antigen] por razones hist6ricas.) La estructura cristalina del PCNA se parece mucho a la subunidad ~ de E. coli: un trimero forma un anillo que rodea al DNA. La secuencia y la organizaci6n de las subunidades son diferentes a las de la pinza dimerica ~; sin embargo, es probable que la funci6n sea similar. Se tiene menos certeza sobre lo que sucede en la cadena retrasada. Una posibilidad es que la polimerasa de DNA 8 tambien alargue la cadena retrasada. Tiene capacidad para formar dim eros, lo que sugiere un modelo analogo a! comportamiento de la replicasa de E. coli (vease la secci6n 18.9, La holoenzima polimerasa de DNA tiene tres subcomplejos). Sin embargo, hay algunos indicios de que la polimerasa de DNA£ puede alm·gar la cadena retrasada, aunque tambien ha sido identificada con otras funciones. Un modelo general sugiere que la horquilla de replicaci6n contiene un complejo de polimerasa de DNA a-primasa y otros dos complejos de polimerasas de DNA. Una es la polimerasa de DNA 8 y la otra es una segunda polimerasa de DNA 8 o puede ser una polimerasa de DNA £. Los dos complejos de polimerasa de DNA 8-£ acttian de la misma manera que los dos complejos de polimerasa de DNA ill en el replisoma de E. coli: uno sintetiza la cadena lider y el otro sintetiza los fragmentos de Okazaki en Ia cadena retrasada. La exonucleasa MF1 elimina los cebadores de RNA de los fragmentos de Okazaki. La enzima ligasa de DNA I se requiere de manera especifica para sellar las hendiduras entre los fragmentos de Okazaki concluidos.

aD

El fa go !4 propo:ciona su prop10 mecam smo de replicaci6n

Concepto principal

• El fago T4 proporciona su propio mecanismo de replicacion, formado por una polimerasa de DNA, el gen 32 SSB, una helicasa, una primasa y por prote\nas rias que incrementan la velocidad y la procesividad.

I

La polimerasa de DNA I utiliza el desplazamiento de hendidura para remplazar al cebador de RNA con DNA

+

La s\ntesis de los fragmentos de Okazaki requiere cebamiento, extension, eliminacion del RNA, rellenado de los espacios y ligamiento de la hendidura.

Cuando un fago T4 infecta una celula de E. coli, aporta numerosas funciones propias que remplazan o que potencian las funciones del hospedador. El fago depende poco de la expresi6n de las funciones del hospedador. La degradaci6n del DNA del hospedador es importante para la liberaci6n de nucle6tidos que son reutilizados en Ia sfntesis del DNA del fago. (El DNA del fago difiere en la composici6n de bases del DNA celular en que utiliza hidroximetilcitosina en Iugar de la citosina acostumbrada.) Las funciones codificadas por el fago implicadas en la sintesis de DNA en la celula infectada pueden identificarse por medio de mutaciones que impiden la producci6n de fagos maduros. Las funciones esenciales del fago se identifican por medio de mutaciones letales condicionales, que se dividen en tres clases fenotipicas: • Aquellas en las cuales no hay sintesis de DNA en absoluto identifican genes cuyos productos son componentes del mecanismo de replicaci6n o participan en la provision de precursores (en especial hidroximetilcitosina).

18.14 El fago T4 proporciona su propio mecanismo de replicacion

445

Cebador de RNA

o-o-P-o

Cebador de RNA

OHO

Enzima+AMP

Enzim~+ NAD

l

Enzima-AMP

l

9

Adenina-Ribosa-o-P-0

6

-o-F>-o-

oH6

La ligasa sella el espacio

FENl es una exojendonucleasa que reconoce la estructura que se crea cuando una cadena de DNA es desplazada de un duplex como un "aler6n". En la replicaci6n hace una division en la base del aler6n para eliminar el cebador de RNA.

• Aquellas en las cuales el comienzo de la sfntesis de DNA se retrasa tienen que ver con la iniciacion de la replicacion. • Aquellas en las que la sfntesis de DNA comienza pero despues se interrumpe incluyen funciones reguladoras, la ligasa de DNA y algunas de las enzimas relacionadas con la degradacion del DNA del hospedador. • Tambien existen genes no esenciales relacionados con la replicacion, como aquellos involucrados en la glucosilacion de la hidroximetilcitosina en el DNA. La sfntesis del DNA del fago T4 es catalizada por un agregado multienzimatico ensamblado con los productos de un pequefio grupo de genes esenciales. La protefna del gen 32 (gp32) es una protefna muy colaboradora de union al DNA de cadena individual, que se necesita en cantidades estequiometricas. Fue el primer ejemplo de este tipo que se describio. La geometrfa de la horquilla de replicacion de T4 puede requerir de manera espedfica Ia protefna codificada por el fago, porque la SSB de E. coli no puede sustituirla. La protefna gp32 forma un complejo con la polimerasa de DNA de T4; esta 446

CAPITULO 18 Replicaci6n del. DNA

La ligasa de DNA sella las hendiduras que se encuentran entre nucle6tidos pr6ximos al emplear un intermediario enzima-AMP.

interacdon podrfa ser importante en la construcdon de la horquilla de replicacion. El sistema de T4 utiliza un episodio de cebamiento de RNA similar al de su hospedador. Con un DNA de cadena individual de T4 como molde, los productos de los genes 41 y 61 actuan juntos para sintetizar cebadores pequefios. Su comportamiento es analogo al de DnaB y DnaG en E. coli. La protefna del gen 41 es la contraparte de la protefna DnaB. Es una helicasa hexamerica que utiliza la hidrolisis del GTP con elfin de proporcionar energfa para desenrollar al DNA. El complejo p4llp6l se desplaza en forma procesiva en direccion 5'-3' en la sfntesis de la cadena retrasada e inicia de manera periodica los fragmentos de Okazaki. Otra protefna, el producto del gen 59, carga al DNA con el complejo p4l/p6l; es necesaria para desplazar la protefna p32 y permitir que la helicasa se ensamble en el DNA. La protefna del gen 61 se necesita en cantidades mucho men ores que la mayor parte de las protefnas de replicacion de T4. Existen desde l 0 copias de gp6l por celula. (Esto ha impedido su caracterizadon. Se requiere en cantidades tan pequefias que en un principia no se identifico como un componente indispensable, debido a que la preparacion de gp32 estaba contaminada con esta proteina, y ejerda su funcion.) La protefna del gen 61 tiene actividad de primasa, la cual es analoga a la del producto DnaG de E. coli. La primasa reconoce la secuencia molde

•

I I

I

"

tJ~r!

. •

I~I

lllii Polimerasa Funcicin de DNA

C(

Replicasas de alta fidelidad Replicaci6n nuclear

Estructura

Tetramero de 350 kD Tetramero de 250 kD

Replicaci6n Dfmero de 200 kD mitocondrial Reparaci6n de alta fidelidad Reparaci6n de escisi6n Mon6mero de 39 kD de bases Reparaci6n de baja fidelidad Puente de dfmero de timina

Heter6mero

Reparaci6n de daiio de bases

Mon6mero

Necesaria para Ia meiosis

Mon6mero

Deleci6n y sustituci6n de bases

Mon6mero

E. coli

HeLa/SV40

Fago T4

Helicasa Carga helicasa/primasa Mantenimiento de Ia cadena individual Actividad cebadora

DnaB DnaC SSB

Antfgeno T Antfgeno T RPA

41 59 32

DnaG

Polcdprimasa

61

PCNA RFC

45 44/62

p Pinza deslizante Carga de Ia pinza (ATPasa) Complejo

Tetramero de 350 kD

E

~.I

Funci6n

yo

Catalisis Dimerizaci6n de Ia holoenzima

Nucleo Pol Ill Polo

Eliminaci6n del RNA Ugamiento

Poll Ligasa

6·

·?

43 43

MF1 Ligasa 1

43 Ligasa T4

Funciones similares son necesarias en todas las horquillas de replicaci6n.

F'"G ... 5 Las celulas eucari6ticas tienen muchas polimerasas de DNA. Las enzimas replicativas operan con alta fidelidad. Excepto por la enzima ~. todas las enzimas de reparaci6n tienen baja fidelidad. Las enzimas replicativas tienen estructuras extensas, con subunidades independientes para actividades distintas. Las enzimas de reparaci6n tienen estructuras mucho mas sencillas.

3'-TTG-5' y sintetiza pentarribonucle6tidos cebadores que tienen la secuencia general pppApNpNpNp. Si esta presente el mecanismo de replicaci6n completo, estos cebadores se extienden y forman cadenas de DNA. La polimerasa de DNA del gen 43 tiene Ia actividad sintetica 5'-3' habituaL que esta asociada a Ia actividad correctora de exonucleasa 3'-5'. Cataliza la sfntesis de DNA y elimina a los cebadores. Cuando Ia polimerasa de DNA de T4 utiliza un DNA de cadena individual como molde, su velocidad de progreso es desigual. La enzima se mueve con rapidez por las regiones de cadena individual, pero lo hace con mucho mas lentitud por las regiones que tienen una estructura secundaria con apareamiento de bases entre las cadenas. Las protefnas rias ayudan a Ia polimerasa de DNA a pasar por estas barricadas y mantenga asf su velocidad. Las tres protefnas restantes se conocen como "protefnas rias de Ia polimerasa". Incrementan Ia afinidad de la polimerasa de DNA por el DNA y tambien aumentan Ia procesividad y Ia velocidad. El producto del gen 45 es un trfmero que actua como una pinza deslizante. La estructura del trfmero se parece ala del dfmero ~de E. coli, en que forma un cfrculo alrededor del DNA que sostiene Ia subunidad de la polimerasa de DNA con mayor fuerza en el molde.

Los productos de los genes 44 y 62 forman un fuerte complejo que tiene actividad de ATPasa. Son el equivalente al complejo de pinza y8 y su funci6n es cargar a p45 sobre el DNA. Cuatro moleculas de ATP son hidrolizadas cuando se carga el DNA con Ia pinza p45 y con la polimerasa de DNA p43. La estructura global del replisoma es muy similar a Ia de E. coli. Esta formada por dos complejos de holoenzimas acoplados, uno que sintetiza Ia cadena lfder y el otro que sintetiza la cadena retrasada. En este caso, la dimerizaci6n comprende una interacci6n directa entre las subunidades de Ia polimerasa de DNA p43, y p32 tiene una funci6n en Ia coordinaci6n de las acciones de las dos unidades de polimerasa de DNA. Basta ahora se ha examinado la replicaci6n del DNA en lo que se refiere a Ia progresi6n de Ia horquilla de replicaci6n. La necesidad de otras funciones Ia demuestran los mutantes de retraso de Ia sfntesis del DNA y los de detenci6n de Ia sfntesis del DNA. Tres de los cuatro genes de los mutantes de retraso de la sfntesis del DNA son el 39, el 52 y el 60, los cuales codifican las tres subunidades de Ia topoisomerasa II de T4, una actividad necesaria para eliminar superenrollamientos en el molde (vease Ia secci6n 19. 13, Las topoisomerasas relajan o introducen superenrollamientos en el DNA). La funci6n esencial de esta enzima sugiere que el DNA de T4 no permanece en forma lineal, sino que mas bien se constrifie topol6gicamente durante alguna etapa de Ia replicaci6n. La topoisomerasa podria n ecesitarse para que la rotaci6n del DNA dejara atras Ia horquilla de replicaci6n. La comparaci6n del mecanismo del fago T4 con el mecanismo de E. coli sugiere que Ia replicaci6n del DNA plantea una serie de problemas que se resuelven de formas analogas en diferentes sistemas. Ahora se pueden comparar las actividades enzimaticas y estructurales observadas en Ia horquilla de

18.14 El fa go T4 proporciona su propio mecanisme de replicaci6n

44 7

r

replicacion en E. coli, en T4 y en las celulas HeLa (humanas) . La resume las funcione s y las asigna a protefnas individuales. Se pueden interpretar las propiedades cono cidas de las proteinas de los complejos de replicacion en terminos de funciones similares que comprenden las reacciones de desenrollamiento, d e cebamiento, de catalisis y de formacion de sellos. Los componentes de cada sistema interactuan de maneras restringidas, como lo demuestra el h echo de que el fago T4 requiere sus propias helicasa, primasa, pinza, etc., y por el hecho de que las protemas bacterianas no pueden sustituir a sus contrapartes fagicas.

IE

Creaci6 n de las ho rquillas de replicaci6n en el origen

llama Ia atencion por ser Ia unica involucrada de manera exclusiva en Ia iniciacion frente a Ia elongaci6n. DnaB y DnaC proporcionan Ia "maquinaria" de iniciaci6n en el origen. La primera etapa en Ia fo r maci6n del complejo es Ia union de la protefna DnaA a oriC. La reacci6n comprende Ia acci6n en dos tipo s de secuencias: las repeticiones de 9 bp y las repeticione s de 13 bp. Juntas, estas dos ultimas secuencias definen los lfmites del origen minima de 245 bp, como se indica en la . Un origen es activado porIa secuencia de episodios que se resumen en la fl, en la cual, a Ia union de DnaA le sigue Ia asociacion con las otras protefnas. Las cuatro secuencias de consenso de 9 bp sobre el !ado derecho de oriC propo rcionan los sitios de

Conceptos principales • La iniciaci6n en oriC requiere el ensamble secuencial de un gran complejo de prote\nas. • DnaA se une a secuencias cortas repetitivas y forma un complejo oligomerico que desnaturaliza al DNA . • Seis mon6meros de DnaC se unen a cada hexamero de DnaB, y este complejo se une al origen. • Un hexamero de DnaB forma la horquilla de replicaci6n . La girasa y la SSB tambien son necesarias.

Para comenzar un ciclo de replicacion de un DNA duplex se necesi tan varias actividades sucesivas: • Las dos cadenas de DNA deben pasar por su separacion inicial. Es decir, en efecto, sufrir una desnaturalizacion en una region corta. • Un punto de desenrollamiento comienza a desplazarse por el DNA; esto indica Ia generacion de la horquilla de replicacion, la cual continua moviendose durante la elongacion. • Los primeros nucleotidos de la nueva cadena deben ser sintetizados para formar el cebador. Esta accion se necesita una vez en la caden a lfder, pero se repite en el comienzo de cada fragmento de Okazaki en Ia cadena retrasada . Por lo tanto, algunos de los sucesos que son indispensables para Ia iniciacion ocurren solo en el origen; otros se repiten con la iniciacion de cada fragmento de Okazaki durante la fase de elongacion. Se han utilizado plasmidos que ponan Ia secuencia oriC de E. coli para desarrollar un sistema sin celulas para Ia replicaci 6n. In vitro, la iniciacion de Ia replicacion en oriC empieza con la formacion de un complejo que requiere seis proteinas: Dna A, DnaB, DnaC, HU, gira sa y SSB . De las seis protefnas comprendidas en el precebamiento, Ia protefna DnaA

448


L

M R

2

repeticio•nes de 13 bp

3

4

repeticiones de 9 bp 245 bp-----+-

El origen m\nimo se define por la distancia que hay entre los externos de las repeticiones de 13 bp y de 9 bp.

GATCTNTTNTTTI El origen tiene tres repeticiones de 13 bp y cuatro repeticiones de 9 bp Los mon6meros de DnaA se unen a las repeticiones de 9 bp

. YJ\.._fJS..'/]\;(/j

DnaA se une a las repeticiones de 13 bp

Las cadenas del DNA se separan en las repeticiones de 13 bp

El precebamiento comprende la formaci6n de un complejo por asociaci6n secuencial de prote\nas, lo cual provoca la separaci6n de las cadenas del DNA.

- .. .. .

~

La burbuja de replicaci6n se forma en el origen

FlGl El complejo en oriC puede apreciarse con microscopia electr6nica. Los dos complejos se visualizaron con anticuerpos contra la proteina DnaB. Fotografta superior reproducida de Funnel, B. E., et al. J. Bioi. Chem. 1987. 262: 10327-10334. Copyright 1987 by American Society for Biochemistry & Molecular Biology. Fotografta cortes1a de Barbara E. Funnell, University of Toronto. Fotografta inferior reproducida de Barker, T. A., et al. J. Bioi. Chem. 1987. 262: 6877-6885. Copyright 1987 by American Society for Biochemistry & Molecular Biology. Fotografta cortesia de Barbara E. Funnell, University of Toronto.

union iniciales para DnaA. Esta se une en colaboraci6n para formar un nucleo central alrededor del cual el DNA de oriC forma una envoltura. Despues, DnaA actua sobre tres repeticiones, en tandem, de 13 bp ricas en A-T, que se encuentran en ellado izquierdo de oriC. En presencia de ATP, DnaA desnaturaliza las cadenas del DNA en cada uno de estos sitios para formar un complejo abierto. Las tres repeticiones de 13 bp deben ser desnaturalizadas para que la reacci6n prosiga a la siguiente etapa. En general, de dos a cuatro monomeros de DnaA se unen al origen y reclutan dos complejos de "precebamiento" de DnaB-DnaC para unirse, por lo que hay uno para cada una de las dos horquillas de replicacion (bidireccionales). Cada complejo de DnaB-DnaC esta formado por seis monomeros de DnaC unidos al hexamero de DnaB. Cada complejo de DnaB-DnaC transfiere un hexamero de DnaB a una cadena opuesta de DNA. DnaC hidroliza ATP para liberar a DnaB. El complejo de precebamiento genera un agregado protefnico de 480 kD, que corresponde a una

esfera con un radio de 6 nm. La formaci6n de un complejo en oriC es detectable por la presencia de un gran globulo protefnico que se observa en la . Cuando la replicacion comienza, una burbuja de replicacion se hace visible allado del globulo. La region de la separacion de la cadena en el complejo abierto tiene el tama1l.o suficiente para que se puedan unir ambos hexameros de DnaB, lo cual inicia las dos horquillas de replicacion. A medida que se une DnaB, desplaza a DnaA de las repeticiones de 13 bp y extiende la longitud de la region abierta. Despues utiliza su actividad de helicasa para extender la region de desenrollamiento. Cada DnaB activa una prima sa de Dna G (en un caso para iniciar la cadena lfder y en el otro para iniciar el primer fragmento de Okazaki de la cadena retrasada). Dos protefnas mas son necesarias para apoyar la reaccion de desenrollamiento. La girasa proporciona un eslabon giratorio que permite que una cadena gire alrededor de la otra (una reaccion que se analiza con mas detalle en la seccion 1 9.15, La girasa funciona por inversion del enrollamiento ); sin esta reaccion, el desenrollamiento generaria tension por torsion en el DNA. La proteina SSE estabiliza al DNA de cadena individual a medida que se va formando. La longitud del DNA duplex que por lo general se desenrolla para iniciar la replicacion es tal vez <60 bp. La protefna HU es una protefna general de union al DNA en E. coli. Su presencia no es indispensable para iniciar la replicacion in vitro, pero estimula la reaccion. La HU tiene la capacidad de plegar el DNA y tiene que ver con la construccion de la estructura que conduce ala formacion del complejo abierto. La entrada de energfa en forma de ATP es necesaria en numerosas etapas para la reaccion de precebamiento y para el desenrollamiento del DNA. La accion helicasa de DnaB depende de la hidrolisis de ATP y la accion rotatoria de la girasa tambien consume ATP. Este ultimo tambien se necesita para la accion de la primasa y para activar la polimerasa de DNA Ill. Despues de la generacion de la horquilla de replicacion, como se indica en la Figura 18.28, tiene lugar la reaccion de cebamiento para generar una cadena lfder. Se sabe que para Ia actividad cebadora se utiliza la sfntesis de RNA pero los detalles de la reaccion se desconocen. Algunas mutaciones en dnaA pueden ser suprimidas por mutaciones en la polimerasa de RNA lo cual sugiere que DnaA podrfa participar en un paso de iniciacion que requiere la sfntesis de RNA in vivo. La polimerasa de RNA podrfa necesitarse para leer el origen desde las unidades de transcripcion adyacentes; al terminar en sitios ubicados en el ori18. 15 Creaci6n de las horquillas de replicaci6n en el origen

449

gen, podria proporcionar los extremos 3'-0H que ceban a la polimerasa de DNA III. (Un ejemplo lo constituye el uso de lazos D en los origenes mitocondriales, como se analiza en Ia seccion 15.1 0, Los lazos D mantienen los orfgenes mitocondriales.) Una alternativa es que el acto de Ia transcripcion estuviera asociado a un cambia estructural que ayude a Ia iniciacion. Esta ultima idea es respaldada por observaciones que sustentan que Ia transcripcion no tiene que pasar por el origen; es eficaz hasta a 200 bp de distancia del origen y puede usar cualquiera de las dos cadenas del DNA como molde in vitro. El episodio de la transcripcion se relaciona de manera inversa con Ia necesidad de superenrollamiento in vitro, lo cual sugiere que actua cambiando Ia estructura local del DNA para facilitar Ia desnaturalizacion del DNA.

111m

Sucesos comunes en el cebamiento de la replicaci6n en el origen

Conceptos principales • El principia general de la iniciacion bacteriana es que el origen es reconocido en un inicio por una proteina que forma un gran complejo con el DNA. • Una region corta de DNA enriquecida con A-T es desnaturalizada. • DnaB se une al complejo y crea la horquilla de replicacion.

Otro sistema para investigar las interacciones en el origen lo proporciona el fago A. En la G 1 se muestra un mapa de la region. La iniciacion de la replicacion en el origen de A requiere "la activa-

ori 1-

•

crol

I

La transcripcion debe iniciar aqui

Para que Ia replicacion inicie aqui

La iniciacion de la transcripcion en PR es necesaria para activar el origen del DNA de A..

cion", con el inicio de la transcripcion a partir de Pa. Igual que en los sucesos en oriC, esto no significa que el RNA proporcione un cebador para la cadena lider. Analogias entre estos sistemas sugieren que la sintesis de RNA podrfa participar en Ia estimulacion de algun cambia estructural en la region. La iniciacion requiere los productos de los genes 0 y P del fago, asi como numerosas funciones del 450

CAPITULO 18 Replicacion del DNA

. Sitios de union para Ia protefna 0 de 18 bp IV

Ill

II

.... . . .

.

.

.

Region rica en A-T 40 bp

I

~~~~~,. ..'>n.Fr'

! desnaturaliza~: ~~~ El DNA es

1 ~ El origen de A. para la replicacion comprende :_ regiones. Los episodios tempranos son catalizados por la prote·-.c la cual se une a una serie de cuatro sitios y despues el DNA es dEC turalizado en la region cercana rica en A-T. El DNA se dibuja co m: duplex recto; sin embargo, en realidad esta plegado en el origE-

hospedador. La proteina 0 del fago se une al origen de A, la proteina P fagica interactua con la protefna 0 y con proteinas bacterianas. El origen se encuentra dentro del gen 0, de modo que la protefna actua cerca de su sitio de sintesis. Las variantes del fago llamadas Adv consisten en genomas mas cortos que portan toda Ia informacion necesaria para la replicacion, pero carecen de funciones infecciosas. El DNA Adv sobrevive en la bacteria como un plasmido y puede ser replicado in vitro por un sistema formado por las proteinas 0 y P codificadas por el fago junto con las funciones de replicacion bacterianas. Las proteinas de A 0 y P forman un complejo junto con DnaB en el origen de /,, oriA. El origen esta formado por dos regiones, como se ilustra en la I J 1: una region que comprende una serie de cuatro sitios de union para la proteina 0 esta proxima a una region rica en A-T. La primera etapa en Ia iniciacion es !a union de 0 para generar una estructura casi esferica con un diametro de -11 nm, una estructura llamada en ocasiones 0-soma . Este contiene -100 bp o 60 kD de DNA. Hay cuatro sitios de union de 18 bp para la protefna 0, de -34 kD. Cada sitio es palindromico y es probable que se una a un di.mero 0 simetrico. Las secuencias de DNA de los sitios de union a 0 parecen estar plegados, y la union de Ia proteina 0 induce un plegamiento mayor. Si el DNA esta superenrollado, !a union de la proteina 0 provoca un cambio estructural en el origen. La region rica en A-T contigua a los si tios de union se hace susceptible a Ia nucleasa S1, una enzima que reconoce de manera especifica a! DNA no apareado. Esto sugiere que junto al complejo de protefnas 0 ocurre una reacci6n de desnaturalizaci6n.

La funcion de la protema 0 es analoga a la de DnaA en ariC: prepara al origen para Ia union de DnaB . Lambda proporciona su propia protefna P que sustituye a DnaC y !leva a DnaE al origen. Cuando se agregan Ia protema P de A. y las proteinas DnaE bacterianas, el complejo se hace mas grande y sirnetrico. Incluye mas DNA (un total de -160 bp), asi como algunas otras protemas. La protema P de A. tiene una funcion especial; inhibe la accion de helicasa de DnaB. El movimiento de la horquilla de replicacion se desencadena cuando Ia proteina P es liberada del complejo. Este episodio precede al cebamiento y a Ia smtesis de DNA. Algunas proteinas son esenciales para la replicacion sin que participen de manera directa en Ia sfntesis de DNA. Las protefnas DnaK y DnaJ son ejemplos interesantes. La proteina DnaK es un chaperon y esta relacionada con una proteina de estres comun de las eucariotas. Su capacidad para interactuar con otras protefnas de un modo dependiente de Ia conformacion es importante en muchas actividades celulares, como Ia replicacion. La funcion de Dnak y DnaJ puede ser desensamblar el complejo de precebamiento: a! causar Ia liberacion de Ia protefna P, permiten el comienzo de Ia replicacion. Las reacciones de iniciacion en ariC y en ariA. son similares. Comprenden las mismas etapas y se basan en componentes comunes. El primer paso es el reconocimiento del origen por una protefna que se une para formar un complejo con el DNA (DnaA para ariC y Ia protein a 0 para ariA.). Una region corta de DNA rica en A-T es desnaturalizada. Despues DnaE es cargada; esto requiere funciones distintas en ariC y en ariA. (no obstante, se requieren otras protefnas para esta etapa en otros orfgenes). Cuando la helicasa DnaB se une al complejo, se crea una horquilla de replicacion. Por ultimo, se sintetiza un cebador de RNA, despues de lo cual comienza la replica cion. El uso de ariC y ariA. ofrece un modelo general para Ia activacion de los orfgenes. Una serie similar de episodios ocurre en el origen del virus SV40 en las celulas de los mamfferos. Dos hexameros de antfgeno T, una protefna codificada por el virus, se unen a una serie de sitios repetidos en el DNA. En presencia de ATP, ocurren cambios en la estructura del DNA, que culminan en una reaccion de desnaturalizacion. En el caso de SV40, Ia region desnaturalizada es bastante corta y no es rica en A-T, pero tiene una composicion atfpica en Ia cual una cadena esta formada casi de manera exclusiva de pirimidinas y Ia otra de purinas. Cerca de este sitio se encuentra otra region esencial. Consiste en pares de bases A-T, en los cuales el DNA esta plegado; el DNA es entonces desenrollado por la union del antfgeno T. Una diferencia interesante con el sistema de las

procariotas es que el antfgeno T posee la actividad helicasa necesaria para extender el desenrollamiento, de modo que no se requiere un equivalente de Ia protefna DnaE.

liD

El primosoma es necesario para reiniciar la replicaci6n

Conceptos principales • La iniciaci6n de la replicaci6n de
En trabajos anteriores sobre Ia replicacion se hizo amplio uso del fago
451

La replicaci6n se interrumpe par una base dafiada o por una hendidura en el DNA.

con lo que sucede cuando existe un dafio en una base en el DNA o una hendidura en una de las cadenas. En ambos casos Ia sfntesis de DNA se detie· ne y Ia horquilla de replicacion queda varada o se deteriora. No esta claro si los componentes de Ia horquilla permanecen asociadas al DNA o se desensamblan. Que una horquilla de replicacion quede varada parece ser bastante comun; las estimaciones de Ia frecuencia de este suceso en E. coli sugieren que de 18 a 50% de la s bacterias confrontan un problema durante un ciclo de replicacion. La situacion se resuelve con un episodio de recombinacion que escinde y remplaza el dafio o proporciona un duplex nuevo para sustituir Ia region que contiene la rotura en la doble cadena (vease Ia Figura 20.20 en Ia seccion 20.8, Sistemas de reparacion por recombinacion en E. coli) . El principia del episodio de reparacion es aprovechar la redundancia de informacion incorporada entre las dos cadenas de DNA. La muestra los episodios fundamentales de dichos sucesos de reparacion. En terminos basicos, la informacion del DNA duplex hijo no dafiado se utiliza para reparar Ia secuencia dafiada. Esto crea una union de recombinacion tfpica que resuelven los mismos sistemas que llevan a cabo la recombinacion homologa. De hecho, algunos opinan que la importancia principal de estos sis temas para la celula radica en la reparacion del DNA dafiado en las horquillas de replicacion varadas. 452


La replicaci6n reinicia

::::m::::: ::::~l::::::> ~ Cuando la replicaci6n se detiene en el DNA dafiado, la secuencia afectada es escindida y la cadena complementaria (recien sintetizada) del otro duplex hijo se entrecruza para reparar la abertura. Ahara puede reanudarse la replicaci6n y llenarse los espacios.

Despues que el dafio ha sido reparado, la horquilla de replicacion debe ser reiniciada. La .. ~ muestra que esto puede lograrse mediante el ensamblaje del primosoma, que en efecto recarga el DnaB para que Ia accion de helicasa pueda continuar. La reactivacion de Ia horquilla de replicacion es una reacci6n frecuente (y, por lo tanto, importante). Es posible que se requiera en Ia mayor parte de los ciclos de replicacion cromosomica. Es inhibida por las mutaciones en cualquiera de los sistemas de recuperacion que remplazan el DNA dafiado o en los componentes del primosoma. Las horquillas de replicaci6n de ben parar y desensamblarse en Ia terminaci6n de la replicacion. (.Como se logra esto? Las se cuencias que detienen el movimiento de las horquillas de replicaci6n se han identificado como elementos ter del cromosoma de E. coli (vease la ) o secuencias equivalentes en algunos plasmidos. La caracteristica comun de estos elementos es una secuencia de consenso de 23 bp que constituye el sitio de union para el producto del

Horquilla de replicaci6n 2

El primosoma es necesario para reiniciar una horquilla de replicaci6n varada despues de que el DNA ha sido reparado.

1:111

Resumen

La sfntesis de DNA ocurre por replicaci6n semidis continua, en la cual la cadena lfder del DNA que

Horquilla de replicaci6n 1

_ Los extremos de la replicaci6n en E. coli se localizan mas alla del sitio donde las horquillas de replicaci6n se encuentran.

accesible La replicaci6n prosigue DNA

gen tus, una proteina de 36 kD que es indispensable para la terminaci6n. Tus se une a la secuencia de consenso, en donde ejerce una actividad de contra-helicasa e inhibe el desenrollamiento del DNA mediado por DnaB. La cadena lfder continua sintetizandose justa hasta el elemento ter, en tanto que la cadena retrasada mas cercana es iniciada de 50 a 100 bp antes de alcanzar al elemento ter. El resultado de esta inhibici6n es detener el movimiento de !a horquilla de replicaci6n y (a! parecer) causar un desensamblaje del mecanismo de replicaci6n. La permite recordar que Tus detiene el movimiento de la horquilla de replicaci6n solo en una direcci6n. La estructura cristalina de un complejo Tus-ter muestra que !a protefna Tus se une a! DNA en forma asimetrica; las helices a de Ja protefna sobresalen alrededor de la doble helice en el extremo que bloquea ala horquilla de terminaci6n. Al parecer, una horquilla que avanza en Ja direcci6n contraria puede desplazar a Tus y de esta manera continuar. Una dificultad para entender el funcionamiento del sistema in vivo es que parece ser prescindible, debido a que las mutaciones en los sitios ter o en tus no son letales.

Origen

bloqueado La replicaci6n termina

DNA

X• DnaB

VA

Tus se une a ter en forma asimetrica y bloquea la replicaci6n solo en una direcci6n.

crece en direcci6n 5'-3' se extiende en forma continua; en contraste, la cadena retrasada que crece por lo general en la direcci6n contraria, 3'-5 ', es creada con fragmentos cortos de Okazaki, cada uno sintetizado en direcci6n 5'- 3'. La cadena lfder y cada fragmento de Okazaki de la cadena retrasada inician con un cebador de RNA que es extendido por la polimerasa de DNA. Las bacterias y las eucariotas poseen mas de una actividad de polimerasa de DNA. La polimerasa de DNA III sintetiza tanto la cadena lfder como la cadena retrasada en E. coli. Se requieren muchas protefnas para !a acci6n de Ia polimerasa de DNA illy varias constituyen parte del replisoma dentro del cual funciona. El replisoma contiene un dfmero asimetrico de polimerasa de DNA III; cada cadena nueva de DNA es sintetizada por un complejo nuclear diferente que contiene una subuoidad catalitica (a). La procesividad del complejo nuclear se conserva porIa pinza ~, la cual forma un anillo alrededor del DNA. El DNA 18.18 Resumen

453

es cargado con Ia pinza por el complejo cargador de pinza. Los pares cargador de pinza/pinza con caracterfsticas estructurales similares se observan de manera generaliza da en los sistemas de replicacion de las procariotas y de las eucariotas. El modelo de formacion de lazos para la horquilla de replicacion propane que, conforme una mitad del dfmero avanza para sintetizar Ia cadena Hder, la otra mitad del dfmero jala el DNA como un solo lazo que proporciona el molde para la cadena retrasada. La transicion entre Ia culminacion de un fragmento de Okazaki y el inicio del siguiente requiere que Ia subunidad catalftica de la cadena retrasada se disocie del DNA y despues se una de nuevo a una pinza ~ en el sitio de cebamiento para el siguiente fragm ento de Okazaki. DnaB proporciona Ia actividad de helicasa en la horquilla de replicacion; esto depende deJa division de ATP. DnaB puede funcionar por sf sola en los replicones oriC y proporcionar la actividad de primasoma al interactuar en forma periodica con DnaG, que proporciona la primasa que sintetiza el RNA. El fago T4 codifica un mecanismo de replicacion formado por siete protefnas: polimerasa de DNA, helicasa, protefna de union a Ia cadena individual, elementos con actividades cebadoras y protefnas rias. En otros sistemas de replicacion se n ecesitan funciones si.milares, incluido el sistema de celulas HeLa que replica el DNA de SV40. Enzimas diferentes (polimerasa de DNA a y poli.merasa de DNA 8) inician y alargan las cadenas nuevas de DNA. La actividad cebadora
CAPITULO 18 Replicacion del DNA

en direcciones contrarias. Sucesos similares tienen Iugar en el origen de A., donde las protefnas fagicas 0 y P son las contrapartes de las protefnas bacterianas DnaA y DnaC, respectivamente. En Ia replicaci6n de SV40, muchas de estas actividades se combinan en las funciones del antfgeno T. La disponibilidad de DnaA en el origen es u n componente i.mportante del sistema que determina cuando deben iniciar los ciclos de replicacion. Despues de la iniciacion de Ia replicacion, DnaA hidroliza su ATP bajo los estfmulos de la pinza deslizante ~, lo que genera una fo rma inactiva de Ia protefna. Ademas, oriC debe competir con el sitio dat por la union de DnaA. En el origen de E. coli hay numerosos sitios que son metilados por Ia metilasa Dam, como los sitios de union de 13 bp para DnaA. El origen permanece hemimetilado y se encuentra en un estado secuestrado durante - 10 min despues de Ia iniciacion de un ciclo de replicacion. Durante este periodo esta asociado a Ia membrana y Ia reiniciacion de Ia replicacion es repri.mida. La protefna SeqA interviene en el secuestro y puede interactuar con DnaA.

Referencias

lliJ

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IJII

Las polimerasas de DNA tienen una estructura comu n

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IIIII

El modelo
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IE

La pi nza co ntrola La asociaci6 n de La enzima central con el DNA

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1111

Coordinaci6n de La s\ntesis de La cadena l\der y de La cadena retrasada

Art\culo de investigaci6n Dervyn , E., Suski, C., Daniel, R., Bruand, C., Chapuis, J ., Errington, J., Janniere, l., and Ehrlich, S.D. (2001). Two essential DNA polymerases at the bacterial replication fork. Science 294, 1716-17 19.

E

Los fra gment os de Okazaki estan unidos por la ligasa

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~~~~ El fago T4 proporciona su propio mecanisme de replicaci6n Artjwlos de investigaci6n Ishmael, F. T., Alley, S. C., an d Benkovic, S. J. (2002). Assembly of the bacteriophage T4 helicase: architecture and stoichiometry of the gp41-gp59 complex. J. Bioi. Chem . 277, 20555-20562. Salinas, F., an d Benkovic, S. J. (2000). Ch aracterization of bacteriophage T4-coordjnated leading- and laggingstrand synthesis on a minicircle substrate. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 97,7196-7201 . Schrock, R. D. and Alberts, B. ( 1996). Processivity of the gene 41 DNA helicase at the bacteriophage T4 DNA replication fork. J. Bioi. Chern. 27 1, 16678-16682.

IE

Creaci6n de las horquillas de replicaci6n en el origen

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El primosoma es necesario para reiniciar la replicaci6n Articulos de revision Cox, M. M. (2001). Recombinational DNA repair of damaged replication forks in E. coli: questions. Annu. Rev. Genet. 35,53- 82.

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ecomb ·naci6n hom6loga y especifica de sitio ESQUEMA DEL CAPITULO Introducci6n Ocurre recombinaci6n hom6loga entre cromosomas en sinapsis • Los cromosomas deben entrar en sinapsis (aparearse) para que se formen los quiasmas, donde tiene Iugar el entrecruzamiento. • Se pueden correlacionar las etapas de la meiosis co n los sucesos moleculares que ocurren en el DNA.

• Si se bloquea la recombinaci6n , el complejo sinaptonemico no puede formarse.

1m El apareamiento y la formaci6n del complejo si-naptonemico son i ndependientes • Pueden ocurrir mutaciones durante el apareamiento cromos6mico o la formaci6n del complejo sinaptonemico sin afectar el otro proceso.

IB

Rotura y reunion afectan el DNA heteroduplex • El suceso clave de la recombinaci6n entre dos moleculas de DNA duplexes el intercambio de cadenas unicas. • Cuando una sola cadena de una estructura duplex desplaza a su contraparte en la otra, crea una estructura ramificada. • El intercambio genera una cadena de DNA heteroduplex constituida por una cadena de cada progenitor. • Se necesitan dos intercambios (reciprocos) para genera r una molecula articulada. • La molecula articulada se resuelve en dos moleculas duplex independientes mediante una hendidura en dos de las cadenas que se conectan. • El que se formen recombinantes depende de que las cadenas participantes en el intercambio original, o el otro par, presenten muescas durante la resoluci6n.

Las roturas de la doble cadena inician la recombinaci6n • La recombinaci6n se inicia co n una rotura de la doble cadena en una cadena de DNA duplex (receptora). • La actividad de la exonucleasa genera extremos 3' de cadena unica que invaden la otra cadena duplex (donadora). • La sintesis nueva de DNA sustituye el material que ha sido degradado. • Esto genera una molecula de articu laci6n recombinante donde las dos cadenas de DNA duplex estan conectadas por DNA heteroduplex.

DR

Los cromosomas en recombinaci6n se conectan por el complejo sinaptonemico • Durante la primera parte de la meiosis, los cromosomas hom6logos se aparean en el complejo sinaptonemico. • La masa de cro matina de cada cromosoma hom6logo esta separada de la otra por un complejo proteinaceo.

DJJI

El complejo sinaptonemico se forma despues de roturas de la doble cadena

Las secuencias chi estimulan el sistema RecBCD bacteria no • El complejo RecBCD tiene actividades de nucleasa y helicasa. • Se une al DNA en se ntido descendente respecto de una secuencia chi, de senrolla la cadena duplex y degrada una cadena de 3' a 5' con forme se des plaza hacia el sitio chi. • El sitio chi desencadena la perdida de la subunidad ReeD y la actividad de nucleasa.

llil!l

Las proteinas de transferencia de cadenas catalizan la asimilaci6n de una sola cadena • La RecA forma filamentos con el DNA de una o dos cadenas y cataliza la capacidad de un DNA de una sola cadena con un extreme libre 3' de desplazar a su contraparte en una estructura duplex de DNA.

lam

El sistema Ruv resuelve las uniones Holliday • El com plejo Ruv actua sobre uniones recombinantes. • La RuvA reconoce la estructura de la union y la RuvB es una helicasa que cataliza la migraci6n de ramas. • La RuvC escinde uniones para generar productos intermedios de recombinaci6n.

(go

La conversion genica contribuye a la recom bi naci6n i nteralelica • El DNA heteroduplex creado por recombinaci6n puede tener secuencias con apareamiento err6neo, donde los alelos recombinantes no son identicos. • Los sistemas de reparaci6n pueden retirar apareamientos err6neos si cambia una de las cadenas, de modo que su secuencia sea co mp le mentaria a la otra.

B6

El superenrollamiento afecta la estructura del DNA • Ocurre superenrollamiento solo en un DNA cerrado sin ningun extreme libre. • Un DNA cerrado puede ser una molecula circular o una lineal donde ambos extremes se anclan a una estructura proteinica .

• Las roturas de la doble cadena que inician la recombinaci6n ocurren antes de que se forme el complejo sinaptonemico.

Continua en Ia siguiente pagina 457

• Cualquier molecula de DNA cerrada tiene un numero de enlace que corresponde a la suma del numero de contorsiones y del numero de torcimientos. • Los plegamientos se pueden repartir entre el numero de contorsiones y el numero de torcimientos, de manera que un cambia en la estructura de la doble helice puede compensar una modificaci6n de su enrollamiento en el espacio. • El numero de enlace puede modificarse s6lo con la rotura y la formaci6n de enlaces en el DNA.

Rl.l

1DB

DB

Las topoisomerasas relajan o introducen superhelices en el DNA • Las topoisomerasas cambian el numero de enlace cuando rompen enlaces en el DNA, modifican la conformaci6n de la doble helice en el espacio y vuelven a formar los enlaces. • Las enzimas de tipo I actuan al romper una cadena unica de DNA; las de tipo II causan roturas de dos cadenas. Las topoisomerasas rompen y resellan cadenas • Las topoisomerasas de tipo I actuan al formar un enlace covalente con uno de los extremos rotos, mover una cadena alrededor de la otra y, despues, transferir el extrema de enlace al otro extrema roto. Los enlaces se conservan y, en consecuencia, no se requiere aporte de energia.

La recombinacion especializada involucra sitios espedficos • La recombinaci6n especializada comprende una reacci6n entre sitios especificos que no tienen que ser hom6logos. • El fago 'A se integra al cromosoma bacteriano por recombinaci6n entre un sitio del fago y el sitio att en el cromosoma de E. coli. • El fago se escinde del cromosoma por recombinaci6n entre los sitios en el extrema del profago lineal. • El gen int del fago /, codifica una integrasa que cataliza la reacci6n de integraci6n.

DllfJ La recombinacion espedfica de sitio comprende rotura y reunion • Se hacen escisiones a intervalos de 7 bp en los genes attB y attP y los extremos se unen en forma cruzada.

BEl

La recombinacion espedfica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa • Las integrasas tienen relaci6n con las topoisomerasas y la reacci6n de recombinaci6n se parece a la acci6n de la topoisomerasa, excepto que las cadenas con hendidura de estructuras duplex d1jerentes se sellan juntas. • La reacci6n conserva la energia al utilizar una tirosina catalitica en la enzima para romper un enlace fosfodiester y enlazarse con el extrema 3' roto. • Dos unidades enzimaticas se unen a cada sitio de recombinaci6n y los dos dimeros hacen sinapsis para formar un complejo donde ocurren las reacciones de transferencia.

mR1iJ

La recombinacion 'A ocurre en un intasoma • La integraci6n ), tiene lugar en un gran complejo que tambien incluye a la proteina IHF del hospedador. • La reacci6n de escisi6n requiere Int y Xis y reconoce los extremos de DNA del profago como sustratos.

458

CAPITULO 19 Recombinaci6n hom6loga y espec\fica de sitio

Las levaduras pueden cambiar loci silentes activos par el tipo de apareamiento

y

• Ellocus MAT del tipo de apareamiento en levaduras porta el genotipo MATa o MATa. • Las levaduras con el alelo dominante HO cambian su tipo de apareamiento con una frecuencia de -10- 6 • • El alelo en MAT se denomina cartucho activo. • Hay tam bien dos cartuchos silentes, HMLa y HMRa. • Ocurre cambia si MATa es sustituido por HMLa o MATer. es sustituido por HMRa.

Dlil

Ellocus MAT codifica prote\nas reguladoras • En celulas haploides de tipo a, MATa activa los genes requeridos para especificar las funciones a indispensables para el apareamiento y desactiva los requeridos para el tipo de apareamiento a. • En las celulas de tipo a nose requiere MATa. • En celulas diploides, los productos de al y a2 cooperan para reprimir genes especificos de celulas haploides.

01!:1

Se reprimen los cartuchos silentes en HML y HMR • Los elementos silenciadores reprimen HML y HMR • Los loci requeridos para mantener el silenciamiento incluyen SIRl-4, RAPl y los genes de la histona H4. • Se necesita la union de ORC (complejo de reconocimiento del origen) a los silenciadores para la desactivaci6n.

La girasa funciona par la inversion de helice • La girasa de E. coli es una topoisomerasa de tipo II que utiliza la hidr6lisis de ATP para proveer la energia necesaria a fin de introducir superhelices negativas en el DNA.

IDI!I

If&)

lmJ

Ellocus MAT receptor inicia la transposicion unidireccional • El cambia del tipo de apareamiento se inicia por una rotura de la doble cadena hecha en ellocus MAT por !: endonucleasa HO.

0D

La regulacion de la expresion de HO controla el cambia • La endonucleasa HO se sintetiza en celulas madre haploides, de manera que un episodio de cambia hacE que ambas cadenas hijas tengan el nuevo tipo de apareamiento.

BiliJ

Resumen

Introducci6n evolucion no podrfa haber ocurrido sin recom: :n acion genetica. Sino fuese posible intercambiar =:aterial entre los cromosomas (homologos), el con·=nido de cada cromosoma individual estarfa fijo ::e manera irrecuperable en sus alelos particulares. = ando se presentasen mutaciones no serfa posible ~ :>parar los cambios favorables y desfavorables. La ;>ngitud de Ia diana para el dafi.o por mutacion au=- entarfa de manera eficaz desde el gen hasta el cro~ osoma. Al final, un cromosoma acumularfa tantas =::~ utaciones deletereas que dejarfa de funcionar. Por Ia mezcla de los genes, !a recombinacion __ rmite separar mutaciones favorables y desfavo_-!!bles y probarlas como unidades individuales en ::1uevos ensamblajes. Constituye un medio de es:ape y dispersion de alelos favorables y pretende :'lirninar un alelo desfavorable sin afectar a todos _ s demas genes con los que esta vinculado. Esta es .a base de la seleccion natural. La recombinacion tiene Iugar entre secuencias :'D correspondencia precisa, de manera que no se 3grega o pierde un par de bases de los cromosomas ::ecombinantes. Tres tipos de recombinacion com- anen Ia caracterfstica de que el proceso comprende ::."Ltercambio ffsico de material entre DNA duplex: • La recombinacion que comprende una reaccion entre secuencias homologas de DNA se de nomina recombinaci6n hom6loga o generalizada. En las eucariotas se presenta en Ia meiosis, por lo general tanto en machos (durante Ia espermatogenesis) como en hem bras (durante la oogenesis). Hay que recordar que sucede en Ia etapa de "cuatro cadenas" de Ia meiosis y afecta solo a dos de las cuatro (vease seccion 2.7, Ocurre recombinaci6n por intercambio ffsico de DNA). • Otro tipo de suceso apoya Ia recombinaci6n entre pares espedficos de secuencias, descrito por primera vez entre eucariotas donde la recombinaci6n especializada, tambien conocida como recombinaci6n especifica de ciclo, se encarga de la integraci6n de genomas de fago al cromosoma bacteriano. El episodio de recombinacion comprende secuencias espedficas del DNA del fago y el bacteriano, que incluyen un segmento corto con homologfa. Las enzimas participantes en el suceso actuan solo en el par de secuencias diana particular en una reaccion intermolecular. Algunas reacciones intramoleculares relacionadas se encargan de regenerar dos cromosomas circulares monomericos durante Ia division bacteriana, cuando se genero _.a

un dfmero por recombinacion generalizada. Esta ultima clase tambien incluye episodios de recombinaci6n que invierten regiones especfficas del cromosoma bacteriano. • Un tipo diferente de suceso permite insertar una secuencia del DNA en otra sin depender de la homologia de secuencia. La transposici6n constituye un medio por el que ciertos elementos pasan de una localizaci6n cromos6rnica a otra. Los mecanismos involucrados en Ia transposici6n dependen de la rotura y reunion de cadenas de DNA y, por tanto, se relacionan con el proceso de recombinaci6n (vease el Capitulo 21 , Transposones, y Capitulo 22, Retrovirus y retroposones). • En circunstancias especiales, se utiliza la reestructuracion genica para controlar la expresi6n, que puede crear nuevas genes indispensables para Ia expresion en circunstancias particulares, como en el caso de las inmunoglobulinas. La reestructuraci6n puede tambien encargarse de cambiar Ia expresi6n de un gen preexistente en otro, como en el ejemplo del tipo de apareamiento de las levaduras, donde Ia secuencia en un locus activo puede ser sustituida por una secuencia de un locus silente. Ambos tipos de reestructuracion comparten similitudes mecanicas con Ia transposici6n; de hecho, se pueden considerar como casos de transposici6n dirigidos de manera especial. • Los virus RNA utilizan otro tipo de recombinaci6n, donde Ia polimerasa cambia de un molde a otro mientras sintetiza RNA. Como resultado, Ia molecula recien sintetizada conjunta informacion de secuencias de dos progenitores diferentes. Ese tipo de mecanismo de recombinacion se llama selecci6n de copias y se aborda de manera sucinta en Ia seccion 22 .4, El DNA virico es generado por transcripcion inversa. Considerense Ia naturaleza y las consecuencias de las reacciones de recombinacion generalizada y especializada. En Ia ' se ilustra que la recombinaci6n generalizada tiene Iugar entre dos cadenas duplex de DNA hom6logas y puede presentarse en cualquier punto de su longitud. Los dos cromosomas se cortan en sitios equivalentes y, despues, cada uno se une al otro para generar recombinantes redprocos. El entrecruzamiento (marcado por la X) es el sitio donde una cadena se une a Ia otra . No cambia la organizacion global del DNA; los productos tienen la misma estructura que sus predecesores y tanto progenitores como productos son hom6logos. 19.1 Introducci6n

459

Lugar1

I \

o co

Lugar2

Se puede usar la recombinaci6n especifica =-:c sitio para generar dos circulos monomericos a partir de _· circulo dimerico.

Lugar3

r-- '

Puede ocurrir recombinaci6n generalizada en cualquier punta de las longitudes de dos DNA hom6logos.

La recombinacion especializada ocurre solo ctre sitios especfficos. Los resultados dependen de !=. localizaciones de los dos sitios de recombinacion. Ela se muestra que una recombinaci -intermolecular entre un DNA circular y uno line:o inserta al primero en el segundo. En la />. • se muestra que una recombinacion intramolecul-entre dos sitios de un DNA circular libera dos DKcirculares, mas pequeiios. La recombinaci6n especializada se usa a menudo para hacer cambios corr. estos en la organizacion del DNA. El cambia en :: organizacion es una consecuencia de las localizacic nes de los sitios recombinantes. Se cuenta con ur.c gran cantidad de informacion acerca de las enzima que realizanla recombinacion especializada y tier:;: relacion con las topoisomerasas, que cambian el s~,; perenrollamiento del DNA en el espacio.

DB

Ocurre recombinaci6n hom6loga entre cromosomas . . en smaps1s

Conceptos principales • Los cromosomas deben entrar en sinapsis (aparearse) para formar quiasmas, donde tiene lugar el entrecruzamiento. • Se pueden correlacionar las etapas de la meiosis con los sucesos moleculares que ocurren en el DNA.

Ocurre recombinaci6n especifica de sitio entre dos secuencias especificas (identificadas en color verde). Las otras secuencias en los dos DNA recombinantes no son hom6logas.

460

CAPITULO 19 Recombinaci6n hom6loga y especifica de sitio

La recombinacion homologa es una reaccion entre dos cadenas duplex de DNA. Su caracteristica determinante es que las enzimas encargadas pueden us a~ cualquier par de secuencias hom6logas como sus-

::-ato (aunque algunos tipos de secuencia tal vez se ~an favorecidos con respecto a otros) . La frecuen.:::a de recombinacion no es constante en todo el ~ " noma, pero influyen en ella los efectos globales y . : ales . La frecuencia global puede ser diferente en · citos y espermatozoides; la recombinacion ocurre :on el doble de frecuencia en mujeres y varones. =: entro del genoma, su frecuencia depende de Ia -: ·tructura cromosomica; por ejemplo, el entrecru3 miento se suprime en Ia vecindad de las regiones : ndensada e inactiva de la heterocromatina. Ocurre recombinaci6n durante la prolongada .: ~ofase de Ia meiosis. En Ia se com para :: progreso visible de los cromosomas por las cinco ::apas de la profase mei6tica con las interacciones ::wleculares comprendidas en el intercambio de aterial entre cadenas duplex de DNA. El inicio de la meiosis lo marca el sitio donde los =omosomas individuales se vuelven visibles. Cada ~no de estos cromosomas se replico antes y consta .:e dos cromatidas hermanas, cada una con una ca~e na duplex de DNA. Los cromosomas hom6logos :t> acercan entre sf, empiezan a aparearse en una o ::-~ as regiones y forman bivalentes. El apareamien: J se extiende hasta que toda la longitud de cada :::omosoma esta en aposicion con su hom61ogo. El : roceso se denomina sinapsis o apareamiento :romos6mico. Cuando concluye el proceso, los :::omosomas tienen relaci6n lateral en forma de un :omplejo sinaptonemico, el cual tiene una es::uctura caracteristica en cada especie, si bien varian _ ucho los detalles entre las especies. La recombinaci6n entre cromosomas compren.:e un intercambio ffsico de las partes, por lo general :"presentado como rotura y reuni6n, donde dos :::omatidas no hermanas (cada una con una cadena _uplex de DNA) han sido rotas y despues unidas : ntre si. Cuando los cromosomas empiezan a sepa: 3.rse, se puede observar que se mantienen unidos : :1 sitios bien definidos llamados quiasmas. El nl!::1ero y Ia distribucion de los quiasmas simulan las .:aracterfsticas del entrecruzamiento genetico. En el '-llalisis usual se afirma que un quiasma representa :I proceso de entrecruzamiento ( 1 ) . Los ~uiasmas se mantienen visibles cuando los cromo- masse condensan y las cuatro cromatidas se ha:en evidentes. (.Cual es la base molecular de estos sucesos? :ada cromatida hermana contiene una sola cadena ~e DNA duplex, de modo que cada bivalente cons:.3 de cuatro moleculas duplex de DNA. La recom: :naci6n requiere un mecanismo que permita a la ::adena duplex de DNA de una cromatida hermana :nteractuar con Ia correspondiente de su contrapar- ~ en el otro cromosoma. Debe ser posible que esta

Los cromosomas leptotene condensados se tornan visibles, a menudo unidos a Ia envoltura nuclear

~~

~

~

/Q ~ ~

Cigoteno Los cromosomas inician el 1 apareamiento en una o varias reg ioneJ l1m1tadas \

fi\f \..'i\fAJi\.1'/ Gada cromosoma \.f;\..fi\.£\.t;,Ji\.1,' se ha replicado y consta de dos "\Do.:.U\0\;0\0\:// cromatidas ~J\;J'J\U hermanas. \.Li\.t':\..f:1 r\.1/\// lniciaci6n

fi\..Fi\.1:\f/ /At~ ~/

Paquiteno El complejo sinaptonemico se ( extiende por toda Ia longitud de los cromosomas apareados Dlploteno

~

;~~ac:~~~~~~as se ~ h ~ permanecen juntos

en los qUiasmas

® / ~

Diacinesis Los cromosomas se condensan , se desprenden de Ia envoltura; los

qc<'"m'" '"'"'" ( Las cuatro cromatides se torn an visibles

~

"'--

~

'.\.~ (\.'i\l;\..'-" Aesoluci6n \.C\. 1 \.f;\..fA(,\f "

La recombinaci6n tiene lugar durante la primera profase de la meiosis. Las etapas de la profase se definen par el aspecto de los cromosomas, cada uno constituido par dos replicas (cromatidas hermanas), ~i bien el estado duplicado se hace visible s6lo al final. Las interacciones moleculares en cualquier episodic de entrecruzamiento individual comprenden dos de los cuatro DNA duplex.

reacci6n ocurra entre cualquier par de secuencias correspondientes de las dos moleculas en una forma muy espedfica, que perrnita el intercambio de material con precision en el ambito de pares de bases individuales. Se sa be de solo un mecanismo para que los acidos nucleicos se reconozcan entre sf con base en la secuencia: la complementariedad entre cadenas unicas . La Figura 19.5 muestra un modelo general de la participacion de cadenas unicas en la recombinaci6n. El primer paso para la provision de cadenas l!nicas es hacer una rotura en cada cadena duplex del DNA. Una o ambas de ese par de cadenas pueden entonces liberarse . Si (al menos) una cadena desplaza ala correspondiente en el otro par, las dos moleculas dtiplex se conectaran de manera especffica en secuencias correspondientes. Si el inter-

19.2 Ocurren recombinaciones hom6logas entre cromosomas en sinapsis

461

1111 Moleculas de DNA progenitoras

Rotura y reunion afectan el DNA heteroduplex

Conceptos principales • El suceso clave de la recombinaci6n entre dos moleculas de DNA duplex es el intercambio de cadenas unicas.

Productos intermedios de Ia recombinaci6n

• Cuando una sola cadena de una estructura duplex desplaza a su contraparte en la otra, crea una estructura ramificada. • El intercambio genera un segmento de DNA heteroduplex, constituida par una cadena de carlia progenitor. • Se necesitan dos intercambios (reciprocos) para generar una molecula articulada.

Recombinantes

• La molecula articulada se resuelve en dos molecu(as duplex independientes mediante una hendidura en dos de las cadenas que se conectan. • El que se fo rmen recombinantes depende de que las cadenas participantes en el intercambio original, o el otro par, presenten hendiduras durante la resoluci6n.

La recombinaci6n implica apareamiento entre cadenas complementarias de los dos DNA progenitores.

cambia de cadenas se extiende, puede haber una conexion mas amplia entre las cadenas duplex. Si se intercambian ambas cadenas y luego se conan, es posible conectar las moleculas duplex progenitoras mediante el entrecruzamiento que corresponda a las demandas de una rotura y reunion. No se pueden correlacionar de manera rigurosa estos sucesos moleculares en tal union con los cambios que se observan en el ambito de los cromosomas. No hay informacion detallada acerca de los sucesos moleculares involucrados en Ia recombina cion en celulas eucarioticas superiores (en las que se ha observado mas de cerca Ia meiosis) . En fecha reciente, no obstante, el aislamiento de mutantes en las levaduras ha permitido correlacionar algunos de los pasos moleculares con etapas aproximadas de Ia meiosis. Se dispone de informacion detallada del proceso de recombinacion en las bacterias, donde se sabe que las actividades moleculares pueden causar intercambio genetico entre moleculas duplex. Sin embargo, Ia reaccion bacteriana comprende una interaccion entre las regiones restringidas del genoma, mas que un apareamiento fntegro de los genomas. La sinapsis de los cromosomas eucarioticos sigue siendo la etapa mas diffcil de explicar en el ambito molecular. 462

CAPITULO 19 Recombinaci6n hom6loga y especlfica de sitio

El acto de conectar dos moleculas duplex de DR-_ es el meollo del proceso de recombinacion. El analisis molecular de Ia recombinacion, por tanto, sinicia con la expansion del concepto del uso de. apareamiento de bases entre cadenas unicas complementarias. Es conveniente imaginar Ia reaccior.. de recombinacion en terminos de intercambios de una sola cadena (aunque se vera que en Ia realida no tiene que ser asf como se inicia), debido a que las propiedades de las moleculas creadas en esa forma son medulares para comprender los procesos involucrados en Ia recombinacion. En Ia se ilustra un proceso que se inicia con Ia rotura de los puntas correspondiente de dos cadenas homologas de DNA apareadas. La rotura permite el movimiento de los extremos libres creados por las hendiduras. Cada cadena deja a su contraparte y se cruza para aparearse con su com plemento en la otra cadena duplex. El intercambio recfproco crea una conexior_ entre las dos cadenas duplex de DNA. El par de cadenas duplex conectado se llama molecula articulada. El sitio donde una cadena individual de DNA se cruza de una cadena duplex a Ia otra se llama articulacion recombinante. En el sitio de recombinacion, cada cadena duplex tiene una region constituida por una eadem: de cada una de las moleculas de DNA progenitoras. region que se denomina DNA hfbrido o DNA heterodttplex. Una caracterfstica importante de una articula cion recombinante es su capacidad de desplazarse

Los DNA duplex se aparean

Las cadenas

hom61ogas son asiento de hendiduras Las cadenas rotas se intercambian entre las duplex El punta de entrecruzamiento .....,~:~:::=~~;:; se desplaza por migraci6n de ram a Se sellan las hendiduras

lt

Puede ocurrir migraci6n de ramas en cualquier direcci6n cuando una cadena no apareada desplaza a una apareada.

Los genomas no son recombinantes , pero contienen una region hetero·juplex

Se generan genomas recombinantes recfprocos ~U La recombinaci6n entre dos DNA duplex aparea::ls podr1a comprender el intercambio rec1proco de una sola :-~d ena, migraci6n de ramas y hendiduras.

-l()r la cadena duplex. Esta movilidad se denomina .:nigracion de rama. En la se ilustra Ia ;:::Jigracion de una cadena unica en una duplex. El ; ~mto de ramificacion puede emigrar en cualquier .:.! reccion a medida que una cadena desplaza a la ira. La migracion de rama es importante por mo..::vos teoricos y practicos. A manera de principia, ~o nfiere una propiedad dinamica a las estructuras ~e c ombinantes. Como caracteristica practica, su =xistencia indica que no puede establecerse el punto _e ramificacion con el examen de una molecula in .;cro (porque la rama podria haber emigrado desde .::ue se aislo la molecula).

La migraci6n de rama podria permitir que el punto de entrecruzamiento en el intermedio de la recombinacion se mueva en cualquier direccion. La velocidad de migraci6n es incierta pero, como se observa in vitro, tal vez sea insuficiente para respaldar la formacion de regiones extensas de DNA heteroduplex en condiciones naturales. Cualquier migracion extensa de rama in vivo debe, por tanto, ser catalizada por una enzima de recombinacion. La molecula articulada formada por el intercambia de cadenas debe resolverse en dos moleculas duplex separadas. La reso1ucion requiere un par de hendiduras mas. Se puede visualizar el resultado con la mayor facilidad si se observa Ia molecula articulada en un plano como la union Holliday, la se ilustra en la , y que representa la estructura de Ia Figura 19.6 con una cadena duplex girada con relacion a la otra. El resultado de Ia reaccion depende de que par de cadenas tiene la hendidura. Si se hacen las hendiduras en el par de cadenas que en un principio no las tenian (el par que no inicio el intercambio de cadenas), las cuatro cadenas originales habran sido motivo de hendidura. Esto libera moleculas de DNA recombinantes con empaJme . La cadena de DNA duplex de un progenitor se enlaza de manera covalente a Ia del otro mediante un segmento de DNA heteroduplex. Ha habido un episodio de recombinaci6n convtencional entre marcadores localizados a cada !ado de Ia region heteroduplex . 19.3 Rotura y reunion afectan el DNA heterodCtplex

463

1 La rotaci6n muestra Ia t estructura de Ia union Holliday

cia es bastante mas larga que los -10 bp requeridos para el vinculo entre regiones complementarias de cadena unica, lo que sugiere que Ia recombinacion impone demandas que rebasan Ia hibridaci6n de las complementarias como tales.

1111

Las roturas de la doble cadena inician la recombinaci6n

Conceptos principales • La recombinacion se inicia con una rotura de la doble cadena en una cadena de DNA duplex (receptora).

~ Las hendiduras en otras cadenas liberan recombinantes de escisi6n

Las hendiduras controlan los resultados Las hendiduras en las mismas cadenas liberan recombinantes en parches

La resolucion de una union Holliday puede generar cadenas duplex progenitoras o recombinantes, dependiendo de cuales sean asiento de una hendidura . Ambos tipos de producto tienen una region de DNA heteroduplex.

Si las mismas dos cadenas involucradas en las hendiduras originales son objeto de hendiduras otra vez, las dos cadenas adicionales se mantienen intactas. las hendiduras liberan las cadenas duplex progenitoras originales, que se mantienen intactas, con excepcion de que cada una tiene un residua del suceso en forma de una longitud de DNA heteroduplex. A estas estructuras se les denomina recombinantes en parche. Estas resoluciones alternativas de Ia molecula articulada establecen el principia de que un intercambia de cadenas entre DNA duplex siempre deja una region de DNA heteroduplex como residua, pero el intercambia no siempre se acompm1a de la recombinaci6n de las regiones en los flancos. (. Cual es Ia longitud minima de Ia region indispensable para establecer Ia conexion entre las cadenas duplex recombinantes? Los experimentos en los que se introdujeron secuencias homologas cortas de plasmidos o fagos en bacterias sugieren que la tasa de recombinacion es sustancialmente menor si la region homologa es <75 bp. Esta distan464

CAPITULO 19 Recombinacion homologa y especlfica de sitio

• La actividad de la exonucleasa genera extremos 3' de cadena unica que invaden la otra cadena duplex ( donadora). • La sintesis nueva de DNA sustituye el material que ha sido degradado. • Esto genera una molecula de articulacion recombinante donde las dos cadenas de DNA duplex estan conectadas por DNA heteroduplex.

El modelo general de la Figura 19.4 muestra qu se puede hacer una rotura en una cadena duplex c. fin de generar un sitio a partir del cual se puedar_ desenrollar cadenas unicas que participen en el intercambio genico. Ambas cadenas de una estructurc. duplex deben romperse para lograr un intercambi genico . La Figura 19.6 muestra el modelo dond e ocurren roturas sucesivas individuales en cadena5 unicas . El intercambio genico, sin embargo, se inicic. en realidad por una rotura de la doble cadena (double-strand break, DSB) . El modelo se ilustra er: Ia .J La recombinacion la inicia una endonuclease que escinde una de las cadenas duplex del DNA progenitor, "receptor". El corte crece basta tornar se en una brecha por Ia accion de Ia exonucleasa_ La exonucleasa corta una cadena a cada !ado de !2. rotura y genera extremos 3' de una sola cadenc._ Uno de los extremos 3' libres invade entonces m E region homologa en Ia otra cadena duplex de DNr_ ("donador"), lo que se denomina invasion por unc. cadena unica. La formacion de DNA heteroduple:;: genera una h elice D, donde se desplaza una cadenc. duplex del DNA donador. El helice D se extiendt por la sintesis del DNA de reparacion, utilizando e_ extrema 3' libre como molde para generar DNA dedoble cadena. En un m omenta dado, el helice D alcanza e ~ tamaflo suficiente para corresponder a la longiruc total de Ia brecha en Ia cromatida receptora. Cuand, Ja Cadena unica expuJsada alcanza eJ !ado distar: te de Ia brecha, las secuencias complementarias de una sola cadena se hibridan. Ahora hay un DN_~_

heteroduplex a cada lado de Ia brecha y esta esta ~epresentada por el helice D de una sola cadena . La integridad duplex de Ia region con brecha se puede restablecer con la sfntesis de reparacion ·1tilizando el extrema 3' en el !ado izquierdo de la brecha como cebador. En formal global, la brecha ha sido reparada por dos rondas individuales de sfntesis de cadenas (micas de DNA . La migracion de ramas convierte esta estructura en una molecula con dos articulaciones recombinantes que deben resolverse por corte. Si ambas articulaciones se resuelven en la mis:na forma, se liberaran las moleculas originales sin entrecruzamientos, cada una con una region de informacion genetica alterada que es vestigia del episodio de intercambio. Si las dos articulaciones se resuelven en formas contrarias tiene Iugar un entrecruzamiento genico. La estructura de Ia molecula con dos articulaciones antes de su resolucion ilustra una diferencia determinante entre el modelo de rotura de doble cadena y aquellos que comprenden solo intercambios de una cadena. • Despues de Ia rotura de Ia doble cadena se ha formado DNA heteroduplex en cada extrema de la region que interviene en el intercambio. Entre los dos segmentos heteroduplex se encuentra Ia region correspondiente a Ia brecha que ahora tiene Ia secuencia del DNA donador en ambas moleculas (Figura 19 .9). Asi, la estructura de las secuencias heteroduplex es asimetrica y parte de una molecula se ha convertido a la secuencia de Ia otra (motivo por el que Ia cromatida de inicio se llama receptora) . • Despues del intercambio recfproco de una sola cadena, cada DNA duplex tiene material heteroduplex que cubre la region desde su sitio inicial de intercambio hasta Ia rama emigrante (Figura 19.6). En variantes del modelo de intercambio de una sola cadena, donde el DNA se degrada y resinteti za, Ia cromatida de in.icio es la donadora de informacion genetica. El modelo de rotura de doble cadena no clisminuye la importancia de la formacion del DNA heteroduplex, que sigue siendo el unico metoda posible por el que dos moleculas duplex pueden interactuar. . o obstante, cambiar Ia responsabilidad de iniciar Ia recombinacion de roturas de cadena unica a las de cadena doble influye en Ia manera de percibir Ia capacidad de Ia celula de actuar sobre el DNA. La participacion de las roturas de doble cadena al principia parece sorprendente. Una vez que se ha hecho una rotura a traves de una molecula del DNA no hay retorno . Comparense los sucesos de

Rotura de doble cadena hecha en el receptor

La rotura crece hasta formar una brecha con extremos 3' El extremo 3' migra a otra cadena duplex

11111111111111 !Ill~ Helice D

La sfntesis desde el extrema 3' desplaza a una cadena en Ia brecha La cadena desplazada migra a otra cadena duplex

donadora La migraci6n recfproca genera un doble entrecruzamiento

~::::::~

La recombinaci6n se inicia con la rotura de una doble cadena, seguida de la formaci6n de extremos 3' de una sola cadena, uno de los cuales emigra a una cadena duplex hom6loga.

las Figuras l 9. 6 y l 9. 9. En ningun pun to conlleva perdida de informacion el modelo de intercambio de una sola cadena. No obstante, en el modelo de rotura de doble cadena, la escision inicial es seguida de inmediato por perdida de Ia informacion. Cualquier error en Ia recuperacion de la informacion podrfa ser leta!. Por otro lado, Ia capacidad misma de recuperar la informacion perdida por resfntesis a partir de otra cadena duplex constituye una red importante de seguridad para Ia celula.

111

Los cromosomas en recom bi naci6n se conectan

por el complejo sinaptonemico Conceptos principales • Durante la primera parte de la meiosis, los cromosomas hom6logos se aparean en el complejo sinaptonemico. • La masa de cromatina de cada cromosoma hom6logo esta separada de la otra por un complejo proteinaceo.

Una paradoja basica en Ia recombinacion es que los cromosomas progenitores nunca parecen tener un o bastante cercano para que ocurra la recombinacion del DNA. Los cromosomas entran a Ia meiosis en forma de pares replicados (cromatidas

19.5 Los cromosomas en recombinaci6n se conectan por el complejo sinaptonemico

465

El complejo sinaptonemico ubica a los cromosomas en yuxtaposici6n. Reproducida de D. vo n Wettstein. 1971. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA. 68: 851-855. Fotografta po r cortesia de D. vo n Wettstein, Washington State University.

•

I

1,..

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•

Helice de DNA duplex mas protefnas \

Eje de _... cohesmas

Las protelnas zip conectan pares _... hom61ogos

QQQOOQQQO.ODQ .. · · ·

}

Cromatidas herman as

Elemento lateral Elemento central Elemento lateral

Cada par de cromatidas hermanas tiene un eje formado por cohesinas. Las helices de la cromatina se proyectan desde el eje. El complejo sinaptonemico se forma con el enlace de los ejes a traves de proteinas zip.

hermanas) , visibl es como masa de cromatina. Se aparean para formar el complejo sinaptonemico y se ha supuesto durante muchos afios que ello representa alguna etapa involucrada en Ia recombinaci6n, tal vez un preambulo necesario para el intercambio de DNA. El pun to de vista mas reciente es que el complejo sinaptonemico es una consecuencia mas que una causa de la recombinaci6n, pero a{m se tiene que definir como Ia estructura del complejo sinaptonemico se relaciona con los os entre moleculas de DNA. La sinapsis se inicia cuando cada cromosoma (par de cromatidas hermanas) se condensa alrededor de una estructura llamada e lemento axial ,

466

CAPiTULO 19 Recombinaci6n hom6loga y especifica de sitio

que a! parecer es proteinaceo. A continuaci6n, se alinean los elementos axiales de cromosomas correspondientes y se forma el complejo sinaptonemico como estructura tripartita, donde los elementos axiales, ahora llamados elementos laterales, estill: separados entre sf por un demento central. En Ia se muestra un ejemplo. En esta etapa cada cromosoma parece una masa de cromatina unida limitada por un elemento lateral. Los dos elementos laterales estan separados entre sf por un elemento central fino, pero denso. El triplete de cadenas densas paralelas yace en un solo plano que se encorva y gira sobre su eje. La distancia entre los cromosomas hom6logos es con siderable en terminos moleculares, de mas de 20 ( nm (el diametro del DNA es de 2 nm). Asf, ur. problema importante para comprender Ia participaci6n del complejo es qu e si bien alinea cromosoma~ hom6logos, esta bastante lejos deponer en moleculas hom6logas de DNA. El unico vinculo visible entre los dos !ados de: complejo sinaptonemico lo constituyen estructura ~ esfericas o cilindricas que se observan en hongo: e ins ectos. Yacen a naves del complejo y se denominan n odos o n6dulos de recombinaci6n; se presentan con Ia misma frecuencia y distribuci6 ~ que los quiasmas. Su nombre refleja la esperanzc. de que pudiesen demostrar que son los sitios de Ia recombinaci6n. A partir de mutaciones que afectan la formacion del complejo sinaptonemico se pueden relacionar los tipos de protefnas que participan en st: estructura. En Ia I 1 ... se ilustra una vista molecular del complejo sinaptonemico. Sus caracterfsticas estructurales distintivas se deben a do-:. grupos de proteinas: • Las cohesinas forman un solo eje lineal pa re. cada par de cromatidas hermanas des dedonde se extienden helices de cromatina Esto equivale al elemento lateral de la Figura 19.1 0. (Las cohesinas pertenecen au::grupo general de proteinas que interviene:-. en Ia conexi6n de cromatidas hermanas, de modo que se segreguen en forma apropiadc. en Ia mitosis de la meiosis.) • Los elementos laterales se conectan mediante filamentos transversos que equivalen a.. elemento central de la Figura 19.1 0, constjtuidos por protefnas Zip. Las mutaciones en las protefnas necesarias pa r· que se formen los elementos laterales se encuentrar:. en los gene s que codifican las cohesinas. Las cohesinas que se utilizan en Ia meiosis incluyen Smc3:(que tambien se utiliza en Ia mitosis) y Rec8p (que es especffica de la meiosis y se relaciona con la cohesina mit6tica Scc1p). Las cobesinas parecen unir t:

a sitios especfficos a lo largo de los cromosomas du~a nte Ia mitosis y la meiosis. Es probable que tengan :ma participacion estructural en la segregacion de :os cromosomas. En Ia meiosis. a veces se requiere :a formacion de elementos laterales para las etapas :nas avanzadas de Ia recombinacion, porque si bien estas mutaciones no impiden la formacion de ro:uras de doble cadena, bloquean la formacion de :ecombinantes. La mutacion zip l permite que se formen y ali~e en los elementos laterales, pero no que presenten inapsis estrecha. El dominio terminal N de Ia pro·efna Zipl se localiza en el elemento centraL pero el dominio terminal C se localiza en los elementos :aterales. Otras dos protefnas, Zip2 y Zip3. tambien se ubican con Zip 1. El grupo de protefnas Zip forma fi lamentos transversos que conectan los elementos laterales de los pares de cromatidas hermanas.

Ill

El com plejo sinaptonemico se forma despues de roturas de doble cadena

Escisi6n reversible

5'

5' Disociaci6n del complejo

5'..Q\J Retiro de Spo11 seguido por ataque de nucleasa

~

5'/A~ 3'3'

5'

La Spol1 se une en forma covalente a los extremos 5' de las roturas de cadena doble.

Conceptos principales • Las roturas de la doble cadena que inician la recombinaci6n ocurren antes de que se forme el complejo sinaptonemico. • Si se bloquea la recombinaci6n, el complejo sinaptonemico no puede formarse.

Hay pruebas solidas e n levadura s de que las roturas de la doble cadena inician la recombinacion tanto en la forma homologa como en la especffica de sitio. En un inicio se penso que las roturas de la doble cadena tenfan que ver con el cambio del tipo de apareamiento. que comprende Ia sustitucion de una secuencia por otra (vease Ia se ccion 19.23, La transposicion unidireccional es iniciada por el locus MAT receptor). Tambien ocurren roturas de doble cadena en las primeras etapas de Ia meiosis, en sitios que constituyen puntos calientes (puntos de referencia) para Ia recombinacion. Sus localizaciones no son especfficas de secuencia. Tienden a presentarse en regiones promotoras y, en generaL a coincidir con regiones mas accesibles de Ia cro matina. La frecuencia de recombinacion desciende en un gradiente a uno o ambo s !ados del punto caliente. El punta caliente identifica el sitio donde se inicia Ia recombinacion y el gradiente refleja Ia probabilidad de que se puedan esparcir los sucesos de la recornbinacion a partir de eJ. Ahora se puede interpretar Ia participacion de las roturas de doble cadena en terminos moleculares. Los extremos rornos creados por la rotura de

Ia doble cadena se convierten con rapidez a ambos !ados en extrem os 3' largos de cadenas (micas. como se muestra en el rnodelo de Ia Figura 19.9. Una mu tacion de las levaduras (rad50 ) que bloquea Ia conversion del extremo de fluj o en una protrusion de una sola cadena tiene defectos en Ia recornbinacion. Esto sugiere que las roturas de doble cadena son indispensables para Ia recombinacion. El gradiente esta deterrninado por Ia proba bilidad cada vez menor de que se genere una region de una sola cadena a medida que aumenta la distancia con el sitio de Ia rotura de la doble cadena . En los mutantes rad50, los extremos 5' de las roturas de la doble cadena se conectan con Ia protefna Spo ll. que es homologa de las subunidades catalfticas de una familia de topoisomerasas de tipo II. Esto su giere que Spoll tal vez sea una enzima similar a Ia topoisomerasa que genera roturas de Ia doble cadena. En Ia _ se muestra el modelo de esta reaccion que sugiere que Spo ll interactua de manera reversible con el DNA; Ia rotura se convierte en una estructura permanente por la interaccion con otra protefna que disocia el complejo Spo il. AI retiro de Spol l le sigue, entonces. la accion de Ia nucleasa. Se requieren a! menos otras nueve protefnas para procesar las roturas de Ia doble cadena. Se necesita un grupo de protefnas para convertir Ia rotura de la doble cadena en extremos 3'-OH protruyentes de una sola cadena . Lu ego, otro grupo permite que los extremos de una cadena unica invadan el DNA duplex homologo.

19.6 El complejo sinaptonemico se forma despues de roturas de doble cadena

467

Productos sin Moleculas entrecruzamiento recombinantes

Sucesos moleculares Tiempo (minutos)

...... ......

t t

Roturas de doble cadena Moleculas articuladas DesapaAparecen recen Persisten

Sucesos citol6gicostTermina Ia Se forman Se forman los Se disocian los~ replicaci6n elementos complejos complejos axiales sinaptonemicos sinaptonemico del DNA Etapa de Ia meiosis

Leptoteno

Cigoteno

Paquiteno

Diploteno

Las roturas de cadena doble aparecen cuando se forman y desaparecen elementos axiales durante la expansion de los complejos sinaptonemicos. Aparecen moleculas articuladas y persisten hasta que se detectan recombinantes de DNA en el extrema del paquiteno.

La correlaci6n entre Ia recombinaci6n y Ia formaci6n del complejo sinaptonemico esta bien establecida y estudios recientes han demostrado que todas las mutaciones que anulan el apareamiento cromos6mico en el genero Drosophila o en levaduras tambien impiden la recombinaci6n. El sistema para generar las roturas de doble cadena que inician la recombinaci6n suele conservarse. Los hom6logos Spo ll se han identificado en varias eucariotas superiores y una mutaci6n en el gen de Drosophila bloquea toda recombinacion meiotica. Hay pocos sistemas donde es posible comparar los sucesos moleculares y citologicos en Ia recombinaci6n, pero en fecha reciente se ha avanzado en los analisis de Ia meiosis en Saccharomyces cerevisiae. En la se resume Ia sincronizacion relativa de los sucesos. Aparecen roturas de doble cadena y luego desaparecen en un periodo de 60 min. Las primeras moleculas articuladas que son intermediarias putativas de Ia recombinaci6n aparecen poco despues de que desaparecen las roturas de Ia doble cadena. La secuencia de sucesos sugiere que las roturas de la doble cadena, las reacciones individuates de apareamiento y Ia forma cion de estructuras recombinantes tienen Iugar de manera sucesiva en el mismo sitio cromosomico. Las roturas de Ia doble cadena aparecen durante el periodo en que se forman los elementos axiales y desaparecen en el momento en que los cromosomas apareados se convierten en complejos sinaptonemicos. Esta sincronizacion relativa de sucesos sugiere que Ia formaci6n del complejo sinaptonemico es resultado del inicio de !a recombinacion a traves 468


de Ia introduccion de roturas de doble cadena y ~ _ conversion en intermediarios posteriores de Ia re· combinacion. Esta idea se sustenta en Ia observ;; cion de que Ia mutante rad50 no puede conver -elementos axiales en complejos sinaptonemicos, : _ que refuta !a opinion habitual de que el compl( : sinaptonemico representa en Ia meiosis !a necesidc. de que el apareamiento cromos6mico preceda a l _ sucesos moleculares de Ia recombinacion. Ha sido cliffcil determinar si ocurre recombinc.cion en Ia etapa de Ia sinapsis, porque Ia recomb:nacion se valora por Ia aparicion de recombinant : despues de concluir Ia meiosis. No obstante, cuand _ se valora Ia aparicion de recombinantes en levad ~,;, ras, clirectamente en terminos de Ia producci6n ·c moleculas de DNA que contienen sitios de restricd6-. diagnosticos, se ha podido demostrar que los recon:. binantes aparecen al final de Ia etapa de paquiten<' Esto indica con claridad que el episodio de recon · binacion concluye despues de Ia formacion de l _ complejos sinaptonemicos. AsL el complejo sinaptonemico se forma despues de las roturas de doble cadena que inician !c. recombinacion y persiste hasta Ia formaci6n de me leculas recombinantes. No parece ser necesario pa F la recombinacion en sl, porque algunos mutante: que carecen de un complejo sinaptonemico normpueden generar recombinantes. Sin embargo, Ia.: mutaciones que suprimen Ia recombinaci6n tampoco pueden estructurar un complejo sinaptonemic Esto sugiere que el complejo sinaptonemico se fo rma como consecuencia de la recombinaci6n, de pues del apareamiento de los cromosomas, y que e: indispensable para etapas posteriores de la meiosi .

Desde que se propuso el modelo de recombi ::J.aci6n a traves de la estructura Holliday, se ha su_:mesto que la resoluci6n de esa estructura da origen a productos sin entrecruzamiento (con un segmento residual de DNA lubrido) o a entrecruzamientos (re(Ombinantes), de acuerdo con las cadenas que paricipen en Ia resoluci6n (vease Ia Figura 19.8) . Las mediciones recientes del tiempo de producci6n de moleculas cony sin entrecruzamiento, no obstante, sugieren que tal vez esto no sea cierto. Los entreruzamientos no aparecen hasta bastante despues de que aparecen por primera vez las moleculas articu ladas, en tanto la ausencia de entrecruzamientos se observa casi de manera simultanea con esas moleculas (vease la Figura 19.13). Sin embargo, si ambos tipos de productos provinieran del mismo proceso de resoluci6n, se esperaria que aparecieran al mismo tiempo. La discrepancia en Ia sincronizaci6n sugiere que los entrecruzamientos se producen como se pens6 antes, por resoluci6n de moleculas articuladas, pero que podrfa haber alguna otra via para Ia aparici6n de ausencia de entrecruzamientos.

El apareamiento y la fo rmaci6n del complejo sinaptonemico son ·i ndependientes Concepto principal • Pueden ocurrir mutaciones durante el apareamiento cromos6mico o La formaci6n del complejo sinaptonemico sin afectar el otro proceso.

Se pueden distinguir el proceso de apareamiento y el de formaci6n del complejo sinaptonemico por los efectos de dos mutaciones, cada una de las cuales bloquea uno de los procesos sin afectar el otro. La mutaci6n zip2 permite que los cromosomas se apareen, pero no que formen complejos sinaptonemicos. Asi, el reconocimiento entre hom6logos es independiente de Ia recombinaci6n o Ia formaci6n del complejo sinaptonemico. La especificidad del vinculo entre cromosomas hom6logos Ia controla el gen hop2 enS. cerevisiae. En los mutantes de hop2 se forman cantidades normales de complejos sinaptonemicos en Ia meiosis, pero los complejos individuales contienen cromosomas no hom61ogos, lo que sugiere que Ia formaci6n de complejos sinaptonemicos como tal es independiente de la homologfa (y, par tanto, no puede basarse en comparaciones extensas de secuencias de DNA) . La funci6n habitual de Hop2 es impedir Ia interaccion de cromosomas no homologos. Se forman roturas de doble cadena en los cromosomas con apareamiento erroneo en los complejos sinaptonemicos de los mutantes hop2, pero

no se reparan. Esto indica que si la formacion del complejo sinaptonemico requiere roturas de doble cadena, no necesita ninguna reaccion extensa de estas roturas con el DNA hom6logo. No se sabe lo que en general ocurre durante el paquiteno, antes de que se observen las recombinantes del DNA. Tal vez este periodo se ocupa con los pasos subsiguientes de recombinaci6n, que comprenden Ia extension del intercambio de cadenas, Ia sintesis de DNA y Ia resoluci6n. En Ia siguiente etapa de Ia meiosis (diploteno), los cromosomas desmiembran el complejo sinaptonemico; los quiasmas se hacen visibles, entonces, como puntas donde los cromosomas estan conectados. Se cree que esto indica Ia aparici6n de un intercambio genetico, pero se desconoce Ia naturaleza molecular del quiasma. Es posible que represente el residua de un intercambio concluido o Ia conexion entre cromosomas homologos donde aun no se ha resuelto un intercambio genetico. Mas adelante en Ia meiosis, los quiasmas se desplazan hacia los extremos de los cromosomas. Esta flexibilidad sugiere que representan algun residua del episodio de recombinacion mas que constituir el intermediario real. Los episodios de recombinaci6n ocurren en sitios bien definidos en los cromosomas meioticos, pero nose puede aun correlacionar su aparicion con las estructuras bien definidas que se han observado, esto es, n6dulos de recombinacion y quiasmas. Los discernimientos de las bases moleculares de Ia formaci6n de estructuras discontinuas, sin embargo, son provistos por Ia identificacion de las protefnas involucradas en Ia recombinacion de las levaduras, que pueden localizarse en sitios bien definidos. Estos incluyen MSH4 (que tiene relacion con proteinas bacterianas involucradas en Ia reparacion de apareamientos erroneos) y Dmc 1 y Rad5l (que son homologas de Ia protefna RecA de E. coli). Aun nose establecen las funciones exactas de estas proteinas en Ia recombinaci6n. Los episodios de Ia recombinacion estan sujetos a un control general. Solo una minima parte de las interacciones en realidad maduran como entrecruzamientos, pero se distribuyen de manera tal que, en generaL cada par de hom6logos requiere s6lo uno ados entrecruzamientos y, sin embargo, Ia probabilidad de 0 entrecruzamientos para un par homologos es muy baja (<0.1% ). Este proceso tal vez sea resultado de un control de entrecruzamiento l'mico, porque Ia no aleatoriedad de los entrecruzamientos suele desaparecer en ciertos mutantes. Es mas, es necesaria Ia aparicion de recombinacion para el avance en Ia meiosis y hay un sistema de "punto de revision" que bloquea la meiosis si no ha ocurrido recombinaci6n. (El bloqueo se levanta cuando se ha concluido con buenos resultados la

19.7 El apareamiento y La formaci6n del complejo sinaptonemico son independientes

469

recombinacion; este sistema constituye una salvaguarda que garantiza que las celulas no traten de segregar sus cromosomas hasta que haya ocurrido la recombinacion.)

Ill

Las secuencias chj estimulan el sistema RecBCD bacteriano


'

• El complejo RecBCD tiene actividades de nucleasa y helicasa. • Se une al DNA en sentido descendente respecto de una secuencia chi, desenrolla la cadena duplex y degrada una cadena de 3' a 5' conforme se desplaza hacia el sitio chi. • El sitio chi desencadena la perdida de la subunidad ReeDy la actividad de nucleasa.

La naturaleza de los episodios comprendidos en el intercambio de secuencias entre moleculas de DNA fue descrita por primera vez en sistemas bacterianos. AhC la reaccion de reconocimiento es parte inseparable del mecanismo de recombinacion e involucra regiones restringidas de moleculas del DNA mas que cromosomas fntegros. No obstante, el orden general de los episodios moleculares es similar: una cade na {mica de una molecula rota interactLl3 con su contraparte d{tplex; Ia region de apareamiento se extiende; y una endonucleasa resuelve las contrapartes duplex. Se conocen las enzimas que participan en cada etapa, aunque es probable que solo constituyan algunos de los componentes requeridos para la recombinacion. Las enzimas bacterianas que intervienen en Ia recombinacion se identificaron por Ia aparicion de mutaciones rec· en sus genes . El fenotipo de los mutantes rec es la imposibilidad de llevar a cabo la recombinacion generalizada. Se han identificado de 10 a 20 loci. Las bacterias no suelen intercambiar grandes cantidades de DNA duplex, pero debe haber varias vias para iniciar Ia recombinacion en las procariotas. En algunos casos, el DNA puede estar disponible con extremos 3' libres de una sola cadena: el DNA puede ser provisto en forma de una cadena unica (como en la conjugacion; vease Ia seccion 16.10, En la conjugacion se transfiere DNA de una sola cadena); se pueden generar brechas de cadena unica con dano por irradiacion; o se pueden generar colas de cadena unica por genomas de fagos en proceso de replicacion por un drculo rodante. Sin embargo, en circunstancias que comprenden dos moleculas duplex (como en la recombinaci6n durante la meiosis en eucariotas), deben generarse regiones de una sola cadena y extremos 3'. 470


Se descubrio un mecanismo para Ia generaci -de extremos adecuados como resultado de la existencia de ciertos puntos calientes que estimulan ·: recombinacion. Estos puntas, que se descubriero~ en el fago "- en forma de mutantes llamados ci: tienen cambios de pares de bases unicos que ere ~ secuencias que estimulan la recombinacion. Est sitios conducen ala funcion de otras protefnas q~ intervienen en Ia recombinacion. Dichos sitios comparten una secuencia no simetrica de 8 bp constante: 5' GCTGGTGG 3' 3' CGACCACC 5'

La secuencia chi ocurre de manera natural en e DNA de E. coli cerca de una vez cada 5 a 10 kb. S ~ ausencia del DNA "- de tipo silvestre y tambien Gc otros elementos geneticos muestra que no es indis pensable para Ia recombinacion. Una secuencia chi estimula Ia recombinacioiil er su vecindad general, es decir, dentro de una dist cia de hasta 10 kb respecto del sitio. Un sitio chi <::c puede activar con una rotura de Ia doble cade n ~ a varios kb de distancia de un !ado particular (a lr. derecha de Ia secuencia mostrada antes). Esta dependencia de Ia orientacion sugiere que el aparar de recombinacion debe vincularse con el DNA e: un extremo roto y luego puede desplazarse por lcadena duplex s6lo en una direcci6n. Los sitios chi son dianas para la accion de un.: enzima codificada por los genes recBCD, complej(' que ejerce varias actividades. Es una nucleasa potente que degrada al DNA yen un principia se identific6 como actividad de exonucleasa V. Tiene actividades de helicasa que pueden desenrollar el Dn;, duplex en presencia de una protefna de union a w1.: sola cadena (SSB) y tiene actividad de trifosfatasa de adenosina. Su participaci6n enla recombinacion ra_ vez sea !a de proveer una region de una sola cadena con un extremo 3' libre. La '· muestra como esas reaccione5 se coordinan en un DNA sustrato que tiene un siti chi. La RecBCD se une al DNA en un extremo de doble cadena. De sus subunidades, dos tienen actividades de helicasa; !a ReeD funciona con polaridaci 5'- 3' y Ia RecB funciona con polaridad 3'- 5'. l a. translocacion a lo largo del DNA y el desenrollad de Ia doble helice son impulsados en un inicio por Ia subunidad ReeD . A medida que avanza RecBCD degrada Ia cadena unica liberada con el extrem 3' . Cuando alcanza el sitio chi, reconoce Ia cadena. superior de ese sitio en forma de una sola cadena. lo que hace que !a enzima entre en pausa. Despues. escinde !a cadena superior del DNA en una posicion entre cuatro y seis bases a la derecha de chi. El reconocimiento del sitio chi hace que Ia subunidad

t~CD desenrofla

ei:DNA .}i escfnae en c~

La RecBCD 5'..,..,.-,~"'~'~"~,..,.,.,.......,f"l"'"~,.,.,.ll"'""''-r-& une una rotura de doble cadena La RecBCD se desenrolla y deg rada eI DNA .U.LLJ..II.U""--.li.LLI.I.I.LLI~L\f" La subunidad ReeD transloca 5'-3' La RecBCD escinde una Cadena unica en chi

~

La ReeD se disocia

La RecBC contin uacomo ~ helicasa · . La subunidad RecB transloca 3'-5'

La nucleasa RecBCD se acerca a una secuencia : i desde un lado y degrada el DNA a medida que avanza; en el _-tio chi hace un corte endonucleol1tico, pierde ReeDy conserva

: )lo la actividad de helicasa.

::<ecD se disocie o se desactive, en cuyo momento la '=I1Zima pi erde su actividad de nucleasa. No obstan:e, sigue funcionando como helicasa (ahora solo con .a subunidad RecB para impulsar la translocacion) a :erca de la mitad de la velocidad anterior. El resul:ado global de esta interaccion es generar un DNA ::.e cadena unica con un extremo 3' en !a secuencia :hi. Este es un sustra to de Ia recombinacion.

Las proteinas de transferencia de cadenas catalizan la asimilaci6n de una sola cadena Conceptos principales • La RecA forma filamentos con el DNA de una o dos cadenas y cataliza la capacidad de un DNA de una sola cadena con un extrema 3' libre de desplazar a su contraparte en una cadena duplex de DNA.

:..a protefna RecA de E. coli fue el primer ejemplo :i: una proteina de transferencia de DNA que se j escubrio. Es el paradigma de un grupo que incluye ·arias otras protefnas bacterianas y arcaicas (Rad5l en S. cerevisiae) y Ia proteina de eucariotas superiores J mcl. El analisis de los mutantes rad51 de las levaj uras muestra que esta clase de proteina desempe:1a una funci6n esencial en la recombinacion . Acuulan roturas de doble cadena y no logran formar ·o:mplejos sinaptonemicos normales. Esto refuerza

la idea de que el intercambio de cadenas entre molecu!as duplex de DNA participa en Ia formaci6n del complejo sinaptonemico y da lugar a Ia posibilidad de que la sinapsis de los cromosomas tenga relacion con Ia reaccion de asimilacion de cadenas en las bacterias. La RecA en bacterias tiene dos tipos bastante diferentes de actividad: puede estimular la reaccion de proteasa en la respuesta SOS (vease la seccion 20.10, La RecA desencadena el sistema SOS) y puede facilitar el apareamiento de bases entre una sola cadena de DNA y su complemento en una molecula duplex. Ambas activida des son estimuladas por el DNA de cadena unica en presencia de ATP. La actividad de manejo del DNA de RecA permite que una sola cadena desplace a su homologa en una molecula dttplex por una reaccion que se denomina captaci6n o asimilaci6n de una sola cadena. La reaccion de desplazamiento puede ocurrir entre moleculas de DNA en varias configuraciones y cumple con tres condiciones generales . • Una de las moleculas de DNA debe tener una region de una sola cadena. • Una de las moleculas debe tener un extremo 3' libre. • La region de una sola cadena y el extremo 3' deben localizarse dentro de una zona que es complementaria entre las moleculas. La reaccion se ilustra en Ia . Cuando una cadena lineal sola invade a una duplex, desplaza a su contraparte original hacia su complementaria . La reaccion puede seguirse con mas facilidad con el marcado del donador o el receptor en una molecula circular. La reaccion procede de 5' a 3' a lo largo de Ia cadena cuya contraparte esta siendo desplazada y sustituida, esto es, Ia reaccion comprende un intercambio donde (al menos) una de las cadenas de intercambio tiene un extremo 3' libre. La asimilacion de una sola cadena tiene una posible relacion con el inicio de la recombinaci6n. Todos los modelos requieren un intermediario donde una o ambas cadenas se cruzan de una molecula duplex a otra (veanse las Figuras 19.6 y 19.9). La RecA podrfa catalizar esta etapa de la reacci6n. En el contexto bacteriano, la RecA actua sobre sustratos generados por RecBCD. El desenrollado y la escision mediados por RecBCD pueden servir para generar extremos que inicien la forma cion de articulaciones heteroduplex. La RecA puede tomar la cadena unica con el extremo 3' que se libera cuando RecBCD corta en chi, usarla para reaccionar con una secuencia duplex homologa y crear asf una molecula de articulacion. Todas las proteinas bacterianas y arcaicas de la familia de RecA pueden agregarse en filamentos largos con el DNA de cadena unica o duplex. Hay

19.9 Las proteinas de transferencia de cadenas catalizan la asimilaci6n de una sola cadena

471

:; La RecA facilita la asimilaci6n de cadenas (micas invasoras en el DNA duplex, siempre y cuando una de las cadenas reactivas tenga un extrema libre.

seis monomeros de RecA por giro del filamento, que tiene una estructura helicoidal con un surco profundo que contiene el DNA. La estequiometrfa de Ia union es de tres nucleotidos (o pares de bases) por monomero de RecA. El DNA se mantiene en una forma extendida l. 5 veces en relaci6n con el DNA B duplex, lo que hace que ocurra un giro cada 18.6 nucleotidos (o pares de bases). Cuando ei DNA duplex se une, entra en o con RecA a traves de su surco menor y deja el surco mayor accesible para una posible reaccion con una segunda molecula de DNA. La interacci6n entre dos moleculas de DNA tiene Iugar dentro de estos filamentos. Cuando una soia cadena se asimila a una duplex, el primer paso es que RecA se una a Ia cadena unica dentro de un filamento. Despues se incorpora Ia cadena duplex, tal vez formando algun tipo de estructura de tres cadenas. En este sistema, Ia sinapsis antecede a! intercambio ffsico de material, porque Ia reacci6n de apareamiento puede ocurrir incluso en ausencia de extremos libres, cuando es imposible el intercambia de cadenas. Se requiere un extremo libre 3' para el intercambio de cadenas. La reaccion tiene Iugar dentro del filamento y RecA se mantiene unida a Ia cadena que en un principia era unica, de modo que al final de Ia reaccion RecA se encuentra unida a Ia molecula duplex. Todas las protefnas en esta familia pueden facilitar el proceso basico de intercambio de cadenas sin necesidad de energfa. No obstante, Ia RecA aumenta su actividad con el uso de hidr6lisis por ATP. Se hidrolizan grandes cantidades de ATP durante Ia reacci6n. El ATP puede actuar mediante un efecto alosterico sobre Ia conformaci6n de RecA. Cuando esta unido a ATP, el sitio de union de RecA al DNA tiene una alta afinidad por el DNA; esto es indispen472


sable para unirse al DNA y para Ia reaccion de apareamiento. La hidrolisis del ATP convierte el sitio dt union en uno de baja afinidad, el cual se necesiE. para liberar el DNA heteroduplex. Se puede dividir Ia reacct6n que cataliza RecA entre DNA de una sola cadena y duplex en tres fases: • una fase presinaptica lema, donde RecA se polimeriza sobre el DNA de una sola cadena; • una reaccion de apareamiento rapido entre el DNA de una sola cadena y su complementario en Ia cadena duplex para produc:i: una articulacion heteroduplex; y • un desplazamiento Iento de una cadenc. desde Ia estructura doble para productr un;; region larga de DNA heteroduplex. La presencia de SSB estimula Ia reacci6n al asegurar que el sustrato carece de estructura secundaria.. Todavfa nose sabe con certeza de que manera SSB y RecA pueden actuar ambas sobre ei mismo segmento de DNA. Al igual que SSB, se requiere RecA e cantidades estequiometricas, lo que sugiere que st:. accion sobre Ia asimilacton de cadenas comprende unirse de manera colaboradora a! DNA para formar una estructura relacionada con el filamento. Cuando una molecula de una soia cadena reacciona con un DNA duplex, Ia molecula duplex se desenrolla en Ia region de la articulacion recombinante. La region inidal de DNA heteroduplex tal vez ni siquiera se encuentre en Ia forma de doble helice convencional, sino que consista en dos caderras relacionadas en forma lateral. Una region de este tipo se conoce como articulacion paranemica (en comparaci6n con Ia relaci6n plectonemica, de entretejido usual de cadenas en una doble helice). Una articulaci6n paranemica es inestable; para que Ia reaccion siga avanzando necesita convertirse a Ia forma de doble helice. Esta reacci6n es equivalente

"--:\.1\. f,\.f;\.f,\.1. ~IJ\.VJ\.W\.()\[}\.0\;U

l

La cadena libre inicia el intercambio

~t;V;\.f\.f\.(. "

u~.fJ\Uv// La cadena desplazada se aparea con Ia complementaria

1

~(\.'\.~~,/\/\.~ "

#\..f.

17\.(Au,.fM/

Concluye el intercambio de cadenas

\.~1,\£\.f\.fj\'J\(/

IJ\."l\.(}Vj {}\.{T\:"1 El intercambio de cadenas mediado par RecA el DNA parcial y completamente duplex genera una mo.ecula articular con la misma estructura que un producto inter' edio de la recombinaci6n. GU

~ntre

al retiro de superhelices negativas yen ocasiones requiere una enzima que resuelva el problema de desenrollado/reenrollado mediante roturas transitorias que permitan a las cadenas girar sobre si mismas. Todas las reacciones que se han analizado basta ahara constituyen solo una parte del episodio de recombinacion potencial: Ia invasion de una molecula duplex por una unica. Dos moleculas duplex pueden interactuar entre sf bajo el patrocinio de RecA, siempre que una de elias tenga una region de una sola cadena de al menos 50 bases. La region de una sola cadena puede adoptar la forma de una cola sabre una molecula lineal o de una brecha en una molecula circular. La reaccion entre una molecula parcialmente duplex y una por completo duplex conduce al intercambio de cadenas. En Ia 1 se incluye un ejemplo. La asimilacion se inicia en un extrema de la molecula lineal, donde la cadena unica invasora desplaza a su homologa de la cadena duplex en la forma acostumbrada. No obstante, cuando Ia

reaccion alcanza Ia region que es duplex en ambas moleculas, la cad en a invasora se separa de su compaiiera, que despues se aparea con la otra cadena desplazada. En esta etapa Ia molecula tiene una estructura indistinguible de la articulacion recombinante in cluida en la Figura 19.8. La reaccion impulsada in vitro por RecA puede generar uniones Holliday, Jo que sugiere que la enzima puede mediar Ia trans ferenda reciproca de cadenas. Se sabe menos acerca de la geometria de los productos intermedios de cuatro cadenas unidos por RecA, pero al parecer dos moleculas duplex pueden yacer Jado a Jado en una forma compatible con los requerimientos de Ia reaccion de intercambio. Las reacciones bioqufmicas descritas in vitro dejan abiertas muchas posibilidades para las funciones de las protefnas de transferencia de cadenas in vivo. Su participacion la desencadena la disponibilidad de un extremo 3' de una sola cadena. En las bacterias, esto con toda probabilidad se genera cuando RecBCD procesa una rotura de doble cadena para originar un extrema de una sola cadena. Una de las principales circunstancias en las que se invoca esto puede ser cuando un triplete de replicacion se detiene en un sitio daiiado del DNA (vease Ia seccion 20.9, La recombinacion es un mecanismo importante para la recuperacion despues de errores en Ia replicacion). La introduccion de DNA durante la conjugacion, cuando se requiere RecA para la recombinacion con el cromosoma hospedador, se relaciona mas de cerca con la recombinacion convencional. En las levaduras, las roturas de la doble cadena pueden generarse por daiio al DNA o como parte del proceso normal de recombinacion. En cualquier caso, al procesamiento de la rotura para generar un extrema 3' de cadena unica le sigue la descarga de Ia cadena unica en un filamento con Rad5l y Juego la busqueda de secuencias duplex complementarias. Esto se puede usar tanto en reacciones de reparacion como de recombinacion.

E

El sistema Ruv resuelve las uniones Holliday

Conceptos principales • El complejo Ruv actua sabre uniones recombinantes. • La RuvA reconoce la estructura de la union y la RuvB es una helicasa que cataliza la migraci6n de ramas. • La RuvC escinde uniones para generar productos intermedios de recombinaci6n.

Uno de los pasos mas determinantes en la recombinacion es la resoluci6n de la union Holliday, la 19.10 El sistema Ruv resuelve las uniones Holliday

473

r

El tetramero RuvA hace o con las cuatro cadenas ( ,

~N ·

El hexamero RuvB se une como anillo alrededor del DNA

}

Migraci6n de rama

La RuvAB es un complejo asimetrico, el cual estimula la migraci6n de ramas de una union Holliday.

Brecha generada por Ia replicaci6n del DNA dafiado

lllll.l l I l I I IJJIIJl/l / l

RecA lntercambio de cadena

Segundo intercambio de cadena

RuvA,B Migraci6n de rama

RuvC Se escinde Ia union Holliday Las enzimas bacterianas pueden catalizar todas las etapas de la recombinaci6n en la via de reparaci6n despues de la producci6n de moleculas sustrato de DNA adecuadas.

cual determina si hay una recombinacion redproca o una reversion de Ia estructura que deja solo un segmento corto de DNA hfbrido (veanse las Figuras 19.6 y 19.8). La migracion de ramas desde el sitio de intercambio (vease la Figura 19.7) determina la longitud de Ia region de DNA hfbrido (con o sin recombinacion). Las protefnas que intervienen en Ia estabilizacion y resolucion de las uniones Holliday se han identificado como los productos de los genes ruv en E. coli. RuvA y RuvB aumentan la formacion de estructuras heteroduplex. La RuvA reconoce la 474


estructura de la union Holliday. La RuvA se une a las cuatro cadenas del DNA en el punta de entrecruzamiento y forma dos tetrameros que ubican al DNA como en un emparedado. La Ruv es una helicasa hexamerica con actividad de trifosfatasa de adenosina que constituye el motor para la migracion de ramas. Los anillos hexamericos de RuvB se unen alrededor de cada cadena duplex de DNA en sentido ascendente respecto del punta de entrecruzamiento. En Ia 9 se muestra un esquema del complejo. El complejo RuvAB puede hacer que Ia rama emigre a una velocidad de basta 10 a 20 bp/s. Otra helicasa, la RecG, provee una actividad similar. La RuvAB desplaza a RecA del DNA durante su accion. Las actividades de RuvAB y RecG pueden incidir ambas sabre uniones Holliday, pero si las dos presentan mutacion, la E. coli tiene una actividad recombinante por completo defectuosa. El tercer gen, ruvC, codifica una endonucleasa que reconoce de manera especifica las uniones Holliday. Puede fragmentar las uniones in vitro para resolver productos intermedios de recombinacion. Una secuencia tetranucleotidica comun provee un pun to caliente para que RuvC resuelva la union Holliday. El tetranucleotido (ATTG) es asimetrico y, por tanto, puede dirigir la resolucion con respecto a que par de las cadenas tiene hendidura. Esto determina si el resultado es la formacion de un parche recombinante (sin recombinacion global) o Ia formacion de un recombinante por corte y empalme (recombinacion entre marcadores flanco). Las estructuras cristalinas de RuvC y otras enzimas de resolucion de union muestran que hay poca similitud estructural en el grupo, a pesar de tener la misma funcion. Todo esto sugiere que la recombinacion utiliza un complejo "resolvasoma" que incluye enzimas que catalizan Ia migracion de ramas, asf como actividades de resolucion de union. Es posible que las celulas de los mamiferos contengan un complejo similar. Ahara se pueden sefialar las etapas de la recombinacion en E. coli en terminos de proteinas individuales. En la se muestran los sucesos que tienen Iugar cuando se usa Ia recombinacio 1~ para reparar una brecha en una cadena duplex mediante Ia recuperacion de material de la otra cadena. duplex. La principal desventaja cuando se aplica.J-. estas conclusiones ala recombinacion en eucariotas es que la recombinacion bacteriana en general com prende la interaccion entre un fragmento de DN/,_ y un cromosoma completo. Ocurre como reacci6L de reparacion estimulada por el dafio al DNA, per no equivale por completo ala recombinacion entH' genomas durante la meiosis. No obstante, participa r actividades moleculares similares en la manipulacion del DNA.

Se describio otro sistema de resolvasas en levamas y mamfferos. Las mutantes mus81 en S. cere·isiae tienen recombinaci6n defectuosa. La Mus81 ~ un compuesto de endonucleasa que resuelve las j niones Holliday en estructuras duplex. La resolva'-<1 es importante tanto en !a meiosis como para el -einicio de horquillas de replicacion varadas (vease . seccion 20.9, La recombinacion es un mecanismo .mportante para Ia recuperacion despues de errores e replicacion).

·~i,!3fr.Ti~

~

, Q

0

Sin recombinaci6n

0 o.J

l!

Proporci6n parental 4:4

{DNA hibrido

--+-

Persiste un hibrido

ol 0

--

. ~

~

Segregaci6n posmei6tica 3:5

g

La conversion genica contribuye a la recombinaci6n interalelica Conceptos pri nci pales • El DNA heteroduplex creado por recombinaci6n puede tener secuencias con apareamiento err6neo, donde los alelos recombinantes no son identicos. • Los sistemas de reparaci6n pueden retirar apareamientos err6neos si cambian una de las cadenas, de modo que su secuencia sea complementaria a la otra.

::..a participaci6n del DNA heteroduplex explica las ·aracterfsticas de Ia recombinacion entre alelos; de .1echo, la recombinacion alelica estimulo el perfec: ·onamiento del modelo heteroduplex. Cuando se escubrio !a recombinacion entre alelos, lo natural :ue pensar que ocurrfa por el mismo mecanismo de .a recombinacion recfproca, que involucra loci mas 'istantes. Es decir, un episodio de rotura y reunion :..11dividual tiene Iugar en el locus para generar un "'lar recfproco de cromosomas recombinantes. Sin : mbargo, en las partes cercanas de un solo gen, !a . rmacion del propio DNA heterodtiplex suele en:argarse del suceso de recombinacion. Los episodios de recombinaci6n individuates _ueden estudiarse en los hongos del grupo de asco -- icetos porque los productos de una sola meiosis se . 1antienen juntos en una gran celula llamada asca o, menos a menudo, tetrada). Es todavfa mejor ue en algunos hongos los cuatro nucleos haploides ""~roducidos porIa meiosis se dispongan en un alelo :meal (en !a actualidad ocurre una mitosis despues :le !a producci6n de estos cuatro nucleos, lo que da _rigen a una serie lineal de ocho nllcleos haploides). :::n la se muestra que cada uno de estos . ucleos representa, en efecto, el cadtcter genetico .1e uno de los ocho segmentos de los cuatro cromo:omas producidos por Ia meiosis. La meiosis en un organismo heterocigoto que .::enerarfa cuatro copias de cada alelo, lo que se ob_erva en la mayor parte de las especies. No obstante, . ay algunas esporas con relaciones anormales, que ~e explican por la formacion y correccion de DNA r

Ambos hibridos se convierten a rojo

...,._=-......-

.

~

g

-

..)

~

g

Conversion del gen 2:6

g

La formacion de esporas en los ascomicetos permite la determinacion de la constituci6n genetica de cada una de las cadenas de DNA involucradas en la meiosis.

heteroduplex en Ia region donde los alelos difie ren. La figura ilustra un episodio de recombinacion donde una longitud de DNA hlbrido se presenta en uno de los cuatro cromosomas meioticos, un posible resultado de Ia recombinacion iniciada porIa rotura de !a doble cadena. Sup6ngase que dos alelos difieren por un solo punto de mutacion. Cuando ocurre intercambio de cadenas para generar el DNA heterod(tplex, las dos de este ultimo tendran apareamiento erroneo en el sitio de Ia mutaci6n. Asi, cada cadena de DNA porta diferente informacion genetica. Si nose hace ningun cambio en !a secuencia, las cadenas se separan en !a siguiente replicacion y dan origen cada una a una d(lplex que perpettla su informacion. Este suceso se denomina segregaci6n posmei6ti£a, porque refleja !a separacion de las cadenas del DNA despues de la meiosis. Su importancia es que demuestra de manera directa Ia existencia del DNA heteroduplex en alelos recombinantes. Otro efecto se observa cuando se revisa !a recombinacion entre alelos: los porcentajes de alelos difieren de Ia relacion ini.cial de 4:4. Este efecto se llama con version genica. Describe una transferencia no recfproca de informacion de una cromatida a otra. La conversion genica es resultado del intercambio de cadenas entre moleculas de DNA, y el cambio en Ia secuencia puede tener cualquiera de dos causas en el ambito molecular: • Como se indica con el modelo de rotura de doble cadena en Ia Figura 19.9, una cadena duplex de DNA puede actuar como donadora de informacion genetica, que sustituye en forma directa las secuencias correspondien-

19.11 La conversion genica contribuye ala recombinacion interalelica

475

tes en la cadena duplex receptora por un proceso de generacion de brechas, intercambio de cadenas y llenado de Ia brecha. • Como parte del proceso de intercambio se genera DNA heteroduplex cuando una sola cadena de una duplex se aparea con su complementaria en la otra cadena duplex. Los sistemas de reparacion reconocen pares de bases con apareamiento erroneo con el DNA heteroduplex y pueden, entonces, escindir y sustituir una de las cadenas para restablecer la complementariedad. Tal suceso convierte la cadena de DNA representante de un alelo en una secuencia del otro alelo. La conversion genica no depende del entrecruzamiento, pero se correlaciona con eL Una gran proporcion de las ascas aberrantes muestra !a recombinacion genetica entre dos marcadores a cada !ado de un sitio de conversion genica interalelica . Esto es exactamente lo que podrfa predecirse si las relaciones aberrantes fueran resultado del inicio del proceso de recombinacion, como se muestra en la Figura 19.6, pero con una probabilidad casi equivalente de resolver !a estructura con o sin recombinacion (como se indica en !a Figura 19.8) . El efecto es que los cromosomas micoticos inician el entrecruzamiento casi con el doble de la frecuencia que se esperarfa respecto de la correspondiente de !a recombinacion entre genes distantes. Se observan varias tendencias cuando se revisa la recombinacion en el ambito molecular. Cualquier direccion de Ia conversion genica puede tener !a misma probabilidad, o los efectos especfficos de alelos pueden propiciar una preferencia por una direccion. Los gradientes de recombinacion pueden alejarse de los puntas calientes. Hoy se sabe que los puntos calientes representan sitios donde se inician las roturas de !a cadena doble y que el gradiente se correlaciona con el grado hasta el cual una brecha en el punto caliente aumenta y origina extremos largos de cadena unica (vease la seccion 19.6, El complejo sinaptonemico se forma despues de las roturas de Ia doble cadena) . Las secuencias de los integrantes de agrupaciones genicas ofrecen un poco de informacion sobre el grado de conversion genica. Por lo general, los productos de un episodio de recombinacion se separaran y no podran analizarse las secuencias del DNA. No obstante, cuando un cromosoma porta dos genes (no alelicos) que tienen relacion, pueden recombinarse mediante un episodio de "entrecruzamiento no equivalente " (vease !a seccion 6.7, El entrecruzamiento no equivalente reestructura grupos de genes). Todo lo que se necesita observar por ahora es que se puede formar un DNA heteroduplex entre dos genes alelicos. La conversion genica con476


El DNA lineal esta extendido (a), un DNA ci·· cular se mantiene extendido si es relajado (no superenrollad_ (b), pero el DNA superenrollado tiene una forma condens; da con torsion (c). Fotografias por cortes\a de Nirupam R Choudhury, International Centre for Genetic Engineering ar : Biotechnology (ICG EB).

vierte, en efecto, uno de los genes no alelicos en 1=. secuencia del otro. La presencia de mas de un gen en el mismc cromosoma constituye un vestigia que permii= rastrear estos sucesos. Por ejemplo, si se formar=: un DNA heteroduplex y hubiera conversion genic~ sobre parte de un gen, esa parte podrfa tener unc. secuencia identica a Ia del otro gen, o muy relacio· nada, en tanto la porcion restante mostrarfa meL divergencia. Las secuencias disponibles sugiere:::. que los episodios de conversion pueden extende:-se distancias considerables, de hasta unos cuant miles de bases.

IE

El superenrollamiento afecta la estructura del DNA

Conceptos principales • Ocurre superenrollamiento s6lo en un DNA cerrado, sin ningun extremo libre. • Un DNA cerrado puede ser una molecula circular de DNA, o una lineal donde ambos extremos se anclan a una estructura prote\nica. • Cualquier molecula de DNA cerrado tiene un numero de enlace, que corresponde a la suma del numero de contorsiones y del numero de torcimientos.

• Los plegamientos se pueden repartir entre el numero de contorsiones y el numero de torcimientos, de manera que un cambio en la estructura de la doble helice puede compensar una modificaci6n de su enrollamiento en el espacio. • El numero de enlace puede modificarse s6lo con la rotura y la formaci6n de uniones en el DNA.

:.a oscilacion de las dos cadenas del DNA entre si :on Ia estructura de Ia doble h elice permite cambiar :a estructura si se influye en su conformacion en el espacio. Silos dos extremos de Ia molecula de DNA estan fijos, se puede enrollar Ia doble helice alredeor de sf misma en el espacio, lo que se denomina superenrollamiento. Se puede imaginar el efecto como el de una liga que se enrolla sabre sf misma. El ejemplo mas simple de un DNA sin extremos libres s el de Ia molecula circular. El efecto del superenrollamiento puede observarse cuando se compara el DNA circular no superenrollado que yace plano n Ia , con la molecula circular superenrollada que forma torsiones y, por tanto, esta mas ondensada . Las consecuencias del superenrollamiento dependen de que el DNA gire en torno a sf mismo en el mismo sentido que las dos cadenas dentro de Ia doble helice (como las manecillas del reloj) o en el sen:ido contrario. El enrollamiento en el mismo sentido produce superenrollamiento positivo, que tiene el efecto de hacer que las cadenas del DNA se tuerzan en:re sf de un modo mas estrecho, de modo que haya :nas pares de bases por giro. El enrollamiento en el sentido contrario produce superenrollamiento negati·o, que hace que las cadenas de DNA giren una en :orno ala otra menos apretadamente, de modo que haya me nos pares de bases por giro. Se puede pensar que el superenrollamiento negativo crea tension en el DNA, que es aliviada por el desenrollamiento de la oble helice. El efecto final del superenrollamiento negativo es generar una zona donde las dos cadenas de DNA se han separado; en terminos formales, hay cero pares de bases por giro. La manipulaci6n topologica del DNA es un aspecto central de todas sus actividades funcionales, recomb inaci6n, replicacion y transcripcion, asf como de Ia organizacion de estructuras de orden mas elevado. Todas las actividades sinteticas en las que participa el DNA de cadena doble requieren Ia separaci6n de las cadenas, que no yacen simplemente una allado de otra, sino que estan entretejidas . Su separacion, por tanto, requiere que una gire en torno a la otra en el espacio. Algunas posibilidades para Ia reaccion de desenrollami emo se ilustran en la u

Podrfa visualizarse la estructura del DNA en terminos de un extrema libre que permitiese a las cadenas girar sobre el eje de Ia doble helice para des enrollarse. No obstante, dada la longitud de la doble helice, esta acci6n implicarfa la separacion de las cadenas en un grado considerable de fragmentaciones, lo que parece poco probable en los confines de Ia celula. Se logra un resultado similar si se coloca un aparato para controlar la rotaci6n del extrema libre. Sin embargo, el efecto tiene que transmitirse por una distancia consid erable, lo que implica, de nuevo, la rotacion de una longitud inmoderada de material. Considerense los efectos de separar las dos cadenas en una molecula cuyos extremos no estan en libertad de girar. Cuando dos cadenas entretejidas se jalan para separarlas de un extrema, se incrementa el enrollamiento de una en torno a !a otra en una mayor distancia de Ia molecula. El problema puede superarse si se introduce una hendidura transitoria en una cadena. Un extrema libre interno permite que Ia cadena con hendidura gire a!rededor de la cadena integra, despues de lo cual se puede sellar dicha hendidura. Cada vez qu e se repite Ia reaccion de hendidura y sellado se Iibera un giro de Ia superhelice.

Rotaci6n cerca de un extrema libre

Rotaci6n en extremes fijos

La separaci6n de cadenas se compensa con el superenrollamiento positive

Producci6n de hendidura, rotaci6n y ligadura Hendidura

~. ~

u~ ~

= - ' -~

llA.{)

Se puede lograr la separaci6n de las cadenas de una helice de DNA doble en varias formas.

19.12: El superenro llamiento afecta la estructura del DNA

477

Se puede definir una molecula de DNA cerrada por su numero de enlaces, el numero de veces que una cadena cruza sobre Ia otra en el espacio. Las moleculas de DNA cerradas de secuencia identica pueden tener diferentes numeros de enlaces, lo que refleja diferentes grados de superenrollamiento. Las moleculas de DNA que son iguales, excepto por sus numeros de enlaces, se denominan is6meros topol6gicos. El numero de enlaces esta constituido por dos componentes: el numero de torcimientos (W) y el numero de contorsiones (T). El numero de contorsiones, T, es una propiedad de Ia estructura misma de doble helice que representa la rotacion de una cadena alrededor de la otra. Corresponde al numero total de giros de la cadena duplex y esta determinada por el numero de pares de bases por giro . Para un DNA circular cerrado relajado, que yace plano, el giro corresponde al numero total de pares de bases dividido entre el numero de pares de bases por giro. El numero de torcimientos, W, representa el giro del eje de la cadena duplex en el espacio. Corresponde al concepto intuitivo del superenrollamiento, pero no tiene exactamente la misma definicion cuantitativa o medicion. Para una molecula relajada W = 0, y el numero de enlace equivale al giro. A menudo interesa el cambio en el numero de enlace, L'>L, expresado en Ia ecuacion L'>L=L'>W+L'>T La ecuacion seiiala que cualquier cambio del numero total de revoluciones de una cadena de DNA alrededor de Ia otra se puede expresar como Ia suma de modificaciones en el enrollamiento del eje de Ia cadena duplex en el espacio (t.W) y las de los giros de Ia doble helice misma (L'>T). En una molecula de DNA libre, W y T pueden ajustarse con libertad yes probable que cualquier M (carnbio en el numero de enlace) se exprese por un carnbio en W, es decir, por una variacion en el superemollamiento. Un decremento en el numero de enlace, esto es, un cambio -t.L corresponde a la introduccion de alguna combinacion de superenrollamiento negativo, subenrollamiento, o ambos. Un aumento en el numero de enlace, determinado como cambio de +L'>L, corresponde a una reduccion en el superenro llamiento negativo o subemollamiento . Se puede describir el cambio en el es tado de cualquier DNA por Ia diferencia especifica de enlace, cr = t.L/L 0 , donde L0 es el numero de enlace cuando el DNA esta relajado. Si todo el cambio en el numero de enlace se debe a Ia modificacion en W (esto es L'>T = 0), la diferen cia especffica de enlace equivale a Ia densidad del superenrollarniento. En efecto, puede asumirse que cr definida en terminos 478

CAPITU LO 19 Recombinaci6n hom6loga y especifica de sitio

de M/L0 corresponde a la densidad de Ia superhelice siempre y cuando Ia estructura de la doble helice misma se mantenga constante. La caracteristica determinante del uso del numero de enlace es que este parametro es una propiedad invariable de cualquier molecula de DNA individual cerrado. El numero de enlace no puede cambiar por alguna deformacion diferente de aquella que implique la rotura y reunion de cadenas. Una molecula circular con un numero de enlace particular puede expresar el numero en terminos de diferentes combinaciones de T y W, pero no puede cambiar su suma en tanto las cadenas nose rompan. (De hecho, Ia particion de L entre T y W impide lc: asignacion de valores fijos a los ultimos parametro~ para una molecula de DNA en solucion.) El numero de enlace se relaciona con los sucesos enzimaticos reales por los que se hacen cambios en Ia topologfa del DNA. El numero de enlace de una molecula cerrada particular puede cambtar solo si se rompen una o dos cadenas, utilizando e: extrema libre para girar una alrededor de la otra y reuniendo los extremos rotos. Cuando una enzima realiza tal accion, el numero de enlace debe cambiar por un entero; este valor puede determinarse como una caracterfstica de la reaccion . Entonces se podran analizar los efectos de este cambio en terminos de t.W y t.T.

E111J

Las topoisomerasas relajan o i ntroducen superhel"ices en el DNA

Conceptos principales • Las topoisomerasas cambian el nCtmero de enlace cuando rompen enlaces en el DNA, modifican la conformaci6n de la doble helice en el espacio y vuelven a formar los enlaces. • Las enzi mas de tipo I actCtan al romper una cadena (mica de DNA; las de ti po II causan roturas de dos cadenas.

Los cambios en Ia topologfa del DNA pueden ocasionarse en varias formas. La muestra algunos ejemplos. Para iniciar Ia replicacio:c o transcripcion deben desenrollarse las dos cadena~ de DNA. En el caso de Ia replicacion, las dos cad.enas se separan de manera permanente y cada una forma una cadena duplex con Ia hija recien sintetizada. En el caso de la transcripcion, el movimient de Ia polimerasa de RNA crea una region de superenrollamiento positivo al frente y una de superenrollamiento negativo detras de la enzima. Esto debe resolverse antes de que las superhelices positiva~

Las cadenas deben separarse para Ia replicaci6n

La transcripci6n crea superenrollamiento positivo

G La estructura topol6gica del DNA cambia dura nte la replicaci6n y la tra nscripci6n. La separaci6n de las cadenas requiere que se desenrolle un giro del DNA. La transcripci6n crea superhelices positivas adelante de la polimerasa de RNA. La replicaci6n de un molde circular produce dos moldes hijos encadenados.

irnpidan el movirniento de la enzirna (vease Ia seccion 11.15, El superenrollamiento es una caracterfstica importante de Ia transcripcion). Cuando se replica una molecula de DNA circular, los produ ctos vinculados pueden estar encadenados, de modo qu e uno pasa a traves del otro. Deben separarse en arden para que las moleculas hijas se segreguen en celulas hijas independientes. Otra situacion donde el superenrollamiento es importante es el plegamiento del DNA en una cadena de nucleosomas del nucleo eucariotico (vease Ia seccion 29 .6, La periodicidad del DNA cambia en el nucleosoma). Todas las situaciones se resuelven con las acciones de las topoisomerasas. Las topoisomerasas del DNA son enzimas que catalizan cambios en Ia topologia del DNA con Ia rotura transitoria de una o ambas cadenas, donde las cadenas que no se rompieron pasan a traves de la brecha que despues se sella. Los extremes que se generan con la rotura nunca estan libres, sino que, en su Iugar, son manipulados de manera exclusiva dentro de los confines de Ia enzirna; de hecho, tienen enlace covalente con ella. Las topoisomerasas actuan sobre el DNA sin importar su secuencia, pero algunas enzimas involucradas en la recombinacion especffica de sitio actuan del mismo modo y tambien cumplen con Ia definicion de topoisomerasas

(vease la seccion 19 .18, La recombinacion especifica de sitio simula la actividad de topoisomerasa). Las topoisomerasas se dividen en dos clases, de acuerdo con la naturaleza de los mecanismos que emplean. Las topoisomerasas de tipo I actuan hacienda una rotura transitoria en una cadena de DNA. Las topoisomerasas de tipo II actuan cuando introducen una rotura transitoria de Ia doble cadena. Las topoisomerasas en general varian con respecto a los tipos de cambia topologico que introducen. Algunas topoisomerasas pueden relajar (retirar) solo superhelices negativas del DNA; otras pueden relajar superhelices negativas y positivas. Las enzimas que pueden introducir superh elices negativas se denorninan girasas; aquellas que pueden introducir superhelices positivas se denominan girasas inversas. Hay cuatro topoisomerasas en E. coli: las topoisomerasas I, III y IVy Ia girasa de DNA. Las topoisomerasas I y III del DNA son enzimas de tipo I. La girasa y Ia topoisomerasa IV del DNA son enzimas de tipo II. Cada una de las cuatro enzimas es irnportante en una o mas de las situaciones descritas en Ia Figura 19.22: • El nivel global de superenroliarniento negative en el nucleoide bacteriano es resultado de un equilibria entre Ia introduccion de superhelices por Ia girasa y su relajacion por las topoisomerasas I y IV. Este es un aspecto crucial de Ia estructura del nucleoide (vease Ia seccion 28.4, El genoma bacteriano esta superenrollado ) y afecta el inicio de Ia transcripcion en ciertos promotores (vease Ia seccion 11 .15, El superenrollarnierito es una caracteristica irnportante de la transcripcion). • Las mismas enzimas participan en Ia resolucion de los problemas creados por Ia transcripcion; la girasa convierte las superh elices positivas que se generan delante de Ia polimerasa de RNA en superhelices negativas, y las topoisomerasas I y IV retiran las superhelices negativas qu e quedan detras de la enzirna. De manera similar, pero mas compleja, ocurren efectos durante Ia replicacion y las enzimas tienen actuaciones similares para enfrentarlos. • A medida que avanza Ia replicacion, las cadenas dobles hijas pueden torcerse una alrededor de la otra, en una etapa conocida como precatenacion. Las estructuras de Ia precatenacion se retiran porIa accion de Ia topoisomerasa IV, que tam bien desencadena cualquier genoma encadenado que queda al termino de Ia replica cion. Las funciones de la topoisomerasa III se superponen de manera parcial con las de Ia topoisomerasa IV.

19.13 Las topoisomerasas relajan o introducen superhelices en el DNA

479

DB

Las topoisomerasas rom pen y resellan cadenas

Concepto principal

Unen Hacen cadenas hendiduras en separadas una cadena y aseguran los extremos

t

Hacen pasar Se sella Ia Ia cadena hendidura intacta a !raves de Ia brecha

3'-0H 5'-P-.,..ir

Las topoisomerasas bacterianas de tipo I reconocen segmentos parcialmente desenrollados de DNA y pasan una cadena a traves de una rotura hecha en la otra.

Las enzimas en eucariotas siguen los mismos principios, si bien Ia division detallada de sus funciones puede ser diferente. No muestran similitud de secuencias o estructurales con las enzimas procarioticas. Casi todas las eucariotas contienen una sola enzima topoisomerasa I, que se requiere tanto para el movimiento del triplete de replica cion como para relajar las superhelices generadas por Ia transcripcion. Se requiere una enzima topoisomerasa II para desenlazar los cromosoma s despues de la replicacion. Se ha sefi.alado a otras topoisom erasas individu ales en las actividades de recombinaci6n y reparacion. 480

CAPITU LO 19 Reco mbinaci 6n hom6loga y especifica de sitio

• Las topoisomerasas de tipo I actuan al forma r un enlace covalente con uno de los extremos rotos, mover una cadena alrededor de la otra y, despues, transferir el extrema de enlace al otro extrema roto. Los enlaces se conservan y, en consecuencia, no se requiere aporte de energia.

La accion que comparten todas las topoisomerasas es enlazar un extrema de cada cadena rota a una molecula de tirosina en Ia enzima. Una enzima de tipo I se une a una sola cadena rota; una enzima de tipo II se une a un extrema de cada cadena rota. Las topoisomerasas se subdividen en grupos A y B, si el enlace se hace con un fosfato 5' o un fosfato 3' . El uso del enlace transitorio fosfodiester-tirosina sugiere un mecanismo para Ia accion de la enzima; transfiere un enlace fosfodiester del DNA a Ia proteina, manipula la estructura de una o ambas cadenas de DNA y, despues, reline los enlaces en la cadena original. Las enzimas de E. coli son todas de tipo A y utilizan enlaces con el 5' fosfato. Este es el patron genera l para las bacterias, donde casi no hay topoisomerasas de tipo B. Los cuatro posibles tipos de topoisomerasas (IA, IB, IIA y liB ) se encuentran en eucariotas. En Ia se incluye un modelo para Ia accion. de Ia topoisomerasa IA. La enzima se une a una region donde el DNA duplex se separa en sus cadenas constitutivas. La enzima rompe entonces una cadena, jala Ia otra bacia la brecha y luego sella Ia brecha. La transferencia de enlaces del acido nucleico a Ia proteina explica como la enzima puede actuar sin necesitar de ningun aporte de energia . No ha habido hidr6lisis irreversible de enlaces; su energia se ha conservado durante las reacciones de transferencia. El modelo esta respaldado por la estructura cristalina de la enzima. La reaccion cambia el numero de enlace en pasos de una unidad. Cada vez que una cadena pasa por Ia rotura en la otra hay un 6L de + l. La figura ilustra Ia actividad enzimatica en terminos del movimiento de las cadenas individuales . En una molecula superenrollada libre, Ia posibilidad de intercambio deWy T deberia permitir que el cambio de numero de enlace tuviera lugar por un cambia de + 1 en 6 W, es decir, un giro men os del superenrollamiento negativo. La reaccion es equivalente a Ia rotacion ilu strada en Ia parte inferior de Ia Figura 19 .21, con Ia restriccion de que Ia enzima limita la reaccion

Las cadenas duplex de DNA son puestas en aposici6n

i

La cadena duplex no rota se hace pasar a !raves de los extremos de Ia rotura

f.'

~

Se sella Ia rotura y Ia enzima Iibera el DNA

ligadura/liberacion, cuando los extremos se reunen y se liberan las cadenas dl'tplex de DNA. Este es el motivo por el que inhibir Ia actividad de la enzima trifosfatasa de adenosina produ ce un "complejo susceptible de escision" que contiene DNA roto. Una consecuencia formal de Ia transferencia de dos cadenas es que el numero de enlace siempre ca mbia en multiplos de dos. La actividad de topoisomerasa II tambien permite, en ocasiones, introducir o resolver cfrculos duplex encadenados y moleculas anudadas. Es probable que Ia reaccion represente un reconocimiento inespecffico del DNA duplex, donde Ia enzima se une a cualquier segmento de dos cadenas que cruce entre ambas. La hidrolisis de ATP se puede usar para impulsar a Ia enzima a pasar por los cambios de conformaci6n que proveen la fuerza indispen sable para empujar una cadena duplex de DNA a naves de esa rotura hecha en Ia otra. Como resultado de la topologia del DNA superenrollado, Ia relacion de los segmentos cruzados permite retirar superhelices de los circulos con superenrollamiento positivo o negativo.

BE

La girasa funciona por la inversion de helice


FIGU

Las topoisomerasas de tipo II pueden pasar un DNA duplex por una rotura de cadena doble en otra duplex.

a un paso de cadena individual por episodio. (Por el contrario, Ia introduccion de una hendidura en una molecula superenrollada permite Ia rotacion de Ia cadena libre para aliviar toda la tension con las rotaciones multiples. ) La topoisomerasa de tipo I tam bien puede pasar un segmento de un DNA de una cadena a traves de otro . Esta reaccion de paso de una sola cadena puede introducir nudos en el DNA y encaden ar dos moleculas circulares, de manera que se conecten como eslabones. Nose comprenden los usos (si los hay) que estas reacciones tienen in vivo. Las topoisomerasas de tipo II en general relajan tanto superhelices negativas como positivas. La reacci6n requiere ATP, con hidrolisis de una molecula por cada episodio catalftko. Como se ilustra en GU , la reaccion es mediada por la rotura de una cadena doble dentro de un DNA doble. La doble cadena es escindida, con un peldafio de cuatro bases entre los extremos, y cada subunidad de Ia enzima dimerica se une a un extrema rota que hace protrusion. Despues se hace pasar otra region duplex por Ia rotura. Se utiliza el ATP en el siguiente paso de re-

La girasa de f. coli es una topoisomerasa de tipo II que usa la hidr6lisis del ATP para proveer la energ\a necesaria a fin de introducir superhelices negativas en el DNA.

La girasa de DNA bacteriana es una topoisomerasa de tipo II que tiende a introducir superhelices negativas en una molecula circular cerrada, relajada. La girasa de DNA se une al DNA circular duplex y lo superenrolla de manera progresiva y catalftica, al tiempo que continua introduciendo superhelices a Ia misma molecula de DNA. Una molecula de girasa de DNA puede introducir -l 00 super helices por minuto. La forma superenrollada del DNA tiene una energfa libre mas alta que Ia forma relajada, y la energfa necesaria para Ia conversion se obtiene de Ia hidr6lisis del ATP. En ausencia de ATP, Ia girasa puede relajar super helices negativas, no asf las positivas, aunque a una velocidad > l 0 veces me nor que Ia usada para introducir superhelices. La girasa de DNA en E. coli es un tetramero constituido por dos tipos de subunidad, cada una de las cuales es diana de antibi6ticos (el usado con mas frecuencia es el acido nalidfxico, que actua sabre GyrA. y Ia novobiocina, qu e actl'ta sabre GyrB) . Los farmacos inhiben la replicaci6n, lo que sugiere 19.!5 La girasa funciona por la inversion de helice

481

• •

•

-IF.Ti! llF.1F.l

~ l

000 (+)

Estabiliza el nodo positivo con giros oompensadores

(-)

l

000

Rompe un segmento posterior

l

000 (-)

Resella Ia rotura en el lado frontal

(-)

La girasa de DNA puede introducir superhelices negativas en el DNA duplex al invertir una superhelice positiva.

que la girasa de DNA es necesaria para que proceda la sintesis de DNA. Las mutaciones que confieren resistencia a los antibioticos identifican los loci que codifican las subunidades. La girasa se une a su sustrato de DNA alrededor del exterior del tetramero de protefnas. La girasa protege -140 bp de DNA de la digestion por parte de la nucleasa del micrococos. En la r se ilustra el modelo de inversion de signo de la accion de Ia girasa. La enzima se une al DNA en una configuracion cruzada y equivale a una superhe!ice positiva. Ello induce una superhelice negativa de compensacion en el DNA no unido. La enzima rompe, entonces, Ia doble cadena en el cruce de Ia superhelice positiva, pasa a traves de Ia otra cadena duplex y sella Ia rotura. La reaccion invierte de manera directa el signo de Ia superhelice: se ha convenido de +1 giro a -1 giro. Asf, el numero de enlace ha cambiado por .6.L = - 2, lo que cumple con Ia demanda de que todos los episodios con un paso de doble cadena deben cambiar el nCtmero de enlace por un multiplo de dos. La girasa Iibera, despues, uno de los segmentos de cruce de Ia superhelice unida (ahara negativa); esto permite que los giros negativos se redistribuyan por el DNA (como un cambia en T, W, o ambas) y el ciclo vuelve a iniciarse. El mismo tipo de manipulacion topologica se encarga de los encadenarnientos y el anudado. 482

CAPITULO 19 Recombinaci6n hom6loga y espedfica de sitio

Alliberar Ia superhelice invertida, Ia conformacion de Ia girasa cambia. Para que la enzima inicie otro ciclo de superenrollarniento debe restablecerse su conformacion original, proceso que se denomina recambio enzimatico. Se cree que lo impulsa la hidr6lisis del ATP, porque la sustitucion del ATP por un analogo que no puede hidrolizarse permite que Ia girasa introduzca solo una inversion (-2 superhelices) por sustrato. Asf, la enzima no necesita ATP para Ia reacci6n de superenrollamiento, pero sf para realizar un segundo ciclo. La novobiocina interfiere con las reacciones dependientes de ATP de Ia girasa a! impedir que el ATP se una a Ia subunidad B. La reaccion de relajacion independiente del ATP es inhibida por el acido nalidfxico, lo que implica a Ia subunidad A en Ia reaccion de rotura y reunion. El tratamiento de la girasa con acido nalidfxico permite al DNA recuperarse en forma de fragmentos generados por una escision por etapas a traves de Ia cadena duplex. Todos los extremos poseen un grupo 3'-0H libre y una extension de una sola cadena de cuatro bases en el extrema 5' unida en forma covalente a Ia subunidad A. El enlace covalente conserva Ia energfa del enlace fosfato; esta se puede u sar para impulsar Ia reaccion de sellado, que explica porque Ia girasa puede presentar relajacion sin ATP. Los sitios de escision son bastante especificos y se presentan cerca de una vez cada 100 bp.

IE

La recombinaci6n especializada involucra sitios espec1ficos

Conceptos principales • La recombinaci6n especializada comprende una reacci6n entre sitios espec\ficos que no tienen que ser hom6logos. • El fago A. se integra al cromosoma bacteriano por recombinaci6n entre un sitio del fago y el sitio ott en el cromosoma de E. coli. • El fago se escinde del cromosoma por recombinaci6n entre los sitios en el extrema del profago lineal. • El gen int del fago A. codifica una integrasa que cataliza la reacci6n de integraci6n.

La recombinacion especializada implica una reaccion entre dos sitios especfficos. Las longitudes de los sitios diana son cortas y por lo general de 14 a 50 bp. En algunos casas los dos sitios tienen la rnisma secuencia, pero en otros no son hom61ogos. La reacci6n se usa para insertar un fago libre de DNA en el cromosoma bacteriano o extirpar un fago de DNA integrado del cromosoma, y en ese caso Ia~ dos secuencias recombinantes son diferentes entre

sf. Tambien se usa antes de la division para generar romosomas circulares monomericos a partir de un dfrnero, que se ha creado por un suceso de recombinacion generalizada (vease la seccion 17 .7, La segregacion cromosomica puede requerir recombinacion especffica de sitio). En este caso las secuencias de recombinacion son identicas. Las enzimas que catalizan la recombinacion especffica de sitio en general se denominan recombinasas y hasta ahora se conocen mas de 100. Las que participan en la integra cion del fago o se relacionan con estas enzimas tambien se conocen como familia de integrasas, de la que son importantes el prototipo Int del fago A, el Cre del fago Pl y !a enzima FLP de las levaduras (que cataliza una inversion cromosomica). El fago A ilustra el modelo clasico de recombinaci6n especifica de sitio. La conversion del DNA A, en sus diferentes formas de vida implica dos tipos de sucesos. El patron de la expresion genica es regulado como se describe en el Capitulo 14, Estrategias de los fagos. La situacion ffsica del DNA es diferente en los estados lisogenico y litico: • En el estilo de vida lftico, el DNA A se encuentra como molecula circular independiente en la bacteria infectada. • En el estado lisogenico, el DNA del fago es parte integral del cromosoma bacteriano (llamado profago). La transicion entre estos estados implica una recombinaci6n especffica del sitio: • Para ingresar al estado lisogenico, el DNA libre debe insertarse en el DNA del hospedador, proceso llamado integraci6n. • Para liberarse de la lisogenia hacia el ciclo lftico, el DNA del profago debe liberarse desde el cromosoma, lo que se llama escisi6n. La integracion y la escision ocurren por la recombinacion en loci especfficos en los DNA bacteriano y de fa go, llamados sitios de union (att) . El sitio de union en el cromosoma de !a bacteria se llama att1• en la genetica bacteriana. Ellocus se define por mutaciones que impiden !a integracion del A; es ocupado por el profago A en cepas lisogenicas. Cuando el sitio attl· sufre delecion en el cromosoma de E. coli, un fago A infectante puede establecer lisogenia por integracion en otro punto, aunque !a eficacia de !a reacci6n es menor de 0.1% de !a frecuencia de integracion en atf. Esta integracion ineficaz tiene Iugar en sitios de union secundaria, que simulan secuencias att autenticas. Para describir las reacciones de integracion, escisi6n o ambas, el sitio de union bacteriana (att') se llama attB, constituido por los componentes de secuencia BOB'. El sitio de union del fa go attP consta de los componentes POP'. En la se

esquematiza la reaccion de recombinacion entre estos dos sitios. La secuencia 0 es comun a attB y attP. Se denomina secuencia central y es asiento del episodio de recombinacion. Las regiones flanco B, B' y P. P' se conocen como brazos; cada una tiene diferente secuencia. El DNA del fago es circular por lo que el suceso de recombinacion lo inserta en el cromosoma bacteriano como secuencia lineal. El profago esta limitado por dos nuevos ciclos att: los productos de recombinacion llamados attL y attR. Una consecuencia importante de la constituci6n de los ciclos att es que las reacciones de integracion y escisi6n no involucran al mismo par de secuencias reactivas. La integracion requiere el reconocimiento entre attP y attB, en tanto la escision requiere el reconocimiento entre attL y attR. El caracter direccional de la recombinacion especifica de sitio es controlado por la identidad de los sitios recombinantes. El episodio de recombinaci6n es reversible, pero prevalecen condiciones diversas para cada direcci6n de !a reaccion. Esta es una caracteristica importante en la vida del fago, porque ofrece un medio para asegurar que un suceso de integra cion nose revierta de manera inmediata por una escision y viceversa. La diferencia en los pares de sitios que reaccionan en la integracion y la escision se refleja por una discrepancia en las proteinas que median las dos reacciones. • La integraci6n (attB x attP) requiere el producto del gen int del fago que codifica una

DNA bacterial'lo

BOB'

attB

tl

La integraci6n requiere lnt e IHF

tl

La escisi6n requiere lnt, Xis e IHF

BOP'

attL

POB' Profago

attR

El DNA del fago circular se convierte en un profago integrado por una recombinaci6n reciproca entre attP y attB; el profago se escinde por la recombinaci6n reciproca entre attL y attR.

19.16 La recombinaci6n especializada implica sitios especificos

483

enzima integrasa, asf como una protefna bacteriana llamada factor de integracion del hospedador (IHF). • La escision (attL x attR) requiere el producto del gen xis del fago ademas de Int y IHF. Por lo tanto, se requieren Int y IHF para ambas reacciones. El xis tiene una participacion imponante en el control de la direccion; se requiere para la escision, pero inhibe la integracion. Un sistema similar, pero con requerimientos algo mas sencillos para los componentes de secuencia y protefnico se encuentran en el bacteriofago Pl. La recombinasa Cre codificada por el fago cataliza una recombinacion entre dos secuencias diana. A diferencia del fago A, para el que las secuencias de recombinacion son diferentes, en el fago P1 son identicas. Cada una consta de una secuencia de 34 bp de longitud llamada loxP. La recombinasa Cre es suficiente para la reaccion; nose requieren protefnas rias. Como resultado de su simplicidad y eficacia, lo que ahora se conoce como sistema Cre/ lox se ha adaptado para su uso en o§lulas eucarioticas, donde se ha convertido en una de las tecnicas estandar para llevar a cabo Ia recombinacion especffica de sitio.

II& La recombinaci6n especifica de sitio comprende rotura y reunion Concepto principal • Se hacen escisiones a intervalos de 7 bp en los genes attB y attP y los extremes se unen en forma cruzada.

Los sitios att tienen distintos requerimientos de secuencia y el attP es mucho mas grande que attB. La funcion de attP requiere un segmento de 240 bp, en tanto que la funcion de attB la puede ejercer el fragmento de 23 bp que se extiende de -11 a +11, donde hay solo 4 bp a cada !ado de Ia porcion central. La disparidad en sus tamaiios sugiere que attP y attB tienen diferentes participaciones en la recombinacion, donde attP ofrece la informacion adicional necesaria para distinguirla de attB . .:,Prosigue Ia reaccion por un mecanismo concertado donde se cortan e intercambian de manera simultanea las cadenas en attP y attB? 0, .:,se intercambian las cadenas, un par a la vez, donde el primero genera una union Holliday y el segundo ciclo de hendidura y ligadura ocurre para liberar la estructura? Las alternativas se incluyen en Ia La reaccion de recombinacion se ha detenido en etapas intermedias mediante el uso de "sustratos suicidas", donde Ia secuencia centra l presenta hen-

484

CAPITULO 19 Recombinaci6n hom6loga y espec1fica de sitio

attB

lntercambio de secuencias Corte concertado

0 /\ 0

~

== = ~

=

\ I {.Avanza la recombinaci6n entre attP y atti por el intercambio secuencial o el corte concertado?

diduras, lo que interfiere con el proceso de recombinacion y permite identificar las moleculas donde comenzo dicho proceso pero no ha concluido. Las estructuras de estos productos intermedios sugiere:c que pueden ocurrir intercambios de cadenas unica de manera secuencial. El modelo ilustrado en .Ia muestra que si los sitios attP y attB son cada uno asiento de la misma escision escalonada, podrfan disponerse de los extremos complementarios de una sola cadena para hibridacion cruzada. La distancia entre lo~ puntas de entrecruzamiento A es de 7 bp, y !a reaccion genera extremos 3'- fosfato y 5'-0H. La reaccion se muestra, para fines de simplicidad, como generadora de superposicion de extremos de una soJa cadena que se hibridan, pero que en realidad ocurre por un proceso similar ala recombinacion ilustrada en la Figura 19.6. Las cadenas correspondientes de cada estructura duplex se conan en Ia misma posicion, se intercambian los extremos 3' libres entre cadenas duplex, Ia rama emigra una distancia de 7 bp a lo largo de la region de homologfa y, despues Ia estructura se resuelve con el corte del otro par de cadenas correspondientes.

La recombinaci6n especifica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa Conceptos principales • Las integrasas tienen relaci6n con las topoisomerasas y la reacci6n de recombinaci6n se parece a la acci6n de la topoisomerasa, excepto que las cadenas con hendidura de estructuras duplex diferentes se sellan juntas.

La recombinac1on especitica de sitio pued

Los DNA de fago y bacteriano se alinean

arse como rotura y reunion escat~

Las escisiones escalonadas llevan a un apareamiento cruzado

DNA de !ago

GCTTTTTTATACTA C G A A A A A A T AT G A TT

GCTTTTTT A T A CT AA

CGAAAAAATATGA DNA bacteriano

Las uniones recombinantes se sellan para generar un DNA de profago integrado .:r--~--- G C T T T T T TAT AC T A A

CGAAAAAATAT GA

,u Las escisiones escalonadas en la secuencia central comun de attP y attB permiten la reunion cruzada para generar uniones recombinantes rec\procas.

• La reacci6n conserva la energ\a al utilizar una tirosina catal\tica en la enzima para romper un enlace fosfodiester y enlazarse con el extrema 3' rota. • Dos unidades enzimaticas se unen a cada sitio de recombinaci6n y los dos d\meros hacen sinapsis para formar un complejo do11de ocurren las reacciones de transferencia.

Las integrasas utilizan un mecanismo similar al de las topoisomerasas de tipo I, donde se hace una rotura en una cadena de DNA a la vez. La diferencia es que la recombinasa vuelve a unir los extremos en forma cruzada, en tanto la topoisomerasa realiza la rotura, manipula los extremos y despues vuelve a unir los extremos originales. El principio basico del sistema es que se requieren cuatro moleculas de la recombinasa para cortar cada una de las cuatro cadenas de las dos duplex que estan recombinandose. La F muestra la naturaleza de Ia reaccion catalizada por una integrasa. La enzima es una protefna monomerica que tiene un sitio activo capaz de cortar y ligar el DNA. La reaccion comprende el ataque de una tirosina en un enlace fosfodie ster. El extrema 3' de la cadena de DNA se enlaza mediante una union fosfodiester con una tirosina en la enzima, lo que deja un extremo 5' hidroxilo libre. Dos unidades enzimaticas se unen a cada uno de los sitios de recombinacion. En ellos, solo una de

las unidades ataca al DNA. La simetrfa del sistema asegura que se rompan las cadenas complementarias en cada sitio de recombinacion. El extremo 5' -OH en cada sitio ataca al enlace 3' -fosfotirosina en el otro sitio, lo que genera una union Hollida y. La estructura se resuelve cuando las otras dos unidades enzimaticas (que no habfan participado en el primer ciclo de rotura y reunion) actuan sobre otro par de cadenas complementarias. Las interacciones sucesivas lo gran un intercambia conservador de cadenas, donde no hay deleciones o adiciones de nucleotidos en el sitio de intercambio y tampoco se necesita un aporte de energfa. El enlace 3' fosfotirosina transitorio entre Ia protefna y el DNA conserva la energfa del enlace fosfodiester rota. La muestra la reaccion intermedia con base en la estructura cristalina. (Fue posible el atrapamiento del producto intermedio mediante un "sustrato suicida ", que consta de una cadena duplex de DNA sintetica donde falta un enlace fosfodiester, de manera que el ataque de la enzima no genera un extrema 5'-0H libre). La estructura del complejo Cre-lox muestra dos moleculas de Cre, cada una unida por una longitud de 15 bp al DNA. El DNA es doblado casi 100° en el centro de simetrfa. Dos de esos complejos se ensamblan en forma antiparalela para constituir una estructura de protefna tetramerica unida a dos moleculas de DNA en la sinapsis. El intercambio de cadenas tiene Iugar en

19. 18 La recombinaci6n espec\fica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa

485

1. Dos subunidades enzimaticas se unen a cada DNA duplex . _..-Tir 5'o=:(

3"""'~

5' 1

-- 3'

);;;;;;;.~~

5'

Tif

......--Tir

- 3' 5'

3'

2. Cada cadena deble se escinde en una cadena para generar un enlace P-Ti r y un extreme -OH HO

.,.- Tir

,r-

5' . 3~

3' 5'

Tir

OH

3' - 5'

3. Cada hidroxilo ataca el enlace Tir-fesfate en Ia

otra cadena doble 3' 5'

5' 3'

Tir

-

3' 5'

4. Las reacciones se repiten en las otras subunidades para unir las otras cadenas 5' 3-=-

Tir

r Tir ,.-Tir

5' I 3'4

_,..~

Tir

- 3' = 5' 3' 5'

Las integrasas catalizan la recombinaci6n por un mecanismo similar al de las topoisomerasas. Se hacen cortes escalonados en el DNA y el extrema 3' fosfato se enlaza de manera covalente con una tirosina en la enzima. El grupo hidroxilo libre de cad a cadena ataca, entonces, el enlace P- Tir de la otra cadena. El primer intercambio que se muestra en la figura genera una estructura Holliday. La estructura se resuelve cuando se repite el proceso con el otro par de cadenas.

una cavidad central de Ia estructura de Ia proteina que contiene las seis bases centrales de Ia region de entrecruzamiento. La tirosina que se encarga de escindir el DNA en cualquier sitio mitad particular es provista por Ia subunidad enzimatica que se une a dicho sitio. Este es elllamado corte en configuracion cis, valido tambien para Ia integrasa Int y Ia recombinasa XerD. No obstante, Ia recombinasa FLP produce escision en configuracion trans, Io que implica un mecanismo donde la subunidad enzimatica que proporciona la tirosina no corresponde a la subunidad unida a ese sitio mitad, sino mas bien se trata de una de las otras subunidades. 486


Un complejo de recombinaci6n en sinapsis de loxA tiene un tetramero de recombinasas Cre, con un mon6mero de enzimas unido en cada sitio mitad. Dos de los cuatro sitios actives estan en usa y actuan sabre cadenas complementarias de los dos sitios de DNA.

111m

La recombinaci6n A ocurre en un intasoma

Conceptos principales • La integraci6n A. tiene lugar en un gran complejo que tambien incluye a la proteina IHF del hospedador. • La reacci6n de escisi6n requiere Int y Xis y reconoce los extremes de DNA del profago como sustratos.

A diferencia del sistema de recombinacion Cre!lox que requiere solo la enzima y los dos sitios de recombinacion, Ia recombinacion del fa go 'A ocurre en una gran estructura y tiene diferentes componentes para cada direccion de la reaccion (integracion versus escision) . Se requiere una proteina del hospedador llamada IHF para la integracion y escision. La IHF es una protefna de 20 kD con dos subunidades diferentes que son codificadas por los genes himA y himD. La IHF no es una protefna esencial en E. coli y no se requiere para la recombinacion bacteriana hom6loga. Es una de las varias protefnas con capacidad de cubrir con DNA una superficie . las mutaciones en los genes him impiden la recombinacion lc espedfica de sitio y pueden suprimirse con mutaciones en 'Aint, lo que sugiere que IHF e Int interactuan. Se puede lograr la recombinacion espedfica de sitio por Int y IHF in vitro. La reaccion in vitro requiere superenrrollamiento en attP, no asf en attB . Cuando se realiza Ia reaccion in vitro entre dos moleculas de DNA superenrollado, casi todo el superenrollamiento se conserve. en los productos. Asi, no puede h aber productos

~

CAGCTTTTTTTATACTAAGTTG GTCGAAAAAAATATGATICAAC

t Sitio de union de lnt

Sitio de union de lnt

La Int y la IHF se unen a diferentes sitios en

attP. Las secuencias de reconocimiento de Int en la region central incluyen los sitios de corte.

intermedios Jibres donde podria haber rotacion de las cadenas. Este fue uno de los primeros indicios de que Ia reaccion prosigue a traves de una union Holliday. Hoy se sabe que las reacciones proceden por el mecanismo habitual de esta clase de enzimas, el cual tiene relacion con el mecanismo de Ia topoisomerasa I (vease la seccion l 9 .18, La recombinacion especifica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa). La Int tiene dos diferentes modos de union. El dominio terminal C actua como Ia recombinasa Cre. Se une a sitios invertidos en la secuencia central y se coloca para realizar las reacciones de escision y ligadura de cada cadena en las posiciones ilustra. El dominio terminal N se une das en Ia ~ a sitios en los brazos de attP que tienen una diferente secuencia de consenso. Esta union se encarga de la agregacion de subunidades al intasoma. Es probable que los dos dominios se unan de manera simultanea a! DNA, lo que acerca los brazos de attP a Ia porcion central. La IHF une las secuencias de -20 bp en attP. Los sitios de union estan cercanos a aquellos donde se adhiere Int. Xis se une a dos sitios cercanos entre si en attP, de manera que la region protegida se extiende sobre 30 a 40 bp. Juntos, Int, Xis e IHF cubren casi todo el attP. La union de Xis cambia la organizacion del DNA, de manera que se torna inerte como sustrato para Ia reaccion de integracion. Cuando Int e IHF se unen a attP generan un complejo donde todos los sitios de union se llevan juntos hacia la superficie de una proteina. Se requiere superenrollamiento de attP para la formacion de este intasoma. Los unicos sitios de union en attB son los dos Int en Ia parte central. No obstante, Int no se une de manera directa a attB en forma de DNA libre. El intasoma es el intermediario que

Multiples capias de la prote1na Int pueden organizar a attP en un intasoma, el cual inicia la recombinaci6n especlfica de sitio al reconocer attB en el DNA libre.

captura a attB, como se indica esquematicamente en Ia De acuerdo con este modelo, el reconocimiento inicial entre attP y attB no depende de manera directa de la homologia del DNA, sino que en su lugar, esta determinada porIa capacidad de las proteinas Int de reconocer ambas secuencias att. Los dos sitios att se unen, entonces, en una orientacion predeterminada por la estructura del intasoma. La homologia de secuencia se vuelve importante en esta etapa, cuando se requiere para Ia reaccion de intercambio de cadenas. La asimetria de las reacciones de integracion y escision se muestra por el hecho de que Int puede formar un complejo similar con attR solo si se agrega Xis. Este complejo puede aparearse con un complejo condensado que Int forma en attL. No se necesita IHF para esa reaccion. Una diferencia significativa entre las reacciones de integracion/escision A- y de recombinacion catalizadas por Cre o Flp es que las reacciones catalizadas por Int unen las secuencias reguladoras en los brazos de los sitios diana, doblando el DNA y permitiendo interacciones entre los sitios brazo y central, que !levan cada reaccion a su conclusion. Es por esto que cada reacci6n A- es irreversible, en tanto la recombinaci6n catalizada 19.19 La recombinaci6n A ocurre en un intasoma

487

por Cre o Flp es reversible. Las estructuras cristalin as de los tetrameros A.-Int muestran que, al igual que otras recombinasas, el tetramero tiene dos subunidades activas y dos inactivas que cambian sus funciones durante Ia recombinacion. Las interacciones alostericas desencadenadas porIa union al brazo controlan las transiciones estructurales e n el tetramero que impulsan Ia reaccion. Gran parte de Ia complejidad de Ia recombinacion especifica de sitio puede deberse a Ia necesidad de regular Ia reaccion, de manera que Ia integracion ocurra de manera preferente cuando un virus ingresa al estado lisogenico, en tanto se prefiere Ia escision cuando el profago esta entrando al sitio litico. Mediante el control de las cantidades de lnt y Xis, ocurrira la reaccion apropiada.

IE

Las levaduras pueden cambiar loci si lentes y activos por el tipo de apareamiento

Conceptos principales • Ellocus MAT del tipo de apareamiento en levaduras porta el genotipo MATa o MATa. • Las levaduras con el alelo dominante HO cam bian su tipo de apareamiento con una frecuencia de -10- 6 • • El alelo en MAT se denomina cartucho activo. • Hay tam bien dos cartuchos silentes, -HMLa y HMRa. • Ocurre cambia si MATa es sustituido por HMLa o MATa es sustituido por HMRa.

La levadura S. cerevisiae puede propagarse en esta do haploide o diploide . La conversion entre esos estados ocurre por apareamiento (fu sion de celulas haploides para formar una diploide) y esporulacion (meiosis de diploides para producir esporas haploides). La posibilidad de participar en estas actividades la determina el tipo de apareamiento de Ia cepa, que puede ser a o a . Las celulas haploides de tipo a pueden aparearse solo con las celulas haploides de tipo a para generar celulas diploides de tipo a / a. Las celulas diploides pueden pres en tar esporulacion para regenerar esporas haploides de cualquiera de esos tipos. La condu cta de apa reamienro esta determinada por Ia informacion genetica presente en e llocus MAT. Las celulas que portan el alelo MA Ta en este locus son de tipo a; de manera similar, las celulas que portan el alelo lVlATa son de tipo a. El reconocimiento entre celulas con un tipo de apareamiento opuesto se logra mediante Ia secrecion de fe romonas: las celulas a secretan el factor polipeptido pequefi.o a; las celu las a secretan e l factor a. Una celula de un tipo de apareamiento porta un receptor de superficie para la feromo na del tipo opuesto.

488


Cuando una cetula a y una celula a se encuentran. sus feromonas actuan en sus receptores para detener a las celulas en Ia fase G l del ciclo celular y surgen varios cambios m orfologicos. Cuan do el apareamiento se logra, a Ia detencion del ciclo celular le sigue Ia fusion ce lular y nuclear para producir una celula diploide a /a. El apareamiento es un proceso simetrico que se inicia con la interaccion de feromonas secretadas por un tipo celular con el receptor que porta el otro tipo celular. Los unicos genes que se requieren de manera exclusiva para Ia via de respuesta en un tipo de apareamiento particular son los que codifican los receptores. La interaccion factor a-recepto o factor a-receptor activa Ia misma via de respuesta. Las mutaciones que eliminan pasos en Ia via comU.n tienen los mismos efectos en ambos tipos celulares. La vfa consta de una cascada de transduccion de seiial que conduce a Ia sfntesis de produ ctos que hacen los cambios necesarios en Ia morfologfa celular y la expresio n genica para que tenga Iugar el apareamiento. Gran parte de Ia informacion acerca de la via del tipo de apareamiento en las levaduras se deduno a partir de las propiedades de las mutaciones que eliminan Ia capacidad de las celulas a , a, o ambas. de aparearse. Los genes identificados portales mutaciones se lla man STE (por esteril ). Las mutacione~ en los genes para las feromonas o los receptores son especificas de los tipos de apareamiento individuales, en tanto las mutaciones en los otros genes STE eliminan el apareamiento en ambas celulas, a y a. Esta situacio n se exp lica por el hecho de que lo episodios que siguen a Ia interaccio n del factor con el receptor son identicos para ambos tipos. Algunas cepas de levaduras tienen Ia capacidad notoria de cambiar los tipos de apareamiento. Esta cepas portan un alelo HO dominante y cambian con frecuencia su tipo de apareamiento, hasta una vez en cada generacion. Las cepas con el alelo recesivo HO tienen un tipo de apareamiento estable qu e esra suj eto a cambios con una frecuencia de - l0-6 . La presencia de HO hace que cambie el genotipo de la poblacion de levaduras. Sin importar el tipo inicial de apareamiento, en unas cuantas generacio nes hay un gran n{Imero de celulas con ambos tipos de apareamiento, que conducen a Ia formacio n de diploides MA Ta/MA Ta que constituyen la poblacion. La produ ccion de diploides estables a partir de una poblacion haploide puede considerarse Ia razon de ser del cambio. La existencia del cambio sugiere que todas las celulas tienen Ia informacion potencial n ecesaria para ser MATa o MATa, pero expresan solo un tipo. (.De donde procede Ia informacion para cambiar los tipos de apareamiento? Se necesitan dos loci para

=I cambio. Se requiere HMLa para el cambio que ..:.a Iugar al tipo MATa; se necesita HM Ra para el ~ambio que origina el tipo MATa. Estos loci yacen ::n el mismo cromosoma que porta M AT. El HM L --sta bastante a Ia izquierda, el HM R esta bastante =. Ia derecha. El modelo de cartucho para el tipo de aparea- ·ento se ilustra en Ia " . Propone que _'.fAT tiene un cartucho activo para los tipos a o a . mbos, HML y HMR, tienen cartuchos silentes. En 5eneraL HML porta un cartucho a , en tanto HMR . orta uno a. Todos los cartuchos contienen infor::~aci6n que codifica el tipo de apareamiento, pero el :artucho activo solo se expresa en MA T. El cambio .e tipo de apareamiento tiene Iugar cuando el car:xho activo es sustituido porIa informacion de un :artucho silente. Entonces, se expresa el cartucho :_ue acaba de instalarse. El cambio no es recfproco; la copia en HML o .i MR sustituye al alelo en MA T. Esto se sa be porque -e pierde una mutaci6n en MA T de manera permaente cuando es sustituida por un cambio; no se !1tercambia con Ia copia que Ia sustituye. Si Ia copia silente presente en HML o HMR tiene _ utaci6n, el cambio introduce un alelo mutante en :I locus MAT. La copia mutante en HM L o HMR per- anece durante un numero indefinido de cambios. ..::omo en Ia transposici6n replicativa, el elememo :ionador genera una nueva copia en el sito receptor mientras se mantiene a sf mismo intacto. El cambio del tipo de apareamiento es un su:eso dirigido, donde hay un solo receptor (MAT) IO dos donadores potenciales (HM L y HM R). El :ambio suele comprender Ia sustituci6n de MA Ta ?Qr Ia co pia de HMLa o Ia de MA Ta. por Ia co pia de .i_A1.Ra. En 80 a 90% de los cambios, el alelo MAT : s sustituido por uno del tipo contrario, lo que esta ]eterminado por el fenotipo de las celulas. Las ce.CI!as con un fenotipo a eligen de manera preferente ~ HML como donador; las celulas con el fenotipo a . refieren elegir a HMR. Varios grupos de genes participan en el establei miemo y cambia de tipo de apareamiento. Ade2las de los genes que determinan de manera directa , I tipo de apareamiento, incluyen los indispensables ?ara reprimir cartuchos silentes, cambiar el tipo de .;pareamiento o ejecutar las funciones involucradas ~ n el apareamiento. Cuando se comparan las secuencias de los car:-Ichos silentes (MHLa y HMRa) con las de los dos :::pos de cartucho activo (MATa y MATa) , se pueen definir las secuencias que determinan el tipo ]e apareamiento . En Ia . se resume Ia rganizacion de los loci del tipo de apareamiento. .:ada cartucho contiene secuencias en comtm qu e :_anquean una region central que difiere en los tipos

Cartucho silente Cartucho activo Cartucho silente

HMLet.

MATa Frecuente

t

Ocurre cambio del tipo de apareamiento cuando un cartucho u sustituye a un cartucho a

! HMLa

HMRa

MATa

HMRa

t

Frecuente Ocurre cambio del tipo de apareamiento cuando un cartucho a sustituye a un cartucho a

! -

HMLa

MATa

t

-

Raro No ocurre ningun cambio del tipo de apareamiento cuando un cartucho del mismo tipo sustituye al cartucho activo

! - -HMLa

HMRa

HMRa

MATa

-

Ocurren cambios en el tipo de apareamiento cuando cartuchos silentes sustituyen a cartuchos activos de genotipo opuesto; cuando ocurren transposiciones entre cartuchos iguales, el tipo de apareamiento se mantiene inalterado.

Los cartuchos inactives no sintetizan RNA

Ya

HMLa

Ya

HMRa

Los cartuchos actives sintetizan productos especificos del tipo de apareamiento

RNAm a.2

RNAm a1

Ya

MATa

RNAm a1

500

1000

1500

2000

bp

Los cartuchos silentes tienen las mismas secuencias que los cartuchos activos correspondie ntes, excepto par la ausencia de las secuencias de flanco ext remas en HMRa. So lo la region Y cambia entre los tipos a y a.

19.20 Las levaduras pueden cambiar loci silentes y activos por el tipo de apareamiento

489

a y a (llamados Ya o Ya). A cada !ado de esta region, las secuencias flanqueadoras son casi identicas, aunque mas cortas en HMR. El cartucho activo en MAT se transcribe desde un promotor en la region Y.

1&1

Ellocus MAT codifica proteinas reguladoras

Conceptos principales • En celulas haploides de tipo a, el MATa activa los genes requeridos para especificar las funciones a indispensables para el apareamiento y desactiva los genes requeridos para el tipo de apareamiento a. • En las celulas de tipo a, no se requiere MATa. • En celulas diploides, los productos de al y a2 cooperan para reprimir genes especificos de celulas haploides.

La funcion basica del locus MATes controlar !a expresion de los genes de feromonas y receptores, asf como otras funciones comprendidas en el apareamiento. El MA Ta codifica dos protefnas, al y a2. El MATa codifica una sola protefna, al. Las protefnas a y a controlan- de manera directa Ia transcripcion de varios genes diana; actuan por regulacion positiva y negativa. Lo hacen de manera independiente en las cetulas haploides y de manera conjunta en las diploides. Sus interacciones se resumen en el cuadro del !ado derecho en !a , en terminos de tres grupos de genes diana: • Los genes especfficos a se expresan de rnanera constitutiva en celulas a; estan reprimidos en las celulas a. Los genes especfficos Wlifir.IillJ . ' .

a incluyen el gen estructural del factor a STE2, que codifica el receptor del factor Asf, el fenotipo a se vincula con la disp ~ cion para reconocer Ia feromona produ -.:... por el tipo de apareamiento opuesto. • Las funciones espedficas a se inducen ~ celulas a, pero no se expresan en las ce!U:.: a. Incluyen el gen estructural del facto::y el gen del receptor del factor a, STE3. :::_ nuevo, la expresion de Ia feromona de :...tipo se vincula con la expresion del recep: . de la feromona del tipo contrario. • Las funciones haploides especfficas incluy _ los genes indispensables para Ia transcr:~ cion de Ia feromona y los genes receptorc el gen HOque participa en el cambio y RN.::. un represor de la esporulacion. Se expres-= de man era constitutiva en ambos tipos ::_celulas haploides, pero estan reprimidas c· las diploides a /a. Como resultado, las fu; ciones especfficas a y a tambien se mam:~ nen sin expresion en celulas diploides. Ahora se revisaran las funciones de los regu:~ dores y sus dianas desde la perspectiva de las fu:::ciones de MAT expresadas en celulas de levadur.:._ haploides y diploides, como se sefiala en el esquer:-, dellado izquierdo de Ia Figura 19.35. Los tipos ~ apareamiento a y a son regulados por diferen C" mecanismos: • En celulas haploides a, las funciones c _ apareamiento se expresan de manera con-'titutiva. Las funciones de los productos -MATa en la celula a (silas hay) se desconc¥r.Til i illii.O jj tTij ~

'

genes a

riliiiill

genes a funciones haploides

Se desconocen sus lunciones

t !

HMLa

t

Q)

"0

c

-o

-~

c. Q)

Q)

"0

c '() ·;;; ~

c. Q)

t

~

HMLo: o:1

t

9;

(I)

Reprime a1 genes especilicos a 2 haploides

Cl:

..,_J a.

diploide no expresado

no expresado

reprimido

inducido

constitutivas

0:

~

HMLo:

Induce funciones de apareamiento

constitutivas

HMRa ~.-

MATa

Cl:

cr.;

a constitutivo no expresado haploide

HMRa

L....

a2 a reprimido haploide Rep rime funciones de apareamieoto a.

En las celulas diploides las proteinas al y a2 colaboran para reprimir las funciones espec\ficas haploides. En las celulas haploides a las funciones de apareamiento son constitutivas. En las haploides a, la proteina a2 reprime funciones de apareamiento a, en tanto que la proteina al induce funciones de apareamiento a.

490


cen. Pueden requerirse solo para reprimir las funciones de celulas haploides en las celulas diploides. • En las celulas haploides a , el producto a1 activa genes especfficos a cuyos productos son necesarios para el apareamiento de tipo a. El producto a2 reprime los genes encargados de producir el tipo de apareamiento a mediante Ia union a una secuencia de operador localizada en sentido ascendente respecto de los genes diana. • En celulas diploides, los productos al y a2 cooperan para reprimir genes haploides espedficos. Se combinan para reconocer una secuencia de operador diferente de Ia diana para solo a2. La posibilidad de que las protefnas a2, al y a1 regulen la transcripcion depende de algunas interacciones interesantes de las protefnas entre sf y con otras. El patron del control genico en las celulas a , a y diploides se resume en Ia Una protefna llamada factor de transcripcion del receptor de feromonas (PRTF) (que es inespecffica del tipo de apareamiento) participa en muchas de estas interacciones. La PRTF se une a una secuencia de consenso corta Hamada caja P. La funcion de PRTF en Ia regulacion genica puede ser bastante amplia, ya que se encuentran cajas P en una diversidad de ubicaciones. En algunos de estos sitios se requiere una caja P para activar a! gen; en otros

loci, se necesita PRTF para Ia represion. Sus efectos pueden, por tanto, depender de otras protefnas que se unen en sitios cercanos a Ia caja P. Solo PRTF puede activar los genes espedficos de a, lo que es adecuado para asegurar su expresion en una celula haploide a. Los genes espedficos a se reprimen en una celula a haploide por la accion combinada de la protefna a2 y PRTF. La protefna a2 contiene dos dominios. El dominio terminal C se une a elementos palindromicos cortos en los extremos de una secuencia de consenso operador de 32 bp. Sin embargo, la union de este fragmento al DNA no causa represion. El dominio terminal N se necesita para la represion y se encarga de hacer o con PRTF. El sitio de union para PRTF es una caja P en el centro del operador. De hecho, a y PRTF se unen de manera colaboradora al operador. La expresion de genes a espedficos requiere otra pequefia protefna llamada activador a1, que tiene 175 arninoacidos de longitud. Las secuencias que actuan en configuracion cis, que confiere transcripcion a espedfica, tienen 26 bp de longitud y pueden dividirse en dos partes. Las primeras 16 bp forman Ia caja P, donde se une PRTF; Ia secuencia adyacente de 10 bp forma el sitio de union para al. El factor al se une solo cuando PRTF esta presente para unirse a Ia caja P. Ninguna protefna sola puede unirse a su caja blanco, pero juntas se pueden unir a! DNA, a! parecer como resultado de interacciones entre protefnas.

genes a especfficos

haploide a

genes u especfficos

PRTF activa a los genes de manera constitutiva

___..

.

Genes desactivados: PRTF no puede unirse sin a1 1 PRTF

PRTF PRTF CCATGTAATTACCCAAAAAGGAAATTTACATGG

u2 + PRTF reprimen genes especfficos a N .N

TTTCCTAATTAGTNCNTCAATGNCAG

u1 + PRTF activan genes diana

haploide u u2

c

PRTF PRTF.

c

CCATGTAATTACCCAAAAAGGAAATTTACATGG

. PRTF · PRTF

u1

TTTCCTAATTAGTNCNTCAATGNCAG

Ct2 + a1 reprimen genes haploides especfficos

diploide ala

1 Las combinaciones de PRTF, al, a1 y u2, activan o repri men grupos especificos de genes que corresponden al tipo de apareamiento de la celula.

19.21 Ellocus MAT codifica prote\nas reguladoras

491

Los genes especfficos a se desactivan en forma predeterminada en celulas haploides a porque en ausencia de Ia protefna a2, el PRTF no puede unirse para activarlos. La protefna a2 puede tambien colaborar con la protefna al. La combinacion de estas proteinas reconoce a un operador diferente. El operador comparte las secuencias palindromicas externas, y solo a2 reconoce la secuencia, pero es mas corto porque la secuencia entre ellas es diferente. La combinacion alla2 reprime los genes con este segmento en las celulas diploides. La principal reflexion que se deriva de estos resultados es que el fenotipo de cada tipo de celula (a o a haploide, o a la diploide) esta determinado por Ia combinacion de proteinas a y a que se expresan. Un aspecto es Ia distincion entre los fenotipos haploide y diploide; otro es Ia distincion entre los fenotipos a y a haploide. Este ultimo se extiende a Ia expresi6n de los genes correspondientes al tipo de apareamiento apropiado y Ia determinacion de Ia direccion del cambia de tipo de apareamiento (vease Ia Figura 19.33). Las celulas MATa activan un potenciador de recombinacion en el brazo izquierdo del cromosoma III, lo que aumenta Ia recombinacion sabre una region de 40 kb que incluye HML. Las celulas MATa desactivan el extrema izquierdo del cromosoma III.

IE

Se reprimen los cartuchos silentes en HML y HMR

Conceptos principales • Los elementos silenciadores reprimen HML y HMR. • Los loci requeridos para mantener el silenciamiento incluyen SIRl-4, RAPl y los genes de la histona H4 . • Se necesita la union de ORC (complejo de reconocimiento del origen) a los silenciadores para la desactivaci6n.

El mapa de transcripcion en el Figura 19.34 revela una caracteristica intrigante: Ia transcripcion de MATa o MATa se inicia dentro de Ia region Y. Solo ellocus MAT se expresa; sin embargo, Ia misma region Yesta presente en el cartucho correspondiente no transcrito (HML o HMR), lo que implica que la regulacion de la expresion no se acompafia del reconocimiento directo de algun sitio superpuesto al promotor. Un sitio fuera de los cartuchos debe distinguir HMLyHMRdeMAT.

El analisis de delecion muestra que se necesitan los sitios a cada lado de HML y HMR para detener su expresion y se Haman silenciadores. Los sitios del lado izquierdo de cada cartucho se Haman silencia-

492


dores E y los dellado derecho silenciadores I. Est . sitios de control pueden funcionar a cierta distancic (hasta 2.5 kb de un promotor) yen cualquier orientaci6n; actuan como potenciadores negativos (l : potenciadores son elementos distantes del promow :que activan Ia transcripcion; vease Ia seccion 24.! 5 Los potenciadores contienen elementos bidimensi nales que ayudan a Ia iniciacion). 2,Se puede encontrar Ia base del control de l;o actividad del cartucho si se identifican los genes que se encargan de mantener los cartuchos silentes? Se esperarfa que los productos de estos genes actuase'· sabre los silenciadores. Un analisis conveniente pare Ia mutacion en tales genes lo proporciona el hech de que cuando una mutacion permite a los cartuchos que en general estan silentes en HML y HM,-:: expresarse, se producen tanto funciones a como a de manera que las celulas actuan como diploide> MATa/MATa.

Las mutaciones en varios loci suprimen el silen ciamiento y !levan a la expresi6n de HML y HMR Los primeros en descubrirse fueron los cuatro Joe SIR (reguladores de Ia informacion si lentes [silent illformation regulators]). Los cuatro loci de SIR de tipo Silvestre son indispensables para mantener a HML :· HMR en estado de represion. La mutacion en cuaJquiera de estos loci para dar un alelo sir- tiene do_ efectos. Tanto HML como HMR se pueden transcribir, y ambos cartuchos silentes se vuelven dianas de reposicion por cambia. De este modo, el mism o episodio regulador sirve para reprimir un cartuch silente y para impedir que sea receptor de reposicion para otro cartucho. Otros loci requeridos para el silenciamiento incluyen RAPJ (que tambien se necesita para mantener Ia heterocromatina telomerica en su estad o inerte) y los genes que codifican Ia histona H4. La deleciones del extrema N de Ja histona H4 o Ia. mutaciones puntiformes individuales activan lo · cartuchos silentes. Los efectos de estas mutaciones pueden contrarrestarse con la introduccion de nuevas mutaciones en SIRJ o la sobreexpresion de SIR !. lo que sugiere que hay una interaccion especffica entre H4 y las proteinas SIR. El modelo general sugerido por estos resultado5 es que las proteinas SIR actuan sabre la estructura de Ia cromatina para prevenir Ia expresion genica. Las mutaciones en las proteinas SIR tienen los mismos efectos en los genes que se han desactivad o debido a la proximidad de Ia heterocromatina telo merica, par lo que parece probable que las protefnas SIR participen, en general, en la interaccion con las histonas para formar estructuras heterocromaticas. (inertes) (vease Ia seccion 31.3, La heterocromatina depende de interacciones con histonas).

E

Ellocus MAT receptor inicia la transposici6n unidireccional

Concepto principal

ORC se une a ars

• El cambia del tipo de apareamiento se inicia por una rotura de la doble cadena hecha en ellocus MAT por la endonucleasa HO.

l

Sir1 se une a ORC

Se logra un cambio del tipo de apareamiento con una conversion genica donde el sitio receptor (MAT) adqu iere la secuencia de tipo donador (HML o HMR). Los sitios necesarios para Ia transposicion se han identificado por mutaciones en MAT que impiden el cambio. La naturaleza unidireccional del proceso Ia indica Ia falta de mutaciones en HML o

0 El complejo de silenciamiento se une a Sir1

HMR.

F1 Sirl.

19.

El silenciamiento en HMR depende de reclutar

Hay una conexion interesante entre la represion en los silenciadores y la replicacion del DNA. Cada silenciador contiene una secuencia ARS (un origen de la replicacion). La ARS se une al ORX (complejo de reconocimiento del origen) que participa en el inicio de la replicacion. Las mutaciones en los genes ORC impiden el silenciamiento, lo que indica que se requiere la union de la protefna ORC al silenciador para el silenciamiento. Hay dos tipos diferentes de conexion entre el silenciador y el aparato de replicacion: • es necesaria la presencia de Sirl y • se requiere replicacion. Si se localiza una proteina Sirl en el silenciador (mediante el enlace con otra proteina unida ahi), ya no se requiere la union de ORC. Esto significa qu e la participacion de ORC es tan solo para llevar al interior a Sirl; nose necesita para iniciar la replicacion. Como se ilustra en la , !a funcion de ORC pudiese, por tanto, consistir en proveer un centro de inicio a partir del cual se pueda dispersar el efecto del silenciamiento. La ORC provee !a estructura ala cual se une Sirl y esta recluta, enton ces, a las otras proteinas SIR. Esto es diferente de su funcion en la replicacion . Sin embargo, el paso por la fase S es necesario para que se establezca el silenciamiento . Esto no requiere que !a iniciacion tenga Iugar en el A RS del silenciador. El efecto podrfa depender del paso de la horquilla de replicacion por el silenciador, tal vez para permitir que la estructura de Ia cromatina cambie .

Las mutaciones identifican un ciclo en ellfmite derecho de Yen 1VLAT que es crucial para el suceso de cambio. La naturaleza del limite se demuestra cuando se analizan las localizaciones de estas mutaciones puntiformes con relacion a! sitio de cambio (lo que se hace revisando los resultados de los cambios muy poco frecuentes que ocurren a pesar de la mutacion). Algunas mutaciones yacen dentro de Ia region que es sustituida (y, por tanto, desaparecen de MAT despues de un cambio), en tanto que otras yacen apenas afuera de la region sustituida (y, por tanto, continuan impidiendo el cambio). De este modo, se necesitan secuencias dentro y fuera de la region sustituida para el episodio de cambio. El cambio se inicia con una rotura de la doble cadena cerca del limite Y-Z, que coincide con un sitio que es sensible al ataque por una desoxirribonucleasa (una caracterfstica com{m de los sitios cromosomicos que participan en el inicio de Ia transcripcion o recombinacion). Se reconoce por una endonucleasa codificada en el locus HO. La endonucleasa HO produce la rotura de doble cadena escalonada apenas por la derecha dellfmite Y. La escision genera extremos de una sola cadena de cuatro bases, que se ejemplifican en la . La nucleasa no ataca loci MAT mutantes que no pueden cambiar. El analisis de la delecion muestra que se requiere casi toda Ia secuencia de 24 bp que rodea a! sitio de union Y, o toda, para la escision in vitro . El sitio de reconocimiento es relativamente grande para una nucleasa y se presenta solo en los tres cartuchos del tipo de apareamiento. Solo ellocus MAT, no asi el HML o los loci HMR. es diana de la endonucleasa. Parece posible que los mismos mecanismos que manti enen a los cartuchos silentes sin transcribir tambien los mantengan inaccesibles a la endonucleasa HO . Tal inaccesibilidad asegura qu e el cambio sea unidireccional.

19.23 Ellocus MAT receptor inicia la trans posicion unidireccional

493

Region Y TTTCAGCTTTCCGCAACAGTATA AAAGTCGAAAGGCGTTGTCATAT

Endonucleasa HO 'tTfCAGCTTTCCGCAACA AAAGTCGAAAGGCG

L

GTATA TTGTCATAT

La endonucleasa HO escinde MAT apenas a la derecha de la region Y, lo que genera extremes pegajosos con un colgajo de cuatro bases.

Receptor MAT

~ Corte eo el limite \

___

La reaccion desencadenada por Ia escision s~ ilustra en Ia , en terminos de Ia reacci6general entre las regiones receptora y donadora. E:. terminos de las interacciones de las cadenas indi viduales de DNA. sigue el esquema de recombinc.cion a traves de una rotura de doble cadena que se incluye en Ia Figura 19.9, y las etapas siguientescorte inicial requieren las enzimas involucradas ela recombinacion general. Las mutaciones en algt:.nos de estos genes impiden el cambia. Sup6ngase que el extremo libre de MAT invaci~ el locus HML o HMR y se aparea con la region ci:: homologia en ellado derecho. La region Y de MA::se degrada hasta exponer una region con homo[ gfa en ellado izquierdo. En ese punto, una MAT = aparea con HML o HMR en ambos !ados, izquierde y derecho. La region Y de HML o HMR se copia pare. sustituir la region perdida de MAT (que podrfa extenderse y rebasar los lfmites del mismo Y). Los loc apareados se separan (el orden de los sucesos podric. ser diferente). AI igual que en el modelo de rotura de doblc cadena para la recombinacion, el proceso lo inicic. MAT, ellocus que se va a remplazar. En ese sentid la descripcion de HML y HMR como loci donadore; se refiere a su funcion finaL pero no al mecanisme del proceso. Como en la transposicion replicativa el sitio donador no se afecta, pero ocurre un cambic de secuencia en el receptor. A diferencia de la transposicion, ellocus receptor sufre una sustitucion mas que una adicion de material.

IE

Apareamiento ~ .. con el donador ~

La reg ulaci6n de la expresi6n de HO contro la el cambio

Concepto principal

Degradaci6n de MAT

\

Sintesis de DNA nuevo \ El DNA receptor ha cambiado el tipo de apa~amiento

El DNA donador no cambia Se inicia la sustitucion del cartucho con una rotura de doble cadena en ellocus receptor (MAT), que puede comprender el apareamiento de cua lquier lado de la region Y con ellocus donador (HMR o HML).

494

CAPITULO 19 Recombinaci6n homologa y espec1fica de sitio

• La endonucleasa HO se sintetiza en celulas madre haploides, de manera que un episodic de cambia hace que ambas cadenas hijas tengan el nuevo tipo de apareamiento.

La produccion de la endonucleasa HO es reguladc. en el ambito de la transcripci6n genica. Hay tres sistemas de control distintos: • El HO esta bajo el control del tipo de apareamiento. No se sintetiza en celulas diploides MATa/MATa. Tal vez el motivo sea que n hay necesidad de cambia cuando ambos alelos MAT se expresan de cualquier forma. • El HOse transcribe en las celulas originates. pero no en las hijas. • La transcripcion de HO tambien responde ai ciclo celular. El gen se expresa solo al terrnino de Ia fase G l de una celula original.

La sincronizacion de la produccion de ]a nucleasa explica Ja relacion entre cambia y linaje celular. muestra que el cambio se detecta La solo en los productos de una division; ambas celulas hijas tienen el mismo tipo de apareamiento, que cambia con respecto al de la que les dio origen. El motivo es que Ia restriccion de la expresion de HO a Ia fase G l asegura que el tipo de apareamiento cambie antes de que se replique el locus MAT, con el resultado de que toda Ia progenie tiene el nuevo tipo de apareamiento. Los sitios de accion en configuracion cis que controJan la transcripcion de HO residen a l 500 bp en sentido ascendente con respecto del gen. El patron general de control consiste en que la represion en solo uno de muchos sitios que responden a varios circuitos regula do res puede impedir la transcripcion se resumen los tipos de de HO. En la sitios que participan. El control del tipo de apareamiento se asemeja al de otros genes haploides especfficos. La transcripcion Ia impide (en las celulas diploides) el represor alla2. Hay 10 sitios de union para el represor en la region en sentido ascendente, que varfan en su conformidad con respecto ala secuencia de consenso. Nose sabe cuales y cuantos de ellos se requieren para la represion haploide especifica. El control de la transcripcion de HO implica la interaccion de una serie de episodios de activacion y represion. Se requieren los genes SWII-5 para Ia transcripcion de HO. Actuan al impedir que los productos de los genes SINI-6 repriman HO. Los genes SWI se descubrieron primero como mutantes incapaces de cambiar; los genes SIN se descubrieron despues por su capacidad de liberar los bloqueos ocasionados por mutaciones particulares de SWI. Las interacciones SWI-SIN participan tanto en el control del ciclo celular como en Ia restriccion de la expresion en las celulas originales. Algunos de los genes SWI y SIN no se encargan de manera espedfica del tipo de apareamiento, sino que son reguladores globales de Ia transcripcion cuyas funciones son indispensables para la expresion de muchos loci que incluyen el complejo de remodelado de cromatina SWIISNF que contiene Swil,2,3 y los loci SINl-4, que codifican protefnas cromosomicas o cromatina en los reguladores. Su participacion en Ia expresion del tipo de apareamiento es incidental. El regulador "real" es, por tanto, Ia proteina Swi, que contrarresta el sistema de represion general de manera especffica en ellocus HO.

El control del ciclo celular es conferido por nueve capias de una secuencia octanucleotfdica llamada URS2. Una copia de la secuencia de consenso puede

~~···· ····;

Ocurre cambia en una a original, ambas hiJas / son a Las celulas no pueden camb1ar otra vez en Ia pnmera generac16n / despues del ultimo cambia Ocurre cambia en una a original, ambas hijas son a /

0

a

--

/ 'a '-. ""

'-. ""

/

0

'-. ""

00 0

0 '

a Ocurre cambia solo en las celulas originales; ambas celulas hijas tienen un nuevo tipo de apareamiento. Una celula hija debe pasar par un ciclo entero antes de co nvertirse en una celula madura y poder cambia r de nuevo.

Represi6n en diploides

Expresi6n especffica de G1 Control del ciclo celular cdc28 URS2

URS2

Represi6n especffica de hija Activador · , _ . .Swi5 . \.V \l

U

URS1

Represor· Activador Swi5 Ash1

IA>f.J

URS1

Los tres sistemas reguladores actuan sabre la transcripci6n del gen HO, la cual ocurre s6lo cuando se elimina toda represi6n.

conferir control del ciclo celular a un gen al que este unida . Un gen vinculado con esta secuencia es reprimido, excepto durante un periodo transitorio bacia el final de la fase G1. Los activadores que liberan Ia represion en URS2 son Swi4 y Swi6. Su actividad depende de Ja funcion del regulador del ciclo celular Cdc28, que ejecuta la decision que !leva a las celulas a dividirse. La diana para la expresion de la restriccion en generaciones alternas es el activador Swi5 (que antagoniza a un sistema de represion general ejercido 19.24 La regulaci6n de la expresi6n de HO controla el cambia

495

por Sin3,4). En los mutantes que carecen de estas funciones, HO se transcribe muy bien en celulas originales e hijas. Este sistema actua sobre los elementos de URSI en Ia region lejana en sentido ascendente. La SWI5 no es en sf misma el regulador de Ia especificidad de las celulas originales, pero es antagonizado por Ashlp, un represor que se acumula de manera preferente en las ce!ulas hijas a! final de la anafase. Las mutaciones en ASHl permiten a las celulas hijas cambiar el tipo de apareamiento. La lo calizacion de Ashlp depende del transporte de su RNAm desde la celula original a traves de filamentos de actina hacia la yema hija (vease la seccion 7.16, El RNAm puede localizarse de man era especifica). Su presencia impide que SWI5 active el gen HO. Actua a! unirse a muchas capias de una secuencia de consensa que se distribuyen en las regiones reguladoras URSI y URS2. Cuando la celula h.ija crece para convertirse en una celula madura, la concentracion de Ashlp se diluye y entonces es posible expresar de nuevo el gen HO.

IE

Resumen

La recombinacion comprende el intercambio fisico de partes entre las moleculas de DNA correspon dientes, lo que origina un DNA duplex donde dos regiones de origen opuesto se conectan por un segmento de DNA hfbrido (heteroduplex), en el cual una cadena es derivada de cada progenitora. Los episodios de correccion pueden ocurrir en sitios con apareamiento erroneo dentro de un DNA hfbrido. El DNA hfbrido tambien puede formarse sin que haya recombinacion entre marcadores a ambos !ados. La conversion genica tiene Iugar cuando se forma una region extensa del DNA hfbrido durante la recombinacion normal (o entre genes no alelicos en un episodio aberrante) y se corrige ala secuencia de SOlO una Cadena progenitora, en cuyo punta un gen toma la secuencia del otro. La recombinacion se inicia con una rotura de la doble cadena en el DNA, que aumenta hasta formar una brecha con un extrema de una sola cadena; el extrema de una sola cadena libre forma, entonces, un heteroduplex con Ia secuencia alelica. El DNA donde ocurre Ia rotura en realidad incorpora Ia secuencia del cromosoma que invade, de modo que el DNA de inicio se llama receptor. Los puntas calientes para Ia recombinaci6n son sitios donde se inician roturas de doble cadena. Se determina un gradiente de Ia conversion genica porIa posibilidad de que una secuencia cercana al extrema libre se convierta en cadena unica; esto disminuye con la distancia a partir de Ia rotura.

496


La recombinacion en las levaduras la inicia Spall, una enzima similar ala topoisomerasa que se enlaza con los extremos 5' libres del DNA. La DSB se procesa, entonces, con la generacion de DNA de cadena unica que puede hibridarse con su complementaria en el otro cromosoma. Las mutaciones de las levaduras que bloquean la fo rmacion del complejo sinaptonemico muestran que se requiere recombinacion para su formacion. La formacion del complejo sinaptonemico puede iniciarse con las roturas de la doble cadena y puede persistir hasta que concluya la recombinacion. Las mutaciones en los componentes del complejo sinaptonemico bloquean su formacion, pero no impiden el apareamiento cromosomico, de manera que el reconocimiento de homologos es independiente de la recombinacion y l]a formacion del complejo sinaptonemico. Las protefnas Rec y Ruv de E. coli pueden llevar a cabo el conjunto completo de acciones requeridas para la recombinacion. La nucleasa RecBCD genera una region de una sola cadena con un extrema libre. La enzima se une al DNA en un lado de lasecuencia chi y despues se desplaza bacia la secuencia chi, desenrollando el DNA a medida que avanza. Se hace una rotura de una sola cadena en la secuencia chi. Las secuencias chi proveen puntas calientes para Ia recombinaci6n. La Cadena unica aporta un sustrato para RecA, que tiene Ia capacidad de hacer sinapsis de moleculas de DNA homologos al facilitar una reacci6n donde una cadena unica de una molecula invade a una duplex de Ia otra molecula. Se forma DNA heteroduplex por desplazamiento de una de las cadenas originales de la duplex. Esta acciones crean una union de recombinacion que resuelven las protefnas Ruv. Las RuvA y RuvB actuan en una heteroduplex y RuvC escinde las unione Holliday. La recombinacion, a semejanza de la replicacion y (tal vez) de Ia transcripcion, requiere manipulacion topologica del DNA. Las topoisomerasas pueden relaj ar (o introducir) superhelices en el DNA y son indispensables para desenmarafiar las molecuIas de DNA que se han encadenado por recombinacion o replicaci6n. Las topoisomerasas de tipo I causan una rotura en una cadena del DNA duplex: las topoisomerasas de tipo II hacen roturas de dos cadenas. La enzima se enlaza con el DNA por una union de Ia tirosina al extrema 5' fosfato (enzimas de tipo A) o al extrema de 3' fosfato (enzimas de tipo B). Las enzimas involucradas en la recombinacio _ especffica de sitio tienen acciones relacionadas co las de las topoisomerasas. En esta clase general de recombinasas, aquellas dedicadas a la integracioc de fagos forman la subclase de integrasas. El sistema

Crellox utiliza dos moleculas de Cre para unirse a ada sitio lox, de manera que el complejo recombi-

nante es un tetramero. Este es uno de los sistemas estandar para insertar el DNA en un genoma extra no. La integra cion del fago 'A req uiere las protefnas Int del fago y la IHF del hospedador e implica una rotura y reunion precisas en au sencia de sfntesis de DNA. La reaccion implica envolver con Ia secuencia attP del DNA del fago la estructura de nucleoprorefna del intasoma, que contiene varias copias de Int e IHF; se une, entonces, la secuen cia attB del hospedador y ocun.:: la recombinaci6n. La reacci6n en direccion inversa requiere la protefna Xis del fago. Algunas integrasas funcionan por escision en configuracion cis, donde una tirosina que reacciona con el DNA en un sitio mitad es provista por la subunidad de enzima u nida a ese sitio mitad; otras funcionan por escisi6n en configuraci6n trans, para lo que una subunidad protefnica diferente provee la tirosina. La levadura S. cerevisiae puede propagarse en es tado h aploide o diploide. La conversion entre estos estados ocurre por apareamiento (fusion de celulas haploides para producir una diploide) y esporulaci6n (Ia meiosis de celulas diploides para dar esporas haploides). La posibilidad de participar en estas actividades la determina el tipo de apareamiento de la cepa. El tipo de apareamiento lo determina la secuencia del locus MAT y puede cambiar por un episodio de recombinacion, que sustituye una secuencia diferente en este locu s. El suceso de recombinaci6n se inicia con una rotura de la doble cadena, como un suceso de recombinaci6n hom6loga, pero lu ego los pasos subsecuentes aseguran una reposicion unidireccional de la secuencia en el locus MAT. La reposici6n es regulada de man era que MA Ta suele ser sustituida por la secuencia de HMLa, en tanto MATa suele ser sustituida por la secuencia de HMRa. La endonucleasa HO desencadena Ia reaccion cuando reconoce un sitio diana unico en MAT. La HOes regulada en el ambito de Ia transcripcion por UD Sistema que asegura SU expresion en celulas originales pero no en sus hijas, con Ia consecuencia de que toda la progenie tiene el mismo tipo de apa reamiento (nuevo).

Referencias

IIIJ

Las roturas de la doble cadena inician la recombinacion

Articulo de investigacion Hunter, N. and Kleckner, N. (2001 ). The single-end invasion: an asymmetric intermediate at the double-

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a

Los cromosomas en recombinacion se conectan por el complejo sinaptonemico

Articulos de i nvestigacion Blat, Y, and Kleckner, N. (1999 ). Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome ill, with differe ntial regulation along arms versus the central region. Cell 98, 249-259. Dong, H. and Roeder. G. S. (2000). Organization of the yeast Zip 1 protein within the central region of the synaptonemal complex. J. Cell Bioi. 148, 417- 426. Klein, F. et al. ( 1999). A central role for coh esins in sister chromatid cohesion. forma ti on of axial elements. and recomb ination during yeast meiosis . Ce/198, 91 - 103 . Sym, M ., Engebrecht, J. A., and Roeder, G. S. ( 1993). ZIP1 is a synaptonemal complex protein requi red for meiotic chromosome synapsis . Ce/!72, 365- 378. Articulos de revision Roeder, G. S. ( 1997). Meiotic chromosomes: it takes two to tango. Genes Dev. ll, 2600-2621. Zic kler. D. and Kleckner, N. (1999). Meiotic chromosomes: integrating struct ure and fu nction. Annu. Rev. Genet. 33, 603-754.

IJill

El complejo sinaptonemico se forma despues de las roturas de la doble cadena

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IJill

Las secuencias chi estimulan e l sistema RecBCD bacteria no

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Las prote\nas de transferencia de cadenas catalizan la asimilaci6n de una sola cadena Artk ulos de revision Kowalczykowsk.L S. C., Dixon, D. A., Eggleston, A. K., Lauder, S.D., and Rehrauer, W. M. (1994). Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli. Microbial. Rev. 58, 40I-465. Kowalczykowski, S. C. and Eggleston, A. K. ( 1994). Homologous pairing and DNA strand-exchange proteins. Annu. Rev. Biochem. 63, 991-1043. Lusetti, S. L. and Cox, M. M. (2002). The bacterial RecA protein and the recombinational DNA repair of stalled replication forks. Annu. Rev. Biochem. 71, 71-100.

IE

El sistema Ruv resuelve las uniones Holliday

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Las topoisomerasas rompen y resellan cadenas

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am

La recombinaci6n A. ocurre en un intasoma

Artkulos de revision

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IIIIJ

Las topoisomerasas relajan o introducen superhelices en el DNA

.j),rt\culos de revision Champoux, J. J . (200 l). DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annu. Rev. Biochem. 70, 369-413. Wang, J. C. (2002). Cellular roles of DNA topoisomerases : a molecular perspective. Nat. Rev. Mol. Cell Bioi. 3, 430-440.

498

am

CAPiTULO 19 Recombinaci6n hom6loga y especifica de sitio

·stemas de reparaci6n ESQUEMA DEL CAPITULO ) (codificada por dinB) pueden sintetizar un complemento de la cadena danada. • El DNA sintetizado par la polimerasa de reparaci6n de DNA a menudo tiene errores en su secuencia. • Los genes mutadores pueden identificar proteinas que afectan la fidelidad de la replicaci6n, donde el cambia de secuencia causa una mayor tasa de mutaciones espontaneas.

Introducci6n Los sistemas de reparaci6n corrigen el dana del

DNA • Los sistemas de reparaci6n reconocen las secuencias de DNA que no cum plen con los pares de bases estandar. • Los sistemas de escisi6n retiran una cadena de DNA del sitio daiiado y despues la sustituyen. • Los sistemas de reparaci6n par recombinaci6n utilizan la recombinaci6n para sustituir la region de doble cadena que ha sido daiiada. • Todos estos sistemas son susceptibles de introducir errores durante el proceso de reparaci6n. • La fotorreactivaci6n es un sistema de reparaci6n no mutagenico que actua de manera especifica en dimeros de pirimidinas.

EnD

• Los genes mut codifican un sistema de reparaci6n de aparea mientos err6neos que se encarga de las bases mal apareadas. • Hay un a tendencia en la selecci6n de que cadenas sustituir en los apareamientos err6neos. • Par to general, se sustituye la cadena que carece de metilaci6n en un segmento ~¢;~ hemimetilado. • Este sistema de reparaci6n se usa para eliminar errores en una cadena de DNA recien sintetizada. En los apareamientos err6neos G- T y C-T, se retira de preferencia la T.

Sistemas de reparaci6n par escisi6n en E. coli • El sistema Uvr hace incisiones a -12 bases de distancia de ambos lados del DNA danado, retira el DNA entre ellas y vuelve a sintetizar el DNA nuevo.

Vias de reparaci6n par escisi6n en celulas de mam1feros

Control de la direcci6n de la reparaci6n de apareamientos err6neos

fii.m1

Sistemas de reparaci6n par recombinaci6n en E. coli

• La reparaci6n par escisi6n en los mamiferos se desencadena con la eliminaci6n directa de una base danada del DNA. • El retiro de las bases desencadena la eliminaci6n y sustituci6n de un segmento de polinucle6tidos. • La naturaleza de la reacci6n de la eliminaci6n de las bases determina cual de las dos vias de reparaci6n par escisi6n se activa. • La via polo/E sustituye un segmento largo de polinucle6tidos; la via pol~ sustituye un segmento corto. Las metilasas y las glucosilasas "lanzan" las bases • las glucosilasas reconocen y retiran de manera directa del DNA las bases alquiladas y el uracilo. • Los dimeros de pirimidina se revierten par la rotura de los enlaces covalentes entre ellos. • Las metilasas agregan un grupo metilo a la citosina. • Todos estos tipos de enzimas actuan allanzar la base fuera de la doble helice donde, de acuerdo con la reacci6n, es retirada o modificada y regresada a la helice. Reparaci6n susceptible de error y fenotipos

60 La recombinaci6n es un mecanisme importante de

mutadores

Rt!)

• El DNA danado que no ha sido reparado causa que la polimerasa III de DNA se detenga durante la replicaci6n. • Las polimerasas V (codificada por umuCD) o IV del DNA

• Los genes rec de f. coli codifican el principal sistema de recuperaci6n. • El principal sistema de recuperaci6n actua cuando la replicaci6n deja una brecha en una cadena recien sintetizada que se encuentra frente a una secuencia danada. • 5e utiliza la cadena unica de otro segmento duplex para sustituir la brecha. • 5e retira entonces la secuencia daiiada y se prese nta una nueva sintesis.

recuperaci6n ante errores de replicaci6n • Una horquilla de replicaci6n puede quedarse varada cuando encuentra un sitio danado o una hendidura en el DNA. • Una horquilla varada puede revertirse par el apareamiento entre las dos cadenas recien sintetizadas. • Una horquilla varada puede reiniciar la reparaci6n del dana y utilizar una heli casa para poder avanzar. • La estructura de la horquilla varada es la misma que la union Holliday y puede converti rse en una cadena duplex y D5B par la acci6n de las resolvasas.

La prote1na RecA desencadena el sistema SOS • El dana at DNA causa que la proteina RecA desencadene la respuesta 505, que consta de genes que codifican muchas enzimas de reparaci6n . Continua en Ia siguiente pdgina

499

• •

BD

La RecA impulsa la actividad de escisi6n propia de LexA. La LexA reprime el sistema 505; su escisi6n propia activa esos genes.

Las mutaciones RAD en levaduras, identificadas por fenotipos sensib les a la radiaci6n, ocurren en genes que codifican si stem as de reparaci6n. • La xerodermia pigmentosa (XP) es una enfermedad humana causada por mutaciones en cualquiera de varios genes de reparaci6n. • Un complejo de proteinas, que incluyen productos XP y el factor de tran scripci6n TFuH' provee un mecanisme de reparaci6n par escisi6n en los seres humanos. • Los genes con actividad transcripcional se reparan de manera preferente.

Ell Introducci6n Cualquier episodio que introduzca una desviacion de Ia estructura habitual de doble helice del DNA representa una ame naza para Ia constitucion gene-

Reversion directa del dafio: mas de un gen.

""i'"''....,..,_,_

1111111 Reparaci6n por escisi6n de bases: 15 genes.

Reparaci6n por escisi6n de nucle6tidos: 28 genes.

Reparaci6n por escisi6n del apareamiento err6neo: 11 genes.

Reparaci6n par recombinaci6n: 14 genes. ""'i""ii"'i"'i,......_

Subunidades cataliticas de polimerasas de DNA: 16 genes.

Los genes de reparaci6n se pueden clasificar en vias que utilizan mecanismos diferentes para revertir el daiio al DNA o pasarlo par alto. CAPITULO 20 Sistemas de reparaci6n

Un sistema comun repara las roturas de l;: doble cadena •

Las celulas eucari6ticas tienen sistemas de reparaci6n conservados •

500

6!16

•

liilll

La via NHEJ puede ligar extremos romos de DN A duplex. Las mutaciones en la via NHEJ ca usan enfermeo; : ,_ en los seres humanos.

Resumen

tica de Ia celula. Las lesiones del DNA dismm a! mfnimo gracias a los sistemas que reconoctccorrigen el dafio. El sistema de reparaci6n e~ complejo como el aparato de replicacion misocr.. : que indica su importancia para !a supervivenc~ !a celula. Cuando un sistema de reparaci6n re,·'::. un cambia ocurrido al DNA, no hay consecuerr ::No obstante, puede haber una mutacion cuand consigue hacerlo. La tasa medida de mutacion : fleja un equilibria entre el numero de suceso" dafio que ocurre en el DNA y el numero de los _ se han corregido (o corregido mal). Los sistemas de reparacion a menudo rec cen una variedad de distorsiones en el DNA c ~ sefiales para actuary es posible que una celula re--varios sistemas capaces de corregir un dafio a! D. La importancia de Ia reparacion del DNA en las cariotas lo indica Ia identificacion de > 130 ge-" de reparaci6n en el genoma humano. Se pue dividir los sistemas de reparacion en varios t'~ generales, como se resumen en Ia 0 1. • Algunas enzimas revierten de manera cfr ta tipos espedficos de dafio al DNA. • Hay vias para la reparacion por escisi6c::. bases o nucl eotidos, y del apaream ie erroneo, todas las cuales act-L1an med: .i.el retiro y Ia sustitucion de material. • Hay sistemas que usan la recombin a, para obtener una copia no dafiada qu:: utiliza luego para sustituir una secue:duplex dafiada. • Una vfa de union de extremos no ho gos vuelve a unir extremos de cadena rotos . • Varias polimerasas de DNA diferentes den resintetizar segmentos de DNA de titucion. La reparaci6n directa sucede muy pocas vee:. comprende la reversion o el simple retiro de ~ :

ento daiiado. Es un buen ejemplo la fotorreacti ;ci6n de dfmeros de pirimidina, donde los enlaces : valentes lesivos son revertidos por una enzima ~ pencliente de la luz. Este sistema esta muy generalizado en Ia na~ . raleza y ocurre en todos los mamfferos, excepto s placentados, y parece muy importante en las < antas. En Escherichia coli depende del producto de ~ 1 gen unico (phr) que codifica una enzima Hamada toligasa. Los apareamientos err6neos entre cadenas de ....,:-TA constituyen una de las principales dianas de los : temas de reparaci6n. La reparaci6n de apareamien·:s err6neos se logra mediante la busqueda de bases :. aposici6n mal apareadas en el DNA. Los aparea""lientos err6neos que surgen durante la replicaci6n .e corrigen al distinguir entre las cadenas "nuevas" "antiguas" y corregir de preferencia Ia cadena que ~caba de sintetizarse. Otros sistemas abordan apa:eamientos err6neos generados por conversiones de :ases, como en el caso de Ia desaminaci6n. La im:- rtancia de estos sistemas queda de manifiesto por :~ hecho de que el cancer en poblaciones humanas : · consecuencia de Ia mutaci6n de genes relacio::::ados con los que participan en la reparaci6n de ~pareamientos err6neos en las levaduras . Los apareamientos err6neos suelen corregirse : )n la reparaci6n por escisi6n; esta la inicia una enzi-na de reconocimiento que detecta una base daiiada ·eal o un cambia en la vfa espacial de] DNA. Hay dos ::pos de sistemas de reparaci6n por escisi6n. • Los sistemas de reparaci6n por escisi6n de bases retiran de manera directa la base daiiada y la sustituyen en el DNA. Un buen ejemplo es la glucosilasa de uracilo del DNA, que retira uracilos mal apareados con guaninas (vease la secci6n 20.5, Las metilasas y glucosilasas usan el aleteo de bases) . • Los sistemas de reparaci6n por escisi6n de nucle6tidos retiran una secuencia que incluya la, o las, bases daiiadas; despues se sintetiza una nueva cadena de DNA para sustituir el material eliminado. En Ia se resumen los principales episodios del funcionamiento de tal sistema. Estos sistemas son comunes . Algunos reconocen el daiio general del DNA; otros actuan sobre tipos especfficos de bases daiiadas. A menudo hay mtlltiples sistemas de reparaci6n por escisi6n en un solo tipo celular. En los sistemas de recombinaci6n-reparaci6n se .anejan situaciones donde el daiio persiste en una "'lolecula hija y se ha forzado la replicaci6n para pa_ar por alto el sitio, lo que por lo general crea una :recha en la cadena hija. Un sistema de recuperaj 6n utiliza Ia recombinaci6n para obtener otra copia

de la secuencia a partir de una fuente no daiiada; luego la copia se utiliza para reparar la brecha. Una caracterfstica importante de la recombinaci6n y reparaci6n es la necesidad de abordar roturas de doble cadena (DSB). Las DSB inician entrecruzamientos en re combinaci6n hom6loga. Tambien pueden crearse por problemas en la replicaci6n, donde tal vez desencadenen el uso de sistemas de reparaci6n por recombinaci6n. Cuando se crean DSB por daiio ambiental (p. ej., el causado por la racliaci6n) o son producto del acortamiento de tel6meros, pueden causar mutaciones. Un sistema para corregir DSB puede unir extremos de DNA no hom6logos. Las mutaciones que afectan Ia capacidad de las celulas de E. coli de contribuir a Ia reparaci6n del DNA entran en grupos que corresponden a varias vfas de reparaci6n (que no tienen que ser independientes ). Las principales vias conocidas son el sis tema uvr de reparaci6n por escisi6n, el sistema de reparaci6n de apareamientos err6neos dirigido por metilos, y las vfas de recombinaci6n recB y reeF asf como las de reparaci6n-recombinaci6n. Las actividades enzimaticas comprendidas en estos sistemas son de endonucleasas y exonucleasas (importantes para retirar el DNA daiiado), resolvasas (endonucleasas que actuan de manera especffica sobre uniones recombinantes), helicasas para desenrollar el DNA y polimerasas de DNA para sintetizar nuevo DNA. Algunas de estas actividades enzimaticas son exclusivas de determinadas vfas de reparaci6n, en tanto otras participan en multiples vfas. El aparato de replicaci6n presta mucha atenci6n al control de calidad. Las polimerasas de DNA utilizan la correcci6n de lectura para verificar la secuencia de la cadena hija y eliminar errores. Algunos de los sistemas de reparaci6n son menos precisos cuando sintetizan DNA para sustituir un material dana do. Por este motivo, a dichos sistemas se les conoce hist6ricamente como sistemas susceptibles de error.

El DNA es dafiado

Se elimina el dafio

Se sintetiza DNA de reposici6n

En la reparaci6n por escisi6n se sustituye de manera directa el DNA daiiado y luego sintetiza de nuevo un segmento de reposici6n para sustituir la cadena dafiada. 20.1 Introducci6n

501

111

Los sistemas de reparaci6n corrigen el dan o del DNA

Conceptos principales • Los sistemas de reparacion reconocen las secuencias de DNA que no cumplen con los pares de bases estandar. • Los sistemas de escisi6n retiran una cadena de DNA del sitio daiiado y despues la sustituyen. • Los sistemas de reparacion por recombinacion utilizan la recombinacion para sustituir la region de doble cadena que ha sido daiiada. • Todos estos sistemas son susceptibles de introducir errores durante el proceso de reparacion. • La foto rreactivacion es un sistema de reparacion no mutageno que actua de manera espec\fica en d\meros de pirimidinas.

Los tipos de dafio que desencadenan sistemas de reparaci6n se pueden dividir en dos clases generales: • Los cambios de una sola base afectan la secuencia del DNA, pero no su estructura glo-

Naturaleza de Ia mutaci6n Citosina H H Uracilo '-N/

AN

__......

Consecuencias U-G sustituye a C-G

0

DesaminacioL(, ·~

lN),.o

11

N),.o

\:1 \:1

Se corrige por sustituci6n de U con C

La desaminacion de la citosina crea un par de bases U-G. Se retira de preferencia el uracilo del par con apareamiento err6neo.

Naturaleza de Ia mutaci6n Consecuencias Citosina Un par de purinas H H Adenina distorsiona Ia 'N/ H,Nj cadena duplex

ArN Errores de Ia I'-J0

lN)~~~6n(N-l •.

\:1"

J

CAPITULO 20 Sistemas de reparacion

Naturaleza de Ia mutaci6n 0

C'CH311N 1 Timina

N"""o

0

Consecuencias El dimero de tim ina distorsiona lc. cadena dupls

CY,A-N Se corrige por retiro de A o G en Ia cadena recien sintetizada

Un error de replicaci on crea un par con apareamiento err6neo, que tal vez se corregiria con la sustitucion de una base; si no se corrige, la mutacion se fij a en una cadena duplex hija.

502

bal. No afectan la transcripci6n o replica-=: cuando se separan las cadenas duple:. DNA. Asf, estos cambios ejercen sus e tos lesivos en generaciones futuras p o ~ consecuencias del cambio en la secue::. del DNA. La causa de este tipo de efec: la conversion de una base en otra qlit aparea mal con su contraparte. Los can:_:de una sola base pueden ocurrir come sultado de la mutaci6n de una base i1: o por errores de replicaci6n. La J muestra que la desaminaci6n de la cit __ para producir uracilo (en forma espomi:. o por un mutageno qufmico) crea un pa:G con apareamiento err6neo. La J muestra que es posible que un error de . plicaci6n cause la inserci6n de una ade en Iugar de una citosina para crear un ~ A-G. Tal vez haya consecuencias simile.~ de la adici6n covalente de un pequefio g:po a una base que modifi ca su capacida ~ apareamiento. Estos cambios pueden c:_ sar una distorsion estructural muy pequ::= (como en el caso de un par U-G) o una J:"_ dificacion bastante significativa (como e:::. caso de un par A-G ), pero la caracter:: ca comun es que el apareamiento err6::: : persiste solo hasta la siguiente replica c Por lo tanto, solo se dispone de poco tie r;::~ para reparar el dafio antes de que se fije ~ replicacion . • Las distorsiones estructurales puec constituir un impedimenta fisico para Ia · plicacion o transcripcion. La introducci6 . _ enlaces covalentes entre las bases de una ~ • dena de DNA o en cadenas opuestas in ·: Ia replicacion y la transcripci6n. En la f se muestra un ejemplo de irradiac · -

~~...0

Timina

Radiaci6n ultravioleta

Se corrige por escisi6n

La irradiacion ultravioleta causa la formacio- :. d\ meros entre timinas cercanas. El d\mero bloquea la rep,':= cion y la transcripcion.

ultravioleta (UV) donde se introducen enlaces covalentes entre dos bases de timina cercanas, lo que da Iugar a un dimero de pirimidina intracatenario. La muestra que puede haber consecuencias similares si se afi.ade un agregado voluminoso o una base que distorsiona Ia estructura de Ia doble helice. Como se muestra en la , una hendidura en una sola cadena o el retiro de una base impiden que una cadena sirva como molde apropiado para la sfntesis de RNA o DNA. La caracterfstica comun de todos estos cambios es que el segmento de agregaci6n dafi.ado se mantiene en el DNA y continua causando problemas estructurales, induce mutaciones, o ambas cosas, hasta que se retira. Cuando se eliminan los sistemas de reparaci6n, :.5 celulas se vuelven en extremo sensibles a !a irra...aci6n ultravioleta. La introducci6n de dafi.o indu- ." o por UV ha constituido una prueba importante M a los sistemas de reparaci6n, por lo que cuando : valoran sus actividades y eficacias relativas debe -~cordarse que el enfasis podrfa ser diferente si seesJdiaran otros segmentos de agregaci6n dafi.ados.

. . ...... Naturaleza de Ia mutaci6n Guanina Metilguanina

yH3

0

____.

0

Consecuencias El grupo metilo distorsiona Ia doble helice

~N Alquilaci6n<~N \A)-NH2

I

I

Ell

Sistemas de reparaci6n po r escisi6 n en E. coli

Concepto principal • El sistema Uvr hace escisiones a -12 bases de distancia de ambos lados del DNA daiiado, retira el DNA entre ellas y vuelve a sintetizar el DNA nuevo.

Los sistemas de reparaci6n por escisi6n varfan en su especificidad, pero comparten las mismas caracterfsticas generales. Cada sistema retira bases dafi.adas o mal apareadas del DNA y luego sintetiza una nueva cadena de DNA para sustituirlas. El principal tipo de vfa para la reparaci6n mediante la escisi6n se ilustra en Ia En el paso de Ia incision, una endonucleasa reconoce Ia estructura del sitio dafi.ado y corta Ia cadena de DNA a ambos !ados. En el paso de Ia escision, una 5'- 3' exonucleasa retira un segmento de !a cadena dafi.ada.

l Daiio La base mutante se aparea en forma err6nea o distorsiona Ia estructura

~

Incision La endonucleasa escinde ambos !ados de Ia base daiiada

N~;NH 2 Se corrige por desalquilaci6n

La metilaci6n de una base distorsiona la doble -~ lice y causa apareamiento err6neo en la replicaci6n. La es-

La exonucleasa retira el DNA entre las hendiduras

:-~ Ua seiiala el grupo metilo.

La polimerasa sintetiza el DNA de reposici6n H, N/H Adenina

No hay purina

~N~N '\J~N)

\i

Despurinaci6n

-~

~

La ligasa sella Ia hendidura Se corrige por inserci6n

J La despurinaci6n retira una base del DNA y blo:_ea la replicaci6n y la transcripci6n.

En la reparaci6n por escisi6n se retira un segmento de DNA que incluye las bases danadas y se sustituye.

20.3 Sistemas de reparaci6n por escisi6n en f. coli

503

.

. llll'l'T,

Deformaci6n del DNA

UltrA UvrB

UvrA reconoce el dafio y se une con

"~~-Q UvrB

UvrC UvrB Se Iibera UvrA;

'\1}\1

fA.~-.()'\;0\..# se une UvrC

..L VO\fi\.ifJYJJ;f\:0\. ~Q

·

UvrD desenrolla Ia region y Iibera el segmento dafiado

El sistema Uvr actua por etapas donde UvrAB reconoce el dafio, UvrBC hace una hendidura en el DNA y UvrD desenrolla la region marcada.

En el paso de la sintesis, Ia region de cadena (mica resultante sirve como molde para que una polimerasa de DNA sintetice una secuencia en sustitucion de la extirpada. (La sintesis de una nueva cadena podda vincularse con el retiro de la antigua en una accion coordinada.) Por ultimo, la ligasa de DNA une de manera covalente el extrema 3' de la nueva cadena al DNA original. El sistema de reparacion por escision uvr incluye tres genes, uvrA, -By -C, que codifican los componentes de una endonucleasa de reparacion. Sus funciones en las diversas etapas se indican en la . Primero, la combinacion UvrAB reconoce dimeros pirimidinicos y otras alteraciones voluminosas. A continuacion, Ia UvrA se disocia (lo que requiere trifosfato de adenosina [ATP]) y la UvrC se une a UvrB. La combinacion UvrBC hace una incision a cada lado, una a siete nucleotidos del extrema 5' del sitio dafiado y la otra alejada de tres a cuatro nucleotidos del sitio 3', lo que tambien requiere ATP. La UvrB es una helicasa que ayuda a desenrollar el DNA para permitir la liberacion de la cadena unica entre los dos cortes. La enzima que corta la cadena danada de DNA es la polimerasa de DNA I. Es posible que la enzima involucrada en la sintesis de reparacion tambien sea la polimerasa I de DNA (aunque las polimerasas II y III de DNA pueden sustituirla). Los episodios son en esencia los mismos, si bien su arden es diferente en lo que 504

CAPiTULO 20 Sistemas de reparaci6n

se refiere a la via de reparacion eucariotica . _ muestra en Ia Figura 20.23. Casi todos los sucesos de reparacion pore! ~ en E. coli corresponde a la reparacion por m UvrABC. En la mayor parte de los casas (9 9' longitud promedio del DNA sustituido es de - ~::. cleotidos. (Por ese motivo, esta reparacion a me: se describe como en parche corto). El l % re"~ de los casas implica la reposicion de segmen~ DNA, en su mayor parte de -l 500 nud e ' de longitud, pero llegan a extenderse basta >.:: nucleotidos (a veces denominada reparaci '-:parche largo). Nose sabe porque algunos st.:·desencadenan la forma de parche largo en luf.:.~ Ia de parche corto. Otras proteinas pueden dirigir el complej" bacia sitios dafiados. El dano del DNA puede ·dir la transcripcion, pero la situacion la resueln ' proteina Hamada Mfd, que desplaza ala polin~ : de RNA y recluta al complejo Uvr (vease la : _ ra 24.19 en la seccion 24.12, Una conexion ;: ~ transcripcion y reparacion).

Vias de reparaci6n por escis=: en celulas de mamiferos Conceptos principales • La reparaci6n por escisi6n en los mamiferos se desencadena con la eliminaci6n directa de una bas;: daiiada del DNA. • El retiro de las bases desencadena la eliminaci6n sustituci6n de un segmento de polinucle6tidos.

~

• La naturaleza de la reacci6n de retiro de bases determina cuM de las dos vias de reparaci6n por escisi6n se activa. • La via polo/£ sustituye un segmento largo de poli r. _cle6tidos; la via pol~ sustituye un segmento corto.

El principia general de la reparacion por escisi · ;,:_ las celulas de mamfferos es similar al de las t>::.:::: rias. No obstante, el proceso por lo general se :.=.... en una forma diferente, con el retiro de una : _ dafiada individual. Esto sirve como desencader.-= para activar las enzimas que cortan un fragc c-_ del DNA que incluye el sitio danado y lo su':... yen. Las enzimas que retiran bases del DNA se ll
Glucosilasa

l

Incision

\

Acci6n de liasa

Sustituci6n del nucle6tido

+I

A 20 Una glucosilasa retira una base del DNA me:: -~e la escisi6n del enlace con la desoxirribosa.

Lig1

Via de parche largo

Via de parche corto

' 1 El retiro de las bases por la actividad de la glucosilasa o la liasa desencadena vias de reparaci6n por escisi6n en los mamiferos.

I

poH r=NH I

r Una glucosilasa hidroliza el enlace entre la . ~e y la desoxirribosa (con H,O), pero una liasa continua : ·eacci6n al abrir el anillo del azucar (con NH,).

~~ a atacar el anillo de la desoxirribosa. Por lo gene.:_., a esto le sigue una reacci6n que introduce una :ndidura en la cadena polinucleotfdica. La muestra que la forma exacta ~ Ia vfa depende de que la base dafiada se retire por -=. acci6n de una glucosilasa o una liasa.

A la acci6n de la glucosilasa le sigue la de la endonucleasa APE l, que corta la cadena polinucleotfclica en ellado 5'. Esto, a su vez, atrae un complejo de replicaci6n que incluye la polimerasa 8/E del DNA y componentes auxiliares, que llevan a cabo un proceso de traducci6n de la hendidura que se extiende de dos a l 0 nucle6tidos. El material desplazado es retirado por la endonucleasa FENl. La enzima ligasa -1 sella la cadena, lo que corresponde a la Hamada vfa de parche largo. Cuando en el retiro inicial hay una acci6n de liasa, la endonucleasa APEl se combina con la polimerasa ~ de DNA para sustituir un solo nucle6tido. La hendidura se sella entonces por la acci6n de la ligasa de XRCCl/ligasa-3. A esto se le llama vfa de parche corto. 20.4 Vias de reparaci6n por escisi6n en celulas de mamiferos

505

Las metilasas y las glucosilasas "lanzan" las bases Conceptos principales • Las glucosilasas reconocen y retiran de manera directa del DNA las bases alquiladas y el uracilo. • Los d\meros de pirimidinas se revierten por la rotura de los enlaces covalentes entre ellos. • Las metilasas agregan un grupo metilo a la citosina. • Todos estos tipos de enzima actuan allanzar la base fuera de la doble helice donde, de acuerdo con la reacci6n, es retirada o modificada y regresada a la helice.

Varias enzimas que retiran o modifican bases individuates en el DNA utilizan una reacci6n notoria donde una base es "lanzada" fuera de la doble helice. Este tipo de interacci6n se demostr6 por primera vez en las transferasas de metilos, enzimas que afi.aden un grupo metilo ala citosina en el DNA. La metilasa Ianza por completo fuera de Ia helice a la citosina diana. En la se muestra que entra a una cavidad en Ia enzima, donde es modificada. Despues, regresa a su posicion normal dentro de la helice. Todo esto ocurre sin aporte de una fuente energetica externa. Una de las reacciones mas frecuentes donde se retira una base de manera directa del DNA es Ia catalizada porIa glucosilasa de uracilo-DNA. Por lo general, el uracilo se encuentra en el DNA debido a una desaminaci6n (espontanea) de Ia citosina, que Ia glucosilasa reconoce y retira. La reacci 6n es similar a la de la metilasa. El uracilo es lanzado fuera

Una metilasa "Lan za" la citosina diana fuera de La doble heli ce para modificarla . Fotografia por cortes\a de Sanjay Kumar, New England Biolabs.

506

CAPITULO 20 Sistemas de reparaci6n

de Ia helice y b acia el sitio activo de Ia glucos: ~ Otras glucosilasas y liasas, como las que recor; _ bases dafiadas en el DNA de los mamfferos, ac de manera similar. Las bases activadas (po r lo general aq ~.: donde se ha agregado un grupo metilo ) se r por un mecanismo similar. Una en zima hue._ (mica, Ia glucosilasa del alquil-adenilo DNA L~- reconoce y retira una variedad de sustratos ale;=-. dos que incluyen 3-metiladenina, 7 -metilgua.-:e hipoxa ntina . En contraste con este mecanismo, la 1- n:.~ adenina es corregida por una enzima que u·_ un m ecanismo de oxigenaci6n (codificado en :: por el gen alkB, que tiene hom6logos muy dG.sos en Ia naturaleza, incluidos tres genes humaEl grup o metilo es oxidado para formar un g:CH20H, y despues, Ia liberaci6n del segmento H --(formaldehido) restable ce la estructura de Ia ac:. na. Una vance muy interesante es el descubrim: ~ de que la enzima bacteriana, y una de las en.c humanas, tambien pueden reparar Ia misma -~ dafiada en el RNA. En el caso de Ia enzima hmrc la principal diana puede ser el RNA ribos6mico. : : es el primer episodio de reparaci6n conocido a:.RNA como diana. Otra enzima que "Ianza" bases es la for o:' : que revierte los enlaces entre dimeros de pir.imi_ · (vease la Figura 20.5). El dimero de pirimidi- = lanzado al interior de una cavidad en Ia en C:: Cerca de esta cavidad se encuentra un sitio ' vo que contiene un donador de electrones, qk provee para romper los enlaces. La energia pa::: reacci6n proviene de la luz dentro de Ia longir..:. ~ onda visible. La caracteristica que comparten estas enz:-_ es el lanzamiento de Ia base diana a! interic ~ Ia estructura enzimatica. La endonucleasa V ri:: utiliza una variaci6n de este esquema, ahara r: brado T4-pdg (glucosilasa del dimero de piric. _ nas) para reflejar su forma de acci6n. Lanza Ia :: adenina complementaria de la timina en el sitio =: dfmero de pirimidinas . Por lo tanto, en este ..:::. Ia diana para Ia acci6n catalitica de la enzima ~. ~ siendo el DNA duplex, y la enzima utiliza el ]--miento como un mecanismo indirecto para ob . ~ a su diana. Despues de que se retira una base del DN.. ne Iugar una escisi6n de la columna fo sfodieste::-una endonucleasa, la sintesis de DNA por una limerasa de DNA para llenar la brecha y la liga por una ligasa para restablecer la integridad de ~ dena polinucleotidica, como se describe para :~ de reparaci6n por escisi6n en los mamfferos (\ _ Ia secci6n 20.4, Vias de reparaci6n por escisi6::. celulas de mamiferos).

Reparaci6n susceptible de error y fenotipos mutadores Conceptos principales El DNA daiiado que no ha sido reparado hace que la polimerasa III de DNA se detenga durante la replicaci6n. La polimerasa V de DNA (codificada por umuCD) o la polimerasa IV de DNA (codificada por dinB) pueden sintetizar un complemento de la cadena daiiada. El DNA sintetizado por la polimerasa de reparaci6n de DNA a menudo tiene errores en su secuencia. Es posible que las proteinas que afectan la fidelidad de la replicaci6n sean identificadas por genes mutadores, en los que la mutaci6n ocasiona una mayor tasa de mutaciones espontaneas.

- existencia de sistemas de reparaci6n que parti- . m en la sfntesis del DNA hace surgir la interro~re de si su control de calidad es comparable con l e la replicacion del DNA. Basta donde se sabe, _: todos los sistemas, incluido el de reparacion por j sion controlado por uvr, no difieren de mane :ignificativa en la frecuencia de errores respecto :: :a replicaci6n del DNA. Sin embargo, en E. coli ..:rre sfntesis de DNA susceptible de errores en :.-:as circunstancias. La caracterfstica de susceptibilidad de error se =~rvo por primera vez cuando se encontro que :=paracion del DNA daiiado del fago A se acom-:':aba de la induccion de mutaciones cuando se ducfa el fago en las celulas que antes se habfan ·ado con UV. Esto sugiere que Ia radiacion UV ospedador activo funciones que generan munes. La respuesta mutagenica tambien actua en =- ~A del hospedador bacteriano. ;_ Cual es la verdadera actividad susceptible de _r? Es una polimerasa de DNA que inserta bases - rrectas, que representan mutaciones, cuando ::. por cualquier sitio donde no puede introducir ·::s de bases complementarios en Ia cadena hija. :unciones involucradas en esta via susceptible ::rror se identifican por las mutaciones en los =-=s umuD y umuC, que suprimen la mutagene- ducida por UV. Esto implica que las proteinas C y UmuD causan mutaciones que tienen lugar ues de la irradiacion UV. Los genes constituyen ~ eron umuDC cuya expresion es inducida por el .::. ) del DNA. Sus productos forman un complejo ·_;D' 2 C que consta de dos subunidades de una ·e(na truncada UmuD y una subunidad UmuC. _·!lluD es escindida por RecA, la cual es activada ·-;I daiio del DNA (vease la seccion 20.10, La _-_ desencadena el sistema SOS).

El complejo UmuD' 2 C tien e actividad de polimerasa de DNA. Se llama polimerasa V de DNA y se encarga de Ia sintesis del nuevo DNA para sustituir secuencias que han sido daiiadas porIa luz UV. Esta es la unica enzima en E. coli que puede pasar por alto los dimeros de pirimidinas habituales producidos por luz UV (u otros productos voluminosos). La actividad de Ia polimerasa es susceptible de error. La mutacion de umuC o umuD desactiva a Ia enzima, lo que hace letalla irradiacion UV. Algunos plasmidos portan genes Uamados mucA y mucB que son homologos de umuD y umuC y cuya introducci6n a una bacteria aumenta su resistencia a Ia eliminacion por UV y Ia susceptibilidad ala mutagenesis. ;_Como gana a! DNA una polimerasa de DNA alternativa? Cuando la replicasa (polimerasa III de DNA) encuentra un bloqueo, como u n dfmero de timidinas, se detiene. Despues es desplazada de Ia horquilla de replicaci6n y sustituida por la polimerasa V de DNA. De hecho, la polimerasa V de DNA utiliza las mismas proteinas auxiliares que Ia polimerasa III de DNA. La misma situacion es valida para Ia polimerasa IV de DNA, producto de dinE, que es otra enzima que actua sabre el DNA daiiado. Las polimerasas rv y V de DNA son parte de una familia mas grande, que incluye las polimerasas de DNA eucarioticas cuyos participan en la reparacion del DNA daiiado (vease la seccion 20.11, Las celulas eucarioticas tienen sistemas de reparacion conservados) .

E1J

Control de la direcci6n de la repa raci6n de apa reamientos err6neos

Conceptos principales • Los genes mut codifican un sistema de reparaci6n de apareamientos err6neos que se encarga de las bases mal apareadas. • Hay una tendencia en la selecci6n de que cadenas sustituir en los apareamientos err6neos. • Por lo general, se sustituye la cadena que carece de mutilaci6n en un segmento GATC hemimetilado. CTAG • Este sistema de reparaci6n se usa para eliminar errores en uria cadena de DNA recien sintetizada. En los apareamientos err6neos de G-T y C-T se retira de preferencia la T.

Los genes cuyos productos participan en el control de la fidelidad de la sfntesis del DNA durante Ia replicacion o reparacion pueden identificarse por las mutaciones que tienen un fenotipo mutador. Un mutante de mutador tiene una mayor frecuencia de mutacion espontanea. Cuando se identifica en un

20.7 Control de la direcci6n de la reparaci6n de apareamientos err6neos

507

MutT hidroliza el 8-oxo-dGTP

<[( MutT 0 dGTP ___.. dGTP ___. dG Hidr61isis MutM retira G=O que se aparea con C G

c

.

<[(

---.. G

c

MutM ___.

c

Glucosilasa

Replicaci6n

___. lnserci6n de G

G

c

La MutY retira A que esta apareada con G=O. 0 II

G

MutY

___.

0 II

G

A Glucosilasa

0 ___. & lnserci6n C

El retire preferente de bases en pares que tienen guanina oxidada esta diseiiado para disminuir al mi nima las mutaciones.

principia a un gen por el fenotipo mutador, se le describe como mut; no obstante, a menudo se observa mas tarde que un gen mut equivale a una actividad de replicacion o reparacion conocida. Los tipos generales de actividades identificadas por los genes mut se dividen en dos grupos: • El grupo principal consta de componentes de sistemas de reparacion de apareamientos erroneos. Cuando no se elimina un par de bases danado o mal apareado antes de Ia re plicacion puede inducirse una mutacion. Las funciones de este grupo incluyen Ia metilasa dam, que identifica Ia diana para reparacion, y las enzimas que participan de manera directa o indirecta en Ia eliminacion de tipos particulares de dano (mutH, -S, -L, - Y). • Un grupo m as pequeii.o, tipificado por dnaQ (que codifica una subunidad de Ia polimerasa III de DNA) , se encarga de Ia precision de Ia sfntesis del nuevo DNA. Cuando se retira una distorsion estructural del DNA, se restablece Ia secuencia del tipo silvestre. En casi todos los casos, Ia distorsion se debe a Ia crea cion de una base que no se encuentra de manera natural en el DNA y que, por tanto, es reconocida y retirada por el sistema de reparacion. Surge u n problema si Ia diana para Ia reparacion es una asociacion mal apareada de bases (normales) que se crea cuando una tenia mutacion. El sistema de reparacion no tien e medios intrfnsecos para conocer cua.I es Ia base de tipo silvestre y cuat Ia mutante. Todo lo que detecta es un par de bases mal apareadas, cu alquiera de las cuales puede proveer Ia diana para Ia reparacion por escision. 508

CAPITULO 20 Sistemas de reparaci 6n

Si se retira Ia base mutada, Ia secuencia d Silvestre se restablece. No obsta nte, si sucede q· retiro Ia base original (de tipo silvestre), Ia w:_ secuencia (mutante) se torna fija. Sin embar:;: menudo Ia direccion de Ia reparacion por es no es aleatoria, sino que en su Iugar tiene unadencia tal que puede llevar a! restablecimien:. Ia secuencia de tipo silvestre. Se toman algunas precauciones para guireparacion en Ia direccion correcta. Por ejer.:.~ para casos como Ia desaminacion de Ia 5-metiisina para obtener timina, hay un sistema es qu e restablece Ia secuencia apropiada (vease :.:. bien Ia seccion 1.15, Muchos puntos calientes resultado de bases modificadas). La desamina.::. genera un par G-T y el sistema que actua sobre :.:. pares tiende a corregirlos a pares G-C (en vez de res A-T). El sistema que se encarga de esta rea incluye MutL, los productos S que retiran las-:los apareamientos erroneos G-T y C-T. El sistema mutT, M, Y se encarga de las co;cuencias del daii.o oxidativo. Un tipo impon de dano qufmico lo ocasiona Ia oxidacion de G _ produce 8-oxo-G. En Ia ' se mue. que el sistema act{~a en tres niveles. La proteina . hidroliza al precursor danado (8 -oxo-dGTP), lo c evita que se incorpore al DNA. Cuando Ia guar_ · esta oxidada en el DNA, su contraparte es Ia cito_ y MutM retira de manera preferente Ia 8-oxo-Clos pares 8-oxo-G-C. La guanina oxidada se a mal con A y, por ello, cuando persiste Ia 8-oxo-G replica, genera un par 8-oxo-G-A. La MutY eliL:_ la A de estos pares. MutM y MutY son glucosil que retiran de m anera directa una base del DN_.:_ que crea un sitio apurinico a! que reconoce una donucleasa cuya acci6n desencadena Ia participa del sistema de reparaci6n por escisi6n. Cuando ocurren errores de apareamiento rante Ia replicacion en E. coli, es posible distin"'_ Ia cadena original del DNA. En cuanto terrnir:.:. replicacion del DNA metila do, solo Ia cadena , genitora original porta grupos metilo. Cuand cadena que acaba de sintetizarse esta espera. _ Ia introduccion de grupos metilos se pueden dj : guir las dos cadenas. Esto constituye la base de un sistema par.= correccion de errores de replicacion. El gen : codifica una metilasa cuya diana es Ia adenina Ia secuencia ~~1~ (vease Ia Figura 15.7). El es:~ hemimetilado permite distinguir orfgenes con replicacion . Un sistema de repara cion relaciorr:. con Ia replicacion usa los mismos sitios diana. La t , muestra que el DNA que c tiene pares de bases unidos en forma erronec. repara de manera preferente mediante Ia esci5.

El dimero MutS se une al apareamiento err6neo

;IJM:i,

Me Replicaci6n

-

~\.(J\ffi_:tF .(}V}

l

~ El dimero Mul l se une al MutS

El error de replicaci6n genera apareamiento err6neo A-C Me CTAG La adenina no metilada hace blanco en Ia cadena para reparaci6n

GATC

-uv; -0\:DV)VJVJ\JJ\.-(A(JVJVAQ

~

C

MutS se transloca a GATC

MutH se une al complejo en Ia secuencia GATC

l

Me

CTAG La cadena no metilada se fragmenta

l l

Me

CTAG Metilaci6n de Dam

T La sintesis de DNA corrige el error

El MutS reconoce un apareamiento err6neo y to transloca a un sitio GATC. La MutH escinde la cadena no metilada en el GATC. Las endonucleasas fragmentan la cadena desde GATC hasta el sitio de apareamiento err6neo.

Me CTAG Me

-

T

Las secuencias GATC son dianas para la meti.:.;a Dam despues de la replicaci6n. Durante el periodo anterior : ;:sta metilaci6n, la cadena no metilada es la dia na para la c:oaraci6n de bases con apareamiento err6neo. U .

_ la cadena que carece de metilaci6n. La escisi6n es :-3stante amplia; se pueden reparar de preferencia apareamientos err6neos de basta > 1 kb alrede - r de un sitio GATC . El resultado es que Ia caden a : cien sintetizada se corrige hacia la secuencia de la :3 ena progenitora. Las mutantes de danr en E. coli muestran una _ayor tasa de mutaciones espontaneas. Este siste---:a de reparaci6n, por tanto, ayuda a disminuir el -·' mero de mutaciones causadas por errores en Ia :-plicaci6n. Consta de varias protefnas codificadas r genes mut. La protefna MutS se une al par mal areado y se agrega MutL. La MutS puede utilizar sitios de union al DNA, como se ilustra en la RA . En el primero se reconocen de rnao-ra especffica apareamientos err6neos. El segundo es especffico para la secuencia o estructura y se :·liza para translocaci6n junto con el DNA hasta ·- · ontrar una secuencia GATC. Se utiliza hidr6lisis ~ ATP para impulsar la translocaci6n. La MutS se __ al sitio de apareamiento err6neo y al DNA a _cdida que se transloca y, como resultado, crea un _lice en el DNA.

El reconocimiento de la secuencia GATC origina que Ia endonucleasa MutH se una a MutSL. Luego, Ia endonucleasa fragmenta Ia cadena no metilada . Esta cadena es despues escindida del sitio GATC hacia el sitio de apareamiento err6neo. La escisi6n puede ocurrir en direcci6n 5'-3' (con uso de RecJ o exonucleasa VII), o 3'- 5' (con uso de exonucleasa I) , yes asistida por la helicasa UvrD . La polimerasa III de DNA sintetiza la nueva cadena de DNA. El sistema de reparaci6n MSH de Sacharomyces cerevisiae es hom6logo del sistema mut en E. coli. La Msh2 es el bastidor para el aparato que reconoce apareamientos err6n eos . Las protefnas Msh3 y Msh6 proveen factores de especificidad. El complejo Msh2-Msh3 es helices con apareamiento err6neo de dos a cuatro nucle6tidos, y el complejo Msh2 -Msh6 se une a apareamientos err6neos de una sola base, inserciones o deleciones. Despues se requieren otras proteillas para el proceso mismo de reparaci6n. Tambien se encuentran hom61ogos del sistema MutSL en celulas de eucariotas superiores. Ademas de la reparaci6 n de apareamientos err6neos de pares de bases unicos, se encargan de la de apa reamientos err6neos que surgen como resultado de deslizamientos en la replicaci6n. En una region como un microsatelite, donde una secuencia muy corta se repite varias veces, la realineaci6n entre Ia cadena bija recien sintetizada y su molde puede llevar a "tartamudeos" don de la polimerasa de DNA

20. 7 Control de la direcci6n de la reparaci6n de apareamientos err6neos

509

Dafio

Las bases en una cadena de DNA estan dafiadas El deslizamiento de Ia replicaci6n genera una helice de una sola cadena

La replicaci6n genera una copia con una brecha !rente al dafio y una co pia normal

MutS se une al apareamiento err6neo

Recuperaci6n

Se repara Ia brecha cuando se recupera una secuencia de una copia normal

Se une MutL

El apareamiento err6neo lo retira una exonucleasa, una helicasa, una polimerasa de DNA y una ligasa -, El sistema MutS/MutL inicia la reparaci6n de apareamientos err6neos producidos por el deslizamiento de la replicaci6n.

se desliza hacia atnis y sintetiza unidades de repetici6n adicionales. Estas unidades en la cadena hija se expulsan como una he lice de cadena unica desde la doble helice (vease la Figura 6.28). Los hom6logos del sistema MutSL las reparan, como se muestra en la La importancia del sistema MutSL para la reparaci6n de aparearnientos err6neos queda de manifiesto por la elevada tasa con la que se encuentra que es defectuoso en los canceres humanos. La perclida de este sistema lleva a un mayor inclice de mutaciones.

ED

Sistemas de re paraci 6n por recombinaci6 n en £. coli

Conceptos principales • Los genes rec de f. de recuperaci6n. •

coli codifican el principal sistema

El principal sistema de recuperaci6n actua cuando la replicaci6n deja una brecha en una cadena recien sintetizada que se encuentra frente a una secuencia dafiada.

• Se utiliza la cadena unica de otro segmento duplex para sustituir la brecha. • Se retira entonces la secuencia dafiada y se presenta una nueva s1ntesis.

510


Se repara Ia brecha en una copia normal

Un sistema de recuperaci6n de E. coli u:- ::_ una cadena normal para sustituir la brecha dejada en u r ~ dena que acaba de sintetizarse frente a un sitio de da f : reparado.

Los sistemas de reparaci6n por recombinaci6n ·lizan actividades que se superponen con las cC'"prendidas en la recombinaci6n genetica . A ,-e~ tambien se denominan de "reparaci6n por rep - ~ cion" porque actuan despues de la replicaci6n. Ti-. sistemas son eficaces para abordar los defectos ~:: ducidos en cadenas hijas duplex por la replica~ de un molde que contiene bases dafiadas. En la se incluye un ejemplo. El reinicio de horquillas de replicaci6n varadas podrfa tener c.- _ funci6n importante en los sistemas de reparac por recombinaci6n (vease la secci6n 18.17, Es ne -~ sario el primosoma para reiniciar la replicaci6n Considerese una distorsi6n estructural, c =. un dfmero de pirimidinas, en una cadena de c doble helice. Cuando se replica el DNA, el dime impide que el sitio dafiado actue como molde. replica cion se ve forzada a pasar por alto ese sitio. :: probable que la polimerasa de DNA avance hasrdimero de pirimidinas, o cerca, y luego cesa la sfr.· = sis de la cadena hija correspondiente. La replica ci se reinicia a distancia mas adelante. Queda una ~ cha sustancial en la cadena recien sintetizada .

Las cadenas duplex hijas resultantes tienen na:uralezas cliferentes. Una posee Ia cadena progeni:ora que contiene el segmento dafiado frente a una :adena de sfntesis reciente con una brecha larga . El no duplicado tiene la cadena progenitora sin dafio, J_ue se ha copiado en una cadena complementaria . ormal. El sistema de recuperaci6n saca ventaja de .a cadena hija normal. La brecha opuesta a! sitio dafiado en Ia prime:a cadena duplex se llena mediante Ia sustracci6n ~e la cadena {mica hom6loga de DNA de la duplex :1ormal. Despues de este intercan1bio de una sola cadena, la forma duplex receptora tiene una cadena . rogenitora (da.fiada) frente a una de tipo silvestre. :..a forma duplex donadora tiene una cadena pro; enitora normal frente a una brecha; entonces, Ia ::-recha puede llenarse mediante Ia sfntesis de repara·'on en la forma habitual, lo que genera una cadena _uplex normal. Asf, el dafio se confina a Ia clistorsi6n riginal (si bien los mismos episoclios de reparaci6n o -ecombinaci6n deben repetirse despues de cada ciclo ~e replicaci6n basta que el dafio se remedie con un -~sterna de reparaci6n por escisi6n). La principal vfa de reparaci6n por recombinaj 6n de E. coli se identifica por los genes rec (veanse .as Figuras 19.13 a 19.15). En E. coli con una repara·on por escisi6n defidente, !a mutaci6n del gen recA :!prime en esencia todos los recursos de reparaci6n recuperaci6n restantes. Los intentos por replicar -:-: DNA en celulas uvr recA- producen fragmentos _e DNA cuyo tamafio corresponde a Ia clistancia es- rada entre los dfmeros de timinas. Este resultado ::n plica que los dfmeros constituyen un obstaculo -:> tal para Ia replicaci6n cuando RecA no funciona, lo :u e explica porque Ia bacteria con Ia doble mutaci6n puede tolerar mas de uno a dos dfmeros en su -enoma (en comparaci6n con Ia capacidad de una ~ .Kteria de tipo Silvestre de manejar hasta 50). Una vfa rec implica a los genes recBC y esta bien : escrita; la otra involucra a reeF y no esta tan -:en definida. Cumplen funciones diferentes in vivo. -.a via RecBC participa en el reinicio de las horquias de replicaci6n varadas (vease Ia secci6n 20. 9, ~ ~ recombinaci6n es un importante mecanismo - a.ra recuperarse de errores de Ia replicaci6n). La ~a ReeF participa en la reparaci6n de brechas de Ia .:..:.dena hija que quedan despues de la replicacion -:!as alia de un dfmero de pirimidinas. Las vias RecBC y ReeF funcionan ambas antes --= !a intervenci6n de RecA (aunque en diferentes . rmas). Conducen a! vinculo de RecA con un DNA - ~ cadena unica. La capacidad de RecA de intercam.;ar cadenas unicas le permite llevar a cabo el paso ~~ recuperacion de Ia Figura 20.18. A continuacion, ~- actividades de nucleasa y polimerasa concluyen .: actividad de reparacion.

La vfa ReeF contiene un conjunto de tres genes: reeF, recO y recR. Las proteinas forman dos tipos de complejos, RecOR y RecOF. Facilitan !a formacion de fi lamentos RecA en el DNA de cadena unica. Una de sus funciones es permitir que los filamentos se ensamblen a pesar de la presencia del SSE, que es inhibitoria. Se cree que funcionan en las brechas; sin embargo, Ia reacci6n in vitro requiere un extrema 5' libre. Las designaciones de genes de reparaci6n y recombinacion se basan en los genotipos de las mutantes, pero a veces una mutaci6n aislada en un conjunto de circunstancias y denominada locus uvr parece estar aislada en otro conjunto de circunstancias como locus rec. Esta incertidumbre es importante. Aun nose define cuantas funciones pertenecen a cada via o como interactuan ambas. Las vias uvr y rec no son por completo indepenclientes porque las mu tantes de uvr muestran menor eficacia en !a reparacion por recombinacion. Se debe esperar encontrar una red de nucleasa, polimerasa y otras actividades, que constituyen sistemas de reparaci6n superpuestos de man era parcial (o don de una enzima por lo general utilizada para proveer alguna funcion puede ser sustituida por otra de una via cliferente) .

B!1J

La recombinaci6n es un mecanismo importante de recuperaci6n ante errores de replicaci6n

Conceptos principales • Una horquilla de replicaci6n puede quedarse varada cuando encuentra un sitio dafiado o una hendidura en el DNA. • Una horquilla varada puede revertirse por el apareamiento entre las dos cadenas recien sintetizadas. • Una horquilla varada puede reiniciar la reparaci6n del dafio y utilizar una helicasa para poder avanzar. • La estructura de la horquilla varada es la misma que la union Holliday y puede convertirse en una cadena duplex y DSB por la acci6n de las resolvasas.

Todas las celulas tienen muchas vias para reparar el dafio en el DNA. La vfa que se utilice dependera del tipo de dafio y las circunstancias. Las vias de reparaci6n por escision pueden, en principia, usarse en cualquier momenta, pero las de reparaci6n por recombinacion se pueden usar solo cuando hay una segunda cadena duplex con una copia de !a secuencia dafiada, esto es, despues de Ia replicaci6n. Se presenta una circunstancia especial cuando se replica el DNA dafiado porque la horquilla de replicaci6n puede quedarse varada en el sitio del dafio.

20.9 La recombinaci6n es un mecanismo importante de recuperaci6n ante errores de replicaci6n

511

La horquilla de replicaci6n se detiene en el sitio dafiadc La horquilla de replicaci6n se queda varada en el sitio dafiado

*

La horquilla de replicaci6n se revierte y colapsa

La horquilla de rep licaci6n se revierte y colapsa

Una resolvasa corta en Ia union

Se ha creado un DSB La helicasa restablece Ia horquilla de replicaci6n

Se crea otro DSB si el daiio consiste en una hendidura

Una horquilla de replicacion se queda varada cuando alcanza un sitio daiiado en el DNA. La reversion de la horquilla permite que las dos cadenas hijas se apareen. Despues de que se ha reparado el daiio, se restablece la horquilla por la migracion de rama en avance cata lizada por una helicasa. Las puntas de flecha indican los extremos 3'.

Las vias de reparaci6n por recombinaci6n permiten el restablecimiento de la horquilla despues de que se ha reparado el dafio, o que lo pasen por alto. La r muestra un posible resultado cuando se detiene una horquilla de replica cion. La horquilla deja de avanzar cuando encuentra el daiio. El aparato de replicaci6n se desensambla, al menos en forma parciaL lo que permite que ocurra migraci6n de ramas cuando Ia horquilla se desplaza bacia atras de manera eficaz y las nuevas cadenas hijas se aparean para formar una estructura duplex. Despues de que se ha reparado el dafio, una helicasa hace girar bacia adelante Ia horquilla para restablecer su estructura. Despues, el aparato de replicaci6n se puede reensamblar y se reinicia el proceso (vease la secci6n 18.17, El primosoma es necesario para reiniciar Ia replicaci6n). Se requiere polimerasa II de DNA para el reinicio de !a replica cion, que despues es sustituida porIa polimerasa Ill de DNA. 512


La estructura de una horquilla de replicac: varada se asemeja a una union de Holliday y las resolva ~ ~ pueden resolverla en la misma forma. El resultado de pen de : o que el sitio dana do contenga una hendidura o no. El resul~:: ::_ 1 muestra que se genera una rotura de doble cadena cuaTJ dc :corta un par de cadenas en la union. El resultado 2 muestra - _· se genera un segundo DSB en el sitio del daiio si contiene _- hendidura. Las puntas de flecha indican los extremos 3'.

La via para el manejo de una horquilla de re caci6n varada requiere enzimas de reparaci6n. Et: E. coli los sistemas RecA y RecEC tienen una funci -importante en esta reacci6n (de hecho, esa pue.: ser su principal funci6n en !a bacteria). Una posi'::-. via es que RecA estabilice el DNA de cadena (uli · mediante su union en la horquilla de replicaci varada y quiza al actuar como sensor que detecta ~ suceso de detenci6n. El RecEC participa en Ia rer "-· raci6n del dafio por escisi6n. Despues de que se ·reparado el daiio, se puede reiniciar Ia replicaci ' ::: Otra vfa puede usar la reparaci6n por recor.- binaci6n, quiza la s reacciones de intercambio ..: cadenas de RecA. La muestra que __

No se conoce Ia secuencia exacta de los sucesos, pero en Ia se ilustra una posibilidad. El principia es que el episodio de recombinacion ocurre a cada !ado del sitio daiiado, lo que permite que Ia cadena (mica no daiiada se aparee con Ia daiiada. Ello permite que Ia horquilla de replicaci6n se reconstruya de manera que Ia replicaci6n pueda continuar y evite de manera eficaz el sitio daiiado.

La horquilla de replicaci6n se queda varada en el sitio daiiado

*

Una cadena progenitora no daiiada presenta entrecruzamiento

E

_.\22

)


La cadena desplazada se aparea con Ia complementaria

\! ~: _}\ ;;· *·

====::!)

La RecA desencadena el sistema SOS

~==="

El daiio del DNA causa que RecA desencadene la respuesta 505, que consta de genes que codifican muchas enzimas de reparaci6n.

• La RecA impulsa la actividad de escisi6n propia de LexA. • La LexA reprime el sistema 505; su escisi6n propia activa esos genes.

Ocurre un segundo entrecruzamiento

La resolvasa actua en las uniones

Se reinicia Ia replicaci6n 1 )

Cuando una horquilla de replicaci6n se queda ::rada, una reparaci6n por combinaci6n puede colocar una :~dena sin dafio frente al sitio dafiado, lo que permite que : ntinue la replicaci6n.

:-structura de Ia horquilla varada es en esencia Ia que Ia de una union Holliday creada por 2 recombinaci6n entre dos DNA duplex, lo que Ia : nvierte en una diana para las resolvasas. Se ge.::era una rotura de Ia doble cadena si una resolvasa =-ctnde cualquier par de cadenas complementarias. -..demas, si el daiio es, de hecho, una henclidura, se :::-ea otra rotura de Ia doble cadena en este sitio. Se pueden rescatar las horquillas de replicaci6n aradas mediante Ia reparaci6n por recombinacion. ~jsma

La participacion directa de Ia protefna RecA en Ia reparacion por recombinacion es solo una de sus actividades. Esta extraordinaria protefna tiene tambien otra funci6n bastante distintiva. Se puede activar con muchos tratamientos que daiian el DNA o inhiben Ia replicaci6n en la E. coli, lo que hace que desencadene una serie compleja de cambios fenotfpicos Ilamados resp uesta SOS, que incluye Ia expresion de muchos genes cuyos productos abarcan funciones de reparaci6n. Estas actividades dobles de Ia protefna RecA hacen diffcil saber si una deficiencia en la reparacion de celulas mutantes para recA se debe a Ia perdida de la funcion de intercambio de cadenas del DNA de RecA o a alguna otra funcion cuya inducci6n dependa de Ia actividad de proteasa. La induccion del daiio puede adoptar Ia forma de irradiacion ultravioleta (el caso mas estudiado) 0 deberse al enlace cruzado o a agentes alquilantes. La inhibici6n de Ia replicaci6n por cualquiera de varios medias, como Ia privaci6n de timina, Ia adici6n de farmacos o mutaciones en varios de los genes dna, tiene el mismo efecto. La respuesta adopta Ia forma de una mayor capacidad de reparacion del DNA daiiado, que se logra mediante Ia induccion de la sfntesis de los componentes del sistema de reparaci6n por escisi6n de parche largo y las vfas de reparacion por recombinaci6n Rec. Ademas, se inhibe Ia division celular. Se pueden inducir profagos lisogenicos. El episoclio inicial de Ia respuesta es Ia activacion de RecA par el tratamiento daiiino. No se sabe mucho de Ia relacion entre el suceso daiiino y el cambia 20.10 La RecA desencadena el sistema 505

513

CIRCUITO REGULADOR

t

1 Gen recA reprimido

Gen /exA

GENES DIANA

I Gen diana reprimido

INDUCCI6N DE RecA El RecA desencadena Ia escisi6n de LexA

Gen recA inducido

Gen lexA

Gen diana expresado

La prote\na LexA reprime muchos genes, incluso las funciones de reparaci6n, recA y /exA. La activaci6n de RecA lleva a la escisi6n proteol\tica de LexA e induce a todos estos genes.

Sttbito en Ia actividad de RecA. Una diversidad de episodios lesivos puede inducir la respuesta SOS; por ello, el trabajo actual se centra en la idea de que la RecA se activa por Ia presencia de algun producto intermedio comun en el metabolismo del DNA. Es probable que la sefi.al inductora consista en una pequefia molecula liberada del DNA o alguna estructura formada en el DNA mismo. In vitro, Ia activaci6n del RecA requiere la presencia de DNA de cadena {mica y ATP. De este modo, Ia sefi.al de activaci6n podria ser la presencia de una region de Cadena unica en un sitio de daiio. Cualquiera que sea la forma que adopte la sefi.al, su interacci6n con RecA es rapida : la respuesta SOS ocurre en unos cuantos minutos despues de iniciar el tratamiento lesivo. La activaci6n de RecA causa la escisi6n proteolitica del producto del gen lexA. La LexA es una proteina pequefi.a (22 kD) relativamente estable en celulas no tratadas, donde actua como represora en muchos operones. La reacci6n de escisi6n es inusitada; Ia LexA tiene una actividad latente de proteasa activada por RecA. Cu ando se activa Ia RecA, hace que LexA realice una escisi6n autocatalftica; esto desactiva Ia funci6n del represor LexA e induce de manera coordinada a todos los operones a los que se uni6. La via se ilustra en la Los genes diana para la represi6n por LexA incluyen muchas funcion es de reparaci6n. Algunos de estos genes SOS son activos en celulas tratadas; otros son activos en celulas no tratadas, pero el gra514


do de expresi6n aumenta con la escisi6n de Le En el caso de uvrB, que es componente del siste de reparaci6n por escisi6n, el gen tiene dos pro::tores; uno actua de manera independiente de Lr~. el otro esta sujeto a su control. Asi, despues cit escisi6n de LexA, el gen se puede expresar des ·: segundo promotor y tambien desde el primero. La proteina LexA reprime sus genes dian :: unirse a un segmento de 20 bp del DNA lla m~ ~ caja SOS, que incluye una secuencia de conse:con ocho posiciones absolutamente conservaL..:: Como ocurre con otros operadores, las cajas 5 se superponen con los promotores respectivos. :=. el locus lexA , sujeto de la represi6n aut6gena, dos cajas SOS cercanas. En el circuito SOS RecA y LexA son diamutuas: la RecA desencadena Ia escisi6n de Lcque reprime arecA y a si misma. La respuesta S por tanto, causa amplificaci6n de la protefna Re-asf como del represor LexA. Los resultados no ~ tan contradictorios como podrian parecerlo al Pcipio. El au men to de Ia expresi6n de la protefna R..:- · es necesario (al parecer) para su participaci6n di::ta en las vias de reparaci6n por recombinaci6n. C Ia inducci6n, Ia concentraci6n de RecA aume: respecto de su cifra basal de - 1200 moleculas/ce: _ hasta por 50 tantos. Su alta concentraci6n en c ' __ las inducidas indica que hay suficiente RecA = asegurar que se fragmente toda la proteina Le_lo que deberfa impedir que LexA restablecierc. represi6n de los genes diana. No obstante, la principal importancia de e. circuito para la celula yace en su capacidad de ~ tornar con rapidez a Ia normalidad. Cuando se r Ia seiial de inducci6n, la proteina RecA pierde capacidad de desestabilizar a LexA. En este mome- to, el gen lexA se esta expresando en un grado a.> en ausencia de RecA activada, Ia protefna Lex..:.. . acumula con rapidez en la forma no fragmemc.. y desactiva los genes SOS, lo que explica porqut respuesta SOS se revierte con libertad. La RecA tambien desencadena la escisi6n · otras dianas celulares, a veces con consecuenc : mas directas. La proteina UmuD se escinde cu -do se activa Ia RecA; el episodio de escisi6n a ..: UmuD y el sistema de reparaci6n susceptible errores. El modelo actual para la reacci6n es que complejo UmuD 2 UmuC se una al filamento Re~ cerca de un sitio de daiio, RecA active el comp>: mediante la escisi6n de UmuD para generar Urn -y el complejo, entonces, sintetice un segmento DNA para sustituir el material dafiado. La activaci6n de RecA tambien causa esci : de algunas otras proteinas represoras, como la _ _

~·arios

profagos. Entre elias esta el represor A (con ;>] que se descubri6 !a actividad de proteasa), lo que i'xplica porque se induce A por irradiaci6n ultra:ioleta; se fragmenta el represor lisogenico, lo que ~ibera el fago para ingresar a! ciclo lftico. Esta reacci6n no es una respuesta celular SOS, >ino que mas bien significa que el profago reconoce .:jUe la celula esta en problemas. Entonces, ]a super•,•ivencia se asegura de la mejor forma mediante el ingreso al ciclo lftico para generar una progenie de :agos. En este sentido, la inducci6n de profagos se 3.poya en el sistema celular al responder al mismo indicador (activaci6n de RecA) . Las dos actividades de RecA son relativamente :ndependientes. La mutaci6n recA441 permite que curra la respuesta SOS sin tratamiento de induc·an, tal vez porque RecA se mantiene de manera espontanea en el estado activado. Otras mutaciones suprimen Ia posibilidad de activaci6n. Ning(m tipo e mutaci6n afecta la capacidad de RecA de manejar el DNA. El tipo inverso de mutaci6n, que desactiva ~a funci6n de recombinaci6n pero deja intacta la ca;Jacidad de inducir !a respuesta SOS, permitirfa desenmarafiar los efectos directo e indirecto de RecA -:n las vfas de reparaci6n.

Las celulas eucari6ticas tienen sistemas de reparaci6n conservados Ccnceptos principales • Las mutaciones RAD de levaduras, identificadas por fenoti pos sensibles a la radiaci6n, ocurren en genes que codifican sistemas de reparaci6n. • La xerodermia pigmentosa (XP) es una enfermedad humana causada por mutaciones en cualquiera de varios genes de reparaci6n. • Un complejo de proteinas, que incluye productos de XP y el factor de transcripci6n TFnH, provee en los seres humanos un mecanismo de reparaci6n por escisi6n. • Los genes con actividad transcripcional se reparan de manera preferente.

os tipos de funciones de reparaci6n reconocidas en E. coli los comparten una amplia variedad de or:ganismos. Los sistemas eucari6ticos mejor descritos ·on las levaduras, donde Rad5l es !a contraparte 1e RecA. En las levaduras, la principal funci6n de :a protefna de transferencia de cadenas es Ia recom) inaci6n hom6loga . Muchos de los sistemas de re;:>araci6n que se observan en las levaduras tienen .:ontrapartes directas en las celulas eucari6ticas su. eriores, yen varios casos estos sistemas tienen que ·.-er con enfermedades humanas.

Los genes RAD intervienen en las funciones de reparaci6n; se han descrito en terminos geneticos en las levaduras por su sensibilidad a Ia radiaci6n. Hay tres grupos generales de genes de reparaci6n en la levadura S. cerevisiae, identificados por el grupo RAD3 (involucrado en !a reparaci6n por escisi6n), el grupo RAD6 (indispensable para !a reparaci6n posterior a Ia replicaci6n) y el RAD52 (encargado de mecanismos similares a !a recombinaci6n). El grupo RAD52 se divide en dos subgrupos por una diferencia de feno tipos mutantes. Un subgrupo afecta la recombinaci6n hom6loga, como se observa por !a disminuci6n de !a recombinaci6n mit6tica en RAD50, RAD51 , RAD54, RAD55 y RAD57. Estas protefnas Rad forman un complejo multiprotefnico en una rotura de !a doble cadena. Despues de que una exonucleasa ha actuado en los extremos libres para generar colas de una sola cadena, !a Rad5l inicia el proceso al unirse al DNA de cadena unica para formar un filamento de nucleoprotefnas. Las protefnas Rad52, Rad55 y Rad54 se unen entonces de manera secuencial al filamento. Por el contra rio, los indices de recombinaci6n se incrementan en las mutantes RAD59, M REII y XRS2; este subgrupo no tiene deficiencia en la recombinaci6n hom6loga, pero sf en las reacciones de union al DNA no hom6logas. Una superfamilia de polimerasas de DNA que interviene en Ia sfntesis de DNA para sustituir el material en los sitios dafiados se identifica por los genes dinE y umuCD que codifican las polimerasas IVy V de DNA en E. coli, el gen RAD30 que codifica una polimerasa T] de DNA en S. cerevisiae y el gen XPV, que codifica el hom6logo humano. Algunas veces se Jes llama polimerasas de DNA translesi6n. Una diferencia entre las enzimas bacteriana y eucari6tica es que Ia ultima noes susceptible de error en los dimeros de tirninas: introducen con exactitud un par A-A en oposici6n a un dimero T- T. Sin embargo, cuando se replican en otros sitios de dafio, son mas susceptibles de introducir errores. Una caracterfstica interesante de !a reparaci6n que se h a descrito mejor en las Jevaduras es su conexi6n con !a transcripci6n. Los genes con actividad transcripcional se reparan de manera preferente. La consecuencia es que Ia cadena transcrita se repara de manera preferente (lo que elimina el impedimenta de Ia transcripci6n). La causa parece ser una conexi6n m ecanica entre el aparato de reparaci6n y !a polimerasa de RNA. La protefna Rad3, que es una helicasa indispensable para el paso de !a escisi6n, es un componente de un factor de transcripci6n vinculado con la polimerasa de RNA (vease Ia secci6n 24.1 2, Una conexi6n entre transcripci6n y reparaci6n) . Las celulas de los mamfferos muestran h eterogeneidad en la cantidad de DNA resintetizado en

20.11 Las celulas eucari6ticas tienen sistemas de reparaci6n conservados

515

El DNA esta danado

XPF ERCC1 XPD

XPB helicasas

endonucleasas

TF 11H abre Ia doble helice

XPG

XPF ERCC1

XPG escinde el extrema 3' de Ia lesion

XPF ERCC1

XPF/ERCC1 escinde el sitio 5' de Ia lesion

meros de timinas. En Ia se muestr.i participacion e n Ia vfa de reparacion. El comp ::: se une al DNA en un sitio de dano, tal vez por _ mecanismo que implica la accion colaboradora _ varios de sus comp on entes. Las cadenas de DN_.:. desenrollan entonces casi 20 bp alrededor de~ s~ dafiado. Esta accion la emprende la actividad de - . helicasa del factor de transcripcion TF11H, en sf_ mo un gran complejo que inclu ye los producto_ varios genes XP y que participa en la reparacion _DNA danado que encuentra la polimerasa de R durante Ia transcripcion . Despues, las endonu · · sas codificadas por gen es XP hacen cortes a c:;_ !ado de Ia lesion. El segm en to de una sola ca dc~ que incluye las bases dafiadas puede, entonces, s·_ tituirse mediante la sfntesis de una de reposicio" En casos donde Ia replicacion se encuentra · un dfmero de timinas que no ha sido retirad requiere Ia actividad de polimerasa 11 de DNA p; avanzar y dejar an·as el dfmero, el cual es codifi c _ por XPV. Los canceres de pie! que ocurren en . mutantes de XPV se de ben, al parecer, a Ia peru _ de Ia polimerasa de DNA.

BiD

Un sistema comCm repara las roturas de doble cadena

Conceptos principales • La v\a NHEJ puede ligar extremos romos de DNA duplex. Una helicasa desenrolla el DNA en un sitio dafiado, las endonucleasas cortan a ambos lados de la lesion y se sintetiza un nuevo DNA para sustituir el segmento extirpado.

cada lesion despues de un dano. No obstante, los parches son siempre relativamente cortos, de menos de 10 bases. Ciertas enferm edades hereditarias humm1as ofrecen indicios de Ia existencia y la importancia de los sistemas de reparacion en los mamfferos . La que mejor se ha investigado es la xerodermia pigmentosa (XP), un trastorno recesivo que causa h ipersensibilidad a Ia luz del sol, y en particular a su fraccion ultravioleta. La deficiencia causa trastornos cutaneos (y a veces defectos mas graves) . La enfermedad se debe a u n a deficiencia en la reparacion por escision. Los fibroblastos de los padentes con XP no pueden cortar dfmeros de pirimidinas y otros productos voluminosos. Las mutacion es se encuentran en och o genes conocidos como XP-A a XP-G. Tienen homologos en los gen es RAD de las levaduras, lo que muestra qu e esta vfa se usa en forma gen eralizada en las eucariotas. Un complejo protefnico que incluye productos de varios genes XP se encarga de Ia escision de df-

516


• Las mutaciones en la v\a NHEJ causan enfermedades los seres humanos.

=-

Ocurren roturas de Cadena doble en las eel - bajo diversas circunstancias. Inician el proceso : recombinacion h omologa y son intermediaria _ : Ia recombinacion de los genes de inmunoglobu li!" (vease la secci6n 23 .10, Las protefnas RAG catalL·...o Ia rotura y reunion) . Tam bien se presentan c . consecuencia del dano al DNA; por ejemplo, ~ irradiacion. El principal m ecanismo pa ra repa- estas roturas se denomina union de extremos h omo lo gos (NHEJ) y consiste en juntar y liga~ extremos romos. Los pasos comprendidos en NHEJ se resu E: en Ia . El mismo complejo enzim a· _ realiza el proceso en NHEJ y la recombinaci6n munitaria. La primera etapa es el reconocimiem _ los extremos rotos por un heterodfmero constitt; _ por las protefnas Ku70 y Ku80, que forman un t ' tidor que mantiene juntos los extremos y penT que otras enzimas actuen sobre ellos. Un cor . nente clave es la cinasa de protefnas dependiemc: DNA (DNA -PKcs), que es activada por el DNA .:.

forilar dianas protefnicas. Una de estas dianas es ' protefna Artemis, que en su forma activada tiene :Kiones de exonucleasa y endonucleasa, y puede rtar extremos colgantes y escindir las horquillas __ neradas por recombinacion de genes de inmuno- bulinas. Nose conoce Ia actividad de Ia polimera..:. de DNA qu e Ilene cualquier protrusion restante . -: una sola cadena. La union real de los extremos de . :. doble cadena Ia realiza Ia ligasa IV del DNA, que - ::tlwjunto con Ia protefna XRCC4. Las mutaciones : cualquiera de estos componentes pueden hacer .as celulas eucarioticas mas sensibles a Ia radia' n. Algunos de los genes de estas protefnas tienen -:::.nacion en pacientes con enfermedades debidas a __ ficiencias en !a reparaci6n del DNA. El heterodimero Ku es el sensor que detecta el .:. no del DNA mediante Ia union a los extremos -. tos . La estructura cristalina en Ia .uestra que se une solo a los extremos. El cuerpo -:: Ia protefna se extiende casi dos giros sobre una .=.ra del DNA (inferior), pero un puente estrecho ::::!tre las subunidades localizado en el centro de Ia _ :ructura rodea por completo al DNA, lo que sig- :fica que el heterodfmero necesita deslizarse bacia 1 extremo libre. El Ku puede unir extremos rotos a! enlazar dos - .oleculas de DNA. La capacidad de los heterodf_eros de Ku de vincularse entre si, sugiere que Ia -.accion tal vez ocurra como se ilustra en Ia f 2 . Esto presagiarfa que Ia ligasa actuase por n i6n en Ia region entre los puentes de heterodf-::eros individuales. AI parecer, Ku debe cambiar su -rructura para ser liberado del DNA. La deficiencia en Ia reparacion del DNA causa 3rias enfermedades humanas. El rasgo comun es : te una imposibilidad de reparar roturas de doble _::.dena en el DNA !leva a Ia inestabilidad cromomica. La inestabilidad se revela por aberraciones mos6rnicas, que se vinculan con una mayor tasa 7 mutaciones, lo que a su vez conduce a una mayor Jsceptibilidad a! cancer en los pacientes afectados. ~ causa basica puede ser la mutaci6n en vfas que : ntrolan Ia reparacion del DNA o en genes que co_fican enzimas de los complejos de reparacion. Los ~ notipos pueden ser muy sirnilares, como en el caso ·:: Ia telangiectasia con ataxia (AT), que se debe a n fracaso de Ia vfa de punto de revision del ciclo .7lular, y el sfndrome de rotura de Nijmegan (NBS), Je es causado por una mutacion de una enzima de -_paracion. Una de las lecciones que se han aprendide Ia descripcion de las vfas de reparaci6n es que -: conservan en mamfferos, levaduras y bacterias. La enfermedad recesiva humana llamada sfn_:-ome de Bloom es producto de mutaciones en un _en de helicasa (llamado BLM) que es homologo ~- recQ de E. coli. La mutacion causa una mayor fre-

Reconocimiento Dfmero Ku del extrema

I

t

5' NNNNN 3'NNNNN NMNN Artemis + DNA-PK

Recorte

N N N3' N N N N 5' Enzima desconocida

Llenado 5' N N N N N 3'NNNNN Ligacion

I

t

N

Ligasa IV de 1 DNA+ XRCC4f

5'N N N N N N N N N N N 3' 3' N N N N N N N N N N N 5'

Para la union de extremes no hom6logos es indispensable el reconocimiento de los extremes rotos, el recorte de los extremes colgantes, elllenado, o ambos, seguidos de la ligaci6n.

=

El heterodlmero Ku70-Ku80 se une a lo largo de dos giros de la doble helice del DNA y la rodea en el centro del sitio de union. Fotografta por cortesla de Jonathan Goldberg, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

cuencia de roturas cromosomicas e intercambios de cromatidas hermanas. La BLM se vincula con otras protefnas de reparacion como parte de un complejo grande. Una de las protefnas con las que interactua 20.12 Un sistema comun repara las roturas de doble cadena

517

otras proteinas Si dos heterod1meros de Ku se unen al DNA, la distancia entre los dos puentes que rodean el DNA es de -12 bp.

es hMLHl, que repara apareamientos erroneos y es homologa humana de la mutL bacteriana. Los homologos de levaduras de estas dos protefnas, Sgsl y MLHl tambien se asocian, lo que identifica a sus genes como parte de una via de reparacion bien conservada. El sfndrome de rotura de N~megan es producto de mutaciones en un gen que codifica una protefna (Hamada de manera variable Nibrina, p95, o NBSl) que es un componente del complejo de reparaci6n Mre ll /Rad50. Su participacion en la reparacion de roturas de la doble cadena queda de manifiesto por la formacion de focos que contienen el grupo de protefnas cuando se irradian celulas humanas con agentes que inducen roturas de doble cadena. Despues de la irradiaci6n, la cinasa ATMP (codificada por el gen AT) fosforila a NBSI; esto activa el complejo, que se localiza en sitios de DNA dafiado. Los pasos siguientes comprenden el desencadenamiento de un punto de revision (un mecanismo que impide que el ciclo celular avance hasta que se repare el dafio) y el reclutarniento de otras proteinas que se requieren para reparar el dafio.

Bill

Resumen

Las bacterias contienen sistemas que mantienen la integridad de sus secuencias del DNA ante dafios o errores de replicaci6n y que distinguen entre el DNA y secuencias de una fuente extrana. Los sistemas de reparacion pueden reconocer bases mal apareadas, alteradas o faltantes en el DNA, asf como otras distorsiones estructurales de la doble helice. Los sistemas de reparaci6n por escisi6n fragmentan el DNA cerca del sitio del dano, retiran una cadena y sintetizan una nueva secuencia para sustituir el material extirpado. El sistema Uvr constituye la principal via de reparacion por escision en E. coli. El sistema dam participa en la correccion de aparearnientos erroneos generados por la incorporacion de bases incorrectas durante la replicacion 518

CAPiTULO 20 Sistemas de reparaci6n

y actua al retirar de manera preferente Ia bas:: Ja cadena de DNA que no esta metilada en :cuencia diana dam. Los homologos eucariotic : sistema MutSL de E. coli participan en la repara de apareamientos err6neos que provienen del :. lizamiento de Ia replicaci6n; las mutaciones e::. via son frecuentes en ciertos tipos de cancer. Los sistemas de reparacion por recombina obtienen informacion a partir de un DNA dup:O:la utilizan para reparar una secuencia que h a __ dafiada en ambas cadenas. Las vias RecBC y ? actuan ambas antes de RecA, cuya funcion de tF ferenda de cadenas participa en toda recombina bacteriana. Un uso importante de la reparaci6r:. recombinacion puede ser recuperarse de Ia cira:.::.. tancia creada cuando se queda varada una horq- ~ de replicacion. La otra capacidad de RecA es la de inducrespuesta SOS. La RecA es activada por el DNA :_ fiado en una forma desconocida. Desencadenescision de la proteina represora LexA, que asf lir::la represion de muchos loci e induce Ia sfntesi: .:. enzimas de las vias de reparacion por escision v :paracion por recombinaci6n. Los genes bajo co- ;:de LexA poseen una caja SOS operador. La Rt .:..tambien activa de manera directa algunas for de reparacion. La escision de represores de fa; lisogenicos puede inducir a los fagos a entrar al d.:: litico. Los sistemas de reparacion pueden conectc.. con Ia transcripcion en procariotas y eucariotas. ::.__: enfermedades humanas se deben a mutaciones ::- los genes que codifican actividades de reparac:- que se asocian al factor de transcripcion TF TJH. r:_ nen homologos en los genes RAD de las levaduE Jo que sugiere que este sistema de reparacion e;· muy generalizado. La union de extremos no homologos (NHEJ1:: una reaccion general para Ia reparaci6n de extrerr.rotos del DNA (eucariotico). El heterodimero -_ reline los extremos rotos de man era que pued-ligarse. Varias enfermedades humanas son produc de mutaciones en enzimas de esta via.

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Los sistemas de reparaci6n corrigen el daiio al Dt#

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ransposones ESQUEMA DEL CAPITULO Introducci6n Las secuencias de inserci6n son m6dulos de transposici6n sencillos • Una secuencia de inserci6n es un transpos6n que codifica las enzimas necesarias para la transposici6n, flanqueadas por repeticiones terminates invertidas cortas. • El sitio diana donde se inserta el transpos6n se duplica durante el proceso de inserci6n para formar dos repeticiones en orientaci6n directa en los extremes del transpos6n. • La longitud de la repetici6n directa es de 5 a 9 bp yes caracteristica para cualquier transpos6n particular

Los transposones compuestos tienen m6dulos IS

liD

• La replicaci6n de un complejo de transferencia de cadenas genera un cointegrado, que es una fusion de los replicones donador y diana. • El cointegrado tiene dos capias del transposon que yacen entre los replicones originates. • La recombinacion entre las capias del transposon regenera los replicones originales, pero el receptor ha ganado una copia del transposon. • La reacci6n de recombinaci6n es catalizada par una resolvasa codificada por el transpos6n.

6131

• Los transposones pueden portar otros genes ademas de los que codifican la transposici6n. • Los transposones compuestos tienen una region central flanqueada par un elemento IS en cada extrema. • Cada uno o ambos elementos IS de un transpos6n compuesto pueden realizar la transposici6n. • Un transposon compuesto puede actuar como unidad, pero un elemento IS activo en cualquier extrema tambien puede realizar la transposicion de manera independiente.

La transposici6n ocurre por mecanismos replicativos y no replicativos

6D

• La transposicion se inicia con la formacion de un complejo de transferencia de cadenas donde el transposon se conecta con el sitio diana a traves de una cadena en cada extrema. • La transposasa Mu forma el complejo par sinapsis de los extremes del DNA de Mu, seguida de la form acion de hendiduras y luego una reacci6n de transferencia de cadena. • Ocurre a continuaci6n transposicion replicativa si el complejo se reproduce, y transposicion no replicativa si se repara.

• La transposicion no replicativa ocurre cuando se hace una hendidura en una estructura entrecruzada en el par no roto de las cadenas donadoras y se ligan las cadenas diana a cada lado del transposon. • Dos vias para la transposicion no replicativa difieren de acuerdo a que el primer par de cadenas del transpos6n se una al sitio diana antes de que se corte el segundo par (Tn5), o que las cuatro cadenas se corten antes de unirse a la diana (TnlO) . La transposici6n de TnA requiere transposasa y • La transposicion replicativa de TnA requiere que una transposasa forme la estructura cointegrada y una resolvasa libere los dos replicones. • La acci6n de la resolvasa se asemeja a la proteina Int f.. y pertenece a la familia general de reacciones de recombinaci6n especificas de sitio similares a las de topoisomerasa, que pasan par un intermediario donde la proteinase une de manera covalente al DNA.

Los transposones causan reestructuraci6n del DNA

6B Intermediarios comunes para la transposici6n

La transposici6n no replicativa avanza por rotura y reunion

resolvasa

• Todos los transposones utilizan un mecanismo comun donde se hacen hendiduras escalonadas en el DNA diana, el transposon se une a los extremos prominentes y se llenan las brechas. • El orden de los episodios y la naturaleza exacta de las conexiones entre el transposon y el DNA diana determinan si la transposicion es replicativa 0 no replicativa. • La recombinaci6n hom6loga entre multiples copias de un transpos6n causa reestructuracion del DNA hospedador. • La recombinacion homologa entre las repeticiones de un transpos6n puede llevar a la escisi6n precisa o imprecisa.

La transposici6n replicativa avanza a traves de un cointegrado

f:DIM

La transposici6n de Tn10 tiene multiples controles • La inhibici6n de capias multiples reduce la tasa de transposicion de cualquier copia de un transposon cuando se introduce otras del mismo transposon en el genoma. • Multiples mecanismos afectan la tasa de transposicion.

DO Los elementos de control en el ma\z causan roturas y reestructuraciones • Se descu bri6 la transposici6n en el maiz par los efectos de las roturas cromos6micas generadas par la transposici6n de "elementos de control". • La rotura genera un cromosoma que tiene un centromere y un extrema roto, asi como un fragme nto acentrico. Continua en Ia siguiente p6gina

521

• El fragmento acentrico se pierde durante la mitosis; lo que puede detectarse por la desaparicion de alelos dominantes en un heterocigoto. • La fusion entre los extremes rotos del cromosoma genera cromosomas dicentricos, que presentan mas ciclos de rotura y fusion. • El ciclo fusion-rotura-puente se encarga de la aparicion de la variegacion somatica.

6116

Los elementos de control forman familias de tra nsposones • Cada familia de transposones en el maiz tiene elementos de control, autonomos y no autonomos. • Los elementos de control autonomos codifican proteinas que les permiten realizar la transposicion. • Los elementos de control no autonomos tienen mutaciones que eli minan su capacidad de catalizar La transposicion, pero pueden realizarla cuando un elemento autonomo proporciona las proteinas necesarias. • Los elementos de control autonomos tienen cambios de fase cuando sus propiedades se alteran como resultado de cambios en el estado de metilacion .

liJD)

Los elementos Spm influyen en la expresi6n genica

liiiB

Intervenci6n de los elementos susceptibles de transposici6n en la disgenesia hibrida •

Los elementos P son transposones que portan las cepas P de Drosophila melanogaster, no asi las cepas M. • Cuando un macho P se cruza con una hembra M, se activa Ia transposicion. • La insercion de elementos P en sitios nuevas en esas cruzas desactiva muchos genes y las hace infecuncilas.

fj&I1J

Los elementos P se activan en la linea germinal • Los elementos P se activan en la linea germinal de cruzas de macho P con hembras M, porque un episodic de corte y empalme especifico de tejido retira un intr6n que genera La secuencia de codificaci6n de La transposasa. • El elemento P tam bien produce un represor de la transposici6n, que se hereda por via materna en el citoplasma. • La presencia del represor explica porque las cruzas de machos Mcon hembras P se mantienen fecundas.

Drit

Resumen

• Los elementos Spm afectan La expresion genica en sus sitios de insercion, cuando la proteina TnpA se une a sus sitios diana en los extremes del transposon. • Los elementos Spm se desactivan par metilacion.

111

Introducci6n

Los genomas evolucionan por Ia adquisici6n de nuevas secuencias y Ia reestructuracion de las existentes. La introducci6n subita de nuevas secuencias se debe a Ia capacidad de los vectores de ll evar informacion entre los genomas. Los elementos extracromos6micos !levan Ia informacion en sentido horizontal al mediar Ia transferencia (por lo general bastante cmta) de material genetico. En las bacterias, los plasmidos se mueven por conjugacion (vease Ia secci6 n 16.10, La conjugaci6n transfiere DNA de Cadena unica), en tanto los fagos se diseminan por infeccion (vease el Capitulo 14, Estrategias de los fagos). Plasmidos y fagos en ocasiones transfieren genes hospedadores junto con su propio replicon. La transferencia directa de DNA tiene Iugar e ntre algunas bacterias mediante transformacion (vease Ia secci6n 1.2, El DNA es el material genetico de las bacterias). En eucario tas, algun os virus, sobre todo retrovirus, pueden transferir informacion genetica durante un ciclo infeccioso (vease Ia secci6n 22.6, Los retrovirus pueden transducir secuencias celulares) . Las reestructu raciones son patrocinadas por procesos internos del genoma. Dos de las principales causas se resumen en Ia

522

CAPITULO 21 Transpasanes

I

•

El transpos6n genera una nueva copia en un sitio aleatoric

Ocurre entrecruzamiento no equivalente entre secuencias relacionadas

X

Una causa impartante del cambia de secuenci= dentro del genama es el desplazamienta de un transpas6n aunuevo sitio. En acasiones esto tiene cansecuencias directas e· la expresi6n genica. El entrecruzamiento no equivalente ent c secuenci as relacionadas ca usa reestructuraciones. Las capias d= transpasanes pueden ofrecer dianas para tales sucesos.

La recombinacion no equivalente es producto : el apareamiento erroneo por los sistemas celulares _ara Ia recombinacion bomologa. La recombinacion :10 reciproca da como resultado Ia duplicacion ore~tructuracion de loci (vease Ia seccion 6.7, El en:recruzamiento no equivalente reestructura grupos j e genes). La duplicacion de las secuencias dentro 'e un genoma constituye una fuente importante de ::~uevas secuencias. Una copia de Ia secuencia puede -etener su fun cion original, en tanto Ia otra evolujona bacia una nueva funcion. Es mas, se encuen'Tan diferencias significativas entre genomas indiviuales en el ambito molecular debido a variaciones polimorficas causadas por la recombinacion. Como se aprecio en Ia seccion 6.14, Los minisatelites son -:ttiles para el mapeo genetico, esa recombinacion entre minisatelites se ajusta en su longitud, de ma:lera que cada genoma individual sea diferente. Otra causa importante de variacion Ia consti~uyen los elementos susceptibles de transposicion o transposones: se trata de secuencias bien efinidas en el genoma, que son moviles y pueden .ransportarse a sf mismas a otras localizaciones denIro del genoma. La marca distintiva de un transposon es que no utiliza una forma independiente del elemento (como DNA de fago o plasrnido), sino que se traslada de manera directa de un sitio del genoma a otro. A diferencia de casi todos los demas procesos comprendidos en la reestructuracion del genoma, Ia transposicion no depende de alguna relacion entre las secuencias de los sitios donador y receptor. Los transposones solo pueden moverse a sf mismos, y a veces a otras secuencias, b acia sitios nuevos en otra parte dentro del mismo genoma; son, por tanto, Ia contraparte interna de los vectores, que puede transportar secuencias de un genoma a otro. Es posible que constituyen Ia principal fuente de mutaciones en el genoma. Los transposones pertenecen a dos clases generales. El grupo de transposones revisado en este capitulo corresponde a secuencias de DNA que codifican protefnas que pueden manipular el DNA, de manera que se propaguen a sf mismas dentro del genoma. Los transposones revisados en el Capitulo 22, Retrovirus y retrotransposones, tienen relacion con los retrovirus y Ia fuente de su movilidad es Ia capacidad de bacer copias del DNA de sus productos de transcripcion del RNA; las copias de DNA se integran entonces a nuevos sitios en el genoma. Los transposones que se movilizan por medio del DNA se encuentran en procariotas y eucariotas. Cada transposon bacteriano porta genes que codifican las actividades enzimaticas indispensables para su propia transposicion, si bien en ocasiones tambien requieren funciones auxiliares del genoma

don de reside (como la polimerasa o Ia girasa del DNA). Hay sistemas semejantes en las eucariotas, si bien sus funciones enzimaticas no estan tan bien definidas. Un genoma puede contener elementos funcionales y no funcionales (defectuosos). A menudo, Ia mayor parte de los elementos de un genoma eucariotico tiene defectos y ba perdido Ia capacidad de transposicion independiente, aun cuando todavfa las enzimas producidas por transposones funcionales pueden reconocerlos como sustratos para la transposicion. Un genoma eucariotico contiene un numero y una variedad grande de transposones. El genoma de Ia mosca tiene >50 tipos de transposones, con un total de varios cientos de elementos individuales. Los elementos susceptibles de transposicion pueden facilitar las reestructuraciones del genoma de manera directa o indirecta: • El episodio mismo de Ia transposicion puede causar deleciones o inversiones, o conducir al movirniento de una secuencia de hospedador bacia una nueva localizacion . • Los transposones sirven como sustratos para los sistemas de recombinacion celular cuando actuan como "regiones portatiles de homologfa"; dos copias de un transposon en diferentes localizaciones (incluso en cromosomas distintos) pueden proporcionar sitios para Ia recombinacion recfproca. Tales intercambios ocasionan deleciones, inserciones, inversiones o translocaciones. Las actividades interrnitentes de un transposon parecen ofrecer una diana algo nebulosa para Ia seleccion natural. Esa preocupacion ba dado Iugar a indicios de que los elementos susceptibles de transposicion (a! menos algunos) no confieren ventaja o desventaja al fenotipo, pero quiza constituyen un "DNA egofsta", aquel interesado solo en su propia propagacion. Ademas, cuando se considera Ia transposicion un episodio diferente del de los otros sistemas de recombinacion celular, se acepta de manera tacita Ja opinion de que el transposon es una entidad independiente que reside en el genoma. Tal relacion del transposon con el genoma se asemejaria a Ia de un parasito con su bospedador. Al parecer, la propagacion de un elemento por transposicion se equilibra con el dafio que bace si un episodio de transposicion desactiva un gen indispensable o si el numero de transposones se convierte en una carga para los sistemas celulares. No obstante, se debe recordar que cualquier suceso de transposicion que confiere una ventaja selectiva, por ejemplo, una reestructuracion genetica, llevara a Ia supervivencia preferente del genoma que porta el transposon activo. 21.1 Introducci6n

523

11J

Las secuencias de inserci6n son m6dulos de transposici6n sencillos

Conceptos principales • Una secuencia de inserci6n es un transpos6n que codifica las enzimas necesarias para la transposici6n, flanqueadas por repeticiones terminates invertidas cortas. • El sitio diana donde se i nserta el transpos6n se duplica durante el proceso de inserci6n para formar dos repeticiones en orientaci6n directa en los extremes del transpos6n . • La longitud de la repetici6n directa es de 5 a 9 bp yes caracteristica para cualquier transpos6n particular.

Los elementos susceptibles de transposicion se identificaron por prim era vez en el ambito molecula r en forma de inserciones espontaneas en operones bacterianos. Ese tipo de insercion impide la transcripcion, traduccion o ambas, del gen donde se inserta. Se han descrito hasta ahora muchos tipos diferentes de elementos susceptibles de transposicion.

12345§789 123456789

( '

987654321 - · 9876.54321

.

Gen de transposasa

n-----~~~~--~ A= TG 'v c~ A~------------~~---=-,

DNA del hospedador

Sitio diana

~

DNA del hospedador

987654321 ATGCA ~- -· 987654321 T ACGT

Repetici6n Repetici6n diana invertida

Transpos6n

Repetici6n diana {bp)

Transpos6n

Repetici6n Repetici6n diana 1nvert!da

Longitud Repetici6n invertida (bp) global (bp)

Selecci6n de diana

9 5

23

768

IS2

41

1327

puntos calientes

IS4 ISS

11-13 4

18 16

1428

AAAN2 oTTT punios calientes NGCTNAGCN

IS1

IS10R

9

22

11 95 1329

IS50R

9

18903

9

9 18

1531 1057

aleatoria

puntos calientes aleatoria

Los transposones tienen repeticiones termi na les invertidas y generan repeticiones directas del DNA de los flancos en el sitio diana. En este ejemplo, la diana es una secuencia de 5 bp. Los ext re mes del transpos6n constan de repeticiones de 9 bp invertidas donde los numeros uno a nueve indican una secuencia de pares de bases. 524

CAPITULO 21 Transposones

Los transposones mas sencillos se llaman s ~ cuencias de inserci6n (lo que refleja la forma _ que se detectan). Cada tipo recibe el prefijo IS se, do de un numero que lo identifica. (Las clases on= nales se enumeraron de IS 1 a IS4; las clases po_ : rio res tienen numeros que reflejan los antecederc·del aislamiento, pero que no corresponden ala 'total de elementos hasta entonces aislados.) Los elementos IS son constituyentes non-· les de los cromosomas bacterianos y plasmidos . .:: probable que una cepa estandar de E. coli conteL varias capias (menos de 10) de cualquiera de elementos IS mas comunes. Para describir una . sercion en un sitio particular se utiliza el sign a de man era que /c: :IS l describe la inserci6n de ~ elemento IS l en el fag o A. Los elementos IS son unidades aut6nomas, c una de las cuales codifica s6lo las protefnas in · pensables para patrocinar su propia transposici ~ Cada elemento IS tiene diferente secuencia, pe· comparten algun as caracterfsticas en su organiz:: cion. La estructura de un transposon generico an> y despues de Ia insercion en un sitio diana se ilu :: en la , que tambien resume los detaL de algunos elementos IS comunes. Un elemento IS termina en repeticiones t e:-minales inve rtidas cortas; par lo generaL las · capias de Ia repeticion tienen una relaci6n estre _ mas que ser identicas. Como se ilustra en la fig u..-: Ia presencia de repeticiones terminales inverti ·indica que se encuentra Ia mism a secuencia av -~ zando hacia el elemento desde el DNA del flan c ambos !ados. Cuando un elemento IS realiza transposici ·-: se duplica un a secuencia del DNA hospedador e. el sitio de insercion . La naturaleza de Ia dupl.ic cion queda de manifiesto cuando se compara . secuencia del sitio diana antes y despues de q h a ocurrido una inserci6n. La Figura 21.2 mu es·~ que en el sitio de inserci6n el DNA de IS siem ~: esta flanqueado por repeticiones d irectas m u cortas . (En este contexto, "directo" indica que !3. dos capias de una secuencia se repiten en Ia mis -' orientaci6n, no que sean cercanas. ) No obstante, e-el gen original (antes de la inserci6n), el sitio dia ~ tiene la secuencia de s6lo una de esas repeticion En Ia figura, el sitio diana consta de Ia secu en · ~1g6~- Despues de Ia transposici6n hay una co ~ de esta secuencia a cada lado del transpos6n. La secuencia de Ia repetici6n directa varia en .. : ep isodios individuales de transposici6n realizad por un transpos6n , pero la longitud es constan· para cualquier elem ento IS particular (reflejo d mecanismo de transposici6n) . La longitud mas fr.:cuente es de 9 bp para las repeticiones directas.

Por lo tanto, un elemento IS muestra una estructura caracterfstica donde sus extremos se identifican por las repeticiones terminales invertidas, mientras que los extremos cercanos del DNA del hospedador en los flancos se identifican por las repeticiones directas cortas. Cuando se observa ese tipo de organizacion en una secuencia de DNA, se considera como diagnostico de un transposon e indica que la secuencia se origino en un suceso de transposicion. Casi todos los elementos IS se insertan en una diversidad de sitios en el interior del DNA del hospedador; algunos, no obstante, muestran preferencia (grados variables) por puntas caJientes particulares. Las repeticiones invertidas definen los extremos de un transposon. El reconocimiento de los extremes es comun a los sucesos de transposicion patrocinados por todos los tipos de transposon. Las mutaciones que actuan en configuracion cis e impiden Ia transposicion se locaJizan en los extremos, que las protefnas encargadas de la transposicion reconocen. Las protefnas se Haman transposasas. Todos los elementos IS, excepto IS 1, contienen una sola region de codificaci6n larga, que se inicia apenas en el interior de Ia repeticion invertida en un extrema y termina apenas antes o dentro de la repeticion invertida en el otro extrema, el cual codifica Ia transposasa . La IS 1 tiene una organizacion mas compleja, con dos marcos de lectura independientes; la transposasa es producto de la estructuracion de un marco durante Ia traduccion para permitir el uso de ambas estructuras. La frecuencia de Ia transposicion varia entre los diversos elementos. El fndice global de transposicion es de -1 o-3 a casi l0 4 por elemento por genera cion. Las inserciones de dianas individuales tienen Iugar en un grado semejante al de Ia tasa de mutacion espontanea, por lo general -1 o-5 a 1o-7 por generacion. La reversion (por escision precisa del elemento IS) suele ser infrecuente, con una varia cion de 1 o--<~ a 1o-I o por genera cion, que es -10 3 veces menos frecuente que Ia insercion.

Bll

Los transposones compuestos tienen m6dulos IS

Conceptos principales • Los transposones pueden portar otros genes ademas de los que codifican la transposicion. • Los transposones compuestos tienen una region central flanqueada por un elemento IS en cada extrema. • Cada uno o ambos elementos IS de un transposon compuesto pueden realizar la transposicion. • Un t ransposon compuesto puede actuar como unidad, pero un elemento IS activo en cualquier extrema tambien puede realizar la transposici6n de manera independiente.

Algunos transposones portan marcadores de resistencia farmacologica (u otros) ademas de sus funciones relativas ala transposicion. Esos transposones se denominan Tn seguido de un nt1mero. Una clase de los transposones mas grandes se denomina de elementos compuestos, porque una region central que porta el marcador farmacologico es flanqueada por ''brazos" que cons tan de elementos IS. Los brazos pueden tener la misma orientacion (lomas frecuente) o invertida . Asf, un transposon compuesto con brazos que corresponden a repeticiones directas tiene la estructura Region central

Arml

ArmR

Si los brazos tienen repeticiones invertidas, Ia estructura es Region central

Arml

ArmR

Las flechas indican Ia orientacion de los brazos, que se identifican como L y R de acuerdo con una oriemaci6n (arbitraria) del mapa genetico del transposon, de izquierda a derecha. La estructura de un

Los m6dulos IS se repiten

ISR = derecho Marcadores del transpos6n

El modulo IS tiene repeticiones invertidas

El m6dulo IS tiene repeticiones invertigas Ejemplo Tn9 IS1

M6dulos IS identicos, ambos funcionales

Los m6dulos IS estan invertidos

Ejemplo Extrema Izquierdo

Marcadores

Extremo derecho

Tn903

IS903

kanR

Ambos extremos IS son funcionales

Tn10

IS10L no funcional

tetR

IS10R funcional

Tn5

IS50L no funcional

kanR

IS50R funcional

Un transpos6n compuesto tiene una region central que porta los marcadores (como el de resistencia a farmacos) flanqueados par modulos IS, que tienen repeticiones termina les invertidas cortas. Si los m6dulos mismos estan en orientaci6n invertida, las repeticiones terminales cortas invertidas en los extremos del transpos6n son identicas. 21.3 Los transposones compuestos tienen m6dulos IS

525

El transpos6n se integra al DNA circular

I

+ tet'

IS10L

IS10R

Resultado 2

El transpos6n Tn10 se desplaza otra vez

El nuevo transpos6n creado por movilizaci6n de m6dulos IS1 0 en orientaci6n altern at iva

Dos m6dulos IS10 crean un transpos6n compuesto que puede movilizar cualquier region del DNA que yace entre ellos. Cuando TnlO es parte de una molecula circular pequena, las repeticiones IS10 pueden tener transposici6n a cada lado del c1rculo.

transposon compuesto se ilustra con mayor detalle en Ia , donde tambien se resumen las propiedades de algunos transposones compuestos comunes. Los brazos constan de modulos IS y cada uno tiene Ia terminacion habitual de Ia estructura de repeticiones invertidas; como resultado, el transposon compuesto tambien termina con las mismas repeticiones invertidas cortas. En algunos casos, los modulos de un transposon compuesto son identicos, como Tn9 (repeticiones directas de IS l) o Tn903 (repeticiones invertidas de IS903). En otros casos, los modulos tienen relacion estrecha, pero no son identicos. Por tanto, se pueden distinguir los modulos L y R en TnlO o en TnS. Un modulo IS funcional puede hacer transposicion de sf mismo o de todo el transposon. Cuando los modulos de un transposon compuesto son ictenticos, parece que cualquiera de ellos puede patrocinar el movimiento del transposon, como en el caso de Tn9 o Tn903. Cuando los modulos son distintos, tal vez difieran en su capacidad funcional, de manera que Ia transposicion quiza dependa por completo 5-26


o de manera principal de uno de los modulos, com en el caso de TnlO o TnS. Se asume que los transposones compuestosevolucionaron cuando dos modulos en un principi independientes se vincularon con Ia region centra: Tal situacion pudiese surgir cuando un elemento I ~ se transpone a un sitio receptor cercano a! sitio do· nador. Dos modulos identicos pueden mantenerst iguales o diferenciarse. La capacidad de un solo m odulo de realizar transposicion de todo el elementc compuesto explica la falta de presion selectiva sob re ambos modulos para mantenerse activos. ;_Que se encarga de la transposicion de u transposon compuesto en Iugar de solo el modul individual? Esta pregunta es en especial problematica cuando ambos modulos son funcionales. En e. ejemplo de Tn9 donde los modulos son element IS l, parece que cada uno es activo por su prop ;~ cuenta, asf como en nombre del transposon COIT puesto. ;_Por que se conserva el transposon en s_ totalidad, en Iugar de que cada secuencia de inse> cion vea por sf misma? Dos elementos IS, de hecho, pueden hace · transposicion de cualquier secuencia que resida er_ ' " ( tre ellos, asf como en ellos mismos. La muestra que si Tn l 0 reside en un rep !icon circular se puede considerar que sus dos modulos flanquea:: a! gen td' del Tn l 0 original o la secuencia en la on.:_ parte del circulo. Asi, en un episodio de transpos:cion puede participar el transposon original Tn : (marcado por el movimiento de tetR) o la creaci6:de un nuevo transposon "volteado a! reves" con ': region central alternativa. Notese que los transposones original y "v ~ teado a] reves" tienen modulos invertidos, pero -evidente que estos modulos pueden funcionar ~ cualquier orientacion con respecto a la region cc tral. La frecuencia de transposicion de los transpos- nes compuestos desciende con Ia distancia entre l modulos. Por lo tanto, Ia dependencia de Ia longi u~ es un factor que determina los tamafios de los trar.sposones compuestos comunes. Una fuerza importante que apoya Ia transp < cion de transposones compuestos es Ia seleccion marcadores que realiza Ia region central. Un m dulo IS 10 esta libre de trasladarse por sf mismo se moviliza un orden de magnitud mas a menuc que TnlO. No obstante, TnlO se mantiene conj u:- tado por Ia seleccion de tetR, de manera que bii condiciones selectivas, la frecuencia relativa de transposicion del TnlO intacto aumenta mucho. Los elementos IS codifican las actividades _ transposasa que se encargan de Ia creacion de un si:-diana o el reconocimiento de los extremos del trar. poson. Solo se necesitan los extremos para que :_ transposon actue como sustrato en la transposici6>

....

La transposici6n ocurre por mecanismos replicativos y no replicativos

Sitio diana"-

lli Ill IWu.,.,.m""'ll'TT'm'""H

l.

Conceptos principales • Todos los transposones utilizan un mecanismo comun donde se hacen hendiduras escalonadas en el DNA diana, el transpos6n se une a los extremos prominentes y se llenan las brechas. • El arden de los episodios y la naturaleza exacta de las conexiones entre el transpos6n y el DNA diana determinan si la transposici6n es replicativa o no replicativa.

Hendiduras escalonadas hechas en el sitio diana

'T'1liCT'1u.,..,n'TTuttu ·,.,.,w,.,...u,..,.,m,.,.u

-.

~

ATGCA .

'---

·- --"

•l

11TIIP ....,......,......ILI.I..L&.Io~.&.~.L.Liwt..:..Ou.....~ 'TACGT

' '"'---.- ·........

El transpos6n se une a extremos de Cadena unica

/ 'fAcG"i"' En la • se ilustra la insercion de un transposon en un nuevo sitio. Consiste en hacer roturas escalonadas en el DNA diana, uniendo el transposon a los extremos de cadena unica prominentes y llenando las brechas. La generacion y elllenado de lo s extremos escalonados explican la aparicion de repeticiones directas de DNA diana en el sitio de insercion. Los escalones entre los cortes en las dos cadenas determina la longitud de las repeticiones directas; de este modo, la repeticion diana caracterfstica de cada transposon refleja la geometria de Ia enzima involucrada en el corte del DNA diana. El uso de extremos escalonados es comun a todos los medios de transposicion, pero se pueden distinguir tres tipos diferentes de mecanismo por el que se desplaza un transposon: • En la transposicion replicativa, el elemento se duplica durante la reaccion, de manera que la entidad de transposicion es una copia del elemento original. En la , se resumen los resultados de tal transposicion. El transposon se copia como parte de su movimiento. Una copia se mantiene en el sitio original en tanto la otra se inserta en un nuevo sitio. Asf, la transposicion se acompafia de un aumento del numero de copias del transposon. La transposicion replicativa comprende dos tipos de actividad enzimatica: una transposasa que actu a sobre los extremos del transposon original y una resolvasa que actua sobre las copias duplicadas. Un grupo de transposones re lacionados con TnA se desplaza solo por transposicion replicativa (vease la seccion 21.7, La transposicion replicativa avanza a traves de un cointegrado). • En la transposici6n no rep licativa, el elemento de transposicion se traslada como una entidad ffsica de manera directa de un sitio a otro y se conserva. Las secuencias de insercion y los transposones compuestos

ATG~

::rrmiuiDIIffiOlOOllilfm ·

------

Las brechas en el sitio diana se llenan y sellan

Repeticiones diana Las repeticiones directas de la diana del DNA que flanquean un transpos6n se generan con la introducci6n de cortes escalonados cuyos extremos prominentes se enlazan al transpos6n.

Donador

mm:

~ J mm :mn El donadorse mantiene inalterado

l El receptor gana una copia del transpos6n

La transposici6n replicativa crea una copia del transpos6n que se inserta en un sitio receptor. El sitio donador se mantiene sin cambia, por lo que tanto el donador como el receptor tienen una copia del transpos6n.

TnlO y Tn5 utilizan el mecanismo qu e se muestra en Ia y que comprende Ia lib eracion del transposon del DNA donador flanqueador durante Ia transferencia. Este tipo de mecanismo requiere solo una transposasa. Otro mecanismo utiliza la conexion de secuencias de DNA donadora y diana, y comparte algunos pasos con la transposicion replicativa (vease Ia secci6n 21 .6, Intermediarios comunes de la transposicion). Ambos mecanismos de Ia transposici6n no replicativa hacen que el elemento se inserte en el sitio diana y se pierda del sitio donador. 2. Que pasa con la molecula

21.4- La transposici6n ocurre por mecanismos replicativos y no replicativos

527

Donador

Receptor

11111 111 11111

?

El donador tiene una rotura en el sitio del transpos6n

El receptor gana una copia del transpos6n

La transposici6n no replicativa permite que un transpos6n se desplace como una entidad ftsica de un sitio donador a uno receptor. Esto deja una rotura en el sitio donador, que es letal, a menos que se pueda reparar.

I e

Donador

La transposici6n conservadora implica desplazamiento directo sin perdida de enlaces nucleotldicos; comparese con La integraci6n y escisi6n A.

donadora despues de una transposici6n no replicativa? Su supervivencia requiere que los sistemas de reparaci6n del h ospedador reconozcan Ia rotura de Ia doble cadena y la reparen. • La transposici6n conservadora describe otro tipo de episodio no replicativo donde se escinde el elemento de un sitio donador y se inserta en un sitio diana gracias a una serie de sucesos donde se conservan todos los enlacen nucleotidicos . En Ia se resumen los resultados de un episodio de conservaci6n. Este simula de manera exacta el mecanismo de la integraci6n ?~ abordado en la secci6n 19.16, La recombinaci6n especffica del sitio comprende rotura y reunion, y las transposasas de tales elementos se relacionan con la familia de la integrasa A.. Los elementos que usan este mecanismo son grandes y pueden mediar Ia transferencia no solo del elemento mismo, sino tambien del DNA donador de una bacteria a otra. Tales elementos se clasificaron en un principia como transposones, pero pueden con528


siderarse de manera mas apropiada come episomas. Algunos transposones utilizan un solo tipo de via para la transposici6n, en tanto otros puede r:. utilizar multiples vias. Los elementos IS 1 e IS90:; emplean las vfas no replicativa y replicativa, y he: sido bien descrita la capacidad del fago Mu de cambiar a cualquier tipo de vfa desde una intermediaric. comun (vease Ia secci6n 21.6, Intermediarios COffil'ne s de Ia transposici6n). Los mismos tipos basicos de reacci6n participa::. en todas las clases de episodios de transposici6n. Lo; extremos del transpos6n se desconectan del DN.-_ donador por reacciones de escisi6n que genera :-_ extremos 3'-0H. Los extremos expuestos se une:-_ despues al DNA diana por reacciones de transfere __ cia, que comprenden Ia transesterificaci6n, dondc el extremo 3'-0H ataca de manera directa el DN."diana. Estas reacciones tienen Iugar dentro de u:-_ complejo nucleoprotefnico que contiene las enz:mas indispensables y ambos extremos del transp s6n. Los transposones difieren en cuanto a si se reconoce el DNA diana antes o despues de Ia escisi6:del transpos6n mismo. La selecci6n del sitio diana la realiza en efecto Ia transposasa. En algunos casos, virtualmen~ = se elige Ia diana en forma aleatoria. En otros, ha: especificidad por una secuencia de consenso o a:guna otra caracterfstica en el DNA. La caracterisr:ca puede adoptar Ia forma de una estructura en e_ DNA, como el DNA flexionado, o de un compkj proteina-DNA. En el ultimo caso, la naturaleza de_ complejo diana puede hacer que el transpos6n _~ inserte en promotores espedficos (como Ty 1 o Ty:;. que seleccionan promotores pol III en las levadt: ras), regiones inactivas del cromosoma o DNA e:proceso de replicaci6n.

ED Los transposones causan reestructuraci6n del DNA Conceptos principales • La recombinaci6n hom6loga entre multiples capias de un transpos6n causa reestructuraci6n del DNA hospedador. • La recombinaci6n hom6loga entre las repeticiones de un transpos6n puede llevar a La escisi6n precisa o imprecisa.

Ademas de la transposici6n intermolecular "sir:.ple", que da como resultado la inserci6n en un nuevo sitio, los transposones estimulan otros tipos c: reestructuraciones del DNA. Algunos de estos suCEsos son consecuencias de Ia relaci6n entre multip>-

copias del transpos6n. Otros representan resultados alternatives del mecanismo de transposici6n y dejan indicios sobre Ia naturaleza de los sucesos subyacentes. Puede haber reestructuraciones del DNA hospedador cuando un transpos6n inserta una copia en un segundo sitio cerca de su localizaci6n original. Los sistemas de hospedador pueden realizar Ia recombinaci6n recfproca entre las dos copias del transposon; cuyas consecuencias dependen de que las repeticiones tengan la misma orientacion o una invertida. La ilustra la regia general de que la recombinacion entre cualquier par de repeticiones directas causara delecion del material entre elias. La region interpuesta se extirpa como un cfrculo de DNA (que se pierde de Ia celula); el cromosoma conserva una copia de la repetici6n directa. Una recombinacion entre los m6dulos IS de repetici6n directa del transpos6n compuesto Tn9 sustituirfa al transpos6n IS1 de un solo modulo. La delecion de secuencias cercanas a un transposon pudiese, por tanto, ser producto de un proceso de dos etapas; Ia transposicion genera una repeticion directa de un transpos6n y ocurre recombinacion entre las repeticiones. Sin embargo, la mayor parte de las deleciones que surgen en Ia vecindad de los transposones tal vez sea resultado de una variacion en Ia via, seguida del episodio de transposicion mismo. En la • se muestran las consecuencias de la recombinaci6n recfproca entre un par de repeticiones invertidas. La region entre las repeticiones se invierte; las repeticiones mismas permanecen disponibles para facilitar mas inversiones. Un transpos6n compuesto cuyos modulos se invierten es un componente estable del genoma, si bien la direccion de la region central con respecto a los modulos pudiese invertirse por recombinaci6n. La escision no es apoyada por los transposones mismos, pero puede ocurrir cuando las enzimas bacterianas reconocen regiones hom6logas en los transposones, algo importante porque la perdida de un transpos6n puede restablecer la funcion en el sitio de inserci6n. La escision precisa requiere el retiro del transposon mas una copia de Ia secuencia duplicada. Esto sucede muy pocas veces; se presenta con una frecuencia de - 1o-6 para Tn 5 y - 10-9 para Tn I 0. Es probable que implique una recombinaci6n entre sitios diana de 9 bp duplicados. La escision imprecisa deja un residua de transposon que puede ser suficiente para impedir Ia reactivaci6n del gen diana, pero tal vez sea insuficiente para causar efectos polares en genes cercanos, de manera que ocurre un cambio en el fenotipo. La

I

I

•

Repeticiones directas

Apareamiento de repeticiones directas

La recombinaci6n Iibera material entre repeticiones como una molecula E;;;;;:;;rn~~:;:;iiiiiiiiiiiiiiiiii;J circular La recombinaci6n reciproca entre repeticiones directas escinde el material entre ellas; cada producto de recombinaci6n tiene una copia de la repetici6n directa.

Repeticiones invertidas

Las repeticiones invertidas se aparean

Region invertida La recombinaci6n reclproca entre repeticiones invertidas invierte la region entre ellas.

escisi6n imprecisa se presenta con una frecuencia de - 1o-6 para Tn 10. Comprende Ia recombinaci6n entre secuencias de 24 bp en los m6dulos IS I 0; estas secuencias son repeticiones invertidas, pero como los m6dulos IS I 0 mismos estan invertidos, forman repeticiones directas en TniO. La mayor frecuencia de escisi6n imprecisa en comparaci6n con Ia precisa tal vez refleje el aumento de Ia longitud en las repeticiones directas (24 bp en contraposici6n a 9 bp). Ningun tipo de escisi6n depende de funciones codificadas por el transpos6n, pero se desconoce el mecanismo. La escision es independiente de RecA y pudiese ocurrir por algunos mecanismos celulares que generan deleciones espontaneas entre secuencias repetidas con espacios reducidos entre sf. 21.5 Los transposones causan reestructuraci6n del DNA

529

1!1

Intermediaries comunes para la transposici6n

Conceptos principales • La transposici6n se inicia con la formaci6n de un complejo de t ransferencia de cadenas donde el transpos6n se conecta con el sitio diana a traves de una cadena en cada extremo. • La transposasa Mu forma el complejo par sinapsis de los extremos del DNA de Mu, seguida de la formaci6n de hendiduras y luego una reacci6n de transferencia de cadena. • Ocurre a continuaci6n transposici6n replicativa si el complejo se reproduce, y transposici6n no replicativa si se repara.

Muchos elementos moviles del DNA se transponen de una localizacion cromosomica a otra por un me canismo en esencia semejante. Incluyen elementos IS, transposones procarioticos y eucarioticos y el bacteriofago Mu. La insercion de Ia copia de DNA

Transpos6n

Diana

Sinapsis de los extremes Los extremes con hendidura se unen

~ .' I

! == = =

Equivalente no plegado

La trans posicion se inicia con hendiduras en los extremos del transpos6n y del sitio diana, y con la union de los extremos con hendidura a un complejo de transfe rencia de cadenas.

530


del RNA retrovirico utiliza un mecanismo simila~ (vease la seccion 22.2, El ciclo vital de los retr . virus comprende sucesos similares a la transpos· · cion). Las primeras eta pas de la recombinacion cie inmunoglobulinas tambien son similares (vease !~ seccion 23 .l 0, Las protefnas RAG catalizan la rotu. ::. y reunion). La transposicion se inicia con un mecanism comun de union del transpos6n a su diana. En ::: '" I se muestra que el transposon tier.-:hendiduras en ambos extremos, y el sitio diana. en ambas cadenas. Los extremos con hendidura unen en forma cruzada para generar una conexio::-. covalente entre el transposon y Ia diana. Los d _ extremos del transposon se juntan en este proces para que sea mas sencillo seguir las escisiones, :=. etapa de sinapsis se muestra despues de Ia escisior; pero en realidad ocurre antes. Gran parte de esta via fue descubierta por pr · mera vez en el fago Mu, que utiliza el proceso de: transposicion en dos formas. Al infectar una celul,: hospedadora, el Mu se integra al genoma graci~ a una transposicion no replicativa; durante el s:guiente ciclo lftico, el numero de copias se amplific por transposicion replicativa. Ambos tipos de tran. posicion implican el mismo paradigma de reaccior. entre el transposon y su diana, pero las reaccion : siguientes son diferentes. La transposasa MuA hace las operaciones iniciii· les del fago de DNA. Tres sitios de union MuA co:::. consenso de 22 bp se localizan en cada extrema de. DNA de Mu. Ll, L2 y L3 estan en el extremo izquier· do, mientras que Rl. R2 y R3 estan en el extrem derecho. Un monomero de MuA puede unirse a cad.:. sitio. La MuA tambien se une a un sitio intemo e;:el genoma del fago. La union de MuA en los extrt· mos izquierdo y derecho, ademas del sitio intern forma un complejo. La participacion del sitio interne no es clara, parece necesaria para la formacion de. complejo, pero no para Ia escisi0n de cadenas y l ; pasos posteriores. La union del transposon Mu de DNA a un siti diana pasa por las tres etapas ilustradas en la lGU . Esto comprende solo los dos sitios mas cercc. nos a cada extremo del transposon. Las subunidad ~ MuA unidas a estos sitios forman un tetramero, k que logra Ia sinapsis de los dos extremos del transposon. El tetramero ahora actua en una forma que asegura una reaccion coordinada de ambos extre· mos del DNA de Mu . El MuA tiene dos sitios para l;:. manipulacion del DNA y su modo de accion impulsa a subunidades de transposasa a actuar en configu racion trans. El sitio de union de consenso se une ~ las secuencias de 22 bp que constituyen los sitios Ll L2, Rl y R2 . El sitio activ o fragmenta las caden a~ de DNA de Mu en posiciones cercanas a los siti :

:le union Ll y R 1 de MuA. El sitio activo n o puede t'scindir la secu encia de DNA que es adyacente a _a secuencia de consenso en el sitio de union de -onsenso. No obstante, puede escindir la secuencia apropiada en un segmento diferente de DNA. De este modo, los extremos del transpos6n son t>scindidos por subunidades MuA qu e actuan en :onfiguracion trans. La fo rma de acci6n en configu :acion trans indica que los monomeros en realidad _midas aLl y Rl no escinden los sitios cercanos. Uno e los monomeros unidos al extrema izquierdo hace una hendidura en el sitio en ellado derecho y viceersa (no se sabe que mon6mero esta activo en esta etapa de la reaccion) . La reaccion de transferencia de cadenas tambien tiene lugar en configuraci6n trans; el monomero en Ll transfiere la cadena en R1 y viceversa. Pudiese ocurrir que diferentes monomeros catalizaran las reacciones de escision y n ansferencia de cadenas para un extrema determinado . Una segunda pro tefna, M u B, ayuda a la reaccion. Influye en la seleccion de sitios diana. La .\1u tiene preferencia para la transposicion al sitio

L1 L2

R2 R1

I t

Extrema izquierda MuA

Extrema derecha

diana alejado mas de 10 a 15 kb de la ins ercion original. Esta es la llamada "inmunidad de diana". Se demuestra en una reaccion in vitro que incluye plasmidos donadores (que contienen Mu) y diana (deficientes en Mu ), protefnas MuA y MuB, protefna HU de E . coli, Mg 2+ y ATP. La presencia de MuB y ATP restringe la transposicion de m anera exclusiva al plasmido diana . El motivo es que cuando MuB se une al DNA del complejo MuA-Mu, MuA hace que MuB hidrolice el ATP, despues de lo cual se Iibera MuB. No obstante, la MuB se une (de manera inespecffica) al DNA diana, donde estimula la actividad de recombinaci6n de MuA cuando se forma u n complej o de transposicion . En efecto, la presencia previa de MuA "elimina " a MuB del donador, lo que da preferencia para la transposicio n al sitio diana. El producto de estas reacciones es un complejo de transferencia de cadenas donde el transposon se conecta al sitio diana por media de una cadena en cada extrema . El siguiente paso de la reacci6n difiere y determina el tipo de transposicion. En las siguientes dos secciones se observa c6mo la estru ctura comu n puede ser sustrato para la replicacion (lo que condu ce a la transposici6n replicativa), o usarse de manera directa para rotura y union (lo que conduce a u na transposici6n no r eplicativa).

fD1 La transposici6n replicativa avanza a traves de un cointegrado

Sin apsis


.

• La replicaci6n de un complejo de transferencia de cadenas genera un cointegrado, que es una fusi on de los replicones donador y diana. • El cointegrado tiene dos capias del tra nspos6n que yacen entre los replicones originales. • La recombinaci6n entre las capias del transpos6n regenera los replicones originales, pero el receptor ha ganado una copia del transpos6n . • La reacci6n de recombinaci6n es catalizada por una resolvasa codificada por el transpos6n .

.... ..

.,

J ..·-~ . 3'-0H 3'-0H

3'-0H

3'-0H

Transferencia de cadena

I

II

IIH

La transposici6n Mu pasa por tres etapas estables. La trans posasa MuA forma un tetramero que hace sinapsis con los extremes de un fago Mu . Las subunidades de transposasa actuan en configuraci6n trans para hacer una muesca en cada extrema del DNA, y despues, una segunda acci6n en confi guraci6n trans une los extremes con hendidura al DNA diana.

FIGu

Las estructuras basicas involucradas en la transposici6n replicativa se ilustran en la • Los extremos 3' del complej o de transferencia de cadenas sirven como cebadores para la replicacion, lo qu e genera una estru ctura llamada cointegrad o , que representa la fusion de las dos mole culas originales. El cointegrado tiene dos capias del transpo s6n, una en cada union entre los replicones originales, orientados como r epe ticio nes directas . El entrecruzamiento se form a por

21.7 La trans posicion replicativa avanza a traves de un cointegrado

531

Transpos6n

Transpos6n

\

I

.. ·-· ..

Diana

\

0

Formaci6n de hendiduras Los cortes de una sola cadena generan extremos escalonados tanto en el transpos6n como en Ia diana

Fusion

Cointegrado

Resoluci6n

La transposici6n puede fusionar un replic6n donador y uno receptor en un cointegrado. La resoluci6n libera dos replicones, cada uno con una copia del transpos6n .

accion de Ia transposasa, como se describio en Ia seccion anterior. Su conversion en el cointegrado requiere funciones de replicacion del hospedador. • Una recombinacion homologa entre las dos copias del transposon Iibera dos replicones individuales, cada uno con una copia del transposon. Uno de los replicones es el replicon donador original. El otro es un replicon diana que ha ganado un transposon flanqueado por repeticiones directas cortas de la secuencia diana del hospedador. La reaccion de recombinacion se llama resoluci6n; la actividad enzimatica encargada se llama resolvasa. Las reacciones comprendidas en Ia generadon de un cointegrado se han definido con detalle para el fago Mu y se ilustran en Ia . El proceso se inicia con Ia formacion del complejo de transferenda de cadenas (a veces llamado tambien complejo de entrecruzamien to ). Las cadenas donadoras y diana estan ligadas de manera que cada extremo de Ia secuenda del transposon se une a una de las cadenas {micas prominentes generadas en el sitio diana. El complejo de transferenda de cadenas genera una estructura de forma cruzada que se mantiene junta en el transposon doble. El destino de Ia estructura de entrecruzarniento deterrnina el modo de transposicion. 532


Estructura entrecruzada (complejo de transferencia de cadena): Los extremos con hendidura del transpos6n se unen a los extremos con hendidura del sitio diana

La replicaci6n de extremos 3' libres genera un cointegrado: La moh§cula unica tiene dos capias del transpos6n

-a

/

El cointegrado dibujado como vfa continua muestra que los transposones estan en las uniones entre replicones

La transposici6n Mu genera una estrucL :. entrecruzada que se convierte, por replicaci6n, en un co'- tegrado.

El principio de Ia transposicion replicativa ~ que Ia replicacion por medio del transposon loci~ plica, lo que crea copias en los sitios diana y do =dor. El producto es un cointegrado. La estructura del entrecruzamiento contie::-: una region de una sola cadena en cada uno de : ~ extremos escalonados. Estas regiones son horq · ·~ de seudorreplicacion que ofrecen un molde para : sfntesis de DNA. (El uso de los extremos como c:badores para la replicacion implica que debe ocu . rotura de Ia cadena con una polaridad que gene:-: un extremo 3'-0H en ese punto.) Si Ia replicacion continua desde ambas horqu· · ~ de seudorreplicaci6n, avanzara por el transposon :: :-

parando sus cadenas y terminando en sus extremos. La replicacion tal vez se logre por funciones codificadas por el hospedador. En esta juntura, la estrucrura se ha convertido en un cointegrado, que posee repeticiones directas del transposon en las uniones entre los replicones (como puede observarse por el rastreo de la via alrededor del cointegrado).

Ill

La transposici6n no rep licativa avanza par rotura y reunion

Conceptos principales • La transposici6n no replicativa ocurre cuando se hace una hendidura en una estructura entrecruzada en el par no roto de las cadenas donadoras y se ligan las cadenas diana a cada lado del transpos6n. • Dos vias para la transposici6n no replicativa difieren de acuerdo a que el primer par de cadenas del transpos6n se una al sitio diana antes de que se corte el segundo par (Tn5) o que las cuatro cadenas se corten antes de unirse al sitio diana (Tn10).

La estructura de entrecruzamiento puede usarse tambien en la transposicion no replicativa. El principia de la transposicion no replicativa por este mecanismo es que una reaccion de rotura y reunion permite reconstruir el sitio diana, con excepcion del transposon; el donador se mantiene roto. Nose forma un cointegrado. La muestra los episodios de escision que generan una transposicion no replicativa del fago Mu. Una vez que a las cadenas no rotas del donador se les hacen hendiduras, se pueden ligar las cadenas diana a cada lado del transposon. Las regiones de cadena (mica generadas por los cortes escalonados de ben llenarse mediante sfntesis de reparacion. El producto de esta reaccion es un replicon diana donde se ha insertado el transposon entre repeticiones de la secuencia creada por las hendiduras de cadena unica originales. El replicon donador tiene una rotura de doble cadena a traves del sitio donde originalmente se localizaba el transposon. Las transposiciones no replicativas pueden tambien ocurrir por una via alternativa, donde se hacen hendiduras en el DNA diana pero tambien una rotura de doble cadena a cada lado del transposon, lo que lo Iibera por completo de las secuencias donadoras de los flancos (como se observa en Ia Figura 21. 7). Esta via de "corte y pegado" es utilizada por TnlO, como se ilustra en Ia Un experimento certero demostro que las transposiciones no replicativas de Tn l 0 hicieron uso de un heteroduplex sintetizado de manera artificial de TnlO que contenia apareamientos erroneos

La transposici6n no replicativa tiene lugar cuando se libera una estructura de entrecruzamiento por la formaci6n de una hendidura, lo que inserta el transpos6n en el DNA diana, flanqueado por las repeticiones directas de la diana, y se deja al donador con una rotura de doble cadena.

La transposasa se une a ambos extremes de Tn

Los extremos transferidos son objeto de producci6n de hendiduras

Otras cadenas son objeto de producci6n de hendiduras

0 "

Se Iibera el donador

Tn se une al sitio diana

El receptor es objeto de

Ambas cadenas de Tn10 se escinden en forma secuencial, y despues, el transpos6n se une al sitio diana con hendidura.

de una sola base. Si la transposicion implica replicacion, el transposon en el nuevo sitio contendra informacion de solo una de las cadenas TnlO progenitoras. No obstante, si la transposicion ocurre por movimiento fisico del transposon existente, se conservaran los apareamientos erroneos en el nuevo sitio, lo cual quedo demostrado en este caso. 21.8 La transposici6n no replicativa avanza por rotura y reunion

533

! ! ! ! !

3'0H 3'QH Horquilla

1..., H20

·u 1 La escisi6n de Tn5 del DNA de los flancos comprende la formaci6n de una hendidura, la reacci6n intercatenaria y la escisi6n de la horquilla.

F

Extremo izquierdo

Transpos6n

Extremo derecho

,/

o

Extremo derecho

Sitio activo

/o

Sitio - activo Ext~emo izquierdo

I Cada subunidad de la transposasa Tn5 tiene un extrema del transpos6n localizado en su sitio activo y tam bien hace o en un sitio diferente con el otro extrema del transpos6n.

La diferencia basica en la Figura 21.16 respecto del modelo de Ia Figura 21.15 es que ambas cadenas de Tn1 0 se escinden antes de cualquier conexi6n con el sitio diana. El primer paso en la reacci6n es el reconocimiento de los extremos del transpos6n por la transposasa, que forman una estructura proteinacea dentro de Ia que ocurre Ia reacci6n. En cada extrema del transpos6n, las cadenas son escindidas en un arden especffico: la cadena transferida (Ia que se va a conectar con el sitio diana) se escinde primero, seguida de la otra. (:Este es el mismo arden de la transposici6n Mu de las Figuras 21.14 y 21.15.) La Tn5 tambien hace transposici6n no replicativa, y en la " se muestra la interesante reacci6n de escisi6n que separa el transpos6n de las secuencias de los flancos. La primera cadena de DNA es objeto de una hendidura. El extrema 534


3'-0H que se Iibera ataca entonces ala otra caden;:; del DNA, lo que Iibera la secuencia del flanco y u nt las dos cadenas del transpos6n en una horquill a Luego, una molecula de agua activada ataca a lc. horquilla para generar extremos libres para cad;; cadena del transpos6n. En el siguiente paso se Iibera el DNA donado:escindido y el transpos6n se une a los extremos cor hendidura en el sitio diana. El transpos6n y el siri<. diana se mantienen constrefiidos en la estructur;: proteinacea creada por la transposasa (y otras proteinas). La escisi6n de do ble cadena en cada extrema del transpos6n impide cualquier transposici 6~ de tipo replicativo y obliga a la reacci6n a avanz ~ por transposici6n no replicativa, lo que arroja e mismo resultado que se muestra en la Figura 21.1 ~ pero con pasos de escisi6n y union individuales que tienen Iugar en un arden diferente. Las transposasas Tn5 y Tnl 0 actuan amba como dimeros. Cada subunidad en el dimero tien t" un sitio activo que cataliza de manera sucesiva :.:. rotura de doble cadena de las dos en un extrema detranspos6n y despues cataliza la escisi6n escalona c~ del sitio diana. En la •.., J se ilustra la estructura de la transposasa Tn5 unida al transpos6:::. escindido. Cada extrema del transpos6n se locali z..: en el sitio activo de una subunidad. Un extrema Gf Ia subunidad tambien hace o con el otro extrema del transpos6n, lo que controla la geometrf::. de la reacci6n de transposici6n. Cada uno de l _ sitios activos escindira una cadena del DNA dian .; Es la geometria del complejo lo que determina ::: distancia entre estos sitios en las dos cadenas diat ~ (nueve pares de bases en el caso de Tn5).

Ill

La transposici6n de Tn A requiere transposasa y resolvasa

Conceptos principales • La transposici6n replicativa de TnA requiere que una transposasa forme la estructura cointegrada y una resolvasa libere los dos replicones. • La acci6n de la resolvasa se asemeja a la proteina Int A. y pertenece a la familia general de reacciones de recombinaci6n espec\ficas de sitio similares a la topoisomerasa, que pasan por un intermediario donde la prote\na esta unida de manera covalente al DNA. La transposici6n replicativa es la unica for e.:. de movilidad de la familia de TnA, que consta transposones grandes (-5 kb). No son compues< dependientes de los m6dulos de transposici6n .: tipo IS, sino que mas bien constituyen unida ric-

independientes que portan los genes para Ia transposicion, asf como para caracterfsticas del tipo de Ia resistencia a farmacos. La familia TnA incluye varios transposones relacionados, de los que Tn3 y Tn I 000 (tambien conocidos como yo) son los mejor caracterizados. Tienen la caracterfstica terminal habitual de las repeticiones invertidas con relacion estrecha, en general de -38 bp de Jongitud. las deleciones que actuan en configuracion cis en cualquier repeticion impiden la transposicion de un elemento. Se genera una repeticion directa de 5 bp en el sitio diana. Fortan marcadores de resistencia como amp'. las dos etapas de Ia transposicion mediada por InA se realizan a traves de la transposasa y la resol vasa, cuyos genes (tnpA y tnpR) se identifican por mutaciones recesivas. La etapa de transposicion involucra a los extremos del elemento, como lo hace en los elementos de tipo IS. La resolucion requiere un sitio interno especffico, caracterfstica exclusiva de la familia TnA. las mutaciones en tnpA no permiten realizar Ia transposicion. El producto del gen es una transposasa que se une a una secuencia de -25 bp localizada dentro de los 38 bp de la repeticion terminal invertida. Existe un sitio de union para Ia protefna IHF de E. coli cercano al sitio de union de Ia transposasa, y Ia transposasa se une de manera colaboradora con IHF. La transposasa reconoce los extremos del elemento y tambien hace las roturas escalonadas de 5 bp en el DNA diana donde se va a insertar el transposon. La IHF es una protefna de union de DNA que a menudo participa en el ensamblaje de grandes estructuras en E. coli; es posible que su participacion en Ia reaccion de transposicion no sea esencial. El producto del gen tnpR tiene funciones dobles. Actua como represor de Ia expresion genica y provee Ia funcion de resolvasa. Las mutaciones en tnpR aumentan la frecuencia de Ia transposicion. El motivo es que TnpR reprime Ia transcripcion en tnpA y su propio gen. De este modo, Ia desactivacion de la protefna TnpR permite una mayor sfntesis de TnpA, lo que da como re sultado una frecuencia mas alta de transposiciones. Esto implica que la cantidad de Ia transposasa TnpA debe ser un factor limitante de Ia transposicion. los genes tnpA y tnpR se expresan de manera divergente desde una region de control intercistronica rica en A-T que se indica en el mapa de Tn3 incluido en la . Ambos efectos de TnpR son mediados por su union en esa region. En su capacidad como resolvasa, la TnpR participa en la recombinacion entre repeticiones directas de Tn3 en una estructura cointegrada. Un cointegrado puede, en principia, resolverse con una recombinacion homologa entre cualquier par de puntos

~

..

.

;

-

.

Unidades de transcripci6n

___,.. ____.

res

JR

tnpA

IR tnpR

ampR

Los transposones de la familia TnA tienen repeticiones terminates invertidas, un sitio res interno y tres genes conocidos.

correspondiente en las dos copias del transposon. Sin embargo, la reaccion de resolucion de Tn3 tiene Iuga r solo en un sitio especffico. El sitio de la resolucion se llama res. Se identifica por deleciones que actuan en configuracion cis e impiden concluir Ia transposicion, lo que causa la acumulacion de cointegrados. En ausencia de res, la reaccion de resolucion puede sustituirse con la recombinacion general mediada por RecA, pero es mucho menos eficaz. los sitios unidos por la resolvasa TnpR se resumen en la porcion inferior de Ia Figura 21.1 9. Ocurre union independiente en cada uno de tres sitios, de 30 a 40 bp de longitud cada uno. Los tres sitios de union comparten una homologfa de secuencia que define a una secuencia de consenso con simetrfa doble. El sitio I incluye la region definida en terminos geneticos como sitio res; en su ausencia, la reaccion de resolucion no avanza en absoluto. No obstante, la resolucion tambien comprende la union en los sitios II y III, porque la reaccion avanza poco si cualquiera de estos sitios presenta delecion. El sitio I se superpone con el punta de inicio de la transcripcion de tnpA. El sitio II se superpone con el punto de inicio para transcripcion de tnpR; una mutacion de operador se ubica apenas en el extrema izquierdo del sitio. i)nteractuan los sitios? Una posibilidad es que se requiera Ia union a los tres sitios para mantener el DNA en una topologfa apropiada. La union en un solo conjunto de sitios puede reprimir la transcripcion de tnpA y tnpR sin introducir cambios en el DNA. En un analisis de resolucion in vitro se usa una molecula cointegrada similar al DNA como sustrato. El sustrato debe ser superenrollado; su resolucion produce dos cfrculos encadenados, cada uno con un sitio res. La reaccion requiere grandes cantidades de 21.9 La transposici6n de TnA requiere transposasa y resolvasa

535

la resolvasa TnpR; no se necesitan factores del hospedador. La resolucion ocurre en una gran estructura nucleoprotefnica. La resolvasa se une a cada sitio res y, despues, los sitios unidos se conjuntan para formar una estructura de -10 nm de diametro, aveces Hamada sinaptosoma, que contiene seis dimeros de resolvasa y dos sitios res. Ocurren cambios en el superenrollado durante la reaccion y el DNA se dobla en los sitios res por la union de la transposasa. Se han determinado varias estructuras cristalinas de la y8 resolvasa. La enzima aislada puede formar un dimero de dimeros, esto es, una subunidad tiene una interfase que facilita la formacion de dimeros y el dimero entonces utiliza una segunda interfase para formar un tetramero. El dimero puede unirse al sitio I y formar una estructura donde los segmentos catalfticos estan distantes de los sitios diana de escision en el DNA. La estructura cristalina del sinaptosoma, donde un tetramero de resolvasa se enlaza a traves de Ser 10 con dos DNA duplex escindidos en el sitio I muestra que los sitios diana en las cadenas duplex que van a recombinarse yacen en sitios opuestos del tetramero. Esto indica que un dimero debe girar 180° con relacion al otro para reubicar el DNA con el fin de lograr la reaccion de recombinacion. Esta parte del mecanismo es diferente de la empleada por las recombinasas de tirosina (como Cre o Flp) donde la enzima, en terminos basicos, junta los DNA recombinantes en forma de una union Holliday (vease la seccion 19 .18, La recombinacion especifica de sitio simula la actividad de la topoisomerasa). Ocurre la resolucion por rotura y reunion de enlaces, sin aporte de energia. La escision se logra por una reaccion de transesterificacion que une de forma covalente la Ser 10 de una subunidad de resolvasa con un fosfato 5' en el enlace diana del sitio I. El producto consta de una resolvasa unida en forma covalente a ambos extremos 5' de los cortes de doble cadena hechos en el sitio res. La escision ocurre de manera simetrica en una region palindromica corta para generar dos extensiones de bases. Se puede describir la reaccion de corte con eA.1Jansion de !a imagen de !a region de entrecruzamiento localizada en el sitio I de !a siguiente forma: 5'TTATAA3' 3'AATATT5'

•

5'TTAT + protefna 3 'AA

protefna- AA3' TATT5'

La reaccion se asemeja a la actividad de Int A en los sitios att (vease la seccion 19 .16, La recombinacion especifica de sitio implica rotura y reunion). De hecho, 15 de los 20 bp del sitio res son identicas a las bases de posiciones correspondientes en att,

536

CAPiTULO 21 Transposones

lo que sugiere que !a recombinacion especifica c: sitio de )c y !a resolucion de TnA han evolucionaG a partir de un tipo comun de reaccion de recoml:( . nacion. De hecho, se observa en la seccion 23. 1: Las proteinas RAG catalizan la rotura y reuni6:-. que la recombinacion que involucra a los genes CL: inmunoglobulinas tiene !a misma base. La caracteristica que comparte todas estas reacciones es : transferencia del extrema roto a la proteina cat.; litica como etapa intermedia, antes de su reuni6:_ con otro extrema roto (vease !a seccion 19 .18, L recombinacion especifica de sitio simula la activid.: · de !a topoisomerasa). Las reacciones mismas son analogas en terre · nos de manipulacion del DNA. aunque solo ocur ~ ~ resolucion entre sitios intramoleculares, en tanto :c recombinacion entre sitios att es intermolecular direccional (como se o bserva por las diferencias t:. los sitios attB y attP). El mecanismo de la accion prc teinica, no obstante, es diferente en cada caso. L resolvasa actua en una forma en la que se unen cu.: tro subunidades a los sitios res recombinantes. CaG..:= subunidad hace una escision de una sola eadem. Una reorganizacion de las subunidades con relaci&:a las otras desplaza entonces, en terminos ffsicos, la.; cadenas de DNA y las coloca en una conformaci6:::. recombinada. Esto permite a las hendiduras sellars= junto con la liberacion de la resolvasa.

fJE

La transposici6n de Tn10 tiene multiples controles

Conceptos principales • La inhibici6n de capias multiples reduce la tasa de transposici6n de cualquier copia de un transpos6n cuando se introducen otras del mismo transpos6n en el genoma. • Multiples mecanismos afectan la tasa de transposici6n.

El control de !a frecuencia de transposiciones e~ importante para la celula. Un transposon debe se: capaz de mantener cierta frecuencia minima de m vimiento a fin de sobrevivir, pero una frecuenci:. muy alta pudiese ser lesiva para la celula hospe dadora. Cada transposon parece tener mecanism que controlan su frecuencia de transposicion. S _ han caracterizado diversos mecanismos para Tn H El Tn10 es un transposon compuesto, donde t_ elemento IS 1OR proporciona el modulo activo. L organizacion del IS 1OR se resume en la 21.L Se encuentran dos promotores cerca del limite e':terno. El promotor PIN se encarga de la transcripci6= de IS 1OR. El promotor Pom hace que la transcriv cion avance hacia el DNA del flanco adyacente. L:

.

. .. Tn10

. .~----~--P-o_"~_,n..,c~ ........ ~

Superposici6n de 36 bases

~ Transposasa .,: Dos promotores en orientaci6n contraria yacen cerca del l\mite externo de IS10R. El fue rte promotor P0u1 impulsa la transcripci6 n hacia el DNA hospedador de los flan cos. El promotor PIN. mas debit, ocasiona la transcripci6n de un RNA que extiende la longitud de IS10R y se traduce en la transposasa.

transcripcion suele terminar dentro del transposon, pero en ocasiones continua en el interior del DNA del hospedador; a veces esa transcripcion leida en forma completa se encarga de activar genes bacterianos adyacentes. El fenomeno de Ia "inhibicion de copias multiples" revela que Ia expresion del gen de Ia transposasa IS 1OR esta regulada. La transposicion de un elemento Tn 10 en el cromosoma bacteriano disminuye cuando se introducen mas capias de IS 1OR a traves de un plasmido de copias multiples. La inhibicion requiere el promotor PouT y se ejerce en el ambito de la traduccion. La base del efecto radica en la superposicion de las regiones terminales 5' de los productos de transcripcion de P L'~ y P ouT' El RNA OUT es un producto de transcripcion de 69 bases, presente a mas de 100x la concentracion de RNA IN por dos motivos: P ouT es un promotor mucho mas fuerte que PIN; y el RNA OUT es mas estable que el RNA IN. El RNA OUT actua como Rt\TA en sentido opuesto (vease la seccion 13.7, Las moleculas pequeiias de RNA pueden regular Ja traduccion). La concentracion de RNA OUT no tiene efecto en la situacion de una sola copia, pero sf presenta uno significative cuando estan presentes mas de cinco capias. Suele haber -5 copias de RNA OUT por copia de ISIO (que corresponde a -150 copias de RNA OUT en una situacion de copias multiples usuales) . El RNA OUT aparea sus bases con el RNA IN y el exceso de RNA OUT asegura que el RNA IN se una con rapidez, antes de que pueda adherirse un ribosoma. Asi, el RNA IN apareado no puede traducirse . La cantidad de la protefna transposasa a menuda es un rasgo crucial. El Tn1 0 cuya transposasa se sintetiza en la baja concentracion de 0.15 molecula por celula por generacion, muestra varios

~

La transposasa actua en configuraci6n cis sobre el molde de DNA

.:··...-

Tn10 CUT El apareamiento IN ... impide Ia traducci6n del RNA IN La metilaci6n impide Ia union de Ia transposasa al DNA - - • La metilaci6n impide Ia sfntesis de Ia transposasa-- • Varios mecanismos restringen la frecuencia de transposici6n de Tn10 mediante la afectaci6n de la s\ntesis o el funcionamiento de la prote\na transposasa. La metilaci6n restringe la transposici6n de un transpos6n individual para que ocurra s6lo despues de la replicaci6n. En situaciones de capias multiples, la preferencia por la configuraci6n cis restringe la selecci6n de la diana, y el apareamiento de RNA OUT/IN inhibe la s\ntesis de la transposasa.

mecanismos interesantes. La resume los diversos efectos que influyen en la frecuencia de transposicion. Un marco de Jectura continuo en una cadena de IS 1OR codifica la transposasa. La concentracion de la transposasa lirnita la tasa de transposicion. Las mutaciones en este gen pueden complementarse en configura cion trans por otro elemento IS 10 de tipo Silvestre, pero solo con alguna dificultad. Esto refleja una fuerte preferencia de la transposasa por la actividad en configuracion cis; la enzima actua de manera eficaz solo con el molde de DNA del que fue transcrita y traducida. La preferencia por laconfiguracion cis es un rasgo comun de las transposa sas codificadas por elementos IS. (Otras proteinas que muestran preferencia por la configuracion cis influyen sobre la protefna A involucrada en Ia replicacion
53 7

Juntos, los resultados de la preferencia por la configuracion Cls y la inhibicion de copias multiples, aseguran que un aumento del nt1mero de copias de TnlO en un genoma bacteriano no cause una mayor frecuencia de transposicion que pudiese danar al genoma. Los efectos de la metilacion constituyen el sistema mas importante de regulacion de un elemento individual. Disminuye la frecuencia de la transposicion y (de mayor importancia) acoplan la transposicion al paso de la horquilla de replicacion. La capacidad de IS l 0 de transposicion tiene relacion con el ciclo de replicacion porIa respuesta del transposon al estado de metilacion en dos sitios. Un sitio esta dentro de la repeticion invertida en el extrema IS lOR donde se une la transposasa. El otro sitio es el promotor PrN' del que se transcribe el gen de transposasa. Ambos sitios estan metilados por el sistema dam descrito en Ia seccion 15 .5, (.Regula el inicio lametilacion en el origen? La metilasa Dam modifica Ia adenina en la secuencia GATC de una cadena recien sintetizada generada por replicacion. La frecuencia de la transposicion Tn l 0 aumenta I 000 tantos en cepas danr donde los dos sitios diana carecen de grupos metilo. El paso de una horquilla de replicacion sobre estos sitios genera secuencias hemimetiladas; ello activa al transposon por una combinacion de transcripcion del gen de transposasa mas a menudo desde P1N y un aumento de Ia union de Ia transposasa a! final de IS I OR. En una bacteria de tipo silvestre, los sitios se mantienen hemimetilados durante un periodo breve despues de !a replicacion. (,Por que deberia ser deseable que ocurriese Ia transposicion poco despues de la replicacion? El mecanismo no replicativo de la transposici6n de Tn l 0 coloca al DNA donador en riesgo de destruccion (vease la Figura 21.7). Las posibilldades de supervivencia de la celula pueden aumentar si la replicacion acaba de ocurrir para generar una segunda copia de la secuencia del donador. El mecanismo es eficaz porque solo una de las copias que acaban de replicarse da origen al suceso de transposicion (determinado por que cadena de transposo n no esta metilada en los sitios dam) . Un transposon selecciona sus sitios diana en forma aleatoria y, como resultado, hay una probabilidad razonable de que pudiese llegar a un operon activo. (. Continuara la transcripcion desde el exterior a traves del transposon y asi activara a Ia transposasa cuya produccion puede, a su vez, llevar a un grado alto de transposicion, tal vez leta!? El Tn l 0 se protege contra tales sucesos por medio de dos mecanismos. La transcripcion a traves del extre538


mo IS lOR disminuye su actividad, a! parecer porquc inhibe su capacidad de unirse a Ia transposasa, y e RNAm que se extiende en sentido ascendente d e~ de el promotor es poco traducido porque tiene u1.=. estructura secundaria donde el codon de iniciaci6::. es inaccesible.

BID

Los elementos de control en el mafz causan roturas y reestructuraciones

Conceptos principales • Se descubri6 la transposici6n en el ma\z por los efectos de las roturas cromosomicas generadas por la transposicion de "elementos de control". • La rotura genera un cromosoma que tiene un centromero y un extremo roto, as\ como un fragmento acentrico. • El fragmento acentrico se pierde durante la mitosis; lo que puede detectarse por la desaparicion de alelos dominantes en un heterocigoto. • La fusion entre los extremos rotos del cromosoma genera cromosomas dicentricos, que presentan mas ciclos de rotura y fusion . • El ciclo de fusion-rotura-puente se encarga de la aparicion de la variegacion somatica.

Una de las consecuencias mas visibles de Ia existeJ:cia y movilidad de los transposones ocurre durar:.te el desarrollo de las plantas, cuando se preseL:.o variacion somatica, Ia cual se debe a cambios en:.:: localizacion o conducta de los elementos de co trol (el nombre que recibieron los transposones ::. el maiz antes de que se descubriera su naturalezo molecular). Dos caracteristicas del mafz han ayudado a seguir los sucesos de transposicion. Los elementos · _ control a menudo se insertan cerca de genes q ~.; e tienen efectos visibles pero no letales sobre el fe notipo . El maiz muestra desarrollo clonal, lo q ·:significa que Ia aparicion y la sincronizacion de ·episodio de transposicion se pueden visualizar con: ' se muestra en !a La naturaleza del episodio no importa; pudie.:: ser una muracion puntiforme, una insercion, u = escision o una rotura cromosomica. Lo que impor...:. es que tiene Iugar en una celula heterocigota pa::-.:. alterar la expresion de un alelo. Los descendiem_ de una celula que ha sufrido el suceso presentadespues un nuevo fenotipo, en tanto los descer__dientes de celulas no afectadas por el suceso con.... nuan mostrando el fenotipo original. Las originadas por mitosis de una celula dete> minada se mantienen en la misma localizacion

dan origen a un sector del tej ido. El cambio en el feno tipo durante el desarrollo som atico recibe el nombre de variegaci6n; se descubre por un sector del nuevo fenotipo que reside dentro de un tejido del fenotipo original. El tamafio del sector depende del nt1mero de divisiones del linaje qu e le dio origen, de manera que el tamaiio de Ia nu eva zona del nu evo fenotipo se dete rmina por el momenta en que ocurre el cambio en el genotipo. Cu anto mas temprano haya ocurrido en el linaje celular mayor sera el numero de descendientes y, por tanto, el tamafio del parche en el tejido maduro. Esto se obse rva de forma mas clara en Ia variacion del color del m eoll o, cuando aparecen parches de un color dentro de otro. La insercion de un elemento de control puede afectar Ia actividad de los genes cercanos. Las deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones se presentan todas en los sitios donde h ay elementos de control. La rotura cromosornica es una conse cuencia comun de Ia presencia de algunos elementos. Una caracterfstica unica del sistema en el maiz es que las actividades de los elementos de control se regulan durante el desarrollo. Los elementos pre sentan transposicion y facilitan reestructuraciones genicas en momentos y frecuencias caracterfsticos durante el desarrollo de las plantas. La conducta caracter(stica de los elementos de control en el mafz se tipifica por el elemento Ds, que en un principia se identifico por su capacidad de ofrecer un sitio para la rotura cromos6mica . Las consecuencias se ilustran en la . Consicterese una celula heterocigota donde Ds yace en un homologo entre el centromero y una serie de marcadores dominantes. El otro homologo carece de Ds y presenta marcadores recesivos (C, bz y wx) . La rotura en Ds genera un fragmento acentrico que porta los marcadores dominantes. Como resultado de su fa lta de un centromero, este fragmento se pierde en la mitosis. As(, las celulas descendien tes solo tienen los marcadores recesivos que porta el cromosoma integra. Esto da el tipo de situacion cuyo resultado se muestra en la Figura 21.22. La muestra que Ia rotura en Ds conduce ala formacion de dos cromosomas desusados, generados por Ia union de los extremos rotos de los productos de Ia replicaci6n. Uno es un frag m ento acentrico o en forma de U constituido por las cromatidas hermanas unidas en Ia region distal a Ds (ala izquierda, com o se ilustra enla figura). El otro es un crom osoma dicentrico con forma de U que incluye a las cromatidas hermanas proximales a Ds (a la derecha en la fig ura) . Esta ultima estructura conduce a! ciclo clasico de rotura-fusi6n-puente ilustrado en Ia figura .

. Las transposiciones son heredadas en forma clonal La rotura de un cromosoma causa perdida de un alelo dominante

I

....o...

JL..

••....

,.0 .. ,..0.. 0 0.. . .0. .0. .... QQQQ QQ 9 ~

"

t

~

~

t

i

i

i

i

i

i

v

0 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 00

Las celulas de un genotipr original muestran fenotipo dominante La clona descendente de una mutante muestra un fenotipo recesivo

~ Meollo con un sector de fenotipo recesivo

El analisis clonal identifica un grupo de celu las provenientes de un solo ancestro, donde un episodio mediado por transposici6n alter6 el fenotipo. La sincro nizaci6n del episodio durante el desarrollo la indica el nCtmero de celulas; la especificidad histica del suceso puede estar indicada por la localizaci6n de las celulas.

Centr6mero ( C/ Bz

(c

wx

bs

~

.

bz wx

l

Fenotipo celula~

)

Cl Bz Wx

Rotura enOs

Fragmento acemtrico ( C!BzWxic=~ ( C bz wx

'~

Mitosis

c=~ ( C bz wx

., ~

C bz wx

Una rotura en un elemento de control causa la perdida de un fragmento acentrico; si el fragmento porta los marcadores dominantes de un heterocigoto, su perdida cambia el fe notipo. Los efectos de los marcadores dominantes, CI, Bz, y Wx pueden visualizarse por el color de las celulas o con una tinci6n apropiada.

21.11 Los elementos de control en el maiz causan roturas y reestructuraciones

539

c

Ds A 8 c

(

II

A 8 c

!

Replicaci6n

)

Rotura enOs

IIA IIA

( .(

~

8 c -) 8 c

~·

Primer ciclo de rotura de fusi6n-puente Fusi6n de cromatides hermanas

~~==· J[~: ~ ~ El fragmento I Los centr6meros se acentrico se 't separan en Ia mitosis pierde ·-c~B-A,------,A---=8--=-c- )

C

! c

c

Rotura

8 A

AI IT:) ....:

Cromosoma con Cromosoma con duplicaci6n de A deleci6n de A Segundo ciclo de rotura de fusi6n-puente ·

~3 -<···········j

c :c

! 8 B C

J

! C "c

B

Cromosoma con duplicaci6n de 8

BIL=:J Cromosoma con deleci6n de 8

El Ds provee un sitio para el inicio del ciclo de rotura-fusi6n-puente de cromatidas. Los productos se pueden seguir por analisis clonal.

Observese el destino del cromosoma dicentrico cuando intenta segregarse en el huso rnitotico. Cada uno de sus dos centromeros jala hacia el polo opuesto. La tension rompe el cromosoma en un sitio aleatorio entre los centromeros. En el ejemplo de Ia figura Ia rotura tiene Iugar entre los loci A y B con el resultado de que un cromosoma hijo tiene duplicacion de A en tanto el otro presenta su delecion. Si A es una marcador dorninante, las celulas con Ia duplicacion conservaran un fenotipo, pero las ce!ulas con Ia delecion mostraran el fenotipo a recesivo. El ciclo de rotura -fusion-puente continua a traves de mas generaciones celulares y perrnite que los cambios geneticos persistan en los descendientes. 540

Por ejemplo, considerese el cromosoma con delecion que perdio A. En el siguiente ciclo ocurre u .o rotura entre B y C, de manera que los descendiente se dividen en aquellos con una duplicacion de B · quienes presentan su delecion. Las perdidas suces:vas de marcadores dominantes se descubren por j: presencia de subsectores dentro de los sectores.


BE

Los elementos de control forman fa milias de transposones

Conceptos principales • Cada familia de transposones en el ma1z tiene elementos de control aut6nomos y no aut6nomos. • Los elementos de control aut6nomos codifican prote1nas que les permiten realizar la transposici6n. • Los elementos de control no aut6nomos tienen mutaciones que eli minan su capacidad de catalizar la transposici6n, pero pueden rea lizarla cuando un elemento aut6nomo proporciona las prote1nas necesarias. • Los elementos de control aut6nomos tienen cambios d.: fase cuando sus propiedades se alteran como resultado de cambios en el estado de metilaci6n.

El genoma del mafz contiene varias familias de elementos de control. Los numeros, tipos y localize..ciones de los elementos son caracterfsticos de cac=. cepa individual de mafz. Pueden ocupar una par: significativa del genoma. Los de cada familia se dividen en dos clases: • Los elementos de control aut6nomo tienen Ia capacidad de realizar escision ~ transposicion. Como resultado de Ia acti,-:. dad continua de un elemento aut6nomo, :... inserci6n en cualquier locus crea un alel: inestable o "mutable" . La perdida del elemento autonomo mismo ode su capacido..:_ de transposicion convierte a un alelo mma · ble en un alelo estable. • Los elementos de control no aut6nomos son estables; no presentan transpc sicion o sufren otros cambios espontane~: de su condicion. Se tornan inestables sol: cuando un miembro autonomo de Ia mi~ ma familia esta presente en otro sitio de. genoma. Cuando esta complementado e:configuracion trans por un elemento amc nomo, un elemento no aut6nomo muest .:. Ia varia cion habitual de actividades vinculc. · das con los elementos autonomos, como j: capacidad de transposicion a nuevos sitios. Los elementos no aut6nomos se derivan G.;:

elementos autonomos porque pierden las funciones en configuracion trans indispensables para Ia transposicion. Las familias de elementos de control se definen por las interacciones entre elementos autonomos y no autonomos. Una familia consta de un solo tipo de elemento autonomo acompai'iado por muchas variedades de elementos no autonomos. Un elemento no autonomo se ubica en una fam ilia por su capacidad de ser activado en configuracion trans por los elementos autonomos. Las principales familias de elementos de control en el mafz se resumen en la rl Descritos en el ambito molecular, los transposones del mafz comparten Ia forma habitual de organizacion (repeticiones invertidas en los extremos y repeticiones cortas y directas en el DNA diana adyacente), por lo demas, varian el tamai'io y capacidad de codificacion. Todas las familias de transposones comparten el mismo tipo de relacion entre elementos autonomos y no autonomos. Los elementos au tonomos tienen marcos de lectura abiertos entre las repeticiones terminates, en tanto los elementos no autonomos no codifican protefnas funcionales. A veces, las secuencias internas se relacionan con las de elementos autonomos que en otros momentos han tenido divergencia completa. El transposon mutador es uno de los elementos mas sencillos. El elemento autonomo MuDR cadifica los genes mudrA (que codifica la transposasa MURA) y mudrB (que codifica una protefna ria no esencial). Los extremos de los elementos estan marcados por repeticiones invertidas de 200 bp. Los elementos no autonomos, en u§rminos basicos cualquier unidad que tenga repeticiones invertidas, que pudiesen no tener ninguna relaci6n de secuencia interna con MuDR, tambien son movilizados por _\1URA. Por lo generaL hay varios comunes (-10) de cad a familia de transposones en un genoma vegetal. Mediante el analisis de elementos autonomos y no autonomos de la familia AciDs se cuenta con informacion molecular acerca de muchos ejemplos individuates de estos elementos. En Ia ri se resumen sus estructuras. La mayor parte de la Iongitud del elemento au ronomo Ac es ocupada por un solo gen constituido por cinco exones. El producto es la transposasa. El clemento mismo termina en repeticiones invertidas de ll bp y se duplica una secuencia diana de 8 bp en el sitio de insercion. Los elementos Ds varian en longitud y secuencia pero tienen relacion con Ac. Terminan en las mismas repeticiones invertidas de ll bp. Son mas ·onos que Ac y Ia longitud de Ia delecion es variaJie. En un extrema, el elemento Ds9 tiene una dele -

No aut6nomo

Aut6nomo

Presenta Activaci6n en Requiere un transposici6n configuraci6n trans elemento de forma aut6nomo

;'''''f'""

J

Se traslada a un nuevo sitio

Se traslada a un nuevo sitio

Ac (activador)

Os (disociaci6n)

Mp (modulador)

dSpm (Spm defectuoso)

Spm (mutador-supresor) En (potenciador)

I (inhibidor)

Dt (punteado)

Sin nombre

MuDR (mutador)

Mu

Cada familia de elementos de control tiene aut6nomos y no aut6nomos. Los elementos autonomos estan aptos para la transposici6n. Los elementos no aut6nomos son deficientes en la transposici6n . Los pares de elementos aut6nomos y no aut6nomos se pueden clasificar en >4 familias.

Ex6n 1 -

2

3

- - - -Transcripci6n

4

5

---+

500 bp Ds9 Ds2d1 · Ds2d2 Ds6

El elemento Ac tiene cinco exones que codifican una transposasa; los elementos Ds tienen deleciones internas.

cion de solo 194 bp. En una delecion mas extensa, el elemento Ds6 conserva Ia longitud de solo 2 kb, que representa un kb desde cada extrema de Ac. Un elemento Ds doble complejo tiene una secuencia Ds6 insertada en orientacion inversa dentro de otra. Los elementos no autonomos carecen de se cuencias internas, pero poseen las repeticiones terminates invertidas (y quiza otras caracter.fsticas de secuencia). Los elementos no autonomos se derivan de elementos autonomos por deleciones (u otros cambios) que desactivan Ia transposasa que actua en configuracion trans, pero dejan intactos los sitios 21.12: Los elementos de contro l forman familias de transposones

541

(incluidos los extremos) donde actua !a transposasa. Sus estructuras varian de mutaciones menores (pero inactivantes) de Ac hasta secuencias que presentan deleciones mayores o reestructuraciones. En el otro extremo, los de la familia Dsl incluyen secuencias cortas cuya unica relacion con Ac radica en que poseen repeticiones terminales invertidas. Los elementos de esa clase no necesitan derivarse de manera directa de Ac, pero pudiesen hacerlo por cualquier suceso que genere repeticiones invertidas. Su existencia sugiere que la transposasa reconoce solo las repeticiones invertidas terminales o tal vez las repeticiones terminales en conjuncion con alguna secuencia interna corta. La transposicion de AciDs ocurre por un mecanismo no replicativo y se acompail.a de su desaparicion en !a localizacion del donador. El analisis clonal sugiere que la transposicion de Ac/Ds casi siempre ocurre poco despues de que el elemento donador se ha replicado. Estas caracterfsticas se asemejan a la transposicion del elemento bacteria no Tnl 0 (vease !a seccion 21.1 0, La transposicion de Tn 10 tiene multiples controles). La causa es la misma; la transposicion no tiene Iugar cuando el DNA del transposon esta metilado en ambas cadenas (el estado habitual antes de la metilacion), y se activa cuando el DNA es hemimetilado (el estado habitual en cuanto termina !a replicacion). El sitio receptor con frecuencia esta en el mismo cromosoma que el sitio donador, y a menudo bastante cerca. La replicacion genera dos copias de un donador potencial AciDs, pero por lo general solo una copia en realidad presenta transposicion (.Que pasa con el sitio donador? Las reestructuraciones que seencuentran en sitios desde los que se han perdido elementos de control podrfan explicarse en terminos de las consecuencias de una rotura cromosomica, como se ilustro antes en !a Figura 21.23. Los elementos autonomos y no autonomos, estan sujetos a una variedad de cambios en su condici6n. Algunos de estos cam bios son geneticos; otros, epigeneticos. El principal cambio es (por supuesto) la conversion de un elemento aut6nomo a uno no autono mo, pero pueden ocurrir otros cambios en los elementos no autonomos. Los defectos de la actuacion en configuracion cis pueden hacer a un elemento no aut6nomo impermeable a los elementos autonomos. Asf, un elemento no autonomo puede volverse estable de manera permanente porque ya no puede ser activado para efectuar la transposicion. Los elementos autonomos estan sujetos a "cambios de fase" que son alteraciones hereditarias, pero tambien relativamente inestables, de sus propiedades. Adoptan !a forma de una desactivacion rever542


sible donde un elemento oscila entre estados acti\ e inactivo durante el desarrollo de la planta. Los cambios de fase en los tipos Ac y Mu c: ~ elemento autonomo son resultado de cambios en :~ metilaci6n del DNA. Las comparaciones de las suo· ceptibilidades de los elementos activos e inactiY.:: a las enzimas de restriccion sugieren que Ia foriL: inactiva del elemento es metilada en la secuen -, CAG . smos . . d"tana d e cad a e lerne . d tana GTC. Hay vanos y no se sabe cuales controlan el efecto. En el c~ de MuDR, la desmetilaci6n de las repeticiones te> minales aumenta la expresi6n de Ia transposasa, : que sugiere que el efecto pudiese ser mediado por :: control del promotor para el gen de Ia transposa:s.:_ Serfa conveniente saber que controla !a metilacic::y desmetilacion de los elementos. El efecto de la metilaci6n es en general com ·entre los transposones de las plantas. La mejor .:~ mostracion del efecto de Ia metilacion sobre Ia ac-vidad proviene de las observaciones hechas con mutanre ddml de Arabidopsis que causa una perd· :..:: de metilacion en la heterocromatina. Entre las d:..:. nas que pierden grupos metilo esta una familia : transposones relacionados con MuDR. El anaJh directo de las secuencias genomicas muestra q·_la desmetilacion causa sucesos de transposicion. - m etilacion tal vez es el principal mecanismo u :__. zado para impedir que los transposones dafien :: genoma por transposicion muy frecuentes. Puede hab er controles autorregulados de . transposicion, analogos a los efectos de la inmu:- dad mostrados por los transposones bacterianos. -· au men to del numero de elementos Ac en el geno::disrninuye la frecuencia de !a transposicion. El e ~;:- mento Ac puede codificar un represor de la trans- ·sicion; es posible que !a actividad !a realice la rnis protefna que provee !a funcion de transposasa.

fDB

Los elementos Sprn influyen en la expresi6n genica

Conceptos principales • Los elementos Spm afectan la expresi6n genica en sL; sitios de inserci6n, cuando la prote\na TnpA se une a sus sitios diana en los extremos de los transposones. • Los elementos Spm se desactivan por metilaci6n.

Los elementos autonomos Spm yEn son casi id;:c: ticos; difieren en menos de 10 posiciones. En la. se resume su estructura. Las repeticio- terminales invertidas de 13 bp son indispensa para la tran sposicion, segun indica el fenotipo ::: transposicion defectuosa de deleciones en los ~

tremos. Los transposones relacionados con Spm se encuentran en otras plantas y se definen como de Ia misma familia por su organizaci6n semejante, en terrninos generales. Todos comparten repeticiones terminales invertidas casi identicas y generan duplicaciones de 3 bp del DNA diana con Ia transposici6n. Nombrados por sus similitudes terminales, se conocen como el grupo CACTA de transposones. Se transcribe una secuencia de 8 300 bp a partir de un promotor en el extrema izquierdo del elemento. Los 11 exones contenidos en el producto de transcripci6n se escinden en un mensajero de 2 500 bases. El RNAm codifica una proteina de 621 aminoacidos. El gen se denomina tnpA y la proteina se une a una secuencia de consenso de 12 bp, presente en multiples copias en las regiones terminales del elemento. Se requiere Ia funci6n de tnpA para Ia esdsi6n, pero en ocasiones no es suficiente. Todos los elementos no aut6nomos de esta familia (seii.alados como dSpm para Spm defectuoso) tienen mucha relaci6n en su estructura con el elemento Spm mismo. Presentan deleciones que afectan a los exones de tnpA. Otros dos marcos de lectura abiertos (ORFl y ORF2) se localizan dentro del primer intr6n largo de tnpA . Estan contenidos en un RNA de 6000 bases alternativamente escindido, presente en 1% de Ia concentraci6n del RNAm de tnpA. La funci6n que contienen los ORF1 y 2 se llama tnpB . Puede proporcionar Ia proteina que se une a las repeticiones invertidas terminales de 13 bp para escindir los exnemos para transposici6n. Ademas del elemento Spm activo por completo, hay derivados Spm-w que muestran actividad mas debil en Ia transposici6n. El ejemplo provisto en Ia Figura 21.27 tiene una delecion que elimina tanto a ORF1 como a ORF2, lo que sugiere que Ia necesidad e transposici6n de tnpB puede pasarse por alto o cambiarse. Las inserciones de Spm pueden controlar Ia exresi6n de un gen en el sitio cuando ocurren. Un locus receptor pudiese quedar bajo control positivo negativo. Un locus susceptible de supresi6n por Spm presenta inhibicion de Ia expresion. Un locus ependiente de Spm se expresa solo con Ia ayuda de Spm. Cuando el elemento insertado es un dSpm, la supresi6n de la dependencia responde a Ia funcion e acci6n en configuraci6n trans provista por un Spm autonomo. (.Cual es la base de estos efectos puestos? Un alelo susceptible de supresi6n dSpm contie:::le una insercion de dSpm dentro de un ex6n del gen. Esa estructura hace surgir Ia pregunta inrnejtata, (.Como un gen con una insercion dSpm en un :'Xon puede llegar a expresarse? La secuencia dSpm

2 3 4 5 67891011 Ex6n 1 -----Transcripci6n _ _ _...,. 1 kb

Spm-w-8011 dSpm-7995 dSpm-79978 dSpm-8004 1 '7 El SpmjEn tiene dos genes. El tnpA consta de 11 exones que se t ranscriben en un RNAm de 2 500 bases, con corte y empalme. El tnpB puede constar de un RNAm de 6 000 bases que contiene ORF1 + ORF2.

puede escindirse del producto de transcripci6n por el uso de secuencias en sus extremos. El suceso de escision puede dejar un cambio en Ia secuencia del RNAm que explica asf un cambio en las propiedades de la protefna que codifica. Se ha descubierto una capacidad similar de escisi6n a partir de un producto de transcripcion para algunas inserciones de Ds. El tnpA provee la funcion supresora por la que en un principia se nombro al elemento Spm. La presencia de un elemento defectuoso puede disminuir la expresion de un gen donde reside, pero no eliminarla. La introduccion de un elemento aut6nomo que posea un gen tnpA funcional, no obstante, puede suprirnir por completo la eA.-presion del gen diana. La supresion es causada porIa capacidad de tnpA de unirse a sus sitios diana en el elemento defectuoso, que bloquea el avance de la transcripcion. Un alelo dependiente de dSpm contiene una inserci6n cerca de un gen. pero no en su interior. La insercion parece proveer un potenciador que activa a! promotor del gen en ellocus receptor. La supresion y dependencia de elementos en dSpm parecen estar sujetas a Ia misma interaccion entre el producto de actividad en configuracion trans del gen tnpA del elemento autonomo de Spm y los sitios de accion en configuracion cis en los extremos del elemento. Asi. una interaccion simple entre Ia protefna y los extremos del elemento suprime o activa un locus diana, dependiendo de que el elemento se localice en sentido ascendente o dentro del gen receptor. Los elementos Spm se encuentran en una variedad de estados, que van desde actividad completa hasta crfpticos. Un elemento crfptico es silente y no presenta transposicion por sf mismo ni activa los elementos dSpm. Un elemento crfptico puede reac21.13 Los elementos Spm influyen en la expresi6n genica

543

tivarse de manera transitoria o convertirse a! estado activo por Ia interacci6n con un elemento Spm por completo activo. La desa ctivaci6n es causada por metilaci6n de secu encias en Ia vecindad del punto de inicio de Ia transcripci6n. La naturaleza de los sucesos que se encargan de Ia desactivaci6n de un elemento por metila ci6n nueva o de Ia activaci6n por desmetilaci6n (o porque se evita Ia metilaci6n) no se conoce aun.

fD1

Intervenci6n de los elementos susceptibles de transposici6n en la disgenesia h1brida

Conceptos pnncipales • Los elementos P son transposones que portan las cepas P de Drosophila melanogaster, no asi las cepas M. • Cuando un macho P se cruza con una hembra Mse activa la transposici6n. • La inserci6n de elementos P en sitios nuevas en esas cruzas desactiva muchos genes y las hace infecundas.

Ciertas cepas de D. melanogaster encuentran clificultades en las cruzas. Cuando se cruzan las moscas de dos de esas cepas, Ia progenie muestra "rasgos disgeneticos", una serie de defectos que incluye mutaciones, aberraciones cromos6micas, segregaci6n distorsionada en Ia meiosis y esterilidad. La aparici6n de estos defectos correlacionados se llama

disgenesia hibrida. Se han identificado dos sistemas encargados de la disgenesia hfbrida en D. melanogaster. En el primero, las moscas se dividen en los tipos I (inductor) y R (reactivo). La fecundidad disminuida se observa en cruzas de machos I con hembras R, pero no en sen-

Macho

Hembra M

p

l El hibrido parece normal pero es esteril

Macho M

Hembra

p

l l

NO HAY PROGENIE

La disgenesia hibrida es asimetrica; es inducida por cruzas de machos P con hemb ras M, pero no por la de machos Mcon hembras P.

544


tido opuesto. En el segundo sistema las mosca~ dividen en los dos tipos, P (de contribuci6n patery M (de contribuci6n materna). En Ia GURA ~ se ilustra Ia asimetrfa del sistema; una cruza er_un macho P y una h embra M causa disgenesia, "Ia cruza inversa nolo hace. La disgenesia es sobre todo un fen6men _ celulas germinativas. En las cruzas que involuc: el sistema P-M, las moscas hfbridas Fl tienen t dos somaticos normales. No obstante, sus g6na no se desarrollan. El defecto morfologico sobre desarrollo de los gametos data de Ia etapa en Ia q comienzan las divisiones celulares rapidas en Ia. nea germinal. Cualquiera de los cromosomas de un mach puede inducir Ia disgenesia en una cruza con v h embra M. La construcci6n de cromosomas recobinantes muestra que varias regiones dentro de cc.cromosoma P pueden causar disgenesia, lo que giere que un macho P tiene secuencias en mu d~.: localizaciones cromos6micas diversas que pueri-:inducir disgenesia. Las localizaciones difieren e -::cepas P individuales. Las secuencias P especfficas <:tan ausentes de los cromosomas de las moscas , La naturaleza de las secuencias especfficas P identific6 primero por mapeo del DNA de mutar:: w encontradas entre los hfbridos disgeneticos. -=- das Ia mutaciones son resultado de Ia inserci6n DNA en el locus w. (La inserci6n desactiva el ~~ y da origen a! fenotipo de ojos blancos por el .recibe su nombre ellocus.) La secuencia insena se denomina elemento P. Las inserciones del elemento P forman un ~ = tema de transposici6n clasico. Los elementos il1.::-viduales varian en longitud, pero tienen secuenhom6loga. Todos los elementos P poseen repetic nes terminales invertidas de 31 bp y generan : :- _peticiones directas del DNA diana de 8 bp con transposici6n. Los elementos P mas largos tien -2 .9 kb de longitud y presenta'l ruatro marcos lecturas abiertos. Los elementos mas cortos surg a! parecer con bastante frecuencia, por delecior.:internas de un factor P de longitud total. AI mer. algunos de los elementos p mas cortos han per- do Ia capacidad de producir Ia transposasa, pero probable que los active Ia enzima codificada por ::..elemento P completo en configuraci6n trans. Una cepa P porta de 30 a 50 copias del elemer ~ P, casi 3 3 % de ell as de longitud completa. Los e> mentos estan ausentes de las cepas M. En una ce-P, se portan los elementos como componentes ine-tes del genoma, pero se activan para Ia transposki -cuando un macho P se cruza con una hembra I\: Los cromosomas de las moscas hfbridas clisge 1 ticas P-M tienen elementos P insertados en muc!1sitios nuevos. Las inserciones desactivan a los ge1:

donde se localizan y a menudo causan roturas cromosomicas. El resultado de Ia transposicion es, por tanto, desactivar a! genoma.

E

lntr6n 1 lntr6n 2 lntr6n 3 Elemento P ~ ORFO_ ORF1 _ ORF2 ORF3

Los elementos P se activan en la linea germinal

Conceptos principales • Los elementos P se activan en la linea germinal de cruzas de machos P con hembras M porque un episodio de corte y empalme especifico de tejido reti ra un intr6n que genera la secuencia de codificaci6n de la bansposasa. • El elemento P tambien produce un represor de la hansposici6n, que se hereda par via materna en el citoplasma. • La presencia del represor explica par que las cruzas de machos Mcon hembras P se mantienen fecundas.

La activacion de los elementos Pes especffica de tejido; ocurre solo en Ia linea germinativa. No obstante, los elementos P se transcriben tanto en Ia lfnea germinal como en tejidos somaticos. La especificidad histica es conferida por un cambio en el patron de corte y empalme. En Ia se muestra la organizacion del elemento y sus productos de transcripcion. El producto de transcripcion primaria se extiende 2.5 kb o 3.0 kb; Ia diferencia tal vez refleje solo Ia susceptibilidad de escurrimiento del sitio de terminacion. Puede haber dos productos proteinicos : • En tejidos somatico s solo se escinden los primeros dos intrones, lo que crea una region de codificacion de ORFO-ORFl-ORF2. La traduccion de este RNA da Iugar a u~a proteina de 66 kD, que corresponde a un represor de Ia actividad del transposon. • En tejidos de Ia llnea germinal tiene Iugar otro episodio de corte y empalme que retira el intron 3. Esto conecta los cuatro marcos de lectura abiertos en un RNAm que se traduce para generar una protefna de 87 kD, que es Ia transposasa. Dos tipos de experimento han demostrado que es necesario el corte y empalme del tercer intron para Ia transposicion. Primero, si las uniones de corte y empalme se mutan in vitro y el elemento P se reintroduce a las moscas, su actividad de transposicion se elimina. En segundo termino, si el tercer intron presenta delecion, de modo que ORF3 se incluya d'e manera constitutiva en el RNAm de todos los tejidos, ocurre transposicion en tejidos somaticos, asi como en Ia linea germinal. Por tanto, siempre que ORF3 es objeto de corte y empa lme al marco die lectura anterior, el elemento P se activa. Este es

~ Transcripci6n RNA corto RNA largo Permanece el intr6n 3 RNAm somatico

-Marco de lectura . .

Represor de 66 kD Lfnea germinativa RNAm -

Marco de lectura ____.

Transposasa de 87 kD El elemento P tiene cuatro exones; los primeros tres se cortan y empalman juntos en la expresi6n somatica; los cuatro se cortan y empalman juntos en la expresi6n de la linea germinal.

un suceso regulador crucial y suele presentarse solo en Ia linea germinal. e,Que se encarga del corte y empalme especificos de tejido? Las celulas somaticas contienen una protefna que se line a Ia secuencia del exon 3 para prevenir el corte y empalme del tt!timo intron (vease Ia seccion 26.12, El corte y empalme alternativos implican el uso diferencial de las uniones de corte y empalme). La ausencia de esta proteina en las celulas de Ia lfnea germinal permite que el corte y empalme generen el RNAm que codifica Ia transposasa. La transposici6n de un elemento P requiere -150 bp de DNA terminal. La transposasa se une a secuencias de 10 bp que estan cercanas a las repeticiones invertidas de 31 bp. La transpos icion ocurre por un mecanismo no replicativo de "corte y pegado" que se asemeja a! de TnlO. (Contribuye a una disgenesia hfbrida en dos formas: Ia inserci6n del elemento con transposici6n en un nuevo sitio puede causar mutaciones y Ia rotura que se deja en el sitio donador [vease Ia Figura 21. 7], tienen efecto adverso.) Es interesante que en un porcentaje significativo de los casos, Ia rotura en un DNA donador se repare con el uso de Ia secuencia del cromosoma homologo. Si el hom6logo tiene un elemento P, su presencia en el sitio donador puede restablecerse (de manera que el episodio simula el resultado de 21 .15 Los elementos P se activan en la l1nea germinal

545

una transposicion replicativa). Si el homologo carece de un elemento P, la reparacion puede generar una secuencia que carece de dicho elemento, por lo que al parecer se provee una escision precisa (un suceso desusado en otros sistemas susceptibles de transposicion). La dependencia de una disgenesia hibrida sobre la orientacion sexual de una cruza muestra que el citoplasma es importante, as! como los propios factores P. La contribucion del citoplasma se describe como citotip o: una linea de moscas que contienen elementos P tiene citotipo P, en tanto una linea de moscas que carece de elementos P tiene citotipo M. Ocurre disgenesia hibrida solo cuando los cromosomas que contienen factores P se encuentran en el citotipo M, es decir, cuando el macho progenitor tiene elementos P y la hembra no. El citotipo muestra un efecto citoplasmico heredable; cuando tiene lugar una cruza entre el citotipo P (el progenitor femenino tiene elementos P), la disgenesia hibrida se suprime por varias generaciones de cruzas con progenitores femeninos M. Asf, algo en el citotipo P, que se puede diluir despues de varias generaciones, suprime la disgenesia hibrida. El efecto del citotipo se explica en terrninos moleculares por el modelo de la 'J . Depende de la capacidad de la protefna de 66 kD de reprimir

Unea P (cruza de macho P con hembra P) Cromosomas del macho Elemento P ORFO ORF2

t

A

..

-

-

_iORF1

Cromosomas de Ia hembra Elemento P

4

ORF3

Citotipo Represor de 66 kD

...

66K

.

El represor impide Ia transposici6n detodoslos elementos P

•••• • ••••aalllla.r:~aaaa:t••••••••••••aaaca•

Cruza de macho P con hembra M Cromosomas del macho Elemento P

t

Cromosomas de Ia hembra Sin elementos

Citotipo Ninguno

I

El elemento P sintetiza Ia transposasa

y Disgenesia hibrida Cruza de macho M con hembra P Cromosomas del macho Sin elementos

Cromosomas de Ia hembra Elemento P

!

!

. '

+a a a a

II

Citotipo Represor de 66 kD 66K

..

El represor impide Ia transposici6n de todos los elementos P

a a a a a a a a a a a.

Las interacciones entre los elementos P del genoma y un represor de 66 kD en el citotipo determinan la disgenesia hibrida.

546


la transposicion. La protefna es provista como factor materna en el oocito. En una linea P det> haber suficiente protefna para impedir la transpo<> cion, aunque haya elementos P. En cualquier cr~ que involucre a una hembra P, su presencia impiC.:la sintesis y actividad de la transposasa. No obsta~ te, cuando el progenitor femenino es de tipo ~ . no hay represor en el oocito y la introduccion liun elemento P del progenitor masculino da corr: resultado la actividad de transposasa en la line : germinal. La capacidad del citotipo P de ejercer t · efecto por mas de una generacion sugiere que det ~ haber suficiente proteina represora en el oocito. · con la suficiente estabilidad, para pasar a traves ci ;:. adulto y estar presente en los oocitos de la siguien:= generacion. Las cepas de D. melanogaster descendientes moscas atrapadas en estado silvestre hace mas de "J . anos son siempre M. Las cepas procedentes demo_cas capturadas en los ultimos l 0 anos son casi siec pre P. c:,Significa esto que la familia de elementos: ha invadido poblaciones silvestres de D. melanogascc en anos recientes? Los elementos P son, de hech muy invasores cuando se introducen en una nue': poblacion; la fuente del elemento invasor tendc que haber sido otra especie. La disgenesia hibrida disminuye las cruzas, p c~ lo que constituye un paso en la via hacia la especic: cion. Supongase que se crea un sistema disgenetic por un elemento susceptible de transposicion en a.:guna localizacion geografica. Otro elemento pued= crear un sistema diferente en alguna otra localiz.0 cion. Las moscas en las dos areas serfan disgenetica..:: para los dos sistemas (o quiza mas). Si esto las hac: esteriles entre ellas y las poblaciones se afslan e::. terminos geneticos, puede ocurrir una separaci6r adicional. Multiples sistemas disgeneticos, por ta r. to, conducen a la imposibilidad de apareamiento. · a la especiacion.

Resumen Las celulas procarioticas y eucarioticas contienen unc variedad de transposones que se desplazan cuandr mueven o copian secuencias de DNA. El transpos6r. puede identificarse solo como una entidad dentrc del genoma; su movilidad no implica una form.;. independiente. El transposon pudiese ser de DN_~_ egofsta, interesado solo en la perpetuacion propii. dentro del genoma residente; si confiere cualquie ventaja selectiva sobre el genoma, esta sera indireda. Todos los transposones tienen sistemas que limitar. la extension de la transposicion porque cuando e. irrefrenable parece ser lesiva, pero los mecanismo;: moleculares son diferentes en cada caso.

El arquetipo de transpos6n tiene repetloones invertidas en los extremos y genera repeticiones directas de una secuencia corta en el sitio de inserci6n. Los tipos mas sencillos son las secuencias de inserci6n (IS) bacterianas, que constan en esencia de las repeticiones terminales invertidas en los flancos y un marco de codificaci6n cuyo producto proporciona actividad de transposici6n. Los transposones compuestos tienen m6dulos terminales que constan de elementos IS; uno o ambos m6dulos IS ofrecen actividad de transposasa y las secuencias entre ellos (que a menudo portan resistencia a los antibi6ticos) se tratan como pasajeros . La genera cion de repeticiones diana en los flancos de un transpos6n refleja una caracterfstica frecuente de la transposici6n. Elsitio diana es escindido en puntos escalonados de cada cadena de DNA por una distancia fija (a menudo cinco o nueve pares de bases). El transpos6n es en efecto insertado entre los extremos de cadena unica prominentes generados por los cortes escalonados. Las repeticiones diana se generan por elllenado de regiones de cadena unica. Los elementos IS, los transposones compuestos y los elementos P se desplazan por transposici6n no replicativa, donde el elemento se mueve de manera directa de un sitio donador a un sitio receptor. Una enzima transposasa unica cataliza Ia reacci6n. Ocurre por un mecanismo de "corte y pegado", donde el transpos6n se separa del DNA en los flancos. La escisi6n de los extremos del transpos6n, las hendiduras en el sitio diana y Ia conexi6n de los extremos del transpos6n a las hendiduras escalonadas, tienen Iugar todos en un complejo nucleoprotefnico que contiene a Ia transposasa. La perdida del transpos6n del donador crea una rotura de doble cadena cuyo destino noes clara. En el caso de TnlO, Ia transposici6n es posible en cuanto concluye Ia replicaci6n del DNA, cuando los sitios reconocidos por el sistema de metilaci6n dam son hemimetilados de man era transitoria. Esto exige la existencia de dos copias del sitio donador, que tal vez aumenten las posibilidades de supervivencia de Ia celula. La familia de transposones TnA se moviliza por transposici6n replicativa. Despues de que el transpos6n en el sitio donador se conecta con el sitio diana, Ia replicaci6n genera una molecula cointegrada que tiene dos capias del transpos6n. Una reacci6n de resoluci6n, que comprende Ia recombinaci6n entre dos sitios particulares, Iibera entonces las dos copias del transpos6n, de manera que una se mantiene en el sitio donador y otra aparece en el sitio diana. Se requieren dos enzirnas codificadas por el transpos6n: Ia transposasa reconoce los extremos del transpos6n y los conecta al sitio diana, y Ia re-

sol vasa proporciona una funci6n de recombinaci6n especifica de sitio. El fago Mu experimenta transposici6n replicativa por el mismo mecanismo que TnA. Tambien puede usar su intermediario cointegrado para Ia transposici6n por un mecanisme no replicative. La diferencia entre esta reacci6n y Ia transposici6n no replicativa de elementos IS es que los episodios de escisi6n se aparecen en un orden diferente. Los transposones mejor descritos en plantas son los elementos de control del mafz, que se dividen en varias familias. Cada familia contiene un solo tipo de elemento aut6nomo que es analogo de los transposones bacterianos en su capacidad de movilizaci6n. Una familia tambien contiene muchos elementos no aut6nomos diferentes que provienen de mutaciones (por lo general deleciones del elemento aut6nomo). Los elementos no aut6nomos carecen de la capacidad de transposici6n, pero muestran actividad de transposici6n y otras habilidades del elemento aut6nomo cuando esta presente uno para proporcionar las funciones necesarias de acci6n en configuraci6n trans. Ademas de las consecuencias directas de inserci6n y escisi6n, es posible que los elementos del mafz tambien controlen las actividades de los genes en o cerca de los sitios donde se insertan; este control puede estar sujeto a Ia regulaci6n del desarrollo. Los elementos del mafz insertados en genes pudiesen extirparse de los productos de transcripci6n, lo que explica porque no tan s6lo impiden Ia actividad genica. El control de Ia expresi6n del gen diana comprende una variedad de efectos moleculares, como Ia activaci6n al ofrecer un potenciador y Ia supresi6n a! interferir en los episodios posteriores a Ia transcripci6n. · La transposici6n de elementos del mafz (en particular Ac) no es replicativa y es probable que requiera s6lo una enzima transposasa unica codificada por el elemento. La transposici6n ocurre de preferencia despues de Ia replicaci6n del elemento . Es posible que haya mecanismos que lirniten Ia fre cuencia de Ia transposici6n. Las reestructuraciones ventajosas del genoma del mafz pudiesen haberse conectado con la presencia de los elementos. Los elementos P en D. melanogaster se encargan de Ia disgenesia hfbrida, que tal vez sea el precursor de la especiaci6n . Una cruza entre un macho que porta el elemento P y una hembra que carece de el genera hfbridos esteriles. Un elemento P tiene cuatro marcos de lectura abiertos, separados por intrones. El corte y empalme de los tres primeros ORF genera un represor de 66 kD y se presenta en todas las celulas. El corte y empalme de los cuatro ORF para generar la transposasa de 87 kD ocurre 21.16 Resumen

54 7

solo en Ia lfnea germinal por un episodio de cone y empalme espedfico de tejido. Los elementos P se desplazan cuando estan expuestos al citoplasma que carece del represor. El brote de sucesos de transposicion desactiva al genoma mediante inserciones aleatorias. Solo un elemento P completo puede generar Ia transposasa, pero Ia enzima puede movilizar los elementos defectuosos en config uracion trans.

Referencias

1111

Introduccion

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Ell

Las secuencias de insercion son modulos de tra nsposicion sencillos

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&II

Los t ransposones compuestos tiene n modulos IS

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1111

La t ra nsposicion ocurre por mecanism os replicativos

y no rep licativos Art\culos de revision Craig, N. L. (1997). Target site selection in transposition . Annu. Rev. Biochem. 66, 43 7-4 74.

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lfJII

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1111

La transposicion no replicativa avanza por rotura _• reunion

Arti culos de investigacion Bender, J. and Kleckner, N. ( 1986 ). Genetic evidence tha: Tnl O transposes by a n onreplicative mechanism. Ce/' 45, 801- 8 15. Bolland, S. and Kleckner, N. ( 1996). The three chemical steps o f Tn 10/IS 10 transposition involve repeated utilization of a single active site. Cell 84, 223- 233 . Davies, D. R., Goryshin, I. Y., Reznikoff. W. S., and Rayment, I. (2000). Three-dimensional structure of the Tn5 synaptic complex transposition intermediate. Science 289, 77- 85. Haniford, D. B., Benjamin, H. W., and Kleckner. N. (1 99 1 Kinetic and structura l ana lysis of a cleaved donor intermediate and a strand transfe r intermedia te in Tn 10 tran sposition. Cell 64, 171- 179. Kennedy, A. K., Guh athakurta, A., Kleckner, N., and Haniford, D. B. ( 1998). Tn 10 transposition via a DN_:._ hairpin intermediate. Ce//95, 125-134.

a

La tra nsposicio n de TnA requiere transposasa y resolvasa

Articulo de revisio n Sherratt. D. (1989) . Tn3 and related tra nsposable eleme site -specific recombination and transposition. In Ber; D. E. and Howe, M . M .. eds., Mobile DNA. W ashingtr~ DC: .t\merican Society for Microbiology Press, pp. 163-1 84. Articulos de invest igacion Droge, P. eta!. ( 1990). Th e two functional domains of gamma delta resolvase act on the same recombinati -

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fJIIil

La transposici6n de Tn10 tiene multiples co ntroles

Art\culos de revision Kleckner, N. ( 1989). Tn 10 transposon. In Berg, D. E. and Howe, M. M., eds., Mobile DNA. Washin gton, DC: American Society for Microbiology Press, pp. 227-268. Kleckner, N. ( 1990). Regulation of transposition in bacteria. Annu. Rev. Cell Bioi. 6, 297-327. Articulo de investigacion Roberts, D. et a!. ( 1985). IS 10 transposition is regulated by DNA adenine methylation. Cell 43, 117-130.

E

Los elementos de control forman familias de tran sposones

Arti culos de revision Fedoroff, N. ( 1989). Maize transposable elements. In Berg, D. E. and Howe, M. M., eds., Mobile DNA. Was hington, DC: American Society for Microbiology Press, pp. 375- 411. FedorofL N. (2000). Transposons and genome evolution in plants. Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 97, 7002-7007. Gierl, A., Sa edler, H., and Peterson, P. A. ( 1989). Maize transposable elements. Amm. Rev. Genet. 23 , 71 -85.

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m

Inte rve nci6n de los elementos susceptibles de transpos icion en la disgenesia hibrida

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fJD

Los elementos P se acti va n en la linea germinal

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Referencias

549

Retrovirus y retroposones ESQUEMA DEL CAPITULO Introducci6n El ciclo vital de los retrovirus comprende sucesos similares a la transposici6n

Los retrovirus pueden hacer transducci6n de secuencias celulares

• Un retrovi rus tiene dos capias de su genoma de RNA de cadena unica. Un provirus integrado es una secuenda de DNA de cadena doble. • Un retrovirus genera un provirus mediante transcripcion inversa del genoma retrovirico.

• los retrovirus en proceso de transformation se gene un suceso de recombination donde una secuencia d• celular sustituye a una parte del RNA retrovirico.

Los genes retroviricos codifican poliproteinas

• los transposones Ty tienen una organization simila• los retrovirus endiigenos. • los transposones Ty son retroposones con actividad transcriptasa inversa que realizan transposition a tr un intermediario de RNA.

• Un retrovirus caracteristico tiene tres genes: gag, pol y env. • las proteinas Gag y Pol se traducen a partir de un producto de transcription de longitud completa del genoma. • la traduction de Pol requiere un cambia de marco por el ribosoma. • Env se traduce a partir de un RNAm individual que se genera por fragmentation . • Cada uno de los tres productos protefnicos es procesado por proteasas para dar orige n a multiples proteinas.

El DNA vi rico se genera par transcripci6n inversa • Se repite una secuencia corta (R) en cada extrema del RNA virico, de manera que los extremes 5' y 3' corresponden a R·US y U3·R, respectivamente. • la transcriptasa inversa inicia Ia slntesis cuando un RNAt cebador se une a un sitio distante de 100 a 200 bases del extrema 5'. • Cuando Ia enzima a\canza el extrema, las bases '>' terminates del RNA se fragmentan, lo que expone el extrema 3' del producto DNA. • Los pares de bases expuestos del extrema 3' se aparean con el extrema 3' de otro genoma de RNA. • La slntesis continua y genera un producto donde las reglones S' y 3' se repite n, lo que da a cada extrema Ia estructura U3-R-U5. • Ocurren episodios similares de cambia de cadenas cuando La transcriptasa inversa utili za el producto DNA para generar una cadena complementaria. • El cambia de cadenas es un ejemplo del mecanisme de selecdon de capias de Ia recombination.

El DNA virico se integra al cromosoma • la organizatiOn del DNA provirico en un cromosoma es Ia misma que en un transposiin, donde el provirus es ftanqueado por repeticiones directas cortas de una secuencia en el sitio diana. • El DNA lineal se inserta en forma directa en el cromosoma del hospedador gracias a Ia accion de la enzima integrasa retrovi rica.

550

• Se pierden dos pares de bases de DNA de cada extre la secuencia retrovirica durante Ia reacd6n de inte9'

Los elementos Ty de las levaduras se asemej los retrovirus

Muchos elementos susceptibles de transposi residen en Drosophila melanogaster • Copia es un retropos6n abundante en D. me/anagast

Los retroposones son de tres clases • los retroposones de Ia superfamilia virica son trans, que se desplazan a traves de un RNA que no constit partlcuta infecciosa. • Algunos retroposones se asemejan de manera direct retrovirus en su uso de LTR, en tanto otros no tiene • Se pueden encontrar otros elementos que fueron ge par un episodic de transposition mediada par RNA. par sl mismos no codifican enzimas que puedan cat transposicion. • los transposones y retroposones constituyen casi La del genoma humano.

La familia Alu tiene muy disperses

mucho~

• Una parte importante del ONA repetitive en genome: mamlfero est~ constituida por repetitiones de una s familia, organizadas como transposones y derivadas productos de transcription de la polimerasa m de I'

Los seudogenes procesados se originaron co sustratos para La transposici6n • Un seudogen procesado se deriva de una secuenda RNAm por transcripcion inversa.

Las LINES utilizan una endonucleasa para gE un extremo con actividad cebadora • Las UNES no tienen LTR y para cebar La transcripcio inversa requieren que el retroposon codifique una endonucleasa que genere una hendidura_

Resumen

E1J

Introducci6n La transposition que comprende un intermediario obligatorio de RNA es una propiedad exdusiva de .as eucariotas y proviene de Ia capacidad de los retrovirus de insenar copias de DNA (provirus) de un gcnoma virico RNA eo los cromosomas de una celula hospedadora. Algunos transposones eucari6jcos se reladonan con provirus retrovfricos en su organizad6n general y experimeman rransposid6n a traves de intermediaries de RNA. Como clase. es:os elementos se Haman retropos o n es (o a veces retrot rans posones). Los retroposones mas sencillos no tienen actividad de transposid6n, pero presentan secuencias que los elementos activos reconocen como susrraros paxa Ia transposici6n. Por lo ramo, los elementos que usan una transposici6n independienre de RNA van tlesde los retrovirus mismos (que tienen capaddad para infectar con libertad celulas hospedadoras), hasta secuencias con transposici6n a traves de RNA, y basta aquellos que por sf mismos no tienen ta capacidad de transposici6n. Companen con todos los transposones la caracterfstica diagn6stica de ge· nerar repeticioncs conas directas de DKA diana en el sitio de una inserci6n. Incluso en genomas donde no se han detecta do los transposones activos se encuentran vestigios de episodios amiguos de transposici6n en forma de ~epetidones diana directas que flanquean secuendas repetitivas dispersas. Las caracterfsticas de estas secuencias a veces comprenden una secuenda de RNA como progenirora de la secuencia geonomica DNA), lo que sugiere que el RNA debe haberse convcrtido en una copia de DNA duplex que se insert6 en el genoma por un suceso simHar a Ia transposicion. Como cualquier o tro ciclo de reproducci6 n, el de un retrovirus o retropos6n es comi_nuo; es arbi:rario considerar como "inlcio" el pumo donde se imerrumpe. No obstante, Ia manera de ver estos ~lementos es parcial. por la forma en que sue1en observarse ( ). Los retrovirus se consideraron primero partf..-ulas viricas infecciosas capaces de reaJizar transmisi6n emre celulas y por ello se cree que el ddo imrace1ular (que cornprende un DKA duplex) es un medio de reproducci6n de virus RNA. Los retroposones se descubrieron como componenres del genoma, y las formas de RNA se han definido en su mayor pane por sus fundones como RNAm. Asi, los autores consideran a los retroposones como secuencias gcn6micas (de DNA duplex) que pueden realizar rransposici6n denrro de un genoma; no migran entre celulas.

El ciclo vital de los retrovirus com prende sucesos si mila res a La transposici6n

Conceptos princ1pales • Un retrovirus tiene dos capias de su genoma de RNA de cadena unica. • Un provirus integrado es una secuencia de DNA de cadena doble. Un retrovirus genera un provirus mediante transcripcion inversa del genoma retrovirico.

Los retrovirus tienen genomas de RNA de cadena tJn.ica que se replican gracias a tm intcrmediatio de DNA de doble cadena. El ciclo vital de un virus comprende una clapa obligatorla en Ia que se insena DNA de doblc cadena en el genoma del hospedador por un episodio similar a la transposici6n y que genera repeticiones directas cortas de DNA diana. La importancia de esta reacci6n rebasa Ia perperuaci6n del virus. Algunas de sus consecuencias son que: • Una secuencia retrovfrica integrada en Ia llnca germmativa se manriene dentro del genoma celular como provirus e n d6geno. Al igual que un bacteri6fago lisogenico, un provirus act(Ja como parte del material genetico del organismo.

:.··· ················ ··· a· ........... ..... .. y

.

reJ;'"' t.

RNA

.

'. INTRACELULAR

EXTRACELULAR

Retrov•rus

RNA ,

., .................. I I

o

't

......•••.•.•••...•

En los ciclos reproductivos de los retrovirus y Los retroposones se alterna La transcripci6n inversa de RNA a DNA con Ia transcription de DNA a RNA. Solo los retrovirus pueden generar particulas infectantes. Los retroposones se confinan a un ciclo i ntracelular.

22.2 El ciclo vital de los retrovirus comprende sucesos similares a Ia transposicion

vv

RNA VV

1

:rranscripci6n + mversa

LTR

DNA lineal

LTR

(;VJ'Vi'VJ\G\./ii l lntegraci6n

Provirus '\. ,

l

Ell

Los genes retrov1ricos codifican poliprote1nas

Conceptos principales Transcr1pci6n

RNA VV

vv

El ciclo vital retrovirico procede por transcripci6n inversa del genoma del RNA en DNA duplex, que se inserta en el genoma del hospedador para ser transcrito en RNA.

• En ocasiones se recombinan secuencias celulares con Ia secuencia rerrovfrica y des pues se transportan juntas; esras secuencias pueden insertarse en el genoma como secuencias duplex en nuevas localizadones. • Las secuencias celulares que experimentan transposicion por un retrovirus pueden cambiar las propiedades de una ceJula cuando se infecta con el virus. Las panicularidades del ciclo de vida de los retrovirus se ilustran en la _Los pasos cruciales son que el RNA vfrico se convierte en DNA, el DNA se integra al genoma del hospedador, y despues, el provirus de DNA de Lranstribe en RNA. La enzima encargada de generar la copia inicial de DNA a partir del RNA es la transcriptasa inversa . La enzima convierte el RNA en una cadena duplex lineal de DNA en el ciwplasma de Ia celu la infecLada. El DNA tambien se convierte en formas circulares, pero estas no parecen iuvolucradas en la repUcaci6n. El DNA lineal se abre camino hada el nucleo. Una o mas copias de DNA se integran al genoma del hospedador_ Una sola enzima, llamada integrasa, se encarga de la imegraci6n. El provirus es Lranscrito por la maquinaria del hospedador para producir RNA virico, que sirve como RNAm y como genemas para empaquetamiento dentro de viriones. La integracion es una pane normal del ciclo vitaL indispensable para Ia transcripci6n. Dos copias del genoma RNA se empaq uetan en cada v irion, lo que hace a la parr£cula vfrica individual eficazmente diploide. Cuando una celula cs infectada de manera simultanea por dos virus dife 552

rentes, pero relacionados, es posible que genere pa ticulas vfricas heterocigotas que porran un genor.: de cada tipo. La diploidia puede ser i.mportante pa:_ permitir al virus adquiri.r secuencias celulares. L: enzimas transcriptasa inversa e inregrasa se tran~ portan con el genoma demro de Ia partfcula vfric.:

CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones

• Un retrovirus caracteristico tiene tres genes: gag, pal~ env. • Las proteinas Gag y Polse traducen a partir de uo producto de t ranscripcion de longitud completa del genoma. • La traducci6n de Pol requiere un cambia de marco par el ribosoma. • Env se traduce a partir de un RNAm individual que se genera por fragmentaci6n . • Cad a uno de los t res productos protei nicos es procesado por proteasas para dar origen a protei nas multiples.

Una secuencia retrovfrica usual contiene tres o cuarro "genes". (En este conrexto el termino genes sc usa para idemificar regiones codificanres, cada um de las cuales en realidad da origen a multiples protcfnas por reacciones de procesamienro.) Un gen('\ ma retrovfrico h abitual co11 Lres genes se organlu en Ia secuencia gag -pol-env. como se indica en l.: El RNAm tetrovfrico Liene u na esttucrura corvencional; presenta una cubiena en el extremo 5'~ esta po liadenilado en el ext remo 3'. Se represent.: en dos RNA.m. Se traduce Ja longirud total de RNA.rr para dar Iugar a las poliprotefnas Gag y Pol. El pr~> ducro Gag se traduce mediante Ia Jectura desde e codon de iniciaci6n hasta cl primer codon de ter~ m.inaci6n . Este ttltimo debe ser pasado por alto par.: que Pol se exprese, Difereotes virus utilizan mecanismos diversos para avanzar y dejar amis a l codon de terminaci6r gag, conforme a la Jelaci6n entre los marcos de lectura gag y pol. Cuando gag y pol se continuan, Jc. supresion por un glutamil-RNAt que reconoce e codon de tenninadon permite Ia generaci6n de unc. sola proteina. Cuando gag y pol estan en d.iierente5 marcos de lectura, tiene Iugar un cambio de marcc ribos6mko que gen era una sola protefna. Por logeneral, Ia lectura cornplc ta es -5% e:ficaz, de mauere que la protefna Gag supera por casi 20 tantos a lc: prorefna Gag-Pol.

. ·-

6

:-.

4

I

a

~

I

•

a

J

I •

10-80

Iy -100 t• Ufr

Genoma virico

gag

-1800

-2000

Traducci6n

Procesamiento

l ~

El empalme produce RNA subgen6mico

Traducci6n !

~

Supresi6n o cambia de marco en el extreme de gag

Procesamiento!

Gada gen genera varies productos proteinicos

=

Procesamiento

!

Gag MA matriz (entre Ia nucleocapside y Ia envoltura virica) CA = capside (principal componente estructural) NC = nucleocapside (que empaqueta el dimero de RNA) PR = proteasa (escinde Gag-Pol y Env) Pol RT =transcriptasa inversa (sintetiza DNA) IN-= integrasa (integra el provirus DNA al genoma)

~v SU = proteina de superticie (las espigas sobre el viri6n interactuan con el hospedador)

TM

=transmembrana (media Ia fusion virus-hospedador)

los genes de los retrovirus se expresan como poliproteinas, que son procesadas hacia productos individuates.

La poliprotefna Env se expresa por orros medias: el ernpalme genera un mensajero subgen6mico, mas corto, que se traduce en el producto Env. El gen gag da origen a los componentes protefnicos del centro nudeoprotefnico del virion. El gen pol codifica funciones encargadas de Ia sfmesis y re combinaci6n de acidos nuclei cos. El gen env codlfica componemes de Ia envoltura de Ia particula, que tambien secues tra componentes de Ia membrana citoplasmica de la celula. Los producros Gag, Gag-Poly Env son poliprorefnas fragmemadas por una proteasa para liberar las prote(nas individuales que se encuentran en los viriones maduros. La actividad de proteasa es codificada por el virus en diversas formas: puede ser parte de Gag o Poly a veces adq uiere la forma de un marco de Jectura independiente adidonal. Laproducci6n de una partfcula retrov1rica comprende el empaquetamiemo del RNA en el centro, su rodeo por protefnas de la capside y Ia extracci6n por presion de un segmento de membrana de Ia celula del hospedador. En Ia se muestra Ia liberaci6n de partfculas infecciosas por ese medio. El proceso se revierte durante Ia infecci6n: un virus infecta una nueva celuJa al fu sionaise con su membrana plasmatica y luego liberar el contenido del virion.

Los retrovirus (VIH) experimentan gemaci6n desde la membrana plasmatica de una celula infectada. Fotos por

cortesia de Matthew A. Gonda, Ph.D., Chief Executive Officer, International Medical Innovations, Inc. 22.3 los genes retrov1ricos codifican poliproteinas

553

10-80 - RUS

1-

gag

pol

-2000

- 2900

80-100

l'.'li!•

-1soo

U3

A-to-so

I

17D-1260

Forma lineal del DNA vlrico U3 RUS

gag

pel

U3 RU5

I I LTR 25D-1400 bp

LTR Forma de DNA vfrico integrado

U3 ha perdido 2 bp

-

~

IU3

-I

US ha perdido 2 bp

j_ RlJ5

gag

Repetici6n de 4--6 bp del DNA diana

pol

::......C.--'-'-"- U3 RUS 'Hospedador

r

Repetici6n de 4--6 bp del DNA diana

El RNA retrav1rico termina en repeticianes directas (R); el DNA lineallibre termina en LTR y el provirus concluye en LTR, acartados cada uno por un par de bases.

Ef1t El DNA virico se ge nera po r transcri pci6n inversa Conceptos principales o

•

•

• •

•

•

Se repite una secuenda corta (R) en cada extreme del RNA v1rico, de manera que los extremes 5' y 3' sean R-U5 y U3-R, respectivamente. La transcriptasa inversa inicia La sintesis cuanda un RNAt cebador se une a un sitio distante de 100 a 200 bases del extrema 5'. Cuando La enzima alcanza el extrema, las bases 5' terminates del RNA se fragmentan, La que expone el extreme 3' del producto DNA. Los pares de bases expuestos del extreme 3' se aparean con el extreme 3' de atro g.enoma de RNA. La sintesis continua y genera un praducto donde las regiones 5'y 3' se repiteo, lo que da a cada extreme la estructura U3-R-U5. Ocurren episadias similares de cambia de cadenas cuando la transcriptasa inversa utiliza el producta DNA para generar una cadena complementaria. El cambia de cadenas es un ejemplo del mecanisme de selecci6n de capias de la reco.mbinaci6n.

Los retrovirus se denominan virus d e cadena positiva porque el propio RNA vfrico codifica los productos protelnicos. Como su nombre lo indica, Ia transcriptasa inversa se encarga de convertir el genoma (cadena RNA positiva) en una cadena complernentaria de DNA que se denomina caden a de DNA negativa. La transcriptasa inversa tambien cataliza etapas posteriores de la producdon del DNA 554

CAPiTULO 22 Retrovirus y retrapasones

duplex. Tiene una actividad de polimerasa que permite sinretizar un DNA duplex a partir del p:ducto de transcripcion inversa de una sola cad ::-na de l RNA. La segunda cadena de DNA en e:;· estrucrura duplex se denomina cadena d e Dl\ positiva. Como adyuvante indispensable de e'actividad, Ia enzima tiene una actividad de RNAa H, que puede degradar la porci6n RNA del hfbli: RNA-DNA. Todas las transcriptasas tnversas retr vfricas comparten similitudes considerables de . ~ secuencias de aminoaddos y se pueden reconocc: secuencias hom6logas en algunos otros retropos nes. En la se comparan las estructuras _ las formas de DNA del virus con el RNA. El ~ virico tiene repeticiones directas en sus extrem Esos segm entos R varian de 10 a 80 nucle6tidos cdiferentes cepas de virus. La secuencia del extrer 5' del viruses R-U5 y la secuenda en el extremoes U3-R. Los segmentos R se usan durante Ia conve-sion de Ia forma de RNA ala de DNA para gene:. las repeticiones d irectas mas extensas que se obse-van en el DNA Hneal ( y ) =:.. acortamiento de 2 bp en cada extremo de la forrintegrada es consecuenda del mecanisme de i.nte~ cion (vease Ia Figura 22.9). Al igual que con otras polimerasas de DN~ rranscriptasa inversa requiere tin cebador. El ceb~ dor natural es el RNAL. Hay un RNAt del hospeci:.dor, sin carga, en el virion. Se aparea una secuenc: de 18 bases en el exuemo 3' del RNA t con las c rrespondientes en un sitio que se encuentra a lOC _ 200 bases de distancia deJ extremo 5' de una de ~ moleculas de RNA vfrico. El RNAt puede tambieaparear sus bases con un sitio cercano al extren:. 5' del otro RNA vfrico, lo que ayuda a Ia formaci de un dimero entre los RNA vfricos. He aqui un dilema: Ia transcriptasa inversa iL~ cia la simesis del DNA en un sitio apenas 100 a 2( bases en sentido descendente respecto del extrem 5'. (.Como puede generarse el DNA que represei:el genoma intacto de RNA? (Esra es una varia:c.: extrema del problema generaJ en Ia replicaci6n .!.. los extremes de cualquier acido nudeico lineaJ; v6se Ia secci6n 16.2, Los exLremos del DNA lineal s<. un problema para la replicacion.) La s(nresis in vitro avanza hasta el final y genera una secuencia de DNA breve llamada DKde detendon fuene-negativo. Esta molecula no ~ encuen rra in vivo porque la sfntesis continua por reacci6n ilustrada en la Figura 22.6. La transcripta5oe in versa cambia de moldes y se II eva al DNA nacte!h_ con ella a un nuevo molde. Este es el pdmero .:. dos saltos entre moldes. En esta reacci6n, Ia region R en el extrema : del mo lde de RNA es degradada por Ia activid

El retrovirus provee Ia cadena positiva de RNA R US U3 R

rr r

r

5,

~

El RNAt cebador hibridiza al sitlo de union sabre el RNA retrovlrico

5'

R

.!:J§

I

! lii

•r -rrr rt.

f

3'

3,

Se retira el RNA! cebador

3' R 3'

!

La 1ranscriptasa inversa inicia Ia sintesis del DNA de cadena negativa -. Cadena negativa•

3' I

5'

fl I

I .a..:~...__

1 ! ! 1

3'

Jlllll

Se degrada el RNA y quedan fragmen tos residuales para cebar Ia sfntesis de DNA

nrrrwn!l r,"'1

Se sintetiza Ia cadena positiva de detenci6n fuerte del DNA

3' 5'

r..,r

. "'rr"'r"'r""tr"r... "'TTT-"'r........ dJ

El DNA de cadena positiva se transfiere al otro extrema de Ia cadena negativa en el segundo salta

3' 3'

5'

~

5'

I f 5'

I

t

I

5' 3'

t

71'1'1'J'1"1!'FlFI'Pn"''n.

5'

5' 3'

Concluye Ia sintesis de Ia cadena positiva de DNA

Se degrada Ia regi6n 5' terminal de Ia cadena de RNA

3' Nuevoextrema 5'

[([[[([[[[[([t~l

3'

Las enzimas alcanzan el extrema del molde y generan un DNA fuerte de detenci6n negative .,_ De detenci6n • fuerte negative

3'

, rurrrntmrrm

3'

3

,

5' 1ll

trrrrmnprnn

5' 3'

Concluye Ia sintesis del DNA de cadena negativa

~: L-

"'t"'r!"""I'I"F"""'Fin~l""i1 !illl£1T ....,

~ LTR~

5' 3'

~ LTR~

La slntesis de la cadena positiva de DNA requiere un segundo salto,

Se genera la cadena DNA negativa por medic del cambia de molde durante la transcripcion inversa.

de RNAasa H de Ia transcriptasa inversa. Su retiro permite que la region R en el extremo 3' realice apareamiento de bases con el DNA reden sintetizado. La transcripcion inversa continua despues por Ia region U3 hacia el cuerpo del RNA. El origeo de la regl6n R que se aparea con el DNA de detenci6n fuerre-negativo puede estar en el extrema 3' de la misma molecula de RNA (aparearniento intramolecu lar), o el extremo 3' de una molecula dlferente de RNA (apareamiento intermolecular). Se usa el cambio a un mol de diferente de RNA en Ja figura porque hay datos de que la se cuen da del RNAt cebador nose hereda en un dclo de vida del retropos6n . (Si ocurriese apareamiento intramolecular, se esperarfa que Ia secuencia se heredara porque ofrecerfa la (mica fuente para la secuencia de union del cebador en el siguien Le ciclo. El apareamiento intermolecular permite que otro RNA retrovirico provea esta secuencia.)

El resultado del cambio y Ia extension es Ia adicion de un segmento U3 al extremo 5'. El segmento de secuencia U3-R-U5 se denomina rep eticion terminal larga (LTR) porque una serie similar de episodios afiade un segmento US at extremo 3' y da lugar ala misrna estructura de U5-R-U3. Su longitud varfa de 250 a 1400 bp (vease la Figura 22.5) . Ahora se necesita generar la cadena de DNA positiva y la LTR en el otro extrema. La reaccion se muestra en Ia Figura 22.7. La transcriptasa inversa ceba Ja sfntesis de la cadena positiva de DNA a partir de un fragmento de Rl'JA que queda despues de degradar Ia molecula original de RNA. Se genera una cadena de DNA de detencion fuerte-positivo cuando la enzima alcanza el exn·emo del molde. Este DNA se transfiere entonces a! otro extremo de una cadena negativa, donde tal vez se libere gracias a una reaccion de desplazamiemo cuan do ocurra una segunda ronda de sfn tesis de DNA a partjr de un fragmenlo cebador en ubicaci6n mas alta (a s u izqu ierda en la figura). Se hace uso de la region R para el apareamiento con el ext,remo 3' de una cadena de DNA negativa . Este DNA de doble cadena requiere entonces concluir ambas cadenas para generar una LTR duplex en cada extremo. 22.4 El DNA vi rico se genera por transcripcion inversa

555

La transcriptasa inversa sintetiza Ia cadena de DNA

.... 3'

La enzima se dlsocia ~ del molde

5' La enzima se une a un nuevo rnolde

3'

~

5' Se reinicia Ia transcrlpci6n inversa

~

5'

3'

La recombinaci6n con selecci6n de capias tiene Iugar cuando la transcriptasa in versa Iibera su molde y reinicia la sintesis de DNA utilizando uno nuevo. Es probable que la transferencia entre las cadenas del molde ocurran de manera directa, pero aquf se muestra en pasos independientes para ilustrar el proceso.

Cada panicula retrovlrica porta dos genomas de RNA. Esro hace posible que ocuna Ia recombi nacion durante un cido viLal vfrico. En principio, esto pudiese presentarse durante la simesis de las cadenas negativa, posiriva, ode ambas. • El apareamiemo intermolecular que se muestra enla Figura 22.6 permite que ocu rra una recombinacion emre secuencias de los dos moldes sucesivos de RNA cuando se simeriza la cadena de DNA negativa. La recombinaci6n retrovirica es en su mayor parte debida a Ia rransferenda de cadenas en esa erapa, cuando se traslada la cadena naciente de DNA de un molde de RNA a otTO durame Ia transcripci6n inversa. • Se puede sintetizar DNA de cadena posi ti va de manera discominua en una reacd6n que comprende varias injciaciones internas. Puede haber tambien Lransferencia de cadenas durante esta reacci6n, pero es menos frecuente. La caracterlstica comun de ambos episodios es que la recombinaci6n es consecuencia de un cambio de mol de durante el acto de la simesis de DNA. Este es un ejemplo general de un mecanismo de la recombinaci6n llamado selecci6n de copia. Durante muchos anos se consider6 como un posible meca-

556


nismo para la recombinaci6n en general. Es pc probable que se emplee en sistemas celulares, pc. constituye una base comun para Ia recombinaci durante la infecd6n por virus RNA, incluso aq<. llos que se replican de mancra exclusiva a traves ~ formas RNA. como los de Ia poliomielilis. El cambia de cadenas ocurre con dena frecue-cia durante cada ciclo de transcripci6n inversa. _ decir, ademas de la reacci6n de transferencia qu es forzada en el final de la cadena del molde . principia se il usLra en la , si bien no sabe mucho del mecanismo. Ocurre transcripdf> inversa i11 vivo en un complejo de ribonucleoprotenas, donde la cadena molde de RNA se u ne a coL ponentcs del "iri6n, induida Ia principal p rotel!:de Ia capside. En el caso del Vll-I, Ia adid6n de e~...: prorefna (N7) a un sistema i11 vitro causa recom~ naci6n. El efecw es probablememe indirecto: Nc~ afecla Ia esuucrura del molde de RNA, lo que a s-vez allera Ia posibilidad de que la transcriptasa ir.versa cambie de una cadena molde a orra.

=

El DNA virico se integra al cromosoma Conceptos principales • La organizaci6n del DNA provfrico en un cromosoma es la misma que en un transpos6n, donde el provirus es fla nqueado par repeticiones directas cortas de una secuencia en elsitio diana. • El DNA lineal se inserta en forma directa en el cromosoma del hospedador gracias a ta acci6n de ta enzima integrasa retrovirica . • Se pierden dos pares de bases de DNA de cada extrema de la secuencia retrovirica durante la reacci6n de integraci6n.

La organizaci6n del provirus lmegrado se asemeja

a Ia del DNA lineal. Las lTR en cada exrremo de! provirus son i<:lenticas. El extreme 3' de US consra de una repedci6n corta invenida con relaci6n al extreme 5' de U3, de manera que la LTR misma termina en repericiones conas invenidas. El DNA provfrico integrado es como un transpos6n: Ia secuencia provirica rermina en repeticiones invertidas y l1anqueada porrepeticiones cortas mrcctas del DNA diana. Se genera el provirus cuando se insena de manera directa un DNA lineal a un sitio diana. (Ademas del DNA lineal hay fo r mas circulares de las secuendas vfricas.) Una tiene dos secuencias LTR adyacentes generadas por la union de los extremos lineales, La orra tiene solo una LTR, al parecer generada por un episoctio de recombinacion y que en realidad constiLUye Ia mayor pane de los cfrculos.

Durante mucho tiempo pareci6 que el cfrculo podrla ser una imegracion intermedi.a (por analogfa con Ia integracion del DNA A.; hoy se sabe que se usa la forma lineal para la integrad6n). La integracion del DNA lineal es catalizada por un produclO virico unico, la integrasa, que actua en el DNA lineal retrovirico y el DNA diana. La reacci6n se Hustra en Ia rr Los extremos del DNA virico son imponames. Por ejemplo, las mutaciones en los extremos de los transposones lmpidcn la integraci6n. La caracterlsti camas conservada es Ia presencia de una secuencia del dinucle6tido CA cerca del extremo de cada re peticion invenida. La integrasa une los extremos del DNA lineal en un complejo r.ibonucleoprotelnico y despues convierte los exrremos romos en ou-os en recesi6n por el retiro de bases mas alla del CA que se conserva. En general esto implica Ia perdida de dos bases. Se eligen sitlos diana en forma aleatoria con respecro ala secuencia. La integrasa hace cortes escalonados en un sitio diana. En el ejemplo de Ia Figura 22.9 los cones estan separados por 4 bp. La !ongitud de una repetici6n diana depende del virus particular; puede ser de 4, 5 o 6 bp. Al parecer se Jetermina por la geometrfa de la reacci6n de la in;egrasa con el DNA diana. Los extremes 5' generados por Ia fragmema .:i6n del DNA diana preseman union covalente con !os exLremos 3' en recesion del DNA vfrico. En ese ;>unto ambos ex1remos del DNA vfrico se unen por .ma cadena al DNA d iana. La region de una sola cadena es reparada por enzimas de Ia celula del hos~ pedador, y durante esta reacci6n se retiran las dos bases que protruycn en cada extremo 5' del DNA :irico. El resultado es que el DNA v(rico imegrado ha perdido 2 bp en cada LTR; esto correspoude a .a perdida de 2 bp desde el extremo izquierdo del :13 terminal y ala perdlda de 2 pb desde el extre;no derecho del U5 3' terminaL Hay una repetici6n .:aracterfstica cona directa del DNA diana en cada extreme de un genoma retrovirico imegrado. El DNA virlco se integra aJ genoma del hospeda jor en sitios seleccionados en forma aleatoria. Una :elula infeclada recibe de una a 10 copias del proVi~ :us. (Un virus infecdoso emra a! ciroplasma, por su ?Uesto, pero Ia forma de DNA se integra al genoma =o el nucleo.) Los retrovirus pucden replicarse solo en .:€1ulas proliferantes porque el ingreso al nudeo re~uiere que la celula pase por la mitosis, cuando el geuoma v[rico logra el a! material nuclear. La region U3 de cada LTR porra un promotor. !:1 promotor en la LTR izquierda se encarga del inid o de Ia transcripci6n del provirus. Recuerdese que :;e requiere Ia generad6n del DNA provlrico para :.tbicar una secuencia de U3 en la LTR izquierda;

1. La integrasa genera dos e)(tremos 3' con retraso de dos bases en ~TR

'=JB._

mmmniiL

2. La Integrasa genera exttemos escalonados en el DNA diana

LTR

• Jrlf 5'

5'

3'

3'

3. La (ntegrasa vincula los extremos 3' con retraso de LTR a los extremos 5' escalonados de Ia diana

La integrasa es La unica proteina virica necesaria para Ia reacci6n de integraci6n, donde cada LTR pierde 2 bp y se inserta entre repeticiones de 4 bp del DNA diana.

por lo lanto, se observa que el promotor es, de he cho, generado por la conversion del RNA en DNA duplex. A veces (tal vez con muy poca frecuencia)1 el promotor en la LTR derecha facilita la transcripci6n de las secuendas del hospedador cercanas aJ ciclo de integra cion, La LTR tam bien lleva un reforzador (una secuencia que activa a los promotores vecinos), que puede actuar sobre las secuenc.ias celular y vfrica. Tal vez ala integrad6n de un reuovirus se deba que una celula hospedadora pase a un estado tumorigenico cuando se activan cien os tipos de genes en esta forma. (.Se pueden escindir del genoma los provims imegrados? Podrfa ocunir recombinaci6n bom6loga emre las LTR de un provirus; hay LTR solitarias presemes en algunos genomas celulares que podrfan constituir vestigios de un episodio de escisi6n. Hasta ahora se han anal izado los retrovirus en tt>nninos del ciclo infectame, donde se necesita integraci6n para la producci6n de mas copias de R.J.'IA. No obstante, cuando un DNA vfrico se integra a la lfnea germinativa se conviene en un "provirus end6geno" originado en el organismo. Los virus end6genos por lo general nose expresan, pero en ocasiones sou activados por episodios extemos, como una infecci6n con orro virus. 22.5 Et DNA v1rico se integra al cromosoma

557

Los retrovirus pueden hacer transducci6n de secuencias celulares Concepto principal • Los retrovirus transformantes se generan por un episodic de recombinaci6n donde una secuencia de RNA celular sustituye parte del RNA retrovirico.

Una informacion interesan te acerca del ciclo vital vlrico surge de Ia aparici6n de virus de transduccion, que son variames que han adquirido secuen-

Virus defectuoso ii!lfflJt~

RUS gag t

lJ3R ~·

Las protefnas del virus auxiliar ~ypueden Jograr•• •• Ia replicacl6n del virus defectuoso Los virus en transformaci6n con replicaci6n defectuosa presentan sustituci6n de una secuencia celular por una parte de \a secuencia virica . El virus defectuoso puede replicarse con la ayuda de un virus auxiliar que realiza las fu nciones naturales.

DELECION

I t

TranscripcJOn a partir dell

provirus con delecl6n

=

t

Transcripcl6n de otro provirus

J

Empalme

/ Empaquetado en el virion

Recombinaci6n del RNAJ ..a

====~========--D

Se pueden generar genes con replicaci6n defect uosa mediante la integraci6n y deleci6n de un genoma vi'rico para obtener un producto de transcripci6n celular-vi'rica unido, que se empaqueta con un genoma normal de RNA. Se necesita recombinaci6n no hom6loga para generar el genoma de transformaci6n con replicaci6n defectuosa. 558


das celulares en Ia forma ilustrada en Ia t . Parte de la secuencia vfrica ha sido susliru.i._ por el gen v-one. La sfnresis de protefnas genera u;; Gag-v-Onc en lugar de las protefnas usuales Ga=Poly Env. El virus resultante presenta un defec to de la replicaci6n; no puede mamener un d e. infectante por sf mismo. Sin embargo, puede pe-peruarse en compafifa de un v irus au x iliar, q;..proporciona las funciones viricas fal tantes. Las siglas One conslHuyen una abreviatura oncogenesis. Ia capacidad de tTansformar celul? cu ltivadas de man era que se liberen de la regulaci,. habitual del crecimienro y sea posible su divisi irresLricta. Los genes 011e vfrico y celular puedeo s~ causa de la aparici6n de celulas tumorigen icas. Un gen v-ane confiere a un virus la capacidad _ transformar un cierto Lipo de celula hospedado:::: Los loci con secuendas hom61ogas que se encue;:-tran en el genoma del hospedador corresponder genes c-one. <.Como adquieren los retrovirus gei:.t:" one? Una caracrerfstica reveladora es Ia discrepa-cia en las esn·ucturas de los genes c-one y v-ane. L genes c-one por lo general son imerrumpidos par :-trones, en tam a los v-onc no son interrumpidos. E.ssugiere que los genes v-onc se originan de copias _ los genes c-one empalmadas al RNA. En Ia se ilustra un modelo para _ formaci6n de los virus en transformaci6n. Un ;-e rrovirus presenla integrad6n cerca de un gen c-c·· Tiene lugar una deleci6n que o rigina fusion del p::- virus al gen c-one; [a transcripci6n genera entonr:un RNA unido que conriene secuencias vfricas e un extremo y secuencias celulares one en el ot: El empalme retira los Lntrones de las partes vir..... y celular del RNA. El RNA tiene las senales ap~ piadas para el empaquetamiento dentro del virif·se generanin viriones si Ia celuta tambien contie~ otra copia intacta del provirus. En este punto, a~: de las particu las vfricas djp}oides puede contener ... RNA fusionado y un RNA virico. Una recombinaci6n entre estas secuencias p drfa generar el genoma de transfonnaci6n, don hay repeticiones vfricas en ambos extxemos. (Oc~ rre con frecuencia alta la recombinad6n por ,._ rios medias durante el ciclo infecLaJ1te reLrovlric No se sabe nada acerca de sus requerimientos _ homologla en los sustratos, pero se supone que reacd6n no hom6loga entre un genoma vfrico la parte celular del RNA fusionado procede por _ mismos mecan ismos que se encargan de la reco. binadon vfrica.) Las caracterfsticas comun es de todas las clax de retrovirus sugieren que pueden derivarse de _ ancestro unico. Los elementos de las secuenctas inserci6n (IS) primordiales podrfan haber rodea,_ a un gen de polimerasa de addo nucleico del b(,

pedador; la uni<.lad resu ltanre tendrla Ia forma de LTR-pol-LTR. que pudiesc evolucionar hada un vi rus infectante porIa adquisici6n de habilidades mas complejas para manipular sustratos tanto de DNA como de RNA, incluida Ia incorporaci6n de genes cuyos productos permitieran el empaqueramiemo del RNA. Otras funciones, como Ia rransformaci6n de genes, podrian incorporarse despues. (No hay molivo para suponer que cl mecanisme involucrado en Ia adquisici6n de fundones celulares sea exclusive de los genes one; no obstante, es posible que los virus que ponan estos genes tengan una vemaja selectiva debido a su efecto estimulador del crecirniemo celular.)

1DJ

Los elementos Ty de las levaduras se asemejan a los retrovirus

-

--RNA de 5.7 kb _ _......,.,...

-

--RNA de 5.0 kb-.

Protema TyA

Proteina TyA-B

Los elementos Ty terminan en repeticiones directas cortas y se transcriben en dos RNA superpuestos. Tienen dos marcos de lectura con secuencias relacionadas con los genes retroviricos gag y pol.

Conceptos principales • Los transposones Ty tienen una organizaci6n similar a la de los retrovirus endOgenos. • Los transposones Ty son retroposones con actividad de transcriptasa inversa que realizan transposici6n a traves de un intermediario de RNA.

los elementos Ty constiruyen una familia de secuencias repetitivas dispersas de DNA que se encuemran en sitios diversos de cepas disfmiles de levaduras. Las siglas Ty corresponden a una abreviatura de ''transposones de tevadura'' (del ingles, transposon yeast, Ty). Un episodic de transposici6n da origen a un vesrigio caracterfstico: 5 bp del DNA diana se repiten a cacla !ado del eleme n to Ty insenado. Los elementos Ty son re troposones que reaJizan Ia transposici6n por el mismo mecanisme que los retrovirus. La frecuencia de Ia tra nsposici6n J)1 es menor que Ia de gran pane de los transposones bacterianos, -10-7-1 o-8 • Hay mucha divergencia entre los distimos elememos Ty. Casi todos entran en una de dos clases principales llamadas Tyl y Ty917. Tienen Ia misma organization general ilusLrada en Ia Cada elemcnto tiene 6.3 kb de longitud; los ulrimos 330 bp en cada extrema constitllyen repeticiones directas llamadas 8. Cada uno de los elementos Ty de cada tipo riene muchos cambios respecto del prorolipo de su clase, como las sustituciones, inserciones y dclcciones de pares de bases. Hay -30 copias del tipo Tyl y -6 del tipo Ty917 en un genoma caracterfsdco de levadura. Ademas, hay -100 elementos :telta independientes llamados 8 solo. Las secueocias delta rambil!n muestran mucha hereroge neidad, si bien es posible que las dos repe-

tidones de un elememo individual Ty sean idemicas, o aJ menus con una relaci6n muy ccrcana. Las secuendas delta vinculadas con elememos Ty muestran mayor conservaci6n de secuencias de los elementos delra solo, lo que sugicre que el reconocimiento de las repeticiones panicipa en Ia rransposici6n. EJ elernemo Ty sc transcribe en dos especies de RNA poli(At. que constiruyen >5% del RNAm total de una celula hapJoide de levadura. Ambas espcdes inician en el interior de un promotor en el elemenro 8 en el extreme izquierdo. Uno termina despues de 5 kb; el otro lo hace despues de 5.7 kb, demro de Ia secuencia 8 en el extremo derecho. La secuencia del elemento Ty tiene dos marcos de lecrura abierros que se expresan en Ia mism a clireccion, pero se 1een en fases diferemes y se su perponen por 13 aminoacidos. La secuencia de TyA hace pensar que codiflca una proteina de un ion al DNA. La secuencia de TyB conLiene region es con bomologias con las sccuendas transcriptasa inve rsa. proteasa e imegrasa de los reuovirus. La organiLaci6n y las fundones de TyA y TyB son an
'2t .i Los elementos Ty de las levaduras se asemejan a los retrovirus

559

Elemento Ty de lnicio

Se matca una unidad delta Sustituci6n de bases

~ El promotor precede al elemento; se agrega el intr6n lntr6n

_L Los elementos con transposici6n tienen deltas notorias, sin intr6n

Un elemento Ty unico sometido a procesos de ingenieria para contener un intr6n, experimenta transposici6n para formar capias que carecen del intr6n. Las capias poseen repeticiones terminates identicas, que se generan desde uno de los extremes del elemento Ty original.

Hay conversion gene tica eucre elementos Ty en dife remes localizadones, con el resultado de que uno e_~ "sustituido" por Ia secuencia del orro. Los elementos Ty pueden escindirse mediante rccombjnaci6n hom6loga entre las secuencias delra de reperici6n directa. Es posible que el gran numero de elementos() solo constituya uu vestigio de dichos episodios. Una escisi6n de esra naturaleza puede asociarse a Ia reversi6n de una muraci6n causada por la inserd6n de Ty; el grado de reversion puede depender d<" las secuencias delta exactas que quedaron atn'is. Es una paxadoja que ambos elementos delra tengan la misma secuencia y. no obstanLe, un pro motor esta activo en el della de un extrerno y un terminador esta activo en el delta del orro extrema. (Se encuentra una caracteristica similar en ottos elementos susceptiblcs de transposici6n. induidos los retrovirus. ) Los elementos Ty son retroposones caracteris ticos, ya que reaUzan transposici6n a traves de un imennediario de RNA. En Ia se incluye un esquema ingeuioso que permite detectax este episodic . Se insert6 un inu·6n en un elemento para generar una secuencia Tv exclusiva. Esra secuencia se coloc6 bajo el control de un promotor GAL en un plasmido y se introdujo en las celulas de levaduras.

560


La transposici6n da como resulrado 1a aparici6n multiples copias del transposon en el genoma de levadura, pero todas las copias carecen del intr6Se conoce solo una forma de retirar intrones· empalme de RNA. lo que h.ace pensar que Ia trar posicion Liene Iugar por el mismo mecanisme
20-60 capias Repeticfones lnvertidas Repetlciones invertidas largas

-30 copias Repeticiones invertidas cortas

los elementos Ty generan particulas similares a virus. Reproducida de J. Mol. Bioi., val. 292, Al-Khayat, H. A., et al., Yeast Ty retrotransposons... , pp. 65-73. Copyright 1999, con autorizaci6n de Elsevier. Foto par cortesia del Dr. Hind A. Al-Khayat, Imperial College london, United Kingdom.

t

0 o -50 copias

Tres tipos de elementos de transposici6n en D.

111

melanogaster tienen diferentes estructuras.

Muchos elementos susceptibles de transposici6n residen en Drosophila melanogaster

Concepto principal • Copia es un retropos6n abundante en Drosop!Jila melanagaster.

La presenda de elememos susceptibles de rransposici6n en D. melanogaster se dedujo por primera vez despues de observaciones analogas a aquellas con que se identificaronlasprimeras secuencias de inserd6n en E. coli. Se encuennan mutaciones inestables que revierten aJ Lipo silvestre por deleci6n, o que generan deleciones del material de los fiancos con un punto terminal en el sitio de origen de Ia mutaci6n. Son causadas por varios tipos de secuencias susceptibles de transposici6n, que se ilustran en la r . Estas secuendas incluyen al retropos6n copia, la familia FB y los elementos P analizados antes en la secci6n 21.14, Participaci6n de los elementos susceptibles de uansposici6n en la disgenesia de hfbridos. La famil ia mejor descrita de retroposones es ~opia. Su nombre refleja Ia presencia de un gran numero de secuencias relacionadas muy de cerca que codifican abundames RNAm. La familia copia se Lorna como paradigma para varios otros tipos de elementos con secuendas que no tienen relaci6n, pero cuya estructura y conducta general parecen similares. El numero de reproducciones del elemento co':lia depende de Ia cepa de la mosca; por lo generales de enrre 20 y 60. Los inregrantes de la familia estan

bastame disperses. Las localizaciones de los elementos copia muestran un espectro difereme (si bien con superposici6n) en cada cepa de D. melanogaster. Estas di[erencias han surgido durante periodos evolutivos. Las comparaciones de cepas que han Lenido d.ivergencia en fechas recientes (durante los ultimos 40 aiios) como resuJtado de su propagaci6n en ellaboratorio revelan pocos cambios. Nose puede calcular el riLmo del cambio, pero Ia natura leza de los sucesos subyacemes queda de manifiesto por el resultado de las celulas que crecen en cultivo. El numero de elementos copia por genoma aumenra de manera sustanciaJ, basta el niple. Los elemem os adicionales representan inserdones de secuencias copia en sitios nuevos. La adaptac:i6n al cultivo en alguna £orma desconocida aumema de manera transitoria Ia rasa de rransposici6n dentro de los llmites de 1o-3 a 1o-l eptsodios por generaci6n. El elememo copia tiene -5 000 bp de longitud, con repeticiones directas termi.nales idemicas de 276 bp. Cada una de las repericiones directas termina en repeticiones invertidas relacionadas. Una repetici6n directa de 5 bp de DNA diana se genera en el sitio de inserci6n. La clivergencia entre cada uno de los integrames deJa familia copia es pequeiia, de <5%; las variantes suelen contener pequeiias deleciones. Todas esras caracrerfslicas son comunes a orras fami]jas similares a copia, si bien sus individuales muestran mayor divergencia. La identidad de las dos repeticiones directas de cada elemento copia indica que interactuan para permitir sucesos de correcci6n o que ambas son generadas a panir de una de las repe ticiones directas de un elemento progenitor durante la transposici6n.

22.8 Muchos elementos susceptibles de transposici6n residen en Drosophila melanogaster

561

Como en el caso similar de los elementOs Ty, esto hace pcnsar en una relaci6n con los retrovirus. Los elementos copia en el genoma siempre em3n inractos; nose han detcctado copias individuates de las repeticiones lenninales (aunque serfa de esperar que se generasen si Ia recombinaci6n produjese deleci6n del material interJ)Uesto) . En ocasiones seen cuemran elementos copia en forma de DNA circular libre; al igual que los cfrculos de DNA retrovtrico, su forma mas prolongada riene dos repeticiones terminales y Ia mas cona tiene solo una. Se han comunicado partfculas que comienen RNA de copia. La secuencia copia contiene un solo marco de lecLUra largo de 4227 bp. Hay homologfas emre partes del marco de lecwra abiena de copia y las secuencias gag y pol de los retrovirus, Es notable la ausencia de las homologias de alguna relaC'i6n con secuencias retrovfricas emr inctispensables para Ia envoltura del virus, lo que signif1ca qlle es poco probable que copia pueda generar panfculas similares a virus. Los producros de transcripci6n copia se encuentran como RNAm poli(A) ~, que representa producLos de lran.scripd6n de longiLUd cotal y parciaL Los RNAm tienen Ul1 extreme 5' comun derivado de la inidaci6n a la mitad de una de las repeticiones tenninales. Se producen varias proreinas, tal vez gracias a episodios como el empa Ime de RNA y la £ragmemaci6n de poliprotelnas. Nose cuenca con pruebas directas del modo de transposici6n de copia; como resultado. hay tantas similitudes con Ia organizacion rerrovfrica que parece inevitable que copia renga un origen relacionado con los retrovirus. Es difkil dedr cuantas funciones retrovfricas posee copia. Se sa be. por supuesto. que efectua rransposici6n. pero (como end caso de los elementos Ty) no hay pruebas de que tenga alguna capacidad infecdosa.

Superiamilia vfrica npos frecuenles Ty (S. cerevlsiae) copia (0. melanogaster)

Bl

Los retroposones son de tres clases

Conceptos principales • Los retroposones de la superfamili a virica son transposones que se desplazan a traves de un RNA que no constituye una partfcula infecciosa. • Algunos retroposones se asemejan de manera directa a retrovirus en su usa de LTR, en tanto otros no tienen

LTR. • Se pueden encontrar otros elementos que fueron generados par un episodic de transposicion mediada par RNA, pero par si mismos no codifican enzimas quuedan catalizar la transposici6n. • Los transposones y retroposones constituyen c~:~si la mitad del genoma humano,

Se define a los rerroposones por su uso de meca u:; mos de rransposici6n que comprenden la n·anscf.:d6n inversa de RNA en DNA. Se conocen Lres clae! de retroposones, incluidos en la • Los 01iembros de la superfa.Jnilia vfrica c difican ac[ividades de nanscriptasa invers.; inregrasa, o ambas. Allgual que otros retr posones, se reproducen de la misma mane ra que los retrovirus. pero difieren de elL porque no pasan por una forma infecci05~ independiente. Se describen mejor en 1 elementos Ty y copia de levaduras y mosCA, • Las secuencias repetidas largas dispers.: (LINES) tambien tienen actividad de trar criptasa inversa (y pueden, por tanto, COi: siderarse como constitutivas de miemb: mas distanres de Ia superfamilia virica pero carecen de LTR y usan un mecanjsm diferente al de los retrovirus para cebar _ reacd6n de tra~lscriptasa inversa. Provieue-

Supertamilia no vi rica

L1 (humano)

Sin repeUclones

SINES (mamlferos) Seudogenes de productos de transcrlpci6n de pol Ill Sin repeticiones

7·21 bp

7-21 bp

Transcriptasa inversa o endonucleasa

Nlnguna (o ninguna que codiflque productos de transposones) Sin intrones

B1 , B21D,B4 (raton)

Terminaciones

Repeticiones terminates largas Repeticiones en 4·6 bp dianas Actividades Transcriptasa inversa, enzimalicas integrasa, o ambas Organizaci6n

-·

LINES

Puede contener intrones Uno o dos OAF lninterrumpidos (retirados en el RNAm subgen6mico)

Los retroposones pueden dividirse en las superfamilias viricas, que son similares a retrovirus o UNES. y superfamilias no viricas, que no ejercen funciones de codificaci6n.

562


de productos de transcripci6n de Ia polimerasa IT de RNA. Una muy escasa pane de los elementos en el genoma tiene lunci6n completa y puede efectuar transposici6n de manera aut6noma; otros prescntan mutadones y por clio solo pueden haccr transposici6n como resultado de un elemcnto aut6nomo que acr(ta en configuraci6n trans. • Lo'> de la s upe rfa milia no v frica se idemifican por caracteristicas externas e imernas que sugieren que provienen de secuencias de RNA. Sin embargo, en estos casas solo se puede espccular acerca de como se gener6 una copia de DNA. Sc supone que cran diana de un eptsodio de u·ansposici6n por tm sistema eozimatico codificado en otro silio, o sea, siempre carecieron de amonomia. Se originaron en productos de rranscripci6n cclular. No codifican proteinas con funcio nes de transposici6n. E1 componente mas promincnte de esta familia recibe el nombre de secuencias repetidas dispcrsas cortas (SfNES) . Estos componemes se dcrivan de productos de transcripci6n de la polimerasa III de RNA. La muestra las relacioncs de organizaci6n y sccuencia de los elcmemos <JUC codifican ,a transcriptasa inversa. AI igual que los retrovirus, . os rerroposones que contienen LTR se pueden dasificar por grupos de acuerdo con cl numero de marcos de lcctura independiente para !1ag. pole mr y cl orden de los genes. A pesar de esas diferencias su,erficiales de organizact6n. Ia caractcri
secuencias relativameme conas relacionadas entre si (constiruidas por el DNA coo repetici6n moderada descritas en Ia sccci6n 4.6. Genomas eucari6ricos que comienen secuencias de DNA repctirivas y no repeuriva~. Las LINES induyen secuencias dispersas largas y las SlNES, secuencias dispersas l'onas. (Se dcscriben como ~ecuencias dispersas o r e peticion es disp e rs a s, por su presencia comun y distribuci6n generali1..ada) . Las planras comienen otro tipo de elemento m6vil pequeiio llamado MITE (que corresponde a un elcmento invertido de uansposici6n rerida en mmiatura). Tales elementos terminan en repeticioncs invertidas. Uenen una secuencia diana tie 2 o 3 bp, no presentan secuencias de codificaci6n y rienen de 200 a 500 bp de longitucl. Hay al menos nueve de 1a lc! rel="nofollow"> familias (por ejemplo} t>n el genoma del arroz. A menudo se encuentran en regiones que flanqucan genes que codifican protefnas. No tienen relaci6n con SINES o LINES. Las UNES y SINES constitllyen una parte significativa del DNA repetitivo de los genomas animales. En muchos genomas eucari6ticos elevados ocupan -50% del DNA total. En Ia sc resume ia distribuci6n de los diferentes rlpos de transposones, que constituycn ca~i la mitad del genoma humano. ExceptO por las SINES, que casi siempre carecen de funci6n, los Otros tipos de elementos csran constituidos por rn:sentantes funcionalcs y orros que han sufrido dcleciones que eliminaron pane de los marcos de lectura que codifican las protefnas necesarias para Ia transposici6n. Los porcemajes relativos de estos tipos de transposones son. en general, similares en el genoma de raton. Una LINES comun en genomas de mamfferos se denomina Ll. El miembro usual ticnc - 6500 bp y 1ermina en un segmento rico rn A. Los dos marcos de lectura abierta de un elemcmo de longitud total se denorninan ORFl y ORF2. El .numero

IRetrovirus-

pol

gag

LTR Ty

[!!TYA

ORF

Cop/a

LTR LINES

LTR

pRF11

Homologra con

gag

ORF2 pol

int

Los retroposones que se relacionan muy de cerca con los retrovirus tienen una organizaci6n similar, pero las UNES comparten solo La actlvidad de transcriptasa inversa. 22.9 los retroposones son de tres clases

563

Elemento

Longltud (Kb) Genoma humano

Organizaci6n

Numero Retrovirus /retropos6n

iiiii gag

LINES (aut6nomo), p. ej. L 1

ORF1

pol

H~>:~i!iilil 1-1 1 450 000

(pol)

iffi

SINES (no aut6nomo), p. ej., Alu Transpos6n de DNA

~

Transposasa

~

6-8

Fracci6n

8%

850 000

17%

<0.3 1 500 000

15%

2-3

300 000

3%

Cuatro tipos de elementos de transposici6n constituyen casi la mitad del genoma humano.

de elementos de iongitud total suele ser pequeno (-50) y el res to de las copias son truncas. Se pueden encomrar productos de transcripd6n. Como lo indica su presencia en el DNA repetilivo, Ia familia L1NES muestra variaci6n de secuencias entre tlliembro~ individuates. Sin embargo, los imegranres de la familia dentro de una espede son relativamente hom ogeneos en comparaci6n con Ia variaci6n observada entre dos especies . Ll es el unico mierobro de Ia familia LINES que ha estado activo en los linajes de raton o humano. Parece haber permanecido muy activo en el raton, pero ha declinado en el Unaje humano. Solo ha habido una SIN ES acriva en el linaje humano, el elemento coml'm Alu. El genoma de raton tiene una conlrapane de este elememo, B 1, y £am bien otros SINES (B2, ID. B4} que han presenrado actividad. El Alu humano y el SINES B 1 de raton tal vez provengan del RNA 7Sl. (vease Ia seccion 22.l0, La familia AJu riene muchos muy disperses) . El otro SINES de raton parece haberse origjuado de tul producto de transcripdon inversa de RNAt. Es probable que la rransposici6n de SINES se deba a que uu elemento activo L1 las reconoce como susuatos.

La familia Alu tiene muchos muy disperses Concepto principal • Una parte importante del DNA repetitivo en genomas de mamiferos consta de repeticiones de una sola familia, organizadas como transposones y derivadas de ptoductos de transcripci6n de la polimerasa III de RNA.

Las SINES mas nowrias incluyen de una so la familia. Su breve longirud y alto grado de repetici6n las hacen comparables al DNA de secuencias simples (satelite), excepto que los individuates de la fatllilia esran disperses en el genoma en Iugar de confinados a grupos seriados. De nuevo, 564


hay similitud sign.ificativa emre los miembrc una espede en comparacion con la vatiaci6n e=.. espedes. En el genom a h umano, una gran parte del!:. moderadamente repetitive se encuentra com(, cuencias de -300 bp que esuin emremezcladas DNA no repetitive. Al menos la mitad del ma:e:doble desnaturalizado es fragmentado por la em:;;::; de restricd6nAlul en un solo sitio localizado 1-: adelante en !a secu encia. Las secuencias fragrtadas penenecen todas a un a sola famil ia con ~'..:. como familia Alu, de acuerdo con los mediC":\' identifi cad6n. Hay -300 000 en e· _ noma haploide (equivalemes a un miembro r · kb de DNA). Las secuendas individuates Alu tiedispersion ampHa. Hay una familia de secuer relacionadas preseme en el raton (donde los 50 se denominan familia B I) en el eric= chino (donde se llama fa milia equiva lente Alt.. en otros mamlferos . Cada uno de los de Ia familia __ tiene relacion mas que ser identicos. La fa milia mana parece haberse originado por una duplicac en serie de 130 bp con una secuencia no relacionE de 31 bp insertados en Ja mitad derecha del diro;:-Las dos repeticioues a veces se denominan "llh .: izquierda'' y "mitad derecha" de Ia sec;uencia ___ Cada imegrante de Ia familia Alu Liene una ide:dad promedio de 87% con Ia secuencia de consezLa unid.ad de repetici6n B I de ra ton tiene l3C de longitud y correspond e a un mon6mero ci~ unidad humana. Tiene homologfa de 70 a 80 % _ la secuencia humana. La secuencia Alu tiene relacion con el RNA - .::-: un componenre deJa parricula de reconocimiem ~ senal (vease la secci6n 1o. 9, La SRP interactua .: el receptor SRP) . El RNA 7SL corresponde ala m; izquierda de una secuencia Alu con una inserc en media. Asf, las 90 bases rerminales 5' del ~ 7SL son homologas con el exrremo izquierdC' Alu, las 160 bases cent.rales del RNA 7SL no tie~ h omologfa con AJu y las 40 bases terminates 3 _

RNA de 7SL son hom61ogas con el extremo derecho de Alu. El RNA 7SL es codiftcado por genes que Ia polimerasa lTI de RNA rraoscribe de manera activa. Es posible que estos genes {u otros relacionados con ellos) den origen a las secuencias inactivas Alu. los de Ia familia Alu se asemejan a transposones porque estan nanqueados por repeIiciones direcras cortas. Muestran, no obstante, Ia curiosa caracterfstica de que las longitudes de repetici6n son diferentes para cada miembro de Ia familia. Se derivan de productos de transcripci6n de Ia polimerasa III de RNA y, como resulrado, es posible que cada miembro porte promorores aclivos internos. Se ha enconrrado una diversidad de propiedades de Ia familia Alu, y su ubicuidad ha originado muchos indidos respecto de su fund6n. No obstante, aun noes posible discernir su fun ci6n real. Al menos algunos de la familia Alu pueden transcribirse en RNA independienres. En el criceto chino algunos (aunque no rodos) de Ia familia equivalente a Alu pare<.:en tener transcription in vivo. Se encuemran unidades de transcripd6n de e!.e tlpo en Ia vecindad de otras tmidades de transcripci6n. Los de Ia familia Alu pueden incluirse denrro de unidades de transcripci6n de genesesn·uctura les, segun se observa por su presencia en el RNA nuclear largo. La presenda de copias mulliples de la secuencia Alu en una sola molecula nuclear pucde generar la estrucrura secundaria. De hecho, Ia presencia de rnlembros de Ia familia Alu en forma de repericiones lnvertidas se eocarga de Ia mayor parte de Ia estrucrura secundaria que se encuemra en el RNA nuclear de los mamffetO!> .

E111J Los seudogenes procesados se originaron como sustratos para la transposici6n Concepto principal • Un seudogen procesado proviene de una secuencia de RNAm por transcripci6n inversa.

Cuando una secuencia generada por transcripd6n mversa de un RNAm se lnsena en el genoma, se puede reconocer su relaci6n con el gena partir del cual se transcribi6 el RNAm. Tal secuencia se denomina seudogen procesado para reflejar el hecho de que se proces6 a partir del RNA y es inactivo. En la se comparan las caracLerfslicas especi£icas de un seudogen procesado con las del gen original y el RNAm. La figura muestra todas las 22,11

G

Ex6n 1

lntr6n

Ex6n 2

lntrOn

Ex6n 3

1n~~rumpido '-."-.0\.r'\.r'\.C\.r'\..f'-.~C\/r

'

RNA nuclear

AN Am

~

"VVVVVVAAAAAAM El extremo 5' oorresponde con el RNAm

seudogen procesado

El extremo 3' tiene un segmento A-T

/~C\.6'\li~J~W -+I 1-

Tira continua de exones

RepeticiOn corta directa del DNA diana

RepetiCl6n corta dfrecta del DNA diana

Pueden surgir seudogenes por transcripcion inversa a partir del RNA para formar DNA duplex, que se integran al genoma.

caractcristicas diagn6sticas imporrantcs, de las que solo algunas se encuenrran en cualquier ejemplo individual. Cualquier producto de rranscripd6n de Ia polimerasa II de RNA pudiese, en principio, dar origcn a tal seudogen y hay muchos ejemplos que incluyen los seudogenes procesados de globina, que fueron los primeros en descubrirse (vease Ia secci6n 3.11, Los seudogenes son callejones sin salida de Ia evoluci6n). El seudogen puede iniciarse en el pumo equivaleme a! exrremo 5' dcJ RNA, circunsrancia que c;erfa de esperar solo si el DNA se hubiese originado del RNA. Vatios seudogenes constan de secuencias ex6nicas unidas de manera precisa; no se conocen mccanismos para reconocer imrones en el DNA, por lo que esta drcunstancia constituye un argumenlO a favor de una etapa mediada por el RNA. EJ seudog~n puede Lermlnar en un segmenro corto de pares de bases A-Tal parecer derivadas de Ia cola poli{A) del RNA. A cada lado del seudogen hay una reperid6n cona direcra que parece haberse generado por un episodic similar a Ia transposici6n. Los seudogenes procesados residen en localizacioues no relacionadas con sus sitios de origen supuesros. Los seudogenes procesados no ponan ninguna informacion que pudlera servir para rcspaldar un suceso de transposici6n {a llevar a cabo Ia transcripci6n inversa precedente del RNA). Esro hace pensa r que el RNA era sustrato para orro sistema y codificado por un retropos6n. De hecho, parece que los elementos LlNES aclivos proveen gran pane de la actividad de transcriptasa inversa y que se encargan no solo de su propia transposici6n, sino tam bien de acruar sobre las SINES y generar seudogenes procesados.

Los seudogenes procesados se originaron como sustratos para la transposici6n

565

flD

Las LINES utili zan una endo nudeasa para generar un extrema con actividad cebadora

•

•

•

•

k

La hendidura proporciona un extreme de cebaci6n

Concepto principal • Las LINES no tienen LTR y para cebar la transcripci6n inversa requieren que el retropos6n codifique una endonucleasa que genere una hendidura .

Los elementos de LINES y algunosouos no terminan en las LTR caracteristicas de los elementos rerrovfricos. Esto Jleva a la interrogante: c.. Como se ceba la transcripd6n inversa? No comprende Ia reacci6n comun donde el cebador de RNAm se aparea con el LTR (vease Ia Figura 22.6). Los marcos de lecrura abiena en estos elementos carecen de muchas de las funciones retroviricas, como dorninios de proteasa o integrasa, pero por lo general tienen secuencias similares a la transaiptasa inversa y codifican una actividad de endonucleasa. En la LINES U humana, ORF l es una proteina unida a DNA y ORF2 tiene actividades ramo de transcriptasa inversa como de endonudeasa; ambos productos son indispensables pa ra Ia transposici6n . La muesua como estas actividades sosrienen la uansposici6n. Se hace una hendldura en el sitio ctiana del DNA por actividad de una endo· nucleasa codificada por el retropos6n. El producto RNA del elemenro se vincula con la protefna unida en Ia hendidura. La hendidura provee un exuemo 3'- 0H que ceba la sfmesis de DNAc sobre el molde de RNA. Se requiere un segundo episodio de escisi6n para abrir la otra cadena de DNA, y el hibrido RNA/DNA se vincula con el otro exuemo de Ia hendldura en esta etapa, o despues de que se ha convertido en una cadena doble de DNA. Algunos in trones m6viles utilizan un mecanisme semejante (vease la Figura 27.12). Cuando se orig).nan elementos a partir de la rranscripci6n de la polimerasa ll de RNA. las secuencias gen6micas son necesariameme inactivas: carecen del promotor que se encontraba en un sitio ascendente respecto del punta de origen inicial de transcripci6n. Estos suelen poseer las caracteristicas de un-producto de transcripci6n maduro, por lo que se denominan seudogenes procesados. Uno de los motivos por lo que los elememos de LINES son tan eficaces radica en su metoda de propagad6n. Cuando se traduce un RNAm de LINES, los producros protei.uicos muestran una preferencia cis para unirse aJ RNAm a partir del cual se rradujeron. La muestra que el complejo de 566

CAPiTULO 22 Retrovirus y retroposones

-

El DNA '"" ""Y' al RNA

RNA

~ t

Se crea un intr6n por recombinaci6n

La retrotransposici6n de elementos diferentf.i a LTR ocurre por formad6n de una hendidura en la diana ccel fin de proveer un cebador para la sintesis de DNAc sobre _molde de RNA. Las puntas de flecha indican extremes 3'.

CITOSOL

~

lnserci6n de una copia de un DNA en un sitio

..,.

...

nuevo ,...-

Se transcribe una LINES hacia un RNA que £~ traduce en proteinas que se ensamblan en un complejo c· el RNA. El complejo se transloca al nucleo, donde inserta L · ::: copia de DNA en el genoma.

,..

y

~ '" \.

Transpos6n no funcional r

RNA

CITOSOL

(

1 Un transpos6n se transcribe haci;;~ Ltn RNA que ;e traduce en proteinas que se desplazan de manera indepen:iente hacia el nucleo, donde actuan sobre cualquier par de ·epeticiones invertidas con Ia misma secuencia que en el trans· ~os6n original.

:ibonudeoprOLefnas se traslada entOnCCS a! n ucleo, Jonde las protefnas insenan una copia del DNA en -:-1 genoma. La transcripci6n inversa a menudo no wanza por completo hasra el finaL de modo que Ia .:opia es inactiva. Sin embargo, hay posibilidades de mercion de una copia activa porque las protcinas acrlian sabre un producto de transcripci6n del ele:nento activo originaL En contraste, las protefnas producidas por los ;ransposoncs de DNA deben importarse al nucleo despues de su sintesis en el dtoplasma, pero no -:uentan con metados para distinguir emre transposoncs de longitud completa y rransposones inac!ivos con dclcci6n. La muesu-a que en lugar de distinguir eStos dos tipos de rransposones, las protefnas rcconoceran de manera indiscriminada cualquie r elemcnto por virtud de las repeticiones que marcan sus extremos. Esro disminuye mucho su posibilidad de actuar sobre un elemento de longitud complcta en comraposicion a uno que ha tenido dclcci6n. La consecuencia ec; qu e los elementos inaaivos se acumulan y, en un momento dado, Ia familia desaparecc porque una transposasa tien e pocas posibilidades de hallar una diana que sea un transpos6n por completo runcional. (.Estan ocurriendo en la actualidad sucesos de transposici6n en estos genomas, 0 solo se observan vestigios en sistemas amiguos? Esto varia con Ia especie. Hay solo unos cuamos rransposones activos en Ia actUalidad en el genoma humano pero, en contraste, se conocen varios rransposones activos en el genoma de rar6n. Esro explica el hecho de que las mutadones esponran eas causadas por inserciones de LINES se presenran con una tasa de

- 3% en el raton, pero de solo 0. 1% en el hombre. Parece haber de - 10 a 50 elementos aclivos de LINES en el genoma humano. Se pueden scna la r algunas enfermedades humanas como resultado de la rransposici6n de Ll a los genes y otras derivadas de episodios no equivalentes de entrecruzamiento, donde partidpan copias reperidas de U. Un sistema modelo en el que ocurre Ia transposici6n de LINES en celulas de cultivo hlsLico hace pcnsar que un suceso de transposici6n puede imroducir varios tipos de dano colateral, as! como Ia inserci6n en un nuevo sitio; el dano comprende recstructuraciones y deleciones cromos6micas. Dichos sucesos podrfan con.siderarse como agentes del cambia genetico. Ni los transposones de DNA ni los retroposones cuasi retrovfricos parecen haber tenido actividad en el genoma humano durante 40 a 50 millones de afios, pero se encuemran ejemplos activos de ambos en el raton. N6tese que para que las transposiciones persistan deben presentarse en Ia lfnea germ inativa. Al parecer. episodios similares tienen Iugar en celu las somaticas, pero estas no sobreviven mas de una generacion.

Resumen La transcripci6n in versa es el mecanismo unificador de la reproducci6n de retrovirus y perpetuaci6n de retroposones. El ciclo de cada tipo de elcmeoto es en principia similar, aunque los retrovirus sueJen considerarse desdc Ia perspcctiva de la forma v(rica libre (RNA m), en tanto Jos retroposones se consideran desde el punta de viSta de la forma gen6m ica (DNA doble). Los rctroviws tiencn gcnomas de RNA decadena (mica que sc rlican mediante un intermediario de DNA de doblc cadcna. Un retrovirus individual comiene dos capias de su genoma. El gen oma contiene los genes gag, poly env, que sc traducen en po liprotefnas, cada una de elias fragrnentada eo protefnas funcio nales mas pcqucnas. Los componentes Gag y Env sc cncargan del empaquetamiento del RNA y Ia generaci6n del virion; los componemes Pol parricipan en Ia sfmesis de acidos nucleicos . La transcriptasa inversa es el p rincipal componente de Pol y se encarga de Ia sinresis de una copia de DNA (cadena negativa) del RNA virico (cadena positiva). El producto de DNA es mas largo que el molde de RNA; mediante el cambia de moldes, la transcriptasa inversa copia desde Ia secuencia de 3' de RNA basta el extremo 5' del DNA y desde Ia secuencia 5' del RNA basta el extrema 3' del DNA, lo que genera las L TR ca racterfsticas (repeticiones tenninales largas) del DNA. Ocunc un cambia simi22. 1J Resumen

567

lar de moldes cuando se sintetiza la cadena posidva del DNA ur.ilizando Ia cadena negativa como molde. El .DNA doble lineal se insena en el genoma de un hospedador ~racias a Ia participaci6n de Ia enzima integrasa. La rranscripci6n del DNAimegrado desde un promotor en Ia LTR izquierda genera 1nas copias de Ia secuencia de RNA. Los cambios de molde durante Ia sinresis de acidos nucleicos permiten que ocurra la recombinaci6n por selecci6n de copias. Durante un ddo infeccioso, un retrovirus puede intercambiar pane de su secuencia habit ual por una secuencia celular. El virus resullante suele tener de[ectos de replicacion, pero puede perpetuarse durante Ia evoluci6n de una lnfecci6n conjuma con un virus auxiliar. Muchos de los virus defectuosos han adquirido una versipn RNA (v-ane) de un gen celu1ar (c-one). Lasecuencia onuede set de cualquiera de varies genes cuya expresion en la forma v-ane hace que la celula se trans-forme hacia un fenotipo tumorigenico. El episodic de in tegraci6n genera repeticiones diana (como transposones que se desplazan a traves del DNA). Por lo tanto, un provirus insenado posee terminadones directas reperidas de LTR, flanqueadas por repeliciones conas de DNA diana. Los genemas de mamiferos y aves tienen provirus end6genos (inactives) con dkhas estructuras. Se han cnconrrado ot.ros elementos con esa organ\zaci6n en una diversidad de genomas, de man era mas notoria en S. cerevisiae yD. melanogaster. Los elementos Ty de las levaduras y los elememos de copia de Las moscas tienen secuencias de codificad6n con homologia con la transcripLasa inversa y se desplazan a traves de una forma de RNA. Pueden generar partfculas que simu lan virus pero no tienen capacidad infectante. Las secuencias LINES de los genomas de mamfferos se retiran aun mas de Los retrovirus, pero censervan diferentes similitudes que sugieren un origen comun. ULiljzan un tipo difereme de actividad cebadora para iniciar la acd6n de Ia transcriptasa inversa, donde una actividad de endonuclease vinculada con la Lranscriptasa joversCI forma una hendiduta que provee un extreme 3'-0H para la sfmesis de cebaci6n sobre un mo lde de RNA . La frecuencia de transposidones de LINES aumenta porque sus productos protefnicos tienen actividad en cis; se vi.oculan con el RNAm del que fueron traducidas para [ormar un complejo ribonucleoprotefnico que se transporta al nucleo. Los de orra dase de re1roposones cuenran con mdos los p un tos calientes de la Lransposici6n a naves de RNA, peru no tienen secuendas de codificaci6n (o al menos n.inguna quesimule fundones retrovfricas). Pueden haberse originado como pasajeros en un episodic de lransposici6n se568

CAPiTULO 21 Retrovirus y retroposones

mejame ala retrovirica, dondc un RNA fue diana de una transcriptasa inversa. Los seudogenes p rocesados surgen por dichos episodios. Una familia particularmente notoria que parece haberse originado por un suceso de procesamiento es Ia familia AJu. AlgunosRNAsn, induido el RNAsn 7SL (un componente de SRP) tienen relaci6n con esta fami lia.

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IDJ

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Elt

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Ell

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Referencias

569

Diversidad inmunitaria ESQUEMA DEL CAPITULO

J

mJ Introduccion fiB

La seleccion clonal amplifica linfocitos que responden a antlgenos individuates • Cada linfocito B expresa una sola inmunoglob ulina y cada li nfocito T, un solo receptor de celulas T. • Hay una gran variedad de inmunoglobulinas de celulas B y receptores de celulas T. • La union de un antigeno con una inmunoglobulina de celulas B o un receptor de celulas T desencadena la multiplicacion clonal.

fiB

ml

Las cadenas ligeras se ensamblan par recombinaci6n simple

fiD

Las cadenas pesadas se ensamblan mediante dos recombinaciones • Las unidades de recombinacion de cadenas pesadas son un gen V, un segmento 0 y un seg mento del gen J-C. • La primera recombinacion une a 0 con J-C.

570

La recombinacion inm unitaria utiliza dos tipos de secuencias de consenso • La secuencia de consenso utilizada para la recom binacion es un heptamero separado de un nonamero par 12 o 23 pares de bases. • La recombinacion ocurre entre dos secuencias de consenso con espaciamientos dife rentes.

m;J

La recombinacion genera deleciones o inversiones • La recombi nacion se debe a rot uras de la dob le cadena en los heptameros de dos secuencias de conse nso. • Los extremos seiial del fragmento ent re rot uras suelen unirse para generar un fragmento circular esci ndido. • Los extremos de codificacion se enlazan de manera covalente para unir V a J-C (cadena L) o 0 a J-C y V a 0-J-C (cadena H). • Si se invierten los genes recombi nantes en lugar de unirse en orientacion directa, hay una inversion y no una delecion de un circulo escindido.

liD La exclusion alelica es desen cadenada por

• Una cadena ligera 'A se ensambla por recombinacion si mple entre un gen V y un segmento del gen J-C. • Un segmento del gen V tiene un exon lider, un intron y una regi on de codificacion variable. • El segmento del gen J-C tiene un exon corto de codificacion J, un intron y una region de codificacion C. • Una cadena ligera K se ensambla por recombinacion si mple entre un segmento de gen V y uno de los cinco segmentos J que preceden al gen C.

Bill

La recombi nacion genera una gran diversidad • Un locus de cadena ligera produce mas de 1 000 cadenas par la combinacion de 300 genes V co n cuatro a cinco genes C. • Un locus H puede produci r mas de 4 000 cadenas por combi nacio n de 300 genes V, 20 segmentos 0 y cuatro segmentos J.

Los genes de las in munoglobu linas se ensamblan en los linfocitos a partir de sus constituyentes • Una inmunoglobulina es un tetramero de dos cadenas ligeras y dos pesadas. • Las cadenas ligeras pertenecen a las familias /, y K; las cadenas pesadas forman una sola familia. • Cada cadena tiene una region terminal N variable (V) y una region terminal C constante (C). • El segmento V reconoce al antigeno y el C provee la respuesta efectora. • Los seg mentos V y C so n codificados separadamente por segmentos de los genes Vy C. • Para unir un segmento del gen V con uno del gen C, por recombinacion somatica se genera un codigo genico de una cadena integra de in munoglobuli na.

till

• La segunda recombinacion une Vcon 0-J -C. • El segmento C consta de varios exones.

rearreglo productive • La recombinacion pa ra generar un gen integra de inmunoglobulina es productiva si lleva a la expresion de una proteina activa. • Un rearreglo productivo impi de que ocurra cualquier rearreglo adicional, a diferencia del rearreglo no productive. • La exclusion alelica se ap lica separadamente a las cadenas ligeras (solo puede rearreglarse de manera productiva una cadena K o 'A) y a las pesadas (u na cadena pesada se rearregla de manera productiva).

1ii1!J

Las prote1nas RAG catalizan la rotura y la nueva union • Las proteinas RAG so n necesarias y suficientes para la reaccion de corte y empalme.

• La RAG1 reconoce las secuencias de consenso nonamericas para la recombinacion. La RAG2 se une a RAG1 y se corta y empalma en el heptamero. • La reaccion se asemeja a la de resolucion ti po topoisomerasa que ocurre en la transposicion. • Una de las histonas avanza a traves de un intermediario en horquilla en el extrema de codificacion; la abertura de la horquilla se encarga de la insercion de bases adicionales (nucleotidos T) en el gen recombinado. • La transferasa de dexosinucleosidos inserta nucleotidos N adicionales en el extrema de codificacion. • La secuencia del codon del sitio de la reaccion de union V-(D)J es muy variable y codifica el aminoacido 96 en el sitio de union del antigeno. • Las roturas de la doble cadena en las uniones de codificacion son reparadas por el mismo sistema involucrado en la union de extremos no ho mologos del DNA dafiado. • Un reforzador del gen C activa al promotor del gen V despues de que la recombinacion ha generado el gen integra de inmunoglobulina.

fiBII

La expresi6n de la cadena pesada temprana puede cambiar por procesamiento del RNA

• La actividad de glucosilasa de uracilo-DNA influye en el patron de mutaciones somaticas. • Una hipermutacion puede empezar por la accion secuencial de esas enzimas.

fjJiiJ

• En el pollo, un gen de in munoglo bulina se genera co piando una secuencia de uno de los 25 seudogenes del gen If de un locus activo unico.

gm

fill)

FIE Los recepto res de las celulas T tienen relaci6n con las inmu noglobulinas

fjiB

gJiiJ

• Las inmunoglobulinas se dividen en cinco clases, segun el tipo de region constante de la cadena pesada. • El cambia de clase para modificar la region C, se debe a una recombinacion entre las regiones S que lleva a la delecion de la region entre la antigua c, y la nueva. • Pueden presentarse multiples recombinaciones de cambios sucesivos.

fjBiJ

El receptor de la celula T actua con el MHC • El TCR reconoce a un peptido corto unido en un surco de una proteina del MHC en la superficie de la celula presentadora.

Ellocus de histocompatibi lidad mayor codifica muchos genes del sistema inmu nitario • El locus del MHC codifica las proteinas de clases I y II, asi como otras del sistema inmu nita rio. • Las proteinas de clase I son los antigenos de trasplante encargados de disti ngui r entre tejidos "propios" y "ajenos". • Una proteina de clase I del MHC actua como heterodimero con la ~' microglobu lina. • Las proteinas de clase II participan en las intervenciones entre celulas T. • Una proteina de clase II del MHC es un heterodimero de cadenas o. y ~-

El cambia se debe a una nueva reacci6n de recombinaci6n

~

La mutaci6n somatica genera otras diferencias en el raton y el ser humano • Los genes activos de inmunoglobulina tienen regiones V con secuencias que cambian respecto de la linea germinativa por mutacion somatica. • Las mutaciones ocurren como sustituciones de bases individuates. • Los sitios de mutacion se concentran en los sitios de union de antigeno. • El proceso depende del reforzador que activa la transcripcion en ellocus Ig.

B)!~

• Las celulas T usan un mecanismo similar de union V(D)J-C a las celulas B para producir uno de los dos tipos de receptor de celulas T. • En > 95% de los li nfocitos T se encuentra TCR a~; la TCR y'& se encuentra en < 5 por ciento. ·

El cambia de clase es producto de la recombinaci6n del DNA

• Habra un cambia por una rotura de la doble cadena seguida de la reacci6n de union no homologa de extremos. • La caracteristica importante de una region de cambia son las repeticiones invertidas. • El cambia requiere de activacion de los promotores que estan en direccion ascendente respecto de los sitios de cambia.

La celula B de memoria permite una respuesta secundaria rapida • La respuesta primaria a un antigeno es montada por las celulas B, que no sobreviven despues del periodo de respuesta. • Se producen celulas B de memoria con especificidad para el mismo antlgeno, pero esta n inactivas. • Una reexposici6n al antigeno origina la respuesta secundaria, en la cuallas celulas de memoria se activan rapidamente.

• Todos los linfocitos empiezan por sintetizar la forma de IgM unida a la membrana. • Un cambia en el empalme del RNA hace que sea remplazado por la forma secretada cuando la celula B se diferencia.

gJ6

Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a pa rtir de seudogenes

La inmunidad innata utiliza las v1as de sefial conservadas • La inmunidad innata se desencadena por receptores que reconocen segmentos (PAMP) altamente conservados en bacterias u otros agentes infectantes • Suelen usarse receptores similares a tragamonedas para activa r la via de respuesta • Las vias se conservan mucho de invertebrados a vertebrados y se encuentra una via analoga en las plantas.

~

Resumen

la desaminasa de citidina y la glucosilasa de uracilo inducen la mutaci6n somatica • Para la mutacion somatica y para el cambia de clase se requiere de una desaminasa de citidina.

CAPiTU LO 23 Diversidad inm unitaria

571

Ell

Introducci6n

Es un axioma de la genetica que todas las celulas somaticas del organismo heredan la constituci6n genica creada en el cigoto por la combinaci6n de espermatozoide y oocito. Para explicar los diferentes fenotipos de celulas somaticas especificas se observa un control diferencial de la expresi6n genica, mas que cambios en el contenido del DNA. Sin embargo, hay situaciones excepcionales en que la reorganizaci6n de ciertas secuencias de DNA regula la expresi6n genica o crea nuevos genes. El sistema inmunitario es un caso sorprendente y amplio en el que el contenido del genoma cambia cuando la recombinaci6n origina genes activos en los linfocitos. Otros casos se deben a la sustituci6n de una secuencia por otra para modificar el tipo de apareamiento de las levaduras o generar nuevos antfgenos de superficie por los tripanosomas. La respuesta inmunitaria de los vertebrados proporciona un sistema de protecci6n que distingue las protefnas extranas de las propias del organismo y reconoce la materia extrana (o parte) como constituyente de un antigeno. Por lo general, el antfgeno es una protefna (o una molecula anadida a una

•

0

•

La secreci6n de anticuerpos por Ia celula B requiere de celulas T auxiliares

~

<<<< Anticuerpos

~

Antfgeno Complejo antfgeno-anticuerpo

El macr6fago engulle al complejo

Complemento

La inmunidad humoral es conferida por la union de anticuerpos libres y antigenos para formar complejos ant\geno-anticuerpo eliminados de la corriente sanguinea por los macr6fagos o que son atacados directamente por las prote\nas del complemento.

5 72

CAPITULO 23 Diversidad inmunitaria

protefna) que ha ingresado ala corriente sangufnea del animal, por ejemplo, la cubierta protefnica de un virus infeccioso. La exposici6n a un antfgeno inicia la producci6n de una respuesta inmunitaria, que espedficamente reconoce al antfgeno y lo destruye. Las reacciones inmunitarias son tarea de los leucocitos, los linfocitos B y T y los macr6fagos. Los linfocitos reciben su nombre de los tejidos que los producen. En los mamfferos, las celulas B maduran en la medula 6sea, en tanto las celulas T maduran en el timo. Cada clase de linfocito utiliza el reaneglo de DNA como mecanisme para producir las protefnas que le permiten participar en la respuesta inmunitaria. El sistema inmunitario tiene muchas formas de destruir a un invasor antigenico, pero conviene considerarlas en dos clases generales. El tipo de respuesta que monte el sistema inmunitario cuando encuentra una estructura extrana depende, en parte, de la naturaleza del antfgeno. La respuesta se define en funci6n de que sea ejecutada principalmente por celulas B o por celulas T. La respuesta humoral depende de las celulas B y es mediada por la secreci6n de anticuerpos, que son protefnas inmunoglobulinicas. La producci6n de un anticuerpo espedfico para una molecula extrana es el suceso principal del reconocimiento de un antfgeno, que implica que el anticuerpo se una a una pequeiia region de la estructura en el antfgeno . En la F GU ,. 2 1 se representa la funci6n de los anticuerpos. La materia extrana que circula en la sangre, por ejemplo, una toxina o una bacteria pat6gena, tiene una superficie que presenta antfgenos, los cuales son reconocidos por los anticuerpos que forman complejos antfgeno-anticuerpo. Dichos complejos atraen despues la atenci6n de otros componentes del sistema inmunitario. La respuesta humoral depende de esos otros componentes en dos formas. Primero, las celulas B necesitan senales de las celulas T para secretar anticuerpos. Dichas celulas T se llaman celulas T auxiliares porque facilitan la tarea de las celulas B. Segundo, la formaci6n del complejo antfgenoanticuerpo es desencadenada por el antfgeno que se va a destruir. La principal vfa es la de la acci6n del complemento, componente cuyo nombre refleja su capacidad de constituir un "complemento" de la acci6n del anticuerpo mismo. El complemento es un conjunto de casi 20 protefnas que actua en una serie de actividades proteolfticas. Si el antfgeno blanco es parte de una celula, por ejemplo, una bacteria infectante, la acci6n del complemento culmina con la lisis de la celula diana. La acci6n del complemento tambien constituye un medio para atraer a los macr6fagos, que ingieren las celulas blanco 0 sus productos; una alternativa es que el complejo activo

de un anticuerpo sea captado directamente por los macrofagos (celulas carrofieras) y destruido. La respuesta mediada por celulas depende de una clase de linfocitos T llamados celulas T citotoxicas (o celulas T asesinas ). En la I se indica la funcion basica de Ia celula T en el reconocimiento de un antfgeno blanco. Por lo general, ante un parasito intracelular, como un virus que infecta las celulas del propio cuerpo, se produce una respuesta mediada por celulas. Como resultado de Ia infeccion vfrica se exponen fragmentos de antfgenos extrafios (vfricos ) en la superficie de Ia celula. Dichos fragmentos son reconocidos por el receptor de Ia celula T (TCR ), que en Ia celula T es el equivalente del anticuerpo producido por una celula B. Una caracterfstica clave de esta reaccion de reconocimiento es que el antfgeno debe ser presentado por una protefna celular integrante del MHC (complejo mayor de histocompatibilidad). Dicha protefna tiene un surco en Ia superficie que se une a un fragmento peptfdico derivado del antfgeno extrafio. La combinacion del fragmento peptfdico y Ia protefna del MHC es reconocida por el receptor de la celula T. Todo individuo tiene un conjunto caracterfstico de proteinas del MHC importantes en las reacciones ante un injerto; el injerto de tejido de un individuo a otro es rechazado por Ia diferencia de las protefnas del MHC del donador y el receptor, problema de gran importancia medica. La necesidad de que los linfocitos T reconozcan tanto al antigeno extrafio como a Ia protefna del MHC asegura que la respuesta mediada por celulas se produzca solo en las celulas del hospedador que han sido infectadas por un antfgeno extrafio. (La division de las protefnas del MHC en los tipos generales de clases I y II se describe mas adelante, en Ia seccion 23.20, Ellocus de histocompatibilidad mayor codifica los multiples genes del sistema inmunitario.) El proposito de cada tipo de respuesta inmu nitaria es atacar un blanco extrafio, y el reconocimiento de dicho blanco es prerrogativa de las inmunoglobulinas de las celulas B y los receptores de las celulas T. Un aspecto crucial de su fu ncion yace en Ia capacidad de distinguir lo "propio" de lo "ajeno". Nunca deben ser atacadas las proteinas y celulas del cuerpo mismo, pero los blancos extrafios deben ser destruidos por completo. La propiedad de no atacarse "a sf mismo" se llama tolerancia, cuya perdida produce una enfermedad autoinmunitaria, en la que el sistema inmunitario ataca al propio cuerpo, a menudo con consecuencias desastrosas. (.Que imp ide que la reserva de linfocitos res panda ante las protefnas "propias"? Probablemente Ia tolerancia aparece muy tempran o en el desarrollo

de los linfocitos, cuando se destruyen las celulas B y T que reconocen a los antfgenos "propios", fenomeno conocido como deleci6n donal. Ademas de esa seleccion negativa, hay tambien una seleccion positiva de celulas T que portan ciertos conj u ntos de receptores. Un corolario de Ia tolerancia es que puede ser diffcil obtener anticuerpos con protefnas que tengan una relacion estrecha con las del propio organismo. En Ia practica, por lo tanto, puede ser dificil usar (por ejemplo) ratones o conejos para obtener anticuerpos contra protefnas humanas que se han conservado bien durante Ia evolucion de los mamfferos. La tolerancia del raton o el conejo ante su propia protefna podrfa extenderse a las protefnas humanas en tales casos. Cada uno de los tres grupos de protefnas reque ridos porIa respuesta inmunitaria, inmunoglobulinas, receptores de celulas T y protefnas del MHC, son diferentes. El analisis de unnumero importante de individuos permitio encontrar much as variantes de cada protefna, cada una de las cuales es codificada por u na gran familia de genes; en el caso de los anticuerpos y los receptores de celulas T, Ia diversidad

,. .-0

...

La celula blanco infectada fragmenta el antigeno

/ .··~

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Celula T ases1na

f!l

El MHC "presenta" el antigeno al receptor de Ia celula T --.....

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Celula T asesina

~

El linfocito T reconoce al fragmento antigenico + MHC

En la inmunidad mediada por celulas, las celulas T asesinas utilizan el receptor de celulas T para reconocer un fragmento del ant1geno extraiio que la prote1na del MHC presenta en la superficie de la celula blanco. 23 .1 Introducci6n

573

de las poblaciones aumenta por rearreglos del DNA en los linfocitos importantes. Las inmunoglobulinas y los receptores de las celulas T son contrapartes directas, cada una producida por su propio tipo de linfocito. La estructura de las proteinas esta relacionada, y sus genes se relacionan en cuanto a organizaci6n; el origen de dichas variaciones es similar. Las proteinas del MHC comparten tambien algunas caracteristicas comunes con los anticuerpos, igual que otras proteinas especificas de linfocitos. Asi pues, al abordar Ja organizaci6n genica del sistema inmunitario se enfrenta una serie de familias de genes relacionados, de hecho una superfamilia que podria haber evolucionado a partir de un ancestro comun que representa una respuesta inmunitaria primitiva.

0 0 reconoce al antfgeno

I

Expansion .... clonal

La reserva de linfocitos inmaduros contiene celulas B y T que forman anticuerpos y receptores con diversas especificidades. Su reaccion con un antigeno lleva a la expansion clonal dellinfocito con el anticuerpo (celula B) o el receptor (celula T) que puede reconocer al antigeno.

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B1J La selecci6n clonal amplifica linfocitos que responden a antigenos individuales Conceptos principales • Cada linfocito B expresa una sola inmunoglobulina y cada linfocito T, un solo receptor de celulas T. • Hay una gran variedad de inmunoglobulinas de celulas B y receptores de celulas T. • La union de un antigeno con una inmunoglobulina de celulas B o un receptor de celulas T desencadena la multiplicacion clonal.

El nombre de la respuesta inmunitaria describe una de sus caracteristicas medulares. Despues de que un organismo se ha expuesto a un antigeno, se vuelve inmune a los efectos de una nueva infecci6n. Antes de exponerse a un antigeno en particular, el organismo carece de la capacidad para enfrentar cualesquiera de sus efectos t6xicos, la cual adquirira durante la respuesta inmunitaria. Una vez eliminada Ia infecci6n, el organismo conserva Ia capacidad de responder rapidamente en caso de reinfecci6n. Esas caracteristicas se ajustan a la teoria de Ia selecci6n clonal ilustrada en la ' . La reserva de linfocitos contiene celulas B y T que portan una gran variedad de inmunoglobulinas o receptores de celulas T. Cualquier linfocito B individual produce una inmunoglobulina susceptible de reconocer solo un antigeno, igual que un linfocito T individual produce SOlO U/1 receptor particular de cefufas T. En la reserva de linfocitos inmaduros, las celulas B y T no estimuladas son morfol6gicamente indistinguibles, pero ante Ia exposici6n a un antigena, una celula B cuyo anticuerpo puede unirse a! antigeno, o una celula T cuyo receptor puede reconocerlo, se estimula para dividirse, tal vez por alguna retroalimentaci6n desde Ia superficie, donde ocurre la reacci6n anticuerpo/receptor-antigeno . Las celulas estimuladas se desarrollan entonces hacia linfocitos B o T maduros, lo cual incluye cambios morfol6gicos que involucran, por ejemplo, un aumento de tamafio (especialmente pronunciado en las celulas B). La expansion inicial de una poblaci6n especffica de celulas BoT ante Ia primera exposici6n a un antigeno se llama respuesta inmunitaria primaria, Ia cual da Iugar a Ia producci6n de un gran numero de linfocitos B o T con especificidad para el antfgeno blanco. Cada poblaci6n representa un don de la celula de respuesta original. Las celulas B secretan anticuerpos en grandes cantidades, e incluso podrfan dominar a Ia poblaci6n de anticuerpos.

de las poblaciones aumenta por rearreglos del DNA en los linfocitos importantes. Las inmunoglobulinas y los receptores de las celulas T son contrapartes directas, cada una producida por su propio tipo de linfocito. La estructura de las proteinas esta relacionada, y sus genes se relacionan en cuanto a organizaci6n; el origen de dichas variaciones es similar. Las proteinas del MHC comparten tambien algunas caracterfsticas comunes con los anticuerpos, igual que otras proteinas especfficas de linfocitos. Asi pues, al abordar Ia organizaci6n genica del sistema inmunitario se enfrenta una serie de familias de genes relacionados, de hecho una superfamilia que podria haber evolucionado a partir de un ancestro comun que representa una respuesta inmunitaria primitiva.

reconoce al antfgeno

I

Expansion ~ clonal

La reserva de linfocitos inmaduros contiene celulas B y T que forman anticuerpos y receptores con diversas especificidades. Su reaccion con un antigeno lleva a la expansion clonal dellinfocito con el anticuerpo (celula B) o el receptor (celula T) que puede reconocer al antigeno. 574

CAPiTULO 23 Diversidad inmunitaria

E1J

La selecci6n clonal amplifica linfocitos que responden a antigenos individuales

Conceptos pri nci pales • Cada linfocito B expresa una sola in.munoglobulina y cada linfocito T, un solo receptor de celulas T. • Hay una gran variedad de inmunoglobulinas de celutas B y receptores de celulas T. • La union de un antigeno con una inmunoglobulina de celulas B o un receptor de celulas T desencadena la multiplicacion clonal.

El nombre de Ia respuesta inmunitaria describe una de sus caracteristicas medulares. Despues de que un organismo se ha expuesto a un antigeno, se vuelve inmune a los efectos de una nueva infecci6n. Antes de exponerse a un antigeno en particular, el organismo carece de la capacidad para enfremar cualesquiera de sus efectos t6xicos, Ia cual adquirira durante Ia respuesta inmunitaria. Una vez eliminada la infecci6n, el organismo conserva Ia capacidad de responder rapidamente en caso de reinfecci6n. Esas caracterfsticas se ajustan a Ia teoria de la selecci6n clonal ilustrada en la I - . La reserva de linfocitos contiene celulas B y T que portan una gran variedad de inmunoglobulinas o receptores de celulas T. Cualquier linfocito B individual produce una imnunoglobulina susceptible de reconocer solo un antigeno, igual que un linfocito T individual produce solo un receptor particular de celulas T. En la reserva de linfocitos inmaduros, las celulas B y T no estimuladas son morfol6gicamente indistinguibles, pero ante Ia exposici6n a un antfgeno, una celula B cuyo anticuerpo puede unirse al antfgeno, o una celula T cuyo receptor puede reconocerlo, se estimula para dividirse, tal vez por alguna retroalimemaci6n desde la superficie, donde ocurre Ia reacci6n anticuerpo/receptor-antigeno. Las celulas estimuladas se desarrollan entonces hacia linfocitos B o T maduros, lo cual incluye cambios morfol6gicos que involucran, por ejemplo, un aumento de tamaiio (especiahnente pronunciado en las celulas B). La expansion inicial de una poblaci6n espedfica de celulas B o T ante la primera exposici6n a un antigeno se llama respuesta irununitaria primaria, Ia cual da Iugar a la producci6n de un gran numero de linfocitos B o T con especificidad para el amfgeno blanco. Cada poblaci6n representa un don de la celula de respuesta original. Las celulas B secretan anticuerpos en grandes cantidades, e incluso podrian dominar a la poblaci6n de anticuerpos.

Despues de que se ha montado una respuesta inmunitaria primaria exitosa, el organismo conserva celulas B y T que portan el anticuerpo o receptor correspondiente. Estas celulas de memoria representan un estado intermedi o entre la celula madura y la inmadura; no han adquirido todas las caracterfsticas de las celulas maduras, pero tienen una vida prolongada y ra.pidamente pueden llegar a serlo. Su presencia permite montar una respuesta inmunitaria secundaria rapidamente si el animal es expuesto otra vez al mismo antfgeno. La reserva de linfocitos inmaduros del mamffero contiene -10 12 celulas, algunos con especificidades unicas (porque nunca han encontrado un antfgeno corresponcliente), en tanto que otros estan representados hasta par 10 6 celulas (porque Ia seleccion clonal ha expandido la reserva celular para responder al antfgeno). LQue caracterfsticas se reconocen en un antfgeno? Los antigenos suelen ser macromoleculares, y si bien las moleculas pequefias pueden tener determinantes antigenicos y ser reconocidas par anticuerpos, par lo general no son eficaces para provocar una respuesta inmunitaria (par su reducido tamafio); no obstante, la provocan cuando se conjugan con una molecula portadora mas grande (par lo general una protefna). La molecula pequefia utilizada para provocar una respuesta mediante esos mecanismos se llama hapteno . En realidad, solo una pequefia parte de la superficie de un antfgeno macromolecular es reconocida par alguno de los anticuerpos. El sitio de union consta de solo cinco o seis aminoacidos, pero, obviamente, una protefna en particular puede tener mas de uno de esos sitios de union, en cuyo caso, produce anticuerpos con especificidad para diferentes regiones. La region que provoca una respuesta se denomina determinante antigenico o epitopo. Cuando un antigeno contiene varios epitopos, algunos suelen ser mas eficaces que otros para provocar la respuesta inmunitaria; de hecho, pueden ser tan eficaces como para que dominen par completo la respuesta. LComo encuentran antfgenos blanco los linfocitos y donde ocurre su maduracion? Los linfocitos son celulas peripateticas que se desarrollan a partir de celulas madre inmaduras localizadas en Ia medula osea del adulto y que emigran a los tejidos linfoides perifericos (bazo, ganglios linfaticos) , ya sea en forma directa por la corriente sangufnea (si son celulas B), o a traves del timo (donde se convierten en celulas T). Los linfocitos tienen recirculacion entre sangre y linfa; el proceso de dispersion asegura que un antigeno sera expuesto a los linfocitos de todas las especificidades posibles. Cuando un linfocito

encuentra un antfgeno que se une a su anticuerpo o receptor, la expansion clonal inicia Ia respuesta inmunitaria.

Los genes de las inm unoglobulinas se ensamblan en los li nfocitos a partir de sus constituyentes Conceptos principales • Una inmunoglobulina es un tetramero de dos cadenas ligeras y dos pesadas. • Las cadenas ligeras pertenecen a las familias 'A y K; las cadenas pesadas forman una sola familia. • Cada cadena tiene una region terminal N variable (V) y una region terminal C constante (C). • El segmento V reconoce al antigeno y el C provee la respuesta efectora. • Los segmentos V y C son codificados separadamente par seg mentos de los genes V y C. • Para unir un segmento del gen V con uno del gen C, par recombinacion somatica se genera un codigo genico de una cadena integra de inmunoglobulina.

Una caracterfstica notoria de la respuesta inmunitaria es Ia capacidad de un animal de producir un anticuerpo apropiado siempre que se exponga a un nuevo antigeno. (,Como puede el organismo estar preparado para producir anticuerpos proteinicos, cada uno disefiado especfficamente para reconocer un antfgeno, cuya estructura no puede preverse? Para fines practices, suele considerarse que un mamffero tiene la capacidad de producir de 10 6 a 10 8 anti cuerpos diferentes, cad a uno de los cuales es un tetramero de inmunoglobulina, constituido por dos cadenas ligeras (L) y dos cad enas pesad as (H) identicas. Si una cadena ligera puede vincularse con una pesada para producir de 10 6 a 108 anticuerpos potenciales, se requieren de 10 3 a 10 4 cadenas ligeras y de 10 3 a 104 cadenas pesadas diferente s. Hay dos tipos de cadenas Jig eras y -1 0 tipos de cadenas pesadas. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen funciones efectoras diversas. La clase depende de Ia region constante de Ia cadena pesada, que ejerce Ia fun cion efectora (vease la Fig. 23.17). La estructura del tetramero de inmunoglobulina se ilustra en Ia . Las cadenas ligeras y las pesadas comparten el mismo tipo genera l de organizacion, donde cada cadena protefnica consta de dos regiones principales, la region variable (region V) N terminal y Ia region constante (region C) C terminal, definidas originalmente por comparacion de las secuencias de aminoacidos de diferentes

23 .3 Los genes de las inmunoglobulinas se ensamblan en los linfocitos a partir de sus constituyentes

5 75

....

~icotlene

~

Cadena ligera CH2 - - --'-t'V

DominioC1

~ Bisagra - - - Dominic C2

- - - Dominic C3 - - -- Funciones efectoras Cadena pesada

U ~ Las cadenas pesadas y ligeras se combinan para formar una inmunoglobulina con varios dominies bien definidos.

cadenas de inmunoglobulinas. Como los nombres sugieren, las regiones variables muestran cambios considerables en Ia secuencia de una protefna a Ia siguiente, en tanto que las constantes muestran semejanzas sustanciales. Las regiones correspondientes de las cadenas ligeras y pesadas se vinculan para generar dominios diferentes en Ia protefna inmunoglobulina. El dominio variable (V) se genera por Ia vinculacion entre las regiones variables de las cadenas ligera y pesada. El dominio V se encarga del reconocimiento del ant£geno. Una inmunoglobulina tiene una estructura con forma de Y, donde los brazos son identicos y cada uno tiene una copia del dominio V. La produccion de dominios V de diferentes especificidades da Iugar a Ia capacidad de responder a diversos antfgenos. El numero total de regiones variables para las protefnas de cadena ligera o pesada se mide en cientos; as(, !a protefna muestra la maxima versatilidad en la region encargada de la union del antigeno. El n{Imero de regiones constantes es bastante mas reducido que el de regiones variables, por Io general, solo hay una a diez regiones c en un tipo especffico de cadena. Las regiones constantes de las subunidades del tetramero de inmunoglobulina se relacionan para generar varios dominios C individuates, el primero de los cuales es resultado de Ia relacion entre Ia region constante unica de Ia cadena Jig era (CL) y Ia parte CH 1 de Ia region con stante de Ia cadena pesada. Las dos capias de este dom inio completan los brazos de Ia molecula en forma de Y. El vinculo entre las regiones C de las cadenas pesa5 76

CAPITULO 23 Diversidad inmu nitaria

das genera los dominios C restantes, cuyo numero varia segun el tipo de cadena pesada. AI comparar las caracteristicas de la region variable y la constante se llega a! dilema central de Ia estructura del gen de inmunoglobulina. cComo codifica el genoma un conjunto de protefnas donde una cadena polipeptidica individual debe tener una de menos de diez posibles regiones C, pero puede tener alguna de varios cientos de posibles regiones V? Resulta que el numero de secuencias de codificacion para todo tipo de region refleja su variabilidad. Hay muchos genes que codifican regiones V, pero solo unos cuantos codifican regiones C. En ese contexto, "gen " significa una secuencia del DNA que codifica una parte definida del polipeptido final de inmunoglobulina (cadena pesada o ligera ). Asf, los genes V codifican regiones variables y los genes C, regiones constantes, si bien ninguno se expresa como unidad independiente. Para construir una unidad que pueda expresarse en forma de una cadena ligera o pesada autentica, un gen V debe unirse ffsicamente a un gen C. En ese sistema, dos "genes" codifican un polipeptido; para evitar confusiones, se hara referencia a estas unidades como "segmentos de gen", mas que "genes". Las secuencias que codifican las cadenas ligeras y pesadas se ensamblan de Ia misma forma, uno de muchos segmentos del gen V puede unirse a uno de w1os cuantos segmentos del gen C. Esta recombinacion somatica ocurre en ellinfocito B, donde se expresa el anticuerpo. El gran numero de segmentos disponibles del gen V se encarga de la mayor parte de Ia diversidad de las inmunoglobulinas, si bien no toda la diversidad esta codificada en el genoma, parte se genera por cambios que se presentan durante el proceso de construccion de un gen funcional. En esencia, la misma descripcion se aplica a la formacion de genes funcionales que codifican las cadenas proteinicas del receptor de las celulas T, que puede ser de dos tipos, uno constituido por dos variantes de cadena llamadas a y ~ y otro constituido por cadenas y y 8. Como los genes que codifican las inmunoglobulinas, los que codifican las cadenas individuates de receptores de celulas T constan de partes separadas, que incluyen regiones V y C, las cuales se unen en una celula T activa (ver seccion 23 .1 8, Los receptores de las celulas T tienen relaci6n con las inmunoglobulinas). Asf pues, el hecho crucial acerca de la sfntesis de las inmunoglobulinas es que el arreglo de los segmentos de los genes V y C es diferente en las celulas que producen las inmunoglobulinas (o receptores de celulas T) del de todas las otras celulas somaticas 0 germinativas. La cons truccion del gen de una inmunoglobulina o un receptor de celula T funcionales pudiese

parecer un proceso de Lamarck, que representa un cambio en el genoma que responde a una caracteristica particular del fenotipo (el antfgeno). Al nacer, el organismo no posee el gen funcional para producir un anticuerpo o receptor de celula T en particular, sino un gran numero de segmentos del gen v y un numero mas pequefi.o de segmentos del gen C. La construccion subsiguiente de un gen activo con esas partes permite la sfntesis del anticuerpo o receptor, de manera que este disponible para reaccionar con el antfgeno. La teoria de seleccion clonal implica que ese rearreglo del DNA tenga Iugar antes de la exposici6n al antigeno, que entonces da Iugar a Ia selecci6n de las celulas que portan una protefna susceptible de unirse a! antfgeno . El proceso completo ocurre en las celulas somaticas y no afecta a las de Ia linea germinativa, por tanto, la respuesta a un antfgeno no es heredada por Ia progenie del organismo. Hay dos familias de cadenas ligeras de inmu noglobulinas, K y A, y una que contiene todos los tipos de cadena pesada (H). Cada familia reside en un cromosoma diferente y consta de su propio conjunto de segmentos de genes V y C, el denominado patron de linea germinativa, que se encuentra en Ia lfnea germinativa yen las celulas somaticas de todos los linajes diferentes al sistema inmunitario. No obstante, en una celula que expresa un anticuerpo, cada una de sus cadenas, una de tipo ligero (K o A) y una de tipo pesado, es codificada por un gen integro unico. El suceso de recombinacion que lleva a un segmento del gen V a unirse con uno del gen C crea un gen activo constituido por exones que corresponden precisamente a los dominios funcionales de Ia proteina. Los intrones se retiran en Ia forma usual por empalme del RNA. La recombinacion entre segmentos de los genes Vy C para dar loci funcionales ocurre en una poblacion de linfocitos inmaduros. Un linfocito B suele tener solo un rearreglo productivo de segmentos del gen de cadena ligera (K o A) y uno de los segmentos del gen de cadena pesada, igual que un linfocito T rearregla de manera productiva un gen ex y uno ~, o un gen 8 y uno y. El anticuerpo o receptor de celula T producido por cualquier celula depende de la configuracion particular de segmentos de los genes V y C que se han unido. Los principios por los que se ensamblan los genes funcionales son los mismos en cada familia, pero hay diferencias en los detalles de Ia organizacion de los segmentos de los genes V y C, asi como en Ia reaccion de recombinacion entre el!os. Ademas de los segmentos de los genes V y C, en los loci somaticos funcionales se incluyen otras secuencias co rtas de DNA (incluidos los segmentos J y D).

Ell

Las cadenas ligeras se ensamblan por recombinaci6n Ctnica

Conceptos principales • Una cadena ligera A. se ensambla por reco mbinacion simple entre un gen V y un segmento del gen J-C. • Un segmento del gen V tiene un exon lider, un int ron y una regio n de codificacion variable. • El segmento del gen J-C tiene un exon corto de codificacion J, un intr6n y una region de codificacio n C. • Una cadena ligera K se ensambla por recombinacion simple entre un segmento de gen Vy uno de los cinco segmentos J que preceden al gen C.

Una cadena ligera 'A se ensambla a partir de dos . El segporciones, como se ilustra en Ia "'J mento del gen V consta del exon lfder (L) separado del segmento variable (V) por un solo intron. El segmento del gen C consta del segmento J, separado por un solo intron del exon constante (C). El nombre del segmento J es una abreviatura de juntura, porque identifica Ia region en que se conecta con el segmento V. Asf, la reaccion de juntura no implica directamente a los segmentos de los genes V y C, sino que se presenta a traves del segmento J; cuando se describe la union de dos "segmentos de genes V y C" de cadenas ligeras, en realidad se hace referencia ala union v -JC. El segmento J es corto y codifica los u ltimos aminoacidos de la region variable, como definen sus secuencias. En el gen fntegro generado por recombinacion, el segmento V-J constituye un solo ex on que codifica a Ia region variable completa. Las consecuencias de Ia reaccion de juntura K se ilustran en la 1 . Una cadena ligera K tambien se ensambla a partir de dos porcion es, pero hay una diferencia en la organizacion del segmento del gen C. Un grupo de cinco segmentos J se dispersa en una region de 500 a 700 bp, separados por un intron de 2 a 3 kb del exon CK. En el raton, el segmento J central noes funcional (\j!J3 ). Un segmen to VK puede unirse a cualquiera de los segmentos J. Sea cual sea el segmento J utilizado, se convierte en la parte t erminal del exon variable integra . Cualquier segmento J a Ia izquierda del segmento de recombinacion J se pierde (en la figura se ha perdido J 1). El segmento J ubicado ala derecha del segmento J recombinante se trata como parte del intron situado entre el ex on variable y el constante (en Ia figura, J3 se incluye en el intron que se empalma). 23.4 Las cadenas ligeras se ensamblan par recombinaci6n Cmica

577

Gen C

Gen V

Constante Codones de linea - 19 a -4 germinativa

-4

a +97

98 a 110

Reco mbinaci6n somatica

110 a COOH

1

RNA nuclear Empalme! RNAm Traducci6n!

Cadena ligera de inmunoglobulina Variable

Constante

El segmento genico CA. es precedido por un segmento J, de manera que la recombinaci6 n V-J genera un gen de cadena ligera A. funcional.

.

. J1

J2

J3

J3

Linea germinativa Recombinaci6n somatica en J2!

DNA de linfocito

Transcripci6n!

\Union V-J J2

J3

RNA nuclear Empalme de J2 a C ! RNAm Traducci6n! Cadena ligera de inmunoglobulina Variable

Constante

El segmento genico C K es precedido por multiples segmentos J en la l1nea germi nativa . La union V-J reconoce a cua lquiera de los segmentos J , que despues seem palma con el seg mento genico C. durante el procesamiento del RN A.

578

CAPITU LO 23 Diversidad inmunitaria

Todos los segmentos J funcionales poseen una sefial en ellimite izquierdo que hace posible la recombinacion con el segmento V; tambien poseen una sefial en el limite derecho que se puede usar para el empalme con el exon C. Cualquier segmento J reconocido en Ia union D-J del DNA utiliza su sefial de empalme en el procesamiento del RNA.

Las cadenas pesadas se ensamblan mediante dos recombinaciones Conceptos principales • Las unidades de recombinaci6n de cadenas pesadas son un gen V, un segmento D y un segmento del gen J-C. • La primera recombinaci6n une a D con J-C. • La segunda recombinaci6n une a V con D-J-C . • El segmento C consta de varios exones.

La construccion de Ia cadena pesada implica un seg mento adicional. El segmento D (por diversidad) se descubrio merced a Ia presencia de dos a trece aminoacidos adicionales en Ia proteina, entre las secuencias codificadas en los segmentos V y J. Un arreglo de > l 0 segmentos D yace en el cromosoma, entre los segmentos VH y los cuatro J H' La union V-D-J ocurre en dos eta pas, como se ilustra en Ia . El primero de los segmentos D se recombina con un segmento JH; un segmento VH se a{ma entonces con el segmento combinado DJH. La reconstruccion lleva a la expresion

••

Uder

lntr6n

A

del segmento CH adyacente (que consta de varios ex ones). (En la seccion 2 3 .12, El cambio de clase es producto de Ia recombinacion del DNA, se analiza el uso de los diferentes segmentos del gen CH; por ahora, solo se considerara Ia reaccion en cuanto a la conexion con uno de varios segmentos J que preceden a! segmento del gen Cw) Los segmentos D se organizan en forma seriada. Ellocus de cadena pesada del raton contiene 12 segmentos D de longitud variable, en tanto que ellocus humano tiene- 30 segmentos D (no necesariamente todos activos). Algun mecanismo desconocido debe garantizar que el mismo segmento D participe en las reacciones de union D -J y V- D (cuando se describe la union de los segmentos de los genes V y C para cadenas pesadas se supone que el proceso ha sido concluido por reacciones de union V-D y D-J). Los segmentos V de las tres farnilias de inmunoglobulinas son similares en cuanto a organizacion. El primer exon codifica las secuencias de sefial (implicadas en la union con la membrana) y el segundo, Ia porcion principal de la propia region variable (<100 codones de longitud), el resto proviene del segmento D (solo en Ia familia H) y de un segmento J (en las tres familias). La estructura de Ia region constante depende del tipo de cadenas. Para ambas cadenas ligeras, K o 'A, dicha region es codificada por un exon unico (que se convierte en el tercer exon del gen activo reconstruido). Para las cadenas H, la region constame es codificada por varios exones; de manera equivalente, en la cadena proteinica que se muestra en Ia Figura 23.4, diversos exones codifican las

.....

Variable

Constante

Unea germinativa

DNA de linfocito La estructura actual del gen C se interrumpe

Los genes de las cadenas pesadas se ensamblan por reacciones secuenciales de union. Primero, un segmento D se une a un segmento J, y despues un segmento genico V se une al segmento D.

23.5 Las cadenas pesadas se ensamblan por dos recombinaciones

5 79

regiones CH 1, de bisagra, CH 2 y CH 3 . Cada exon CH tiene -l 00 codones de longitud y Ia bisagra es mas corta. Los intrones suelen ser relativamente pequeiios (-300 bp).

1111

La reco mbinaci6n genera una gran diversidad

Conceptos principales • Un locus de cadena ligera produce mas de 1 000 cadenas por la combinacion de 300 genes V con cuatro a cinco genes C. • Un locus H puede producir mas de 4 000 cadenas por combinacion de 300 genes V, 20 segmentos D y cuatro segmentos J.

Ahara deben revisarse los diferentes tipos de segmentos de los genes V y C para ver que tanta diversidad se adapta a Ia variedad de regiones de codificacion que porta Ia linea germinativa. En cada familia del gen de cadena ligera de Ig, muchos segmentos del gen V se vinculan con un numero mucho menor de segmentos del gen C.

En Ia

U

su propio segmento J. En el raton, el locus A tiene mucho menos diversidad que ellocus humano: Ia principal diferencia es que en el raton hay solo dos segmentos del gen V)_, cada uno enlazado condos regiones J-C. De los cuatro segmentos del gen C)" uno esta inactivo. En algun punta en el pasado, el raton sufrio una delecion catastrofica de La mayor parte de los segmentos del gen VA. de linea germinativa. En Ia l se muestra que ellocus K tiene solo un segmento del gen C, si bien es precedido par cinco segmentos J (uno de ellos inactivo). Los segmentos del gen VK ocupan un gran grupo del cromosoma, en direccion ascendente respecto de la region constante. El grupo humano tiene dos regiones; inmediatamente antes del segmento del gen C" una region de 600 kb contiene los cinco segmentos JK y 40 segmentos del gen VK. Una hendidura de 800 kb separa esa region de otro grupo de 36 segmentos del gen VK. Los segmentos del gen VK se pueden subdividir en familias que se definen segun el criteria de que los de una familia tienen >80% de identidad de los aminoacidos. La familia del raton es desusadamente grande (-l 000 genes), y hay -18 familias V cu yo tamaiio varfa de 2 a l 00 . Como en otras familias de genes relacionados, los segmentos del gen V relacionados forman subgrupos generados par duplicacion y divergencia a partir de los ancestrales individuales. Sin embargo, muchos de los segmentos V son seudogenes inactivos, y <50 posiblemente se usen para generar inmunoglobulinas. Un linfocito determinado genera ya sea una cadena ligera K o una A para relacionarse con Ia cadena pesada. En el hombre, -60% de las cadenas ligeras es K y -40% es A. En el raton, el 95% de las celulas B expresa el tipo K de Ia cadena ligera, supuestamente porque el numero de segmentos del genA es menor. El locus unico para Ia produccion de cadenas pesadas en el hombre consta de varias secciones definidas, como se resume en Ia ~ , yes similar en el raton, donde hay mas segmentos del gen VH' menos segmentos D y J y una ligera diferencia en el numero y Ia organizacion de los segmentos del gen C. El miembro 3' del grupo VHesta separado par solo 20 kb del primer segmento D. Los segmentos D se distribuyen en -50 kb, seguidos del grupo de segmentos J. En los siguientes 220 kb se encuentran todos los segmentos del gen Cw de los cuales, nueve son funcionales, y dos seudogenes. La organizacion sugiere que un segmento del gen ydebe haberse duK'

2 en el raton 4 segmentos genicos J-C en el rat6r en el hombre >6 segmentos J-C en el hombre

-300

La familia A. consta de segmentos genicos V unidos a un nCtmero pequef\o de segmentos genicos J-C.

Las familias K humana y de raton constan de segmentos genicos V unidos a cinco segmentos J conectados a un solo segmento genico C.

-.GenesV" -300

~Segmentos

-20

,-- - ,--

kb 300

OJ ---Segmentos del gen

f

6 J.l.O

Uii U 250

y1 \j/Eo: 1 'VY

C----f'('

E

u. 2

I !_ _ 200

150

100

50

Un solo grupo genico humano contiene toda la informacion para el ensamblaje del gen de cadena pesada.

580


se muestra que ellocus A tiene

-6 segmentos del gen C, cada uno precedido par

plicado para producir el subgrupo y-y-£-a, despues de lo cual se duplico el grupo entero. ,:,Hasta que grado la diversidad de la informacion de lfnea germinal genera Ia variedad de Ia region V de las protefnas inmunoglobulinas? Combinando cualquiera de los -50 segmentos del gen V con cualquiera de los cuatro a cinco segmentos J, un locus usual de cadena ligera tiene el potencial de producir casi 250 cadenas; ellocus de Ia cadena H esta todavia mas diversificado. Por la combinacion de cualquiera de los -50 segmentos VH' 20 segmentos D y cuatro segmentos J, el genoma podria producir 4 000 regiones variables para acompaiiar cualquier segmento del gen CH. En los mamfferos, ese es el punto de partida de ]a diversidad, pero hay mecanismos adicionales que introducen mas cambios. Cuando se analizan variantes estrechamente relacionadas de las inmunoglobulinas, a menudo hay mas protefnas de las que pudiera pensarse por el numero de segmentos correspondientes delgen V. Los nuevos son creados por cambios somaticos en los genes individuates, durante o despues del proceso de recombinacion (ver seccion 23.14, La mutacion somatica genera diversidad adicional en el raton y el hombre).

IDI

La recombinaci6n inmunitaria utiliza dos tipos de secuencia de consenso


I

• La secuencia de consenso utilizada para la recombinaci6n es un heptamero separado de un nonamero por 12 o 23 pares de bases. • La recombinaci6n ocurre entre dos secuencias de consenso con espaciamientos diferentes.

V1• va seguido de una secuencia de consenso con espaciamiento de 23 bp, y cada segmento del gen 1~. es precedido por una secuencia de consenso de 12 bp de tipo espaciador. La regia que rige Ia reaccion de juntura es que una secuencia de consenso con un tipo de espaciamiento puede unirse solo a una secuencia de consenso con el otro tipo de espaciamiento. Las secuencias de consenso de los segmentos V y J pueden estar en cualquier orden, de modo que los diferentes espaciamientos no impanen ninguna informacion direccional, sino que sirven para evitar que un segmento del gen V o J se recombine con otro igual. Este concepto se confirma por Ia estructura de los componentes de los segmentos del gen de Ia cadena pesada. Cada segmento del gen VHva seguido de una secuencia de consenso de tipo espaciador de 23 bp. Los segmentos D son flanqueados a uno y otro lado por secuencias de consenso de tipo espaciador de 12 bp. Los segmentos JH son precedidos por secuencias de consenso de tipo espaciador de 23 bp. AsL el segmento del gen V debe unirse a un segmento D, y este, a un segmento J. Un segmento del gen V no puede unirse directamente con un segmento J, porque ambos poseen el mismo tipo de secuencia de consenso. El espaciamiento entre los componentes de las secuencias de consenso corresponde casi a uno o dos giros de la doble helice, lo cual podria reflejar una relaci6n geometrica en la reacci6n de combinaci6n. Por ejemplo, las proteinas de recombinaci6n pueden acercarse al DNA lateralmente, de la misma forma que la polimerasa de RNA y los represores se aproximan a los elementos de reconocimiento, como promotores y operadores.

.. . . . ~

El ensamblaje de genes de Ia cadena ligera y Ia pesada implica el mismo mecanismo (aunque el numero de partes es diferente), se encuentran las mismas secuencias de consenso en los lfmites de todos los segmentos de la linea germinativa que participan en las reacciones de union. Cada secuencia de consenso consta de un heptametro separado de un nonamero por 12 o 23 bp. En Ia '' 23 1 se ilustra la relacion de las secuencias de consenso en los loci de Ig de raton. En ellocus K, cada segmento del gen V, va seguido de una secuencia de consenso con un espaciamiento de l2 bp; cada segmento J K es precedido por una secuencia de consenso con espaciamiento de 23 bp; la orientacion de las secuencias de consenso V y J esta invertida . En ellocus A, cada segmento del gen

~

Heptametro

Nonamero

:

. .

Nonamero

Heptametro

CACAGTG ACAAAAACCGGTTTTTGT CACTGTG GTGTCAC TGTTTTTGGCCAAAAACA GTGACAC - -

Espaciador de 12 bp

J-CK

Espaciador de 23 bp

Las secuencias de consenso estan presentes en orientacion invertida en cada par de sitios de recombinaci6n. En un miembro de cada par, el espaciamiento entre sus componentes es de 12 bp, yen el otro, de 23 bp.

23 .7 La recombinaci6n inmunitaria utiliza dos tipos de secuencia de consenso

581

Ell

La recombinaci6n genera deleciones o i nversiones

Conceptos principales • La recombinacion se debe a roturas de la doble cadena en los heptameros de dos secuencias de consenso. • Los extremos sefial del fragmento entre roturas suelen unirse para generar un fragmento circular escindido. • Los extremos de codificacion se enlazan de manera covalente para unir V a J-C (cadena L) o D a J-C y V a D-J-C (cadena H). • Si se invierten los genes recombinantes en Lugar de unirse en orientacion directa, hay una inversion y no una delecion de un circulo escindido.

La recombinacion de los componentes de los genes de inmunoglobulina se logra mediante un rearreglo flsico de secuencias que implica rotura y nueva union, pero el mecanismo es diferente del de la recombinacion homologa . En la se ilustran las caracterfsticas generales de la reaccion para una cadena A ligera. (La reaccion es similar en ellocus de Ia cadena pesada, con la salvedad de que hay dos sucesos de recombinacion, primero D-J y despues, V- DJ.) La rotura y nueva union tienen Iugar como reacciones independiente; hay una rotura de la doble cadena de los hectameros que yacen en los extre 6

Los extremos de los heptameros identifican los extremo,p de codificaci6n

Espaciador de 12 bp Escisi6n

Espaciador de 23 bp

mos de las unidades de codificacion, lo cuallibera. todo el fragmento entre el segmento del gen V y el del gen J-C; los puntas terminales de ese fragmento se denominan terminos seftal. El extrem fragmentado de los loci V y J-C se llama termino de codificaci6n. Los dos extremos de codificacior. tienen enlace covalente para formar una union de codificacion, la cual enlaza los segmentos V y J : tambien se conectan los dos extremos sefial, el fragmento escindido formarfa una molecula circular. Se ha demostrado que los loci V y J -C esta rorganizados con Ia misma orientacion, de modo qu e el corte de cada secuencia de consenso Iibera entre ellos una region como fragmento lineal. Si se unen los extremos sefial, se forma una molecula circular. como se indica en la Figura 23.12. La delecion para liberar un drculo escindido es el modo predominante de recombinacion en los loci de inmunoglobulinas y TCR. En algunos casos excepcionales, la orientacion del segmento del gen V esta invertida en el cromosoma, respecto de los loci J-C. En tal caso, la rotura y nueva union invierte el material interpuesto, er: Iugar de eliminarlo. Los resultados de Ia delecion respecto de Ia inversion son los mismos mostrados antes para Ia recombinacion homologa entre Ia repeticion directa o la in vertida en las Figuras 21.9 y 21.10, con Ia salvedad adicional de que la recombinacion con un segmento del gen V hace necesario que los extremos sefial se unan, de otra manera. habra una rotura en ellocus. En la recombinacion de TCR, se produce una inversion y, en ocasiones, tambien en el locus de Ia cadena ligera K.

Ill

La exclusion alelica es desencadenada por un rearreglo productivo

Conceptos principales Extrema sefial

-

EX1remo de codificaci6n

Extrema seiial

EX1remo de codificaci6n

• La recombinacion para generar un gen lntegro de inmunoglobulina es productiva si lleva a La expresion de una protelna activa. • Un rearreglo productivo impide que ocurra cualquier rearreglo adicional, a diferencia del rearreglo no productivo. • La exclusion alelica se aplica separadamente a las cadenas ligeras (solo puede rearreglarse de manera productiva una cadena K o "A) y a las pesadas (una cadena pesada se rearregla de manera productiva).

' La rotura y nueva union en secuencias de consensa genera genes de inmunoglobulinas.

582


Cada celula B expresa un solo tipo unico de cadena ligera y uno de Cadena pesada, porque nada mas tiene Iugar un rearreglo productivo de cada tipo en un linfocito dado para producir un gen con una

cadena ligera y una pesada. Cada suceso involucra a los genes de solo uno de los cromosomas homologos, de modo que los alelos del otro cromosoma nose expresan en !a misma celula; este fenomeno se conoce como exclusion alelica. La exclusion alelica complica el analisis de la recombinacion somatica; una sonda que reacciona con una region en que ha tenido lugar el rearreglo de un homologo, tambien detectara las secuencias alelicas del otro homologo, de modo que se tiene la obligacion de analizar los diferentes destinos de los dos cromosomas juntos. El patron usual mostrado por un gen activo con rearreglo puede interpretarse seg{m una delecion del material entre los loci V y C recombinantes. En las celulas activas se observan dos tipos de organizacion genica: • Las sondas para el gen activo suelen revelar una copia con rearreglo y una de Ia linea germinativa, de modo que se supone que Ia union ocurri6 en un cromosoma, mientras que el otro se mantuvo sin cambios. • Pueden encontrarse dos patrones diferentes de rearreglo, lo cual indica que los cromosomas han experimentado rearreglos independientes. En algunos de estos casos, el material entre los segmentos de los genes V y C recombinantes esta por completo ausente de la lfnea celular, Io cual explica muy facilmente porIa aparicion de deleciones independientes (resultado de recombinaciones) en cada cromosoma. Cuando dos cromosomas carecen del patron de linea germinativa, por Io general uno de ellos ha pasado por un rearreglo productivo para generar un gen funcional y el otro ha experimentado un rearreglo no productivo, lo cual podria asumir varias formas, pero en cada caso, la secuencia del gen nose expresaria como cadena de inmunoglobulina. (Puede ser incompleto, por ejemplo, porque se produjo la union D-J, pero nola consiguiente union V- D, o bien ser aberrante, con el proceso concluido, pero sin generar un gen que codifique una protefna funcional.) La coexistencia de rearreglos productivos y no productivos sugiere que hay un asa de retroalimentaci6n que controla el proceso de recombinaci6n, modelo esbozado en la J 1 . Supongase que cada celula inicia condos loci en una configuracion Ig 0 de lfnea germinativa sin rearreglo, cualquiera de esos loci puede pasar por un rearreglo para generar un gen productivo, Ig+, o uno no productivo, Ig-. Si el rearreglo es productivo, la sintesis de una cadena activa provee un desencadenante para evitar el rearreglo del otro alelo, y la celula activa tendra una configuracion Ig 0 /Ig+.

Si el rearreglo es no productivo, se creara una celula con la configuracion Ig 0 /lg-. No hay impedimenta para el rearreglo del alelo de lfnea germinal restante, que de ser productivo, la celula expresada tendra una configuracion Ig+ng-. Tambien en este caso, la presencia de una cadena activa suprime Ia posibilidad de rearreglos adicionales. La celula Ig-nges producto de rearreglos sucesivos no productivos. En algunos casos, este tipo de celula puede intentarlo otra vez; en ocasiones, los patrones de DNA observados solo pueden haber sido generados por arreglos sucesivos. La esencia del modelo es que la celula sigue tratando de recombinar segmentos de los genes V y C hasta Iograr un rearreglo productivo. La exclusion alelica es causada porIa supresion de rearreglos adicionales tan pronto como se produce una cadena activa. El uso de este mecanismo in vivo se demuestra por la creacion de ratones transgenicos, cuya linea germinativa tiene un gen de inmunoglobulina con rearreglo. La expresion del transgen en las celulas B suprime el rearreglo de genes endogenos. La exclusion alelica es independiente para los loci de las cadenas pesadas y ligeras. En general, los genes de las cadenas pesadas son los primeros en pasar por un rearreglo. La exclusion alelica de las cadenas ligeras debe aplicarse de manera equivalente a ambas familias (las celulas pueden tener cadenas ligeras activas K o /c). Es posible que

Genes de linea germinativa (lgOflgO)

v

El rearreglo productivo culmina en IgOJig+

................

El rearreglo no productivo culmina en lgOflg-

Transcripci6n

La expresi6n de lg impide rearreglos adicionales

Transcripci6n

- Un rearreglo exitoso para producir una cadena activa ligera o pesada evita rearreglos adicionales del mismo tipo y da como resultado la exclusion alelica.

23.9 La exclusion alelica es desencadenada par un rearreglo productivo

583

Ia celula rearregle primero sus genes K y trate de rearreglar los A. solo si ambos intentos con los K no tienen exito. Una paradoja interesante de esta serie de sucesos es que las mismas secuencias de consenso y Ia misma recombinasa V (DJ) participan en las reacciones de recombinacion en los loci H, K y A., y sin embargo, los tres loci se rearreglan en un orden establecido. LQue asegura que el rearreglo de cadenas pesadas preceda a! de cadenas ligeras, y que el rearreglo K preceda a! A.? Los loci pueden volverse accesibles a Ia enzima en diferentes momentos, tal vez como resultado de Ia transcripcion, Ia cual ocurre incluso antes del rearreglo, si bien, por supuesto, los productos no tienen funcion de codificacion . La transcripcion puede cambiar Ia estructura de Ia cromatina, lo cual pone a disposicion de Ia enzima las secuencias de consenso para Ia recombinacion.

f1D

Las protefnas RAG catalizan la rotura y la nueva union

Conceptos principales • Las protefnas RAG son necesarias y suficientes para la reacci6n de corte y empalme. • La RAG1 reconoce las secuencias de consenso nonamericas para La recombinaci6n. La RAG2 se une a RAG1 y se corta y empalma en el heptamero. • La reaccion se asemeja a La de resolucion tipo topoisomerasa que ocurre en La transposici6n. • Una de las histonas avanza a traves de un intermediario en horquilla en el extrema de codificacion; La abertura de La horquilla se encarga de la insercion de bases adicionales (nucleotidos T) en el gen recombinado. • La transferasa de desoxinucleosidos inserta nucleotidos N adicionales en el extrema de codificacion. • La secuencia del codon del sitio de La reaccion de union V-(D)J es muy variable y codifica el aminoacido 96 en el sitio de union del antigeno. • Las roturas de La doble cadena en las uniones de codificacion son reparadas par el mismo sistema i nvolucrado en La union de extremos no hom6logos del DNA daiiado. • Un reforzador del gen C activa al promotor del gen V despues de que la recombinacion ha generado el gen integra de inmunoglobulina.

Las protefnas RAG! y RAG2 son necesarias y suficientes para seccionar el DNA en Ia recombinacion V(D)J; son codificadas por dos genes, separados por < l 0 kb en el cromosoma, cuya transfeccion a fi broblastos produce un sustrato de DNA adecuado para que en el ocurra Ia reaccion de juntura V(D)J. Los 584


ratones que carecen de RAG J o RAG2 no pueden r combinar sus inmunoglobulinas nisus receptores ·-:: celulas T, y como resultado, portan linfocitos de B ~ T inmaduros. Las proteinas RAG juntas emprend las reacciones catalfticas de rotura y nueva union d.o. DNA y tambien proveen una red estructural en :: cual ocurren las reacciones. La RAG l reconoce las senates de heptamero nonamero con el espaciamiento apropiado 12/2 :} y recluta a RAG2 para el complejo. El nonamer proporciona el sitio para el reconocimiento inicic... y el heptamero dirige el sitio de corte. En Ia I l se muestran las reaccion _ involucradas en Ia recombinacion. El complejo produce una hendidura en una cadena de cada unio Ia cual tiene extremos 3'-0H y 5'-P. El extrem . libre 3'-0H ataca entonces la union fosfato en lc. posicion correspondiente de la otra cadena de Ia estructura doble, to cual da Iugar a horquilla en el extrema de codificacion donde Ia terminacion 3' de una cadena se enlaza de manera covalente con lc terminacion 5' de Ia otra, de modo que se product una perdida de continuidad roma de doble cadenc: en el extrema sei'ial. Este segundo corte es una reaccion de transesterificacion en Ia cual se conservan las energfas de enlace y que simula las reacciones similares a Ia_ de topoisomerasa catalizadas por las protefnas resolvasa de transposones bacterianos (vease secci6 21. 9, La transposicion TnA requiere de transposasa y resolvasa). La semejanza con estas reacciones es respaldada aun mas por una homologia entre RAG I y las proteinas invertasa bacterianas (que invierten segmentos especfficos del DNA por reacciones de recombinacion similares). De hecho, las proteina pueden insertar un DNA donador cuyos extremos libres constan de las secuencias sefial apropiadas (heptametro-12 /espaciador nonamero -2 3) en un DNA blanco no relacionado en una reaccion de tra nsposicion in vitro. Esto sugiere que Ia recombinacion somatica de genes inmunitarios evoluciono a partir de un transposon ancestral y tambien que las protefnas RAG se encargan de las translocaciones cromosomicas donde se conectan loci de Ig o TCR con otros loci . Las horquillas de los extremos de codificacion proporcionan el sustrato para Ia siguiente etapa de Ia reaccion. Si se introduce una seccion de una sola cadena cerca de Ia horquilla, en el extrema, una reaccion de desapareamiento genera !a protrusion de una sola cadena. La sfntesis de u n complemento para Ia cadena unica expuesta convierte entonces el extremo de codificacion en una estructura do ble ampliada, reaccion que explica Ia introduccion de nucleotidos P en los extremos de codificacion; constan de unos cuantos pares de bases adicio nales

.

..

.

..

...... t

Gen J-C

Gen V

I

~A

G G T T T T T G 1 123 } C ACT G T G ,C"Q;.;;Ge.===~ CCAAAAACA GTGACAC TI:"'

TA C A G T G{ }A C AAAAA C C ATQIGTCAC 12 TGTTTTTGG H

Hendidura en una o P I I Cadena TA CACAGTG AT GTGTCAC Extrema de codificaci6n Extrema seiial en horquilla romo

RAG1 ,2 hace una hendidura en una cadena de cada union El -OH libre ataca el enlace en otra cadena y crea horquillas en los extremos de codificaci6n

'f

Se escinde una cadena adyacente a Ia horquilla

TA-O AT-P

!

T

ATA Recorte

GGCCG Adici6n

~~ c

T~

AT

Extrema de codificaci6n

~

TA

AT

Extremos de codificaci6n unidos

c~::::=:=.

La cadena escindida se separa para generar un extrema libre (las bases afectadas se muestran en negro) Recorte del extrema, adici6n aleatoria de nucle6tidos (N) o ambos

Extrema de /codificaci6n

!

Se llenan los extremos "NfilGtfCCl NNCCGGC ===;- de una sola cadena Nucle6tidos P

/

TA NNGGCCG AT NNCCGG

cr:======

Los extremos de codificaci6n se unen

Nucle6tidos N/ El procesamiento de los extremos de codificaci6n introduce variabilidad en la union .

relacionados con el extrema de codificacion original, pero de orientacion invertida. Tambien pueden insertarse algunas bases adicionales aparentemente con secuencias aleatorias entre los extremos de codificacion que se conocen como nucle6tidos N. La insercion se debe ala actividad de la enzima transferasa de desoxinucleosido (que se sabe es un componente activo de los linfocitos) en el extrema libre de codificacion 3' generado durante el proceso de union . Asf pues, los cam bios en Ia secuencia durante Ia recombinacion son consecuencia de los mecanismos enzimihicos implicados en Ia escision y nueva union del DNA. En Ia recombinacion de Ia cadena pesada se pierden pares de bases o se insertan en las uniones VH-D, D-J, o ambas; tambien ocurren deleciones en la union VA-JA, pero la inserci6n en esas uniones es desusada. Los cambios de secuencia afectan al amino
Estos diferentes mecanismos, juntos, aseguran que una union de codificacion puede tener una secuencia diferente de la pronosticada par la union directa de los extremos de codificacion en las regiones v; D, y J. Los cambios de secue ncia de la union hace n posible codificar una gran variedad de aminoacidos en este sitio. Es interesante que el aminoacido de Ia posicion 96 es creado por la reaccion de juntura V-J; forma parte del sitio de union del antfgeno y puede tambien involucrarse en ellogro del o entre las cadenas ligeras y las pesadas, de modo que la maxima diversidad se genera en el sitio que hace o con el antfgeno blanco. Los cambios en el numero de pares de bases de Ia union de codificacion afectan el marco de lectura. El proceso de union parece ser aleatorio respecto del marco de lectura, de manera que probablemente solo el 3 3% de las secuencias unidas conserva el marco apropiado de lectura de union a union . Si la region V-J se une de man era que el segmento J 23.10 Las proteinas RAG catalizan la rotura y la nueva union

585

quede desfasado, la traduccion termina prematuramente con un codon de finalizacion en el marco incorrecto. La formacion de genes aberrantes se puede considerar como el precio que Ia celula debe pagar por tener una mayor cliversidad, Ia cual es obtenida al ajustar la secuencia en el sitio de union. En las reacciones de union que involucran al segmento D de Ia cadena pesada se genera una diversidad similar, incluso mayor; el resultado observado es el mismo respecto del marco de lectura; los genes no productivos son generados por sucesos de union que ubican a J y C fuera de fase respecto del segmento genico V precedente. La reaccion de union que funciona en el extremo de codificacion utiliza Ia misma via de union terminal no homologa (NHEJ) con que se reparan secciones de la doble Cadena en las celu!as (vease seccion 20.11 , Las celulas eucarioticas han conservado sistemas de reparacion). Las etapas iniciales de la reaccion fueron identificadas por el aislamiento de productos intermedios de linfocitos de raton con Ia mutacion de inmunodeficiencia combinada grave (SCID) , que da Iugar a un grado muy disminuido de actividad en Ia recombinacion de inmunoglobulinas y TCR. Los ratones SCID acumulan moleculas rotas que terminan en perclidas de continuidad de Ia doble cadena en los extremos de codificacion, de modo que no son competentes para concluir algunos aspectos de Ia reaccion de juntura. La mutacion SCID desactiva una cinasa de protefnas dependiente del DNA (DNA-PI<). La cinasa es reclutada en el DNA por las proteinas Ku70 y Ku80, que se unen a los extremos del DNA. La DNA-PK produce fosforilacion de la protefna Artemis, que provoca una hendidura en los extremos en horquilla y, por tanto, la

Promotor inactive

desactiva (tambien tiene actividad de exonuclea-.: y endonucleasa en Ia via NHEJ) . La union real . realizada porIa ligasa IV de DNA y tambien requcere de Ia protefna XRCC4. Como resultado, en i~ protefnas Ku y XRCC4 o en Ia ligasa IV de D -__ de pacientes humanos con enfermedades produ - das por deficiencias en la reparacion del DNA, :encuentran mutaciones que producen una may sensibilidad a la radiacion. ,;_ Cual es Ia relacion entre Ia union de los se; · mentos genicos V y C y su activacion? Los segment del gen V sin rearreglo nose presentan de manera c.:tiva en el RNA. No obstante, cuando un segmento (L gen V se une de manera productiva a un segmer:.: de C"' Ia unidad resultante se transcribe. La secue:::cia de direccion ascendente de un segmento del geV no se modifica con Ia reaccion de union; con· resultado el promotor tendra que ser el mismo en los:-:nes sin rearreglo, o con rearreglo, ya sea no productihproductivo. En direccion ascendente de cada segmento ·':gen V se encuentra un promotor, pero esta inacti' y para que se active, debe relocalizarse en la region L El efecto dependera de secu encias en direccion d _· cendente. ,;_Cual seria su participacion? Un reforzad localizado en el segmento del gen C, o en direcci ' descendente respecto del rnismo, activa al promor ~ en el segmento del gen V. El reforzador es especffic de tejidos y esta activo solo en celulas B. Su existen ." sugiere el modelo ilustrado en Ia ' :'..::~ , don · L el promotor del segmento del gen V es activado cua:::.· do se lleva dentro de los lfmites del reforzador.

Bill

La expresi6n de la cadena pesada temprana puede cambiar por procesamiento del RNA

Conceptos principales • Todos los li nfocitos empiezan por si ntetizar la forma de Ig Munida a la membrana.

Ex6n V

l

Exones C Recombinaci6n

..........

: Activaci6n : l' Promotor Reforzador

-Transcripci6n.....,. Un promotor genico Vesta inactivo hasta que la recombinaci6n lo lleva cerca de un reforzador del segmento del gen C. El reforzador esta activo s6lo en los linfocitos B.

586


• Un cambio en el empa lme del RNA hace que sea remplazado por la forma secretada cuando la celula B se diferencia .

El periodo de sintesis de IgM con que se inicia e desarrollo dellinfocito consta de dos partes, durar:.te las cuales se sintetizan versiones diferentes de ! region constante 11: • Conforme una cetula madre se diferencia er:. un pre-linfocito B, se sintetiza una caden=. ligera acompaiiante y aparece Ia molecw; de IgM (L2 p 2 ) en Ia superficie de Ia ceJuJa Esa forma de IgM contiene Ia version ).lm de

la region constante (la m indica que la IgM esta localizada en la membrana). La localizacion en Ia membrana puede relacionarse con Ia necesidad de iniciar la proliferacion celular en respuesta al primer reconocimiento de un antfgeno. • Cuando el linfocito B se diferencia mas en direccion de celula plasmatica, se expresa Ia version P, de Ia region constante. La IgM en realidad es secretada como un pentamero IgM 5J donde J es un polipeptido de union (sin conexi on con la region J) que forma enlaces disulfuro con las cadenas p . La secrecion de la protefna va seguida de la respuesta humoral que se muestra en la Figura 23.1. Las versiones Pm y P, de la cadena pesada p difieren solo en el extrema terminal C. La cadena Pm termina en una secuencia hidrofobica que probablemente la fije en la membrana. Dicha secuencia

•

El gen

~

•

•

I

4

I

c. tiene 6 exones M1

es sustituida por una secuencia hidrofflica mas corta en ].1 la sustitucion permite que la cadena pesada J.1 pase a traves de la membrana. El cambia en el extrema C se logra por un suceso de empalme alterno controlado por el extrema 3' del RNA nuclear, como se ilustra en Ia l. En la etapa de union con la membrana, el RNA termina despues del ex on M2, y la region cons tante se produce por el empalme de seis exones. Los primeros cuatro codifican a los cuatro dominios de la region constante, en tanto que los ultimos dos, Ml y M2, codifican el segmento hidrofobico de 41 bases de Ia region C terminaL que es un remolque no traducido. La union de empalme 5' con el exon 4 se enlaza con Ia union de empalme 3' en el inicio de Ml. En la etapa de secrecion, el RNA nuclear termina despues del ex on 4. Se ignora Ia union de em palme 5' en ese exon, Ia cual habfa estado relacionada con Ia forma Ml en Ia membrana, de modo de permitir que el exon se extienda otros 20 codones. En otras regiones constantes se encuentra una transicion similar de Ia forma de membrana ala secretada. La conservacion de las estructuras de exon sugiere que el mecanismo es el mismo. 5

;

T

M2

fiB El cambio de clase es producto de la reco mbinaci6n del DN A AAAA

Canceptos principales • Las inmunoglobulinas se dividen en cinco clases, segun el tipo de region constante de La cadena pesada. • El cambia de clase para modificar La region CH se debe a una recombinacion entre las regiones S que lleva a La deleci6n de La region entre la antigua CH y la nueva.

Etapa secretora El RNA nuclear termina despues del ex6n 4 El HNAm tiene solo cuatro exones

• Pueden presentarse multiples recombinaciones de cambios sucesivos.

--~~~~~~~~ AAAA

l

Empalme

El extrema 3' cantrala el usa de unianes de empalme, de manera que se expresen formas alternas del gen de cadena pesada.

Tipo

lgM

lgD

Cadena pesada

Jl

8

Estructura

(il2~)5J

Praporci6n

5%

82~ 1%

Funci6n efectora Activa el complemento

La clase de inmunoglobulina se define por el tipo de region CH. En Ia F u - . , se resumen las cinco clases de Ig. La IgM (primera inmunoglobulina producida por alguna de las celulas B) y la IgG (la conocida) poseen Ia capacidad medular de activar a!

lgG

Desarrollo de tolerancia (?)

lgA

lgE

Activa el Se encuentra Respuesta complemento en las secreciones alergica

J d.~., EL tipo y funci6n de La inmunoglobulina dependen de la cadena pesada. La J es una proteina de union en la IgM; todos los demas tipos de Ig corresponden a tetrameros.

23 .12 El cambia de clase es producto de la recombinaci6n del DNA

587

complemento, y de ahf Ia destruccion de las celulas invasoras. La IgA se encuentra en las secre ciones (como Ia saliva) y Ia IgE se vincula con Ia respuesta alergica y Ia defensa contra los parasitos. Todos los linfocitos inician su vida productiva como celulas inmaduras que participan en la sfntesis de IgM, las celulas que la expresan tienen el arreglo de grupo del segmento del gen CH de linea germinativa que se muestra en la Figura 23 .10. La reaccion de juntura V-D-J desen cadena !a expresion del seg mento del gen C . En general, u n linfocito produce solo una clase de inmunoglobulina en un momenta dado, pero dicha clase puede cambiar en ellinaje celular, dicho cambia se llama cambio de clase y se debe ala sustitucion del tipo de region CH que se expresa. El cambia puede ser simulado por efectos ambientales, por ejemplo, el factor de crecimiento TGF~ causa un cambia de a Ca. . El cambia se produce solo en el segmento del gen CH; el mismo segmento VH sigue expres(mdose, de modo que un segmento dado del gen VHpuede expresarse con exito en combinacion con mas de un segmento del gen CH. La misma cadena ligera continua expresandose en t odo ellinaje de !a celula, por lo tanto, el cambia de clase permite modificar el tipo de respuesta efectora (mediada porIa region CH) , mientras se mantiene la misma capacidad de reconocimiento de an tfgeno (mediada por las regiones V) . ~

.. .

~

VDJ

~

~

8

1[].

1~

"11

[

Genes Regiones de cambia

E

-· s~

Sy1

5'{3

5 y2b

5.1 2a SE

[].1 [].2

--

So.1 5 [].2

8 ~

siJ _ . Recombinaci6n s11

_,,p,,;''""'"~ -C ; VDJ

"11

~~

ju

E

[].1

DNA circular escindido

[].2

n

S~ , "( 1 Sf2b Sy 2a SE S[J.1

Sa2

siJ, y 1 . . . Recombinaci6n s[J.1

-

Se expresa el gen o.1 __... VDJ [].1 [].2

Puede haber un cambia de clase de genes de cadena pesada por recombinaci6 n entre regiones de cambia (S) , con deleci6n del material entre los sitios S de recombinaci6n. Los cambios pueden ser sucesivos.

588


Los cambios en Ia expresion de segmentos del gen CH son de dos tipos; la mayor parte ocurre por sucesos adicionales de recombinacion del DNA qu implican un sistema diferente del encargado de Ia juntura V-D-J (que puede fu ncionar solo en etapa posteriores del desarrollo de !a ce lula B). El otr tiene Iugar en el ambito del procesamiento del RNA qu e en general se relaciona con el cambia de la secuencia C terminal de Ia region Cw mas que con un cambia de clase (ver seccion 23. 11, La expresion temprana de Ia cadena pesada puede cambiar por procesamiento del RNA). Las celulas que se expresan en direccion descendente respecto de los segmentos del gen CH tie nen deleciones de y de los otros segmentos genicos que preceden a! segmento expresado de dich gen. El cambia de clase se debe a una recombinacion para ubicar un nuevo segmento del gen CHen yuxta posicion con Ia unidad V-D -J expresada. La secuencias de las unidades V-D-J -CH modificadas mu estran que los sitios de cambia, denominados regiones S, estan en sentido ascendente respect de los segmentos del propio gen CH' En Ia ..,u se m uestran dos cambios sucesivos. En el primer cambia, la expresion de vaseguida por la de C,11, segmento genico que es llevad ala posicion expresada por recombinacion entre lGls siti os SP y 511 . El primero yace entre los segmento> genicos V-D-J y , y S¥1, en direccion ascenden te respecto del segmento del gen C11; entre los do> sitios de cambia, Ia secuencia de DNA se escind como molecula circular. El modelo de delecion lineal impone una restriccion al locus del gen de la cadena pesada, una vez que se ha hecho un cambia dr? clase, es imposible expresar cualquier segmento genico C que hubiera residido entre C1, y el nuevo segmento genicc CH. En el ejemplo de Ia Figura 23 .1 8, las celulas que expresan c yl deberfan ser capaces de originar celula que expresaran C.,y que ha sido eliminado. No obstan te, 'deberfa ser posible realizar otr cambia a cualquier segmento del CH en sentido descendente respecto del gen expresado. En la Figura 23.18 se muestra un segundo cambia ala expresion de ( e< [ogradO por recombinaciOn entre Sa I Y Ia region de cambia S" " generada con el cambia original. · ·· Se supone que todos los segmentos genicos CH tienen regiones S en direccion ascendente respecto de las secuencias de codificacion, pero no se sabe si hay alguna restriccion en el u so de las regiones S, que experimentan cambios secuenciales, si bien se ignora si so n optativos u obligatorios para proceder hacia los segmentos posteriores del gen CH. Tambien serfa interesante saber si Ia IgM puede cambiar directamente a cualquier otra clase. Las regiones S yacen en los intrones que preceden a las

regiones de codificacion del gen Cw de modo que con el cambio no se modifica el marco de lectura de Ia traducci6n.

fD!l

El cam bia se debe a una nueva reacci6n de recombinaci6n

Conceptos principales • Habra un cambia por una rotura de la doble cadena seguida de La reaccion de union no homologa de extremos. • La caracteristica importante de una region de cambia son las repeticiones invertidas. • El cambia requiere de activacion de los promotores que estan en direccion ascendente respecto de los sitios de cambia.

Se sabe que los sitios de cambio no se definen de una sola manera, pues diferentes celulas qu e expresan el mismo segmento genico CH h an mostrado recombinacion en puntos diferentes. La longitud de las regiones de cambio varfa (segun definen los lfmites de los sitios implicados en Ia recombinacion) de 1 a 10 kb; contienen grupos de repeticiones cortas, invertidas, cuya longitud fluctua entre 20 y 80 unidades de nucleotidos. La secuencia primaria de Ia region de cambio no parece ser importante, lo que interesa son las repeticiones invertidas. Una region S su ele localizarse -2 kb en direccion ascendente respecto de un segmento del gen Cw La reaccion de cambio libera el material escindido entre los sitios de cambio como una molecula de DNA circular, para lo cual se requieren dos de las proteinas que intervienen en la fase de union de la recombinacion de VDJ (y tambien en Ia via de union general de extremos no homologos, NHEJ), Ku y DNA-PKcs, lo cual sugiere que Ia reaccion de u nion podria usar Ia via NHEJ. Basicamente, esto implica que Ia reaccion se debe a una fractura de Ia doble cadena segu ida de una nueva union de los extremos separados. En Ia generacion de Ia fractura de Ia doble cadena se pueden conj untar las caracterfsticas de Ia rea ccion para proponer un modelo cuyos puntos criticos son: • Se requiere transcripcion a traves de Ia regionS; • las repeticiones invertidas son cruciales, y • Ia fractura puede ocurrir en m uchos sitios diferentes de Ia region S. En Ia se muestran las etapas de Ia reaccion de cambio de clase. Un promotor (I) yace inmediatamente en direccion ascendente respecto de cada region de cambio que implica Ia transcripci6n desde ese promotor. Este ultimo podria res-

ponder a los activadores, que a su vez responden a las condiciones ambientales, como Ia estimulaci6n por citocinas, lo cual da Iugar a un mecanismo para regular el cambio . Asi pues, Ia primera etapa en el cambio es la activacion de los promotores I que estan en direccion ascendente respecto de cada una de las regiones de cambio que participan. Cuando esos prom otores se activan, generan productos de transcripcion esteriles que se empalman para unir a Ia region I con Ia correspondiente region constante de Ia caden a pesada. · La clave para descifrar el m ecanismo del cambio fue descubrir Ia n ecesidad de Ia en zima AID (desaminasa de citidina inducida por activacion) , pues sin ella, el cambio de clase se in terrumpe antes de la etapa de producci6n de Ia hendidura. La mutacion somatica tambi en resulta obstaculizada, lo cual muestra una conexi6n interesante entre dos procesos funda m entales para la diversificaci6n inmunitaria (vease la seccion 23.1 5, La mutacion soma tica es inducida porIa desaminasa de citidina y la glucosilasa de uracilo). La AID se expresa solo en una etapa especifica durante Ia diferenciaci6n de los linfocitos B, lo cual restringe los procesos de cambio de clase y mutacion somatica a esta etapa. La AID es miembro de una clase de enzimas que actua en el RNA para convertir una citidina en uridina (vease secci6n 27.10, La

Expresi6n l.l

VDJ

Genes Regiones de cambio

E

~I IS

IS

l !

Productos de VDJI.l transcripci6n l ~ ll.l empalmados Escisi6n Escisi6n

Escisi6n

lE

ll.l

VDJ

I VDJ

Productos de transcripci6n empalmados

l

E

VDJE

El cambia de clase pasa por etapas bien defi nidas. Los promotores I inician la transcripcion de productos esteriles. Las regiones de cambio se escinden . Las regiones esci ndidas se unen. 23.13 El cambio se debe a una nueva reaccion de recombinaci6n

589

Repeticiones invertidas

~ Transcripci6n Cadena que no es molde Cadena molde Cuando en La transcri pci6n se separan las cadenas del DNA, una puede formar una repetici6n invertida si La secuencia es palindr6mica.

edici6n del RNA ocurre en las bases individuates), pero su especificidad diferente y actua en el DNA de una sola cadena. Para el cambia de clase y Ia mutacion somatica tambien se requiere de otra enzima, Ia UNG, una glucosilasa de uracilo del DNA que elimina el uracilo que genera Ia AID por desaminacion de Ia citidina . En los ratones con deficiencia de UNG, el cambia de clase disminuye l 0 veces, lo cual sugiere un modelo en que las acciones sucesivas de AID y UNG crean sitios que han perdido una base en el DNA, con consecuencias diferentes en el cambia de clase y los sistemas de mutaci6n somatica . La fuente del DNA de una sola cadena, blanco de la AID, se genera por el proceso de transcrip cion esteril, muy probablemente por exposicion de Ia cadena de DNA que no es molde y que es desplazada cuando Ia otra se usa como molde para Ia sfntesis de RNA. Este fen6meno es respaldado por la observacion de que Ia AID hace blanco preferentemente en citidinas de Ia cadena que no funciona como molde. Para dar Iugar a un cambia de clase, estos sitios se convierten en roturas de Ia cadena nucleotfdica que proporcionan los sucesos de escision que se muestran en Ia Figura 23.19. Los extremos rotos se unen con Ia via 1\THEJ, sistema de reparacion que incide en las roturas de Ia doble cadena del DNA (vease Ia seccion 20.12, Un sistema comun repara las roturas de Ia doble cadena) . Nose sa be aun como los sitios sin bases se convierten en roturas de do ble cadena; podrfa necesitarse el sistema de hidrato de silicato de magnesia (MSH) que participa en Ia reparaci6n de apareamientos incorrectos del DNA, pues las mutaciones del gen MSH2 aminoran los cambios de clase. Una caracterfstica no explicada es Ia participaci6n de las repeticiones invertidas; quiza se formen 590


horquillas por Ia interaccion entre las repeticione_ invertidas de Ia cadena desplazada que no sirve de molde, como se muestra en Ia , lo cua combinado con Ia generacion de sitios sin bases er. esa cadena, podrfa llevar ala rotura. Dos interrogantes crfticas siguen sin respuesta· (.Como hace blanco el sistema en las regiones apropiadas del locus de Ia cadena pesada? LQue control.: el uso de los sitios de cambia?

f1D

La mutaci6n somatica genera otras diferencias en el raton y el ser humano

Conceptos principales • Los genes activos de inmunoglobulina tienen regiones V con secuencias que cambian respecto de La linea germinativa par mutaci6n somatica. • Las mutaciones ocurren como sustituciones de bases individuates. • Los sitios de mutaci6n se concentran en los sitios de union de ant\geno. • El proceso depende del refo rzador que activa La transcripci6n en el locus Ig.

Las cbmparaciones entre las secuencias de los genes de inmunoglobulina expresados y los segmentos genicos V correspondientes de Ia Hnea germinativa muestran que en Ia poblaci6n expresada aparecen nuevas secuencias. Parte de esa diversidad adicional es resultado de los cambios de secuencia en las junturas V-J o V-D-J ocurridos durante el proceso de recombinacion, mientras que otros se presentan en ubicaci6n ascendente en sitios del dorninio variable. Los cambios en las secuencias genicas V despues de que se ha obtenido un gen funcional de inmunoglobulina por rearreglo son generados por dos tipos de mecanismos. En el raton y el ser humano, dicho mecanismo es Ia inducci6n de mutaciones somaticas en localizaciones espedficas del gen. en especial en ellinfocito activo. El proceso suele llamarse hipermutaci6n. En pollos, conejos y cerdos, un mecanismo diferente aprovecha Ia conversion genica para cambiar un segmento del gen V expresado en Ia secuencia correspondiente de un gen V diferente (ver secci6n 23.16, Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a partir de seudogenes ). Para identificar los fragmentos correspondientes de Ia lfnea germinativa se puede usar una sonda que represente un segmento genico V expresado, cuyas secuencias deben identificar el repertorio completo disponible para el organismo. Cualquier gen expresado cuya secuencia sea diferente, debe haber sido generado por cambios somaticos.

Asegurar que cada contribuyente potencial de los segmentos genicos V de la linea germinativa en realidad ha sido identificado constituye un problema, el cual se resuelve con la sencillez del sistema de cadena 'A en el raton. En una encuesta entre pacientes con mieloma, que producen cadenas \, se observ6 que muchos tienen Ia secuencia del segmento unico de lfnea germinativa, pero otros tienen nuevas secuencias que deben haberse generado por mutaci6n del segmento genico de La linea germinativa. Para determinar Ia frecuencia de Ia mutacion somatica en otros casos es necesario revisar gran numero de celulas en que se exprese el mismo segmento genico V. Un procedimiento practico para identificar a ese grupo es caracterizar las inmunoglobulinas de una serie de celulas, todas con expresion de una respuesta inmunitaria ante un antfgeno en particular. Los epftopos utilizados para este fi n son pequefias moleculas, haptenos, cuya estructura definida posiblemente provoque una respuesta coherente, a diferencia de una protefna grande, de Ia cual, diferentes partes producen anticuerpos diversos. Un hapteno se conjuga con una protefna no reactiva para formar el antfgeno. Las celulas se obtienen por imnunizacion de ratones con el antfgeno y recuperacion de linfocitos reactivos y, en ocasiones, por !a fusion de esos linfocitos con el mieloma (tumor inmortal) para generar un hibridoma, que sigue expresando de manera indefinida el anticuerpo deseado. En un ejemplo, 10 de 19 lfneas celulares diferentes que producen anticuerpos dirigidos contra el hapteno fosforilcolina, tenian Ia misma secuencia VH' que era el segmento Tl 5 del gen V de !a lfnea germinativa, uno de los cuatro genes VH relacionados. Los otros nueve segmentos genicos expresados diferian entre sf y de los cuatro de linea germinativa de Ia familia; tenfan una relacion mas estrecha con !a secuencia de lfnea germinal T15 que con cualquiera de las otras, y sus secuencias flanco eran las mismas que rodean a T15, lo cual sugirio que se originaron en un miembro Tl5 por mutaci6n somatica. En Ia ., se muestra que los cambios de secuencia se localizan en torno al segmento genico V, con extension en una region desde - 150 bp en direccion descendente respecto del promotor del gen Vy abarcando - 1. 5 kb; romanIa forma de sustituciones de pares de nucle6tidos individuales. Por lo general, hay -3 a -15 sustituciones, que corresponden a < 10 cambios de aminoacidos en Ia protefna. Se concentran en el sitio de union de antfgen o (generando asf Ia maxima diversidad para reconocer antigenos nuevos) . Solo algunas de las mutaciones afectan Ia secuencia de aminoacidos, pues otras ya -

VDJ

2 kb

c

'l La mutacion somatica tie ne lugar en la region que circunda al segmento Vy se extiende sobre los seg mentos VDJ unidos.

cen en posiciones de codificacion de tercera base, asi como en regiones no traducidas. La gran proporcion de mutaciones ineficaces sugiere que Ia mutacion somatica es mas o menos aleatoria en una region que incluye el segmento genico V y que va mas alia. Algunas mutaciones muestran Ia tendencia a recurrir muchas veces, y podrian representar puntos calientes como resultado de alguna preferencia intrfnseca del sistema. AI parecer, durante Ia proliferacion clonal, Ia mutacion somatica ocurre con una frecuencia de -1 o-3 /bp por generaci6n celular. Casi Ia mitad de las celulas de Ia progenie gana una mutacion , de mane ra que las celulas que expresan anticuerpos m utados se convierten en una fra ccion elevada del don. En muchos casos se usa de m an era sistematica una sola familia de segmentos genicos V para responder a un antfgeno en particular. Supuestamente, ante Ia exposicion a un antigeno, la region V con afinidad intrinseca mas alta proporciona el punto de inicio, de m odo qu e Ia mutaci6n somatica aumenta el repertorio . Las mutaciones aleatorias tienen efectos impredecibles en la funcion protefnica; algunas Ia desactivan, en tanto otras le confieren alta especificidad para un antfgeno especffico. La proporci6n y la eficacia de los linfocitos que respon den aumentan por seleccion en la poblaci6n de linfocitos de las celulas que tienen anticuerpos en los cuales una m utaci6n h a aumentado Ia afinidad por el antfgeno.

La desaminasa de citidina y La glucosilasa de uracilo

inducen la mutaci6n somatica Conceptos principales • Para la mutacion somatica y para el cambia de clase se requiere de una desa minasa de citidi na. • La actividad de glucosilasa de uracilo-D NA influye en el patron de mutaciones somaticas. • Una hipermutacio n puede empezar por la accion secuencial de esas enzimas.

23 .15 La desaminasa de citidina y la glucosilasa de uracilo inducen la mutacion somatica

591

La mutaci6n somatica tiene muchos de los mismos requisitos que el cambio de clase (vease secci6n 23.13, El cambio ocurre por una reacci6n de recombinaci6n nueva): • La transcripci6n debe ocurrir en Ia region blanco (como en este caso, porIa demanda del reforzador, que activa la transcripci6n en cada locus Ig) ; • se necesitan las enzimas AID y UNG, y • participa el sistema de reparaci6n de apareamiento err6neos de MSH. La forma en que el retiro de Ia base desaminada lleva a Ia mutacion somatica es sugerida por el experimento que se resume en Ia r . Cuando Ia AID desamina a Ia citosina, genera uracilo, que entonces es retirado del DNA por la UNG. Normalmente, todas las posibles sustituciones ocurren en el sitio sin bases, pero si se obstruye Ia acci6n de la glucosilasa de DNA-uracilo, el resultado sera diferente. Si no se retirara el uraci!o del DNA, tendrfa que aparearse con Ia adenina durante Ia replicacion, y en ultima instancia, el resultado serfa la sustituci6n de un par original C-G con uno T-A. La glucosilasa de DNA-uracilo se puede bloquear introduciendo en las celulas la codificaci6n genica para

La desaminasa de citidina crea un par U-G

una protefna que inhiba la enzima. (El gen es un componente del bacteriofago PSB-2, cuyo genoma es poco comun porque contiene uracilo, de manera que es necesario bloquear la enzima durante una infeccion por fago. ) Cuando se introduce el gen en una linea de celulas linfodticas es notorio el cambio en el patron de mutaciones, pues casi todas incluyen la transicion pronosticada de C-G a A-T. La clave de Ia generacion de una variedad aleatoria de mutaciones es, por tanto, crear el sitio sin bases, y despues se recluta el sistema de reparacion MSH para escindir y sustituir Ia tira de DNA que contiene el sitio dafiado. La posibilidad mas sencilla es que si se sustituye por una polimerasa de DNA sujeta a error, podrfa haber mutaciones. Otra posibilidad es que se creen tantos sitios sin bases, que los sistemas de reparaci6n se vean rebasados. En caso de replicaci6n, esto podria llevar a la inserci6n aleatoria de bases frente a los sitios sin bases. Nose sabe aun que limita Ia accion de este sistema a la region blanco para Ia hipermutaci6n. La diferencia en los sistemas es a! final del proceso, cuando se introducen roturas de Ia doble cadena en el cambio de clase, pero se crean m uta ciones puntuales individuales durante Ia mutacion

Resultados experimentales

La glucosilasa de DNA-uracilo crea un sitio sin bases Patron normal de mutaci6n

G~A=48%

En Ia replicaci6n se insertan bases en forma aleatoria en direcci6n opuesta a Ia hendidura

G

La replicaci6n de un par U-G causa transici6n de G a A

La glucosilasa de DNA-uracilo ES BLOQUEADA

G~C =39% ~

T

= 12%

G ~A= 84% G ~ C = 16%

Cuando la acci6n de la desaminasa de citidina (arriba) va seguida de la acci6n de la glucosilasa de DNA-uracilo se crea un sitio sin bases. La replicaci6n mas alla de ese sitio debe insertar las cuatro bases de forma aleatoria en la cadena hija (centro) . Si no se elimina el uraci lo del DNA, su replicaci6n causa t ransici6n de C-G a T-A.

592


somatica. No se sabe con exactitud donde divergen los sistemas. Una posibilidad es que las roturas se introduzcan en sitios sin bases durante el cambio de clase, pero que se reparen de manera erratica en la mutacion somcitica, o bien, que se introduzcan las roturas en ambos casos, pero se reparen en una forma susceptible de error en Ia mutacion some:hica.

f!D

Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a partir de seudogenes

Ccncepto principal • En el pollo, un gen de inmunoglobulina se genera copiando una secuencia de uno de los 25 seudogenes del gen V de un locus activo unico.

El sistema inmunitario del polio es el paradigma para conejos, vacas y cerdos, que dependen del uso de Ia diversidad codificada en el genoma. Un mecanismo similar es utilizado por el locus unico de cadena ligera (de tipo A) y el de Ia cadena H. En Ia 3 t. se incluye una interpretacion de Ia organizacion del locus A; solo tiene un segmento genico V funcional, y los segmentos J y C. En direccion ascendente respecto del segmento V, 1 se encuentran 25 seudogenes v~.. organizados en cualquier orientacion, los cuales han sido clasificados asf porque presentan delecion de un segmento de codificacion en uno o en ambos extremos, carecen de sefiales apropiadas para Ia recombinacion, o ambos. Esta asignacion se confirma por el hecho de que solo el segmento genico V). 1 se recombina con el segmento genico J-C, . Sin embargo, las secuencias de los segmentos genicos v,-J-C ~. con rearreglo muestran diferencias considerables. Un gen rearreglado tiene una o mas posiciones en que han ocurrido varios cam bios de secuencia. Casi siempre se puede encontrar una secuencia identica ala nueva en uno de los seudogenes (que no cambian). Las secuencias excepcionales que no se encuentran en un seudogen siempre representan cambios en Ia union de Ia secuencia original y la modificada. Asf, para generar diversidad se emplea un m ecanismo nuevo. Las secuencias de los seudogenes, de entre 10 y 120 bp de longitud, se introducen en Ia region V,_ , activa por conversion genica, en tanto que la misma no modificada no se expresa, ni siquiera en las primeras etapas tempranas de Ia respuesta inmunitaria. Es posible que un suceso de conversion tenga exito cada diez a veinte divisiones celulares en todas las secuencias V, 1 con rea rreglo. Al termino del periodo de maduracion inmunitaria,

una secuencia con esas caracterfsticas cuenta con cuatro a seis segmentos cornpartidos que abarcan toda su longitud y que se derivan de diversos seudogenes donadores. Si todos los seu dogenes participaran, jlas combinaciones posibles serfan 2.5 x 10 8 ! La base enzimatica para el copiado de secuencias de seudogen es en el locus expresado depende de las enzimas involucradas en la recornbinacion, ademas de que se relaciona con el mecanismo de hipermutacion somatica que introduce diversidad en el raton y el h ombre. Para el proceso de conversion genica se necesitan algunos de los genes irnplicados en la recornbinacion; por ejernplo, se evita por la delecion RAD54. Por otra parte, la delecion de diferentes genes recombinantes (X RCC2, XRCCJ, y RAD51B ) tiene otro efecto muy interesante, la mutacion sornatica del gen V en el locus expresado . La frecuencia de las mutaciones somaticas es -10 mayor que la tasa usual de conversion genica. Estos resultados muestran que la ausencia de mutacion somatica en el pollo n o se debe a una deficiencia de los sistemas enzirnciticos correspondiente del raton y el hombre; la explicacion mas probable para una conexion (o su carencia) entre la recombinacion y la mutacion somatica, es que las roturas no apareadas en ellocus desencadenan la induccion de m utaciones. Asi pues, el m otivo de la mutacion somatica en el raton y el hombre, pero no en el pollo, puede estar en los detalles de la operaci6n del sistema de reparacion que actua en las roturas del locus. Es mas eficiente en el polio, de manera que el gen se repara por conversion antes de que puedan inducirse mutaciones.

Juntura V-J

La secuencia del seudogen sustituye Ia parte correspondiente de v,.1

El locus 'A de cade na ligera del pollo tiene 25 seudogenes Ven direcci6n ascendente respecto de la region fun cional unica V-J-C. Las secuencias derivadas de los seudogenes, sin embargo, se encuentra n en genes activos V-J-C con rearreg lo.

23.16 Las inmunoglobulinas aviarias se ensamblan a partir de seudogenes

593

fD1

La celula B de memona permite una respuesta secundaria rapida

Conceptos principales • La respuesta primaria a un ant\geno es montada por las celulas B, que no sobreviven despues del periodo de respuesta.

SCID RAG1 ,2 etc.

~

C~lula

j Celulas B

• Se producen celulas B de memoria con especificidad para el mismo ant\geno, pero estan inactivas. • Una reexposici6 n al ant\geno origina la respuesta secundaria, en la cual las celulas de memoria se activan rapidamente.

En este momenta ya es posible resumir la relacion entre la gen eracion de anticuerpos muy afines y la diferenciacion de Ia celula B. En la se muestra que las celulas B se derivan de una poblacion autorrenovable de celulas madre de lamedula osea. La maduracion para producir celulas B depende del rearreglo del gen Ig, que requiere de las funciones de los gen es SCID y RAGI,2 (ademas de otros) . Si se bloqu ea el rearreglo genico no se produ cen celulas B maduras. La especificidad de los anticuerpos que portan las celulas B depende de las combinaciones particulares de las regiones V(D )J y de cualquier nucleotido adicional incorporado durante el proceso de union. La exposicion a un antfgeno desencadena dos aspectos de la respuesta inmunitaria; la respuesta inmunitaria primaria se debe a la expansion clonal de celulas B en respuesta a un an tfgeno, con lo cual se gen era un numero importante de celulas plasmaticas especfficas del antigeno; hay un cambio de isotipo para gen erar el tipo apropiado de respuesta efectora . La poblacion de celulas encargadas de Ia respuesta primaria constituye un punto terminal, pu es no viven mas alla de la respues ta primaria misma. El fenomeno de la memoria de Ia celula B permite preparar para una respuesta irununitaria secundaria. La mutacion somatica genera celulas B con mayor afinidad por el antfgeno que no desencadenan una respuesta inmunitaria en ese momenta, aunque podrfan presentar cambios en el isotipo para seleccionar otras formas de la region CH; se almacenan como celulas de memoria con especificidad apropiada y tipo de respuesta efectora, pero no estan activas, se activan cuando hay una nueva exposicion al mismo antigeno; el antfgeno las selecciona de antemano, de modo que pueden montar una respuesta secundaria muy rapida, sencillamente por expansion clonal; durante la respuesta secundaria no h ay mas mutaciones somaticas ni cambios de isotipo. 594

CAPiTULO 23 Diversidad inmunita ria

Rearreglo del gen de lg

'

~

B de memoria

.....

Mutaci6n somatica Antigeno Cambia ~ de isotipo Respuesta primaria

Expansion clonal y cambio de isotipo

Celulas de l

merria

Respuesta secundaria

Expansion clonal

,...,

I 't

~

Celulas plasmaticas La dife renciaci6 n de La celula B se encarga de la in munidad adquirida . Las celu las pre-B se convierten en celulas B por rearreglo del gen de Ig . La exposici6n inicial a un ant\geno provoca la respuesta primaria y el almacenamiento de celulas de memoria . La exposici6n subsiguiente a un ant\geno provoca la respuesta secunda ria de las celulas de memoria.

Las vfas que se re sumen en la Figura 23 .24 m uestran el desarrollo de la inmunidad adquirida, esto es, Ia respuesta a un antfgeno. Ademas de estas celulas, hay un conjunto independiente de celulas B llamado de celulas Ly-1 , las cuales han pasado por un proceso de rearreglo del gen V y aparentemente se seleccionan para la expresion de un repertorio particular de especificidades de anticuerpos. No presen tan mutacion somatica ni respuesta de memoria, si bien podrfan participar en Ia inmunidad n atural, esto es, tener una capacidad intrfnseca para respon der ante ciertos antfgenos. La es una descripcion mas detallada del desarrollo de Ia celula B. El primer paso es la

Ce 'ula madre

0

Recombinaci6n DH-JH

~

Celula pre-8 grande

Se expresa Ia cadena ligera subrogada

Recombinaci6n ~ VH-DH JH

1 X 107 celulas

Celula pre-B pequeiia 2

X

107 Celulas

Celula B inmadura 2 X 107 celulas

.Receptor pre-8 de Ia cadena pesada; cadena ligera IJ subrogada

El receptor de antigenos de la celula B consta de un tetramero de inmunoglobuli na (H2 LJ en lazado con dos copias del heterodimero de transducci6n de senal (Iga~).

fl. expresada

Receptor B de cadena pesada; cadena ligera IJ: KOJ..

Celula B madura 2 X 108 celulas

Receptor B de cadena pesada: cadena ligera

IJ

r

4

0

B:

K 0

A.

El desarrollo de la celula B procede en etapas

secuenciales.

recombinacion de los segmentos D y J de Ia cadena pesada p, que se logra por recombinacion de V-D, que genera una cadena pesada p. Como se mostro antes, en Ia Figura 23. 13, pueden tener Iugar varios sucesos de recombinacion, incluida una sucesion de rearreglos no productivos y productivos. Estas celulas expresan una protefna que simula una cadena 'A, llamada cadena ligera subrogada (SL) , Ia cual se expresa en !a superficie y se vincula con Ia cadena pesada )l para formar el receptor pre-B; es similar a un complejo de inmunoglobulinas, pero nose comporta como ellas. La produccion de la cadena )l reprime !a sfntesis de !a cadena SLy las celulas se dividen para convertirse en celulas pre-B pequefias. A continuacion, se expresa la cadena ligera y aparece u na inmunoglobulina funcional en !a superficie de las celulas B inmaduras; se presentan divisiones celulares adicionales y se afiade !a expresion de !a cadena 8 pesada

a !a de !a cadena p, conforme las celulas se tornan B maduras. Las inmunoglobulinas actuan tanto por secrecion en las celulas B, como por expresion superfi cial. En la se muestra que el complejo activo de la superficie celular se llama receptor de Ia celula B (BCR) y consta de u na inmunoglobulina vinculada con proteinas transmembrana llamadas Iga y Ig~, las cuales proporcionan los componentes de sefializacion que desencadenan las vias intracelulares en respuesta a una union antfgeno-anticuerpo. La activacion de BCR tambien es influida por interaccion es con otros receptores, por ejemplo, para mediar la interaccion de celulas B activadas con antigeno y celulas T auxiliares.

IE

Los receptores de las celulas T tienen relaci6n con las inmunoglobulinas

Conceptos principa les • Las celulas T usan un mecanisme similar de union V(D)J-C a las celulas B para producir uno de los dos tipos de receptor de celulas T. • En >95% de los linfocitos T se encuentra TCR TCR y8 se encuentra en <5 por ciento.

a~;

la

El linaje linfocitico constituye un ejemplo de oportunismo evolutivo; tanto en las celulas B como en lasT se utiliza un procedimiento similar para generar protefnas con una region variable susceptible de dar Iugar a un a diversidad significativa, en tan-

23.18 Los receptores de las celulas T tienen relaci6n con las inmunoglobulinas

595

to que las regiones constantes son mas limitada : contribuyen a una pequefia variedad de funcio nes efectoras. Las celulas T producen uno de dos tip _ de receptor de celulas T; estos receptores de celul2. T se sintetizan en momentos diferentes durante e desarro llo de las celulas T, com o se resume en .~

I

I

Sin rearreglo

Sin rearreglo

El receptor y8 se sintetiza al principia del desarrollo de la celula T; el TRC ex~ se si ntetiza mas adelante y se encarga de la inmunidad "clasica" mediada por celulas, en la cual se reconocen juntos los antigenos blanco y de histocompatibilidad del hospedador.

• ,, .

El receptor yo se encu entra en < 5% de los linf citos T; es sintetizado solo en las primeras etapas de. desarrollo de las celulas T. En ratones, es el u nic receptor detectable con < 15 dfas de gestacion , per virtualmente se ha pe rdido para el momento de nacimiento, en el dfa 20 . El TCR ex~ se e n cu entra e n >9 5 % de los li focitos; se sintetiza m as tarde que el yo, durante e desarrollo de las celulas T. En ratones, empieza a se detectable entre los dfas 15 y 17 de gestacion. Par~ el nacimiento, es el receptor predominan te, el a le.. es sintet izado por un linaje ind ependiente de Ia..: celulas involucradas en Ia sfntesis de TCR yo; implic,: eventos de rearreglo independien tes . Como las inmunoglobulinas, un TCR debe reco nocer un antfgeno extrafio de estructura impred.ecible. El problema del reconocimiento de antfgenos por las celulas B y T se resuelve en Ia misma forma y la organizaci6n de los receptores de Ia celula T. asemeja a Ia de los genes de inmunoglobulinas e: el u so de regiones variables y constantes. Cada lor:u:.

se organiza en !a misma forma que los genes de imm .noglobulina, con segmentos separados que se juntan p-~ una reacci6n de recombinaci6n especifica dellinfocito. Lo-:

kb 140 120 100

80

60

40

20

Resumen del a humano: 42 V 61 J Ellocus del TCRex humano tiene segmentos ex y 8 dispe rsos. Un segmento V8 se localiza en el grupo V". Los segmentos D-J-(8 yace n entre los segmentos genicos Vy J-C". Ellocus del raton es similar, pero tie ne mas segmentos V8.

v 1

500 kb

280 kb

30

20

10

0

Resumen del~ humano: 47 V, 2 D, 13 J Ellocus del TCR~ contiene muchos segmentos genicos V dispersos en - 500 kb que se encuentran -280 kb en direcci6n ascendente respecto de los dos grupos D-J-C.

596


componentes son los m ismos que se encuentran e . las tres familias de Ig. La organizaci6n de las protefnas del TCR simu lla de las inmunoglobulinas; las secu encias V tien er. Ia misma organiza cion interna general tanto en Ia~ protefnas Ig como en el TCR. La region C de este ultimo se relaciona con las regiones constantes de Ig y presenta un solo dominio constante, segui-d de porciones transmembrana y citoplasmicas. La e tructura exon-intron tiene relacion con Ia funcior. protefnica . Las sim ilitudes de organizaci6n de los genes de~ TCR y con los de Ig es notoria. Como se resume en Ia , Ia organ izaci6n del TCR a es simila a Ia de Ig K, con segmentos del gen V separados de un conjunto de segm entos J que precede a un sol segmento del gen C. La organizacion del locus e~ similar en el ser humano y el raton, con solo algunas diferencias en cuanto a num ero de segmento:: del gen Va y de J a · (Ademas de los segmentos a. este locus tambien contiene segmentos o, qu e se describen brevemente.) Los compon entes de TCR ~ son similares a los. de IgH. En Ia se observa que Ia or ganizacion es diferente, con segmentos del gen ,,-

separados por dos grupos, cada uno de los cuales contiene un segmento D, varios segmentos J y un segmento del gen C. Tambien en este caso, las unicas diferencias entre el ser humano y el raton yacen en el numero de unidades vp y JP" La diversidad es generada por los mismos mecanismos que en las inmunoglobulinas; Ia intrfnseca es resultado de Ia combinacion de una variedad de segmentos V, J, D, y C; ciertas diferencias adicionales resultan de Ia introduccion de nuevas secuencias en las uniones entre dichos componentes (en forma de nucleotidos P y N; vease Ia Fig. 23. 14). Algunas cadenas TCR ~ incorporan dos segmentos D, generados por uniones D-D (dirigidas por una organizacion apropiada de las secuencias de nonamero y heptamero). Una diferencia entre TCR e Ig es que Ia mutacion somatica no ocurre en los loci de TCR. Las determinaciones del grado de diversidad muestran que las 10 12 celulas T del ser humano contienen 2.5 x 107 cadenas adiferentes, relacionadas con 106 cadenas ~ diferentes. Posiblemente los mismos mecanismos participen en las reacciones de recombinacion de genes de Ig en celulas B y genes de TCR en celulas T. Los segmentos del TCR recombinados son rodeados por secuencias de consenso nonamericas y heptamericas, identicas a las que utilizan los genes de Ig, lo cual lleva a pensar seriamente que participan las mismas enzimas. La mayor parte de los rearreglos quiza tenga Iugar por el modelo de delecion (vease la Fig. 23.12). Nose sabe como se controla el proceso de que los loci de Ig se rearreglan en las celulas B, en tanto que los receptores de celulas T se rearreglan en celulas T. La organizaci6n del locus r se asemeja a Ia de IgA-, con segmentos genicos V separados de una se0 se muestra rie de segmentos J -C. En Ia t- - RA que ese locus tiene relativamente poca diversidad, con -8 segmentos V funcionales . La organizacion es diferente en el hombre y el raton; en el raton tiene 3 loci J -C funcionales, pero con algunos segmentos de orientacion invertida, mientras que en el ser humano tiene multiples segmentos J por cada segmento del gen C. La subunidad oes codificada por segmentos que se encuentran en el locus TCRa, como se mostro en Ia Figura 23.28. Los segmentos D8 -D 8 -J8 -C 8 yacen entre los segmentos del gen V y los de Jcx-Ca. Ambos segmentos D pueden incorporarse a Ia cadena ()para dar Ia estructura VDDJ. La naturaleza de los segmentos genicos V usados en el rearreglo () es interesante, muy pocas secuencias V se encuentran en cadenas TCR oactivas. En el ser humano, solo un segmento del gen V se utiliza de manera general para el rearreglo o. En el raton se encuentran varios

Raton

v

- ... - .... C2J2

............

J4C4

i

Direcci6n de Ia expresi6n

Ser humano

J1 C1 J2 C2

v kb 100

Yy

80

60

40

20

Ellocus TCRy contiene un pequeiio numero de segmentos funcionales del gen V (y ta mbien algunos seudogenes no ilustrados) en direcci6n ascendente respecto de los loci J-C.

segmentos V8, algunos exclusivos del rearreglo o, pero otros tambien se encuentran en rearreglos a. Se desconoce Ia base de Ia especificidad para Ia selecci6n de segmentos V en los rearreglos a y ~; una posibilidad es que muchos de los segmentos del gen Va pueden unirse al segmento DDJ8, pero que solo algunos (definidos, por lo tanto, como V8 ) pu edan proporcionar protefnas activas. Por el momento, los elementos V que se encuentran en las cadenas () han sido etiquetados como segmentos del gen V8; sin embargo, noes posible juzgar si son realmente exclusivos del rearreglo o. El arreglo disperso de genes implica qu e Ia sfntesis de los receptores TCR a~ y el receptor yo es mutuamente exclusiva en cualquier alelo, pues el locus ose pierde por completo cuando se presenta el rearreglo Va. -Ja· Los rearreglos en los loci de TCR, como los de los genes de inmun oglobulina, pueden ser productivos o no productivos. Ellocus ~ muestra exclusion alelica, muy parecida a !a de los loci de las inmunoglobulinas; el rearreglo se suprime u na vez que se ha generado un alelo productivo. Ellocus a puede ser diferente; va rios casos de rearreglo con tinuo sugieren !a posibilldad de que Ia sustitucion de secuencias va podrfa continuar despues de la generacion de un alelo productivo.

f1D

El receptor de la celula T actua con el MHC

Concepto principal • El TCR reconoce un peptide corto unido a un surco de una proteina del MHC en La superficie de La celula presentadora.

Las celulas T con receptores a~ se dividen en varios subtipos con diversas funci ones conectadas con in 23.19 El receptor de la celu la T actua con el MHC

597

teracciones entre celulas implicadas en la respuesta inmunitaria. Las celulas T citot6xicas poseen la capacidad de lisar una celula blanco infectada, en tanto que las celulas T auxiliares facilitan la eliminaci6n del blanco mediada por la celula T o la interacci6n antfgeno-anticuerpo mediada por la celula B. Una diferencia importame entre los anticuerpos de las celulas By los receptores de las celulas T es la forma en que manejan el antfgeno. Un anticu erpo reconoce una region corta (epftopo) en un antfgeno. El receptor de la celula T se une a un p eptido pequeiio, de cuatro a cinco aminoacidos de longitud, p rocesado a partir del antfgeno p or reacciones de escisi6n. El fragmento peptfdico es "presentado" a la celula T por una protefna del MHC, de m odo que la celula T reconoce de m anera simultanea al antfgeno extrano y a una protefna del MHC que porta Ia celula transportadora, como se ilustr6 antes en Ia Figura 23.2. Tanto las celulas T au xiliares como las T asesinas actuan de esta forma, pero tienen diferentes requerimientos para la presen taci6n del antfgeno; en cada caso se utilizan tipos diversos de protefna del MHC (vease la secci6n 23.20, El locus de histocompatibilidad mayor codifica m uch os genes del sistema inmunitario). Las celulas T a uxi-

.

rfb of:X'h I iii kl·

. jilik'

co4- cosRecombinaci6n mediada por RAG Expresi6n de TCR~ TCR~ se une a Ia .

cadena a subrogada

Expresi6n de preTCRa.

Se expresan CD4 y CD8

Expresi6n de TCR~

l secuenciales.

598

El desarrollo de la celula T procede en eta pas

CAPITULO 23 Diversidad in munitaria

liares requieren de la presen taci6n del antigeno p :una protefna del MHC de clase II, en tanto que a la._ T asesinas les debe ser presentado por una protefiE de clase I del MHC. El receptor TCR a~ se en carga de la funci6n de las celulas T auxiliares en la inmunidad humoral ~ de las celulas T asesinas en la inmunidad m ediad<. por celu las, de modo que tiene qu e recon ocer tan to el antfgeno extrano como la proteina del MHC del h ospedador. La p rotefna del MHC se une a ur_ peptido corto derivado del a ntfgeno extraiio y e: TCR reconoce entonces al peptido en un surco de la superficie del MHC. Se dice que el MHC prese;:ta el peptido al TCR (el peptido se gene ra cuan do el proteosoma fragmen ta la protefna extraiia para. producir segmentos de S a 10 moleculas de longitud). Determinado TCR tien e especificidad para un2 proteina del MHC en pa rticular, asf como para e~ antfgeno extraiio. La base para esa doble capacida · es uno de los asp ectos m as in teresantes que esta _ por definirse acerca del TCR a~. La recombinaci6n para generar cadenas de TCR funcionales se vincula con el desarrollo dellinfocit T, segu n se resume en la . La primera etapa es el rearreglo para formar una cadena TCR ~ activa, que se une a una cadena a subrogada y sin rearreglo, llamada pre-TC R a. En esta etapa . el linfocito no ha expresado las pro tefnas de superficie CD4 ni CDS. El heterodfmero pre-TCR se une entonces al complejo de seiial CD3 (vease m as adelante ). Las seiiales del complejo desencadenan varios ciclos de division celular durante los cuales se rearreglan las cadenas a y los genes CD4 y CDS se activan, de modo qu e el linfocito se convierte de CD4-CDs- a CD4+CDS+, momenta del desarrollo que se denomina selecci6n ~ y genera timocitos DP. El rearreglo de la cadena a continu a en los tim ocitos DP y el proceso de maduraci6n procede por selecci6n positiva (para complejos de TCR m aduros susceptibles de unir u n ligando) y p or selecci6n n egativa (contra com plejos que interactu an con ligandos, propios, inadecu ados ). Ambos tipos de selecci6n implican la interacci6n con protefnas del MHC. Los timocitos DP mu eren despues de -3 dfas o se convier ten en linfocitos maduros como resultado del proceso selectivo. El h eterodfmero de superficie TCR a~ presenta enlaces cruzados d urante la selecci6n positiva (lo que rescata a los tim ocitos de la muerte ). Silos timocitos sobreviven a la selecci6n negativa subsiguiente, dan origen a las clases definidas de linfocitos T que son CD4+CDS- y CD4-CDS+. El receptor de las celu las T se vincu la con un complejo de protefn as llamado CD3 que participa en la tran smisi6n de una seiial que parte de la superficie de la celula hacia el interior cu a n do su

receptor relacionado se activa por Ia union con el antfgeno. La imagen actual de los componentes del complejo receptor de una celula T se ilustran en Ia Fl ·J . El punta importante es que Ia interaccion de las regiones variables del TCR con el antfgeno provoca que las unidades ~ del complejo CD 3 activen Ia respuesta de Ia celula T. La activacion del CD3 constituye el medio por el que los TCR 0'.~ o yo senalan que han reconocido un antigeno, fenomeno comparable con Ia constituci6n del receptor de Ia celula B, en el que Ia inmunoglobulina se vincula con las cadenas de sefial Iga~ (vease la Fig. 2 3.26). Aun no se resuelve un dilema clave sabre Ia funcion de Ia celula T. La inmunidad m ediada por celulas implica dos procesos de reconocimiento; el del antfgeno extraiio requiere de la capacidad de responder a estructuras nu evas, en tanto que el de Ia proteina del MHC se limita, por supuesto, a una de las codificadas por el genoma, pero aun asf, hay muchas protefnas del MHC diferentes, de modo que en ambas reacciones de reconocimiento, Ia diversidad requerida es considerable. Tanto las celulas T auxiliares como las asesinas dependen de diferentes clases de proteinas del MHC; sin embargo, utilizan la misma reserva de segmentos genicos 0'. y ~ para ensamblar sus receptores. Incluso teniendo en cuenta la introducci6n de variaciones adicionales durante el proceso de regeneraci6n de TCR, no se sabe c6mo se ponen a Ia disposici6n suficientes versiones diferentes del receptor de celulas T como para satisfacer todas esas exigencias.

La cadena

t, es efectora

Las dos cadenas del receptor de la celula T se vinculan con los polipeptidos del complejo CD3. Las regiones variables del TCR estan expuestas en la superficie de la celula. Los dominios citoplasmaticos de las cadenas de CD3 desempeiian una funci6n efectora.

s

BE

Ellocus de histocompatibilidad mayor codifica muchos genes del sistema in munitario

Conceptos principales • Ellocus del MHC codifica las proteinas de clases I y II, asi como otras del sistema inmunitario. • Las proteinas de clase I son los antigenos de trasplante encargados de disting uir entre tejidos "propios" y "ajenos". • Una proteina de clase I del MHC actua como heterodimero con la ~ 2 microg lobulina. • Las proteinas de clase II participan en las i ntervenciones entre celulas T. • Una proteina de clase II del MHC es un heterodimero de cadenas a y ~ ·

Ellocus de histocompatibilidad mayor ocupa un pequeiio segmento de un cromosoma en el raton (que se llama locus H2 ) yen el hombre (llamado locus HLA); en dicho segmento hay muchos genes que codifican funciones relacionadas con la respuesta inmunitaria. En loci genicos individuales cuyos productos han sido identificados se encontraron muchos alelos en Ia poblacion; el locus se describe como altamente polim6rfico, es decir, que cada genoma tal vez sea diferente de los demas. Los genes que codifican otras funciones tambien se localizan en esa region. Los antfgenos de histocompatibilidad se clasifican en tres tipos, segun sus propiedades inmunitarias, ademas de que otras protefnas que se en cuentran en linfocitos y macr6fagos tienen una estructura relacionada y son importantes para la funci6n de las celulas del sistema inmunitario: Las proteinas de clase I del MHC son antigenos de trasplante y se encuentran en todas las celulas de los mamfferos. Como su nombre sugiere, se encargan del rechazo de tejidos extrafios, que se reconocen como tales en virtud de su arreglo es pecifico de antfgenos de trasplante. En el sistema inmunitario deben estar en celulas blanco para la respuesta mediada por celulas. Las protefnas de clase I se definen serologicamente (por sus propiedades antigenicas). La clase I de genes murinos codifica las protefnas H2-K y H2-D /L. Cada cepa de ratones tiene uno de varios posibles alelos para cada una de esas funciones. Las funciones de la clase I humana incluyen los antfgenos de trasplante usuales, HLAA, By C.

Las proteinas II del MHC se encuentran en Ia superficie de los linfocitos B y T, asf como de los macrofagos. Estas protefnas participan en la comunicaci6n entre celulas, necesaria para ejecutar

23.20 Ellocus de histocompatibilidad mayor codifica muchos genes del sistema inmunitario

599

Ia respuesta inmunitaria; en particular, son necesarias para Ia funcion de las celulas T auxiliares. Las funciones de la clase II murina se definen geneticamente como I-A e I-E. La region de clase II humana (tambien Hamada HLA-D) esta dispuesta en cuatro subregiones, DR, DQ, DZ/DO, y DP. Las protefnas del complemento se codifican en un locus que tambien se conoce como region S, por suero, o sea que son componentes sericos. Su funcion es interactuar con complejos antigeno-anticuerpo para dar Iugar a las lisis de celulas en Ia via clasica de la respuesta humoral. las protefnas de los loci Qa y Tla se encuentran en celulas hematopoyeticas murinas; se les conoce como antigenos de diferenciacion porque cada una se encuentra solo en un subgrupo especifico de celulas sanguineas, supuestamente relacionada con su funcion. Tienen vfnculos estructurales con las proteinas H2 de clase I y, como elias, son polimorficas. Ahora es posible relacionar los tipos de proteinas con la organizacion de los genes que las codifican. La region del MHC originalrnenre se definio por via genetica en el raton, donde Ia region clasica H2 ocupa 0.3 unidades de mapa. Aunada ala region adyacente, donde tambien se encuentran mutaciones que afectan a la funcion inmunitaria, corresponde a una region de -2 000 kb del DNA, la cual ha sido secuenciada completamente en varios mamiferos, as! como en aves y peces . Comparando estas secuencias se llega a Ia conclusion de que, en general, Ia organizacion ha sido conservada. En la Ft ~ .. se resume la organiza cion genetica del raton y del hombre. Las regiones ge-

nomicas en que se localizan los genes de clases I : II marcan los limites originales del locus (que va.:en direccion de telomero a cen tromero; de derech:: a izquierda, como se muestra en Ia figura ). los genes de la region que separa a los de clase I y los ci'=' clase II codifican para m uy diversas funciones, Ia llamada region de clase III. La definicion de I _ extremos del locus varia en funcion de Ia especi y la region que se encuentra mas alia de los genede clase I, dellado telomerico, se denomina regi ' __ extendida de clase I. Asimismo, la region que es:=. mas alia de los genes de clase II, del !ado centro· merico, se denomina region extendida de clase [ La principal diferencia entre el raton y el hombre es qu e, en el raton, la region extendida de clase ~ contiene algunos genes de clase I (H2-K). En las regiones del MHC de los mamiferos ha: varios cientos de genes, pero es posible que much~ menos sean los que propo rcionan las funciones de. MHC, como en el caso del polio, que tiene 92 kb :· solo nueve genes. Como en las comparaciones de otras familia. genicas, hay diferencias en cuanto al nu mero exacto de genes dedicados a cada funcion. El locus de: MHC muestra amplias variaciones entre individuos de modo que el numero de genes puede ser diierente en sujetos diferentes. Como regla general, sir:: embargo, el genoma de raton tiene menos gene~ H2 activos que el humano. Los genes de clase II soc exclusivos de los mamfferos (excepto un subgrupo) y como regia, en aves y peces, diferentes genes ocupan su Iugar. Hay -8 genes de clase I funcionales er: el ser humano y -30 en el raton. La region de clase I tambien incluye muchos otros genes. Las regione

Raton Codifica Ia clase I del MHC

480Mb Codifica Ia clase II del MHC

700Mb Codifica muchos genes no relacionados

860Mb Codifica Ia clase I del MHC

Clase I extendida

Region II extendida

845Mb 100 kb

700 Mb Humano

960Mb Tel6mero

La regi on del MHC cubre >2 Mb. Las prote1nas del MHC de clases I y II son codificadas por dos regiones separadas. La regio n de clase III se define como el segmento que las separa. Las regiones extendidas describen segmentos sintenicos a cada lado del grupo. La principal diferencia entre el raton y el ser huma no son los genes H2 de clase I en la region extendida, a la izquierda. Ellocus mu rino se localiza en el cromosoma 17 y el humano, en el 6.

600


de clase III son muy similares en seres humanos y ratones. Todas las protefnas del MHC son dfmeros localizados en Ia membrana plasmatica, con una parte irnportante que protruye en ella do extracelular. Las estructuras de las protefnas de clases I y II del MHC estan relacionadas, aunque presentan diferentes componentes, como se resume en Ia . ft. Los antfgenos de clase II constan de dos cadenas. a y ~- cuya combinaci6n genera una estructura global en Ia cual hay dos dominios extracelulares. Todas las protefnas de clase I del MHC constan de un dfmero entre Ia propia cadena de clase I y Ia protefna ~2-microglobulina. La cadena de clase I es un componente transmembrana de 4 5 kD con tres dominios externos (cada uno de -90 aminoacidos de longitud, uno de los cuales interactua con !a ~2-microglobulina), una region transmembrana de -40 fragmentos y un dominio citoplasmico de -30 fragmentos que reside en el interior de Ia celula. La ~2 microglobulina es una protefna secretada de 12 kD necesaria para transportar Ia cadena de

Clase I

Clase II Cadena

r:t.

Cadena

~

clase I a Ia superficie de Ia celula. Los ratones que carecen del gen ~2 de Ia microglobulina no tienen antfgeno de clase I del MHC en Ia superficie celular. La organizaci6n de los genes de clase I, resumida en Ia .b 2~ ., ., coincide con !a estructura protefnica . El primer exon codifica una secuencia sefial (escindida de la protefna durante el paso por Ia membrana). Los siguientes tres exones codifican a cada uno de los dominios externos, mientras que el quinto hace lo propio con el dominio transmembrana. Los ultimos tres exon es, bastante pequ efios, codifican juntos al dominio citoplasmico. La unica diferencia en los genes de antfgenos de trasplante humanos es que su dominio citoplasmico es codificado solo por dos exones. El ex6n que codifica el tercer dominio externo de los genes de clase I esta muy conservado respecto de los otros, y quiza represente la region que interactua con Ia ~ 2 microglobulina, lo cual explica la necesidad de una estructura con stante. Ese dominio tambien muestra homologfas con los dominios de la region constante de las inmunoglobulinas. .:.Que se encarga de generar el alto grado de polimorfismo de esos genes? Casi todas las variaciones de secuencias entre alelos ocurre en el primero y segundo dominios externos, a veces asumiendo Ia forma de un grupo de sustituciones de bases en una pequefia region. Un mecanismo implicado en su ge neracion es Ia conversion entre genes de clase I; hay tanto seudogenes como genes funcionales. El gen de Ia ~2 microglobulina se localiza en un cromosoma separado; tiene cuatro exones, el primero de los cuales codifica u na secuencia sefial; el segundo, para Ia mayor parte de Ia proteina (de los aminoacidos 3 a 95); el tercero para los ultimos cua tro aminoacidos y parte del remolque no traducido, y el resto, para Ia parte restante del remolque.

Clase I Clase II Clase ~

r:t.

II~

-··

microglobulina Ex ones

~

Los antlgenos de histocompatibilidad de clases I y II tienen una estructura relacionada. Los antlgenos de clase I constan de un solo polipeptido (a) con tres do minios externos (al, a2, a3) que interactua con la microglobulina ~2 W2m). El antlgeno de clase II consta de dos polipeptidos (a y ~). cada uno con dos dominios (al y a 2, ~1 y ~2 ) y una estructura global similar. fiGU

Extracelulares Transmembrana

- No traducidos -:- Citoplasmaticos

c; Cada clase de genes del MHC tiene una organizaci6n caracterlstica en que los exones represe ntan dominios protelnicos individuates.

23.20 El locus de histocompatibilidad mayor codifica muchos genes del sistema in munitario

601

La longitud de Ia ~2 microglobulina es similar a Ia de un gen V de inmunoglobulina, con ciertas similitudes en cuanto a constituci6n de aminoacidos, y algunas homologias (limitadas) de la secuencia de nucle6tidos entre la ~2 microglobulina y los dominios constantes de Ig o el tercer dominio externo del gen de tipo I. Todos los grupos de genes descritos en este capitulo pueden haber descendido de un ances tro comun que codificaba un dominio primitivo.

fD1

La inmunidad innata utiliza las vias de senal conservadas

Conceptos principales • La inmunidad innata se desencadena por receptores que reconocen segmentos (PAMP) altamente conservados en bacterias u otros agentes infectantes. • Suelen usarse receptores similares a tragamonedas para activar la via de respuesta. • Las vias se conservan mucho de invertebrados a vertebrados y se encuentra una via analoga en las plantas.

La respuesta inmunitaria descrita en este capitulo comprende un conjunto de reacciones que se presentan ante un pat6geno por selecci6n de linfocitos (celulas BoT) cuyos receptores (anticuerpos o TCR) tienen gran afinidad por el pat6geno. La base de este proceso selectivo es la generaci6n de un numero muy considerable de receptores, como para dar Iugar a una elevada posibilidad de reconocer una molecula extraiia. Los receptores que reconocen las proteinas propias del cuerpo son motivo de exclusion en etapas tempranas del proceso . La activaci6n de los receptores de las celulas B desencadena las vias de la respuesta humoral, en tanto que la de receptores de las celulas T, desencadena las vias

I 1

Organismo

Pat6geno

Localizaci6n

Todas las bacterias

Formilmetionina

Casi todas las proteinas

La mayor parte de las bacterias

Peptidoglucano

Pared ce lular

Bacterias gramnegativas

Lipopolisacarido

Pared celular

Levaduras

Zymosan

Pared celular

Los patrones moleculares relacionados con pat6genos (PAMP) son compuestos comunes a muchas variedades de bacterias o levaduras; se exponen en caso de infecci6n.

602

CAPITU LO 23 Diversidad inmunitaria

de Ia respuesta mediada por celulas. La respu _ global ante un antfgeno a traves de Ia selecci61. : receptores de los linfocitos se denomina inmu dad adaptativa (o inmunidad adquirida).-= general, Ia respuesta se monta durante varios · despues de Ia activaci6n inicial de las celulas B - que reconocen el pat6geno extraiio. El organis. conserva una memoria de respuesta que le pern' ~ reaccionar mas rapidamente si vuelve a expone. al mismo pat6geno. Los principios de Ia inmuni · ;_ adaptativa son similares en todos los vertebrad aunque varian en detalles. Otro tipo de respuesta inmunitaria ocurre rapidamente y se encuentra en una mayor varie ·= de animales (entre otros, los que no tienen iil.I"L:.. · nidad adaptativa). La inmunidad innata depen:. del reconocimiento de ciertos patrones predefinid en los pat6genos extraiios, los cuales se han c :-. servado pat6genos porque son esenciales para :funci6n, p ero no se encuentran en las eucario·:_ mas elevadas. Por lo general, el segmento es rec nocido por un receptor dedicado a desencaden2 la respuesta innata ante una infecci6n, el cual : : encuentra en celulas como los neutr6filos y los m<:cr6fagos, que hacen que el pat6geno sea fagocitac y eliminado. La respuesta es rapida porque el co:::junto de receptores ya esta en las celulas y no tie : que amplificarse por selecci6n, esta muy conserva · ' y se encuentra en todo tipo de organismos, desC:: moscas hasta el ser humano. Cuando !a respuesc:_ innata puede enfrentar eficazmente una infecci6::: !a respuesta adaptativa nose desencadena. Hay cieta superposici6n entre las respuestas porque activaalgunas de las mismas vias, de manera que las ceh.ilas activadas por la respuesta in nata pueden partiepar despues en !a respuesta adaptativa. Los segmentos que desencadenan Ia inmunida.:. innata suelen denominarse patrones moleculare-s relacionados con pat6genos (PAMP), yen la '"I.J · se observa que estan ampliamente distribuid : en una amplia gama de organismos. La formilmetionina se usa para iniciar casi todas las proteina_ bacterianas, pero no se encuentra en las eucariota _ El peptidoglucano de la pared celular es exclusi · de las bacterias, en tanto que ellipopolisacarido (LPS) es un componente de !a membrana exteroa de !a mayor parte de las bacterias gramnegativas. que tambien se conoce como endotoxina; causa del sfndrome de choque septico. Un descubrimiento clave de la naturaleza de la inmunidad innata fue Ia participaci6n de los receptores de peaje (TLR); el que se relaciona con e: receptor ILl de los mamiferos, desencadena la via en el genero Drosophila, donde controla el desarrollo dorsal-ven tral. Esto lleva a Ia activaci6n del factor

de transcripci6n dorsal, miembro de Ia familia Rei que se vincula con el factor NF-K.B de los marniferos. La via de Ia inmunidad innata es paralela a Ia via de peaje, con componentes similares. De hecho, uno de los primeros indicios de la naturaleza de la inmunidad innata en la mosca fue el descubrirniento del factor de transcripci6n Dif (factor inmunitario relacionado-dorsal), que es activado por una de esas vfas. Las moscas no tienen sistema de inmunidad adaptativa pero son resistentes a las infecciones microbianas porque sus sistemas inmunitarios innatos desencadenan la sintesis de potentes peptidos antimicrobianos, de los cuales se han identi:ficados siete diferentes en el genero Drosophila, que se sintetizan en el cuerpo graso (6rgano equivalente a! hfgado ); dos de los peptidos son antirnic6ticos y cinco actuan sobre todo en bacterias. La forma en que generalmente actuan es asesinar el organismo blanco por permeabilizaci6n de su membrana. Estos peptidos se codifican en genes cuyos promotores responden a los factores de transcripci6n de la familia Rei. En Ia I se resumen los componentes de las vfas innatas del genero Drosophila. En el genero Drosophila actuan dos vfas de respuesta innata; una responde principalmente a bongos, en tanto que Ia otra hace lo propio sobre todo contra bacterias gramnegativas; las bacterias grampositivas pueden desencadenar am bas vfas. En la se resumen los pasos de cada una. Los bongos y las bacterias grampositivas activan una cascada que genera peptidos activadores de TLR via similar a Ia de NF-K.B. El receptor de peaje activa al factor de transcripci6n Dif (pariente del NF-K.B), que en ultima instancia conduce ala activaci6n del peptido antimic6tico, drosomisina. Las bacterias gramnegativas desencadenan una vfa a traves de un receptor diferente que activa el factor de transcripci6n Relish, que lleva a la producci6n del peptido bactericida, actacina. Esta vfa se denomina Imd por uno de sus componentes, una protema que tiene un "dominio mortal" relacionado con los encontrados en las vfas de la apoptosis. Los agentes clave de la respuesta a las bacterias son protefnas Uamadas PGRP debido a su gran afinidad con los peptidoglucanos bacterianos, de las cuales hay dos tipos. Las PGRP-SA son protefnas extracelulares cortas que probablemente actuan por activaci6n de proteasas que desencadenan Ia vfa de peaje. Las PGRP-LC son protefnas transmembrana con un dominio extracelular PGRP pero su funci6n exacta se desconoce. La respuesta inmunitaria innata esta muy conservada. Los ratones resistentes al choque septico presentan mutaciones en el receptor de peaje TLR4

La bacteria tiene PAMP

Peptidos activados LLR extracelular (Region rica en leucina) Receptor de peaje (TLR)

Factor de transcripci6n de Ia familia Rei Peptidos bactericidas y antimic6ticos Los peptidos permeabilizan Ia bacteria

J La inmunidad innata es dese ncadenada por PAMP. En la mosca da lugar a la producci6n de peptidos que activan los receptores de peaje. Los receptores conducen a una via que activa un factor de transcri pci6n de la familia Rel. Los genes blanco para ese factor incluyen peptidos bactericidas y antimic6ticos, que actuan por permeabilizaci6n de La membrana del organismo pat 6geno.

Hongos

Bacterias

Bacterias

\ ::::z"r""' ! Protea~

Peptidos

(\f)

PGRP-SA

~. '

Peaje

~

I

Receptor de peaje (TLR)

Via similar a Ia de NF-KB

~ Dorsal

J ~

Via lmd

~ Factor de transcripci6n de Ia familia Rei

Peptidos . . bactericidas y Drosom!clna antimic6ticos

Relish

~

~ Alacina

Una de las vias de inmunidad in nata del genera Drosophila tiene relaci6n estrecha con la via para La activaci6n

NF-x:B de los mamiferos; La otra tiene componentes relacionados con las vias de la apoptosis.

23.21 La inmunidad innata utiliza las vias de sefial conservadas

603

cuando son tratados con LPS . Un hom6logo hu mano del receptor de peaje puede activar algunos genes de respuesta inmunitaria, lo cual sugiere que la vfa de Ia inmunidad innata puede tambien fu ncionar en el hombre. La vfa de direcci6n descendente respecto de TLR suele ser similar en todos los casos y por lo generallleva a Ia activaci6n del factor de transcripci6n NF-KB. Aun nose sabe si Ia vfa de direcci6n ascendente se conserva y, en particular, si los PAMP actuan por generaci6n de ligand as que a su vez activan los TLR o si podrfan interactuar directamente con eUos. La vfa de direcci6n ascendente de TLR es diferente en mamfferos y moscas porque los pat6genos activan directamente los TLR de los mamfferos. En el caso del LPS, el pat6geno se une a Ia protefna CD 14 de superficie, lo cual permite que CD14 active a TLR4 y desencadene Ia vfa de respuesta innata. Hay -20 receptores enla clase TLR del genoma humano, indicio de cuantos patogenos pueden desencadenar la respuesta innata. Las plantas tienen amplios mecanismos de defensa, entre los cuales hay vfas ana!ogas a Ia res puesta innata en animales. Es aplicable el mismo principia de que los PAMP son segmentos que identifican al agente como patogeno. Las protefnas que responden a los patogenos son codificadas por una clase de genes Hamada de resistencia a la enfermedad, muchos de los cuales codifican para receptores que comparten una propiedad con la clase TLR de receptores en animales, el dominio extracelular tie ne un segmento llamado region rica en leucina (LLR). El mecanismo de respuesta difiere del de las celulas animales y se dirige ala activaci6n de una cascada cinetica de protefnas activadas por mitogenos (MAPK). Muchos pat6gen os diferentes activan la misma cascada, lo cual sugiere que diversas interacciones pat6geno-receptor convergen en Ia activacion del primer MAPK, o antes.

f!D

Resumen

Las inmunoglobulinas y los receptores de celulas T son protefnas con funciones analogas en la participacion de las celulas B y Ten el sistema inmu nitario. Una Ig o una protefna TCR se genera por rearreglo del DNA en un solo linfocito; la exposicion a un antfgeno reconocido por Ig o por TCR lleva a la expansion clonal para generar muchas celu las con Ia misma especificidad que Ia original. Muchos rearreglos ocurren en etapas tempranas del desarrollo del sistema inmunitario, de modo que se crea un gran repertorio de celulas de diferentes especificidades . 604

CAPITULO 23 Diversidad inmu nitaria

Cada protefna inmunoglobulina es un tetran:::· ro que contiene dos cadenas ligeras identicas y C. cadenas pesadas identicas. Un TCR es un dfme que contiene dos cadenas diferentes. Cada cade- polipeptfdica se expresa por un gen creado por e:-. lace de uno de muchos segmentos V a traves ·= segmentos D y J con uno de u nos cuantos segme;:.tos C. Las cadenas Ig L (K o A) tienen la estrucr.: ra general de V-J-C; las lg H tienen una estructu::-· V-D-J-C, en tanto que TCR a. y y tienen com ...nentes del tipo de las caden as lg L; TCR 8 y ~ s similares a las cadenas H de Ig. Cada tipo de cadena es codificado por un gr-grupo de genes V separados del grupo de segmem D, J y C. Los numeros de cada tipo de segmento y s-_ organizaci6n son diferentes para cada tipo de cadena, pero el principia y el mecanismo de Ia recomL nacion parecen ser iguales . Las mismas secuencicic de consenso de nonamero y h eptamero participa::. en cada recombinacion; Ia rea ccion siempre inc plica union de un consenso con espaciamiento d:23 bp y un consenso con espaciamiento de l2 bp La reaccion de escision es catalizada por las prot :nas RAG l y RAG2, en tanto que Ia de union lo ~ por Ia misma vfa NHEJ que repara las roturas d~ doble cadena en las celulas. El mecanismo de accion de las protefnas RAG tiene relacion con :c. acci6n de recombinacion especffica de sitio catalizada por las resolvasas. Por Ia u nion de diferentes segmentos V, D, : J a un segmento C se genera una gran diversida
matica, pero se desconoce su funcion. En una etapa previa de Ia produccion de Ig, se pasa de la sfntesis de una version unida a membrana de Ia protefna a una version de secrecion. Esos cambios se logran por escision alterna del producto de transcripcion. La inmunidad innata es una respuesta desencadenada por receptores cuya especificidad esta predeterminada para ciertos segmentos comunes en bacterias y otros agentes infecciosos. El receptor que desencadena Ia vfa es por lo general miembro de la clase de peaje y Ia vfa simula la desencadenada por esos receptores durante el desarrollo embrionario. La vfa culmina con Ia activacion de factores de transcripcion que dan Iugar ala expresion de genes cuyos productos desactivan al agente infeccioso, en general por permeabilizacion de su membrana.

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Ell

Ill

Los genes de las inmunoglobulinas se ensamblan en los linfocitos a partir de sus constituyentes

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La exclusion alelica es desencadenada por rearreglo producti vo

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La recombinacion inmunitaria utiliza dos tipos de secuencias de consenso

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f!IEI

El cambia se debe a una nueva reacci6n de recombinaci6n

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La mutacion so matica genera otras diferencias en e. raton y el se r humano

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fJIB

La desaminasana de citidina y la glucosilasa de uracilo inducen la mutaci6n somatica

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am

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f!IJ!

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romotores y potenciadores ________ES_O _U_E_M_A_D_E_L_CA_P_i_TU_L_o_j Introducci6n Las polimerasas de RNA eucari6ticas constan de muchas subunidades

1111

• La polimerasa de RNA I sintetiza RNAm en el nucleolo. • La polimerasa de RNA II sintetiza RNAm en el nucleoplasma. • La polimerasa de RNA III sintetiza RNA pequeiios en el nucleoplasma. • Todas las polimerasas de RNA eucari6ticas tienen -12 subunidades y son agregados de >500 kD. • Algunas subunidades son comunes a los tres tipos de polimerasas de RNA. • La subunidad mas grande de la polimerasa de RNA II tiene un dominio carboxilo terminal (CTO) constituido por multiples repeticiones de un heptamero.

Los elementos promotores se definen por mutaciones y vestigios

IIIII

• El promotor de la polimerasa de RNA I consta de un promotor medular y un elemento de control en flujo ascendente (UPE). • El factor UBF1 envuelve al DNA con una estructura proteinica para acercar el centro y el UPE. • El SL1 incluye el factor TBP que participa en el inicio por las tres polimerasas. • La polimerasa de RNA se une al complejo UBF1-Sl1 en el promotor medular.

IJII

El TFmB es el factor de encargo para los promoto res de la Pol III • El TF111A y TF111 Cse unen a la secuencias de consenso y permiten al TF111 B unirse en los puntas de inicio.

La TBP es un factor universal

La TBP se une al DNA de fo rm a inusual .. El TBP se une a la caja TATA en el su rco me nor del DNA • Forma una silla de montar en to rno al DNA y lo dobla -80 o. • Algunos de los TAF simulan histonas y podrian formar una estructura parecida a un octamero de histona.

EIJID

El apa rato basa l se ensambla en el promotor • La uni on de TF11 Da la caja TATA es el primer paso del inicio. • Otros factores de transcripci6n se unen al com plejo en un arden definido, aumentando, asi, Ia longitud de Ia region protegida en el DNA. • Cuando la polimerasa de RNA II se une al com plejo, empieza la transcripci6n.

La polimerasa de RNA III utiliza promotores en flujo ascendente y descendente • La polimerasa de RNA III tiene dos tipos de promotores. • Los promotores internos tienen secuencias de consenso cortas dentro de la unidad de transcripci6n y producen inicio a una distancia fija de flujo ascendente. • Los promotores de flujo ascendente contienen tres secuencias de consenso cortas en flujo ascendente respecto del punta de inicio, donde se unen los factores de transcripci6n.

El punta de inicio de la polimerasa de RNA II • La polimerasa de RNA II requiere de fa ctores generales de transcripci6n (llamados TF11 X) para iniciar la transcripci6n. • Los promotores de la polimerasa de RNA II tienen una secuencia corta conservada Py, CAPy5 (el InR de inicio) en el punta de inicio. • La caja TATA es un componente comOn de los promotores de la polimerasa de RNA II y esta constituido por un octamero rico en A-T localizado -25 bp en flujo ascendente respecto del punta de inicio. • El OPE es un componente comOn de los promotores de la polimerasa de RNA II que no tiene caja TATA. • Un promotor medular de la polimerasa de RNA II incluye el In R y la caja TATA o un OPE. • La TBP constituye un componente del factor de posicionamiento necesaria para que cada tipo de polimerasa de RNA se una a su promotor. • El factor para la polimerasa de RNA II es TF,p, que consta de TBP y 11 TAF, con una masa total de -800 kD.

• Los promotores se definen por su capacidad para provocar la transcripci6n de una secuencia agregada a un sistema de prueba apropiado in vitro o in vivo.

La poli me rasa de RNA I tiene un promotor bipartido

• El TF10 B tiene a TBP como una de sus subunidades y permite la union de la polimerasa de RNA.

fJIII

El inicio va seguido de la depuraci6n del promotor • Para disolver el DNA y permitir el traslado de la polimerasa, se necesitan TF11 E y TF11 H. • La fosforilaci6n del CTD podria ser necesaria para que se inicie la elongaci6n. • Para terminar un inicio abortive, se requiere de fosforilaci6n adicional del CTD en algunos promotores. • El CTD puede coordinar el procesamiento del RNA con La transcripci6n.

Continua en Ia siguiente pdgina

609

Una conexi6n entre transcripci6n y reparaci6n • Los genes transcritos se reparan de manera preferencial cuando se dana el DNA. • El TF 0 H proporciona ligamiento para un complejo de enzimas de reparaci6n. • Las mutaciones del componente XPD de TFnH causan tres t1pos de enfermedades humanas.

Los potenciadores contienen los mismos elementos encontrados en los promotores

Los elementos de secuencia corta se unen a activadores

Los potenciadores actuan aumentando la concentraci6n de los activadores cerca de . promotor

• Los elementos de secuencia corta conservados se dispersan en la region que precede al punta de inicio. • Los elementos en flujo ascende nte aumentan la fre cuencia del inicio. • Los factores que se une n a ellos para estimular la transcripci6n se llaman activadores.

La estructura del promotor es flexible, pero el contexto puede ser importante • Ningun elemento individua l de fl ujo ascendente es indispensable para la fu nci6n del promotor, si bien uno o mas deben estar presentes para que el inicio sea eficaz. • Algunos elementos son reconocidos por mu chos factores, y un factor utilizado en un promotor en particular puede ser determinado por el co ntexto de los otros factores unidos.

Los potenciadores contienen elementos bidireccionales que facilitan el inicio • Un potenciador activa al promotor mas cercano, es decir, a cualquier distancia en flujo ascendente o descendente respecto del promotor. • Un UAS (secuencia de activador ascendente) de las levaduras se comporta como potenciador, pe ro funciona s6lo en flujo ascendente respecto del promotor. • En potenciadores y promotores se encuentran elementos de secuencia similares. • Los potenciadores forman complejos de activadores que actuan directa o indirectamente con el promotor.

Ill

Introducci6n

Para que empiece la transcripcion se necesita Ja enzima polimerasa de RNA y factores de transcripcion. Cualquier proteina necesaria para el inicio de la transcripcion pero que, en si, no es parte de la polimerasa de RNA, se define como factor de transcripcion, muchos de los cuales actuan reconociendo sitios de accion cis en el DNA. La union al DNA, sin embargo, noes su unico medio de accion . Un factor puede reconocer a otro, ala polimerasa de RNA o, tal vez, incorporarse a un complejo de inicio solo en presencia de varias otras proteinas. La prueba final para la participaci6n del aparato de rranscripcion es funcional, debe requerirse de una protefna para que Ia transcripcion tenga lugar en un promotor o conjunto de promotores especffico. Una diferencia significativa en Ia transcripcion del RNAm eucariotico y el procariotico es que el inicio en un promotor eucariotico implica a gran 610

CAPITULO 24 Promotores y potenciadores

• Los potenciadores estan hechos del mismo tipo c ~ elementos de secuencia que se encuentran en to: promotores. • La densidad de los componentes de secuencia es - en el potenciador que en el promotor.

• Los potenciadores suelen funcionar s6lo en configuraci6n cis con un promotor diana. • Es posible hacer que los potenciadores funcione- o· configuraci6n trans por ligamiento del DNA cont~ en el promoto r diana co n DNA conte nido en el potenciador mediante un puente proteinico o poconcatenaci6n de las dos moleculas. • El principia es que un potenciador funciona en cualquier situaci6n en que esta constrenido a la ~ proxi midad que el promotor.

La expresi6n genetica se vincula con la desmeti laci6n • La desmetilaci6n en el extrema 5' del gen es necs;para su transcripci6n .

Los islotes G son dianas reguladoras • Los islotes G rodean a los promotores de gene: :-expresi6n constitutiva donde no estan metilados. • Los islotes G tambien se encuentran en los promotores de algunos genes regulados por tejid:: • Hay -29 000 islotes G en el genoma humano. • La metilaci6n de un islote G impide la activac' : un promotor en su interior. • La union de proteinas a pares de G metilados r€5 _ en represi6n.

Resumen

numero de factores que se unen con diversos -:: mentos que actuan en configuracion cis. El protor se define como la region que contiene todos sitios de union, esto es, todoslos sitios de union - _ pueden sostener la transcripcion con la eficacia ::. mal y el control apropiado. Asi, la principal cara.:- _ ristica de un promotor de un RNAm eucariotic Ja localizacion de los sitios de union para los fa u ~ - de transcripcion. La rnisma polimerasa de RK _.:_ une cerca del punto de inicio, pero no hace comc...:directo con Ia region extendida de flujo ascende:del promotor. Por el contra rio, los promotores ":'.:. terianos descritos en el Capitulo ll , Transcripc se definen, en gran medida, segun el sitio de m:. de Ia polin1erasa de RNA en Ia vecindad inmed'.::. del punto de inicio. La transcripcion en celulas eucarioticas se de en tres clases, cada una transcrita por una merasa de RNA diferente: L.

• La polimerasa de RNA I transcribe RNAr. • La polimerasa de RNA II transcribe RNAm. • La polimerasa de RNA III transcribe RNAt y otros RNA pequefi.os . Para el inicio se necesitan factores de transcripci6n, pero no despues. En el caso de las tres enzimas eucari6ticas, los factores, mas que las polimerasas de RNA mismas, son los principales encargados de reconocer a! promotor, lo cual clifiere de Ia polimerasa de RNA bacteriana, en cuyo caso, es la enzima Ia que reconoce las secuencias promotoras. Para todas las polimerasas de RNA eucari6ticas, los factores crean una estructura en el promotor de modo de proporcionar Ia diana que reconoce Ia enzima. Para las polimerasas de RNA I y III, esos factores son relativamente sencillos, pero para Ia polimerasa II, forman un grupo de dimensiones considerables conocido colectivamente como basal, o en general, como factores. Los factore s basales se unen con la polimerasa de RNA II para forma r un complejo que rodea el punto de inicio y determinan su sitio; por otra parte, junto con la polimerasa de RNA constituyen el aparato de transcripci6n basal. Los promotores de las polimerasas de RNA I y II se encuentran (principalmente) en flujo ascendente respecto del punto de inicio, pero algunos de la de RNA III estan en flujo descendente. Cada promotor incluye conjuntos caracterfsticos de secuencias cortas conservadas reconocidas por la clase apropiada de factores. Las polimerasas de RNA I y III reconocen cada una un conjunto relativamente restringido de promotores y depend en de un pequefi.o numero de factores rios. Los promotores utilizados por la polimerasa de RNA II muestran mas variacion en secuencias y su organizacion es modular. Los elementos de secuencia corta reconocidos por factores de transcripcion se encuentran en flujo ascendente respecto del punto de inicio. Esos sitios de accion con configuracion cis suelen estar dispersos en una region >200 bp . Algunos de esos elementos y los factores que los reconocen son comunes; se encuentran en una variedad de promotores y se usan de manera consecuriva, mientras que otros son especfficos, identifican ciertas clases de genes y su uso es regulado . Los elementos se presentan en diferentes combinaciones en cada promotor. Todos los promotores de la polimerasa de RNA II tienen elementos de secuencia cerca del punto de inicio, los cuales se unen al aparato basal y esta] lecen dicho sitio. Las secuencias mas alejadas ·~n flujo ascendente deterrninan si el promotor se expresa en todos los tipos de celulas 0 es regulado de manera especffica . Los promotores que se expresan de manera constitutiva (sus genes a veces se llaman

genes domesticos) tienen elementos de secuencia de flujo ascendente reconocidos por activadores ubimos. Ninguna combinacion de elemento/factor es un componente indispensable del promotor, lo cual sugiere que el inicio de Ia polimerasa de RNA puede ser promovido de muchas forma s. Los promotores qu e se expresan solo en ciertos momentos o Jugares tienen elementos de secuencia que requieren de activadores disponibles solo en esos momentos o lugares. Los componentes de secuencia del promotor se definen de manera operacional por Ia demanda de que deben estar ubicados en las cercanfas del punto de inicio y de que se necesitan para este. El potenciador es otro tipo de sitio involucrado en el inicio, el cual se identifica por secuencias que estimulan el inicio, pero que se localizan a considerable distancia del punto de inicio. Los elementos potenciadores suelen ser diana s de la regulacion temporal especffica de tejido. En la se muestran las propiedades generales de promotores y potenciadores. Los componentes de un potenciador se parecen a los del promotor, ya que constan de diversos elementos modulares, sin embargo, estan muy apretados y actuan como los del promotor. El potenciador no necesita estar cerca del punto de inicio. Las protefnas unidas a elementos del potenciador interactuan con protefnas unidas a elementos del promotor. La diferencia entre promotores y potenciadores es operativa, mas que implicar una cliferencia fundamental en el mecanismo. Esta perspectiva es reforzada por el hech o de que algunos tipos de elementos se encuentran tanto en promotores como en potenciadores. La transcripcion eucariotica muy a menudo esta bajo regulacion positiva. Con control especffico del tejido se proporciona un factor de transcripcion que activa a un promotor o a un conjunto de promotores que contienen una secuencia diana comun; Ia regulacion o represion especffica de un promotor diana es menos frecuente. En general, una unidad de transcripcion eucariotica contiene un solo gen, y la terminacion tiene Iugar una vez concluida la region de codificaci6n. La terminacion carece de Ia importancia reguladora necesaria para sistemas procarioticos. Las polimerasas de RNA I y III terminan en secuencias y reacciones definidas, pero no esta clara Ia forma de terminacion de Ia polimerasa de RNA II. No obstante, el suceso significativo en Ia generaci6n del extrema 3' de un RNAm n o es propiamente un suceso de terrninacion, resulta de una reaccion de escisi6n en el producto primario de transcripcion (vease Capitulo 26, Escision, empalme y procesamiento del RNA). 24.1 Introducci6n

611

Potenciador

. - - 100bp-+Contiene varios elementos de secuencia, muy juntos, que se unen a factores de transcripci6n

• - 200 bp en flujo ascendente ~ respecto del punta de inicio La separaci6n entre potenciador Contiene elementos de secuencia disperses y promotor puede que unen factores de transcripci6n ser de varias kb Solo Ia localizaci6n de los elementos muy cercanos (<50 bp) al punta de inicio de Ia transcripci6n es fija

Un gen comun transcrito por la polimerasa de RNA II tiene un promotor que, en flujo ascendente, parte del sitio donde se inicia la transcripci6n, el cual contiene varios elementos de secuencia cortos (<10 bp) que se unen a factores de transcripci6n disperses en >200 bp. Un potenciador con un arreglo mas estrechamente empaquetado de elementos que tambien se unen a los factores de transcripci6n puede localizarse a varios kb de distancia. (El DNA puede ser ensortijado o estar reestructurado desde otro punta de vista, de manera que los factores de transcripci6n de uno y otro interactuen para constituir un gran complejo proteinico.)

BfJ

Las polimerasas de RNA eucari6ticas constan de muchas subunidades

Conceptos pri nci pales • La polimerasa de RNA I sintetiza RNAm en el nucleolo. • La polimerasa de RNA II sintetiza RNAm en el nucleoplasma. • La polimerasa de RNA III sintetiza RNA pequefios en el nucleoplasma. • Todas las polimerasas de RNA eucari6ticas tienen -12 subunidades y son agregados de >500 kD. • Algun as subunidades son comunes a los tres tipos de polimerasas de RNA. • La subunidad mas grande de la polimerasa de RNA II tiene un dominio carboxilo terminal (CTD) constituido por multiples repeticiones de un heptamero .

Las tres polimerasas de RNA eucari6ticas se ubican de manera diferente en el nucleo, en funci6n de los genes que transcriben. La actividad preponderante es la de Ia enzima polimerasa de RNA I, que reside en el nucleolo y se encarga de la transcripci6n de genes que codifican RNAr; contribuye en la mayor parte de las s[ntesis de RNA celular (en cuanto a cantidad). La otra enzima primordial es Ia polimerasa de RNA II, localizada en el nucleoplasma (Ia parte del nucleo que no es el nucleolo) . Representa prckticamente toda Ia actividad celular restante y se encarga de sintetizar el RNA nuclear heterogeneo (RNAhn), precursor del RNA. 612


La polimerasa de RNA liTes una actividad e~ matica menor. Esta enzima nucleoplasmica sinte"RNAt y otros RNA pequeiios. Todas las polimerasas de RNA eucari6tica __ protefnas grandes que aparecen como agregc.: >500 kD y por lo general t ienen - 12 subunida_ La enzima codificada puede llevar a cabo Ia L -..=cripci6n dependiente de un molde del RNA ~ _ no iniciarla selectivam ente en los promotore_ _ constituci6n general de una enzima polimera RNA II eucari6tica, como se tipifica en Sacchasor:cerevisiae, se ilustra en Ia . Las dos subL dades mas grandes son hom6logas de las subu.U: des ~ y Wde la polimerasa de RNA bacteriana; de Ia subunidades restantes son comunes a todfu polimerasas de RNA esto es, son tambien co ::nentes de la I y Ia ill. La subunidad mas grande de Ia polimerasRNA II tiene un dominio carboxilo ter · (CTD) constituido por multiples repeticione: una secuencia de consenso de siete aminoaci.. que es exclusiva de dicha polimerasa. Hay -26 ~ peticiones en levaduras y casi 50 en mamifero_ numero de repeticiones es importante porque deleciones que suelen eliminar mas de la mitac las repeticiones, son mortales (en levaduras) . El uede estar altamente fosforilado en moleculas _ serina o treonina, fen6meno que forma parte de reacci6n de inicio (vease Ia secci6n 24.11, El ir;__ va seguido de Ia eliminaci6n del promotor). Las polimerasas de RNA de mitocondrias y -: roplastos son mas pequeiias y simulan Ia polime_-, de RNA bacteriana, mas que alguna de las enzi~ nucleares. Por supuesto, los genomas de los orgo_ los son mucho mas pequefios, Ia polimerasa resi ~

=_

/

kD 200

~

100

50

Relacionada con Ia subunidad W bacteriana Une DNA Tiene CTD = (YSPTSPS)n [levadura, n = 26; raton , n =52] Relacionada con Ia subunidad bacteriana Une nucle6tidos

~--Relacionada

~

con Ia subunidad a.

bacteriana I

I

1

1

25

-Comun a las Ires polimerasas -Comun a las Ires polimerasas -Comun a las Ires polimerasas

1 Algunas subunidades son comunes a todas las clases de polimerasas de RNA eucari6ticas y otras se relacionan con la polimerasa de RNA bacteriana.

te necesita transcribir relativamente pocos genes y el control de la transcripcion posiblemente sea mucho mas sencillo (si es que existe). Asf, esas enzimas son analogas de las de fagos, que no necesitan Ia capacidad para responder a un ambiente mas complejo. Una distincion practica importante entre las enzimas eucarioticas depende de su respuesta a! octapeptide dicfclico a amanitina. Basicamente en todas las celulas eucarioticas, Ia actividad de la polimerasa de RNA es inhibida n1pidamente por las bajas concentraciones de amanitina alfa, pero la polimerasa de RNA I no se inhibe. La respuesta de Ia polimerasa de RNA III a Ia amanitina alfa esta menos bien conservada y en celulas animales es 'nhibida por altas concentraciones, si bien en levaiuras e insectos nose inhibe.

Los elementos promotores se definen pa r mutaciones y vestigios Concepto principal • Los promotores se definen por su capacidad para provocar la transcripci6n de una secuencia agregada a un sistema de prueba apropiado, in vitro o in vivo.

El primer paso de la caracterizacion de un promotor es definir la longitud global del DNA que contiene :odos los elementos de secuencia necesarios. Para eUo, se necesita un sistema de prueba en el que .m promotor se encargue de Ia generacion de un producto facilrnente analizable. Tradicionalmente ;.e han aplicado varios sistemas: • En el sistema del oocito se inyecta un molde de DNA en el nucleo de un oocito de

Xenopus laevis. El producto de transcripcion del RNA puede recuperarse y analizarse. La principallimitacion de este sistema es que se restringe a las condiciones que prevalecen en el oocito. Permite la caracterizacion de secuencias de DNA pero no de los factores que normalmente se unen ellas. • Los sistemas de transfecci6n permit en introducir DNA exogeno a una celula cultivada y expresada. El sistema es genuinamente in vivo, en el sentido de que Ia transcripcion Ia !leva a cabo el mismo aparato encargado de expresar el genoma propio de Ia celula. Sin embargo, difiere de Ia situacion natural porque el molde esta constituido por un gen que normalmente no serfa transcrito en Ia celula hospedadora. La utilidad del sistema puede ampliarse utilizando diversas celulas hospedadoras. • Los sistemas transgenicos implican agregar un gen a Ia linea germinativa de un animal. La expresion de un transgen puede ser seguida en uno o todos los tejidos del animal. Algunas limitaciones comunes son aplicables a los sistemas transgenicos y a Ia transfecdon, pues el gen adidonal a menu do esta presente en multiples copias y se integra en una localizacion diferente del gen endogeno. Las discrepancias en Ia expresion de un gen in vitro y su expresion como transgen pueden proporcionar informacion importante acerca de la participaci6n del contexto genomico del gen. • El sistema in vitro adopta el abordaje clasico de purificar todos los componentes y manipular las condiciones hasta que se observa un inicio confiable. Por inicio "confiable" se entiende Ia produccion de un RNA que inicie en el sitio correspondiente del extrema 5' del RNAm (o los precursores RNAr o RNAt), lo cual, en ultima instancia, permite caracterizar los elementos de la secuencia individual en el promotor y los factores de transcripcion que se le unen. Cuando se analiza un promotor, es importante que solo la secuencia del promotor cambie. se muestra que siempre se coloque En Ia Ia misma secuencia larga, ascendente, cerca del promotor para asegurar que se encuentre siempre en el mismo contexto. La terminacion no ocurre propiamente en sistemas in vitro, de modo que el molde se corta a cierta distancia del promotor (por lo general -500 bp en flujo descendente), lo cual garantiza que todas las polimerasas "se viertan" en el mismo punto, generando, asf, un producto de transcripcion iden tificable.

24.3 Los elementos promotores se definen par mutaciones y vestigios

613

1-

!.!.1.111' o

o o ~~~

La secuencia de flujo ascendente es siempre Ia misma

•

o ·

Solo el promotor de prueba difiere

"EJ(i{o rr:;!F-

ilr·

La longitud del producto de transcripci6n es definida

4 Un promotor se pone a prueba modificando la secuencia que se conecta con una secuencia de flujo ascendente constante y a una unidad de transcripci6n constante de flujo descendente.

Flujo ascendente Promotor

Transcrito

Transcripci6n!

Aun se produce RNA: La deleci6n no entra al promotor

l

Ya nose produce RNA: Ia deleci6n ha entrada al promotor Ellfmite de flujo ascendente del promotor yace entre los extremos de las deleciones Los limites del promotor se determinan mediante deleciones que eliminan progresivamente mas material de un lado . Cuando una deleci6n no puede impedir la sintesi s de RNA, pero la siguiente detiene la transcripci6n, el limite del promotor debe estar entre ambas.

Se empieza con un fragmento espedfico de DNA con el que puede dar principia la trans cripdon en uno de estos sistemas, de manera que los lfrnites de Ia secuencia que constituye al promotor pueden determinarse restando Ia longitud del fragmento de cada extrema hasta que cese su actividad en algun 614


punto, como se ilustra en la •c;uR . El lfm> ascendente se puede identificar eliminando pro g~~ sivamente el material de dicho extrema hasta qu e ~ pierda la funcion del promotor. Para probar ellin:i·descendente, es necesario reconectar el prom o~ acortado a la secuencia por transcribir, ya que : otra manera no habrfa producto que analizar. Una vez que los lfmites del promotor se h~ definido, es posible determinar la importancia : las bases espedficas que tiene en su interior im' . duciendo mutaciones puntuales u otras reestr..:_ turaciones en Ia secuencia. Como en el caso de polimerasa de RNA bacteriana, estas pueden ca r=. .terizarse como mutaciones ascendentes o descende;:· Algunas de esas reestructuraciones afectan s6l velocidad de inicio, en tanto que otras inciden e1: ;;. sitio donde ocurre, como se observa en un cam·: de punto de inicio. En todo caso, para asegurarse .:. que se trata de productos comparables, es necesc.... caracterizar el extrema 5' del RNA. Para identificar los componentes de secuer. .:::_ de un promotor (o cualquier otro sitio del DNA, pueden aplicar varios criterios: • Las mutaciones en el sitio impiden las f~ ciones in vitro o in vivo. (Hoy se cuenta muchas tecnicas para introducir mutacio::. _ puntuales en pares de bases particulare' en principia, es posible mutar todas las ciones de un promotor y estudiar la secue-cia con mutacion in vitro o in vivo.) • Las protefnas que actuan por union con ......: sitio pueden ser identificadas en el; debe: haber una correlaci6n entre la capac i ~ de las mutacion es para evitar Ia funci6r: -::. promotor y Ia union del factor. • Cuando un sitio reconocido por un facto:- : particular se encuentra en varios promc res, debe ria ser posible derivar una secu:' · cia de consenso que se una al factor. -_ nuevo promotor tendra que encargarse · ese factor cuando se introduzca una ccapropiada del elemento.

lilt La polimerasa de RNA I tiene un promotor bipartido Conceptos principales • El promotor de la polimerasa de RNA I co11sta de un promotor medular y un elemento de control en flujo ascendente (UPE). • El factor UBF1 envuelve al DNA con una estructura proteinica para acercar el centro y el UPE. • El SL1 incluye el factor TBP que participa en el inici: par las tres polimerasas. • La polimerasa de RNA se une al complejo UBF1-SL1 '=" el promotor medular.

La polimerasa de RNA I transcribe a partir de un solo tipo de promotor los genes del RNA ribosomico. El producto de transcripcion incluye secuencias de RNAr grandes y pequefios que despues se liberan por escision y procesamiento. Hay muchas capias e Ia unidad de transcripcion, las cuales alternan con espaciadores no transcritos y se organizan en n conjunto, seg(m se describio en la seccion 6.8, Los genes de RNAr forman repeticiones en serie . La organizacion del promotor y los sucesos implicados en el inicio se incluyen en Ia El promotor consta de dos regiones separadas . El promotor medular rode a al punto de inicio con una extension de - 45 a +20, suficiente para que se inicie la transcripcion. En generaL es rico en GC (algo desusado para un promotor), excepto por el unico elemento conservado de Ia secuencia, una secuencia corta, rica en A-T, que rodea el pun to je inicio, llamada Inr. Sin embargo, la eficacia del promotor medular aumenta mucho por la partici- acion del elemento promotor ascendente (UPE), tra secuencia rica en G-C y relacionada con Ia del _romotor medular que abarca de -180 a -107. Este :ipo de organizacion es comun a los promotores Pol _ de muchas especies, si bien las secuencias en sf ,-arfan ampliamente. La polimerasa de RNA I requiere de dos factores auxiJiares; el que se une al promotor medular consta j e cuatro proteinas. (Se denomina SLl, TIF-IB, y Ribl, en diferentes especies). Uno de sus componen:es, Ia protefna unidora de TATA (TBP) , es un factor -1ue tambien necesitan para el inicio las polimerasas :leRNA II y III (vease la seccion 24.8, La TBP es un :actor universal.) La TBP nose une directamente con ~ l DNA rico en G-C y la union de DNA es responsailidad de los otros componentes del factor de union :nedular. Es posible que la TBP interactue con la olimerasa de RNA, tal vez mediante una subunidad comun o una caracterfstica que se ha conservado entre las polimerasas. El factor de union medular _ermite a la polimerasa de RNA I iniciar a partir del _romotor con una frecuencia basal baja. El factor de union medular tiene como responxtbilidad prioritaria garantizar que Ia polimerasa de 1NA este adecuadamente localizada en el punto de !nicio. En pocas palabras, las polimerasas RNA li y Ill jesempeiian una funcion similar mediante un factor .:jUe consta de TBP relacionada con otras protefnas. _.\sf pues, una caracterfstica comun del inicio por las :res polimerasas es confiar en un factor de "posi ..:ionamiento" constituido por TBP relacionado con rotefnas especificas de cada tipo de promotor. Para el inicio de alta frecuencia, se requiere del :actor UBF, polipeptido sencillo que se une a un ele:nento del UPE rico en G-C. Un indicia de Ia forma ~n que el UBF interactua con el factor de union me-

Ri co en G-C Rico en A-T Punto de inicio lnr Elemento promotor de flujo ascendente

-170 - 160 -1 50 - 140 - 130 -120 -11 0

Promotor medular

-40 -30 -20 -1 0

+10

+20

"I. El UBF se una al elemento promotor de flujo ascendente

La holoen zim a polimerasa de RNA I incluye un factor de uni6n centra l (SL 1) que se une at promoto r medular

Las unidades de transcripcion de la polimerasa de RNA I tienen un promotor medular separado por -70 bp del elemento promotor de flujo ascendente. La union de UBF a UPE aumenta la capacidad del factor central de union de aunarse al promotor medular. El factor de union central (SLl ) ubica ala polimerasa de RNA I en el punto de inicio.

dular es la importancia del espaciamiento entre el UPE y el promotor medular, lo cual puede cambiarse por distancias que implican numeros enteros de giros de DNA, pero no por distancias que introduzcan medias giros. El UBF se une con la hendidura menor del DNA y lo envuelve en un asa de casi 360°, de modo que pone al nucleo muy cerca del UPE. En Ia Figura 24.5 se observa el inicio como una serie de interacciones en secuencia, pero la polimerasa de RNA I existe como una holoenzima que conti ene la mayor parte de los factores necesarios para el inicio, si no es que todos, y que probablemente es reclutada directamente al promotor.

BJ1

La polimerasa de RNA III utiliza promotores en flujo ascendente y descendente

Conceptos principales • La polimerasa de RNA III tiene dos tipos de promotores. • Los promotores internos tienen secuencias de consenso cortas dentro de la unidad de transcripcion y producen inicio a una distancia fija de flujo ascendente. • Los promotores de flujo ascendente contienen tres secuencias de consenso cortas en flujo ascendente respecto del punto de inicio, donde se unen los factores de transcripcion.

El reconocimiento de los promotores por la polimerasa de RNA III ilustra de manera sorprendente la participacion relativa de los factores de transcripcion

24.5 La polimerasa de RNA III utiliza promotores en flujo ascendente y descendente

615

y la enzima polimerasa. Los promotores se clasifican en dos clases generales, reconocidas en diferentes formas por diversos grupos de factores. Los promotares de los genes 5S y de RNAt son internos y seencuentran en flujo descendente respecto del punto de inicio. Los promotores de los genes del RNAsn (RNA nuclearpequefi.o) yacen en flujo ascendente respecto del punto de inicio, a Ia manera mas convencional de otros promotores. En ambos casos, cada elemento es necesario para las funciones del promotor que corresponden exclusivamente a secuencias reconocidas por factores de transcripci6n que, a su vez, dirigen Ia union de la polimerasa de RNA Antes de que se identificara al promotor de los genes del RNA 5S en X. laevis, en todos los intentos por identificar secuencias de promotores se suponfa que podrfan encontrarse en flujo ascendente respecto del punto de inicio. El analisis de delecion, sin embargo, mostro que el producto RNA 5S jsigue

Punto de inicio Prom.otor Flujo Regi6n transcrita ascendente

RNA

La deleci6n que elimina secuencias en flujo ascendente respecto del promotor permite que Ia transcripci6n empiece en Ia posici6n correspondiente al punto de inicio usual

El analisis de del.eci6n muestra que el promotor de los genes de RNA 55 es interne; el inicio ocurre a una distancia fija (-55 bp) en flujo ascendente respecto del promotor.

,

Punto de inicio

sintetizandose cuando se elimina toda la secuer .:::.. del gen en flujo ascendente! Cuando las deleciones continuan en el ger:. gue sintetizandose un producto muy similar er: mafi.o al RNA 5S usuaL mientras la deleci6n te rn· ~ antes de la base +55. En la se mu e: que la primera parte del producto RNA corresp =_ a un plasmido de DNA, la segunda represeni.=. segmento restante de Ia secuencia usual de RNA ; _ Sin embargo, cuando la delecion rebasa la posi+55, no hay transcripcion, de modo que el pro: tor yace en flujo descendente respecto de dicha posi,- · pero hace que la polimerasa de RNA III inic:transcripcion a una distancia mas o menos fija flujo ascendente. Cuando la deleci6n parte del extremo dista: · gen, la transcripci6n no se afecta si los primer ~ _ bp quedan intactos, pues una vez que la delec hace un corte en esa region, la transcripcion c::de modo que la posicion lfmite en flujo descende:del promotor es casi +80 . Asf pues, el promotor de la transcripci6n dei _-: 55 yace entre las posiciones +55 y +80, dentro del _; Un fragmento que contenga esa region puede ~- ~ paldar el inicio de cualquier DNA donde quiera : se coloque, desde un punto de inicio a -55 b:distancia en flujo ascendente (el punto de inici vestre es {mico; en deleciones que no lo tiene:::. transcripcion se inicia en la base purfnica mas ce~ na a Ia posicion 55 bp en flujo ascendente res · :del promotor). En la ' se resumen las estrurr....; de los tres tipos de promotores de la polimera RNA. Hay dos tipos de promotor interno, cada -:. de los cuales contiene una estructura bipartida e:que dos elementos de secuencia corta estan sep~ dos por una secuencia variable. El tipo l comE una secuencia de caja A separada de una secuede caja C, y el2, de una secuencia de caja A sere:: dade una secuencia de caja B. La distancia enc tcaja A y la caja B en un promotor de tipo 2 pL _ variar ampliamente, pero, en general, dichas :.:: no pueden acercarse mucho sin abolir su func Un grupo comun de promotores de tipo 3 tiene ~ elementos de secuencia en flujo ascendente resp:: -· del pumo de inicio. L

BD

El TFmB es el factor de encars: para los promotores de la Pol

Conceptos principales Los promotores de la polimerasa de RNA III podrian consistir en secuencias bipartidas en flujo descendente respecto del punta de inicio, con la caja A separada de las cajas C o 8, o estar constituidos par secuencias separadas en flujo ascendente respecto del punta de inicio (Oct, PSE, TATA).

616


• El TFmA y TFmC se unen a la secuencias de consens: . permiten al TFmB unirse en los puntos de inicio. • El TFmB tiene a TBP como una de sus subunidades _ permite la union de la polimerasa de RNA.

....as interacciones detalladas son diferentes en los ~ s tipos de promotor interno, pero el principia es el -·smo. El TFllle se une en flujo descendente respec: del punto de inicio, ya sea de manera indepen_'ente (promotores tipo 2) o en combinacion, con ---:?rnA (promotores de tipo l). La presencia de TFme _rmite al factor de posicionamiento TF mB unirse : el punto de inicio. A continuacion se recluta Ia )limerasa de RNA. En Ia se resumen las etapas de Ia ::accion en los promotores internos de tipo 2. El -:-::'!lie se une a las cajas A y B, lo cual permite a TF~ nirse en el pun to de inicio. En ese punto se puede ..ir Ia polimerasa de RNA III. La diferencia en los promotores internos de tipo es que TFmA debe unirse a una caja A para per·nr que TFme se una ala caja C. En la : muestra que una vez que se ha unido TFme, los ~ cesos siguen el mismo curso que con todos los pro.otores de tipo 2, con union de TF u1B en el punto :- inicio y Ia polimerasa de RNA III uniendose al mplejo. Los promotores de tipo l se encuentran :o en los genes del Rl~Ar 5S. TF111 A y TFme son factores de ensamblaje ..:ya {mica funcion es facilitar Ia union de TFmB en 'localizacion correcta. Una vez que se une TFrnB, : pueden eliminar TF rnA y TF me del promotor (par .:a concentracion de sales in vitro) sin afectar Ia :accion de inicio. El TFu/3 se mantiene unido en la . :indad del pun to de inicio y su presencia es suficiente no para permitir que la polimerasa de RNA III se una ?! punta de inicio. AsL TFrrrB es el {mico factor de _cio real requerido por Ia polimerasa de RNA III. : :a secuencia de sucesos explica como las cajas de ; promotores en flujo descendente pueden hacer _e Ia polimerasa de RNA se una en el punta de ~cia, en una ubicacion algo mas alejada en flujo :endente. Aunque la capacidad de transcribir es; genes es conferida por el promotor interno, los - -nbios en Ia region inmediata en flujo ascendente :~pecto del punto de inicio pueden alterar Ia efica= de Ia transcripcion. El TFrne es un gran complejo protefnico (>500 ~ 1, comparable en tamafio a Ia propia polimerasa : RNA que contiene seis subunidades. El TF rnA es embro de una clase interesante de protefnas que :'uye un segmento de union de acidos nucleicos ·:nado dedo de zinc (vease Ia seccion 25.9, Un seg.mto de dedo de zinc es un dominio de union del . ·A). El factor de posicionamiento, TFmiB, consje tres subunidades; incluye Ia misma proteina, ""? ~, presente en el factor de union medular de los Jmotores de Pol I y tambien en el factor de trans·- cion (TF11D) correspondiente de la polimerasa de _-.-\ II. Asimismo, incluye Brf, que tiene relacion :::. el factor TFuB utilizado por Ia polimerasa de

Punto de inicio

Los promotores internos de pol III, tipo 2, utilizan la union de TF111C con las secuencias de las cajas A y B para reclutar al factor de posicionamiento TF111 B, que a su vez recluta a la polimerasa de RNA III.

Punto de inicio

I

Los promotores internos de pol III, tipo 1, utilizan los factores de ensamblaje TF111 A y TF1} en las cajas A y C para reclutar al factor de posicionamiento TF111 B, que a su vez recluta a la polimerasa de RNA III .

RNA. La tercera subunidad se llama B", prescindible si el DNA doble se disuelva parcialmente, lo cual sugiere que su funcion es iniciar Ia burbuja de transcripcion; la participacion de B" puede ser comparable con la correspondiente del factor sigma

24.6 El TFmB es el factor de encargo para los promotores de la Pol III

617

en Ia polimerasa de RNA bacteriana (vease Ia seccion 11.16, La sustitucion de factores sigma puede controlar el inicio). La region de flujo ascendente desempeiia un papel convencional en Ia tercera clase de promotores de Ia polimerasa de RNA ill. En el ejemplo de Ia Figura 24.8 hay tres elementos de flujo ascendente que tambien se encuentran en promotores de los genes de RNAsn transcritos por la polimerasa de RNA II. (Los genes de algunos RNAsn son transcritos por Ia polimerasa de Ri\JA II y otros por Ia de RNA III.) Los elementos de flujo ascendente actuan de manera similar en promotores de ambas. El inicio en un promotor de flujo ascendente de la polimerasa de RNA III puede tener Iugar en una region corta inmediatamente anterior a! punto de inicio y contiene solo el elemento TATA. La eficacia de la transcripcion, sin embargo, aumenta mucho por Ia presencia de elementos PSE y OCT. Los factores que se unen a dichos elementos interactuan de manera cooperativa. (El elemento PSE puede ser indispensable en los promotores usados por Ia polimerasa de RNA II, en tanto es estimulador en promotores utilizados por la polimerasa de RNA ill; su nombre significa elemento de secuencia proximal.) El elemento TATA confrere especificidad para el tipo de polimerasa (II o III) reconocida por un promotor de RNAsn; esta unido a un factor que incluye TBP, que en realidad reconoce la secuencia en el DNA. La TBP se vincula con otras proteinas especfficas del tipo de promotor. La funcion de TBP y las protefnas vinculadas es colo car correctamente Ia polimerasa de RNA en el punto de inicio, lo cual se describe en mas detalle para Ia polimerasa de RNA II (vease Ia seccion 24.8, La TBP es un factor universal). Los facto res actuan en la misma forma para ambos tipos de promotores de Ia polimerasa de RNA IlL se unen en el promotor antes que la propia polimerasa de RNA se pueda unir y forman un complejo de preiniciaci6n que dirige Ia union de polimerasa de RNA. La polimerasa de RNA III de por sf no reco noce la secuencia del promotor, pero se une junto a factores que de suyo estan unidos apenas en flujo ascendente respecto del punto de inicio. Para los promotores internos de tipo 1 y 2, los factores de ensamblaje aseguran que TFmB (que incluye TBP) se una justo en ubicacion ascendente respecto del punto de inicio, de modo de proporcionar informacion de posicion. Para los promotores de flujo ascendente, el TF111 B se une directamente con Ia region que incluye Ia caja TATA, lo cual significa que independientemente de la localizacion de las secuencias del promotor, cerca del punto de inicio se unen factores para dirigir Ia union de Ia polimerasa de RNA III. 618


Ell

El punto de inicio de la poli me rasa de RNA II

Conceptos pri nci pales • La polimerasa de RNA II requiere de factores genera _: de transcripci6n (llamados TF11 X) para iniciar la tra nscripci6n. • Los promotores de la polimerasa de RNA II tienen ur : secuencia corta conservada Py/APy 5 (el InR de inici: en el punta de inicio. • La caja TATA es un componente comun de los promotores de la polimerasa de RNA II y esta constituido por un octamero rico en A-T localizado < : bp en flujo ascendente respecto del punta de inicio. • El DPE es un componente comun de los promotores la polimerasa de RNA II que no tiene caja TATA. • Un promotor medular de la polimerasa de RNA II incluye el InR y la caja TATA o un DPE.

::~

La organizacion basica del aparato de transcri ;:: de genes que codifican protefnas fue revelada el descubrimiento de que Ia polimerasa de RN _!_ rificada puede catalizar Ia sfntesis de RNAm . no iniciar Ia transcripcion, a menos que se agrc-_ un extracto adicionaL La purificacion de ese ex _ to llevo a Ia definicion de los factores genera: transcripcion, un grupo de proteinas que nece ~ : polimerasa de RNA II para el inicio en todos 1 : : motores . Junto con esos factores, Ia polimera~ ' RNA II constituye el aparato basal de transcr~_;: ~ necesario para transcribir cualquier promoto: ~ facto res generales se describen como TF )C, c · "X " es una letra que identifica a! factor indi"·:.=. Las subunidades de polimerasa de RNA II y 1 _ tores genera les de transcripcion se consen·c:= eucariotas. El punto de partida del analisis de la or~ ~ zaci6n de los promotores es definir al pw medular como la secuencia mas corta en qu
.... Punto de inicio

I

•

TATAA ...... N2o······ YYCAYYYYY ...... N24···--- AGAC L-...,--'

~

Caja TATA lnr OPE Promotor medular _...... ....,_ que contiene TATA ...,.._Promotor medular ,__. sin TATA GURA 24.10 El promotor minima de pol II puede tener una :aj:a TATA a -25 bp en flujo ascendente respecto de Inr. La caja -;TA contiene la secuencia de consenso de TATAA. El InR tiene :'rimidinas (Y) que rodean a CA en el punto de inicio. La DEP ~5ta en flujo descendente respecto de este ultimo. La secuencia - uestra la cadena de codificaci6n.

Podrfa esperarse que cualquier componente de :ecuencia implicado en la union de la polimerasa :!.e RNA y los factores generales de transcripcion :uera conservado en casi todos los promotores, o ~n todos. Como sucede con los promotores bacte-:anos, a! comparar los de la polimerasa de RNA II, _;~s homologfas en las regiones cercanas al punto de .:ticio se limitan a secuencias bastante cortas que =quivalen a las secuencias implicadas en Ia funcion : e los promotores por mutacion . En la I 21 1 ::: muestra Ia estructura de un promotor medular ~ polll tfpico. En el punto de inicio no hay gran homologfa de :::cuencias, pero sf una tendencia a que la primera ~ :~se de RNAm sea A, flanqueada a ambos !ados por < rimidinas. (Esta descripcion tambien es valida para 2 secuencia de inicio CAT de los promotores bacte_-:.anos.) Dicha region se denomina iniciador (lnr), en generaL puede describirse como Py 2 CAPy 5 . .::: Inr esta contenido entre las posiciones -3 y +5. luchos promotores tienen una secuencia llamada .:aja TATA, que en las eucariotas superiores suele . alizarse -25 bp en flujo ascendente respecto del - ~nto de inicio y que constituye el {mico elemento ~el promotor de flujo ascendente con localizacion ·:-]ativamente fija respecto de dicho punto. La se. 1encia medular es TATAA, y suele ir seguida de :ras tres pares de bases A-T. La caja TATA tiende :: ser rodeada por secuencias ricas en G-C, que po_ia ser un factor de su funcion. Es casi identica a ...: secuencia -10 de los promotores bacterianos; de echo, podrfa pasar por uno de ellos, excepto por la _ierencia de Jocalizacion, en -25 y no en -10. Las sustituciones de una sola base en la caja -:-_-\TA actuan como mutaciones descendentes so-das; algunas invierten Ia orientacion de un par -_-T, de manera que Ia sola composicion de bases - es suficiente para su funcion. Asf, la caja TATA Jnstituye un elemento cuya conducta es analoga

a! concepto de promotor bacteriano, una secuencia corta, bien definida, apenas en flujo ascendente respecto del punto de inicio, necesaria para Ia transcripcion. Los promotores que no contienen un elemento TATA se llaman promotores sin TATA. Los rastreos de secuencias de promotores sugieren que el 50%, o mas, pueden carecer de TATA. Cuando un promotor no incluye una caja TATA, suele contar con otro elemento, el DPE (elemento promotor de flujo descendente), que se localiza entre +28 y +32. Casi todos los promotores medulares constan de una caja TATA mas InR o un InR mas DPE.

BD


Conceptos principales • La TBP constituye un componente del factor de posicionamiento necesaria para que cada tipo de polimerasa de RNA se una a su promotor. • El factor para La polimerasa de RNA II es TFnD, que consta de TBP y 11 TAF, con una masa total de -800 kD.

El primer paso en Ia formacion de un complejo en un promotor qu e contenga una caja TATA, es Ia union del factor TF1p , que tiene dos tipos de componente, con una region en flujo ascendente respecto de Ia secuencia TATA. El reconocimiento de dicha caja es conferido porIa proteina de union a TATA (TBP), una pequeiia protefna de- 30 kD. Las otras subunidades se llaman TAF (factores vinculados con TBF), algunas de las cuales tienen relacion estequiometrica con TBP; otras estan presentes en cantidades menores. Los TF1p que contienen diferentes TAF, podrfan reconocer diferentes promotores; algunos TAF (subestequiometricos) son especfficos de tejidos. En generaL Ia masa total de TFnD es de -800 kD, contiene TBP y ll TAF, con una variacion de masa de entre 30 y 250 kD . Los TAF de TFnD reciben el nombre de TAFuOO, donde "00" incluye la masa molecular de Ia subunidad . Los factores de posicionamiento, que constan de TBP vinculada con un conjunto de TAF, se encargan de Ia identificacion de todas las clases de promotores. Se pod ria considerar que el TF rnB (para los promotores de pol III) y el SLl (para los de pol I) estan constituidos por TBP relacionada con un grupo particular de protefnas que sustituye a los TAF que se encuentran en TFnD. La TBP es el componente clave, y se incorpora a cada tipo de promotor por un mecanismo diferente. En el caso de promotores de la polimerasa de RNA II, un factor dave de posicionamiento es Ia distancia fija de la caja TATA respecto del punto de inicio. 24.8 La TBP es un factor universal

619

Promotores de pol Ill

Promotores de poll

TBP

TBP

En una vista transversal se observa q u ~ rodea al DNA del lado del surco estrecho. La TBP co no::o dos dominios conservados relacionados (identicos hasta ~~ 40%) que se muestran en azul clara y oscura. La region teN varia ampliamente, y se representa en verde. Las dos ca:~ ~ de DNA de doble helice son de color gris, clara y oscuro. Ir- : ~ cortes\a de Stephen K. Burley.

Promotores de pol II

se com porta de la misma forma que TBP y apor._c propio conjunto de TAF para formar un comt: · que actua como alternativa de TFuD en un conj _ especifico de promotores.

B1J

La TBP se une al DNA de fo rma i nusual

Conceptos principales • El TBP se une a la caja TATA en el surco memor del _ Las polimerasas de RNA se posicionan en todos los pramotores por un factor que contiene TBP.

En la se muestra que el factor de posicionamiento reconoce a! promotor de manera diferente en cada caso. En los promotores de Ia polimerasa de RNA III, TFmB se une junto a TFmC. En los promotores de la polimerasa de RNA I, SLl se une junto con UBF. El TF 1p solo esta encargado de reconocer promotores de la polimerasa de RNA II . En un promotor que tiene un elemenro TATA, la TBP se une especfficamente con el DNA, pero en otros, puede hacerlo por vinculo con otras protefnas que se unen al DNA. Cualquiera que sea el medio de entrada al complejo de inicio, tiene el proposito comun de interactuar con la polimerasa de RNA. El TF 1p es ubicuo , pero no unico . Todas las eucariotas multicelulare s tambien expresan un complejo alterno que contiene TLF (factor similar a! TBP en -60 %) y no TBP . Probablemente inicie Ia formacion del complej o mediante el conjunto usual de factores TFn, pero el TLF no se une a la caja TATA, y no se sabe como actua. En el genero Drosophila tambi en hay un tercer factor, TRFL que 620

CAPiTULO 24 Promotores y potenciadores

• Forma una silla de montar en torno al DNA y lo dofi .:. -80°.

• Algunos de los TAF simulan histonas y podrian for rr::· una estructura parecida a un octamero de histona.

La TBP tiene la propiedad in usual de unirse al ::: en el surco menor (virtualmente todas las pr nas de union a DNA conocidas se unen en el ,. mayor). La estructura cristalina de Ia TBP su ;un modelo detallado de union. En la J se muestra que rodea una cara del DNA y f .una "silla de montar" en tono a la doble helice hecho, la cara interna de la TBP se une al D: -la superficie externa, mas grande, queda dispo . para extender os en direccion de otra. ~ tefnas. El sitio de union del DNA consta de u:_ minio terminal C, que se conserva entre espec:i. cola terminal N variable esta expuesta para in- .:: tuar con otras proteinas. Como medida de cons :: cion del mecanismo de inicio de la transcripci ~ secuencia de union de TBP con DNA perdura :-....:. en 80 % entre las levaduras y los seres human La union de TBP puede no concordar c . presencia de nucleosomas, los cuales se for-

sabre to do, colocando las secuencias ric as en A-T con los surcos menores hacia el interior, de modo e evitar Ia union de TBP, fenomeno que podrfa explicar porque los nucleosomas impiden el inicio de Ia transcripcion. La TBP se une al surco menor y dobla al DNA -so·, como se ilustra en la . La caja TATA se dobla hacia el surco mayor y ensancha el menor. La dispersion se restringe a los 8 bp de la caja TATA; en cada extrema de la secuencia, el surco menor :ienen su ancho usual de -5 A, pero en el centro es de >9 A lo cual con stituye una deformacion de :a estructura, pero no separa realmente las cadenas eDNA porque se mantiene el apareamiento de las oases. La extension del doblez puede variar respecto i e Ia secuencia exacta de Ia caja TATA y se correla:iona con Ia eficacia del promotor. Dicha estructura tiene varias implicaciones fu n ~ ·onal es, pues si se m odifica Ia organizacion espacial J el DNA a cada !ado de Ia caja TATA, los factores de transcripcion y Ia polimerasa de RNA formaran ·. m vfnculo mas estrecho del que serfa posible con el JNA lineal. El doblez de Ia caja TATA corresponde a! desdoblamiento de casi un tercio de giro del DNA y es compensado por una rotacion positiva. La TBP en el surco menor, combinada con la J.Ilion de otras protefnas en el surco mayor, estable::e os de alta densidad de protefna -DNA en ~sa region. !11 vitro, Ia union de TBP purificada con JNA protege -1 giro de Ia doble h elice en la caja -::-ATA, que por lo general abarca de -37 a - 25. No bstante, Ia union del complejo TF uD en Ia reaccion 'e inicio suele proteger Ia region de -45 a -1 0, y .ambien va mas alla en flujo ascen dente, respecto j el punta de inicio . La TBP es el {mico factor gene ~al de transcripcion que hace o especffico de ~ e cuencia con el DNA. Dentro del TF11 D como complejo proteinico lix e, el factor TAFrr230 se une a TBP, donde ocupa a superficie concava de union al DNA. De hecho, Ia :-structura del sitio de union que yace en el dominio .ermina l N de TAFrr230 simula la superficie del sur~o menor del DNA. Esa similitud molecular permite :. TAF11 230 controlar Ia capacidad de TBP de unirse : n el DNA; el dorninio terminal N de TAF11 230 debe esplazarse de !a superficie de union del DNA de -:BP para que TFrrD se una al DNA. Algunos T AF simulan h istonas, en particular -:-A.Fu42 yTA.Frr62 parecen ser homologos (distantes) ·e las histonas H3 y H4, y forman un heterodfm ero ·rilizando el mismo segmento (pliegue de histona ) -. e las histonas para su interaccion. (Las histonas . 3 y H4 forman el meollo del octamero de h istonas, : mplejo basico que se une a! DNA en !a cromatina :-ucariotica; vease Ia seccion 29.7, Organizacion del 'Ctamero de histonas.) Junto con otros TAF, TAF 1142

La estructura cocristalina de TBP con DNA de - 40 al punto de inicio muestra un doblez en la caja TATA que ensancha el surco estrecho do nde se une TBP. Imagen cortesia de Stephen K. Burley.

y TAF u62 pueden forma r !a base de la estructura que simula un octamero de histonas, estructura que puede encargarse de las interacciones inespecfficas de secuencia de TF 1p con el DNA. Los pliegu es de histonas tambien se usan en interacciones pareadas entre otros TAFw Algunos de los TAFn pueden encontrase en otros complejos, asf como en TFrrD . Particularmente losT AFrr similares a histonas se encuentran tambien en complejos protefnicos que modifican !a estructura de la cromatina antes de la transcripcion (vease seccion 30.7, Las acetilasas se vinculan con los activadores).

fZ1m

El aparato basal se ensambla en el promotor

Conceptos principales • La union de TF11 D a La caja TATA es el primer paso del inicio. • Otros factores de transcripcion se unen al complejo en un orden definido, aumentando, as1, la longitud de la region protegida en el DNA. • Cuando La po limerasa de RNA II se une al complejo, empieza la transcripcion.

El inicio implica que los factores de transcripcion actuen en un arden definido para constituir un complejo que se une a Ia polimerasa de RNA. La serie de sucesos se definio inicialmente por segu imiento del 24.10 EL aparato basal se ensambla en el promotor

621

FACTOR

COMPLEJO DE TRANSCRIPCION

TF 11 D TBP

I

I TAFs Union en el surco menor

-CJ

Polimerasa

Un complejo de inicio se ensambla en los promotores de la polimerasa de RNA II mediante una secuencia ordenada de vlnculo con factores de transcripci6n.

tamafio creciente del complejo proteinico relacio nado con el DNA pero ahara pueden definirse con mayor detalle en funcion de las interacciones reveladas por las estructuras cristalinas de los diversos factores y de la polimerasa de RNA unida al DNA. El vestigio de las regiones de DNA protegidas por cada complejo sugiere el modelo que se resume en Ia . Conforme cada factor TFrr se une a! complejo, se cubre una longitud cada vez mayor de DNA, la polimerasa de DNA se incorpora en la ultima etapa . El encargo a un promotor se inicia cuando el TFrrD se une con la caja TATA. (El TFrrD tambien reconoce la secuencia InR en el punto de inicio.) Cuando el TFrrA se une al complejo, el TFnD adquiere la capacidad de proteger una region que se extiende mas adelante en flujo ascendente. El TFnA puede activar la TBP a! aliviar la represion causada por TAFn230. La adicion de TFrrB protege parcialmente la region de la cadena molde en las cercanias del punto de inicio, de -10 a +10, lo cual sugiere que TFDB se une en flujo descendente desde la caja TATA, tal vez en relacion taxa con el DNA y orientado de manera asimetrica respecto de las dos cadenas. La estructura 622


Dos imagenes del complejo ternario de -':" TBP-DNA muestran que el TF 11 B se une a lo largo de lac.:: . flexion del DNA. Las dos cadenas del DNA son de color = y amarillo, la TBP es azul y el TF11 B, rojo y purpura. Ima~o -_ cortesla de Stephen K. Burley.

cristalina que se muestra en Ia 4 ~!: ar:7"" dicho modelo. El TF11B se une al lado de TBP · extiende para prolongar el o en una · ~ caras del DNA; hace o con el surco m.:-:::en flujo descendente respecto de Ia caja TATA : _ el mayor en flujo ascendente, respecto de Ia TATA. en una region llamada ERE. En organL arcaicos, el homologo de TF 0 B en realidad esta· : os especfficos de secuencia con el prom _en Ia region ERE. El TF DB proporcionaria Ia sc _ ficie, que a su vez es reconocida por Ia polime de RNA, de modo que se encarga de la direcci ' ::.. union de Ia enzima. La estructura cristalina de TF DB con la po ·rasa de RNA muestra que tres dominios del fi:.interactuan con la enzima. Como se ilustra es- _ maticamente en Ia , un Iiston de z: ::- _ terminal de TF rrB hace o con la enzima c:del sitio donde sale el RNA, de modo que es t dria interferir con la salida del RNA y con el cade inicio abortivo a escape promotor. Un "d::- _ alargado de TFnB se inserta en el centro activo .:.c polimerasa. El dominio terminal C interactuc. Ia polimerasa de RNA y TF DB para orientar el :::,. tambien determina Ia via del DNA donde em::-:. o con los facto res TF DE, TF DF y TF JI · pueden alinearlos en el complejo del factor bas.:..

El factor IF 11 F es un heterotetramero constituido por dos tipos de subunidad, de las cuales, ]a mas grande (RAP74) tiene una actividad de helicasa de DNA dependiente de AIP, que podria participar en Ia solubilizacion del DNA en el inicio. La subunidad mas pequefia (RAP38) tiene cierta homologfa con las regiones del factor sigma bacteriano que hacen o con la polimerasa medular, y se une estrechamente con la polimerasa de RNA II, que el IF uF puede llevar hacia complejo de ensamblaje de la transcripcion y proporcionar el media por el que se une. El complejo de IBP y IAF puede interactuar con Ia cola CIB de Ia polimerasa de RNA, y la interacci6n con IF uB tal vez tambien sea importante cuando IFuF/polimerasa se unen al complejo . La union de la polimerasa extiende los sitios protegidos en flujo descendente hasta + 15 en Ia cadena molde y +20 en Ia que noes molde. La enlima abarca la longitud total del complejo porque se observa proteccion adicional en ellimite de flujo ascendente. (.Que sucede con los promotores sin IAIA? Se requieren los mismos factores generales de la transcripci6n, incluido IFuD. El Inr proporciona el ele ::nento de posicionamiento y el IF rrD se une a el par :a capacidad de uno o mas IAF de reconocer direc:amente el Inr. Otros IAF en IF uD tam bien recono:en el elemento DPE en flujo descendente respecto je] punta de inicio. La funcion de la IBP en esos romotores es mas parecida a la que tiene Iugar en . os promotores de la polimerasa de RNA I y en los . romotores internos de Ia polimerasa de RNA III. El ensamblaje del complejo de inicio de la po.imerasa de RNA II proporciona un contraste in:eresante con la transcripci6n procari6tica. La po..:merasa de RNA bacteriana es esencialmente un : gregado coherente con capacidad intrinseca de .:nirse al DNA; el factor sigma, necesario para el _"licio pero no para la elongaci6n, se vuelve parte de ..a enzima antes de que se una al DNA, aunque mas :.arde es liberada . La polimerasa de RNA II puede ..illirse al promotor pero s6lo despues de que se h an .:.nido factores de transcripci6n separados. Los facto~:'S tienen una participacion analoga a ]a del factor :gma bacteriano, permitir que la polimerasa basica -~:conozca especfficamente a! DNA en las secuencias romotoras, pero ha evolucionado de manera mas :1dependiente. De hecho, los factores se encargan bre todo de Ia especificidad del reconocimiento ·"el promotor y solo algunos participan en los con:..>ctos protefna-DNA (solo IBP hace os es- ecificos de secuencia); por tanto, las interacciones ~rotefna-protefna son importantes para el ensam: :aje del complejo. Cuando hay una caja IAIA, determina Ia loca...zaci6n del punta de inicio, y su deleci6n hace que

DNA en flujo descendente

DNA en flujo ascendente Salida de RNA

TF B (C-terminal) 11

_____.

enzimatico

\

Nucle6tidos

El TFnB se une al DNA y entra en o con la polimerasa de RNA cerca del sitio de salida del RNA y en el centro activo, y La orienta sabre el DNA. Compiuese con La Figura 24.17 que muestra la estructura de la polimerasa implicada en La transcripci6n.

este se tome erratico, si bien cualquier disminuci6n global de la transcripcion es relativamente pequeiia . En realidad, algunos promotores sin IAIA carecen de puntas de inicio {micas y el inicio tiene Iugar en cualquiera de un grupo de puntas de inicio. La caja IAIA alinea a la polimerasa de RNA (por la interaccion con IF liD y otros factores) , de man era que se inicie en el sitio apropiado. Esto explica que la localizaci6n sea fija respecto del punta de inicio. La union de IBP y I AIA es la caracterfstica predominante del reconocimiento del promotor, pero tambiendosgrandesiAF (IAFn250yiAF1J50) hacen o con el DNA cerca del punta de inicio e influyen en la eficacia de la reacci6n. Si bien in vitro el ensamblaje puede ocurrir en el promotor medular, esa reacci6n no es suficiente para la transcripci6n in vivo, en Ia cual se requieren conexiones con activadores que reconocen a los elementos mas alejados en flujo ascendente. Los activadores interactuan con el aparato basal en diversas etapas durante su ensamblaje (vease secci6n 25.5, Los activadores interactuan con el aparato basal) .

El i nicio va seguido de la depuraci6n del promotor Conceptos principales • Para disolver el DNA y permitir el traslado de La polimerasa, se necesitan TF 11 E y TF11 H. • La fosforilaci6n del CTD podria ser necesaria para que se inicie la elongaci6n. • Para terminar un inicio abortivo, se requiere de fosforilaci6n adicional del CTD en algunos promotores. • El CTD puede coordinar el !)rocesamiento del RNA con La transcripci6n .

24.11 El inicio va seguido de la depuraci6n del promotor

623

La mayor parte de los factores generales de transcripcion son necesarios solo para unir la polimerasa de RNA al promotor, pero algunos actuan en una etapa posterior. La union de TFnE bace que ellfmite de la region protegida en flujo descendente se extienda por otro giro de la doble belice, basta +30. Despues de TFuE se unen al complejo dos factores adicionales, TF 11H y TF nJ, que no cambian el patron de union con el DNA. EL TFIIH es el unico factor general de transcripcion que tiene varias actividades enzimaticas independientes, entre otras, la de ATPasa, belicasas con ambas polaridades y cinasa que puede fosforilar la cola CTD de la polimerasa de RNA II. Este factor es excepcional en el sentido de que tambien puede participar en la elongaci6n. Su interacci6n con el DNA en flujo descendente respecto del punto de inicio es necesaria para que la polimerasa del DNA escape del promotor, ademas de que tambien participa en la reparacion de danos del DNA (vease la seccion 24.12, Una conexi6n entre transcripcion y reparacion).

La cola del

.

La pol1merasa de

CTD

~transcnb

RNA

.

G [YSPTSPSJn 4 7 Para liberar ala polimerasa de RNA y que inicie la transcripci6n, puede necesitarse fosforilaci6n del CTD par actividad de cinasa del. TFnH.

624


La reaccion de inicio, definida por la forma.::_ del primer enlace fosfodiester, ocurre una vez q;_ _ ba unido la polimerasa de RNA. En la GUR se propone un modelo donde se necesita la fo .;· laci6n de la cola para la liberaci6n de la polime · de RNA II respecto de los factores de transcripc de modo que pueda bacer la transicion a la fo::elongada. Gran parte de los factores de transcriJ"U. se Iibera del promotor en esta etapa. En un molde lineal, para el movimiento C.:polimerasa se requiere de la bidrolisis de AF TFnE y la actividad de helicasa de TF11H (provistc. · la subunidad XPB). Este req uisito es pasado po~ ::.. por un molde superenrollado, lo cual sugiere : se necesitan TF rrE y TF rrH para solubilizar el D.- permitir el inicio del movimiento de la polimer..:. La actividad de belicasa de la subunidad XPE TFnH se encarga de la solubilizacion en sf del D. La polimerasa de RNA II vacila en algunos ~ nes cuando inicia la transcripci6n. (El resulta ci . · es distinto del inicio abortivo de la polimeraYRNA bacteriana descrito en la seccion ll.ll, E tor sigma controla la union con el DNA, au r. : el mecanismo es diferente.) En mucbos gen e< polimerasa de RNA II termina despues de un c tramo y se fragmenta rapidamente. Para exte-__ la elongacion bacia el gen, se requiere de U!k nasa llamada P- TEFb, miembro de la familia _ que regula el ciclo celular. La P-TEFb actua e::. CTD para fosforilarlo aun mas. No se sabe por: es necesario ese efecto en algunos promotores -_ en otros, tampoco como se regula. El CTD tambien puede estar implicado direc indirectamente con el procesamiento del RNA _ pues de que ba sido sintetizado por la polime::. de RNA II. En la se resumen las re: ciones de procesamiento en que puede partici= La enzima de cobertura (transferasa), que ag::- c el fragmento G al extremo 5' de un RNAm rec · sintetizado, se une a la forma fosforilada del c-:-:.. lo cual podrfa ser importante para la modificac del extremo 5' tan pronto como se sintetice. -_ conjunto de protefnas llamadas SCAF se une al c-:-· y, a su vez, podrian unirse con factores de co~ c empalme, el cual seria, quiza, un medio de c dinacion de la transcripci6n y el corte y empa::Algunos componentes del aparato de fragm e:-. ci6n/poliadenilaci6n tambien se unen a! CTD . : tranamente en el momento de inicio, jde modo L la polimerasa de RNA esta lista para las reacci : de procesamiento del extremo 3' tan pronto cC'·· se establece! Todo ello sugiere que el CTD puede un punto de concentracion general para cone;:otros procesos con la transcripci6n. En los cas o~ _ formaci6n de capucb6n, corte y empalme, el c~=

fBE Formaci6n de capuch6n en el extreme 5'

Una conexi6n entre transcripci6n y reparaci6n

Conceptos principales I_/ Complejo del ca!uch6n

~

• El TFnH proporciona ligamiento para un complejo de enzimas de reparaci6n.

. ....

• Las mutaciones del componente XPD de TFuH causan tres tipos de enfermedades humanas .

Los SCAF reclutan facto res de corte y empalme

.... ••

.......c-r-

Factores de rotura

y empalme Poliadenilaci6n y fragmentaci6n del extreme 3'

......

• Los genes transcritos se reparan de manera preferencial cuando se daiia el DNA.

AAAA

El CTD es importante para reclutar enzimas que odifican el RNA.

~unciona de manera indirecta para promover Ia for :-:J.aci6n de complejos protefnicos que llevan a cabo .as reacciones, si bien en Ia generaci6n del extremo .r suele participar directamente en la reacci6n. El proceso general de inicio es similar al catali:ado porIa polimerasa de RNA bacteriana. La union : e una polimerasa de RNA genera un complejo :errado que, en una etapa posterior, se convierte :-n un complejo abierto, en el cual se han separa_o las cadenas del DNA. En Ia reacci6n bacteriana, 2 formaci6n del complejo abierto concluye con el ~mbio estructural necesario para el DNA; una dife:encia en la reacci6n eucari6tica es que se necesita _:n desenrollado mas amplio del molde despues de : ta etapa.

En bacterias y otras eucariotas hay un vinculo di recto entre !a polimerasa de RNA y Ia activaci6n de la reparaci6n_ El fen6meno basico fue descubierto porque se da preferencia a Ia reparaci6n de los genes transcritos; mas tarde se supo que es s61o Ia cadena molde del DNA Ia que constituye Ia diana, y que Ia cadena que no es molde se repara a la misma velo cidad que !a mayor parte del DNA. En las bacterias, !a actividad de reparaci6n es tarea del sistema de escisi6n-reparaci6n uvr (vease Ia secci6n 20.3, Sistemas de reparaci6n y escisi6n en E. coli.)_ La reparaci6n preferencial se elimina por mutaciones en el gen de mfd, cuyo producto proporciona elligamiento de Ia polimerasa de RNA a las enzimas Uvr. En Ia 1 se muestra un modelo del vinculo entre Ia transcripci6n y !a reparaci6n. Cuando Ia polimerasa de RNA encuentra dafi.os del DNA en Ia cadena molde, se detiene porque no puede usar las secuencias dafi.adas como molde porque no puede dirigir el apareamiento de bases complementarias. Esto explica !a especificidad del efecto en dicha cadena (los dafios en la que no es molde no impiden el a vance de !a polimerasa de RNA). La protefna Mfd tiene dos funciones. La primera implica el desplazamiento del complejo ternario de polimerasa de RNA del DNA, y Ia segunda hace que Ia enzima UvrABC se una al DNA dafiado, lo cual conduce ala reparaci6n del DNA por el meca nismo de escisi6n-reparaci6n (vease Ia Fig. 20.11 ). Despues de que se ha reparado el DNA, Ia siguiente polimerasa de RNA que atraviesa el gen puede originar un producto de transcripci6n normaL Un mecanismo similar, si bien depende de otros componentes, se usa en las eucariotas, pues se da preferencia a la reparaci6n de Ia cadena molde de un gen transcrito despues del dafio inducido por UV. El factor general de transcripci6n TFuH participa y se encuentra en formas alternas constituidas por un centro relacionado con otras subunidades. El TFuH tiene una funci6n comun en el inicio de la transcripci6n y la reparaci6n del dafio. La misma subunidad de helicasa (XPD) crea Ia burbuja de 24.12 Una conexi6n entre transcripci6n y reparaci6n

625

transcripcion inicial y solubiliza el DNA en el sitio daiiado. Sus otras funciones difieren entre transcripcion y reparacion, segun Ia forma apropiada del complejo. La muestra que el factor basico implicado en Ia transcripcion consta de un centro (de cinco unidades) relacionado con otras subunidades con actividad de cinasa; ese complejo tambien incluye una subunidad de reparacion. La subunidad catalitica de cinasa que fosforila el CTD de Ia polimerasa de RNA pertenece a! grupo de cinasas que participa en el control del ciclo celular. Es posible que esa conexion influya en Ia transcripcion como respuesta a Ia etapa del ciclo celular. El complejo alterno consiste en el centro relacionado con un gran grupo de proteinas codifica-

La polimerasa de RNA se detiene en el sitio dai'iado del molde

El Mfd se une a Ia polimerasa de RNA detenida

das por genes de reparacion (el modelo basic muestra en la Figura 20.2 5). Las proteinas de re_:racion incluyen una subunidad (XPC) que rec01: al DNA daiiado, desempeiia la funcion de ac ~ mien to y permite que se de preferencia a Ia re ;. cion de una cadena molde cuando Ia polimeras:: RNA se detiene en el DNA daiiado. Otras prore-vinculadas con el complejo son las endonucl ; (XPG, XPF y ERCCl). En los complejos de leva --~ (donde a menudo se identifican por mutacione ~ defectuosas en !a reparacion) y en el ser hurr:,: (porque se identifican con mutaciones que ca· enfermedades resultantes de deficiencias en lc. ~ paracion del DNA dana do) se encuentran prote·homologas. Las subunidades que llevan el nor:-: de XP son codificadas por genes en los cua!e:; mutaciones causan xerodermia pigmentosa (P:: Ia seccion 20.11, Las ce!ulas eucarioticas han servado los sistemas de reparacion). El complejo de cinasa y el de reparacion pu .;_ vincularse y disociarse de man era reversible re __ to del TF uH central, lo cual sugiere un mode: que para el inicio se req uiere de Ia prim era f ::de TF uH, pero puede ser sustituido por Ia otrc _ rna (tal vez como respuesta a los daiios encontE .:. en el DNA) . El TFuH se disocia de Ia polimera~ .: RNA en una de las primeras etapas de Ia elonga (despues de Ia transcripcion de -50 bp); su :.: union en un sitio de DNA daiiado puede exigir c ponentes de acoplamiento adicionales.

El TF 11 H proporciona una cinasa en el inicio

Se liberan Ia polimerasa de RNA y el producto de transcripci6n

La UvrAB inicia Ia reparaci6n de Ia escisi6n

El TF 11 H proporciona un complejo de reparaci6n en Ia elongaci6n Complejo de

Danos en el DNA El Mfd reconoce a una polimerasa de RNA detenida y dirige la reparaci6n correspondiente hacia la cadena molde daiiada .

626


El centro TF11 H puede vincularse con una :- en el inicio y con un complejo de reparaci6n cuando enc:·-= DNA daiiado.

La funcion para reparacion puede requerir de modificacion o fragmentacion de la polimerasa de RNA, cuya subunidad grande se fragmenta cuando la enzima se detiene en los sitios de dafio por UV. Se desconoce la conexion entre el aparato de transcripcion/reparacion como tal y la fragmentacion de la polimerasa de RNA, quiza sea necesario eliminar la polimerasa una vez que se estanca. Esa fragmentacion de la polimerasa de RNA es deficiente en celulas de pacientes con el sfndrome de Cockayne (trastorno de la reparacion), causado por mutaciones en uno de dos genes (CSA y CSB) cuyos productos parecen ser parte de TF 0 H o unirse a ei. Dicho sfndrome tambien suele ser provocado por mutaciones en XPD. Otra enfermedad que puede ser causada por mutaciones en XPD es la tricotiodistrofia, que tiene poco en comun con XP o con el sfndrome de Cockayne (incluye retraso mental y son notorios los cam bios en la estructura del pelo) . To do ello apunta a que XPD sea una protefna pleiotropica, en la cual diversas mutaciones pueden afectar a diversas funciones. De hecho, para la estabilidad del complejo TFnH durante la transcripcion se requiere de XPD, pero la actividad de helicasa como tal no es necesaria. Las mutaciones que impiden que XPD estabilice el complejo causan la tricotiodistrofia. La funcion de reparacion necesita la actividad de helicasa, y las mutaciones que afectan su actividad dan Iugar a deficiencias en Ia reparacion que origina el sfndrome de Cockayne o en XP.

(\i

fBI

Los elementos de secuencia corta se unen a activadores

Conceptos principales • Los elementos de secuencia corta conservados se dispersan en la region que precede al punta de inicio. • Los elementos en flujo ascendente aumentan la frecuencia del inicio. • Los factores que se unen a ellos para estimular la transcripcion se llaman activadores.

Un promotor de la polimerasa de RNA II consta de dos tipos de region; el punto de inicio mismo se identifica por la cercanfa con Inr, la caja TATA, o ambos. Aunada a los factores generales de transcripcion, la polimerasa de RNA II forma un complejo de inicio que rodea al punto de inicio, como ya se describio. Sin embargo, la eficacia y la especificidad con que se reconoce un promotor, depende de se cuencias cortas mas alejadas en flujo ascendente, las cuales se identifican por un grupo diferente de factores, llamados activadores . En generaL las secuencias diana estan -100 bp en flujo ascendente respecto del punto de inicio, pero en ocasiones estan mas lejos . La union de activadores con dichos sitios puede influir en la formacion del complejo de inicio (probablemente) en cualquiera de varias etapas. En la se resume el analisis de un promotor tfpico. Se introducen sustituciones de ba-

4

E 0 c

II ,..~

c

3

·O '(3

a.

·~ c

jg

2

> ~ ~ 'ai >

z -100

-80

-60

-40

-20

CGTAGAGCCACACCC TGGTAAG GGCCAATCTGCTCACACAGGATAGAGAG GGCAGGAGCCAGGGCAGGC.ATATAA GGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACA

... 1.. La mutagenesis de saturacion de la region de flujo ascendente del promotor de la ~ globina identifica tres regiones :xtas (centradas a -30, -75 y -90) necesarias para el inicio de la transcripci6n que corresponden a las cajas TATA, CAAT y GC.

24.13 Los elementos de secuencia cortos se unen a activadores

627

ses individuales en casi todas las posiciones de las 100 bp en flujo ascendente respecto del punto de inicio de la ~ globina, y el sorprendente resultado es que casi ninguna de las mutaciones afecta la capacidad del promotor para iniciar la transcripci6n. Por otra parte, ocurren mutaciones descendentes en tres localizaciones correspondientes a tres elementos cortos bien definidos. Los dos elementos en flujo ascendente producen un efecto mayor en el grado de transcripcion que aquel mas cercano al pun to de inicio. Ademas, se produce mutacion ascendente solo en uno de los elementos. Se concluye que las tres secuencias cortas centradas en -30, -75 y -90 constituyen el promotor, y cada una de ellas corresponde a la secuencia de consenso para un tipo com(m de elemento promotor. La caja TATA (centrada en -30) es el componente menos eficaz del promotor, segun se determina por la disminucion en la transcripci6n provocada por las mutaciones. Notese que aunque no se impide el inicio cuando hay mutacion en la caja TATA varia la localizacion usual precisa del punto de inicio, lo cual confirma la participaci6n de dicha caja como componente crucial del posicionarniento del promotor medular. Los elementos basales y los que se encuentran en flujo ascendente respecto de ellos tienen diferentes funciones. Los elementos basales (la caja TATA e Inr) deterrninan principalmente la localizaci6n del punto de inicio, pero pueden respaldar el inicio solo en un nivel bastante bajo; identifican la localizaci6n en que los factores generales de transcripci6n se ensamblan para formar el complejo basal. Los elementos de secuencia en flujo mas ascendente influyen en la fi"ecuencia de inicio, con toda probabilidad al actuar de manera directa en los factores generales de transcripcion a fin de promover la eficacia del ensamblaje en un complejo de inicio (vease la seccion 25.5, Los activadores interactuan con el aparato basal). La secuencia en -75 es la caja CAAT , asf llamada por su secuencia de consenso, que fue uno de los primeros elementos comunes en ser descrito. A menudo se localiza cerca de -80, pero puede funcionar a distancias que varian considerablemente respecto del punto de inicio y en cualquier orientacion. Su susceptibilidad a las mutaciones sugiere que participa de manera importante en la determinacion de la eficacia del promotor, pero no influye en su especificidad. La caja GC en -90 contiene la secuencia GGGCGG; a menudo hay multiples copias en el promotor, en cualquier orientacion. Esta caja tambien es un componente relativamente comun del promotor.

628


BJI

La estructura del promotor es flexible, pero el contexte puede ser importante


• Ningun elemento individual de flujo ascendente es irdispensable para la funci6n del promotor, si bien un o : mas deben estar presentes para que el inicio sea efic~: • Algunos elementos son reconocidos por muchos factores, y un factor utilizado en un promotor en particular puede ser determinado por el contexte de l:: otros factores unidos.

Los promotores se organizan segun un principio _"mezcla y apareamiento". Diversos elementos pL den contribuir ala funci6n del promotor, pero l~: guno es indispensable para todos. En la JRA" se incluyen algunos ejemplos. Entre esos promo: res se encuentran en total cuatro tipos de elemerr cajas TATA GC, CAAT y el octamero (un elem e= de 8 bp). Los elementos encontrados en cualqu;:de esos promotores difieren en numero, localizac y orientacion, ninguno es comun a todos. Si b:: el promotor conduce informacion direccional transcripcion procede solo en flujo descende c: las cajas GC y CAAT parecen tener la capacidad ~ actuar en cualquier orientacion, lo cual implica c _ los elementos funcionan solo como sitios de ur. : de DNA para acercar los factores de transcrip c' al pun to de inicio; la estructura de un factor cic: ser suficientemente flexible como para perrni: establecer os protefna-protefna con el ii·- _ rato basal, independientemente de la forma en el dominio de union de DNA este orientado y ci~ distancia exacta del punto de inicio. Se supone que los activadores, que son m.i ~ menos ubicuos, estan disponibles para cualq-..:..:

.~.

SV40 temprano

Cinasa de timidina

Histona H2B

1-. -140-120-1 00 -80 -60 -40 -20 bp Tipos de modulo

~

~

Octamero CAA T

GC

TATA

Los promotores contienen diferentes ciones de cajas TATA, CAAT, GC y otros elementos.

co me ' · ~

promotor que tenga una copia del elemento que reconocen, entre los que se incluyen las cajas CAAT y GC, y el octamero. Todos los promotores podrian necesitar uno o mas de esos elementos para funcionar eficazmente. Un activador suele unirse a una secuencia de consenso de <1 0 bp, pero en realidad cubre una longitud de -20 bp del DNA. Dado el tamaiio de los activadores y Ia longitud del DNA que cubre a cada uno, es de esperar que las diversas protefnas cubran juntas toda Ia region en flujo ascendente a partir del pun to de inicio en que residen los elementos. En general, una secuencia de consenso en particular es reconocida por el activador correspondiente (o por un miembro de una familia de factores) . Sin embargo, en ocasiones, una secuencia de promotor especffica puede ser reconocida por uno de varios activadores. Un activador ubicuo, el Oct-1, se une con el octamero para activar el gen de la histona H2B (y posiblemente tambien otros); es el {mico factor de union octamero en celulas no linfoides. Sin embargo, en celulas linfoides, un activador diferente, el Oct-2, se une a! octamero para activar el gen de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina. AsL Oct-2 es un activador especffico de tejido, en tanto Oct-l es ubicuo. Noes tan importante conocer los detall es exactos del reconocimiento, como el hecho de que diversos activadores reconocen las cajas CAAT. El uso del mismo octamero en el gen H2B de expresion ubicua yen los genes de inmunoglobulina especfficos de linfoides constituye una paradoja, (.por qu e el Oct-l ubicuo no puede activar los genes de inmunoglobulina en tejidos no linfoides? El conrexto debe ser importante; tal vez se requiera Oct-2 mas que Oct-1 para interactuar con otras protefnas que se unen en el promotor. Estos resultados indican que no es posible pronosticar si un gen sera activado por un activador en particular sencillamente con base en la presencia de elementos especificos en su promotor.

Hasta ahora se ha considerado al promotor como una region aislada que se encarga de la union de Ia polimerasa de RNA pero los promotores eucarioticos no necesariamente actuan solos; cuando menos algunos casas, la actividad del promotor aumenta enormemente por la presencia de un potenciador, que consta de otro grupo de elementos, pero se localiza a distancia variable de los considerados como parte constitutiva del promotor mismo. El concepto de que el potenciador es distinto del promotor refleja dos caracterfsticas; no es necesario que la posicion del potenciador respecto del promotor sea fija, sino que puede variar sustancialmente. En la .. u , l se muestra que puede ser de flujo ascendente o descendente, ademas de que suele actuar en cualquier orientaci6n respecto del promotor (es decir, puede estar invertido). Las manipulaciones del DNA muestran que el potenciadar puede estimular a cualquier promotor que este cerca; en genomas silvestres pueden estar dentro de los genes (esto es, apenas en flujo descendente del promotor) o a decenas de kilo bases en cualquier direccion de flujo. Para fines operativos, en ocasiones conviene definir al promotor como una o varias secuencias del DNA que de ben estar en una localizaci6n (relativamente) fija respecto del punto de inicio, definicion que incluye a la caja TATA y otros elementos de flujo ascendente, pero se excluye al potenciador, si bien esta definicion es de trabajo, mas que una clasificaci6n rfgida. En las levaduras se encuentran elementos analogos a los potenciadores llamados secuencias activadoras en flujo ascendente (UAS), los cuales

Los potenciadores contienen elementos bidireccionales que fa cilitan el inicio Conceptos principales • Un potenciador activa al promotor mas cercano, es decir, a cualquier distancia en flujo ascendente o descendente respecto del promotor. • Un UAS (secuencia de activador ascendente) de las levaduras se comporta como potenciador, pero funciona solo en flujo ascendente respecto del promotor. • En potenciadores y promotores se encuentra n elementos de secuencia similares. • Los potenciadores forman complejos de activadores que actuan directa o indirectamente con el promotor.

Transcripci6n

U ~. Un potenciador puede activar a un promotor desde localizaciones de flujo ascendente o descendente y su secuencia se puede invertir respecto del promotor.

24.15 Los potenciadores contienen elementos bidireccionales que facilitan el inicio

629

pueden actuar en cualquier orientacion y a distancias variables en flujo ascendente respecto del promotor, pero no en flujo descendente. Su funcion es regulatoria; en varios casos, Ia UAS esta unida a las protefnas reguladoras que activan los genes en flujo descendente. Los experimentos de reconstruccion en que se elimina la secuencia del potenciador del DNA y despues se inserta en otro sitio, muestran que es posible mantener Ia transcripcion normal en tanto se encuentre en cualquier punto de Ia molecula del DNA, pero si se coloca un gen de ~-globina en una molecula de DNA que contiene un potenciador, su transcripcion aumenta, in vivo, mas de 200 veces, incluso si el potenciador esta varios kb en flujo ascendente o descendente respecto del punto de inicio, en cualquier orientacion; todavfa no se sabe a que distancia deja de actuar el potenciador.

fBra Los potenciadores contienen los mismos elementos encontrados en los promotores Conceptos principales • Los potenciadores estan hechos del mismo t1po de elementos de secuencia que se encuentran en los promotores. • La densidad de los componentes de secuencia es mayor en el potenciador que en el promotor.

Una diferencia entre el potenciador y un promotor comun es Ia densidad de los elementos reguladores. En la se resume Ia sensibilidad del potenciador SV40 a los dafi.os provocados por una mutaci6n, y se observa que un porcentaje mucho

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80

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60

'5

mayor de sus sitios influye directamente en su f; cion, a diferencia de lo que ocurre con el promo: analizado en Ia misma forma en la Figura 24.::. Hay un incremento equivalente en Ia densida · _· los sitios de union de protefnas, de los cuales, 1:-__ chos son elementos comunes, por ejemplo, AP ~ el octamero. La especificidad de Ia transcripci6n puede _ controlada por un promotor o un potenciador. -_ promotor puede ser especfficamente regulaci un potenciador cercano se utilizara para aum~ tar Ia eficacia del inicio; o bien, un promotor p·_ de carecer de regulacion especffica pero activ&~ solo cuando un potenciador cercano es acti,·c:. _ espedficamente. Un ejemplo son los genes de munoglobulinas, que portan potenciadores de; : de la unidad de transcripcion. Los potenciadore-s _ las inmunoglobulinas parecen estar activos sole los linfocitos B, donde se expresan los genes de inmunoglobulinas. Tales potenciadores propor nan parte de Ia red regulatoria mediante Ia cua~ controla Ia expresion genica. Una diferencia entre potenciadores y prom res puede ser que aquellos se muestran mas coo:rativos entre Ia union de factores. Un complejo ~ se ensambla en el potenciador y que responde a ~ (interferon) y se ensambla de manera coopera-para formar una estructura funcionalllamada tenciadorsoma. La union de Ia proteina no h.Gna HMGI (Y) dobla al DNA en una estructura : _ despues se une a varios activadores (NF-KB, OC ATF-Jun) . A diferencia de la estructura de "me: y apareamiento" de los promotores, todos esos cc::ponentes son necesarios para crear una estruc_activa del potenciador; no se unen directame : = Ia polimerasa de RNA, sino que crean una su ~ :e ficie que se une a un complejo de coactivaci6n. D:.::.

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CCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAAC GGTCGACACCTTACACACAGTCAATCCCACACCTTTCAGGGGTCCGAGGGGTCGTCCGTCTTCATACGTTTCGTACGTAGAGTTAATCAGTCGTTG

AP4

AP1

AP3

AP2

Octamero

AP1

Un potenciador contiene varios segmentos estructurales. En el histograma se ilustra el efecto de todas las mutaciones que reducen la funci6n del potenciador a <75% del tipo silvestre. Los sitios de union para las prote1nas se indican abajo del histograma.

630


complejo ayuda al complejo de preiniciaci6n de los ia:ctores de transcripci6n basal que se ensamblan en el promotor para reclutar ala polimerasa de RNA. En la secci6n 25.5, Los activadores interactuan con el a para to basal, se describe en detalle la funci6n de los coactivadores.

E

Los potenciadores actuan aumentando la concentraci6n de los activadores cerca del promotor

Conceptos principales • Los potenciadores suelen funcionar solo en configuraci6n cis con un promotor diana. • Es posible hacer que los potenciadores funcionen en configuraci6n trans por ligamiento del DNA contenido en el promotor diana con DNA contenido en el potenciador mediante un puente prote\nico o por concatenaci6n de las dos moleculas. • El principia es que un potenciador funciona en cualquier situaci6n en que esta constreiiido a La misma proximidad que el promotor.

(. C6mo puede un potenciador estimular el inicio en · n promotor que puede estar localizado a cualquier ·stancia de uno y otro lado? Cuando se descubrie~on los potenciadores, se tomaron en cuenta varias posibilidades respecto de su acci6n como elementos -Iaramente diferentes de los promotores. • Un potenciador podria cambiar la estructura global del molde, por ejemplo, influyendo en la densidad del superenrollado. • Podria encargarse de localizar el molde en un sitio especffico dentro de Ia celula, por ejemplo, al unirlo ala matriz nuclear. • Un potenciador podria proporcionar un "sitio de entrada", un punto en que la polimerasa de RNA (o alguna otra proteina esencial) se vincula inicialmente con la cromatina. Ahora se considera que la funci6n del potenjador implica el mismo tipo de interacci6n con el .:~parato basal que las interacciones dependientes e elementos promotores de flujo ascendente . Los . otenciadores son modulares, igual que los promo~ores. Ciertos elementos se encuentran tanto en potenciadores como en promotores, y algunos de . s que se encuentran en los promotores, compar:en con los potenciadores la capacidad de actuar :. diferentes distancias y en cualquier orientaci6n. \si, se desdibuja Ia distinci6n entre potenciadores y romotores; los primeros podrian ser considerados

como portadores de elementos del promotor, porque se agrupan estrechamente, y porque tienen Ia capacidad de actuar a distancias mayores, respecto del punto de inicio. La funci6n esencial del potenciador podria ser aumentar la concentraci6n del activador cerca del promotor (cercania, en este sentido, es un termino relativo). Dos tipos de experimentos ilustrados en la sugieren que eso es lo que ocurre. Un fragmento de DNA que incluye un potenciador en un extremo y un promotor en el otro, no se transcribe de manera eficaz, pero el potenciador puede estimular Ia transcripci6n desde el promotor cuando se conectan mediante un puente proteinico. Los efectos estructurales del tipo de los cambios en el superenrollado, no podrian transmitirse a traves de tal puente, lo cual sugiere que la caracterfstica clave es acercar mucho a potenciador y promotor. Un potenciador bacteria no proporciona un sitio de union para el regulador NtrC, que actua sobre la polimerasa de RNA utilizando promotores reconocidos por 0' 54 . Cuando el potenciador se coloca en un cfrculo de DNA concatenado (enlazado) con un circulo en que se encuentre el promotor, el inicio es casi tan eficaz como cuando el potenciador y el promotor estan en Ia misma molecula circular. Sin embargo, no hay inicio si el potenciador y el promotor estan separados. Tambien en este caso se sugiere que la caracteristica mas importante es la localizaci6n de la proteina unida con el potenciador, lo cual aumenta la posibilidad de que este ultimo entre en o con una proteina unida al promotor.

Estructuras inactivas

Estructuras activas Puen!~.

Promotor

proteinico

Po~enciador

/.J"'¥JYJ"YIYN/'Y}Y/\ti'Y/VJYJ
-+

Circulos concatenados

Un potenciador puede actuar acercando prote\nas al promotor. Si bien no actua en un promotor en el extrema opuesto de un DNA lineal largo, se torna eficaz cuando el DNA se integra a un circulo mediante un puente prote\nico. Cuando el potenciador y el promotor se encuentran en DNA circulares diferentes no interactuan, pero pueden hacerlo cuando las dos moleculas se concatenan .

24.17 Los potenciadores actuan aumentando la concentraci6n de los activadores cerca del promotor

631

Silas protefnas unidas en un potenciador a varios kb de distancia de un promotor interactuan directamente con protefnas unidas cerca del punta de inicio, Ia organizaci6n del DNA debe ser suficientemente flexible como para permitir que potenciador y promotor se ubiquen cerca uno del otro, para lo cual es necesario que el DNA interpuesto se pueda expulsar como una "asa" grande. Tales asas se han observado directamente en el caso de un potenciador bacteriano. Una interesante excepci6n a Ia regia de que los potenciadores actuan en configuraci6n cis en circunstancias naturales es el fen6meno de Ia transfeccion. El apareamiento de los cromosomas somaticos permite a un potenciador de un cromosoma activar a un promotor del cromosoma homologo, lo cual refuerza el punta de vista de que los potenciadores actuan por proximidad. c. Que limita Ia actividad de un potenciador? Por lo general, actua sabre el promotor mas cercano, pero hay circunstancias en que un potenciador esta entre dos promotores y activa solo a uno de ellos con base en os especfficos protefna-protefna entre los complejos unidos con los dos elementos. La accion de un potenciador puede ser limitada por un aislador, elemento del DNA que impide al potenciador actuar en los promotores mas alla de su ubicacion (vease la seccion 2 9 .14, Los aisladores bloquean las acciones de los potenciadores y de Ia heterocromatina). No se ha definido aun que tan general es el potenciamiento; se desconoce que porcentaje de los promotores celulares requiere de un potenciador para alcanzar su grado usual de expresion, y tambien que tan a menudo un potenciador constituye una diana para la regulacion. Algunos potenciadores se activan solo en los tejidos en que actuan sus genes, pero otros podrfan estar activos en todas las celulas.

E

reversible desencadenado por modificaciones de histonas que incluyen desacetilaci6n y metilac: protefnicas (vease Ia seccion 30. 9, La metilaci6c _ las histonas y el DNA esta relacionada). La metilaci6n es tambien un suceso epigene co, en cuyo caso, puede dar Iugar a modificacio;especfficas del espermatozoide o el oocito, de m .:. que tal vez habrfa una diferencia entre dos alelos : Ia siguiente generacion. El resultado de esto pod_-=.,: ser diferencias en Ia expresion de los alelos pater y materna (vease Ia seccion 31.8, La metilacion :..DNA es Ia causa de Ia impresion). En este capitulo se abordan los medias por _ que Ia metilacion influye en Ia transcripci6n, _ son los mismos si se agregan o eliminan grupos IL -tilo como suceso regulatorio locaL o epigenetic0. La metilacion en los promotores de Ia polii::c rasa de RNA II ocurre en pares CG. La distribuc de los grupos metilo puede realizarse aprovechac las enzimas de restricci6n que rompen sitios diaque contienen pares CG. En Ia U 4:'6 sec paran dos tipos de actividades de restriccion. b -: isoesquiz6meros son enzimas que fragmentar. misma secuencia diana del DNA, pero responden .:..manera diferente ante su estado de metilacion. La enzima Hpall fragmenta Ia secuencia CC C: : (escribiendo Ia secuencia de solo una cadena DNA). Sin embargo, si Ia segunda C esta metilada ~ enzima ya no podra reconocer el sitio. No obstac -

Metilado

Mspl

No metilado

La expresi6n genetica se vincula con la desmetilaci6n

Concepto principal • La desmetilaci6n en el extremo 5' del gen es necesaria para La transcripci6n.

La metilacion del DNA es uno de varios sucesos reguladores que influyen en Ia actividad de un promotor; su efecto impide la transcripcion, y los grupos metilo deben ser eliminados para que se active el promotor. Dicho efecto esta bien caracterizado en los promotores de las polimerasas I y II de RNA. De hecho, Ia metilacion es un suceso regulatorio 632


GGCC Me El sitio metilado no se escinde

El sitio no metilado se escinde

La enzima de restricci6n Mspi fragmenta to-: las secuencias CCGG, metiladas o no, en La segunda C, _ Hpaii fragmenta solo los tetrameros CCGG no metilados.

Ia enzima Mspi fragmenta el mismo sitio diana, independientemente e! estado de metilacion en esa C, de modo que se puede usar Mspl para identificar todas las secuencias CCGG y usar Hpall para determinar si estan metiladas. Con un sustrato de DNA no metilado, las dos enzimas generarfan las mismas bandas de restriccion. No obstante, en el DNA metilado, las posiciones modificadas no son fragmentadas por la Hpaii; para cada una de dichas posiciones, un segmento mayor de Hpaii sustituye a dos segmentos de Mspl. Vease el ejemplo de la IGU 7. Muchos genes muestran un patron en que el estado de metilacion es constante en casi todos los sitios, pero varfa en otros; algunos de los sitios estan metilados en todos los tejidos revisados, a diferencia de otros. Una minima parte de los sitios esta metilada en los tejidos en que el gen nose expresa, pero no esta metilada en sitios en que el gen no esta activo. Por tanto, se puede describir a un gen activo como submetilado. Los experimentos con el farmaco 5-azacitidina aportan pruebas indirectas de que la desmetilacion puede dar como resultado la expresion genetica. Dicho farmaco se incorpora al DNA, no ala citidina, y no puede metilarse porque Ia posicion 5' esta obstruida, lo cual !leva a Ia aparicion de sitios desmetilados en el DNA como consecuencia de la replicacion (segun el esquema de Ia derecha de la Figura 15.7). Los efectos fenotfpicos de Ia 5 -azacitidina incluyen Ia induccion de cambios en el estado de diferenciacion celular. Por ejemplo, se induce a cetulas musculares a desarrollarse a partir de precursores celulares diferentes del musculo. El farmaco tambien activa genes en un cromosoma X silencioso,

•

•

•

&

.....

Producto de digestion de Mspl

Producto de digestion de Hpall Una banda exclusiva de Hpall sustituye a las bandas de Mspl

Bandas exclusivas de Mspl = sitios metilados

Banda en Ia misma - - - --4posicion =sitio no metilado

IGU ~4 ., Los resultados de Mspl y Hpaii se comparan electroforesis en gel de los fragmentos.

par

lo cual resulta en la posibilidad de que el estado de metilacion podrfa estar relacionado con Ia inactividad cromosomica. Revisando el estado de metilacion de los genes residentes, es posible comparar los resultados de Ia introduccion de DNA metilado, o no, a nuevas celulas hospedadoras, experimentos que muestran una clara correlacion: el gen metilado esta inactivo, pero el no metilado esta activo. (.Que extension tiene Ia region submetilada? En el grupo de genes de a globina del polio de celulas eritroides adultas, Ia submetilacion se confina a los sitios que van de -500 bp en flujo ascendente respecto del primero de dos genes a de adultos, a -500 bp en flujo descendente del segundo. Los sitios de submetilacion se encuentran en Ia misma region, incluido el espaciador intermedio. La region de submetilacion coincide con la de sensibilidad maxima a Ia desoxirribonucleasa I. Con esto se argumenta que la submetilacion es la caracterfstica de un dominio que contiene un gen transcrito o varios. Como con otros cambios de Ia cromatina, parece probable que los grupos metilo se relacionen con la capacidad de transcripci6n, mas que con la transcripcion en sf. El problema de la interpretacion del vinculo general entre la activacion del gen y la submetilacion es que solo participa una minorfa de los sitios metilados (en ocasiones muy pequefia). Es posible que el estado de metilacion sea crftico en sitios especfficos o en una region restringida, como tambien lo es que una disminucion en el grado de metilacion (o incluso la eliminacion total de grupos metilo de alguna cadena del DNA) sea parte de algun cambio estructural que permite que avance la transcripcion. En particular, la desmetilacion del promotor podrfa ser necesaria para que este disponible para el inicio de la transcripcion. En el gen de y globina, por ejemplo, Ia presencia de grupos metilo en la region que rodea a! pun to de inicio, entre -200 y +90, suprime la transcripcion. La eliminacion de los tres grupos metilo localizados en flujo ascendente respecto del pun to de inicio, o de los tres grupos metilo en flujo descendente, no alivia la supresion, pero la eliminacion de todos los grupos metilo permite que el promotor funcione. Por lo tanto, la transcripcion puede implicar una region sin metilos en el promotor (vease Ia seccion 24.19, Los islotes G son dianas reguladoras). Hay excepciones a esta relacion general. Algunos genes pueden expresarse incluso si estan muy metilados, as! que cualquier de las conexiones entre metilacion y expresion no son universales en un organismo, pero la regia general es que la metilacion impide Ia expresion genica y que se necesita desmetilacion para lograr la expresion. 24.18 La expresi6n genetica se vincula con la desmetilaci6n

633

Los islotes G son dianas

reguladoras Conceptos principales • Los islotes G rodean a los promotores de genes con expresi6n constitutiva donde no est<3n metilados. • Los islotes G tambien se encuentran en los promotores de algunos genes regulados por tejidos. • Hay ~29 000 islotes G en el genoma humano. • La metilaci6n de un islote G impide la activaci6n de un promotor en su interior. • La union de proteinas a pares de G metilados resulta en represi6n.

La presencia de islotes G en las regiones 5' de algunos genes se relaciona con el efecto de !a metilacion en la expresion genetica. Dichos islotes se detectan por una mayor densidad de !a secuencia dinucleotidica G (G = 5'-CG-3'). El par G se encuentra en el DNA de los vertebrados con apenas una frecuencia del -20% de lo que se esperaria a partir del porcentaje de pares de bases G-C (quiza porque los pares G estan metilados en C y !a desami.nacion espontanea de !a metil-C Ia transforma en T, con lo que se introduce una mutacion que elimina a! par), pero en ciertas regiones, Ia densidad de los pares G llega a! valor

y-globina

r

I'

I

.

IL

I

5'

Ex6n

Ex6n

1

2

500

1000

bp

5' __

Ex6n

Ex6n

1

2

La concentraci6n usual de los pares G en el DNA de mamifero es ~1/100 bp, como en el caso de un gen de gamma globina. En un islote rico en G la densidad aumenta a >10 pares/100 bp. El islote del gen APRT se inicia ~100 bp en flujo ascendente respecto del promotor y cubre ~400 bp hacia el gen. Cada linea vertical representa un par G.

634


pronosticado; de hecho, aumenta 10 veces, respec del resto del genoma. En esas regiones, los pa~ G no estan metilados. En estos islotes ricos en G, el contenido pr medio de G-C es de -60%, respecto del promeri: de 40% de Ia mayor parte del DNA; asumen forma de cadenas de DNA, por lo general de l c: ~ kb de longitud. Hay -45 000 de ellos en el geno - ' humano, algunos en elementos repetidos Alu, q·_;_ za como consecuencia de su elevado contenido ::.G-C. En Ia secuenciacion del genoma humano ::confirmo que, descartados estos, hay -29 000 is: . tes, y son menos en el genoma de raton, -15 5 : Mas o me nos l 0 000 de los islotes pronosticados e-ambas especies parecen residir en un contexto C= secuencia que se conserva entre especies, lo Ct.L: sugiere que podrian corresponder a aquellos qc._ tienen importancia reguladora. La estructura de :.. :_ cromatina en esas regiones presenta cambios vi·· culados con !a expresion genica (vease la secci ' 30.11, La activacion del promotor implica una rie ordenada de sucesos), disminuye el conten.ic . de Ia histona Hl (lo cual probablemente signific que la estructura es menos compacta); las otrc. histonas estan ampliamente acetiladas (caract- ristica que tiende a vincularse con !a expresi - ~ genica) y hay sitios hipersensibles (como seria "::esperar de los promotores activos) . En varios casos, los islotes ricos en G empie-zan justo en flujo ascendente respecto de un pr motor y se extienden en flujo descendente hacia ...:. region transcrita, antes de desaparecer. En Ia nc se compara la densidad de los pares G e:una region "general" del genoma con un islote Cr ~ identificado a partir de !a secuencia del DNA; e5:-: ultimo rodea !a region 5' del gen APRT, que tie1: -:: expresion constitutiva. Todos los genes "domesticos" que se expres- de manera constitutiva tienen islotes G, es dec' casi Ia mitad; la otra mitad se presenta en los promt tores de genes regulados por tejidos, y solo una pt quefia pane (<40 % ) de esos genes tiene islotes, e~ cuyo caso, no estan metilados, independientemen:::del estado de expresion del gen. Los islotes riCf . en G no metilados pueden ser necesarios per por lo tanto, es insuficiente para la transcripci6 Asi, la presencia de islotes G no metilados pue ~ ::tomarse como indicio de qu e un gen es potencia.: mente activo, que ser transcrito inevitablemen> Muchos islotes no metilados en animales, se tome.:. metilados en lineas celulares de cultivos de tejid lo cual podria relacionarse con !a imposibilidad ~ ~ esas lfneas para expresar todas las funciones usua~ _ del tejido del que se derivan. La metilacion de un islote G puede afectar _:. transcripcion por uno de dos mecanismos:

• La metilacion de un sitio de union para a)gun factor puede evitar su union, como en el caso de la union con un sito regulador diferente del promotor (vease Ia seccion 31.9, Los genes con impresion opuesta pueden ser controlados por un solo centro). • La metilacion puede hacer que represores especfficos se unan al DNA. La represion se debe a uno de dos tipos de protefnas que se unen a las secuencias G metiladas. La protefna Me 1 requiere de varios grupos metilo para unirse al DNA, en tanto que Me2 y una familia de protefnas relacionadas se pueden unir a un solo par de bases G metiladas. Esto explica porque se necesita una zona sin metilacion para el inicio de la transcripcion . La union de protefnas de cualquier tipo impide la transcripcion in vitro por un extracto nuclear. La Me2, que reprime directamente la transcripcion por interaccion con complejos en el promotor, se une tambien a! complejo represor Sin3, que ~iene actividad de desacetilasa de histonas (vease la Figura 30.16). Esta observaci6n constituye una conexion directa entre dos tipos de modificaciones represivas, Ia metilacion del DNA y Ia desacetilacion de histonas. La ausencia de grupos metilo se vincula con Ia expresion genica, si bien hay algunas dificultad es para sustentar que el estado de metilacion constituya un medio general de control de la expresion genica. En el caso de Drosophila melanogaster (y otros insectos dfpteros), el DNA esta escasamente metilado (si bien hay un gen que posiblemente codifique una metiltransferasa) y en el nematodo Clostridium elegans el DNA no esta metilado. Las otras diferen cias entre la cromatina inactiva y la activa parecen ser las mismas que en especies que presentan metilacion. Asi, en esos organismos, cualquiera que sea la organizacion de la metilacion en los vertebrados, es sustituida por algun otro mecanismo. En genes activos se producen tres cambios: • Se establece uno o varios sitios hipersensibles cerca del promotor. • Los nucleosomas de un dominio que incluye la region transcrita se tornan mas sensibles a la desoxirribonucleasa I. • El DNA de Ia misma region esta submetilado. Todos esos cam bios son necesarios para la transcripcion.

E

Resumen

::)e las tres polimerasas de RNA eucarioticas, la I :ranscribe del DNAr y contribuye a la mayor parte

de las actividades; Ia II transcribe genes estructurales para RNAm y tiene los productos mas variados, en tanto que la III, transcribe RNA pequefi.os. Las enzimas tienen estructuras similares, con dos grandes subunidades y muchas subunidades mas pequefi.as; hay algunas subunidades comunes entre enzimas. Ninguna de las tres polimerasas de RNA reconoce directamente a sus promotores. Un principia unificador es que los factores de transcripcion tienen Ia responsabilidad primaria de reconocer los elementos de secuencia caracterfsticos de cualquier promotor en particular y sirven, a su vez, para unirse a la polimerasa de RNA y posicionarla correctamente en el punto de inicio. En cada tipo de promotor, el complejo de inicio se ensambla por una serie de reacciones en que los factores individuales se unen al complejo (o lo abandonan). El factor TBP es necesario en las tres polimerasas de RNA para el inicio; en cada caso proporciona una subunidad de un factor de transcripcion que se une en las cercanfas del punto de inicio. Un promotor consta de varios elementos de secuencia cortos en Ia region en flujo ascendente respecto del punto de inicio, cada uno de los cuales esta unido a un factor de transcripci6n. El aparato basal, que consiste en los factores TF 0 , se ensambla en el punto de inicio y permite que se una Ia polimerasa de RNA. La caja TATA (si la hay), cercana al punto de inicio, y la region iniciadora, ubicada justo en este, se encargan de la seleccion del punto de inicio exacto en los promotores de la polimerasa de RNA II. La TBP se une directamente con Ia caja TATA, en su caso; en los promotores que carecen de ella, se localiza cerca del pun to de inicio por union a DPE en flujo descendente. Despues de la union de TF 0 D, los otros factores generales de transcripcion de Ia polimerasa de RNA II ensamblan el aparato de transcripci6n basal en el promotor. Otros elementos del promotor localizados en flujo ascendente respecto de Ia caja TATA se unen a activadores que interactuan con el aparato basal. Los activadores y los factores basales son liberados cuando la polimerasa de RNA inicia Ia elongacion. El CTD de la polimerasa de RNA II es fosforilado durante la reaccion de inicio. El TF1p y las proteinas SRB pueden interactuar con el CTD, asf como proporcionar un punto de o para las protefnas que modifican el producto de transcripcion del Ri\IA, incluida la enzima de estructuracion del capuch6n 5', los factores de corte y empalme y el complejo de procesamiento 3'. Los promotores pueden ser estimulados por potenciadores, secuencias que pueden actuar a grandes distancias y en cualquier orientacion, a uno y otro !ado de un gen. Los potenciadores tambien constan 24.20 Resumen

635

de conjuntos de elementos, si bien su organizaci6n es mas compacta. Algunos elementos se encuentran tanto en promotores como en potenciadores. Los potenciadores tal vez actuen ensamblando un complejo protefnico que interactua con las protefnas unidas en el promotor, lo cual implica que el DNA interpuesto forme "asas" . Los islotes G contienen concentraciones de pares G; a menudo rodean a los promotores de genes con expresi6n constitutiva, aunque tambien se encuentran en los promotores de los genes regulados. El islote que incluye a un promotor debe estar no metilado para que dicho promotor pueda iniciar la transcripci6n. Una protefna especffica se une a los pares G metilados y evita el inicio de Ia transcripci6n.

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EIIJ

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lfBI

El TFmB es el factor de encargo para los promotort : de la Pol III

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I1JI

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IZJI

fZJE!l

El aparat o basal se ensambla en, el promotor


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fDII

El inicio va seguido de la depuracion del promotor

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fDIJ

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Referencias

639

Activaci6n de La transcripci6n ESQUEMA DEL CAPITULO _/

ml

Los elementos de respuesta son reconocidos :: los activadores

Introduccion • La expresion del gen eucariotico suele controlarse en el ambito del inicio de la transcripcion.

• Los elementos de respuesta pueden localizarse en promotores o potenciadores. • Cada elemento de respuesta es reconocido par un ac'- o.. especifico. • Un promotor puede tener muchos elementos de respc=._que, a su vez, pueden activar la transcripcion de rna-~-; independiente o en ciertas combinaciones.

lmfJI Hay varios tipos de factores de transcripcion • El aparato basal determina el punta de inicio de la transcripcion. • Los activadores determinan la frecuencia de la transcripcion. • Los activadores actuan estableciendo os proteinaproteina con los factores basales. • Los activadores pueden actuar a traves de coactivadores. • Algunos componentes del aparato de transcripcion actuan modificando la estructura de la cromatina.

mil Hay muchos tipos de dominios de union con : • Los activadores se clasifican de acuerdo con el tipo c ~ union con DNA. • Los del. mismo grupo tienen variaciones de secuencia de un segmento especifico que les confiereespecificidad para sitios diana especificos.

lfBI Dominios independientes se unen con el DNA y activan la transcripcion • La actividad de union con DNA y activacion de la transcri pcion son obra de dominies independientes de un activador. • La funcion de la union del dominic con el DNA es acercar el dominic de activacion de la transcripcion al promotor.

mJ El segmento de dedo de zinc es un dominio de union con DNA • Un dedo de zinc es un asa de -23 aminoacidos que sobresale de un sitio de union de zinc formado por lo; aminoacidos His y Cis. • Una proteina con dedos de zinc suele tener varies. • La porci6n C terminal de cad a de do forma un a helice ~- se une a un giro del surco mayor del DNA. • Algunas proteinas de dedos de zinc se unen con el R r no al DNA, o ademas de al DNA.

Em9i El analisis de dos hibridos detecta interacciones proteina-proteina • El analisis de dos hibridos actUa solicitando una interacci6n entre dos proteinas, donde una tiene un dominic de union con DNA y la otra un dominic de activacion de la transcripci6n.

lfiB

Los activadores interactuan con el aparato basal • El principia que regu la la funcion de los activadores es que el dominic de union con el DNA determina la especificidad para el promotor o potenciador diana. • El dominio de union con DNA se encarga de localizar el dominio de activacion de la transcripci6n en las cercanias del aparato basal. • Un activador que actua directamente tiene un dominio de union con el DNA y uno de activacion. • Un activador que no tiene un dominio de activacion puede actuar uniendose a un coactivador. que si lo tiene. • Varios factores del aparato basal son dianas con las que interactuan activadores o coactivadores. • La polimerasa de RNA puede vincularse con diversos conjuntos alternos de factores de transcripcion en forma de un complejo holoenzimatico.

mil Algunas proteinas de union con promotor

640

fBliJ

Los receptores de esteroides sc:: activadores • Los receptores de esteroides son ejemplos de activado·:__ de respuesta a ligandos que se activan por union con _esteroide (u otras moleculas relacionadas). • Hay dominies separados de union con DNA y de union ::ligandos.

fDI)

Los receptores de esteroides tienen dedos de z:'- : • El dominic de union con DNA de un receptor de estero': ;:. es un tipo de dedo de zinc que tiene la porcion Cis, pe-~ · la His. • Los receptores de glucocorticoides y estrogenos tienen dos dedos de zinc cada uno, el primero de los cuales determina la secuencia diana del DNA. • Los receptores de esteroides se unen al DNA como dime·: _

fBB

corresponden a represores

La union con elemento de respuesta es activadc: por la union con ligando

• La represion suele lograrse par afectaci6n de la estructura de la cromatina, pero hay represores que actuan par union con promotores especificos.

• La union delligando con el dominio C terminal aument.; .:: afinidad del dominio de union con DNA par su sitio dia - ~ especifico en el DNA.

Los receptores de esteroides reconocen a los elementos de respuesta por un c6digo combinatorio • Un elemento de respuesta a esteroides consta de dos sitios mitad cortos, palindr6micos o de repetici6n directa. • Hay s6lo dos tipos de sitios mitad. • Un receptor reconoce su elemento de respuesta par la orientaci6n y el espaciamiento de los sitios mitad. • La secuencia de los sitios mitad es reconocida por el primer dedo de zinc. • El segundo dedo de zinc se encarga de la dimerizaci6n , que determina la distancia entre subunidades. • La separaci6n de las subunidades en el receptor determina el reconocimiento del espaciado en el elemento de respuesta. • Algunos receptores de esteroides actuan como homodlmeros, en tanto que otros forman heterodlmeros. • Los homodlmeros reconocen elementos de respuesta palindr6micos; los heterodlmeros reconocen elementos de respuesta de sitios mitad con repetici6n directa.

fB]iJ

• Las protelnas helice-asa-helice tienen un segmento de 40 a 50 aminoacidos que incluye do s a helices anfipaticas de 15 a 16 aminoacidos, separados par un asa. • Las helices se encargan de la formaci6n de dimeros. • Las protelnas bHLH tienen una secuencia basica adyacente al segmento HLH , que se encarga de la union con el DNA. • Las protelnas de clase A bHLH son de expresion ubicua, en tanto que las de clase B bHLH son especlficas de tejido. • Una protelna de clase B par lo general forma un heterodlmero con una protelna de clase A. • Las protelnas HLH que carecen de region basica impiden que la contraparte bHLH de un heterodlmero se una con el DNA. • Las protelnas HLH forman vlnculos combinatorios que podrian cambiar durante el desarrollo por la adici6n o la eliminacion de proteinas especificas.

Glm

Los homeodominios se unen con dianas relacionadas en el DNA • El homeodominio es un dominio de DNA de 60 aminoacidos que tiene tres a helices. • El C terminal del a helice 3 tiene 17 aminoacidos y se une con el surco mayor del DNA. • El brazo Nterminal del homeodominio se proyecta hacia el surco menor del DNA. • Las protelnas que contienen homeodominios pueden corresponder a activadores o represores de la transcripci6n.

Introducci 6n :;mcepto principal La expresi6n de los genes eucari6ticos suele controlarse en el ambito del inicio de La transcripci6n.

-""-' diferencias fenotfpicas que distinguen a los di-:rsos tipos de celulas en una eucariota superior se --=ben en gran parte a diferencias en la expresi6n -= genes que codifican protefnas, esto es, las trans--:Las por Ia polimerasa II de RNA. En principia, Ia -. resi6n de esos genes podrfa ser regulada en una 7 varias etapas. Se pueden distinguir (cuando me: 5) cinco puntas de control posibles que forman -erie siguiente: Activaci6n de Ia estructura del gen j,

Inicio de la transcripci6n j,

Procesamiento del producto de transcripci6n j,

Transporte al citoplasma j,

Traducci6n del RNArn

Las proteinas helice-asa-helice interactUan por vinculo combinatorio

Las cremalleras de leucina participan en la formaci6n de dimeros • La cremallera de leucina es una helice anfipatica que presenta dimerizacion. • La cremallera es adyacente a una region basica que se une con el DNA. • La dimerizacion forma el segmento bliP donde se unen en forma simetrica dos regiones basicas a repeticiones invertidas del DNA.

fBD

Resumen

Como se observa en la , la expresi6n genica en eucariotas es controlada sobre todo al iniciarse la transcripci6n. Para la mayor parte de los genes, es el principal punto de control de su expresi6n, el cual implica cambios de la estructura de la cromatina del promotor (vease Ia secci6n 30.11, La activaci6n del promotor implica una serie ordenada de sucesos) , acompafiada de Ia union del aparato basal de transcripci6n (que incluye la polimerasa II de RNA) al promotor. (La regulaci6n en etapas subsiguientes de la transcripci6n es rara en celulas eucari6ticas. En algunos genes se observa terminaci6n prematura, la cual es contrarrestada por una cinasa, P-TEFb, pero por lo demas, no parece que se emplee el proceso anti terminaci6n.) El producto primario de la transcripci6n es modificado por un capuch6n en el extrema 5' y, en general, tambien es transformado por la poliadenilaci6n del extrema 3'. Se de ben extirpar los intrones de los productos de transcripci6n de los genes interrumpidos y el RNA maduro debe exportarse del nucleo al citoplasma. La regulaci6n de la expresi6n genica por selecci6n de secuencias en el ambito del RNA nuclear podrfa implicar una o todas esas etapas, pero ]a que ma s ha tenido preocupado, en cuanto a pruebas, se refiere a cambios en el corte 25.1 Introducci6n

641

Control del inicio de Ia transcripci6n: usado por casi todos los genes La estructura local del gen cambia

)) )) )J ffi )) )J ... ]} )L/J) El aparato general de transcripci6n se une con el promotor

interrogantes acerca de esa forma de regula GComo identifica el factor de transcripci6n su g:-_ de genes diana? GC6mo se regula la actividad ' del factor de transcripci6n en respuesta a se- ~ intrfnsecas o extrfnsecas?

Hay varios tipos de factores de transcripci6n Conceptos principales • El aparato basal determina el punta de inicio de la transcripci6n.

El RNA se modifica y procesa: puede controlar Ia expresi6n de productos genicos altemos

__J. = o = AAAA El RNAm se exporta del nucleo al citoplasma: no regulado

• Los activadores determinan la frecuencia de la transcripci6n. • Los activadores actuan estableciendo os proteina-proteina con los factores basales. • Los activadores pueden actuar a traves de coactivadores. • Algunos componentes del aparato de transcripci6n actuan modificando la estructura de La cromatina.

AAAA ======~~====~' ~

Nucleo

""

Citoplasma

Se traduce el RNAm: regulado en el desarrollo de anfibios

La expresi6n genica es controlada principalmente al inicio de la transcripci6n, yes raro que los pasos subsiguientes permitan determinar si se expresa un gen, aunque se puede usar un control del proceso para definir la forma del gen se representa en el RNAm.

y empalme; algunos genes expresan mediante patrones alternos de corte y empalme cuya regulaci6n controla el tipo de producto protefnico (vease Ia secci6n 26.12, El corte y empalme alterno implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme). En ultima instancia, la traducci6n de un RNAm en el citoplasma puede controlarse de manera especffica. Si bien el empleo de ese mecanismo es raro en las celulas somaticas del adulto, se presenta en algunas situaciones embrionarias, lo que implicarfa la localizaci6n del RNAm en sitios especfficos donde se expresa el bloqueo del inicio de la traducci6n por factores protefnicos especfficos o ambos. La regulaci6n de la transcripci6n genica especffica de tejidos constituye el meollo de la diferenciaci6n eucari6tica. Un factor de transcripci6n regulatorio sirve para el control comun de gran numero de genes diana y se ha intentado responder a dos 642

CAPITULO 25 Activaci6n de la tra nscripci6 n

El inicio de Ia transcripci6n implica muchas i.;:_acciones protefna-proteina entre factores de t 'cripci6n unidos con el promotor o un potencia. asf como con Ia polimerasa de RNA. Los fac req ueridos para Ia transcripci6n se pueden divi ·- . varias clases, las cuales se describen en la siguk:. lista. En Ia se resumen sus propiedc. - • Los factores basales, aunados ala polin::sa de RNA, se unen con el punto de i.::__ de Ia caja TATA (vease Ia secci6n 24. 1 : aparato basal se ensambla en el promo: • Los activadores son factores de trans- cion que reconocen elementos de consr espedficos, cortos y que se unen con > del promotor o de activadores (vea_eo secci6n 24.13, Los elementos de secu - cortos unen activadores) . Su acci6n im ; a umentar la eficacia del aparato basal -;-: unirse con el promotor, de modo que i.L ~ mentan Ia frecuencia de Ia transcripci se necesitan para que un promotor actti~ un nivel adecuado. Algunos activador : nJ.an de manera constitutiva (son ubic~ en tanto a otros tienen un papel regu·- .:. y se sintetizan o activan en momento;. : pedficos o en tejidos especfficos, de ~::_ que se encargan del control de los patrr- · de transcripci6n en tiempo y espacio. ::_ secuencias a las que se unen se Haman e: mentos de respuesta. • Los de otros grupos de fac: : para Ia transcripci6n eficaz, en sf, n:

unen con el DNA. Los coactivadores proporcionan una conexi on entre activadores y aparato basal (vease !a seccion 25.5, Los activadores interactuan con el aparato basal); actuan por interacciones protefna-protefna y forman puentes entre los activadores y el aparato basal de transcripcion. • La accion de algunos activadores y otros reguladores provoca cambios en !a cromatina (vease !a seccion 30.7, Las acetilasas serelacionan con activadores). La diversidad de los elementos a partir de los ~_;_ ales puede construirse un promotor funcional las variaciones en cuanto a su localizacion, resc:-cto del punto de inicio, sugieren el argumende que los activadores tienen capacidad para __reractuar entre sf o en interacciones protefna-pro~1na en multiples formas. No parece haber restric.::ones en cuanto a relaciones potenciales entre los =-:ementos. La naturaleza modular del promotor se _Jstra mediante experimentos en que se han inter__:.mbiando regiones equivalentes de promotores -'iferentes . Los promotores hfbridos, por ejemplo, :._ue los genes de la timidina cinasa D y los genes de .: globulina beta funcionan bien, lo cual sugiere que :: principal proposito de los elementos es acercar los . :tivadores a los que se unen, al complejo de ini=acion, donde las interacciones protefna-protefna _':'terminan la eficacia de la reaccion de inicio. La organizacion de los promotores de !a poli:."'! erasa II de RNA contrasta con !a de los promo- res bacterianos, en la cual todos los factores de _anscripcion deben actuar directamente con la pomerasa de RNA. En el sistema eucariotico, solo ..s factores basales interactuan directamente con la ::-tzima. Los activadores pueden interactuar con los __:.ctores basales o con coactivadores que, a su vez, __teractuan con los factores basales. La construcci6n :el aparato en capas de interacci6n explica la flexi:Jidad con que los elementos pueden disponerse y c3 distancia en que pueden dispersarse.

Domi nios i ndependientes se unen con et DNA y activan ta transcripci6n Conceptos pri nci pales • La actividad de union con DNA y activaci6n de la transcripci6n son obra de dominies independientes de un activador. • La funci6n de la union del dominic con el DNA es acercar el dominic de activaci6n de la transcripci6n al promotor.

Potenciador

La polimerasa de RNA y los factores basales se unen con el promotor

Los activadores se unen con el promotor

Los activadores se unen con sitios distales en el promotor o con potenciadores

Los coactivadores conectan a los activadores con los factores basales

Los coactivadores o reguladores actuan en Ia estructura local delgen

Los factores involucrados en la expresi6n genica incluyen la polimerasa de RNA y el aparato basal, activadores que se unen directamente con el DNA en el promotor o con potenciadores; coactivadores que se unen tanto a los activadores como al aparato basal, y reguladores que actuan en la estructura de la cromatina.

Los activadores y otras protefnas regu ladoras necesitan dos tipos de capacidad: • Reconocen secuencias diana especfficas localizadas en activadores, promotores u otros elementos reguladores que afectan a un gen diana particular. • Una vez unido con el DNA, un activador ejerce su funci6n a! unirse con otros componentes del aparato de transcripci6n. (,ES posible caracterizar dominios en el activador que se encargan de esas actividades? A menudo un activador tiene dominios separados que unen DNA y activan la transcripci6n . Cada dominio se comporta como un modulo independiente que actua por su cuenta cuando se enlaza con un dominio

25 .3 Dominies independientes se unen con el DNA y activan la transcripci6n

643

de otro tipo . La geometria del complejo de transcripcion global debe permitir al dominio de activacion entrar en o con el aparato basal, sin importar la localizacion exacta y la orientacion del dominio de union del DNA. Los elementos de direccion ascendente respecto del promotor deben estar a una distancia apreciable desde el punta de inicio y en muchos casas orientados en cualquier direccion. Los activadores incluso pueden estar mas lejos, y siempre muestran independencia de orientacion. Esta organizacion tiene implicaciones tanto para el DNA como para las protefnas. El DNA puede presentar asas o condensarse de alguna forma para permitir la forma cion del complejo de transcripcion. Por otra parte, los dominios del activador pueden conectarse de forma flexible como se ilustra esquematicamente

Dominio activador

Dominio de union con DNA Las funciones de union con DNA y su activaci6n en un factor de transcripci6n pueden incluir dominios independientes de la prote1na.

en la . Lo principal en este caso es : los dominies de union y de activacion del DN. _ independientes, y se conectan de forma que pe::-:ten que el dominio de activacion interactue c :aparato basal, independientemente de la oriecion y la localizacion exacta del dominic de t ~ de DNA. La union con DNA es necesaria para la aG cion de la transcripcion, pero c.la activacion depede un dominic de union de DNA en particular? En la se ilustra un experimento ::responder a esta pregunta. El activador Gal4 .. _ un dominio de union de DNA que reconoce u n ·. y un dominio de activacion que estimula el i: .. en el promotor diana. El represor bacteriano L: tiene un dominic de union de DNA terminal!\ _ reconoce un operador espedfico. Cuando Lex.--. une a este operador, rep rime al promotor adya\: _ te. En un experimento de "trueque", el domin:union de DNA de LexA puede ser sustituid el de DNA de Gal4, de manera que el gen h.ib :pueda introducirse en la leva dura con un gen ct· =que contenga UAS o un operador LexA. Una protefna Gal4 autentica puede activa < _ gen diana solo si tiene un UAS. Obviamente, e; ~ presor Lex A por sf mismo carece de la capac:-:_ para activar cualquie r tipo de diana, y el hfb:LexA-Gal4 ya no puede activar un gen con ~ jpero ahara puede activar al gen que porta el rador LexA!

Activador Gal4

Uni6n de Gal4 con DNA Activador Gal4

Uni6n y transcripci6n

I

Uni6n de LexA con DNA La capacidad de Gal4 para activar la transcripcion es independiente de su especificidad para la union con DNA. Cuando el dominio de union con DNA Gal4 es sustituido por el de uni on con DNA LexA, la prote1na h1brida puede activar la transcripcion cuando se coloca un operador LexA cerca de un promotor.

644

CAPITULO 25 Activacion de la transcripcion

Este resultado concuerda con el punto de vista odular de la transcripcion. El dominio de union : )n DNA sirve para llevar la proteina hacia Ia loca.:zacion correcta. No tiene importancia como o don=_ se une precisamente a! DNA, pero una vez a hi, :: dominio de transcripcion-activacion puede ejer:=r su accion. De acuerdo con este punto de vista, -o importa si el dominio de activacion de la trans:::-ipcion se acerca a! promotor por reconocimiento _ un VAS, a traves del dominio de union de DNA e Gal4 o por reconocimiento de un operador LexA, : .raves del modulo de especificidad de LexA; la ca-.acidad de ambos tipos de modulo para actuar en .15 proteinas hlbridas sugiere que cada dominio de .:i protefna se pliega de manera independiente en _na estructura activa en Ia cual no influye el resto ~e Ia proteina. La idea de que los activadores tienen dorn.inios dependientes que se unen con el DNA y que la =.::tivacion de Ia transcripcion se refuerza porIa ca-acidad de Ia proteina tat del VIR para estimular el _"'licio sin union alguna de DNA. La protefna tat se _ e a una region de Ia estructura secundaria en el · !"oducto RNA; Ia parte del RNA requerida para la .:.;::cion de tat se llama secuencia tar. En Ia 5 se muestra un modelo del funcionamiento de .1 interaccion tat-tar en la estimulacion de la trans::ipcion. La secuencia tar se localiza justo en direccion . escendente del punto de inicio, de manera que ::.~ ando se une a tar, se acerca a! complejo de ini-~acion, lo cual es suficiente para asegurar que su .:ominio de activacion este lo suficientemente cerca .: :el complejo de iniciacion. El dominio de activacion .,teractua con uno o mas de los factores de trans.:::-ipcion unidos con el complejo de la misma forma ~ue una activador. (Obviamente el primer producto ~e transcripcion puede formarse en ausencia de tat, ·e modo de proporcionar el sitio de union.) Ciertas estructuras en que se obtuvo tat por :1genieria genetica constituyen una demostracion 7Xtrema de la independencia de los dominios de . xalizacion y activacion, de manera que el dominio ~ e activacion se conectara con el dominio de union del DNA y no con la secuencia de union usual tar. =uando se colocaba un sitio diana apropiado en el romotor, el dominio de activacion tat podia activar .3. transcripcion, lo cual sugiere que deberfa penrse que la union de DNA (o en este caso la union ::e RNA) proporciona una funci6n "de sosten", cuyo -:rincipal prop6sitc es asegurar que el dominic de activa::·6n esta cerca del complejo de inicio. La nocion de sosten a manera de correa cons::tuye un ejemplo mas especffico de la idea general ..:e que el inicio requiere de una elevada concentra-

cion de factores de transcripcion en las cercanfas del promotor, lo cual puede lograrse cuando los activadores se unen con los potenciadores en el entorno general cuando se unen a componentes del promotor de direccion ascendente, o en un caso extremo, con el producto de RNA por sosten a manera de correa. La exigencia comun en todos estos casos es Ia flexibilidad del arreglo tridimensional exacto del DNA y las protefnas. El principia de los dominios independientes es comun en los activadores de Ia transcripcion. Se podrfa considerar que !a funcion del dominio de union de DNA es acercar el dominic de activaci6n a! punta de inicio. Esto explica porque las localizaciones exactas de los sitios de union con DNA pueden variar en el promotor.

Bit

El analisis de dos hfbridos detecta i nteracciones prote1na-prote1na

Concepto principal • El analisis de dos h1bridos funcionan por requerimiento de una interaccion entre dos prote1nas donde una tiene un dominic de union de DNA y la otra un dominio de activacion de la transcripci6n .

El modelo de independencia de dominio es !a base de un analisis muy uti! para Ia detecci6n de interacciones protefnicas. De hecho, el dominio de conexion de la Figura 25.3 se sustituye con la interaccion protefna-protefna, principia que se ilustra en

Dominic de activacion

('/

Dominic de union con RNA Producto de

_I

Dominic de union con DNA ~ El dominic de activacion de la prote1na TATA de VIH puede estimular la transcripcion si se inserta cerca par union con un producto de RNA de una ronda previa de transcripcion. La activaci6n es independiente del media de insercion, como se muestra por la sustituci6n de un dominio de union con DNA por el dominio de union con RNA.

25.4 El analisis de dos h1bridos detecta interacciones prote1na-prote1na

645

\a c; . Una de las proteinas en estudio se fusiona con un dominio de union de DNA, y la otra, con uno de activacion de Ia transcripcion. (Esto se logra enlazando las secuencias de codificacion apropiadas para caso y creando proteinas sinteticas par expresion de los genes hibridos.) Silas dos proteinas que se estudian pueden interactuar entre si, las dos proteinas hibridas haran lo propio, lo cual se refleja en el nombre de la tecnica, analisis de dos hfbridos. La proteina con el dominio de union de DNA se fusionan con un gen reportero que tiene un promotor simple con su sitio diana, pero no puede activar el gen par si mismo. La activacion ocurre solo si el segundo hibrido se une con el primero para llevar el dominio de activacion al promotor. Se puede usar cualquier gen reportero cuando el producto es facilmente analizable, y esta tecnica ha dado origen a varios procedimientos automaticos para pro bar rapidamente interacciones protefna-protefna. La eficacia de la tecnica ilustra de manera sorprendente la naturaleza modular de las proteinas. Incluso cuando se ha unido a otra proteina, el dominio de union con DNA puede fusionarse con el

DNA y el dominio de activacion de Ia transcripci6r: puede hacer lo propio. En consecuencia, la capacidad de imeraccion de las dos protefnas en est dio no es inhibida par Ia union de los dominios dt union con DNA o de activacion de la transcripciou (Obviamente hay excepciones en que no son apEcables estas sencillas reglas y la interferencia entre los dominios de Ia proteina hibrida impide que ! ~ tecnica funcione.) La utilidad de este ana!isis es que solo requier~ que las dos proteinas estudiadas pueden interactuar entre sf, no necesitan tener nada que ver con ·= transcripcion. Como resultado de Ia independencia · ~ los dominios de union con DNA y de activacio::: de la transcripcion, todo lo que se requiere es quse unan, lo cual sucedera en tanto las dos prote:nas en estudio puedan interactuar en el ambito de nudeo.

E

Los activadores interactuan con el aparato basal

Conceptos principales • El principia que regula la funcion de los activadores es que el dominio de union con el DNA determina la especificidad para el promotor o potenciador diana. • El dominic de union con DNA se encarga de localizar el dominio de activacion de la transcripcion en las cercan1as del aparato basal.

Protefna 2 fusionada con un dominio de con un dominio union con DNA de activaci6n Sistema de reporte

• Un activador que actua directamente tiene un dominio de union con el DNA y uno de activaci6n. .. Un activador que no tiene un dominic de activaci6n puede actuar uniendose a un coactivador, que s1 lo tiene. • Varios factores del aparato basal son dianas con las q interactuan activadores o coactivadores.

CAT

~ u otro producto del reportero

Las protefnas no interactuan: no hay expresi6n

Las protefnas interactuan y activan Ia expresi6n

La tecnica de dos h1bridos estudia la capacidad de dos prote1nas de interactuar al incorporarlas a prote\nas h\bridas donde una tiene un dominic de union con DNA y la otra un dominic de activacion de la transcripcion. 646


• La polimerasa de RNA puede vincularse con diversos conjuntos alternos de factores de transcripcion en forma de un complejo holoenzimatico.

Un activador puede actuar directamente cuanc consta de un dominio de union con DNA enlaza con uno de activaci6n de la transcripcion, como :::: ilustra en la Figura 25.3. En otros casas, el acth·- dor no tiene en sf un dominio de activaci6n de :.; transcripci6n, pero se une a otra protefna, un coa~ tivador, que silo tiene. En la se muesc~ Ia acci6n de este tipo de activador. Los activador'::_ pueden considerarse como facto res de transcripcic cuya especificidad es conferida par Ia capacidad ; unirse con factores de transcripci6n del DNA y r.. · directamente con el DNA. Un activador en parti lar puede necesitar un coactivador especffico.

Si bien los componentes protefnicos se organide manera diferente, el mecanismo es el mismo. ·.-:1 activador que establece o directo con el -_arato basal tiene un dominio de activacion unido :-::1 forma covalente con el dominio de union con ~ :--l'A. Cuando un activador actua a traves de un co: .:tivador, las conexi ones irnplican una union no coalente entre subunidades de protefnas (comparen~ las Figs. 25.3 y 25.7). Las mismas interacciones ·~ encargan de la activacion, independientemente : e que los diversos dominios esten presentes en la ~isma subunidad proteinica o divididos en varias ,;e esas subunidades. Un dominio de activacion de Ia transcripcion .;.::tua a traves de lograr os protefna-protefna : n los factores de trascripcion general que promueen el ensamblaje del aparato basal. Se puede hacer ::mtacto con el aparato basal en cualquiera de los .:iferentes factores basales, pero en general ocurre :on TF 0 D, TFrrB o TF11 A; los cuales participan en : tapas tempranas del ensamblaje del aparato basal vease la Fig. 24.14). En Ia se ilustra la :ruaci6n en que se hace un o de ese tipo. .::1principal efecto de los activadores es influir en el ~nsamblaje del aparato basal. El TFDD puede ser Ia diana mas frecuente de los ~ctivadores, que pueden ar a cualquiera de ·arios TAF. De hecho, una accion importante de los -=-AF es proporcionar la conexion del aparato basal .:. los activadores, lo cual explica porque !a TBP sola : stenta !a transcripcion de nivel basaL pero se re::uieren TAF o TFnD para niveles mas altos de trans:ripcion estimulados por activadores. Los diferentes -=-AF de TF nD pueden proporcionar superficies de _'lteraccion con diferentes activadores, de los cuales, ~lgunos interactuan solo con TAF individuales, en :anto que otros lo hacen con varios. Se supone que .a interaccion ayuda a !a union de TF liD con la caja -=-ATA o con otros activadores en torno a! complejo Y}) -caja TATA. En cualquier caso, !a interaccion ~stablece el complejo de transcripcion basaL que 3celera el proceso de inicio y, por tanto, aumenta :>1 uso del promotor. Los dominios de activacion de los activadores de :evaduras Gal4 y Gcn4 tienen multiples cargas ne sativas, lo que llevo a describirlos como "activadores i cidos". Otro activador de este tipo, particularmente :>ficaz, es el que porta la protefna Vp 16 del virus del .'lerpes simple (VP16 no tiene de por sf un dominio je union con DNA, pero interactua con el aparato 1e transcripcion a traves de una protefna intermeiia) . Se han hecho experimentos para caracterizar .as funciones del activador acido en que frecuentec-n ente se utiliza la region activadora de VP 16 enlazada a un segmento de union con DNA. ~

Los activadores acidos actuan por incremento de la capacidad de TFrrB de unirse al complejo de inicio basal. En experirnentos in vitro se ha demostrado que la union de TFliB con un complejo de inicio en un promotor de adenovirus es estimulada por la presencia de los activadores GAL4 o VP16 acido, y que este ultim o puede unirse a TFliB. El ensamblaje de TFrrB en el complejo de su promotor es, por tanto, una limitante de la velocidad estimulada por !a presencia de un activador acido. La resistencia de un promotor de Ia polimerasa II de RNA ante la reestructuracion de elementos y su indiferencia incluso ante los elementos particulares presentes sugieren que los sucesos que la activan son relativamente de naturaleza general. Cualquier activador cuya region de activacion se pone a! alcance del inicio basal tiene !a capacidad de estimular su formacion. Algunos ejemplos sorprendentes de tal versatilidad se hanlogrado por !a estructuracion de promotores constituidos por nuevas combinaciones de elementos. Asf pues, cuando un elemento UASG de levadura se inserta cerca del promotor de un gen eucariotico superior, este puede ser activado por Gal4 en una celula de mamffero cultivada. Por

Coactivador

I Activador Un activador puede unirse a un coactivador que hace o con el aparato basal.

El act1vador hace o con TAF en TF11 D

~--6

I

Los activadores pueden actuar en diferentes etapas del inicio por o con TAF de TF11 D o con TFnB. 25.5 Los activadores interactuan con el aparato basal

647

de RNA previamente ensamblada con activac y coactivadores adicionales, como se ilustra e:-

!

Se une Ia holoenzima polimerasa de RNA

La polimerasa de RNA es una holoenzima que contiene muchos activadores.

tanto, cualquiera que sea el meclio que Gal4 utiliza para activar a! promotor parece haberse conservado entre las levaduras y las eucariotas de mas alta jerarquia. La proteina Gal4 debe reconocer alguna caracteristica del aparato de transcripci6n de los mamfferos qu e simula sus os normales en levaduras. c.C6mo estimula la transcripci6n un activador? Se pueden imaginar dos tipos generales de modelo: • El modelo de reclutamiento seii.ala que su solo efecto es aumentar la union de la polimerasa de RNA con el promotor. • Un modelo alterno supone que en el complejo de transcripci6n se induce algun cambia, por ejemplo de la conformaci6n de la enzima, que aumenta su eficacia. En una prueba de esos modelos, en un caso de levaduras, se demostr6 que el reclutamiento puede contribuir ala activaci6n. Cuando la concentraci6n de la polimerasa de RNA se aument6 lo suficiente, el activador no pudo producir ningun aumento de la transcripci6n, lo cual sugiere que su unico efecto es aumentar la concentraci6n eficaz de la polimerasa de RNA en el promotor. Cuando se suman todos los componentes re queridos para la transcripci6n eficaz, factores basales, polimerasa de RNA, activadores y coactivadores, se obtiene un aparato muy grande que consta de >40 protefnas . c.Es factible que ese aparato se ensamble en el promotor? Algunos activadores, coactivadores y factores basales pueden ensamblarse de manera gradual, pero entonces tal vez se unan a un complejo muy grande constituido por la polimerasa 648

CAPiTULO 25 Activaci6n de la transcripci6n

Se han encontrado varias formas de polime. _ de RNA en que la enzima se vincula con fac: . · de transcripci6n. El "complejo de holoenzimas levaduras mas notorio (definido como capaz d ciar la transcripci6n sin componentes adicionconsta de la polimerasa de RNA vinculada co~ complejo de 20 subunidades llamado media
BD

Algunas proteinas de union con promotor corresponden a represores

Concepto principal • La represi6n suele lograrse por afectaci6n de la estructura de la cromatina, pero hay represores que actuan por union con promotores especlficos.

La represi6n de la transcripci6n en eucario -. logra en general en el ambito de influ encia estructura de la cromatina; las protefnas reguJ; · ras que actuan como represores bacteriano ~ actividad en configuraci6n trans para bloque~ transcripci6n son relativamente raras, pero se nocen algunos ejemplos. Un caso es el del r sor global NC2/Drl!DRAPl, heterodfmero q~;_ une con TBP para impedir su interacci6n con · componentes del aparato basal. La importanc~ esta interacci6n es sugerida por la letalidad d ·

- .

:-....,. .

f

. ,.

I

I

•

•

~

Ell

•

Activa El complejo de transcripci6n se ensambla en el testfculo (no se ilustran todos los componentes del aparato basal)

TATA Punto de inicio

CAAT CAAT


Octamero

Oct-1

Los elementos de respuesta son reconocidos por los activadores

• Los elementos de respuesta pueden localizarse en promotores o potenciadores. CTF

• Cada elemento de respuesta es reconocido por un activador especifico.

Oct-1

• Un promotor puede tener muchos elementos de respuesta que, a su vez, pueden activar la transcripcion de manera independiente o en ciertas combinaciones.

lnactiva La COP impide que otros factores se unan a Ia caja CAAT y los factores basales no pueden unirse

COP

COP

GURA Un complejo de transcripcion implica el reco·ximiento de varios elementos del promotor H2B del erizo :2 mar en el testiculo . La union del factor de desplazamiento ::AAT en el embrion impide que el factor de union CAT se una, =~ manera que no puede formarse un complejo activo.

::nutaciones nulas en los genes que codifican al re-_ esor en levaduras. Los represores que asf actuan, - articipan activamente en Ia inhibicion de la fun_:6n del aparato basal. En un caso mas espedfico, la secuencia CAAT 'C 5 diana de Ia regulaci6n. En el promotor de un gen .3..ra la histona H2B se encuentran dos capias de ese ~:emento (vease Fig. 24.22), que se expresa solo du~Jnte la espermatogenesis del erizo de mar. Los fac·.:~res de union de CAAT pueden extraerse del tejido ·::sticular y tambien de tejidos embrionarios, pero · ' lo el del primero se puede unir a Ia caja CAAT. En J S tejidos embrionarios, otra protefna, Hamada de ~e splazam iento de CAAT (CDP) , se une a las cajas :AAT, evitando asi, que el activador las reconozca. En Ia 1 se ilustran las consecuencias .:.e Ia expresion genetica. En los testfculos, el promo. r se une a los factores de transcripci6n de la caja ~ ..\TA, las cajas CAAT y las secuencias octamericas. ::::1 tejidos embrionarios, Ia exclusion del factor de 2 1.i6n de CAAT desde el promotor evita el ensam: :aje de un complejo de transcripci6n. La analogfa : n el efecto de un represor bacteriano para impectir ·- inicio por la polimerasa de RNA en el promotor _- obvia. Estos resultados tambien concuerdan con :. hecho de que no puede suponerse Ia funcion de ::1a protefna en Ia union con un elemento promo- conocido: puede ser un activador, un represor o -:::. duso carecer de importancia para la transcripcion __ un gen.

El principia derivado de la caracterizacion de genes controlados en comun es que comparten un elemento promotor (o potenciador) reconocido par un activador. Un elemento que hace que un gen responda a tal factor se denomina elemento de respuesta, como el HSE (elemento de respuesta al choque termico); el GRE (elemento de respuesta a glucocorticoides), y el SER (elemento de respuesta serico). Los elementos de respuesta contienen secuencias de consenso cortas; las copias de los elementos de respuesta encontrados en diferentes genes tienen relacion estrecha, pero no necesariamente son identicas. La region a la que se une el factor cubre una distancia corta a un !ado y otro de Ia secuencia de consenso. En los promotores, los elementos no estan presentes a distancias fijas respecto del punto de inicio, en general se encuentran a <200 bp en flujo ascendente respecto de eL La presencia de un solo elemento suele ser suficiente para conferir Ia respuesta reguladora, pero a veces se encuentran varias copias. los elementos de respuesta pueden localizarse en promotores o potenciadores. En general, algunos tipos de elementos se encuentran en uno, mas que en el otro; normalmente, un HSE se encuentra en un promotor, en tanto un GRE se encuentra en un potenciador. Se supone que todos elementos de respuesta actCtan por el mismo principia general, se requiere Ia union de un activador al elemento de respuesta para permitir a Ia polimerasa de RNA iniciar Ia transcripci6n. La diferencia respecto de los activadores constitutivamente activos es que Ia protefna esta disponible o esta activa solo en determinadas condiciones, las cuales determinan cuando se va a expresar el gen. Ejemplo de una circunstancia en que muchos genes son controlados por un solo factor es Ia respuesta de choque termico, comun a una amplia variedad de procariotas y eucariotas, Ia cual implica multiples controles de la expresion genica. Un au menta en Ia temperatura interrumpe la transcrip-

25 .7 Los elementos de respuesta son reconocidos por los activadores

649

cion de algunos genes, activa la transcripcion de los genes de choque tt.~rmico, y provoca cam bios en Ia produccion del RNAm. El control de los genes de choque u~rmico ilustra las diferencias entre las formas de control eucarioticas y procarioticas. En las bacterias se sintetiza un nuevo factor sigma que dirige ala holoenzima polimerasa de RNA a reconocer una secuencia alterna -10 comun a los promo to res de genes de choque termico (vease Ia seccion 11.16, La sustitucion de los factores sigma puede controlar el inicio). En las eucariotas, los genes de choque terrnico tam bien pose en una secuencia de consenso comun (HSE), pero se localiza en diversas posiciones respecto del punto de inicio yes reconocida por un activador independiente, el factor de transcripcion de choque termico (HSTF). La activacion de este factor, por tanto, constituye un medio de inicio de Ia transcripcion en el grupo especffico de -20 genes que la secuencia diana apropiada contiene en su promotor. Los genes de choque terrnico de Drosophila melanogaster contienen multiples capias de HSE. El HSTF se une de manera cooperativa con los elementos de respuesta adyacentes. Tanto HSE como HSTF han sido conservado durante la evolucion y es sorprendente como un gen de choque termico de D. melanogaster se pueda activar en especies tan distantes como los mamfferos o los erizos de mar. Las protefnas HSTF de Ia mosca de la fruta y las levaduras parecen similares, y muestran el mismo patron vestigial del DNA que contiene secuencias de HSE. El HST de levaduras se fosforila cuando las celulas entran en choque terrnico, modificadon que se encarga de la activacion de la protefna . El gen de la metalotionefna (MT) constituye un ejemplo de como un solo gen puede ser regulado por muchos circuitos diferentes. La protefna metalotionefna protege a la celula de concentraciones

Elementos de respuesta GRE

Caja-E

BLE

excesivas de metales pesados uniendose cone~ ~ eliminandolos de Ia celula. El gen se expresa e:grado basal, pero es inducido a niveles mas ele\·= de expresion por los iones de los metales pe ~ = (como el cio) o por los glucocorticoides. E gion de control combina varios tipos de elem reguladores. En la se resume la organiza..: del promotor para un gen MT. Una caracteri_• importante de ese mapa es la elevada concentra de elementos que pueden activar Ia transcripc Las cajas TATA y GC estan en sus posiciones u __ les, bastante cerca del pun to de inicio. Para el cr-: basal de expresion tambien son necesarios los _ elementos de nivel basal (BLE) que coinciden cc:. descripcion formal de potenciadores. Aunque l -zados cerca del punto de inicio, se pueden trasl~ a cualquiera otro sin perder su efecto; contiene:: cuencias relacionadas con las encontradas en potenciadores y se unen a protefnas que se fusi con el potenciador SV40. El elemento de respuesta TPA (TRE) es _ secuencia de consenso presente en varios p :~ ciadores, incluido un BLE de metalotionefna ~ repeticiones de 72 bp del virus SV40. El TRE un sitio de union para el factor API, interaccion ~ forma parte del mecanismo para la expresion c~ = titutiva, de Ia que API es un activador. La u:-~ de API tambien tiene una segunda funcion, el -=-~ confiere una respuesta a los esteres de forboL c _ el TPA (agente que promueve tumores), y esa :-: puesta es mediada por Ia interaccion de API ~ TRE. Esta reaccion de union es una forma (a:__ que no necesariamente la unica) de que los estc · de forbol desencadenen una serie de cambios d ~ transcripcion. La respuesta inductiva ante los metales es c ferida por secuencias multiples del elemento de:_

MRE MRE

BLE TRE

MRE GC MRE

TATA

-260 -240 -220 -200 -180 -160 -140 -120 -100 Union de protefna

~,de

e§leroide$

U8F

'AP2

'~-i~1

tAP2 'AP'i

BLE = elemento de grado basal GRE = elemento de respuesta a glucocorticoides MRE = elemento de respuesta a metales TRE = elemento de respuesta a TPA La region reguladora del gen de metalotione1na humane contiene elementos reguladores en el promotor y el potenciador. El promotor tiene elementos para la inducci6n por metales; un potenciador tiene un elemento de respuesta a los glucocorticoides. Los elementos promotores se muestran arriba del mapa y abajo, las prote1nas que se unen a ellos.

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CAPITULO 25 Activaci6n de la transcripci6n

~ esta a metales MRE, que actuan como elementos - ~o motores. La presencia de un MRE confiere Ia ~ addad de responder ante un metal pesado, y con ~ inclusion de varios elementos se logra un mayor _-ado de induccion. El factor MTFl se une con MRE =- respuesta a los iones metalicos. La respuesta a las hormonas esteroides es re~ lada por un GRE localizado a 250 bp en flujo as~-=ndente respecto del punto de inicio, que se com- rta como potenciador. La delecion de esa region afecta el grado basal de expresion o inducido por nes metalicos, pero es absolutamente necesaria :lra la respuesta a esteroides. La regulacion de Ia metalotionefna ilustra el -:incipio general de que cualquiera de los elementos -_'fllizados en un potenciador o promotor puede activar _ manera independiente al gen. La ausencia de un :.emento necesario para un modo de activacion no ,:ecta la activacion en los otros modos. La diver- ad de elementos, su independencia de accion y ~ flexibilidad al parecer ilimitada de sus reestruc.:raciones relativas sugiere que es posible que un "- or de union con cualquier elemento aumente _: manera independiente la eficacia del inicio por :_ aparato basal de transcripcion, probablemente en ~ :tud de una interacci6n proteina-proteina que es- iliza la formacion de un complejo de inicio o lo ..:cilita de alguna otra forma.

Hay muchos tipos de dominios de union con DNA :oncept·JS principales • Los activadores se clasifican de acuerdo con el tipo de union con DNA. • Los del mismo grupo tienen variaciones de secuencia de un segmento espec1fico que les confieren especificidad para sitios diana espec1ficos. ~

frecuente que un activador tenga una estructura dular en Ia cual diferentes dorninios se encargan : la union con DNA y Ia activacion de la transcrip- · n, y los facto res sue! en clasificarse de acuerdo . dicho tipo de dominio. En general, un segmenrelativamente corto del mismo se encarga de Ia .=ion con DNA: • El segmento dedo de zinc constituye un dominio de union con DNA que se detecto por primara vez en el factor TFmA, el cual es necesario para que Ia polimerasa III de RNA transcriba los genes de RNAr 55. Desde entonces, se ha identificado en otros factores de transcripcion (y supuestos factores

de transcripcion). Tam bien se encuentra en una forma diferente en el segmento de receptores de esteroides. • Los receptores de esteroides se definen como grupo por una relacion funcional, cada uno es activado por Ia union con un esteroide en particular. El receptor de glucocorticoides es el que ha sido analizado mas a fondo. Ademas de otros, como el de Ia hormona tiroidea 0 el del acido retinoicb, los receptores de esteroides son de la superfamilia activada por ligandos, con el mismo modo de acci6n general: el factor protefnico esta inactivo hasta que no se une con un pequefio ligando. • El segmento helice-giro-helice se identifico originalmente como dorninio de union con DNA de los represores de fagos. Una helice a yace en el surco mayor del DNA y la otra en angulo, atravesandolo. Una forma relativa del segmento esta presente en el homeodominio, secuencia caracterizada por primera vez en varias protefnas codificadas por genes encargados de Ia regulacion del desarrollo en el genera Drosophila, asf como en genes de factores de transcripcion de mamiferos. • El segmento anfipatico helice-asa-helice (HLH) se identifico en algunos reguladores del desarrollo y en genes que codifican protefnas eucarioticas de union con DNA. Cada helice anfipatica presenta una cara de moleculas hidrofobas en un !ado y cargadas en el otro. La longitud del asa de conexion varia de 12 a 28 arninoacidos, segmento que perrnite Ia dimerizaci6n de las protefnas, y una region basica cercana hace o con e!DNA. • Las cremalleras de leucina constan de una cadena de aminoacidos con una molecula de leucina en cada septima posicion. Una cremallera de leucina de un polipeptido interactua con Ia de otro polipeptido para formar un dimero. La cadena de moleculas con carga positiva adyacente a cada cremallera participa en la union con DNA. La actividad de un activador inducible puede ser regulada en una de varias formas, como se ilustra esquemc'iticamente en Ia • Un factor es espedfico de un tejido porque se sintetiza en determinado tipo de celula, lo cual es comun en los factores que regulan el desarrollo, como las protefnas de homeodominio. • La actividad de un factor puede ser controlada directamente por modificacion. El 25.8 Hay muchos tipos de dominies de union con DNA

651

Sin protefna

Se sintetiza Ia protefna Protefna fosforilada

-

Protefna desfosforilada

Uni6n de ligando

Ejemplo Homeoprotefnas

.....,......,.-..,~,.....,...

-

Liberaci6n por el inhibidor

Cambia de contraparte

-

Se Iibera el factor activo par escisi6n

Receptores de esteroides

NF-K-6

El segmento dedo de zinc un domi nio de union con HLH (MyoD/D)

Respuesta de esterol

Protefna unida a membrana

La actividad de un factor de transcripci6n regulador puede ser controlada par la sintesis de proteinas, par modificaci6n covalente de las proteinas, union de ligandos o par union de inhibidores que secuestran a la proteina o afectan su capacidad de union con el DNA.

HSTF se convierte ala forma activa por fosforilacion. La API (heterodimero entre las subunidades Jun y Fos) se convierte ala forma activa por fosforilacion de !a subunidad Jun. • Un facto r es activado o desactivado po r union con un ligando, como los receptores de esteroides, que son ejemplos selectos. La union delligando puede influir en la localizacion de la protefna (que provoca el traslado del citoplasma al nucleo), asi como en Ia determinacion de su capacidad de union con DNA. • La disponibilidad de un factor puede variar; por ejemplo, el factor NF-KB (que activa los genes K de inmunoglobulinas en los linfocitos ~), presente en muchos tipos de celulas, pero es secuestrado en el citoplasma par la protefna inhibidora I-KE. En los linfocitos B, el NF-KB es liberado de I-KB y se dirige al nucleo, donde activa la transcripcion. • Un factor dime rico puede tener contra partes alternas, una de las cuales provoca su inactividad; Ia sintesis de Ia contraparte activa puede desplazar ala inactiva. Esas situaciones se amplifican en m allas en que diversas 652


contrapartes alternas se aparean, mente las protefnas HLH. • El factor puede ser fragmentado a un precursor inactivo. Se produce vador como proteina unida a Ia e:: nuclear y el retfculo endoplasmic sencia de esteroles (como el coleste~ que el dominio citosolico se fragn::modo que se traslada a] nucleo y co:la forma activa del activador. A continuacion se analizan en detalle : ~ ciones de union y activacion del DNA pro.:por algunas de esas clases de proteinas.

Conceptos principales • Un dedo de zinc es un asa de -23 aminoacidos - - = sobresale de un sitio de union de zinc formado : ~ aminoacidos His y Cis. • Una proteina con dedos de zinc suele tener vari:: • La porcion C terminal de cad a dedo forma un a -: que se une a un giro del. surco mayor del DNA. • Algunas proteinas de dedos de zinc se unen con y no al DNA, o ademas de al DNA.

~

Los dedos de zinc reciben su nombre de la : _ tura ilustrada en !a , en la que · queiio grupo de aminoacidos conservados _-: : con un ion zinc para constituir un dominio pendiente en la proteina. Dos tipos de prate{-union con DNA tienen estructuras de ese ti:: proteinas de "dedos de zinc" usuales y los rece~ de esteroides. Una "protefna de dedos" por lo genera: una serie de dichos dedos, como se muestra r gura. La secuencia de consenso de un solo de-c. Cis-X 2 _4 -Cis-X3 - Phe-X5 -Leu-X2 - His-X3 -His El segmento toma su nombre del asa de .:. noacidos que sobresale del sitio de union con ::::.. se denomina dedo Cis/ His 2 • El zinc se mantic una estructura tetraedrica formada por las m c las de His y Cis conservadas; el dedo mismo c de -23 aminoacidos y el enlace entre dedos tener de siete a ocho. Los dedos de zinc son segmentos comur: las proteinas de union con DNA que por lo ge se organizan como una serie unica de repetic aunque a veces hay mas de una. La extension -= dedos va de nueve repeticiones, que ocupan -=. totalidad de Ia proteina (como en TFmA), as ·-

_quefio dominio constituido por dos dedos (como el regulador ADRl del genera Drosophila). El ac:...,: ador Spl tiene un dominio de union con DNA ~ :t e consta de tres dedos de zinc. La estructura cristalina del DNA unido a una :otefna con tres dedos sugiere la forma ilustrada ~quematicamente en la b ' . La parte ter::tinal C de cada dedo forma a. helices que se unen :an el DNA, la parte terminal N forma una hoja ~. ?ara simplificar, la hoja ~ y la localizacion del ion _:: zinc no se muestran en la parte inferior de la - sura.) Las tres cadenas a.-helicoidales se ajustan :-:1 un giro del surco mayor; cada a.-helice (y, por .:ulto, cada dedo) hace dos os especificos de ::cuencia con el DNA (indicados por las flechas) . : e considera que los aminoacidos no conservados ::1 el sitio terminal C de cada dedo se encargan del : _conocimiento de sitios diana especificos. Sabiendo que los dedos de zinc se encuentran ~ :1 activadores autenticos que ayudan a las polime-_sas de II y III de RNA, es posible analizar a las pro_,fnas de los dedos desde una perspectiva inversa. : uando se observa que una protefna tiene varios de :-stos dedos, a primera vista hay cuando menos una ·:;zon para investigar su posible participacion como .Ktor de transcripcion. Ese tipo de identificacion . 1giere que varios loci implicados en el desarrollo : mbrionario de D. melanogaster son reguladores de ..> transcripcion. Es necesario ser cauteloso en la interpretacion :.e la presencia de (supuestos) dedos de zinc, espe::almente cuando la protefna contiene un segmento _e solo uno de ellos . Los dedos suelen participar ::1 la union con RNA, mas que con DNA, o tal vez ::.i siquiera tengan actividad de union con acidos :-:ucleicos. Por ejemplo, el prototipo de protefna de edos de zinc, TFrnA se une tanto al gen 5S como 2 su producto, RNAr 5S. Un factor de inicio de la ~adluccion, eiF2~, tiene un dedo de zinc, y las mu. .;ciones en esa estructura influyen en el reconoci:liento de los codones de inicio. Las proteinas de la ~.apside retrovfrica tienen un segmento relacionado : n el dedo, que podrfa participar en la union con ::L'Il"A vfrico. :-:1

Leu

r I A ". El factor de transcripcion SP1 tiene una serie de tres dedos de zinc, cada uno con un patron caracteristico de moleculas de ciste1na e histidina que constituyen el sitio de union del zinc.

Forma una hoja ~

Forma una o.-helice

Los dedos de zinc pueden formar helices alfa que se insertan en el surco mayor, relacionado con las hojas beta del otro lado.

Los receptores de esteroides son activadores Conceptos principales • Los receptores de esteroides son ejemplos de activadores de respuesta a ligandos que se activan por union con un esteroide (u otras moleculas relacionadas). • Hay dominios separados de union con DNA y de union con ligandos.

Las hormonas esteroides se sintetizan en respuesta a diversas actividades neuroendocrinas y ejercen efectos importantes en el crecimiento, el desarrollo de los tejidos y Ia homeostasia corporal en el mundo animal. En la 1= .:s 1 ~5.1 se clasifican los principales grupos de esteroides y algunos otros compuestos con actividades (moleculares) relacionadas. 25.10 Los receptores de esteroides son activadores

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Corticoides (esteroides suprarrenales) Los glucocorticoides aumentan Ia glucemia y tam bien tienen cH 0H 2 1 acci6n antiinflamatoria CHC=O OH

Los mineralocorticoides mantienen el equilibria de agua y sales

OH I

CH2 I

C=O

0

0 Hormonas esteroides saxuales

Los estr6genos participan en el desarrollo sexual femenino

Los andr6genos son necesarios para el desarrollo sexual CH OH masculine 3

OH

OH

0 Desarrollo y mortogenasis

Para el desarrollo 6seo y el El acido retinoico es un morf6geno metabolismo del calcic se yH3 requiere vitamina D CH CH CH cr!i'cr r 1 2 CH /

\

CH3CH3

Vitamina D3 Hormonas tiroideas Las hormonas tiroideas regulan Ia tasa metab61ica basal

O l

HO

ol 0

COOH

f _ ' CH2-i~

I

Triyodotironina (T3)

Acido (trans) retinoico

Varios tipos de moleculas hidr6fobas pequefias activan los factores de transcripci6n.

La glandula suprarrenal secreta > 30 esteroides, los dos grupos principales son glucocorticoides y mineralocorticoides. Los esteroides proporcionan las hormonas reproductivas (sexuales masculinas o androgenos y sexuales femenina s o estrogenos). Se requiere vitamina E para el desarrollo oseo. Otras hormonas que tienen estructuras y propositos fisiologicos no relacionados funcionan en el ambito molecular de manera similar a las hormonas esteroides. Las hormonas tiroideas, que se basan en formas yodadas de Ia tirosina, controlan la tasa me tabolica basal en animales. Las hormonas esteroides y tiroideas pueden tambien ser importantes para Ia metamorfosis (l os ecdiesteroides en insectos y las hormonas tiroideas en ranas).

654

t:AP.ifULO 25 Activaci6n de la transcripci6n

El acido retinoico (vitamina A) es un n: geno encargado de Ia diferenciacion del eje : roposterior en Ia yema de extremidad del po~. desarrollo. Su metabolito, el acido 9-cis reti.:: se encuentra en tejidos que son sitios imp or.= para el almacenamiento y metabolismo de Ia minaA. Se podrian considerar esas divers as actividades ~~ minos de vias para la regulaci6n para la expresi6n_-~ Esos diversos compuestos comparten una forr:· = accion comun: cada uno es una pequeiia molecu.·~· se une a un receptor especfjico que activa la transcr:~ genica. ("Receptor" puede ser nombre equivo ' Ia protefna es un receptor para Ia hormona e :~ de o tiroidea en el mismo sentido que el rep:_ Laces un receptor de un ~-galactosido; es dec:~ es receptor en el sentido de contener una pro::: unida a la membrana que se expone en la supe:' celular.) Los receptores para los diversos grupos de :monas esteroides, tiroideas y el acido retinoic presentan una nueva "superfamilia" de regulad genicos, los activadores de respuesta a ligando dos los receptores tienen dominios independi :para la union con DNA y a las hormonas que :· en las mismas localizaciones relativas. Su orgar_ cion general se resume en la r iJ La parte central de la protefna es el domin: · union con DNA. Esa region tiene relacion estre.: con los diversos receptores de esteroides (des ~: par mas estrechamente relacionado, con idem:~ de secuencia del 94%, hasta el par menos bier. ~ lacionado, con identidad de 42 % ). El acto de u ~ con DNA no puede desconectarse de la capacida activar la transcripcion, porque las mutacione_ ese dominio afectan ambas actividades. Las region es terminales N de los recept muestran Ia mas baja conservaci6n de secuen · o incluyen otras regiones necesarias para activa: transcripcion. Los dominios terminales C se unen a las horG:. nas. Aquellos en Ia familia de receptores de este des muestran identidades que van desde 30 ha_ 57%, lo que refleja !a especificidad para horm . ' individuales. Sus relaciones con los otros rece· tores son mfnimas y reflejan la especificidad pauna diversidad de respuestas, hormonas tiroid .:. vitamina D, acido retinoico, y asi sucesivamer : Este dominio tam bien contiene los segmentos e-cargados de Ia dimerizacion y uno involucrado :!a activacion de !a transcripcion. Algunos ligandos tienen multiples recepto:-::con relacion estrecha, como los tres receptores acido retinoico (RARcx, ~, y y) y los tres recepto del acido 9-cis-retinoico (RXR ex, ~, y y).

Union de DNA y activacion de Ia transcripcion (Ia identidad varia de 94 a 42%) Las regiones terminales Regiones de union de hormonas y dimerizacion (Ia identidad varia N tienen <15% de identidad (necesaria de 57 a 15%) para activar Ia transcripci6n) Glucocorticoides

94

57

Mineralocorticoides

90

55

Progesterona

76

50

Androgenos

52

30

Estrogenos

47

17

Triyodotironina

42 <15

Vitamina D

45

1•5

Acido retinoico

40

15

Acido 9-cis retinoico

Los receptores de muchas hormonas esteroides jroideas tienen una organizacion similar, con una region ter- inal N individual, una region de union con DNA conservada y _ a region terminal C de union con hormonas. Las identidades : . n relativas a GR .

Los receptores de esteroides tienen dedos de zinc Conceptos principales El dominio de union con DNA de un receptor de esteroides es un tipo de dedo de zinc que tiene la porci6n Cis, pero no la His. Los receptores de glucocorticoides y estr6genos tienen dos dedos de zinc cada uno, el primero de los cuales determina la secuencia diana del DNA. Los receptores de esteroides se unen con el DNA como d\meros. Los receptores de esteroides se unen al DNA como d\meros.

_ s receptores de esteroides (y algunas otras protei-as) tienen un tipo de dedo de zinc diferente del de ~ \ /His 2 y su estructura se basa en una secuencia Jn el consenso de union de zinc: Cis - X 2 -Cis- X 13 -Cis- X2 -Cis

Estas secuencias se llaman dedos Cis 2 / Cis 2 , que elen n o ser repetitivos, a diferencia de Ia repe j on seriada de los de tipo Cis 2 /His 2 . Los sitios de _:lion con DNA (cuando se conocen) son cortos y .: lf]ldromos . Los receptores de glucocorticoides y estrogenos :-nen dos dedos cada uno, ambos con un atomo de . ..nc en el centro de un tetraedro de cistefnas. Los _ s dedos forman ex-helices que se pliegan juntas

zn++

Union con DNA

Espaciado

El primer dedo de un receptor de esteroides regula que secuencias se unen (las posiciones se muestran en color purpura); elsegundo dedo controla el espaciado entre las secuencias (las posiciones se muestran en azul).

para formar un dominio globular gra nde . Los anillos aromciticos de dichas helices y una hoja ~ que con ecta las dos helices constituyen un sitio hidrofobo . Un !ado de Ia helice terminal N hace o con el surco mayor del DNA, de tal forma que dos receptores de glucocorticoides presentan dimerizaci6n al unirse al DNA, y cada uno participa en un giro sucesivo del surco mayor que se adapta a Ia naturaleza palindr6mica del elemento de respuesta (vease Ia secci6n 2 5.13, Los receptores de esteroides reconocen elementos de respu esta por un c6digo combinatorio). Cada dedo controla una propiedad significativa del receptor. En la se identifican los aminoacidos importantes; los dellado derecho del primer dedo determinan Ia secuencia diana en el DNA y los de la izquierda del segundo dedo controlan el espaciado entre los sitios diana reconocidos por cada subunidad en el dimero (vease Ia seccion 2 5. 13, Los receptores de esteroides reconocen elementos de respuesta por un c6digo combinatorio). La prueba directa de que el primer dedo se une con DNA se derivo de un experimento de "trueque de especificidad" en el cual se detect6 el dedo del receptor de estr6genos y se sustituy6 con la secuencia del receptor de glucocorticoides. La nueva protefna reconocfa la secuencia GRE (diana usual del receptor del glucocorticoides) y no ERE (diana usual del receptor de estr6genos), de modo que esa region establece Ia especificidad para reconocer el DNA. Las diferencias entre los dedos de los receptores de glucocorticoides y estrogenos yacen sobre todo en Ia base de esas estructuras; Ia sustituci6n en dos posiciones que se muestra en Ia permite al receptor de glucocorticoides unirse a un ERE y no a un GRE. 5.: -· Los receptores de esteroides tienen dedos de zinc

6 55

.. .. Misma secuencia en '.- - - - ambos receptores

fDB

La umon con el elemento de respuesta se activa por la union con ligando

Concepto principal • La union delligando con el dominio C terminal aumenta la afinidad del dominio de union con DN;. : su sitio diana espec1fico en el DNA.

- C

C

c c

8

,

··················~

s .................. .. Especificidad GRE

G

Especificidad ERE

La discriminacion entre las secuencias diana GRE y ERE depende de dos aminoacidos de la base del primer dedo de zinc del receptor.

.,.

Esteroide

! .,. ..... !

R ~c_eptor

.

CITOPLASMA

Promotor GRE/potenciador

l

Activaci6n

1

Transcripci6n

~ VV

vVV

Los glucocorticoides regulan la transcripcion genica al hacer que su receptor se una a un potenciador, cuya accion es necesaria para la correspondiente del promotor.

65 6


Se sabe mucho acerca de Ia interaccion de lo> cocorticoides con su receptor, ilustrada en Ia . Una hormona esteroide puede pasar a tra\ _ la membrana e ingresar a Ia celula por difusion si.i!: · y ya dentro de Ia celula, un glucocorticoide se unc c receptor. (Los trabajos sobre el receptor de glue ~ ticoides se han basado en Ia dexametasona, hoc . estero ide sintetica). No se ha definido Ia localize de los receptores libres, que podria estar en equi::.: entre el nucleo y el citoplasma. No obstante, cut::.:::. la hormona se une con el receptor, Ia proteinase viene a su forma activada, que tiene mayor afir.: · por el DNA, de manera que el complejo horm receptor siempre se localiza en el nucleo. El receptor activado reconoce una secuenc' consenso especffica que identifica al GRE, el .::.. suele localizarse en un potenciador que tal vez -:" varios kb en flujo ascendente o descendente ~ ::' pecto del promotor. Cuando el complejo este de-receptor se une con el potenciador, se acti = promotor cercano y ahi empieza Ia transcripc · La activacion del potenciador proporciona el me-.:; nismo general por el que los esteroides regula r. amplio conjunto de genes diana . La region terminal C regula Ia activida d :receptor de forma que varia respecto del recepto~ dividual. Si el dominio terminal C del receptor de <:- _ cocorticoides presenta delecion, la proteina term.i:...._ N restante se activa de forma constitutiva porque::: requiere de estero ides para su actividad, lo cual : . giere que sin estos, el dominio de union de esterok evita que el receptor reconozca a GRE y actua co;regulador interno negativo. La adicion de estero[:..;: desactiva Ia inhlbicion, dejando libre Ia capacidad - _ receptor de unirse a GREy activar la transcripcion. ::._ base para la represion podrfa ser interna, depende_ interacciones con otra parte del receptor o tal vez :producto de una interaccion con alguna otra prote:::que se desplaza cuando se une el esteroide. La interaccion entre los dominios es diferer· en el receptor de estrogenos; si el dominio de un: _ con hormonas presenta deleci6n, Ia proteina no ;;. ~ tivara Ia transcripci6n aunq ue continua uniendc _ a GRE, region que, por lo tanto, es necesaria p ~ estimular Ia actividad mas que para reprimirla.

Los receptores de esteroides reconocen a los elementos de respuesta por un c6digo combinatorio Conceptos principales • Un elemento de respuesta a esteroides consta de dos sitios mitad cortos, palindr6micos o de repetici6n directa. • Hay solo dos tipos de sitios mitad. • Un receptor reconoce su elemento de respuesta por la orientaci6n y el espaciamiento de los sitios mitad. • La secuencia de los sitios mitad es reconocida por el primer dedo de zinc. • El segundo dedo de zinc se encarga de la dimerizaci6n, que determina Ia distancia entre subunidades. • La separaci6n de las subunidades en el receptor determina el reconocimiento del espaciado en el elemento de res puesta. • Algunos receptores de esteroides actCtan como homodimeros, en tanto que otros forman heterodimeros. • Los homodimeros reconocen elementos de respuesta palindr6micos; los heterodimeros reconocen elementos de respuesta de sitios mitad Con repetici6n directa .

Cada receptor reconoce a un elemento de respuesta constituido por dos repeticiones cortas (o sitios mitad), lo cual sugiere de inmediato que el receptor se une como dfmero, de modo que cada mitad de Ia secuencia de consenso entra en o con una subunidad (que recuerda Ia interacci6n operador A.-represor descrita en Ia secci6n 14.11 , El represor utiliza un segmento helice-giro-helice para unirse con el DNA). Los sitios mitad pueden disponerse como estructuras palindromas o repeticiones con !a misma orientaci6n; estan separados por 0 a 4 pares de bases cuya secuencia carece de importancia. Solo dos tipos de sitio mitad son utilizados por los diversos receptores, y su orientaci6n y espaciado determinan que receptor reconoce al elemento de respuesta, de modo que los elementos de respuesta con secuencias de consenso restringidas seran reconocidos especificamente por una variedad de receptores. Las reglas que norman el reconocimiento no son absolutas, podrian modificarse por contexto, y tambien hay casos en que los elementos de respuesta palfndromos son reconocidos de manera permisible por mas de un receptor. Los receptores pertenecen a dos grupos: • Los receptores de glucocorticoides (GR), mineralocorticoides (MR), andr6genos (AR) y progesterona (PR) forman homodimeros

TGTTCT 0-4 bp AGAACA ACAAGA TCTTGT

Glucocorticoide (GR) Mineralocorticoide (MR) Andr6geno (AR) Progesterona (PR) Los elementos de respuesta formados en el sitio mitad palindr6mico TGTTCT son reconocidos por varios receptores diferentes, dependiendo del espaciado entre los sitios mitad.

cr-·· . TGACCT ACTGGA

RXR

1 bp - RXR 3

bp -

VDR

4 bp - T3R

5 bp - RAR Los elementos de respuesta con la repetici6n directa TGACCT son reco nocidos por heterodimeros, de los cuales es miembro RXR.

y reconocen elementos de respu esta cuyos sitios mitad tienen la secuencia de consense muestra so TGTTCT; en la que se disponen de manera palindr6mica y que el espaciamiento entre ellos determina el tipo de elemento. El receptor de estr6genos (ER) actua de Ia misma forma, pero tiene Ia secuencia TGACCT del sitio mitad. • El receptor del acido 9-cis-retinoico (RXR) forma homodfmeros y tam bien heterodfmeros con - 15 receptores adicionales, incluido el tiroideo (T3R), el de Ia vitamina D (VDR) y el del acido retinoico (RAR). En Ia 1 se muestra que los dimeros reconocen a los medios elementos con Ia secuencia TGACCT; estos ultimos se disponen como repeticiones directas y su reconocimiento es controlado por el espaciado entre ellos. Algunos de los receptores heterodimericos se activan cuando el ligando se une a su contraparte por RXR, en tanto que otros se pueden activar por union de ligandos, ya sea a esta subunidad o a Ia subunidad RXR. Esos receptores tambien pueden formar homodimeros que reconocen secuencias palindromas.

25.13 Los receptores de esteroides reconocen a los elementos de respuesta por un c6digo combinatorio

65 7

Ahora ya es posible entender las bases de Ia especificidad del reconocimiento. Recuerdese que la Figura 2 5.17 muestra como el reconocimiento de la secuencia del sitio mitad es conferido por Ia secuencia de los aminoacidos en el primer dedo, mientras que Ia especificidad para el espaciamiento entre los sitios mitad reside en los aminoacidos del segundo dedo. La estructura del dfmero determina la distancia entre subunidades, que se establece en giros sucesivos del surco mayor y asf controla Ia respuesta del espaciado de los sitios mi tad. Las posiciones exactas de las moleculas encargadas de Ia dimerizacion difieren de las combinaciones individuales pareadas. e,Como activan Ia transcripcion los receptores de esteroides? No act{lan directamente en el aparato basaL mas bien a traves de un complejo activador. El coactivador tiene varias actividades, entre otras, el componente comun CBP/p300, una de cuyas funciones es modificar Ia estructura de Ia cromatina por acetilacion de histonas (vease Ia Fig. 30. 14). Todos los receptores de Ia superfamilia son activadores de Ia transcripcion que dependen del li gando, pero algunos tambien pueden reprimir Ia transcripcion. Los receptores TR y RAR se unen a ciertos loci en forma de heterodfmeros con RXR en ausencia de un ligando y reprimen Ia transcripcion mediante su capacidad de interaccion con una protefna correpresora, que actua por el mecanismo inverso al usado por los coactivadores, es decir, inhibe

Polimerasa de RNA

Los receptores de esteroides TRy RAR se unen con el correpresor SMRT en ausencia de un ligando. El promotor no se expresa. Cuando el SMRT es desplazado por la union de un ligando, el receptor se une a un complejo coactivador, lo cual conduce a la activaci6n de la transcripci6n por el aparato basal.

658

CAPilULO 25 Activaci6n de la transcripci6n

Ia funcion del aparato de transcripcion basal de cuyas acciones es Ia desacetilacion de hi : (vease Ia Fig. 30.16). Se desconoce Ia imponc.relativa de Ia actividad del represor [rente a Ia. ~ vaci on dependiente del ligando en Ia respue_:~ siologica a Ia hormona. El efecto de la union delligando con el recc. es Ia conversion de un complejo represor ePactivador, como se muestra en la 2S 2,. ~ hay un ligando, el receptor se une a un com:correpresor; el componente del correpresor qu . une con el receptor es SMRT y Ia union dellig<~: produce un cambia de conformacion que lode ~ za, lo cual permite que el coactivador se una.

fill

Los homeodominios se uner. con dianas re lacionadas en el DNA

Conceptos principales • El homeodominio es un dominio de DNA de 60 aminoacidos que tiene tres a-helices. • El C terminal del a-helice 3 tiene 17 aminoacidos une con el surco mayor del DNA.

_.

• El brazo Nterminal del homeodominio se proyecta hacia el surco menor del DNA. • Las proteinas que contienen homeodominios puedecorresponder a activadores o represores de la transcri pci6n.

La homeocaja es una secuencia que codifica . dominio de 60 aminoacidos en las proteinac muchos organismos eucarioticos cuyo nombrc deriva de su identificacion original en los loci :::. meoticos de Drosophila (cuyos genes determinar identidad de las estructuras corporales). Se enn: tra en muchos de los genes que regulan el derrollo temprano en el genera Drosophila, asf cc::-en segmentos relacionados de genes de una an~: variedad de eucariotas superiores. El homeodor 'se encuentra en muchos genes encargados de Ia _ gulacion del desarrollo, y las secuencias relaciona- ' con eJ forman parte de varios tipos de factore. transcripcion de animales. En los genes homeoticos del genera DrosopL a menudo el hom eodominio esta cerca del extre::terrninal C. En Ia se resumen algu:-. ejemplos de genes con homeocaja. Con frecue::- cia, Ia con servacion de las secuencias en los g es escasa, excepto en Ia homeocaja, en Ia cua; ~ variable . Un grupo importante de genes del ger ro Drosophila que Ia incluyen, tiene una secueubien conservada, con similitudes del 80% al 9 (

:en comparaciones pareadas, mientras que en otros .its homeocajas tienen una relacion menos estrecha. .:=:1 homeodominio suele combinarse con otros seg-nentos en factores de transcripcion animales, como :n las protefnas Oct (de union de octamero), donde Jna cadena conservada de 75 aminoacidos, Hamada -:-cgion Pou, se localiza cerca de una region que si~mla el homeodominio. Las homeocajas del grupo ? u de protefnas cuya relacion es menos estrecha .:on el grupo original constituyen la extension mas :; lejada de la familia. El homeodominio se encarga de la union con ::>NA y los experimentos de trueque de h omeodo -:linios entre proteinas sugieren que Ia especificidad el reconocimiento del DNA yace en el homeodoninio, pero como con los represores de fagos, no se uede deducir un codigo simple que relacione la s ecuencias de protefnas y el DNA. La region termi '1al C del homeodominio es homologo a! segmento Jelice-giro-helice de los represores procarioticos. En .a seccion 14.11, El represor utiliza un segmento elice-giro-helice para unirse a! DNA, ya se hizo ~eferencia a que el represor A tiene una "helice de ·econocimiento" (he lice a- 3) que hace o en ~I surco mayor del DNA, en tanto que otra (helice J.-2) yace en un angulo que atraviesa el DNA . El :wmeodominio puede organizarse en tres regiones 1elicoidales potenciales; en la se com. aran las secuencias de los tres ejemplos; la parte -:nejor conserva da de la secuencia yace en Ia tercera ~dice. La diferencia entre dichas estructuras y las Jel represor procariotico se encuentra en Ia longitud -~ e la he lice que reconoce al DNA, he]ice- 3, que tie·.e 17 aminoacidos de longitud en el homeodomini o ~ c specto de los nueve del represor A. -~

'

...

•

En Ia se representa esquematicamente Ia estructura de la protefna dentada del homeodominio de D. melanogaster. La helice 3 se un e en el surco ma yor del DNA y establece el mayor numero de os entre Ia protefna y el acido nucleico, de los cuales, muchos de los que orientan Ia helice en el surco mayor son con la columna de fosfatos, de manera que no son especfficos para Ia secuencia del DNA, sino que se encuentran sabre todo en una cara de Ia doble helice y flanquean las bases con las que se hacen os espedficos. Los os restantes son del brazo terminal N del homeodominio, secuencia inmediata a la primera

Homeodominio

J

Antp en eve

400

Hox

763

Oct-1 Oct-2

r-

467

Regi6n Pou

El homeodominio puede ser el (mica segmento de union con DNA en un regulador transcripcional, o podria combinarse con otros segmentos. Representa una parte bien definida (60 moleculas de la proteina) .

,_.

• '

i[i

En

1 Brazo N terminal 1o Helice 1 20 Glu LisArg ProArg TreoAia Phe SerSer Glu Gin Leu Ala Arg Leu Lis Arg Glu Phe Asn Glu

Antp

Arg Lis Arg Gli Arg Gin TreoTirTreoArg Tir GlnTreoLeu Glu Leu Glu Lis Glu Phe His Phe

Oct-2

Arg Arg Lis Lis Arg TreoSer lie Glu TreoAsnVal Arg PheAia Leu Giu Lis Ser Phe Leu Ala

En

Helice 2 30 40 Asn ArgTir LeuTreoGiu Arg Arg Arg Glu Glu LeuSe!' SerGiu Leu Gii Leu

Antp

Asn ArgTirLeuTreoArgArgArgArg lie Glu lle Ala His Ala Leu Cis Leu

Oct-2

Asn Glu Lis Pro TreoSerGiuGiu fie LeuLeu lle Ala Glu Gin LeU His Met

En

41 so Helice 3 so Asn GluAiaGin lle Lis lie TrpPhe GinAsnlis Arg Aia Lis lie Us Us Ser Asn

Antp

TreoGiuArgGin lle Lis lie TrpPhe GinAsnArgArg Metlis Trp Us Lis Glu Asn

Oct-2

Glu Lis GluVaflle ArgVaiTrpPhe Cis AsnArgArg Gfn lis Glulis Arg lie Asn

El homeodominio de un gen del genera Antennapedia representa el principal grupo de genes con homeocajas en el genera Drosophila; el dentado (en) representa otro tipo de gen home6tico, y el factor Oct-2 de mamifero, a un grupo de facto res de transcripci6n con relaci6n distante. El homeodominio se numera de manera convencional dell al 60. Se inicia con el brazo terminal N y las tres regiones helicoidales ocupan las posiciones 10-22, 28-38 y 42-58. Los aminoacidos sefialados en azul se conservan en las tres muestras.

25.14 Los homeodominios se unen con dianas relacionadas en el DNA

659

El brazo terminal N yace en el surco menan

' La helice 3 del homeodominio se une con el surco mayor del DNA, con las helices 1 y 2 fuera de la doble helice. La helice 3 hace o con la columna de fosfatos y las bases especificas. El brazo terminal N yace en el surco menor y hace os adicionales.

Las mismas contrapartes (Exd y Hth) estan pre_: tes con cada protefna Hox en el complejo trime:por lo que sigue siendo un enigma la forma er. se manifiesta Ia especificidad de cada una de e: ' Las protefnas del homeodominio pueden c tituir activadores o represores de la transcrip . pero Ia naturaleza del factor depende de otro u t dominios, pues el homeodominio se encarga s , Ia union con DNA. El dominio activador o el re sor actuan ambos por influencia en el aparato b.:_ _ Los dominios activadores pueden interactuar _ coactivadores, que a su vez se unen a los cm::nentes del aparato basaL en tanto que los domi_ del represor tambien interactuan con el aparatranscripcion (esto es, no actuan impidiendo e• .:: ceso al DNA como tal). El represor Eve, por ejer::~ interactua directamente con TF 0 D.

~ helice, y se proyecta hacia el surco menor. Asf. las regiones terminal N y terminal C del homeodominio son las principales encargadas de hacer o con el DNA. Una demostracion sorprendente de Ia generalidad de este modelo se deriva de una comparacion de !a estructura cristalina del homeodominio de Ia protefna dentada con Ia de Ia protefna de apareamiento o.2 de las levaduras. El dominio de union con DNA de esta proteina semeja un homeodominio, puede formar tres helices similares y su estructura en el surco de DNA puede estar superpuesta casi exactamente sobre Ia del homeodominio dentado. Esas similitudes sugieren que todos los homeodominios se unen con el DNA de Ia misma forma, lo cual significa que el numero relativamente pequefi.o de moleculas de la he lice- 3 y el brazo terminal N se encarga de Ia especificidad de los os con el DNA. Un grupo de protefnas con un homeodominio es el de las protemas Hox, que se unen con el DNA con una especificidad de secuencia bastante baja y han constituido un enigma en cuanto a su forma de presentar diferentes especificidades; de ahf se deriva que las protefnas Hox a menudo se unen con el DNA como heterodfmeros con una contraparte (llamada Exd en moscas y Pbx en los vertebrados) . El heterodfmero tiene una especificidad mas restringida in vitro que una protefna Hox, por lo generaL se une ala secuencia de 10 bp TGATNNATNN, pero esto no basta para explicar las diferencias de especificidad de las protefnas Hox. Una tercera protefna, Hth, necesaria para lo calizar a Exd en el nucleo, tambien forma parte del complejo qu e se une con DNA y puede restringir aun mas los sitios de union. 660


Las proteinas helice-asa-helice i nteractua por vinculo com bi nato rio

Conceptos principales • Las prote1nas helice-asa-helice tienen un segmento de 40 a 50 aminoacidos que incluye dos a helices anfipaticas de 15 a 16 aminoacidos, separados por _as a. • Las helices se encargan de la fo rmaci6n de d1meros. • Las prote1nas bHLH tienen una secuencia basica adyacente al segmento HLH, que se encarga de la union con el DNA. • Las prote1nas de clase A bHLH son de expresi6n ub';:__:_ en tanto que las de clase B bH LH son espec1ficas dr: tejido. • Una prote1na de clase B por lo general forma un heterod1mero con una prote1na de clase A. • Las prote1nas HLH que carecen de region basica impiden que la contraparte bHLH de un heterod1me r~ se una con el DNA. • Las prote1nas HLH forman v1nculos combinatorios q podrian cambiar durante el desarrollo por la adici6 la eliminaci6n de prote1nas espec1ficas.

Dos caractensncas comunes de las protefna union con DNA son las regiones helicoidales ~ se unen con el DNA y Ia capacidad de dimeriza.::: de Ia protefna, ambas representadas en el gru protefnas helice -asa-helice (HLH) que compc;::-· ~ un tipo de segmento de secuencia, una cadena C:e- a 50 aminoacidos que contiene dos ex helices an .ticas separadas por una region de enlace (el asa longitud variable. (Una helice anfipatica forma : caras, una que presenta aminoacidos hidrofob · otra que presenta aminoacidos cargados.) Las r:

~.-

-

• iF.ll-s::l

MyoD Ala Asp Arg Arg LisAia Ala Tree Met Arg Gin Arg Arg Arg Arg Leu Pro Ala Leu Leu Asp Gin Glu Glu Val Asn Val Leu ld

Regi6n basica Seis moleculas conservadas estan ausentes de ld

MyoD Leu Ser Lis Val Asn Gin Ala Phe Gin Tree Let! Lis Arg Cis Tree Helice 1 ld Leu Tir Asp Met Asn Gli Cis Tir Ser Arg Leu Lis Gin Leu Val Se encuentran moleculas conservadas tanto en Myod como en ld MyoD Lis Val Gin lie Leu Arg Asn Ala lie Arg Tir lie Gin Gli Leu Glu Helice 2 ld Lis Val Gin lie Leu Glu His Val lie Asp Tir lie Arg Asp Leu Giu

FI J Todas las prote\nas HLH tienen regiones que corresponden a las helices 1 y 2, separadas por una asa de 10 a 24 aminoacidos. Las prote\nas basicas HLH tienen una region con cargas positivas conservadas, inmediatamente adyacentes a la helice 1.

:efnas de ese grupo forman homodimeros y heteroj fmeros mediante interacciones entre los fragmen:os hidrofobos de Ia cara correspondiente de ambas ~ elices. Las regiones helicoidales tienen de 15 a 16 .:minoacidos de longitud y cada una incluye varios :-t'agmentos conservados. En la se comiJaran dos ejemplos. La capacidad de formar dime~o s reside en estas helices anfipaticas y es comun a :odas las proteinas HLH. El asa probablemente sea wportante solo para dar libertad de interaccion in1ependiente ados regiones helicoidales. Casi todas las protefnas HLH contienen una :egion adyacente al segmento del mismo nombre _ue, en sf, es altamente basico, y se necesita para la - nion con DNA. Hay -6 moleculas conservadas en Jna cadena de 15 aminoacidos (vease Ia Fig. 25.26) . ::.os del grupo que la tienen, se llaman proteinas bHLH. Un dimero en que ambas sub·_midades tienen la region basica, puede unirse al JNA. Los dominios HLH probablemente orientan je manera correcta las dos regiones basicas aporta:ias por las subunidades individuales. Las proteinas bHLH forman parte de dos grupos ~enerales. La clase A consta de protefnas con ex}resion ubicua, incluida la E12/E47 de mamffero, =n tanto que Ja B esta form ada por protefnas que ;e expresan en forma especffica de tejido, incluidas \ lyoD, miogenina y Myf-5 de mamffero (grupo de .:.ctivadores que participa en Ia miogenesis [formaj on de musculo]). Una forma de accion frecuente :ie una proteina bHLH especffica de tejido es formar 1 heterodfmero con una contraparte ubicua. Hay :ambien un grupo de productos genicos que espej fican el desarrollo del sistema nervioso de D. me.1nogaster (donde Ac-S es el componente especffi.co i e tejido y da el componente ubicuo). Las proteinas _.lye (contraparte celular de productos oncogeni:os que participan en la regulacion del crecimiento) : rman una clase aparte de protefnas bHLH, cuyas :ontrapartes y dianas son diferentes.

Los dfmeros formados a partir de proteinas bHLH difi.eren en su capacidad de union con el DNA; por ejemplo, los homodimeros E47 y los heterodfmeros E12-E47 y MyoD-E47 se forman eficazmente y se unen con fuerza al DNA; E12 presenta buena homodimerizacion, pero se une mal al DNA, en tanto que MyoD apenas presenta homodimerizacion. Asf, tanto Ja formacion de dimeros como Ia union con DNA pueden representar importantes puntos reguladores. En ese contexto, es posible definir grupos de protefnas HLH cuyos forman diversas combinaciones pareadas, pero a partir de las secuencias no es posible pronosticar Ia fortaleza de la formacion de dimeros y de la union con DNA. En ese grupo, todos los dimeros que se unen con el DNA reconocen Ia misma secuencia de consenso, pero no se sabe aun si diferentes homodfmeros y heterodfmeros tienen preferencia por sitios dianas ligeramente diversos relacionados con sus funciones. Las diferencias en el resultado de Ia union con el DNA dependen de las propiedades de Ia region del segmento HLH o cercana a esta; por ejemplo, E 12 difiere de E4 7 porque posee una region inhibidora muy cerca de Ia region basica, que impide que el DNA se una a homodimeros. Algunas protefnas HLH carecen de la region basica, contienen moleculas de prolina, o ambos, lo cual parece modificar su fu ncion. En Ia Figura 25.26 se muestra el ejemplo de Ia protefna Id, que tiene Ia misma capacidad de formar dfmeros que las protefnas bHLH, pero un dfmero qu e contiene una subunidad de ese tipo ya no puede unirse de manera especffica con el DNA, lo cual constituye una demostracion convincente de Ia importancia de Ia duplicacion del segmento de union con DNA en protefnas de union con DNA. La importancia de !a diferenciacion entre las protefnas HLH y bHLH no basicas es sugerida por las propiedades de dos pares de protefnas HLH, el par da-Ac-S/emc y el par MyoD/Id. En Ia se

25. 15. Las prote\nas helice-asa-helice interactuan por vinculo combinatoric

661

HLH-0···r·· I

:

Region basica'f

MyoD/E12 o Ac-S/da

E12/ld

o AC-S/emc

'f

Q

Afinidad insuficiente para unirse al DNA

\ :IA(A ·IA.Q Un dimero HLH donde ambas subunidades son de tipo bHLH se puede unir al DNA, a diferencia de uno en que una subunidad carece de region basica.

ilustra un modelo de sus funciones en Ia formaci6n de una red regulatoria. En D. melanogaster el gen emc (extramacrochaetae) es necesario para establecer el patron espacial normal de los 6rganos sensoriales del adulto; actua suprimiendo Ia funcion de varios genes, incluidos da (sin hermana) y achaetescute (complejo Ac-S). Ac-S y da son genes de tipo bHLH. El supresor emc codifica una proteina HLH que carece de Ia region basica, y se supone que en ausencia de una funci6n emc, las protefnas day Ac-S forman dfmeros que activan Ia transcripcion de genes diana apropiados, pero Ia producci6n de Ia protefna emc da Iugar a Ia sfntesis de heterodfmeros que no pueden unirse a! DNA, asi que es necesaria Ia produccion de dicha protefna en las celulas apropiadas para suprimir Ia funcion de Ac-S!da. La formaci6n de celulas musculares es desencadenada por un cambia en el programa de transcripci6n que requiere varias protefnas bHLH, entre otras, MyoD, Ia cual es producida especificamente en celulas mi6genas, ademas de que Ia sobreexpresion en otras celulas puede inducirlas a iniciar un programa miogenico. El desencadenante de la diferenciaci6n muscular es tal vez un heterodfmero constituido por MyoD-El2 o Myo -E47, mas que un homodimero de MyoD . Antes de qu e se inicie Ia miogenesis, un miembro de tipo no basico de HLH, Ia proteina Id, se puede unir a M yoD, E 12, o ambas, y E47, para formar h eterodfmeros que nose pueden unir al DNA; se une mejor a El2/E47 que a MyoD y, por tanto, podria actuar por secuestro de Ia contraparte bHLH ubicua. La sobreexpresi6n de Id puede evitar Ia miogenesis, de modo que su 662

CAPITULO 25 Activaci6n de la tra nscripci6n

eliminaci6n podria desencadenar Ia libera c: MyoD para iniciar Ia miogenesis. Un activador de bHLH, como MyoD, puede trolarse en varias formas; se evita su union DNA cuando es secuestrado por una contra- : HLH, como Id y suele activar Ia transcripci6n ·· .a una contraparte bHLH, como El2 o E47. Tarr puede actuar como represor especifico de sitio - ~ a otra contrapane; Ia protefna bHLH MyoR : un dimero MyoD-MyoR en los mioblastos er ceso de proliferacion, que reprime Ia transcr'_ . (en los mismos loci diana donde MyoD-EL: ::: activa Ia transcripci6n). El comportamiento de las protefnas HLE tanto, ilustra dos principios generales de Ia c: ·= laci6n de la transcripci6n. Un pequeiio numerotefnas forma vfnculos combinatorios. Las cbinaciones particulares tienen funciones difere- · respecto de Ia union con DNA y Ia regulaci ':Ia transcripcion. La diferenciaci6n puede depe:- : de Ia presencia o eliminacion de contrapartes ~ · ticulares.

Las cremalleras de leucina participan en la formaci6n de d1meros Conceptos principales • La cremallera de leucina es una helice anfipatica que presenta dimerizaci6n. • La cremallera es adyacente a una region basica que une con el DNA.

s~

• La dimerizaci6n forma el segmento bliP donde se uneen forma simetrica dos regiones basicas a repeticione; invertidas del DNA.

Las interacciones entre protefnas son un te _ o frecuente en Ia estructuraci6n de un complejo _ transcripcion, y un segmento que se encuentra varios activadores (y otras protefnas) participa en > interacciones de homodfmeros y heterodimeros. ::__: cremallera de Jeucina es una cadena de aminoad ' rica en moleculas de leucina que proporciona ~ segmento de dimerizacion. La formacion del dime en sf surgi6 como principia comun a la acci6n ,.;: las protefnas que reconocen secuencias especifica de DNA, yen el caso de la cremallera de leucina, -~ relacion con Ia union con DNA es particularmen:-:: clara, porque se puede ver como Ia dimerizacion .yuxtapone a las regiones de union con DNA de ca ' subunidad. En Ia se presenta de mane ~ esqu em arica Ia reacci6n. En la estructura de una a helice anfipatica, I : grupos hidr6fobos (incluida Ia leucina) estan en u:-.

ado y los cargados en el otro. Una cremallera de eucina forma una helice anfipatica en que las mo. ' culas de leucina de la cremallera de !a protefna pocrfan sobresalir del a helice e interdigitarse con las .eucinas de la cremallera de otra proteina en para.elo, de modo de formar un asa ensortijada. Las dos __ elices dextrogiras se enredan una en torno a !a otra :on 3.5 moleculas por giro, de manera que el patron ~ e repite integralmente cada siete moleculas. i.. Como se relaciona esta estructura con la union :on DNA? La region adyacente a las leucinas repeti:ias es altamente basica en cada una de las protefnas je cremallera y podrfa constituir un sitio de union :on DNA. De hecho, las dos cremalleras de leucina : rman una estructura en Y en !a que las primeras :onstituyen el tronco y las dos regiones basicas se :~dhieren para formar los brazos que se unen con ::l DNA, lo cual se conoce como segmento estruc:ural bZIP y explica porque las secuencias diana _ara tales proteinas son repeticiones invertidas sin :eparacion. Para fomentar la formacion de homodfmeros heterodfmeros se pueden usar cremalleras, son ~egmentos largos. La leucina (u otro aminoacido :1idrofobo) ocupa cada septima posicion de !a ere. 1allera potencial. Hay cuatro repeticiones en !acreallera (Leu-X6 ) de !a protefna C/EBP (factor que :e une como dfmero tanto ala caja CAAT como a! potenciador central SV40) y cinco repeticiones en .os facto res Jun y Fos (que forman un activador . eterodimerico, API). El APl fue identificado por primera vez mer:ed a su union con una secuencia de DNA en el otenciador SV40 (vease Ia Fig. 24.24). La prepa~acion activa de API incluye varios polipeptidos. ·_n componente importante es Jun, producto del ~en c-jun, identificado por su relacion con el on.::ogen c-jun que porta el virus del sarcoma aviario. :::1 genoma del raton contiene una familia de genes ~elacionados, c-jun (aislado originalmente), junE y :mD (identificados por homologfa de secuencias con :m). Las tres protefnas Jun muestran considerables -imilitudes en su secuencia; tienen cremalleras de . ucina que pueden interactuar para formar homofmeros o heterodfmeros. El otro componente importante de AP l es el _roducto de un gen adicional con una contrapar:e oncogenica. El gen c-fos es el homologo celular del oncogen v-fos que porta el virus del sarcoma ::nurino . La expresion de c-fos activa genes cuyos _romotores o potenciadores poseen un sitio diana .:..PI y cuyo producto es una fosfoproteina nuclear _ue pertenece a un grupo de protefnas. Las otras ; c describen como antigenos relacionados con Fos FRA) y constituyen una familia de protefnas simi~ a res a Fos.

La region basica se une con DNA ~ Subunidad

~

Las regiones basi cas del segmento bliP se mantienen juntas por la dimerizaci6n de la region en cremallera adyacente cuando las caras hidr6fobas de dos cremalleras de leucina interactuan en orientaci6n paralela.

La protefna Fos tambien tiene una cremallera de Ieucina, no puede formar homodfmeros, pero sf un heterodfmero con Jun; para la reacci6n se requiere de una cremallera de leucina en cada protefna. La capacidad de formar dfmeros es una parte crucial de Ia interaccion de estos factores con el DNA, y la protefna Fos no puede en si unirse a! DNA, tal vez por su imposibilidad de fonnar un dfmero. Sin embargo, el heterodfmero Jun-Fos puede unirse al DNA con la misma especificidad de diana que el dfmero Jun-Jun, y ese heterodimero se une con sitio API con una afinidad -I Ox respecto de la del homodimero Jun.

BJ1

Resumen

Los factores de transcripcion incluyen a basales, activadores y coactivadores. Los factores basales interacn1an con la polimerasa de RNA en el pun to de inicio; los activadores se unen a elementos de respuesta cortos especfficos (Res) localizados en promotores o potenciadores y los activadores actuan mediante interacciones protefna-proteina con el aparato basal. Algunos activadores interactuan directamente con el aparato basal, en tanto que otros requieren de coactivadores para mediar Ia interaccion. Los activadores a menudo tienen una estructura modular con dominies independientes encargados de la union con DNA y la activacion de Ia transcripcion. La principal funcion del dominio de union con DNA puede ser insertar el dorninio activador cerca del complejo de union. Algunos elementos de respuesta estan presentes en muchos genes y son reconocidos por factores ubicuos, otros se encuentran en unos cuantos 25.17 Resumen

663

genes y son reconocidos por factores especfficos de tejidos. Los promotores de la polimerasa de II de RNA contienen una variedad de elementos de accion cortos en configuracion cis, cada uno reconocido por un factor de accion en configuracion trans. Los elementos de accion en configuracion cis se localizan en flujo ascendente respecto de Ia caja TATA y pueden presentarse en cualquier orientacion y a diferentes distancias respecto del punta de inicio. Los elementos de flujo ascendente son reconocidos por activadores que interactuan con el complejo de transcripcion basal para determinar la eficacia con que se usa un promotor. Algunos activadores interactuan directamente con componentes del aparato basal, y otros, a traves de un intermediario llamado coactivador. Las dianas del aparato basal son TAF de TFuD, TF0 B o TF 0 A. La interaccion estimula el ensamblaje del aparato basal. Otro segmento implicado en !a union con DNA es el dedo de zinc, que se encuentra en protefnas que se unen con el DNA o el RNA (y en ocasiones con ambos). Un dedo tiene moleculas de cistefna que se unen con el zinc. Un tipo de dedo se encuentra en repeticiones multiples de algunos factores de transcripcion, y el otro, en repeticiones unicas 0 dobles de otros. Se han identificado varios grupos de factores de transcripcion por homologfa de secuencias. El homeodominio es una secuencia de 60 moleculas que se encuentra en genes que regulan el desarrollo de insectos y gusanos, asf como en factores de transcripcion de mamfferos; se relaciona con el segmento procariotico helice-giro-helice y proporciona el segmento por el que los factore s se unen con el DNA. La cremallera de leucina contiene una cadena de aminoacidos rica en leucina que participa en Ia dimerizacion de los factores de transcripcion. Una region basica adyacente se encarga de la union con DNA. Los receptores de esteroides fueron los primeros identificados de un grupo de factores de transcripcion en que la protefna se activa par union con una pequefia hormona hidrofoba. El factor activado se localiza en el nucleo y se une a su elemento de respuesta especffico, donde activa !a transcripcion . El dominio de union con DNA tiene dedos de zinc. Los receptores son homodfmeros o heterodfmeros. Los primeros reconocen todos los elementos de respuesta palindromicos con Ia misma secuencia de consenso; Ia diferencia entre los elementos de respuesta es el espaciado de las repeticiones invertidas. Los heterodfmeros reconocen repeticiones directas, qu e se distinguen asimismo por el espaciado entre repeticiones. El segmento 664


de union con DNA de esos receptores incluye dedos de zinc; el primero determina que secuc de consenso se reconoce y el segundo responde espaciado entre las repeticiones. Las protefnas HLH (helice-asa-helice) tier_ helices anfipaticas encargadas de Ia dimerizaci6-. adyacentes a regiones basicas que se unen co DNA. Las protefnas bHLH tienen una region ba __ que se une con DNA y pertenecen a uno de c grupos, de expresion ubicua y espedficas de tejid Una protefna activa suele ser un heterodfmero c dos subunidades, una de cada grupo . Cuando _ dfmero tiene una subunidad sin region basica. puede unirse a! DNA, de manera que las subuni - ~ des pueden evitar Ia expresi6n genica. Los vfnc~..<_ combinatorios de subunidades forman redes ref ladoras. Muchos factores de transcripcion actuan co=dfmeros, y es frecuente que haya multiples rniebros de una familia que forman heterodfmero; homodfmeros, lo cual da Iugar a! potencial de - rigir la expresion genetica para las combinacio _ complejas. En algunos casas, una familia incl u· inhibitorios, cuya participacion en la f :macion de dfmeros impide que su contraparte affi· Ia transcripcion.

Referencias

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Hay varios tipos de factores de transcripci6n

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llfDI

Hay muchos t ipos de dominios de union con DNA

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I1IJ

El segmento de dedo de zinc es un dominio de uni on co n DNA

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fBI

Los rece ptores de esteroides son activadores

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f1lll

Los receptores de esteroides tienen dedos de zinc

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BiiiJ

Los receptores de esteroides reconocen a Los elementos de respuesta por un codigo combinatorio

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fBI

Los homeodominios se unen a dianas relacionadas en el DNA

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fDD

Las prote1nas. helice-asa-helice interactuan por v1ncu lo combmatono

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E!ID

Las cremalleras de leucina participan en la forrr ~~ de d1meros

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orte, empalme procesamie-nto del RNA ESQUEMA DEL CAPITULO Introducci6n Las uniones de corte y em palme nucleares son secuencias cortas • Los sitios de corte y empalme son las secuencias que rodean inmediatamente los limites de exon-intron. Se nombran de acuerdo con sus posiciones respecto de intron. • El sitio de corte y empalme S' del extrema s' (izquierdo) del intron incluye la secuencia de consenso GU. • El sitio de corte y empalme 3' esta en el extrema 3' (derecho) del intron e incluye la secue ncia de consenso AG. " La regia GU-AG (originalmente llamada regia GT-AG segu n la secuencia de DNA) describe la necesidad de esos dinucleotidos constantes en las dos primeras y las dos ultimas posiciones de los intrones en los pre-RNAm.

Las uniones de corte y empalme se leen por pares • El corte y empalme depende solo del recQnocimiento de pares de uniones de corte y empalme. • Todos los sitios de corte y empalme 5' son funcionalmente equivalentes, igual que los sitios de corte y empalme 3'.

El corte y empalme del pre-RNAm procede a traves de un lazo • El corte y empalme requiere de los sitios 5' y 3' y de un sitio de ramificacion jus to en flujo ascendente respecto del 3'. • La secuencia de ramificacion se conserva en levaduras, pero esta menos bien conservada en eucariotas superiores. • Cuando el intron se escinde en el sitio de corte y empalme s' y este ultimo se une en la posicion 2' de una A, en el sitio de ramificacion dentro del intron, se forma un lazo . • El intron se Iibera como lazo cuando se escinde en el sitio de corte y empalme 3'; despues se juntan los exones izquierdo y derecho. • Las reacciones ocurren por transesterificacion, donde un enlace es transferido de una localizaci6n a otra.

Se requieren RNAsn para el corte y empalme • Los cinco RNAsn implicados en el corte y empalme son U1, U2, US, U4 y U6. • Con algunas protein as adicionales, las RN Psn forman el empalmosoma . • Todas las RNPsn, excepto U6, contienen una secuencia conservada que se une a proteinas Sm, reconocidas por anticuerpos generados durante una enfermedad autoinmunitaria.

La RNPsn U1 inicia el corte

y

empalme

• La RNPsn U1 inicia el corte y empalme por union con el sitio 5' mediante una reaccion de apareo RNA-RNA. • El complejo E co nti ene RNPsn U1 unida al sitio 5', la proteina U2A F unida a una via de pirimidina entre el sitio de ramificacion y el de corte y empalme 3', y proteinas SR que conectan la RNPsn U1 con la U2AF.

El complejo E puede formarse por definicion de intr6n o ex6n • La via directa de formacion de un complejo E es para RNPsn U1 unirse al sitio de corte y empa lme 5' y para U2AF, unirse a una via de pirimidina entre el sitio de ramificacion y el de corte y empalme 3'. • Otra posibilidad es que el complejo se forme entre U2 AF en la via de pirimidina y RNPsn Ul en el sitio 5' de corte y empalme de flujo descendente. • El co mplejo E se torna en A cuando la RNPsn U2 se une con el sitio de ramificacion. • Si se forma un complejo E utilizando el sitio S' de corte y empalme de flujo descendente, este es sustituido par el correspondiente 5' de flujo ascendente cuando el complejo E se co nvierte en el complejo A. • Los sitios de corte y empalme 3' debiles pueden requerir un potenciador de corte y empalme localizado en el exon de flujo descendente para unirse directamente con las proteinas SR.

Cinco RNPsn forman el empalmosoma • La union de las RNPsn US y U4/ U6 convierte al complejo A en el empalmosoma B1, que contiene todos los componentes necesarios para el corte y empalme. • El empalmosoma pasa a traves de una serie de complejos adicionales conforme avanza el proceso. • La liberacion de la RNPsn U1 permite al RNAsn U6 interactuar con el sitio de corte y empalme 5' y convierte al empalmosoma 81 en empalmosoma 82. • Cuando U4 se disocia de la RNPsn U6, este ultimo puede aparearse con el RNAsn U2 para formar el sitio catalitico activo.

Un aparato alternativo de corte y empalme utiliza diferentes RNPsn • Una via alterna de corte y empalme utiliza otro conjunto de RNPsn que constituyen el empalmosoma U12.


667

o

o

~

El corte y empalme esta relacionado con la exportaci6n del RNAm Las proteinas REF se unen a las uniones de corte y empalme por un vinculo con el empalmosoma. o Despues del corte y em palme se mantienen adheridas al RNA en la union exon-exon. • Interactuan con la protein a de transporte TAP/Mex, que exporta el RNA a traves de un poro nuclear. o

fl!WD

f!i11i1

fm1D

fl\111 ilas reacciones de corte y empalme en configuraci6n trans utilizan RNA pequeiios

fim;)

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fi!Ig

La endonucleasa de corte y empalme reconoce al RNAt • Una endonucleasa escinde los precursores de RNAt en ambos extremes del intr6n.

668

CAPITULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

Los extremas 3' del RNAm se generan par escisi6n y paliadenilaci6n • La secuencia AAUAAA es una seiial para la escisitque genera un extrema 3' del RNAm poliadenilado. • La reaccion requiere de un complejo proteinico q t ~ contiene un factor de especificidad, una endonuc.:: y una po limerasa poli(A). • El factor de especificidad y la endonucleasa esci r.:.;.el RNA en flujo descendente respecto de AAUAAI>. • El factor de especificidad y La polimerasa poli(A) agregan continuamente -200 moleculas de A al extrema 3'. • En el genera Xenop us, las secuencias ricas en A-L :7 cola 3' controlan la poliadenilacion o desadenilac' :citoplasmatica durante el desarrollo embrionario.

El corte y empalme del RNAt en levaduras implica escisi6n y reunion El corte y empalme de RNAt se debe a reaccio nes sucesivas de escision y ligadu ra.

Los extremos 3' de los productos de transcripci6n pol I y pol III se generan po termi naci6n La polimerasa I de RNA term ina la transcripci6n c- una secuencia finalizadora de 18 bases. • La polimerasa III de RNA termina la transcripcioo ~ secuencia poli (U)4 de una secuencia rica en G-C.

Las reacciones de corte y empalme suelen ocurrir solo entre uniones de corte y empalme en configuracion cis de la misma molecula de RNA. .. En los tripanosomas y gusanos ocurren corte y empalme en configuracion trans en el sitio en que una secuencia corta (RNA SL) se empalma con los extremos 5' de muchos RNAm precursores. o La estructura del RNA SL simula el sitio de union Sm de los RNAsn U y podria tener una participacion analoga en la reacci6n.

o

La respuesta de la proteina no plegada tie r = relaci6n con el corte y empalme del RNAt

o

•

fi!1D

reaccio r~

• La Irelp es una proteina interna de la membrana nuclear con su dominio terminal-N en la luz del E terminal-( en el nucleo. • La union al dominic terminal-N de una proteina no plegada activa la nucleasa terminal-( por autofosforilaci6n. o La nucleasa activada escinde al RNAm Hacl para liberar un intron y generar exones que se unen ]J O ligasa de RNAt. • El RNAm Hacl escindido codifica un factor de trar 'cripci6n que activa genes codificadores de chaperc- ;_ que ayudan a plegar las proteinas no plegadas.

El proceso de corte y em pa lme alternativo implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme • Los exones especificos pueden excluirse o incluirse en el RNA producido mediante el uso, o no, de un par de uniones de corte y empalme. • Los exones pueden extenderse cambiando una de las uniones de corte y empalme para usar una union alternati va. • La determinacion del sexo en el genera Drosophila implica una serie de sucesos de co rte y empalme alternatives en genes que codifican productos sucesivos de una via. • Los elementos P del genera Drosophila muestran corte y empalme alternos especificos de la linea germinal.

La escisi6n y ligadura del RNAt son separadas

• La liberacion del intron genera dos mitades de RN A: que se unen para formar la estructura madura. • Las mitades tienen los extremes singulares 5' hidro·· y 2'-3' fosfato ciclico. • El extreme 5'-0H es fosforilado por una cinasa de polinucleotidos; la fosfodiesterasa abre el grup<J fosfato ciclico para producir un extrema 2' fosfato , _grupo 3'-0H; los extremos de los exones se unen p.:· accion de una ligasa de RNA y el 2' fosfato es reti re por una fosfatasa.

Los intrones del grupo II se cortan y empalman a si mismos por la formaci6n de un lazo • Los intrones del grupo II se escinden por si mismos del RNA mediante un proceso de corte y empalme autocatalltico. • Las uniones y el mecan isme de corte y empalme de los intrones del grupo II son simi lares a los de los intrones nucleares. • Un intron del grupo II se pliega en una estructu ra secundaria que genera un sitio catalitico que simula la estructura del intron nuclear U6-U2.

fBif:l

• La endonucleasa de las levaduras es un heterotetramero con dos subunidades cataliticas (relacionadas). • Utiliza un mecanisme de medici6n para determinar sitios de escision por sus posiciones relativas respe.::: de un punto de la estructura del RNAt. • La nucleasa antigua tiene una estructura mas sencilL; y reconoce segmentos estructurales de protuberanc';.helice-protuberancia en el sustrato.

Los intrones diana se definen por secuencias de consenso mas largas en las uniones de corte y empalme, pero, en general, incluyen las mismas uniones AU-AC. Ciertos intrones tienen las uniones de corte y empalme AU-AC, incluidos algunos dependientes de U1 y otros, de U12.

fiB

La escisi6n del extrema 3' del RNAm de histonas puede requerir de un RNA peque ii : • Los RNAm de histonas no estan poliadenilados; s_: extremes 3' se generan por una reaccion de escis'-:que depende de la estructura del RNAm.

• La reaccion de escision exige la union de SLBP a una estructura de tallo-asa y que se aparee el RNAsn U7 con una region adyacente monocatenaria.

fml

• Para convertir la uridina en seudouridina se necesita el grupo H/ACA de RNAsno. • Para generar una estructura usual, sustrato de la modificaci6n, en todos los casos, la base del RNAsno se aparea con una secuencia de RNAr que contiene la base diana.

La producci6n de RNAr requiere de sucesos de escisi6n • El RNAr grande y el pequeiio se liberan por escision a partir de un RNA precursor comun.

flti)

Resumen

fldflJ Se requieren RNA pequefios para el procesamiento del RNAr • Para modificar la posicion 2' de la ribosa con un grupo metilo se requiere del grupo C/D de RNAsno.

flll

Introducci 6n

Todas las clases de organismos tienen genes interrumpidos, los cuales representan un porcentaje menor de los genes de las eucariotas inferiores, pero Ia mayor parte de los genes de genomas de eucariotas superiores. Los genes varian ampliamente en funci6n del numero y Ia longitud de los intrones, nero un gen tfpico de mamffero tiene de siete a ocho exones dispersos en -16 kb. Los exones son relativamente cortos (-100 a 200 bp) y los intrones, relativamente largos (> 1 kb) (vease la secci6n 3 .6, Los genes muestran una amplia variedad de tamafios). La discrepancia entre Ia organizaci6n ininterrumpida de un gen y aquella no interrumpida de s:u RNAm requiere del procesamiento del producro primario de transcripci6n, el cual tiene Ia misma organizaci6n que el gen y suele denominarse preRNAm. La eliminaci6n de los intrones del pre RNArn deja un mensajero usual de -2.2 kb mediante un denominado corte y empalme del RNA. La eliminaci6n de los intrones constituye una parte irnportante de Ia producci6n del RNA en todas las eucariotas. (Aunque los genes interrumpidos son relativamente raros en las eucariotas inferiores, como las levaduras, en el porcentaje global se subestima Ia importancia de los intrones, pues Ia mayor parte de los genes interrumpidos codifica protefnas relativamente abu:ndantes. El corte y empalme, por tanto, participa en Ia producci6n de un mayor porcentaje total del RNAm del que serfa aparente al analizar el genoma, tal vez hasta el 50%.) Una de las primeras claves sobre Ia naturaleza de Ia discrepancia de tamafio entre los genes nuclea~ res y sus productos en eucariotas superiores proviene de las propiedades del RNA nuclear. Su tamafio pFomedio es mucho mayor que el de RNArn, es muy inestable y Ia complejidad de su secuencia es mucho mayor. Dada su amplia distribuci6n, se le denomin6 RNA nuclear heterogeneo (RNAhn), e incluye al pre-RNAm, pero podrfa tambien abarcar otros productos de Ia transcripci6n (esto es, aquellos que

RNPhn.::::. _ 200

A

408

RNA de 500-800 bases Protefnas medulares (-30-40 kD)

A1

A2

B1

B2

C1

C2

El RNAhn es una particula de ribonucleoproteina organizada como una serie de cuentas.

finalmente no Ilegan a RNArn durante el procesamiento). La forma ffsica del RNAhn es de ribonucleoprotefna (RNPhn), donde el RNAhn esta unido a protefnas. Seg{m se caracteriz6 in vitro, una partfcula de RNPhn asume Ia forma de cuentas conectadas por un hilo, estructura que se resume en Ia 1.> . t . Las protefnas mas abundantes de Ia partfcuIa son protefnas nucleares, pero hay otras con una estequiometrfa menor que constituyen un total de -20. For lo general, las protefnas estan presentes en -10 8 copias por nucleo, respecto del -10 6 del RNAhn. En algunos casos su participaci6n puede ser estructural en el empaquetado del RNAhn, y se sabe que varias viajan entre el nucleo y el citoplasma y participan en la exportaci6n del RNA o controlan su actividad. El corte y empalme ocurre en el nucleo, aunado a otras modificaciones que experimentan los RNA recien sintetizados. En Ia se revisa el proceso de expresi6n de un gen interrumpido. El producto de Ia transcripci6n tiene un capuch6n en el extremo 5' (vease la secci6n 7. 9, El extremo 5' del RNAm eucari6tico tiene capuch6n), ha sido motivo de eliminaci6n de intrones y esta poliadenilado en 26 .1 Introducci6n

669

~ Transcripci6n

!

Capuch6ndel extreme 5'

/

rk=

-

.

.

~

Poli(A) del extreme 3' Modificaci6n terminal "-._A 200

~ Corte y empalme Ex6n

lntr6n

Ex6n

~ Se romp.;:;.;as uni7 nes ex6n-intr6n

~~ Se unen los exones

Transports

~ Traducci6n

NUCLEO

CITOPLASMA

El RNA se modifica en el nucleo por adiciones al extremo 5' y al 3' y por corte y empalme para eliminar los intrones. El suceso de corte y empalme implica La rotura de las uniones ex6n-intr6n y la reunion de los extremos de los exones. El RNAm maduro se transporta a traves de poros nucleares hacia el citoplasma, donde se traduce.

el extrema 3' (vease la seccion 7 .l 0, El extrema 3' esta poliadenilado). El RNA se transporta entonces a traves de los poros nucleares hacia el citoplasma, donde se encuentra disponible para su traduccion . Respecto de las diversas reacciones de procesamiento que ocurren en el nucleo, deberia saberse en que punto ocurre el corte y empalme ante las otras modificaciones del RNA, (_en una localizacion espedfica del nucleo y se conectan con otros sucesos, como el transporte del nucleo al citoplasma? (.Que importancia tiene en la expresion de los genes interrumpidos el que no se produzca? Respecto de la reaccion de corte y empalme en sf, uno de los principales enigmas es como se controla su especificidad. (.Que asegura que los extremos de cada intron se reconozcan en pares, de manera que se retire la secuencia correcta del RNA ? (.Se escinden los intrones de un precursor en un orden en particular? (.Se utiliza la maduracion del RNA para regular Ia expresi6n genica por discriminacion entre los precursores disponibles o por cambia del patron de corte y empalme? Se pueden identificar varios tipos de sistemas de corte y empalme: • Los intrones se retiran del preRNAm de las eucariotas superiores por un sistema que re670


conoce solo secuencias de consenso co::conservadas en los !Unites ex6n-intr6r. · interior del intr6n. Esa reacci6n requie : un gran aparato de corte y empalme asume Ia forma de un arreglo de prorc- y ribonucleoproteinas y que actua corr: · gran complejo particulado (empalmoso:-· El mecanisme de corte y empalme in~ : transesterificaci6n, ademas de que el ce _ catalitico incluye el RNA y proteinas. • Ciertos RNA tienen la capacidad de esc sus intrones de manera aut6noma, los ::-_ les forman dos grupos, segun su estrur secundaria o terciaria; ambos usan rea.:_ nes de transesterificaci6n en que el Rl'.-. el agente catalitico (vease Capitulo r ~ RNA catalftico). • La eliminacion de intrones de los pre::-_ sores RNAt nucleares de levaduras im;actividades enzimaticas que manejan e: _ trato en forma similar a la de las enzimc..s _ procesamiento del RNAt, en cuyo caso caracterfstica crftica es la conformaci6 , precursor del RNAt. Estas reacciones d :: te y empalme son catalizadas por enz:;:que dan Iugar a escisi6n y ligadura.

Ill

Las uniones de corte y empalme nucleares son secuencias cortas

Conceptos principales • Los sitios de corte y empalme son las secuencias qL~ rodean inmediatamente los lfmites de ex6n-intr6n. ~ nombran de acuerdo con sus posiciones respecto de . intr6n. • El sitio de corte y empalme 5' del extremo 5' (izquie·do) del intr6n incluye La secuencia de consenso GU. • El sitio de corte y empalme 3' esta en el extremo 3' (derecho) del intr6n e incluye La secuencia de conse- AG. • La regla GU-AG (originalmente llamada regla GT-AG _;:gun la secuencia de DNA) describe La necesidad de es.:.: dinucle6tidos constantes en las dos primeras y las cl:: ultimas posiciones de los intrones en los pre-RNAm.

Para centrarse en los sucesos moleculares impli ::.. . dos en el corte y empalme de los intrones nucle<: -,se debe considerar la naturaleza de los sitios corte y empalrne, los dos lfmites ex6n-intr6n. • incluyen los sitios de escisi6n y nueva union. Si se compara la secuencia nucleotidica ~ RNAm con la del gen estructural, las uniones e ::exones e intrones pueden ser asignadas. Los :

Sitio izquierdo (5')

I

.. 12PyN

lntr6n • LIRA 26

Los extremes de los intrones nucleares se definen par la regla GU-AG.

~ ~rremos

de un intron no son homologos ni amplia__ ente complementarios, las uniones, sin embargo, -~ ne n secuencias de consenso bien conservadas, - ~que bastante cortas . Es posible asignar un extrema especifico a cada -~l1ion, dependiendo de la conservacion de las unio_s exon-intron, que pueden ser alineadas para : _nstituir la secuencia de consenso que se incluye : n la F' .. . Los subindices indican el porcentaje de aparicion ·-: Ia base especifica en cada posicion de consenso; : conservacion es elevada solo inmediatamente dentro ·1intr6n en las supuestas uniones, de modo que Ia cuencia de un intron generico se identif:ica como: GU .... ... AG El intron definido de esta manera se inicia con ' - dinucleotido GU y termina con el AG, de modo ·Je a menudo se dice que las uniones cumplen con _;, regia GT-AG (lo cual refleja el hecho de que las . ::cuencias se analizaron originalmente en fun cion _ l DNA, pero, obviamente, el GT de la secuencia _e codificacion del DNA se convierte en GU en el 1 NA). Notese que ambos sitios tienen diferentes se_:Jencias, por tanto, definen los extremos de un in-::-on de manera direccional. Se nombran de izquierda _ derecha, a lo largo del intron, como sitio de corte y :-:npalme 5' (a veces llamado sitio izquierdo o dona- r) y sitio de corte y empalme 3' (tambien llamado -rio derecho o aceptor). Las secuencias de consenso c sefialan como sitios reconocidos por mutaciones -untiformes en el corte y empalme, que in vivo e in :·rro, impiden dicho corte y empalme.

Un RNAm tipico de mamifero tiene muchos intrones. El problema basico del corte y empalme del pre RNAm resulta de la sencillez de los sitios respectivos 4: c. Que garantiza que se y se ilustra en la corten y se empalmen los pares de sitios correctos? Los pares GU-AG correspondientes deben recorrer gran des distancias (algunos inn·ones tienen > l 0 kb de longitud) , de modo que es posible imaginar dos tipos de principia que podrian encargarse del apareamiento de los sitios 5' y 3' apropiados: • Tal vez sea una propiedad intrinseca del RNA conectar los sitios en los extremos de un intron en particular, lo cual implicarfa aparear secuencias o estructuras especfficas. • Podrfa ser que todos los sitios 5' fuesen equivalentes desde el punto de vista fundonal, y todos los 3', indistinguibles, pero el corte y empalme podrfa seguir reglas que garanticen que el sitio 5' siempre se conecte con el siguiente sitio 3' del RNA . Los sitios de corte y empalme y las regiones circundantes no tienen secuencias complementarias, lo cual descarta modelos de apareamiento de bases complementarias entre los extremos de los intrones.

El apareamiento de uniones equivocadas eliminarfa los exones

Las uniones de corte y empalme se leen por pares Conceptos principales • El corte y empalme dependen s6lo del reconocimiento de pares de uniones de corte y empalme. Todos los sitios de corte y empalme 5' son funcionalmente equivalentes as\ como los sitios de corte y empalme 3'.

' Las uniones de corte y empalme se reconocen s6lo en las combinaciones de pares correctas. 26.3 Las uniones de corte y empalme se leen par pares

671

Los experimentos con precursores de RNA hfbridos muestran que cualquier sitio de corte y empalme 5' puede, en principia, conectarse con uno 3'. Por ejemplo, cuando el primer exon de una unidad de transcripcion temprana de SV40 se enlaza con el tercer exon de Ia ~-globina de raton, se puede extirpar el intron hfbrido para generar una conexion perfecta entre el exon de SV40 y el de ~-globina. De hecho, esa posibilidad de intercambio es Ia base de Ia tecnica de atrapamiento de exones descrita antes, en Ia Figura 4.11. Tales experimentos ponen en claro dos puntas generales: • Los sitios de corte y empalme son genericos; no presentan especificidad por precursores individuales de RNA. y los precursores individuales no confieren informaci~h especifica (como Ia estructura secundaria) indispensable para el corte y empalme. • El aparato de corte y empalme no es espedfico de un tejido; en general, cualquier celula puede escindir y empalmar un RNA apropiadamente, sea o no sintetizado normalmente por ella. (En Ia seccion 26.12, El corte y empalme alternativos implican el uso diferencial de uniones de corte y empalme, se analizan excepciones en que hay patrones alternativos de corte y empalme especificos de tejidos.) He aquf una paradoja. Es posible que todos los sitios de corte y empalme 5' parezcan similares a! aparato de corte y empalme, lo mismo que todos los sitios de corte y empalme 3'. En principia, cualquier sitio de corte y empalme 5' puede reaccionar con cualquier sitio de corte y empalme 3 ', pero en circunstancias normales, el corte y empalme ocurre solo entre los sitios 5' y 3' del mismo intron. 2Que reg las aseguran que el reconocimiento de sitios de corte y empalme se restrinja de manera que solo los sitios 5' y 3' del mismo intron se corten y empalmen? (.Se retiran los intrones en un orden espedfico de un RNA en particular? Mediante pruebas de manchado de RNA se pueden identificar RNA nucleares que representan productos intermedios de los que se han eliminado algunos intrones. En la "l1 se muestra una mancha de los precursores del RNAm ovomucoide. Hay una serie bien definida de bandas que sugiere que el corte y empalme ocurre por vias determinadas (si se retiraran los siete intrones de manera totalmente aleatoria, habrfa mas de 300 precursores con diferentes combinaciones de intrones y no se verfan bandas bien definidas). No parece haber una via {mica, pues se pueden encontrar productos intermedios donde se han retirado combinaciones diversas de intrones. No obstante, hay pruebas de Ia presencia de una ova672


2

3

RNAm

4

= 1.1

5

6

7

kb

Producto primario de transcripci6n (5.5 kb)

Carece de intrones 5 y 6

Carece de intrones 4, 5, 6 y 7

Contiene solo el intr6n 3

RNAm (1.1 kb)

rJr 6 ~ Estudio Northern del RNA nuclear con una so•:..;. ovomucoide que identifica precursores definidos del RNA m. indican los contenidos de las bandas mas prominentes. Imac ocortesia de Bert W. 0'~1alley, Baylor College of Medicine. -

>

rias vias preferidas. Cuando solo se ha perdido tintron, esto ocurre practicamente siempre en e: ' o 6, cualquiera puede ser el que se pierda prime Una vez que se han perdido los dos intrones, 5 6, vue]ven a ser los mas frecuentes, pero hay Ot:c combinaciones. El intron 3 nunca (o cuando me!~ muy rara vez) se pierde en uno de los primeros c~ pasos del corte y empalme. A partir de ese pan se observa que hay una via preferida por Ia qu e . · eliminan los intrones en el orden 5/6, 7/4, 2/l pero hay otras, puesto que (por ejemplo) en algt· -...:.. moleculas el ultimo intron en perderse es 4 (l con la salvedad de que en Ia interpretacion de e :;~ resultados no se cuenta con pruebas de que toe esos productos intermedios en realidad conduzc:..a un RNAm maduro. La conclusion general sugerida por este anL .:es que Ia confirmacion del RNA influye en Ia acce.-bilidad de los sitios de corte y empalme. Conforme · retiran intrones especificos, Ia conformacion carr ·_ y se dispone de nuevas pares de sitios de corte y e-

.:lroe. Sin embargo, Ia capacidad del precursor para orden sugiere _..;e se dispone de conformaciones alternas en cada _:apa. Por supuesto, mientras mayor sea Ia molecumas opciones estructurales brindara, y cuando se ~ nsideran genes mas grandes, se dificulta ver que ~ n especfficamente podrfan controlar Ia reacci6n .:-s estructuras secundarias. Una conclusion impor_!Ote de este ana lisis es que la reacci6n no avanza

c: ninar sus intrones en mas de un

Sitio 5'

Sitio 3'

5'~~=~~~===-!"-:=~~...o...--

GU UACUAAC AG

3'

7 .

:_·uencialmente a lo largo del precursor. Un modelo sencillo para controlar el reconoci·ento de los sitios de corte y empalme serfa que =- aparato respectivo actuase de manera progresiva. .-:abieudo reconocido un sitio 5', podrfa recorrer el .- :'-l'A en Ia d.irecci6n apropiada hasta encontrar el si;·Jiente sitio 3', lo cual restringirfa el corte y empalme : sitios adyacentes. Ese modelo, no obstante, ha sido :escartado por experimentos que muestran que el : rte y empalme pueden ocurrir en configuraci6n ~.ms, en circunstancias especiales, como Ia reacci6n :nermolecular (vease Ia secci6n 26.13, Las reaccio- es de corte y empalme en configuraci6n trans utili:.an RNA pequefios), o en moleculas de RNA donde ~ rte de Ia cadena nucleotfdica es sustituida por un ~ ::1lazador quimico; esto significa que no puede exi;:rse un rasn·eo estricto a lo largo del RNA desde el ::rio de corte y empalme 5' hasta el 3' correspon_iente. Otro problema con el modelo de rastreo es ~ue no explica Ia existencia de patrones de corte y ::npalme alternativos, donde (por ejemplo), un sitio :nmun 5' se empalme con mas de un sitio 3'. La base . ara el reconocirniento apropiado de los pares de si_os de corte y empaJme correctos sigue sin definirse talmente.

EL corte y empalme del pre-RNAm procede a traves de un lazo Ccnceptos principales • El corte y empalme requiere de los sitios 5' y 3' y de un sitio de ramificaci6n justa en flujo ascendente respecto del3'. • La secuencia de ramificaci6n se conserva en levaduras, pero esta menos bien conservada en eucariotas superiores. • Cuando el intr6n se escinde en el sitio de corte y empalme 5' y este ultimo se une en la posicion 2' de una A, en el sitio de ramificaci6n dentro del intr6n , se forma un lazo. • El intr6n se Libera como lazo cuando se escinde en el sitio de.corte y empalme 3'; despues se juntan los exones izquierdo y derecho. • Las reacciones ocurren por transesterificaci6n, donde un enlace es transferido de una localizaci6n a otra.

Py80 N Py 80 Py 87 Pu75 A PYgs

Consenso animal Corte en el sitio 5' y formaci6n de un lazo por enlace 5'-2' que conecta el intr6n 5'-G con el Iugar 2' de A en el sitio de ramificaci6n

n"":~""UG~5'...,._,_,.,_,

s·--~= 3'

3'

UACUAACAG 2'

Corte en el sitio 3' y uni6n de exones; el intr6n se Iibera como lazo

~G

5' - - - - 3· \ . 1 5' 3'5'= · ~~= UACUAACAG 2'

3'

l

5'- - - -- = = 3'

Desramificaci6n del intr6n 5'GU

\.

UACUAAC AG 3'

El corte y empalme ocurre en dos eta pas, primero se esci nde el ex6n 5' y despues se une con el ex6n 3'.

El mecanismo de corte y empalme ha sido caracterizado in vitro mediante sistemas que permiten Ia eliminaci6n de intrones de precursores de RNA. Los extractos nucleares pueden cortar y empalmar precursores de RNA purificados. lo cual demuestra que la acci6n no esta vinculada con el proceso de transcripci6n. En RNA que no tienen capuch6n es posible el corte y empalme, o bien, Ia poliadenilaci6n. Las reacciones de corte y empalme como tales son independientes de Ia transcripci6n o modificaci6n del RNA, sin embargo, ocurren normalmente en forma coord.inada y su eficacia puede ser influida por otros sucesos de procesamiento. Las etapas del corte y empalme in vitro se ilustran en Ia vfa de Ia . Se analiza Ia reacci6n respecto de las especies individuales de RNA identificables, pero recuerdese que, in vivo, las que contienen exones nose liberan como moleculas libres, se mantienen unidas por el aparato de corte y empalme. El primer paso es escindir en el sitio de corte y empalme 5', separando el ex6n izquierdo de Ia molecula de intr6n -ex6n derecha; el ex6n izquierdo asume Ia forma de una molecula lineal y Ia molecula intr6n-ex6n derecha fo rma un lazo, en el cual el

26.fi El corte y empalme del pre-RNAm procede a traves de un lazo

673

extremo 5' generado en el final del intr6n se une por enlace 5'-2' con una base, dentro del intr6n. La base diana es una A en una secuencia llamada sitio de rarnificacion. La escisi6n en el sitio 3' de corte y empalme Iibera al intr6n libre con forma de lazo; el ex6n derecho se liga (corta y empalma) con el ex6n izquierdo. Por claridad, las reacciones de escisi6n y ligadura se muestran separadamente en Ia figura, pero en realidad ocurren como una transferencia coordinada. Ellazo es entonces "desramificado" para obtener un intr6n lineal escindido, qu e se degrada rapidamente. Las secuencias necesarias para el corte y empalme son las cortas de consenso de los sitios 5 'y 3 'y del de ramificaci6n. Ya sabiendo que la mayor parte de las secuencias de un intr6n pueden ser motivo de delecion sin impedir el corte y empalme, se Sabe que el intr6n (o ex6n) no necesita una conformaci6n especffica . El sitio de ramificaci6n, muy conservado en las levaduras y con Ia secuencia de consenso UACUAAC, tiene una participaci6n importante en Ia identificacion del sitio de corte y empalme 3'. Por el contrario, en eucariotas superiores no esta bien conservado y tiene preferencia por purinas o pirimidinas en cada posicion, ademas de conservar el nucleotido diana A (vease Ia Fig. 26 .6). El sitio de ramificaci6n yace a una distancia de 18 a 40 nucle 6tidos en flujo ascendente respecto del sitio 3' de corte y empalme, en el cual, las muta-

ciones o deleciones impiden el corte y empalrr: _ levaduras. En eucariotas superiores, las restricc en su secuencia son mas relajadas, lo cualle c -re la capacidad de usar secuencias relacionadas madas sitios crfpticos) cuando Ia cadena aute:- _ sufre deleci6n. La proximidad con el sitio 3' de y empalme parece importante, pues el crfptico -::pre esta cerca del sitio autentico; el criptico se _ solo cuando el sitio de Ia ramificaci6n esta de ~ vado. Cuando Ia secuencia de rama crfptica e _ de esa forma, el corte y empalme parecen no n::~ desde otra prespectiva, y los exones dan origen .=. mismos productos que los de tipo natural. La fu __ del sitio de ramificaci6n, por tanto, es identificar el s:: de corte y empalme como diana para la conexi6u : el sitio 5' de corte y empalme. Esto puede exp:.:..:.... se porque ocurre una interaccion entre comp· .:eprotefnicos que se unen a esos dos sitios. El enlace constituido por el lazo va, de la . cion 5' de Ia G invariable que estaba en el exrrc 5' del intr6n a Ia posicion 2' de Ia A invariable sitio de ramificaci6n, que corresponde a Ia te ·· molecula A de Ia caja UACUAAC de las levad ~L .:: las reaccion es quimicas proceden por tr terificacion; un enlace es, de hecho, transferi.i: una localizaci6n a otra. En Ia ~ , 1 2 se mue-;· que el primer paso es un ataque nucleofilico p extremo 2'-0H de Ia A invariable de Ia secue~ · UACUAAC en el sitio 5' de corte y empalme. E= · segundo paso, el extremo 3'- 0H libre del exon 1 rado porIa primera reacci6n, ataca ahora el e · ' del sitio 3' de corte y empalme. N6tese que se c· serva el numero de enlaces fosfo diester. Orig· ~.:. mente habfa dos enlaces 5'-3' en los sitios de c y empalme ex6n-intr6n, pero uno ha sido susti por el enlace 5'-3' entre los exones y el otro, p o~ enlace 5'-2' que forma ellazo.

ED

Se requieren RNAsn para el corte y empalme


t H;:>

• Los ci nco RNAsn implicados en el corte y empalme scU1, U2, U5, U4 y U6.

p

6

·t-~-- A

- -,._..;....,...-=·"'"2""'_

• Con algunas proteinas adicionales, las RNPsn forma n ~ empalmosoma. • Todas las RNPsn, excepto U6, contienen una secuenc'= conservada que se une a proteinas Sm, reconocidas por anticuerpos generados du rante una enfermedad autoinmunitaria.

+ -OH

El corte y empalme nuclear se de be a dos reacciones de transesterificaci6n, en las cuales un grupo OH ataca a un en lace fosfodiester.

6 74


los sitios de corte y empalme 5' y 3', y la secuen - · de ramificaci6n, son reconocidos por componen::del aparato de corte y empalme que se ensamb ~ -

-:-~ara

formar un gran complejo, el cual une los sitios - · y 3' de corte y empalme antes de que ocurra :ualquier reaccion, lo que explica porque una de.=ciencia en cualquiera de esos sitios puede impedir :: inicio de !a reaccion. El complejo se ensambla de :nanera secuencial en el pre-RNAm y los complejos :::-accionadores de diferentes tamafios pueden reco. ocer diversos intermediaries. El corte y empalme -.:ene Iugar solo despues de que todos los compo:::.entes se han ensamblado. El aparato de corte y empalme contiene tan- proteinas como RNA (ademas del pre-RNAm). :..os RNA adoptan !a forma de pequefia s moleculas _resentes a manera de ribonucleoproteinas. Tanto =I nucleo como el citoplasma de las celulas euca--:oticas contienen muchas especies pequefias bien . efinidas de RNA, cu yo tamafio va de 100 a 300 :'ases en eucariotas superiores y hasta - 1000 bases =::1 las levaduras. Tambien Ia cantidad varia con;lderablemente, de l 0 5 a l 06 moleculas por celula ~asta concentraciones demasiado bajas como para _~r detectadas de man era directa. Los restringidos al nucleo se llaman RNA nu:leares pequeiios (RNAsn), y los del citoplasma, ~A citoplasmaticos pequeiios (RNAsc). En su : ·rado natural se presentan como partfculas de ribo- cleoprotefnas (RNPsn y RNPsc); coloquialmente -~ les llega a llamar snurps y scyrps. Tambien hay .:.na clase de RNA pequefios en el nucleolo, llama:os RNAsno, que participan en el procesamiento : -=1 RNA ribosomico (vease la seccion 26.22, Sere::~.ieren RNA pequefios para el procesamiento del : Ar) . Las RNPsn involucradas en el corte y empale, ademas de muchas otras protefnas, forman un ;:an complejo especifico llamado empalmosoma. -Jslado in vitro de los sistemas de corte y empalme, ~ a constituido por una partfcula de ribonucleopro-~'nas de 50 a 60 S, y puede formarse en etapas, _rynforme se unen las RNPsn a traves de "varios : . mplejos de corte y empalme" . El empalmosoma .: una gran estructura, con una masa mayor que .: del ribosoma. En la se resumen sus componentes. :. s cinco RNAsn contribuyen con mas del 25% de o masa, y con sus 41 protefnas vinculadas, consti.:.:•en casi la mitad de !a masa. Algunas de las 70 -: tefnas que se encuentran en el empalmosoma se =scriben como factores de corte y empalme, que - :Iuyen las necesarias para el ensamblaje del em.:..inosoma y para unirlo al sustrato RNA, ademas -=las implicadas en sucesos cataliticos. Por otra par= se han sefialado otras -30 protefnas vinculadas ~:1 el empalmosoma que participan en otras etapas _ la expresion genica, lo cual sugiere que puede · ' ·er las veces de apara to de coordinacion.

El empalmosoma se forma en el RNA precursor intacto y pasa a traves de un estado intermedio en el cual contiene Ia molecula lineal individual del exon 5' y ellazo-intron-exon derecho. El complejo tiene muy poco producto de corte y empalme, lo cual sugiere que suele liberarse de inmediato, despues de !a escision del sitio 3' y !a ligadura de los exones. Se puede pensar que las particulas de RNPsn participan en la estructuracion del empalmosoma. Como el ribosoma, el empalmosoma depende de interacciones RNA-RNA, asf como proteina-RNA y protefna-proteina. Algunas de las reacciones en que participan las RNPsn requieren que el RNA aparee sus bases directamente con secuencias del RNA que se corta y empalma, en tanto que otras requieren del reconocimiento entre RNPsn o entre sus protefnas y otros componentes del empalmosoma. La importancia de las moh~culas de RNAsn puede probarse directamente en levaduras, provocando mutaciones en sus genes. Las mutaciones en los cinco genes de RNAsn son mortales, e i.mpiden el corte y empalme. Todos los RNAsn involucrados en el corte y empalme se pueden reconocer en formas conservadas en celulas animales, de aves e insectos. En las levaduras, los RNA correspondientes a menuda son bastante mas grandes, pero las regiones conservadas incluyen caracterfsticas similares a las de RNAsn de las eucariotas superiores . Las RNPsn implicadas en el corte y empalme son Ul , U2, U5, U4 y U6, nombrados de acuerdo con los RNAsn presentes. Cada RNPsn contiene un solo RNAsn y varias proteinas (<20) . Las RNPsn U4 y U6 suelen encontrarse como una sola particula (U4/U6). Un centro estructural comun para cada

•-. 30 protefnas adicionales 2.1 MDa 17% de Ia masa

70 factores de corte y empalme 4.7 MDa 38% de Ia masa

5 RNAsn 3.3 MDa 27% de Ia masa

41 proteinas en RNPsn 2.2 MDa 18% de Ia masa

El empalmosoma mide - 12 MDa. Cinco RNPsn contribuyen con casi la mitad de la masa; el resto de las proteinas incluye factores de corte y empalme conocidos, as\ como las implicadas en ambas etapas de la expresi6n genica.

26.5 Se requieren RNAsn para el corte y empalme

675

RNPsn consta de un grupo de ocho protefnas, todas reconocibles por un antisuero autoinmunitario llamado anti-Sm; las secuencias conservadas en las protefnas forman la diana de los anticuerpos, en tanto que las otras son exclusivas de ella. Las protefnas Sm se unen a la secuencia conservada PuAU 3 6 Gpu, presente en todos los RNAsn, excepto U6,-que en su Iugar contiene un conjunto de protefnas simi lares a Sm (Lsm). Las protefnas Sm deben participar en la reaccion autoinmunitaria, si bien no se ha aclarado su relacion con el fenotipo de la enfermedad autoinmunitaria. Algunas de las protefnas de la RNPsn pueden participar directamente en el corte y empalme, mientras que otras tal vez sean necesarias para actividades estructurales 0 solo para el ensamblaje 0 las interacciones entre particulas de RNPsn. Casi el 33% de las proteinas involucradas en el corte y empalme son componentes de las RNPsn. Pruebas cada vez mas numerosas de Ia participacion directa del RNA en la reaccion de corte y empalme sugieren que relativamente pocos factores de corte y empalme participan directamente en la catalisis, casi todos participan en actividades estructurales o de ensamblaje.

Dominio C

Dominio B cUCc GAC A GGAUGUGCU CCCUG :<\CCUAU CGGA CGGGAC

9,

U.U.

U

UGC GACGGUCCAUUCAUApppGme5'

8§

. G

~~u

Ex6n 5' G U A A G U A lntr6n 3'

I

UA

~~

Apareamiento de intrones

Gc

GUA G UG

A A

A U

GcAC

Dominio A

El RNAsn Ul tiene una estructura de bases apareadas que forma varios dominios. El extrema 5' se mantiene con una sola cadena y puede apa rear sus bases con el sitio de corte y empalme 5'.

676


B

La RNPsn Ul inicia el corte y empalme

Conceptos principales • La RNPsn Ul inicia el corte y empalme por union coel sitio 5' mediante una reacci6n de apareo RNA-R~A . • El complejo E contiene RNPsn Ul unida al sitio 5', la proteina U2AF unida a una via de pirimidina entre el sitio de ramificaci6n y el de corte y empalme 3', ~ proteinas SR que conectan la RNPsn Ul con la U2AF.

En generaL el corte y empalme se puede dividi~ _ dos etapas: • En primer termino se reconocen las secuecias de consenso del sitio 5' de corte y epalme, la secuenGia de ramificacion y la adyacente de pirimidina. Se ensambla _ complejo que contiene todos los compont:-. tes de corte y empalme. • Las reacciones de escision y ligadura camb:.:. entonces la estructura del sustrato RNA. ::_ componentes del complejo se liberan ore -ganizan conforme avanzan las reaccione5 corte y empalme. El punta importante es que todos los compomntes : corte y empalme esten ensamblados y tienen asegura: sitios de corte y empalme disponibles antes de que se h.-. algun cambia irreversible en el RNA. El reconocimiento de las secuencias de conse _ so involucra al RNA y a las proteinas. Ciertos RNA<; tienen secuencias complementarias de las de co:-. senso o entre sf, y el apareamiento de bases en~ RNAsn y pre-RNAm, o entre varios RNAsn, tiee: un papel importante en el corte y empalme. La RNPsn U l humana contiene ocho proteinc... ademas de RNA. En la se muestra __ estructura secundaria, que tiene varios dominios. :=. sitio de union Sm es necesario para la interacci · . con las protefnas usuales de la RNPsn. Los domini identificados por estructuras individuales de ta c asa proporcionan sitios de union para protefnas e::clusivas de la RNPsn Ul. La union de la RNPsn Ul con el sitio 5' de cor:. y empalme es el primer paso de dicho proceso. t=. reclutamiento de RNPsn Ul implica una interacci6::entre una de sus proteinas (U l-70k) y la protei~ ' ASF/SF2 (factor general de co rte y empalme de cla se SR; vease mas adelante) . El RNAsn U l aparea SU. bases con el sitio 5' mediante una region de una sod. cadena en su extremo 5', que suele incluir una fi \::. de cuatro a seis bases, complementaria de la del siti de corte y empalme. Las mutaciones del sitio 5' de corte y empa· · me y en el RNAsn U l se pueden usar para prob

clirectamente Ia necesidad de que se apareen entre elias. Los resultados de tal experimento se muestran en Ia fT u 6 C' . La secuencia de tipo natural del sitio de corte y empalme del pre-RNAm del adenovirus l2S se aparea en cinco de seis posiciones con el RNAsn Ul. Un mutante del RNA l2S que no puede escindirse ni empalmarse tiene dos cambios de secuencia; las fracciones GG de las posiciones 5 a 6 del inn·on cambian a AU. La mutacion modifica el patron de apareCJmiento de bases entre el RNAsn Ul y el sitio de corte y empalme 5', si bien no modifica Ia extension global del apareanziento {puesto que se pierde complementariedad en una posicion y se gana en otra). El efecto en el corte y empalme sugiere que la interaccion base-apareamiento es importante. Cuando se introduce una mutaci6n en el RNAsn Ul que restablece el apareamiento enla posicion 5', se recuperan el corte y empalme normales. Otros casos en que se producen mutaciones correspon·entes en el RNAsn Ul para ver si es posible suprimir Ia mutacion en el sitio de corte y empalme sugieren Ia regia general: es necesaria la complelentariedad entre RNAsn Ul y el sitio 5' de cone :' empalme para que este se lleve a cabo, pero su eficacia depende solo del numero de pares de bases que pueden formarse. La reacci6o de apareamiento ·e estabiliza por las protefoas de RNPsn Ul. En Ia 2 .J se muestran las etapas tempranas del corte y empalme. El primer complejo :ormado durante esta actividad es el E (corte y em;Jalme tempranos) , que contiene RNPsn Ul, el fac :or de corte y empalme U2AF y de una :amilia llamada de prote inas SR, que comprende Jn grupo importante de factores de corte y empal::ne y reguladores, los cuales toman su nombre de Jna region rica en Arg -Ser, de longitud variable. Las '"'rotelnas SR interact{Jan entre sf a traves de dichas ~egiones, y tambien se unen al RNA; constituyen J ll componente indispensable del empalmosoma y : rman una malla sobre el sustrato de RNA; conec~ m a U2AF con Ul {f''"' 6 ). El complejo E :.~ele denominarse complejo de asignacion, debido ~ que su formacion identifica a un pre-RNAm como i.!Strato para la formacion del complejo de corte y ~:npa lme.

En el complejo E, el U2AF se une a Ia region el sitio de ramificacion y el 3' de corte y em alme. El nombre refleja su aislamiento original : rno factor auxiliar U2. En casi todos los organis-::os tiene una subunidad grande (U2AF 65) que -ace o con una via de pirimidina de flujo : scendente respecto del sitio de ramificaci6n; una - equefia subunidad (U2AF35) h ace o direccon el dinucleotido AG en el sitio 3' de corte y ~:::~palme . En Saccharoinyces cerevisiae, esa funcion

es realizada por Ia protefna Mud2, contraparte de U2AF65, y se une solo a la via de pirimidina, lo cual marca una diferencia en el mecanismo de corte y empalme entre S. cerevisiae y otros organismos. En las levaduras, el sitio 3' de corte y empalme no participa en las primeras etapas de formacion del complejo de corte y empalme, pero sf en todos los demas casos conocidos. Otro factor de corte y empalme, llamado SFl en mamfferos y BBP en levaduras, conecta U2AF/ Mud2 con la RNPsn Ul unida en el sito 5' de corte y empalme. La formacion del complejo mejora con las reacciones cooperativas de las dos proteinas; SFl y U2AF (o BBP y Mud2) se unen al sustrato de RNA con -10 mas eficacia que cualquiera por sf sola. Dicha interaccion tal vez se encarga de hacer Ia primera conexion entre los dos sitios de corte y empalme a traves del intron. El complejo E se convierte en complejo A cuando Ia RNPsn U2 se une con el sitio de ramificacion, para lo cual se requieren tanto RNPsn U l como U2AF/Mud2. El RNAsn U2 incluye secuencias complementarias del sitio de ramificacion. Una secuen-

RNA U1 de tipo silvestre y pre-RNAm de 12S Corte y empalme normal

/

J.!
Ex6;rs:-GCUAGUAtJ

5

Sitio de corte y empalme del adenovirus 12S

1 ..J

RNAsn U 1 de tipo silvestre y mutante de pre-RNAm de 12S No hay corte y empalme

Sitio de corte y empalme con mutaci6n RNAsn U 1 y RNA 12S con mutaci6n Se restablece el corte yempalme

~:ltre

J Las mutaciones que inhabilitan la funci6n del sitio de corte y empalme 5' pueden ser suprimidas por mutaciones compensatorias en el RNAsn U1, que restablecen el apareamiento de bases.

26.6 La RNPsn U1 inicia el corte y empalme

677

cia cercana al extrema 5' del RNAsn aparea sus bases con la secuencia de ramificaci6n en el intr6n. En las levaduras, implica generalmente Ia formaci6n de una estructura doble con la caja UACUAAC (vease la Fig. 26.14). Varias proteinas de la RNPsn U2 se unen con el sustrato RNA justo en flujo ascendente respecto del sitio de ramificaci6n. La adici6n de Ia RNPsn U2 a! complejo E genera el complej o A previo al corte y empalme, para Ia cual se requiere de Ia hidr6lisis de ATP y asigna un pre-RNAm para Ia via de corte y empalme.

Bll

Conceptos principales • La via directa de formaci6n de un complejo E es r;NRPsn Ul unirse al sitio de corte y empalme 5' y ::.U2AF, unirse a una via de pirimidina entre el sitic -~ ramificaci6n y el de corte y empalme 3'. • Otra posibi lidad es que el complejo se forme entre _: AF en la via de pirimidina y RNPsn Ul en el sitio: :. corte y empalme de flujo descendente. • El complejo E se torna en A cuando la RNPsn U2 s~ _ con el sitio de ramificaci6n. • Si se forma un complejo E utilizando el sitio 5' de :::y empalme de flujo descendente, este es sustituid: : el correspondiente 5' de flujo ascendente cuando e. complejo E se convierte en el complejo A. • Los sitios de corte y empalme 3' debiles pueden requerir un potenciador de corte y empalme localizado en el ex6n de flujo descendente para u directamente con las proteinas SR.

Exon

&===:

~~~=GtiH==~==till~e===~~-

5' Sitio de corte y empalme RNPsn U1 y factor ASF/SF2

Sitio de Via Py ramificaci6n

ASF/SF2 I

=

·GU

-

Sitio de corte y empalme 3'

tiA6 UMe- -'f!¥·AG

se unen con el

I

sitio de corte y empalme5' U2 AF se une con Ia via Py y el sitio de corte y \ empalme 3'

'i

U2AF65 U2AF35

U1 RNPsn

-

El complejo Epuede formar:= por definicion de intr6n o E..=:

I

I

Hay mas de una forma de constituir el compie-· en Ia Figura 26.12 se ilustran algunas posibili · =..: La reacci6n mas directa es que ambos sitios de ~ - y empalme se reconozcan en el intr6n. La pres.:- de RNPsn U l en el sitio 5' de corte y empalr:::: indispensable para Ia union de U2AF en Ia ,-::: pirimidina en flujo descendente respecto del si-:ramificaci6n, lo cual hace posible que los extre-5' del intr6n se unan en ese complejo. El com :- = E se convierte en A cuando Ia RNPsn U2 se un e ::. el sitio de ramificaci6n. La caracterfstica bdsica a:' v{a de corte y empalme es que los dos sitios de carle :

-

l

SF1/BBP

r l

SF1/BBP conecta RNPsn U1 con U2AF

ly•AG:UACUAAC

El complejo de asignaci6n (E) se forma por adici6n sucesiva de RNPsn U1 al sitio de corte y empalme 5', U2AF a La via de pirimidinajsitio de corte y empalme 3', y La proteina puente SF1/BBP.

Definicion de intr6n Ex6n

Definici6n de ex6n

lntr6n G·

Ex6n

Ex6n

Aei:IAAG:=Ry=AG

Sitio5'

===:-GU

Sitio 5' Sitio de ramificaci6n

Sitio de ramificaci6n

SF1

lntr6n GU-tlACUA-;t~;C

U2AF Complejo E

tlA"GUAAG=f>r"AG=

=

l

Sitio 3' Sitio 5' Proteinas SR

GU - uAe t:JAA:C Py=AG

Jn

GU ·

GU = UACUAAC-=¥

AG

GU . :

U1

-

--

Complejo A

=

GU UACUAAC- Py=

J .. Puede haber multiples vias para el reconocimiento inicial de los sitios 5' y 3' de corte y empalme. 678


palme son reconocidos sin necesidad de secuencias ajenas al intr6n, proceso llamado definicion de intron. En un caso extrema, las proteinas SR pueden permitir a U2AF/RNPsn U2 unirse in vitro sin Ul, lo cual da Iugar ala posibilidad de que hubiera una via independiente de Ul para el corte y empalme. Cuando los intrones son largos y los sitios de m rte y empalme debiles, puede seguirse una ruta alterna para formar el empalmosoma. Como se muestra ala derecha de la figura, el sitio S' de corte : empalme es reconocido por el RNAsn Ul en la iorma usual, no obstante que el 3' se reconoce como parte de un complejo formado a naves del siguiente :>x6n, en cuyo caso, el siguiente sitio S' de corte y empalme tambien esta unido al RNAsn Ul, el cual es conectado con el U2AF por las proteinas SR en Ia via de pirimidina. Cuando se une RNPsn U2 para generar el complejo A, hay una reestructuracion . or la cual el sitio S' de corte y empalme correcto el del extrema izquierdo) desplaza al de flujo descendente del complejo. La caracteristica importante j e esa via de corte y empalme es que se requieren secuencias de flujo descendente respecto del intron :nismo, que por lo general incluyen el sitio S' de : orte y empalme siguiente, proceso denominado definicion de ex on. Este mecanismo no es uni~·ersal, no se encuentran proteinas SR ni definicion j e exon en S. cerevisiae. Los sitios 3' de corte y empalme "debiles" nose .men a U2AF y RNPsn U2 de manera eficaz; se ne:esitan secuencias adicionales para unir las protei'las SR, que ayudan a U2AF en su union con la via :le pirimidin(l. Tales secuencias se Haman "potenciaj ores de corte y empalme", y se encuentran muy ~recuentemente en un exon en flujo descendente :especto del sitio 3' de corte y empalme.

Cinco RNPsn forman el empalmosoma Conceptos principales • La union de los RNPsn U5 y U4/U6 convierte al complejo A en el empalmosoma Bl, que contiene todos los componentes necesarios para el corte y empalme. • El empalmosoma pasa a traves de una serie de complejos adicionales conforme avanza el proceso. • La liberaci6n de la RNPsn Ul permite al RNAsn U6 interactuar con el sitio de corte y empalme 5' y convierte al empalmosoma Bl en empalmosoma B2. • Cuando U4 se disocia de la RNPsn U6, este ultimo puede aparearse con el RNAsn U2 para formar el sitio catalltico activo.

::lespues de la formacion del complejo E, los de::::~as RNPsn y los factores involucrados en el corte y

empalme se vinculan con el complejo en un orden definido. En la r: I 1' se muestran los componentes de los complejos identificables conforme avanza la reaccion. El complejo Bl se forma cuando un primer ribete que contiene las RNPsn US y U4/U6 se une con el complejo A que contiene RNPsn Ul y U2; este complejo se considera empalmosoma porque tiene los componentes necesarios para la reaccion de corte y empalme; se convierte en complejo B2 despues de que se Iibera Ul, disociacion necesaria para permitir que otros componentes se yuxtapongan con el sitio S' de corte y empalme, sobre todo con el RNAsn U6. En ese punto, el RNAsn US cambia de posicion, pues inicialmente esta cerca de las secuencias exonicas del sitio S' de corte y empalme, pero se traslada cerca de las secuencias del intron. La reaccion catalftica es desencadenada por la liberacion de U4, que implica la hidrolisis de ATP .

..

. . . .. :

ASF /SF2--.._

I/ /U1

.

....

SF1

/iBBP

Py

~

C C

p'

Complejo E

U2

UG

UAAC

~ )/ r=:=:;.~

AG ~- Complejo A

~-

Py

U6

U2AF

/ Py

AG

~~ Py

AG

~ Hidr61isis de ATP

Jl uG lJACUAAC

~

Py

AG

Complejo 8 1 Se une el recortador U5/U4/U6 U5 se une con el ex6n en el sitio 5' U6 se une a U2 Complejo 82 Se Iibera U1 U5 cambia de ex6n a intr6n U6 se une en el sitio de corte y em pal me 5'

UG

8ACUAAC

U2 se une con sitio de ramificaci6n

U5 /

/

~EJ~CUAAC

C

AG -

=

Complejp C1 Se Iibera U4 U6/U2 cataliza Ia transesterificaci6n U5 se une con el ex6n en el sitio de corte y empalme 3' Se escinde el sitio 5' y se forma uo la:zo

Hidr61lsis de ATP

Complejo C2 U2/U5/U6 se mantienen unidos con ellazo El sitio 3' se esciode y se lig an los exones

GU=

tTACtJAAC= E'y-A6

El RNA escindido se Iibera El lazo se desramifica

~ I~ La reacci6n de corte y empalme pasa por definidas en las cuales la formaci6n del empalmosoma implica la interacci6n de com ponentes que reconocen a las secuencias de consenso.

26.8 Cinco RNPsn forman el empalmosoma

679

3'

cAu G A

~~-U6

8GA Centro catalftico 5'

c Gu uA ~ ~

0'~'

3'

UGAUC'r000

A

ACUAGA~

G UGUAGUA

3' "-"'.......,~ GAo.. ' ~--'\ ACAAO CAU Sitio de corte Sitio de y empalme ramificaci6n 3' (derecho)

Sitio de corte y empalme 5' (izquierdo)

El apareamiento de U6-U4 es incompatible con el de U6-U2. Cuando U6 se une con el empalmosoma, esta apareada con U4, cuya liberaci6n permite un cambia de conformaci6n de U6; una parte de la secuencia liberada forma una horquilla (gris oscuro) y la otra parte (negro) se aparea con U2. Una region adyacente de U2 ya esta apareada con el sitio de ramificaci6n, lo cual conduce a U6 a una yuxtaposici6n con el sitio de ramificaci6n. N6tese que el sustrato RNA se invierte respecto de su orientaci6n usual y se muestra de 3' a 5'. r

La funcion del RNAsn U4 puede ser secuestrar al RNAsn U6 hasta que se necesite. En la :Z J se muestran los cambios que ocurren en las interacciones de apareamiento de bases entre RNAsn durante el corte y empalme. En Ia RNPsn U6/U4 una longitud continua de 26 pares de bases de U6 se aparea con dos regiones independientes de U4, que cuando se disocia, la region que se Iibera en U6 queda a la disposicion para captar otra estructura. La primera parte de ella se aparea con U2 y Ia segunda forma una horquilla intramolecular. La interaccion entre U4 y U6 es mutuamente incompatible con la interaccion entre U2 y U6, por lo que la liberacion de U4 controla la capacidad de avance del empalmosoma. Por claridad, en Ia figura se muestra el sustrato RNA extendido, pero el sitio S' de corte y empalme en realidad esta cerca de la secuencia U6 inmediata allado S' de la cadena unida a U2. Esta secuencia del RNAsn U6 se aparea con secuencias del intron justo en flujo descendente respecto del GU conservado en el sitio S' de corte y empalme (las muta680


ciones que potencian tal apareamiento mejor.r.::eficacia del corte y empalme). As{ pues, varias reacciones de apaream ie- entre RNAsn y el sustrato RNA ocurren durac: : corte y empalme, las cuales se resumen en la r 6 1 . Las RNPsn tienen secuencias que se apa~ ~ con el sustrato y entre si, ademas de regiones ~ nocatenarias en asas muy cercanas a secuen1=ia ~ sustrato, que tienen una participacion import~ a juzgar por la capacidad de las mutaciones cic asas para bloquear el corte y empalme. El apareamiento de bases entre U2 y el p un~ ramificacion, y entre U2 y U6, crea una estruc: que simula el centro activo de los intrones del g:_II de autocorte y empalme (vease la Fig. 26.2 1:' cual sugiere la posibilidad de que el compon': catalftico incluyera una estructura de RNA gen e~: por la interaccion U2-U6. La U6 se aparea c sitio S' de corte y empalme, y los experimentc : enlaces cruzados muestran que un asa del R.l\- -US es inmediato a las posiciones de primeras t ;_ en ambos exones. Aunque se pueden definir la ~ ' cania del sustrato (el sitio S' de corte y em pair:__ el sitio de ramificacion) y los snurps (U2 y U6 ) e:centro catalitico (como se muestra en la Fig. 2 6 _ ~ los componentes que realizan las transesterificc. :_ nes no han sido identificados de manera direc: .:_ La formaci on del lazo en el sitio de ram::=_: cion se encarga de determinar el uso del sitio J corte y empalme, porque la secuencia de cons!'=3' mas cercana allado 3' de la ramificacion se :- vierte en diana para la segunda transesterificac La segunda reaccion de corte y empalme se pre' :-ta inmediatamente despues, reaccion que req L: ~ de la union de RNPsn US con el sitio 3' de cor:::: empalme, pero no hay pruebas de una reacci6r_ _ apareamiento de bases. La conclusion importante sugerida por e: resultados es que los componentes RNAsn del ap: de corte y empalme interactuan tanto entre si como c sustrato RNA mediante interacciones de apareamiec: bases, interacciones que permiten cambios en la estruc que podrian llevar a la aposici6n de grupos reactil_-_ inclusive, a crear centres catalfticos_ Es mas, los c.:.:bios de conformacion de los RNAsn son reversit __ por ejemplo, nose usa RNAsn U6 en una reacc de corte y empalme, y al concluir, deb~ liberarst U2 de manera que pueda volver a formar la est:_ tura doble con U4 para iniciar otro ciclo de co r-~ em palm e. Se han descrito reacciones individuates en L _ cada RNPsn participa, pero como se esperarfa una serie compleja de reacciones, cualquier RK:= en particular puede tener mas de una participac en el corte y empalme. Asi, la capacidad de la Ri\~ U l de promover la union de RNPsn U2 con el s;:...

importantes para crear o liberar estructuras en los componentes pre -RNAm o RNAsn de los empalmosomas. Algunas de las protefnas PRP son componentes de panfculas RNPsn, pero otras actuan como factores independientes. Un ejemplo interesante es PRP16, helicasa que hidroliza el ATP y se vincula transitoriamente con el empalmosoma para participar en el segundo paso catalftico. Otro ejemplo es PRP22, helicasa dependiente de ATP necesaria para liberar el RNAm maduro del empalmosoma. La conservacion de enlaces durante la reaccion de corte y empalme indica que noes necesaria la introduccion de energfa para impulsar Ia formacion del enlace en sf, lo cual implica Ia necesidad de hidrolisis del ATP para otros fines. El que PRP16 y PRP22 utilicen ATP, puede ser ejemplo de un fenomeno mas general, el uso de Ia hidrolisis de ATP para producir los cambios conformacionales necesarios para el a vance del corte y empalme .

U1 se aparea con el sitio de corte_y empalme 5'

,j73' U1

@=;!fii;;§~-~a·o-cCAUlYI::

5' A.GGUI\UGV.

Q

Sitio de corte y empalme 5'

U2 se aparea con el sitio de ramificaci6n

3' 5'···U I;

5' C

UA A C ············AG-·3'

Sitio de ramilicaci6n U6 se aparea con el sitio de corte y empalme 5' U6 3' ~ 5' 5' A G G U A U G U_ 3'

Sitio de corte y em pal me 5'

us esta cerca de ambos exones

ErD

Un aparato alternativo de corte y empalme utiliza diferentes RNPsn


, GURA !> El corte y empalme utiliza una serie de reac:iones de apareamiento de bases entre RNAsn y los sitios de :orte y empalme.

de ramificacion es independiente de su capacidad de Jnion con el sitio 5' de corte y empalme; de la mis:11a manera se pueden definir diferentes regiones de RNPsn U2 necesarias para la union con el sitio de ~amificacion y Ia interaccion con otros componentes Je corte y empalme. Se ha h echo un extenso analisis de las muta :iones en las levaduras para identificar los compo!lentes de RNA y los componentes protefnicos del empalmosoma. Las mutaciones n ecesa rias en los ,enes para el corte y empalme se identifican por Ia acumulacion de precursores no empalmados. Una serie de loci que identifica a genes potencialmente :odificadores de protefnas implicadas en el corte y ~mpalme, originalmente se llamaron RNA, pero hoy se conocen como mutantes PRP (por procesamiento el pre-RNA). Varios de los productos de esos genes :ienen segmentos que los identifican como protef~as de union a RNA, y algunos parecen relacionarse .:on una familia de helicasas de RNA dependientes el ATP. Se supone que ademas de las interaccioCles RNA-RNA, las interacciones protefnas-RNA son

• Una via alterna de corte y empalme utiliza otro conjunto de RNPsn que co nstituyen el empa lmosoma U12. • Los intrones diana se definen por secuencias de consensa mas largas en las uniones de corte y empalme, pero, en general, incluyen las mismas uniones AU-AC. • Ciertos intrones tienen las uniones de corte y empalme AU-AC, incluidos alg unos dependientes de Ul y otros, de U12.

Los intrones GU -AG son la gran mayorfa, >98% de las uniones de corte y empalme en el genoma humano; menos del 1% utilizan uniones relacionadas GC -AG y despues, hay una clase menor de intrones marcados par los extremos AU -AC que representan el 0.1 par ciento. El descubrimiento del primero de ellos requirio un aparato de corte y empalme alternativo llamado empalmosoma Ul2, constituido por Ull y Ul2 (relacionados con Ul y U2, respectivamente), una variante U5 y los RNAsn U4atac y U6a tac. La reaccion de corte y empalme es esencialmente igual a Ia de los intrones GU-AG y los RNAsn actuan de manera analoga. Se desconoce si hay diferencias en los componentes protefnicos de este aparato. Ahara resulta qu e Ia dependencia del tipo de empalmosoma recibe tambien la influencia de se cu encias en el interior del intron, por lo que hay algunos intrones AU-AC con escision y empalme

26.9 Un aparato alternativo de corte y empalme utiliza diferentes RNPsn

681

por empalmosomas de tipo U2 y otros GU-AG con corte y empalme por los de tipo Ul2. Una secuencia de consenso fuerte del extrema de la izqu ierda de fine el tipo de intron dependiente de Ul2: 5'GAUAUCCUUU ..... 3'PyA\. De hecho, casi to dos los intrones dependientes de Ul2 tienen terminaciones GU .... .. . AG, ademas de un pun to de ramificacion muy conservado, UCCUUPuAPy, que se aparea con un Ul2, motivo por el cual se usa la denominacion intron dependiente de Ul2, en vez de intron AU-AC. Ambos tipos de intrones coexisten en una varie dad de genomas, y en algunos casos se encuentran en el mismo gen, si bien los intrones depenclientes de Ul2 tienden a ser flanqueados por intrones dependientes de U2 . Lo que se sabe acerca de Ia fi logenia de estos intrones es que los depenclientes de AU-AG Ul2 tal vez fueron mas frecuente s en algun momenta, pero tienden a convertirse en extremos GU-AG y ala dependencia de U2 durante la evolucion. La evolucion comun de los sistemas resalta por el hecho de que utilizan conjuntos analogos de apareamiento de bases entre RNAsn y con el sustrato pre RNAm. La participacion de RNPsn en el corte y empalme es un ejemplo de su intervencion en las reacciones de procesamiento del RNA, pues es necesario para varias acciones durante el procesamiento del RNA nuclear hacia RNAr maduros. En especial por la demostra cion de que los intrones del grupo I son de corte y empalme propios y que el RNA de Ia ribonucleasa P tiene actividad catalitica (como se describe en el Cap. 27, RNA catalftico), es posible que las acciones RNA-RNA sean importantes en muchos sucesos del procesamiento del RNA.

BIB

El corte y empalme esta relacionado con la exportaci6n del RNAm

Conceptos principales • Las proteinas REF se unen a las uniones de corte y empalme por un Vinculo con el empalmosoma. • Despues del corte y empalme se mantienen adheridas al RNA en La union exon-exon. • Interactuan co n la protein a de trans porte TAP/ Mex, que exporta el RNA a traves de un poro nuclear.

DNA y que garantiza que solo se exporten K - completamente procesados. Las respuestas se : · cionan, en parte, con el momenta relativo en :: ocurren los sucesos: los empalmosomas tal ,·e: forme n para eliminar intrones antes de haber ..: cluido Ia transcripcion, aunque tambien puede . ber una conexion directa entre corte y empalr:·.: exportacion. Los intrones podrfan impedir Ia exportacio ~ RNAm porque se vinculan con el aparato dec _ empalme, si bien el empalmosoma tambien pL:· proporcionar el punto inicial de o con el ~ rato de exportacion. En Ia F se muerun modelo en que el complejo proteinico se -_ con el RNA a traves del aparato de corte y empae dicho complejo consta de >9 protefnas y se ll = EJC (complejo de juntura de exones). El EJC participa en varias· funcione~ de R_ -empalmados en las cuales participan directame:ciertas proteinas del EJC y otras reclutan prot adicionales para funciones especfficas . El pri::::.. o en el ensamblaje de EJC es con uno de factores de corte y empalme, y despu es, el EJC mantiene unido al RNAm justo en flujo ascen · ~ te respecto de la juntura exon-exon. El EJC nc vincula con el RNA transcrito de genes que care-.: de intrones, por lo que su participacion en el proc::es exclusiva para los productos empalmados. En caso de delecion de intrones en un ger. producto se exporta mucho mas lentamente a! ··

Ex6n

lntron

Ex on

~ Corte y empalme

I

t

La proteinase une con el complejo de corte y empalme

I

La proteina se mantiene

t en Ia union exon-exon 1 El complejo (EJC) se

t ensambla en Ia union exon-exon

Despues de qu e se h a sintetizado y procesado el RNAm, se exporta del nucleo a! citoplasma a manera de un complejo ribonucleoproteinico. Las proteinas encargadas del transporte "van y vienen" entre nucleo y citoplasma, solo permanecen brevemente en el compartimiento . Dos aspectos importantes son como reconocen esas protemas sus sustratos de 682

CAPITULO 26 Corte, empalme y procesa miento del RNA

El EJC se une a protefnas implicadas en Ia exportacion, localizacion y decadencia del RNA

El EJC (complejo de union de exones) se une -- RNA por reconocimiento del complejo de corte y empalme.

La protefna REF {Aiy) es parte del EJC

REF El factor de transports TAP/Mex se .une a REF

· !. TAP/Mex ·:. El TAP/f\llex ll.eva el RNAni a traves del poro nuclear

==.=:t. . .r r

.t:::====

TAP/Me NUCLEO .

CITOPLASMA

Se Iibera TAP/Mex

Gll Una prote1na REF se une a un factor de corte y empalme y se queda con el producto RNA. El REF se une a un factor de exportaci6n que se une con el poro nuclear.

plasma, lo cual sugiere que el intron puede propordonar una sefial de union a! aparato de exportacion. Ahora se puede abordar ese fenomeno segun una serie de interacciones protefnicas, como se muestra en Ia 1. El EJC induye un grupo de protefnas llamado familia REF (cuyo miembro mejor caracterizado es Aly). Las proteinas REF, a su vez, interactuan con una protefna de transporte (cuyo nombre varia, TAP o Mex), que se responsabiliza directamente de la interacci6n con los poros nu cleares. Para definir un RNA con corte y empalme, se puede usar un sistema similar, de manera que las mutaciones de terminacion previas a! ultimo ex6n desencadenen su degradaci6n en el citoplasma (vease Ia seccion 7.14, Las mutaciones de terminaci6n desencadenan un sistema de vigilancia) .

fE

Los intrones del grupo II se cortan y empalman a s1 mismos por la formaci6n de un lazo

Conceptos principales • Los intrones del grupo II se escinden del RNA por un suceso autocatal1tico. • Las uniones y el mecanisme de corte y empalme en intrones del grupo II son similares a los de los intrones nucleares. • Un intr6n del grupo II se pliega en una estructura secundaria que genera un sitio catalltico si milar a la ordenaci6n del intr6n nuclear U6-U2.

Los intrones de genes que codifican protefnas (de hecho, excepto los nucleares de codificacion de RNAt) pueden dividirse en tres clases generales. Los intrones nucleares pre-RNAm se identifican solo por Ia posesi6n de dinucleotidos GU .... AG en los extremos 5' y 3' y el sitio de ramificacion/vfa de pirimidina cerca del extremo 3', no muestran ninguna caracterfstica comun en Ia estructura secundaria . Los intrones de los grupos I y II se encu entran en organelos y bacterias (los del grupo I tambien estan en el nucleo de eucariotas inferiores) y se clasifican de acuerdo con su organizaci6n interna; cada uno puede plegarse en un tipo usual de estructura secundaria. Por otra parte, tienen Ia notable capacidad de escind.irse de un RNA, lo que se llama autoescisi6n. Los intrones del grupo I son mas comunes que los del grupo II, y hay poca relaci6n entre ambas clases, pero en cada caso el RNA puede hacer Ia reacci6n de escision in vitro por sf mismo, sin necesidad de actividades enzimaticas provistas por protefnas; sin embargo, casi no hay duda de in vivo se requieren para ayudar al plegamiento (vease Cap. 27, RNA catalftico). En Ia se muestra que mediante dos transesterificaciones sucesivas se escinden tres clases de intrones (mostradas antes en la Fig. 26.6, para los intrones nucleares). En Ia prim era reaccion, Ia union exon-intr6n 5' es atacada por un grupo hidroxilo libre (proporcionado por una posicion 2'-0H interna en los intrones nucleares y del grupo II, y por un nucle6tido de guanina libre en los del grupo I) . En Ia segunda reaccion, el 3'-0H libre en el extremo del exon liberado ataca a su vez Ia union intr6n-ex6n 3'. Hay paralelismos entre los intrones del grupo II y el corte y empalme del pre-RNAm. Los intrones mitocondriales del grupo II se escinden por el mismo mecanismo qu e los pre-RNAm nucleares, a traves de un lazo que se mantiene unido por un enlace 5'-2'. En Ia se muestra un ejemplo del lazo producido por corte y empalme de un intr6n del grupo II. Cuando un RNA de grupo II aislado se incuba in vitro, sin componentes adicionales, puede presentar una reaccion de corte y empalme, lo cual significa que la secuencia misma del intron de RNA del grupo II puede llevar a cabo las dos reacciones de transesterificacion que se muestran en Ia Figura 26.18. El numero de enlaces fosfodiester se mantiene en la reacci6n y, como resultado, no se necesita un aporte externo de energfa, lo cual podrfa haber sido una caracterfstica importante en la evoluci6n del corte y empalme. En una estructura secundaria que contiene varios dominios formados por tallos de pares de ba-

26.11 Los intrones del grupo II se cortan y empalman a si mismos par la formaci6n de un lazo

683

RNA nuclear Primera transferencia~ OH Ex6n 1 ,... 'I ==== G- - -A= G Segunda ~ transferencia Grupo II !'

Ex6n 2

.,

'J(i d3

Grupo I

.. 6 1 Son tres las clases de reacciones de corte y empalme que tienen lugar mediante dos esterificaciones. En primer termino, el grupo OH libre ataca la union exon 1-intron y despues, el OH creado en el extremo del exon 1 ataca la union intron-exon 2.

ses y asas de una sola cadena, se forma un intr6n del grupo II. El dominio 5 esta separado del 6 por dos bases; este ultimo contiene una molt~cula de A que dona el grupo 2'-0H para Ia primera transesterificaci6n y constituye un dominio catalftico en el RNA. La FJ ,u 26 2C muestra una comparaci6n de esa estructura secundaria con la formada por la combinaci6n de U6 con U2 y de U2 con el sitio de ramificaci6n. La similitud sugiere que U6 puede tener actividad catalftica. Las caracterfsticas del coney empalme del gru po II sugieren que el proceso evolucion6 a partir de una reacci6n autocatalftica de una molecula individual de RNA, en la cual se lograba una dele ci6n controlada de una secuencia interna. Es posible que dicha reacci6n implique que el RNA se pliegue en 684


F 9 El corte y empalme libera un intron del g : mitocondria l en forma de lazo estable. Tomada de Van De· = R., et al EMBO J. 1987. 6: 1079-1084. Imagen cortesla de_:::_ A. Grivell, European Molecular Biology Organisation .

una conformaci6n especffica o en una serie de c formaciones, lo cual ocu rrirfa exclusivameme configuraci6n cis. La capacidad de los intrones del grupo ll 7 eliminarse a si mismos por un suceso de cor: empalme autocatalftico contrasta con Ia nece :_ · de intrones nucleares para un aparato de cor: empalme complejo. Los RNAsn del empalmo. . pueden ser considerados como compensador ~ Ia falta de info rmacion de secuencias en el inrr ademas de que proporcionan la informacion --querida para formar estructuras particulares er; "RNA. Las funciones del RNAsn pueden haber e· lucionado a partir del sistema autocatalftico origir; Estos RN Asn actuan en configuraci6n trans so·- · : el sustrato pre-RNAm; se podria imaginar qu e · capacidad de U l para aparearse con el sitio de co:-y empalme 5', ode U2 con la secuencia de ramifL ' ci6n. sustituy6 a una reacci6n similar que requ e::- · que el intr6n portara la secuencia importante. P tanto, los RNAsn pueden presentar reacciones c el sustrato pre-RNAm y entre si, las cuales han Sl4 . tituido a una serie de cambios conformacionales q _: se presentan en el RNA que se corta y empalma p ~ mecanismos del grupo II. De hecho, esos cambi han liberado al sustrato pre-RNAm de Ia obligaci· de portar las secuencias necesarias para patrocin=.Ia reacci 6n. Conforme el aparato de corte y empa.me se ha tornado m as complejo (y el numero "= sustratos potenciales ha a umentado) , las protein.:... han tenido un papel mas importante.

El corte y empalme nucleares estructuran un sitio activo per apareamiento entre U6-U2 y U2-intr6n

Ex6n 1---G U El co rte y empalme del grupo II originan un centro activo a partir de las regiones de apareamiento de bases de los dominies 5 y 6

ru

El corte y empalme nuclear y el del grupo II plican la formaci6n de estructuras secundarias similares. Las :=cuencias son mas especificas en el proceso nuclear; el del ; ll po II hace uso de posiciones que podrian ser ocupadas por : Jrinas (R) o pirimidinas (Y).

El proceso de corte y em palme alternativo i mplica el uso diferencial de uniones de corte y empalme Conceptos pri nci pales • Los exones especificos pueden excluirse o incluirse en el RNA producido mediante el uso, o no, de un par de uniones de corte y empalme. • Los exones pueden extenderse cambiando una de las uniones de corte y empalme para usar una union alternativa. • La determi naci6n del sexo en el genero Drosophila imp lica una serie de sucesos de corte y empalme alternatives en genes que codifican productos sucesivos de una via . • Los elementos P del genera Drosophila muestran corte y empalme alternos especificos de la linea germinal.

Cuando un gen interrumpido se transcribe en un RNAsn que da origen a un solo tipo de RNAm con corte y empalme, no hay ambigi.iedad en Ia asignacion de exones e intrones. Los RNA de algunos genes, sin embargo, siguen patrones de corte y empalme alternativos que se presentan cuando un solo gen da origen a mas de una secuencia de RNAm. En algunos casas, el patron ultimo de expresion es dictado por el transcrito primario, debido a que el uso de diferentes puntas de inicio o Ia generacion de extremos alternativos 3' modifica el patron de corte y empalme. En ciertos casas, un solo transcrito primario se corta y empalma en mas de una forma, y se sustitu yen, agregan o eliminan exones internos, mientras que en on·os, los multiples productos son sintetizados en Ia misma celula, aunque en otros el proceso es regulado, de manera que hay patrones de corte y empalme especfficos solo en condiciones tambien especfficas . Una de las cuestiones mas importantes acerca del corte y empalme, es determinar que controla el uso de tales vias alternas. Las proteinas que intervienen para desviar el uso de ciclos alternativos de corte y empalme se han identificado de dos maneras. En algunos sistemas de mamfferos ha sido posible caracterizar el corte y empalme alternativo in vitro, e identificar las protefnas que se requieren para el proceso. En Ia D. melanogaster, las aberraciones en el corte y empalme alternativo pueden ser producto de mutaciones en los genes que sufren el proceso, ode aquellos cuyos productos son necesarios para la reaccion. se muestran ejemplos de corEn la te y empa lme alternos, en los cuales, el sitio respectivo se mantiene constante, mientras que el otro varia. Los antfgenos T grande/t pequefi.a de SV40 y el prod ucto de Ia region de E l A adenovfrico se generan por conexi6n de un 5' variante con un 3' constante, mientras que en el caso de los antigenos Tit el sitio 5' utilizado para el antigeno T elimina un codon de termina ci6n presente en el RNAm del antigeno t, de manera que el antfgeno T es mas grande que el antfgeno t. En el caso de los productos de transcripci6n de ElA, uno de los sitios 5' se conecta con el ultimo ex6n en un marco de lectura diferente, nuevamente a traves de un cambia significativo en Ia parte terminal- C de Ia proteina. En estos ejemplos, todos los sucesos de corte y empalme importantes ocurren en todas las celulas donde se expresa el gen, de manera que se hacen todos los productos proteinicos. Hay diferencias en la relaci6n de antigenos T/t en diferentes tipos de ce!ulas. La protefna extraida de celulas que producen relativamente mas antfgeno t pequefi.o, puede dar Iugar a Ia produccion preferencial de RNA de t pequefio en extractos de otros tipos

26.12 El proceso de corte y empalme alternative implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme

685

Los antfgenos T/t de SV40 cortan y em pal man dos sitios 5' con el sitio 2' usual

T La E1A de adenovirus corta y empalma sitios variables 5' a un sitio 3' comun 4

Exones

"1-

_

13S 12S

~289 aminoacidos ~243 aminoacidos

.....__ _

~55 aminoacidos

9S

Marcos de lectura alternos El tra de D. melanogaster corta y empalma el sitio 5' con sitios 3' alternos 1

~

2

/'u_

A

3

· IJ\..f, '-"a~'"'~L"r.a

Exones

1\ = 1\

Macho y hembra Sin proteina Solo Ia hembra = 2 0 0 aminoacidos

Las for mas alternativas de corte y empa lme pueden generar diversos productos proteinicos a partir de un gen individual. El cambio de los sitios de corte y empalme puede introducir codones de terminaci6n (marcados con asteriscos) o cambiar los marcos de lectura.

celulares. Esta proteina, Hamada ASF (factor de corte y empalme alternativo), resulta ser la misma que el factor de corte y empalme SF2, necesario para los primeros pasos del ensamblaje del empalmosoma y para la primera reacci6n de escisi6n-ligaci6n (vease la Fig. 26.13) . La ASF/SF2 es una protefna de union de RNA de Ia familia SR. Cuando un pre-RNAm tiene mas de un sitio de corte y empalme 5' que precede a un solo sitio de corte y empalme 3', el aumento de concentraci6n de ASF/SF2 promueve el uso del sitio 5' mas cercano al 3', a expensas del otro, efecto que puede ser contrarrestado por otro factor de corte y empalme, SF5. Atm se desconoce Ia funci6n molecular exacta de los factores en el control de la limitacion del corte y empalme, pero en terminos generales, se observa que el corte y empalme alternativos que implican a diferentes sitios 5' puede ser influido por proteinas involucradas en el ensamblaje del empalmosoma. En el caso de los antfgenos T I t, el efecto tal vez yace en una mayor union de las proteinas SR con el sitio preferido. El corte y empalme alternativo tambien puede ser influido por la represion de un sitio. Los exones 2 y 3 del gen T de troponina de raton son 686


mutuamente excluyentes, se usa el2 en e l m·'~ liso y 3 en los otros tejidos. El musculo liso co-r· protefnas que se unen a elementos repetidos: ~ zados a cada lado del exon 3 que impiden el t:___ los sitios 3' y 5' necesarios para incluirlo. La vfa de determinacion del sexo en D. ii::' gaster implica interacciones en una serie de ; _ donde sucesos de corte y empalme alternos ~ guen a machos y hembras. La via toma la : ilustrada en Ia " '- , en la cual, la re:~ : de cromosomas X con autosomas determina :~ presion de sxl y los cam bios de expresion pa ~c. cuencialmente a traves de los otros genes ha .: el ultimo de la via. La vfa se inicia con el corte y empalme e~ fico de sexo de sxl. El exon 3 del gen sxl co::un codon de terminacion qu e impide Ia sinte-:una protefna funcional, ademas de estar inclu;el RNAm producido en los machos, pero se paE alto en las hembras. (Otro ejemplo de la evi-: : de exones se ilustra la ~ .) Como r __ do, solo las hembras producen la protefna sx: : concentracion de aminoacidos basicos simula --" otras protefnas de union de RNA. La presencia de la protefna Sxl cambia e: ~ y empalme del gen transformador (tra). En la :=:,.. 26.21 se muestra que dicho proceso implica e: y empalme de un sitio 5' constante con sitios ::... nativos 3'. El patron de corte y empalme se pr~: en machos y hembras, y da como resultado un : con un codon temprano determinacion. La precia de la protefna Sxl inhibe el uso del sitio nc:=de corte y empalme 3' por union con Ia via d:: lipirimidina, en su sitio de ramificacion. Cuan pasa por alto ese sitio, se utiliza el siguiente sir: con lo cual se genera un RNAm especffico feme que codifica a una protefna. Asf pues, tra produce una proteina s6lo en !:-.: bras, que es un regulador de corte y empalme.:::... 2 tiene una funcion similar en las hembras - tambien se expresa en la lfnea germinativa n - -lina). Las protefnas Tra y Tra2 son facto res de ~ te y empalme SR que actuan directamente e= productos de transcripcion diana, ademas de c rar (en las hembras) en la modificaci6n del c -:- empalme de dsx. En la Figura 26.23 se muestran ejemplos er. los sitios de corte y empalme se us an para ag:~-"' o sustituir exones o intrones, con la consigu:c sintetizaci6n, otra vez, de diferentes productos ~ · teinicos. En el gen de doble sexo (dsx) , en las 1-:..:: bras empalman el sitio 5' del intr6n 3 con el _ 3' de ese mismo intron, de modo que la traductermina al final del ex6n 4. En los machos, el 5' del intr6n 3 se empalma directamente con e. tio 3' del intron 4, de modo que se omite el exc

del RNAm, y se permite a la traduccion continuar hasta el exon 6. El resultado del corte y empalme alternativos es que se producen diferentes proteinas en cada sexo. El producto masculino bloquea Ia diferenciacion sexual femenina, en tanto que el plioducto femenino reprime la expresion de genes especificos del macho. El corte y empalme alternativos de RNA dsx es controlado por la competencia entre sitios de corte y empalme 3'. El RNA dsx contiene un elemento de J.ujo descendente en el sitio de corte y empalme 3', en el extrema izquierdo, el cual se une a Tra2; las proteinas Tra y SR se vinculan con Tra2 en el sitio, que se convierte en un promotor de la union de U2AF con la via adyacente de pirimidina, fenomeno que asigna el sitio 3' para la formacion del empal:nosoma en las hembras, mas que el sitio alternativo 3'. Las proteinas reconocen al promotor de man era cooperativa, tal vez dependiendo de la formacion de alguna estructura secundaria, asi como de la secuencia en sf. Asi pues, lc,t determinacion del sexo tiene una simetria complaciente: la via se inicia con un suceso especifico de corte y empalme femenino que provoca la omision de un exon que tiene un codon je terminacion y termina con un suceso de corte y empalme especifico femenino que lleva ala inclu;ion de un exon que tiene un codon determinacion. Los sucesos tienen diferentes bases moleculares; en d primer pun to de controL Sxl inhibe el patron de .=orte y empalme predeterminado, y en el ultimo, Tra y Tra2 cooperan para prom over el corte y empalme especifico femenino. Las proteinas Tra y Tra2 no son necesarias para d corte y empalme normales, pues en su ausen.::ia, las moscas se desarrollan normalmente (como 'Tlachos). Como reguladores especificos, no necesa:iamente necesitan participar en la mecanica de la ~eaccion de corte y empalme, a ese respecto difieren je SF2, que es un factor general requerido para el :orte y empalme, pero tambien puede influir en la ~ eleccion de sitios alternos. Los elementos P de D. melanogaster muestran Jn patron de corte y empalme especifico de tejido. ::n las celulas somaticas hay dos sucesos de corte y empalme, pero en la linea germinativa, un su..:eso adicional elimina otro intron. Un codon de :erminacion yace en el intron especifico de linea ~erminativa, de modo que se produce una proteina· -nas larga (con diferen tes propiedades) en la linea germinativa. En la seccion 21.15, Los elementos P ;e activan en la linea germinafiva, se analizan las :onsecuencias del control de la transposicion, pero oor ahara, se sefiala que la especificidad de tejido ~ s resultado de diferencias en el aparato de corte y ::mpalme.

~ ··· Via masculina

-

Via femen ina Raz6n X:A

/ ol "0-s\\. '? :~-b" e\e

Alta

. ~~ ,_. 0-\\0

, 10e ,. e\0'?0. , . _ Mortal respecto ____.... :(I.e 'l 0o5 del sexo e\ co ,i--'0 "" i-,'i:Je 0e\e Proteina Sxl \\1 '?'e

sin producto

""

Corte y em pal me Proteina Tra predeterminados ....,..__ Transformador ____.... 1 sin producto Promueve el corte y empalme femeninos Corte y empalme .. predeterminados ....,..__ Transformador 2 ____.... 0 :(1.e 0 sin producto e e\ c e0'" \le'" wl0 Proteina Tra2 ?lo\0 0-\1\\e 9 Proteina Dsx -*' 'l e\0 Proteina Osx especifica ...,..__ Doble sexo ___,.. esped fica masculine femenina

"s

~

lmpide Ia diferenciaci6n femenina (y promueve el desarrollo masculino)

Suprime los genes masculines (y promueve el desarrollo femenino)

Macho

Hem bra

La determinacion del sexo en D. melanogaster implica una via en que tienen lugar diferentes sucesos de corte y empalme en las hembras. ~l bloqueo en cualquier etapa de la via da lugar al desarrollo masculino.

Hem bra

1\1\ ~Macho El u. tropomiosina corta y empalma exones alternatives

00

,_

~ Musculoliso ~ Otrostejidos Los elementos P escinden un intr6n adicional

1\d\:::::::*:::===

Protefna somatica

JU.J\_ ___ :~~efna

de linea germinativa 87K

Los sucesos de corte y empalme alternos que involucran ambos sitios pueden dar lugar a adici6n o sustituci6n de exones.

La via de corte y empalme predeterminada del preRNAm del elemento Pes el patron germinativo, cuando el RNA es sometido a un extracto de corte y

26.12 El proceso de corte y empalme alternativo implica el uso diferencial de uniones de corte y empalme

68-

empalrne heter6logo (humano) en el cual se escinde el intr6n 3. Los extractos de celulas somaticas de D. melanogaster, sin embargo, contienen una proteina que inhibe la escisi6n de dicho intr6n. La proteinase une a secuencias del ex6n 3, y si esas secuencias presentan deleci6n, el intr6n se escinde, de modo que la funci6n de la proteina quiza sea reprimir el vinculo del empalmosoma con el sitio 5' del intr6n 3.

Las reacciones de corte y empalme en co nfiguraci6n trans utilizan RNA pequenos Co11ceptos principales • Las reaccio11es de corte y empalme suelen ocurrir s6lo entre uniones de corte y empalme en configuraci6n cis de la misma molecula de RNA. • En los tripanosomas y gusanos ocurren corte y empalme en configuraci6n trans en el sitio en que una secuencia corta (RNA SL) se empalma con los extremos 5' de muchos RNAm precursores. • La estructura del RNA SL simula el sitio de union Sm de los RNAsn U y podria tener una participaci6n analoga en la reacci6n.

Desde una perspectiva tanto mecanistica como evolutiva, el corte y empalme se considera como una reacci6n intramolecular que resulta esencialmente en una deleci6n controlada de las secuencias de intr6n en el ambito del RNA. Desde un punto de vista genetico, el corte y empalme ocurre solo en confi-

Ex6n 1

lntr6n

guraci6n cis, lo cual significa que solo las sea .. de la misma molecula de RNA pueden cortarse 1 ~ marse juntas. En la parte superior de la RGUF se muestra la situaci6n normal, los introne _ den eliminarse de cada molecula de RNA de :::: de permitir el corte y empalme simultaneo c. exones, pero no hay corte y empalme intem:: lar de exones entre moleculas de RNA. Nose de decir que nunca ocurra un corte y empalc: configuraci6n cis, entre productos de transcri: : pre-RNAm del mismo gen, pero se sabe que ser excesivamente raro, pues si fuese frecue rr·: exones del gen podrian complementarse gene-: mente, en vez de pertenecer a un solo gru p complementaci6n. Algunas manipulaciones pueden generar e~ _ te y empalme en configuraci6n trans; en el ej e::::- · de la parte inferior de la Figura 26.24 se introu_ ron secuencias complementarias en los intronf""' dos RNA. El apareamiento de bases entre los .: plementos deberia crear una molecula con forrr_ : H, que podria empalmarse en configuraci6n :para conectar exones de las moleculas de RNA ~ _ tapuestas; ambas reacciones ocurren in vitro. Otra situaci6n en que es posible un corte y -:: palme en configura cion trans in vitro se pre;:;:cuando se proporcionan substratos de RNA. _ que contiene un sitio de corte y empalme 5' r con un sitio de corte y empalme 3', aunados .::. cuencias de flujo descendente apropiadas (ya s:-: siguiente sitio de corte y empalme 5', o un pc ::: ciador de corte y empalme). De hecho, este si.rr:.

Ex6n 2

lntr6n

Ex6n 3

Ex6n 4

Puede ocurrir corte y empalme en configuraci6n trans si se introducen secuencias complementarias en los intrones

.....

Ex6n 1

lntr6n

Ex6n 2

Ex6n 3

lntr6n

Ex6n 4

Productos de corte y empalme en configuraci6n cis

Productos de corte y empalme en configuraci6n trans

El corte y empalme suele ocurrir s6lo en configuraci6n cis entre exones de la misma molecula fisica de DNA, pero en configuraci6n trans que soportan el apareamiento de bases entre intrones.

688


el corte y empalme por definicion del exon (vease parte derecha de Ia Figura 26.12) y muestra que, in vitro, no es necesario que los sitios de corte y empalme izquierdo y derecho se encuentren en Ia misma molecula de RNA . Estos resultados demuestran que no hay impedimenta mecanfstico para el ensamblaje en configuracion trans y descartan modelos de corte y empalme que exijan el movimiento progresivo de un empalmosoma a lo largo del RNA; por otra parte, el empalmosoma debe ser capaz de reconocer los sitios de corte y empalme 5' y 3' de diferentes RNA cuando estan muy cerca. Aunque el corte y empalme en configuracion trans es raro in vivo, ocurre en circunstancias especiales. Uno se revela porIa presencia de una secuencia lfder de 35 bases al final de numerosos RNAm, en el tripanosoma, si bien Ia secuencia lfder no se codifica en flujo ascendente respecto de las unidades de transcripci6n individual. Por el contrario, se transcribe en un RNA independiente que porta se cuencias adicionales en el extremo 3', desde una unidad repetitiva localizada en otra parte del genoma. En Ia GU ' se muestra que ese RNA corta la secuencia lfder de 3 5 bases seguida de una secuencia de sitio de corte y empalme 5'. Las secuencias de codificaci6n del RNAm portan un sitio de corte y empalme 3' inmediatamente anterior ala secuencia que se encuentra en el RNAm maduro. Cuando se conectan la secuencia lfder y el RNAm mediante una reacci6n de corte y empalme en configuraci6n trans, efectivamente la region 3'· del RNA lfder y la 5' del RNAm constituyen las mitades 5' y 3' de un intr6n. Al ocurrir el corte y empalme, se forma un enlace 5'-2' por la reaccion usual ent re GU del intron 5' y la secuencia de ramificaci6n cercana a! AG del intr6n 3'; no hay un enlace covalente entre ambas partes del intron, y por ello generan una molecula en forma de Y, no un lazo. La situaci6n similar es con la expresi6n de genes de actina en el Clostridium elegans; tres RNAm de actina (y algunos mas de Rl\TA) comparten la misma secuencia Hder de 22 bases en el extremo 5'. Lasecuencia lfder no esta codificada en el gen de actina, pero se transcribe de man era independiente como parte de un RNA de l 00 bases, codificado por un gen en otra parte. El corte y empalme en configuracion trans tambien ocurre en los cloroplastos. El RNA que dona el ex6n 5' para el corte y empalme en configuracion trans, se denomina RNA SL (RNA lider con corte y empalme) . Los RNA SL que se encuentran en varias especies de tripanosomas, y tambien en el nematodo (C. elegans), presentan algunas caracterfsticas comunes; se pliegan en una estructura secundaria comun que tiene

tres tallos-lazos y una region de una sola ca dena que simula el sitio de union de Sm, de manera que se presentan como RNPsn que forman parte de la clase Sm de RNPsn. Los tripanosomas poseen los RNAsn U2 , U4 y U6, no asf Ul o U5. La ausencia de RNAsn Ul se puede explicar por las propiedades del RNA SL, susceptible de realizar las funciones que el RNAsn Ul suele desempefiar en el sitio de corte y empalme 5', de modo que el RNA SL consta efectivamente de una secuencia d e RNAsn que posee funcion Ul enlazada al sitio de ex6n-intron que reconoce . Hay dos tipos de RNA SL en C. elegans; el RNA SLl (primero en ser descubierto ) se utiliza para corte y empalme de secuencias de codificacion precedidas solo por regiones 5' no traducidas (situacion mas frecuente), en tanto que el RNA SL2 se usa en casos en que 1.111 pre-RNAm contiene dos secuencias de codificacion; se corta y empalma a Ia segunda liberandose de la primera y permitiendo que se utilice como RNAm independiente . Cerca dellS % de los genes de C. elegans estan organizados en unidades de transcripci6n que incluyen mas de un gen (lomas frecuente es que sean de dos a tres). Aun no se define el significado de esa forma de organizacion para el control de la expresi6n genica. En generaL esas unidades de transcripcion no simulan operones, en los cuales los genes actuan de manera coordinada en una via.

Unidades de transcripci6n individuales

Repeticiones seriadas de Ia unidad lfder

~

;l;

Uder de 100 bases 35 bases G~

Secuencia de RNAm

_A

_ AG e==:~

(..lntr6n izquierdo? <..lntr6n derecho?

• Lfder Molecula con forma deY

=

AG =

Uder de 35 bases

Secuencia de RNAm

El SLRNA proporciona un ex6n conectado con el primer ex6n de un RNAm por corte y empalme en configuraci6n trans. La reacci6n implica las mismas i nteracciones que el corte y empalme en con figuraci6n cis nuclear, pero genera un RNA con forma de Y, en vez de un lazo .

26.13 Las reacciones de corte y empalme en configuraci6n

trans

utilizan RNA pequeiios

689

La reacci6n de corte y empalme en configuracion trans del RNA SL puede representar un avance en la evolucion del a para to de corte y empalme preRt"J"Am. En configura cion cis, el RNA SL proporciona Ia capacidad de reconocer el sitio de corte y empalme 5', probabilidad que depende de Ia conformaci6n especffica del RNA; las funciones restantes requeridas para el corte y empalme provienen del RNPsn. Por otra parte, el RNA SL puede actuar sin participacion de las protefnas, como las RNPsn en Ul, lo cual sugiere que el reconocimiento del sitio de corte y empalme 5' depende directamente del RNA.

fZB El corte y empalme del RNAt en levaduras implica escisi6n y reunion

RNAt maduro

C

G

G A

AU Gem A?

CG m AU C

A

U

G

El intron en el RNAt de levaduras apare~ :_ bases con el anticodon para cambiar la estructura del: -=anticodon; el apareamiento entre una base excluida de. ::o y el asa del intron del precursor puede ser necesario ~2: corte y empalme.

Concepto principal • El corte y empalme de RNAt se debe a reacciones sucesivas de escision y reunion.

Casi todas las reacciones de corte y empalme dependen de secuencias de consenso cortas y ocurren por transesterificacion, donde se coordina Ia rotura y estructuracion de enlaces, en tanto que el corte y empalme de los genes de RNAt se logra por un mecanismo diferente, que depende de reacciones independientes de escision y reunion. Unos 59 de los 272 genes de RNAt nuclear de Ia levadura S. cerevisiae estan interrumpidos; cada uno tiene un solo intron localizado apenas un nucleotido mas alia del sitio 3' del anticodon. La longitud de los intrones fluct{ta entre 14 y 60 bp; los de genes de RNAt relacionados tienen vfnculos en secuencia, pero los intrones de genes de RNAt que representan diferentes aminoacidos no estan relacionados. No hay secuencia de consenso que pueda ser reconocida por las enzimas de corte y empalme, lo cual tam bien es valido para los genes nucleares de RNAt interrumpidos en plantas, anfibios y mamfferos. Todos los intrones incluyen una secuencia complementaria a Ia del anticodon de RNAt, lo cual da Iugar a una conformacion alternativa para el brazo del anticodon, en la que sus bases se aparean para formar una extension del brazo usual, como en el ejemplo de la ' solo se afecta el brazo del anticodon, el resto de Ia molecula conserva su estructura usual. La secuencia y el tamafio exacto del i.ntron carecen de imponancia, casi ninguna mutacion impide el corte y empalme; el corte y empalme del RNAt depende sabre todo del reconocimiento de una estructura secundaria comun en el RNAt, mas que de una secuencia comun del intr6n. Las regiones de varias partes de Ia molecula

690


son importantes, incluido el segmento entre el br-' aceptor y el brazo D, del brazo C T'¥, y especiaJrr. :: te el brazo anticodon. Esto recuerda las exige:-. estructurales impuestas al RNAt para Ia sfnte5':... protefnas (vease Cap. 8, Sfntesis de protefnas . Sin embargo, el intron no carece por com de importancia, se necesita el apareamiento euna base del asa del intron y una base no pa : ~' del tallo para el corte y empalme. Las mutac en otras posiciones que influyen en dicho apii: : mien to (por ejemplo, para generar patrones - -:. nativos de apareamiento) intervienen en el c y empalme. Las reglas que rigen Ia disponib··.de precursores de RNAt para el corte y empalr::: asemejan a las que dirigen el reconocimient las sintetasas de aminoacil-RNAt (vease la sec9. 9, Los RNAt son cargados con aminoacido5 las sintetasas). En un mutante de levadura sensible alate::ratura, que no puede eliminar los in nones, los ~. cursores interrumpidos se acumulan en el nu c;~ pueden ser usados como sustratos por un sis~ =- libre de celu!as extrafdo de las de tipo Silvestro:> lo cual puede resultar el corte y empalme dei - _ cursor, en virtud de Ia disminuci6n de tamai1 sultante. Esto se observa en Ia electroforesis e- _ por un cambio en la posicion de Ia banda, cor.:-. ilustra en Ia . La disminucion de · fio se discierne por Ia aparicion de una banda. representa al intron. El ex tracto libre de celulas puede fracciose probando Ia capacidad de corte y empail.n e RNAt. La reacci6n in vitro requiere de ATP. LG _ racterizacion de las reacciones que ocurren con · ATP muestra que dos etapas separadas de Ia re,-. son catalizadas por diferentes enzimas.

Electroforesis en gel

Senis~

Precursor

0

=

Par de bases anticod6n-intr6n (AI)

RNA!

lntr6n FJ(; A. El corte y empalme del RNAt de levaduras in vitro puede ir seguido del analisis del RNA precursory los productos por electroforesis en gel.

• El primer paso no requiere de ATP; implica rotura del enlace fosfodiester por una reaccion de nucleasa inusual; es catalizada por una endonucleasa. • El segundo paso requiere de ATP e implica la formacion de un enlace, es una reaccion de ligadura, y la enzima encargada de esa actividad se describe como una RNA ligasa.

Las escisiones 3' y 5' del pre-RNAt de 5. cerevisiae son catalizadas por diferentes subunidades de endonucleasa; otra subunidad puede determinar la localizacion de los sitios de escision determinando la distancia a partir de la estructura madura. El par de bases AI tambien es importante.

---Protuberancia Pu

/Pu Py Pu Py

La endonucleasa de corte y empalme reconoce al RNAt Conceptos principales • Una endonucleasa escinde los precursores de RNAt en ambos extremes del intron . • La endonucleasa de las levaduras es un heterotetramero con dos subunidades catal\ticas (relacionadas). • Uti liza un mecanisme de medicion para determinar los sitios de escision por sus posiciones relativas respecto de un punta de la estructura del RNAt. • La nucleasa antigua tiene una estructura mas sencilla y reconoce segmentos estructurales de protuberanciahelice-protuberancia en el sustrato.

La endonucleasa se encarga de Ia especificidad del del intron y de escindir a! precursor en ambos extremos del mismo. La endonucleasa de Ia levadura es una protema heterotetramerica cuyas actividades se ilustran en Ia l . Las subunidades relacionadas Sen 34 y Sen2 escinden los sitios de corte y empalme 3' y 5', respectivamente . La subunidad Sen 54 puede determinar los sitios de

r~conocimiento

La endonucleasa de corte y empalme del RNAt arcaico escinde las cadenas que sobresalen en un segmento protrusion-he lice-protrusion.

escision "midiendo" !a distancia desde un punto de Ia estructura del RNAt que se encuentra en el codo de la estructura en forma de L (madura) . Se desconoce la participacion de la subunidad Senl5, pero su gen es indispensable en las levaduras, p ues se requiere el par de bases que forma entre la primera base del asa del anticodon y Ia base precedente del sitio de corte y empalme 3' para el sitio de escision del corte y empalme 3' . Una profundizacion interesante en !a evolucion del corte y empalme del RNAt proviene de las endonucleasas arcaicas, homodfmeros u homotetrameros en que cada subunidad tiene un sitio activo (aunque solo dos de eUos funcionan en el tetramero) que fragme nta uno de los sitios de corte y empalme. La subunidad tiene secuencias relacionadas con las se26.15 La endonucleasa de corte y empalme reco noce al RNAt

691

cuencias de sitios activos de las subunidades Sen34 y Sen2 de Ia en zima de levaduras. Sin embargo, Ia enzima arcaica reconoce su su strato d e forma diferente, y en Iugar de medir Ia distancia a partir de secuencias espedficas, reconoce Ia caracterfstica es tructuralllamada protrusi6n-helice-protrusi6n. En Ia ' se muestra que Ia escisi6n ocurre en ambas protrusiones. AsL el inicio del corte y empalme del RNAt pre cede a Ia separaci6n de las enzimas arcaicas y las eucariotas, si se origin6 a rafz de Ia inserci6n del intr6n en el RNAt, debe haber sido un suceso muy antiguo.

BB

La escisi6n y la ligadura del RNAt son reacciones separadas

Conceptos principales • La liberaci6n del intr6n genera dos mitades de RNAt que se unen para formar la estructura madura. • Las mitades tienen los extremes singulares 5' hidroxilo y 2'-3' fosfato ciclico. • El extrema 5'-0H es fosforilad o par una ci nasa de polinucle6tidos; la fosfodi esterasa abre el grupo fo sfato ciclico para producir un extrema 2' fosfato y un grupo 3'-0H; los extremes de los exones se unen par acci6n de una ligasa de RNA y el 2' fosfato es retirado par una fosfatasa.

0~2'-3' P +

_JL"=:":J~':::"~L~ +5·3 · ~C. -

II

-

11 5•

2'-3'P

"La fosfodiesterasa abre el anillo fosfato Cadena

La cinasa fosforila el extremo 5'-0H

0

Cadena

R~"~~~' 2'-3' fosfato cfclico

3'

3'-HO, 2' fosfato

o-~-0

b

OH

6H

0

Base

~ 0

Base

~ -~ Cadena RNA!

Cadena RNA!

El corte y em palme del RNAt requie re de actividades separadas de nucleasa y ligasa . Los limites de ex6n-intr6n son escindidos par la nucleasa para generar fosfato ciclico de 2' a 3' y un extrema 5' OH . El fosfato ciclico se abre para generar los grupos 3'-0H y 2' fosfato; el 5'- OH esta fosforilado . Despues de liberar al intr6n, las mitades de moleculas de RNAt se pliegan en una estructura similar al RNAt, que ahara tiene una rotura 3'-0H, 5'- P, sellada por una ligasa.

692

CAPITULO 26 Corte, empalme y procesa miento del RNA

La reacci6n total del corte y empalme del RNA: 0 . Los productos de lc: = resume en Ia cisi6n son un intr6n lineal y d os medias molec: de RNAt. Cada extrema 5' termina en un grupo hidro' y cada extremo 3' en un grupo fosfato dclico 2· (Todas las demas en zimas d e corte y empalme RNA escinden el otro sitio del enlace fosfato. ) Las dos mitades de RNAt aparean su s bases --'formar una estructura similar al RNAt, y cuand agrega ATP se presenta Ia segunda reacci6n. ~ extremos inusuales generados por Ia endom.J,cle~ deben ser modificados, de modo que el grupo fo =dclico se abre para generar un extrema 2' fosf~ reacci6n que requiere de Ia actividad de Ia fosfo ·-_ terasa cfclica. El producto tiene un grupo 2' fos~.:: y uno 3'-0H. El grupo 5'-0H generado por Ia nucleasa C':" ser fosforilado para dar uno 5' fosfato, lo que or.,.. n a un sitio en el que el grupo 3'-0H esta cerca _ 5' fosfato. La integridad covalente de Ia caden.;. polinucle6tidos se restablece entonces por ac _ de una ligasa. Las tres actividades, fosfo diesterasa, cinas.;. ~ polinucle6tidos y sintetasa de adenilato (que empen a Ia funci6n de ligasa) se disponen en rentes dominios funciona les en una sola protefr;.;. actuan en forma seriada para u nir las dos mira de RNAt. La molecula empalmada ahora es ininterru:::. pida, con un enlace 5'-3 ' fosfato en el sitio de _ si6n, pero tambien un grupo 2' fosfato que m- el suceso. El grupo sobrante debe ser eliminado :una fosfatasa. Durante Ia reacci6n de corte y empalme :.. RNAt en plantas y mamfferos tambien se geiil.er · fosfato ciclico 2', 3'; Ia reacci6n en plantas parec.: misma que en las levaduras, pero las reacciones Ci micas detalladas son diferenres en los mamffer : Los precursores de RNAt en levaduras tam ::: pueden presentar corte y empalme en un ext:-.::.· to obtenido de Ia vesfcula germina l (nucleo) de. oocitos del gen era Xenopus, fen6meno que mue:;· qu e Ia reacci6n noes especffica de una especie, s~ que el genero Xenopus debe contar con enzimas :..:. paces de reconocer los intrones de los RNAt de levaduras. La capacidad de corte y empalme de los prod·_ tos de los genes de RNAt esta, por tanto, bien c servada, pero es posible que su origen sea difer :del de otras reacciones de corte y empalme (c :el del pre -RNAm nuclear). La reacci6n de cor: empalme de RNAt hace uso de escisi6n y sfntesio enlaces y depende de las secu encias ajen as al inc En otras reacciones de corte y empalme se utiliz.: transesterificaci6n, en Ia cual se transfieren dire.:-

mente los enlaces, y las secuencias requeridas para Ia reaccion yacen en el intron.

E

La respuesta de la prote1na no plegada tiene relaci6n con el corte y empalme del RNAt i

Conceptos principales • La Ire1p es una prote\na interna de la membrana nuclear con su dominic terminal-N en la luz del ER y el terminal-( en el nucleo. • La union al dominio terminal-N de una prote\na no plegada activa la nucleasa terminal-( por autofosfori laci6n . • La nucleasa activada escinde al RNAm Hac1 para liberar un intr6n y generar exones que se unen por una ligasa de RNAt. • El RNAm Hac1 esci ndido codifica un factor de transcripci6n que activa genes codificadores de chaperones que ayudan a plegar las prote\nas no plegadas.

Un sistema de corte y empalme desusado relacionado con el corte y empalme del RNAt media Ia respuesta a las protefnas no plegadas de las levadimas. La acumulacion de este tipo de protefnas en Ia luz del retfculo endoplasmico (ER) desencadena una vfa de respuesta qu.;e !leva al aumento de Ia transcripcion de genes que codifican chaperones, los cuales facilitan el plegamiento de las protefnas en el ER, de modo que debe trasmitirse una sefial de Ia luz del ER al nucleo. El censor que activa Ia vfa es Ia protefna Ire l p, protefna integral de membrana de tipo cinasa (Ser/ Treo) que tiene dominios a cada lado de Ia membrana del ER. El dominio terminal-N, en Ia luz del ER, detecta las protefnas no plegadas, supuestamente por union con los segmentos expuestos, lo cual provoca la agregacion de monomeros y activa el dominio terminal-C en el otro lado de Ia membrana por autofosforilacion. Los genes activados por esta vfa tienen un elemento promotor comun llamado UPRE (elemento de respuesta de protefna no plegada), a! cual se une el factor de transcripcion Hac l p para producir una respuesta a Ia acumulacion de protefnas no plegadas; el desencadenante de Ia produccion de Haclp es Ia accion de Irelp en el RNAm de Had. La operacion de Ia vfa se resume en la 6. . En condiciones normales, cuando la vfa no esta activada, el RNAm de Had se traduce en una protefna que se fragmenta rapidamente. La activacion de Irelp da origen a! corte y empalme del RNAm de Had que cambiara la secuencia de Ia pro-

tefna a una forma mas estable, la cual proporciona el factor de transcripcion funcional que activa los genes con UPRE. En esta reaccion participan componentes inusuales de corte y empalme. La Irelp tiene actividad de endonucleasa, que actua directamente en el RNAm de Had para escindir las dos uniones de corte y empalme, las cuales estan unidas por Ia ligasa de RNAt, la cual actua en la via de corte y empalme de RNAt. La reaccion de endonucleasa simula Ia escision del RNAt durante el corte y empalme. ,:.Donde ocurre la modificacion del RNAm Hac!? Es probable que Ia Irelp este en la membrana interna del nucleo, con el dominio sensor terminal-N en la luz del ER y el terminal-C cinasa /nucleasa en el nucleo, lo cualle permitirfa actuar directamente en el RNA de Hac! antes de que se exporte a! citoplasma, ademas de facilitar el a Ia RNAt ligasa. No hay una relacion aparente entre la actividad de nudeasa de Irelp y la de endonucleasa de corte y empalme del RNAt, de modo que no es obvio como evoluciono este sistema especializado.

El dominio ER-Iuminal se une con Ia proteina no plegada

El dominio nuclear/ citos61ico escinde el HAC1 RNAm

!

Traducci6n

!

Degradaci6n

I Ligasa .... de RNAt

Traducci6n HAC1

1 La respuesta de la prote\na no plegada se produce por activaci6n de un corte y empalme especial del RNAm HAC1 para producir un factor de transcripci6n que reconoce al UPRE.

26.17 La respuesta de la prote\na no plegada tiene relaci6n con el corte y empalme del RNAt

693

Bill

Los extremos 3' de los productos de transcripci6n pol I y pol III se generan por terminaci6n

Conceptos pri ncipales • La polimerasa I de RNA termina la transcripci6n con una secuencia finalizadora de 18 bases. • La polimerasa III de RNA termina la transcripci6n en la secuencia poli (U)4 de una secuencia rica en G-C.

Los extremos 3' del RNA pueden generarse en dos formas. Algunas polimerasas de RNA terminan la transcripci6n en una secuencia definida (termi-

Cuando se genera un extrema 3' por terminaci6n, la polimerasa de RNA y el RNA se liberan en una secuencia definida (de terminaci6n) en el DNA.

5'

Cuando se genera un extrema 3' por escisi6n, la polimerasa de RNA continua la transcripci6n, mientras una endonucleasa hace un corte en una secuencia definida en el RNA.

694

CAPiTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

nadora) en el DNA, como se muestra en Ia nG , en tanto que otras polimerasas de RNA L muestran una terminaci6n definida, sino que co:-.tinuan mas alla del sitio que corresponde al extren _ 3' generado por la escisi6n del RNA por una end nucleasa, como se muestra en la I 6 .J . La informacion acerca de Ia reacci6n de te rn~- nacion para las polimerasas de RNA eucarioticas. ::: menos detallada que el conocimiento que se tie-_; de la iniciacion. Las polimerasas I y III de RNA f ~ nen sucesos de terminaci6n bien definidos (coc Ia polimerasa de RNA bacteriana), pero no se ~.:: aclarado si la polimerasa II de RNA suele termir:..::.de esa forma. Para Ia polimerasa I de RNA, el producto lie_co de transcripci6n es un gran precursor que c ::_tiene las secuencias del RNAr mayor. El precur~ esta sujeto a un procesamiento extenso, con u-terminacion en un sitio definido > l 00 bp en fl t_; descendente respecto del extrema 3' maduro, ger_::rado por corte y empalme. La terminaci6n imp!: el reconocimiento de una secuencia terminadora -=- = 18 bases por un factor a uxiliar. Con la polimerasa III de RNA, Ia transcripci in vitro genera moleculas con los mismos extre n~ _ 5' y 3' que los sintetizados in vivo. La reaccion :: terminaci6n simula Ia terminaci6n intrfnseca __ la polimerasa de RNA bacteriana (vease Ia seed -11.21 , Hay dos tipos de terminadores en E. coli). ::...0 terminaci6n suele ocurrir en el segundo U de u:-_ serie de cuatro bases U, pero hay heterogeneidc.: de modo que algunas moleculas terminan en c :-o hasta cuatro bases U. La misma heterogeneiC..o se observa en moleculas sintetizadas in vivo, de n·_: nera que parece una caracterfstica de buenafe d reacci6n de terminaci6n. Como los terminadores procari6ticos, la s :de U esta incrustada en una region rica en G- C aunque hay secuencias simetricas cada 180°, no necesarias para la terminaci6n, pues las mutacio _;: que eliminan Ia simetrfa no evitan la conclusi normal de Ia sfntesis de RNA; tam poco hay secue-cias necesarias mas alla de Ia serie U porque to -' las secuencias vitales pueden ser sus tituidas, :;. ningun efecto en Ia terminaci6n. La serie U misma no es suficiente para Ia te:-minaci6n porque hay regiones de cuatro molec :. .:_ U sucesivas en las unidades de transcripci6n lei ' por la polimerasa III de RNA (si bien no hay ser: U5 internas, lo cual coincide con una mayor efica- ~ en la terminaci6n cuando el terminador es U 5, n·..:: que una secuencia U4 ). Asf pues, Ia caracteris -clave de Ia terminacion debe ser el reconocimie:-_de una secuencia U4 en un contexto rico en pillde bases G-C.

(.Como ocurre Ia reaccion de terminacion? No _ puede confiar en la debilidad de Ia region del -lbrido RNA-DNA rU -dA que yace en el extremo : I transcrito, pues a menudo solo se transcriben c1s primeras dos moleculas de U. Tal vez Ia region ...; a en G-C participe en el enlentecirniento de la ~ :~zima , pero no parece qu e una contraparte de horquilla este involucrada en Ia terminacion en as procariotas. Se mantiene el enigma en cuanto a 3. forma en que Ia enzima puede responder de ma~ era tan espedfica a una sefial tan breve. A diferen_·a de la reaccion de iniciacion, que la polimerasa JI de RNA no puede realizar sola, Ia terminacion :1arece ser una funcion de Ia enzima misma.

Los extremos 3' del RNAm se generan por escisi6n y poliadenilaci6n Conceptos principales • La secuencia AAUAAA es una sefial para la escisi6n, que genera un extrema 3' del RNAm poliadenilado. • La reacci6n requiere de un complejo prote1nico que contiene un factor de especificidad, una endonucleasa y una polimerasa poli(A). • El factor de especificidad y la endonucleasa escinden el RNA en flujo descendente respecto de AAUAAA. • El factor de especificidad y la polimerasa poli(A) agregan continuamente - 200 moleculas de A al extrema 3'.

:..os extremos 3' del RNAm son generados poresjsion, seguida de poliadenilacion. La adicion de poli(A) al RNA nuclear puede evitarse mediante el analogo desoxiadenosina, qu e tambien se conoce :omo cordicepina, que si bien no detiene la trans:ripcion del RNA nuclear, a! agregarla se impide la aparicion de RNAm en el citoplasma, con lo cual se demuestra que Ia poliadenilacion es necesaria para Ia _1aduracion del RNAm a partir del RNA nucl ear. La generacion del extremo 3' se ilustra en Ia GU . La polimerasa de RNA transcribe mas alia del sitio correspondiente al extremo 3', de modo ~ue las secuencias de RNA se reconocen como dianas para un corte endonucleolftico seguido de poliade:J.ilacion; un solo complejo de procesamiento realiza :>1 corte y Ia poliadenilacion; esta ultima estabiliza el ~NAm contra Ia fragmentacion desde el extremo 3'; =I extremo 5' ya esta estabilizado por el capuchon. La . olimerasa de RNA continua la transcripcion despues _e Ia escision, pero el extremo 5' que se genera esta iesprotegido. El suceso de escision proporciona un desencade :-~ante indirecto de Ia terrninacion por Ia polimerasa

II de RNA. Una exonucleasa se une con el extremo 5' del RNA, que sigue siendo transcrito despues de la escision y fragmenta al RNA en forma mas rapida que su sintesis; se aparea con Ia polimerasa de RNA para despues interactuar con proteinas auxiliares unidas al dorninio carboxilo terminal de la polimerasa, interaccion que desencadena Ia liberacion de Ia polimerasa de RNA del DNA y !leva a su fin Ia transcripcion. El modelo global es similar a! de Ia participaci6n de Rho en Ia terminaci6n de Ia transcripcion porIa polimerasa de RNA bacteriana (vease Ia secci6n II.22, (.Como funciona el factor Rho?), lo qu e explica porque los sitios de terminacion para Ia polimerasa II de RNA no estan bien definidos, sino que pueden ocurrir en varias localizaciones de una prolongada region de flujo descendente respecto del sitio correspondiente a! extremo 3' del RNA. Una caracteristica comun del RNAm en eucariotas superiores (no asf en las levaduras) es una secuencia altamente conservada, AAUAAA, en Ia region de II a 30 nucleotidos en flujo ascendente respecto del sitio de adicion de poli(A) . La delecion o mutacion del hexamero AAUAAA impide Ia generadon de un extremo 3' poliadenilado, pues Ia sefial es necesaria para Ia escisi6n y Ia poliadenilacion. El desarrollo de un sistema en el cualla poliadenilacion ocurre in vitro, abrio las puertas al analisis de las reacciones. La formacion y las funciones del complejo que realiza el procesamiento 3' se ilustran en Ia La generacion de Ia estructura 3' terminal apropiada requiere de una endonucleasa constituida por los componentes CFl y CFII para escindir el RNA, una polimerasa poli(A) (PAP) J

.

Elongaci6n

___,.

\E ..6n SCISI

Capuch6n 5' Endonucleasa El RNAm se estabiliza por poliadenilaci6n

Degradaci6n Poliadenilaci6n Capuch6n 5'-

I

AAUAAA

La secuencia AAUAAA es necesaria para que la escisi6n genere un extrema 3' para la poliadenilaci6n.

26.19 Los extremos 3' del RNAm se generan par escisi6n y poliadenilaci6n

695

PAP El factor de escisi6n genera un extreme 3' AAUAAA

La polimerasa poli(A) (PAP) agrega moleculas de A _, ( PAP AAUAAA . AAAAAAAA-3' CstF

1

La protefna de uni6n poli(A) (PBP) se une a poli(A)

PBP' AAUAAA CstF

~

'Afl'..'AM'AAAAAAAAA-3' 1 / · 1

El complejo se disocia despues de agregar -200 moleculas de A

---I AAUAAA

.tpBR

A'/f..AI}.A />:.'A'/i..AAAAA-3' (

'

'

D .J El complejo de procesamiento 3' consiste de varias actividades; el SF y el CstF constan cada uno de varias subunidades; los otros componentes son monomericos. La masa total es de >900 kD.

para sintetizar Ia cola poli(A ) y un componente de especificidad (SF) que reconoce la secuencia AAUAAA y dirige las otras actividades. Un factor de estimulacion, CstF, se une a una secuencia rica en G-U en flujo descendente respecto del sitio mismo de escision. El factor de especificidad contiene cuatro subunidades que juntas se unen especfficamente al RNA que contiene la secu encia AAUAAA. Las subunidades individuales son proteinas con segmentos de union al RNA comun es, pero que por si mismas se unen de manera inespecffica al RNA. Las interacciones proteina-proteina entre subunidades tal vez sean necesarias para gene rar el sitio de union especffico a AAUAAA. El SF se une fuertemente a esta ultima solo cuando tambi en esta presente el CstF para unirse al sitio rico en G- U. Para las reacciones de escision y poliadenilacion se necesita el factor d e espe cificidad, que se

696


encuentra como complejo con la endonuclea ~ polimerasa poli(A), complejo que suele reali.L.c: escision seguida de poliadenilacion en una : estrechamente acoplada . Los dos componentes CFI y CFII (facto:::escision I y II) , aunados al factor de especi fison necesarios y suficientes para la escision e _ nucleolitica. La polimerasa poli(A) tiene una actividacl ~ litica inespecffica. Cuando se combina con los componentes, la reacci6n sintetica se hace _ fica del RNA que contiene la secuencia AAL-_La reaccion de poliadenilaci6n pasa por dos e : ~ primero se agrega una secuencia mas bien c_ oligo(A) (-10 molecula s), al extremo 3', rea -::absolutamente dependiente de la secuencia A.-_-_ AA, que realiza Ia polimerasa poli(A) dirigida ;- · factor de especificidad. En la segunda fase, lo. ~ oligo(A) se alarga basta un total de -200 mole'--._ Dicha reaccion requiere de otro factor estimu :~ que reconoce la cola oligo(A) y dirige a Ia po:-rasa poli(A) especificamente a que extienda e tremo 3' de una secuencia p oli(A).La polimerasa poli(A) agrega por sf misma ~ leculas de A individuates a la posicion 3' . Su = ~ = intrfnseca de accion es distributiva, se disocia. _ pues de que se ha agregado cada nucleotido, : : en presencia de SF y PABP (protefna de u:::._ poli(A)) actua de manera progresiva para e:Xte.::: una cadena poli(A) individual. La PABP es u nc. _tefna de 33 kb que se une de manera estequior:· : ca al segmento poli(A), cuya longitudes contrc...c. por la PABP, que de alguna manera limita la ac::. de la polimerasa poli(A) a -200 adiciones de r:· culas de A. El limite podria representar Ia ac~ !a cion de una masa critica de PABP en la ca.:. . poli(A). La PABP se une con un factor de inic la traduccion, eiF4G, gen erando asf una asa ce:da en Ja cual un complejo protefnico contiene extremos 5' y 3' del RNAm (vease la Fig. 8._ · la seccion 8.9, Las eucariotas usan un complej muchos facto res de iniciacion) . La poliadenilacion determina de manera in:. tante la funcion del RNAm, pues pu ede afectar u :la estabilidad como el inicio de la traducci6n ( '~" la secci6n 7 .l 0, El extremo 3' esta poliadenilc: .::. Durante el desarrollo embrionario de algunos o:-:nismos, la poli(A) controla la transducci6n, de rt: que los RNAm previos pueden estar poliadenil.;.::. (para estimular la traduccion) 0 de sadenilados r-: terminarla). Durante el desarrollo embrionario _ genero Xenopus, la poliadenilacion del RNAm e:-. citoplasma depende de un elemento especffi w actuaci6n en configuracion cis (el E) en la cole. · otra frecuencia rica en AU, UUUUUAU .

En los embriones del genera Xenopus, cuando ::::1enos dos tipos de secuencias de actuacion en con:Jguracion cis que se encuentran en la cola 3' pue: en desencadenar Ia desadenilacion. Por una parte, :!I EDEN (elemento de desadenilaci6n embrionaria) ::s una secuencia de 17 nucle6tidos, en tanto que . s elementos ARE son ricos en AU y suelen con:ener repeticiones seriadas de AUUUA. Hay una ibonucleasa poli(A) (PARN) especffica que podrfa participar en Ia fragmentacion. Obviamente, Ia des:~denilacion no siempre es desencadenada por los :'lementos especfficos; en ciertas situaciones (incluiia Ia fragmentacion normal del RNAm conforme envejece), Ia poli(A) se fragmenta, a menos que sea cspecfficamente estabilizada.

La escisi6n del extrema 3' del RNAm de histona puede requerir un RNA pequeno Conceptos principales • Los RNAm de histonas no estan poliadenilados; sus extremos 3' se generan por una reacci6n de escisi6n que depende de la estructura del RNAm. • La reacci6n de escisi6n exige la union de SLBP a una estructura de tallo-asa y que se aparee el RNAsn U7 con una region adyacente monocatenaria.

_.\lgunbs RNAm no estan poliadenilados, de modo que Ia formacion de sus extremos 3' es diferente de :a reacci6n coordinada de escisi6n/poliadenilacion. _os mas notables de esta clase de RNAm son los que codifican para las histonas que se sintetizan durante Ia replicacion del DNA, Ia forma cion de :uyos extremos 3' depende de la estructura secundaria. La estructura del extrema 3' es de tallo-lazo muy conservada, con un tallo de 6 bp y un asa de ~uatro nucleotidos. La escision ocurre a una dis_ancia de cuatro a cinco bases en flujo descendente respecto del tallo-lazo. Para Ia reaccion de escision, -e requieren dos factores, que la protefna de union al tallo-asa (SLBP) reconozca la estructura y que d RNAsn U7 se aparee con una secuencia rica en _urinas (el elemento de flujo descendente histona o HDE) localizada - 10 nucleotidos en flujo desceniente respecto del sito de escision. Las mutaciones que no permiten Ia formacion iel tallo doble en la estructura tallo-lazo impiden :a formacion del extrema del RNA. Las mutacio:les secundarias que restablecen la estructura doble aunque no necesariamente Ia secuencia original) se comportan como revertores, fenomento que sugiere que la formaci6n de la estructura secundaria es mas :mportante que la secuencia exacta. La SLBP se une con

uu

U U UA Horquilla--c G

RNAm H3

Consenso

uA

I

CG 5' ... AACG3 CCACCACACCCCCAAGAAAGAUUCUCGUUAAA CAACCGUGA uCUGGGAAGAUcu\.liJ\.\Gi>-COlJUCU A G ,

5

GC CG GC GG AU GC GC CG

U

RNAsn U7

A

G A

I 1 26. La generaci6n del extrema 3' del RNAm de la histona H3 depende de una horquilla conservada y una secuencia que aparea sus bases con el RNAsn U7 .

tallo-asa y despues interactua con el RNAsn U7 para promover su interaccion con el sitio de union del flujo descendente de RNPsn U7, que es una RNPsn menor constituida por 63 nucleotidos del RNAsn U7 y un conjunto de varias proteinas (incluidas las Sm; vease Ia seccion 26.5, Se requieren RNAsn para el corte y empalme) . La reaccion entre el RNAm de Ia histona H3 y el RNAsn U7 se incluye en Ia . La horquilla en flujo ascendente y el HDE que se aparea con el RNAsn U7 se han conservado en el RNAm de la histona H3 de varias especies. El RNAsn U7 tiene secuencias hacia su extrema 5' que se aparean con las de consenso del RNAsn de histonas. El procesamiento 3' es inhibido por mutaciones en HDE que reducen su capacidad de apareamiento con el RNAsn U7. Las mutaciones compensatorias en este ultimo que restablecen la complementariedad, tambien restablecen el procesamiento 3'; esto sugiere que el RNAsn U7 actua por apareamiento de bases con el RNAm de histonas. La secuencia de HDE varia entre los diversos RNAm de histonas, de modo que Ia union de RNAsn noes por sf misma necesariamente estable, sino que requiere tambien de Ia interaccion con SLBP. La escision para generar un extrema 3' ocurre a una distancia fija respecto del sitio reconocido por el RNAsn U7, lo cual sugiere que el RNAsn participa en Ia definicion del sitio de escision. Sin embargo, los factores realmente encargados de Ia escision no han sido identifi cados aun.

fZ111

La producci6n de RNAr requiere de sucesos de escisi6n

Concepto principal • El RNAr grande y el pequeiio se liberan por escisi6n a partir de un RNA precursor comun.

26.21! La producci6n de RNAr requiere de sucesos de escisi6n

697

3'

~-

188

288

~

Endonucleasa

.,_

3'-5' exonucleasa

~

5'-3' exonucleasa

A partir de un producto primario de transcripci6n se generan RNAr eucari6ticos maduros por sucesos de escisi6n y recorte.

RNAt DNA ~ P1 P216S RNAr

RNAt 238 RNAr

~

308 RNA

Productos

l

168 RNAr RNAt

~ 238 RNAr

l

58 RNA RNAt

Los operon es rrn de E. coli co ntienen genes para RNAr y RNAt. La longitud exacta de los productos de transcripci6n depende de que promotores (P) y terminadores (t) se usen. Cada RNA producido debe liberarse del transcrito mediante cortes a ambos lados.

698

CAPiTULO 26 Corte, empalme y procesamiento del RNA

Los principales RN Ar se sintetizan como parte ·, producto unico de transcripcion prima ria pro ce~ para generar los productos maduros. El prec . contiene las secuencias de los RNAr de l8S, 5 .~ : 28S. En eucariotas superiores, el precursor se bra de acuerdo con su velocidad de sedimenta . como RNA 45S; en eucariotas inferiores es pequei'i.o (35S en levaduras) . Los RNAr maduros se liberan del precurs ~ una combinacion de sucesos de escision y rea-::; nes de recorte. En Ia se muestra !« general de las levaduras. Puede haber variaci ':el arden de los sucesos, pero basicamente parti¢ reacciones similares en todas las eucariotas. L
te otras, se unen al precursor, de manera que en el sustrato para el procesamiento no esta el RNA libre, mas bien un complejo ribonucleoprotefnico.

RNAsno 5'

E

Se requieren RNA pequenos para el procesamiento del RNAr

CajaC RUGAUGA

Caja D NNNNNN CUGA

!

Apareamiento de bases

5' RUGAUGA


NNNNNN

CUGA

'f'lliNhl ~ 1\J RNAr

• Se requiere el grupo C/D de los RNAsno para modificar la posicion 2' de la ribosa con un grupo metilo.

!

• Para modificar la posicion 2' de la ribosa con un grupo metilo se requiere del grupo C/D de RNAsno.

Metilaci6n

5 bases de Ia caja D

• !Para convertir la uridina en seudouridina se necesita el grupo H/ACA de RNAsno.

5' RUGAUGA

• Para generar una estructura usual, sustrato de la modificacion, en todos los casas, la base del RNAsno se aparea con una secuencia de RNAr que contiene la base diana.

LNNNN

CUGA

NNNN~

Me

El procesamiento y modificacion del RNAr requiere de una clase pequeii.a de RNA llamada RNAsno (RNA nucleolares pequefios), de los cuales hay 71 en el genoma de las levaduras (S. cerevisiae), los cuales se vinculan con la protefna fibrilarina, componente abundante del nucleolo (region del nucleo donde se transcriben los genes de RNAr). Para escindir al precursor de RNAr se requiere de algunos RNAsno; un ejemplo es el U3, necesario para el primer suceso de co11e en levaduras y organismos del genero Xenopus. o se sabe que participacion tiene en la escision, pero podrfa requerirse para el apareamiento con Ia secuencia de RNAr y formar una estructura secundaria reconocida por una endonucleasa. Para las modificaciones que se hacen en las bases del RNAr, se requieren dos grupos de RNAsno, cuyos se identifican por secuencias conservadas muy cortas y caracterfsticas comu nes en las estructuras secundarias. El grupo C/D del RNAsno permite afiadir un grupo metilo ala posicion 2' de Ia ribosa. Hay> l 00 grupos 2'-0-metilo en localizaciones conservadas en RNAr de vertebrados. Ese grupo toma su nombre de dos secuencias cortas conservadas llamadas cajas C y D. Cada RNAsno contiene una secuencia cerca de Ia caja D, complementaria de una region del RNAr de ISS o 28S metilada. La perdida de un RNAsno impide Ia metilacion en la region del RNAr de la que es complementario. En la se sugiere que el RNAsno aparea sus bases con el RNAr para crear una region doble que se reconoce como sustrato para la metilacioQ Ia cual ocurre en la region de complementariedad, en una posicion fija a cinco bases de distancia

~;:::::::::;:::==.NIISit-lf\JNN~:;:=:=:::::I

Me RNAr metilado

Un RNAsno aparea sus bases con una region del RNAr que se va a metilar.

0

0

II

II

_,..G,

HN 3 4 5c H

I

II

'"'C 2 1 6CH

0" 'N /

I

Uridina

Sintetasa de seudouridina

_,..G HN 3 2 'J NH I

6

1

'lC't_ 5 7 CH 0 c

I

Seudouridina (1j!)

La uridina se convierte en seudouridina por sustitucion del en lace Nl-azucar con el enlace C5-azucar y rotacion de la base respecto del azucar.

dellado 5' de la caja D. Es posible que cada suceso de metilacion sea especificado por un RNAsno diferente, de los cuales se han caracterizado -40, basta ahora. No se han caracterizado las metilasas, de modo que es posible que el RNAsno mismo provea parte de la actividad de metilasa. Otro grupo de RNAsno participa en Ia sfntesis de la seudouridina. En el RNAr de las levaduras hay 43 moleculas 'Jf y - 100 en el de los vertebrados. La sfntesis de la seudouridina implica Ia reaccion que se muestra en la , en la cual se rompe

26.22 Se requieren RNA pequefios para el procesamiento del RNAr

699

RNA-RNA. Como en las reacciones de escisi6r RNAsn tal vez actua en forma de una ribonucleo:-:teina especifica que contiene proteinas y RNA. E ::.: cuente que el RNA de la particula aparee sus bases: una secuencia corta en el RNA sustrato (aunque 'unico mecanismo de acci6n).

E

.. ANANNA RNAsno 5'

Caja H

ACANNN .. Caja ACA

- " Los RNAsno H/ ACA tienen dos secuencias cortas conservadas y dos estructuras en horquilla, cada una con regiones complementarias del RNAr en el tallo. La seudouridina se forma por conversion de una uridina impar en la region complementaria del RNAr.

el enlace Nl del acido uridilico a la ribosa, la base gira y C5 se re{me con el azucar. La formaci6n de seudouridina en el RNAr necesita al grupo H/ACA de -20 RNAsno, los cuales se nombran por la presencia de un triplete de ACA a tres nucle6tidos de distancia del extrema 3' y una secuencia parcialmente conservada (la caja H) que yace entre dos estructuras de tallo-asa-horquilla. Cada uno de esos RNAsno tiene una secuencia complementaria del RNAr en el tallo de cada horquilla. En la se muestra la estructura que se produciria por apareamiento con el RNAr. En cada region de apareamiento hay dos bases no apareadas, una de cuales es una uridina que se convierte en seudouridina. Los RNAsno HI ACA se vinculan con una protefna nucleolar llamada Garlp necesaria para la formaci6n de la seudouridina, pero se desconoce su funci6n. Las sintetasas de seudouridina conocidas son proteinas que actuan sin un cofactor RNA. No se han identificado las sintetasas que podrian participar en la sintesis de seudouridina mediada por RNAsno. La participaci6n de Rl'l"Asn U7 en la generaci6n del extrema 3' y de RNAsno en el procesamiento y modificaci6n del RNAr es compatible con el punta de vista expresado en el Capitulo 27, RNA catalftico, de que muchos de los sucesos de procesamiento del RNA, si no es que todos, dependen de interacciones 700


Resumen

Por el corte y empalme se eliminan intrones : unen exones en la secuencia madura del RNA. :-: cuando menos cuatro tipos de reacci6n, seg , observa por sus requerimientos in vitro y los _ ductos intermedios que generan. Los sistema. cluyen intrones nucleares eucarioticos, introne;; los grupos I y II e intrones de RNAt. Cada reac : implica un cambia de organizaci6n en una molec individual de RNA y, por tanto, es un suce:so ocurre eo configuracioo cis. El corte y empalme del pre-RNAm sigue preferidas, pero no obligatorias. Solo se requi : secuencias de consenso muy cortas, el resto de: tron parece carecer de importancia. Todos los s.:· de escision 5' son tal vez equivalentes, igual que 3'. Las secueocias necesarias se derivan de Ia r· _GU-AG, que describe los extremos del intron. :::_ intrones de mamifero tambien se requiere el siti . _· ramificaci6n UACUAAC de las levaduras o una -cuencia de consenso menos conservada. La reacc con el sitio de corte y empalme 5' implica Ia fo ..: · cion de uo lazo que une el extrema GU del intn. . traves de uo enlace 5' -2' con la A de la posicion 6 - · el sitio de ramificaci6n. El extrema 3'-0H del c ataca entonces el sitio de corte y empalme 3' _ manera que los exones se ligan y el intron se lil:-::como lazo. Ambas reacciones son transesterificac nes que conservan los enlaces. En varias etapa_ Ia reacci6n se requiere de hidrolisis de ATP, blemente para producir cambios conformacion- _ en el RNA, los componentes proteinicos, o amt La formaci6n de lazos se encarga de Ia selecci6n ... sitio de corte y empalme 3', en tanto que facto: _ protefnicos producen patrones alternos de con e empalme que estimulan el uso de un nuevo si · bloquean el de un sitio predeterminado. El corte y empalme del pre-RNAm implica formaci6n de un empalmosoma, partfcula gran que ensambla secueocias de consenso en una c -formaci6n reactiva. El empalmosoma se forma m·w a menudo por un proceso de definicion de intron el cual implica el reconocimiento del sitio de con empalme 5', el de ramificacion y el de corte y e-palme 3' . Una via alterna implica la definicion - exon, que in cluye el reconocimiento inicial de : sitios 5' de corte y empalme del intr6n sustrato '" -

siguiente intr6n. Su formaci6n pa sa por una serie de etapas, del complejo E (de asignaci6n ), que contiene RNPsn Ul y factores de corte y empalme, a los complejos A y B como componentes adicionales. El em palmosoma contiene las RNPsn Ul, U2, U4/U6 y U5, asf como algunos fact ores de corte y empalme adicionales. Las RNPsn Ul, U2 y U5 contienen cada uno un RNAsn unico y varias protefnas: la RNPsn U4/U6 contiene dos RNAsn y varias pro tefnas, algunas son comunes a todas las partfculas de RNPsn, que reconocen secuencias de consenso . El RNAsn Ul aparea sus bases con el sitio de corte y empalme 5', la RNAsn U2 con la secuencia de ramificaci6n y el RNPsn U5 actua como sitio de corte y empalme 5'. Cuando U4 libera a U6, el RNAsn U6 aparea sus bases con U2, lo cual puede dar Iugar al centro catalftico para el corte y empalme. Un conjunto alternativo de RNPsn proporciona funcio nes analogas para corte y empalme de la subclase de intrones dependien te de Ul2. Las moleculas de RNAsn pueden tener fu n ciones cuasi catalfticas en el corte y empalme, otras de procesamiento. En el nucleolo, do s grupos de RNAsno se encargan del apareamiento con el RNAr en sitios modificados; los RNAsno del grupo C/D indican sitios diana para la metilaci6n y los del grupo ACA idenrifican sitios en que la uridina se convierte en seu douridina. El corte y empalme suelen ser intramoleculares, ero en tripanosomas y n ematodos ocurre en configuraci6n trans (corte y empalme intermoleculares). Este proceso impUca una reacci6n entre un RNA Sl pequefto y el pre-RNAm. El RNA SL simula un RNAsn U 1 y puede combinar la funci6n de propordo nar el ex6n con las funciones de U l. En los gu·anos hay dos tipos de RNA SL, u no se utiliza para corte y empalme del extremo 5' de un RNAm y el tro, para corte y empalme en un sitio interno. Los intrones del grupo II comparten con los in:rones nucleares el uso de un lazo como intermedio, ero pueden realizar la reacci6n como propiedad 3utocatalizada del RNA. Dichos intrones siguen la :egla GT-AG pero forman una estructura secundaria .::aracteristica que mantien e los sitios reactivos de :one y empalme en la aposici6n apropiada. El corte y empalme del RNAt de las levaduras .mplica reacciones de endonucleasa y ligasa separaj as. La endonucleasa recon oce la estructura secunj aria (o terciaria ) de l precurso ry fragmenta ambos -:xtremos del inn·6n; las dos mitades de RNAt libe-adas por perdida de un inn·6n, se pueden ligar en resencia de ATP. La capacidad de terminaci6n de la polimerasa _ de RNA no ha sido caracterizada atm, y los extre;:;-J.OS 3' de sus productos de transcripci6n se gene-

ran por escisi6n . La secuencia AAUAAA localizada de ll a 30 bases en flujo ascendente respecto del sitio de escisi6n proporciona la seftal para la escisi6n y la poliadenilaci6n. Una endonucleasa y la polimerasa poli(A) se vinculan en un complejo con otros factores que confieren especificidad para la seftal AAUAAA. La transcripci6n termina cuando una exonucleasa que se une con el extrema 5' de la cadena de RNA naciente creada por la escisi6n, se empareja con Ia polimerasa de RNA.

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Se requieren RNA pequefios para el procesamiento del RNAr

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Referencias

705

RNA catalitico ESQUEMA DEL CAPITULO Introducci6n Los intrones del grupo I realizan autocorte y empalme por transesterificaci6n • Los unicos factores necesarios para el autocorte y empalme de los intrones del grupo I in vitro son iJn cation mon ovalente, un cation bivalente y un nucleotido de guanina. • El corte y em palme ocurren par dos transesterificaciones, sin necesidad de ingreso de energia. • El extrema 3'-OH del cofactor de guanina ataca al extrema 5' del intr6n en la primera transesterificacion . • El extrema 3'- 0H generado al final del primer ex6n ataca la union entre el intr6n y el segundo ex6n en la segu nda transesterificacion. • El intron es liberado como molecula lineal que se convierte en circular cuando su extrema 3'- OH ataca un enlace en una de las dos posiciones internas. • El enlace interno G414-A16 del intron puede tambien ser atacado par otros nucleotidos en una reaccion de corte y empalme en configuraci6n trans.

BJfJI

requieren de madurasas • Los intrones de autocorte y empalme pueden necesitar actividades de madurasa codificadas en su interior para ayudar al plegamiento en la estructura catalitica activa.

fiE)

~

flJII!J

flJID

UN

706

La edici6n del RNA puede di rigirse por RNA gu\as .. La intensa edici6n de RNA en mitocondrias de tripanoso- se debe a inserciones o deleciones de uridina. • El sustrato de RNA aparea sus bases con un RNA guia e~ ambos lados de la region par editar. • El RNA guia proporciona el molde para la adicion (o, comenos frec uencia, la deleci6n) de uridinas. • La edici6n es catalizada par un complejo de endonuclea ~~ actividad de transferasa de uridilo terminal y ligasa de 1\J . El corte y empalme de prote\nas son

autocatal1ticos • Una inteina tiene La capacidad de catalizar su propia eli minaci6n de una proteina, de manera que las exteina: :.. los flancos se conecten. • Corte y empalme de las proteinas se catalizan par la inte-• Casi todas las inteinas tienen dos actividades independientes, corte y empalme de proteinas y una endonucleasa que vuelve a casa.

Los intrones del grupo II pueden codificar prote\nas multifuncionales • Los intrones del grupo II pueden ser sujetos de autocorte y empalme in vitro, pero suelen ser auxiliados par actividades proteinicas codificadas en el intro n.

La edici6n de RNA ocurre en bases individuales • Los receptores de apolipoproteina B y glutamato present'· desaminaciones especificas de sitio catalizadas par desaminasas de citidina y adenosina, que cam bian la secuencia de codificaci6n.

Algunos intrones del grupo I codifican endonucleasas que fomentan la movilidad • Los intrones moviles pueden insertarse en nuevas sitios. • Los intrones m6viles del grupo I codifica n una endonucleasa que produce rotura de la doble cadena en un sitio diana. • El intr6n se transpone al sitio de la rotura de la doble cadena par un mecanismo de replicaci6n mediado par DNA.

Los virioides tienen actividad catal\tica • Virioides y virusoides forman una estructura en cabeza a;. martillo con actividad de autoescisi6n. • Se puede n generar estructuras simi lares para el apareamiento de una cadena de sustrato fragmentada pC' una cadena de enzimas. • Cuando una cadena enzimatica se introduce en una celu_; puede aparearse con una cadena sustrato dia na, que despues es escindida.

Las ribozimas tienen varias actividades catal\ticas • Cambiando el sitio de union del sustrato de un intr6n del grupo I es posible introduci r secuencias alternas que interactuan con la G re<;~ctiva. • Las reacciones siguen la cinetica enzimatica usual de baja velocidad catalitica. • Las reacciones que utilizan enlaces z· - OH podrian haber sido la base de la evoluci6n de las activida des cataliticas originates del RNA.

La actividad catal1tica de la ribonucleasa P se debe al RNA • La ribonucleasa Pes una ri bonucleoproteina en la cual eRNA tiene actividad catalitica.

Los intrones del grupo I forman una estructura secundari a caracteristica • Los intrones del grupo I forman una estructura secundaria con nueve regiones dobles. • Las porciones medulares de las regiones P3, P4, P6 y P7 tienen actividad catalitica. • Las regiones P4 y P7 se forman par apareamiento entre secuencias de consenso conservadas. • Una secuencia adyacente a P7 aparea sus bases con la secuencia que contiene la G reactiva.

• Un solo marco de codificaci6n especifica a una proteina con actividad de transcri ptasa inversa y madurasa, un segmento de union de DNA y una endonucleasa de DNA. • La transcriptasa inversa genera una copia de DNA a partir de la secuencia del RNA, que se transpone par un mecanismo similar al del retropos6n. • La endon ucleasa escinde el DNA diana para permitir la inse rcion del transposon en un nuevo sitio. Algunos intrones de autocorte y empalme

flJD)

Resumen

Introducci6n :..a idea de que solo las protefnas tienen actividad -:nzimatica estaba profundamente arraigada en Ia ~ :oqufmica (incluso los devotos de Ia funcion pro~dn ica llegaron a pensar que jSOio elias tenfan Ia ersatilidad para constituir el material genetico!) . ·_·na de las razones de la identificaci6n de enzimas protefnas proviene del punta de vista de que solo c:.s protefnas con sus variadas estructuras tridimen: nales y grupos laterales tienen Ia flexibilidad para ::-ear los sitios activos que catalizan las reacciones : :oqufmicas. Sin embargo, Ia caracterizacion de sis _-:mas implicados en el procesamiento del RNA ha ostrado que ese punta de vista es una simplifica-'n exagerada. Hoy se sabe que el RNA tiene varios tipos de :-:acciones catalfticas. El termino ribozima es ya _:- usa general para describir un RNA con actividad :.'3talftica y es posible caracterizar Ia actividad en~atica en Ia misma forma que una enzima mas : nvencional. Algunas de las actividades catalfticas ~e l RNA se dirigen contra sustratos separados, en - to que otras son intramoleculares (lo cuallimita ...:. accion catalftica a un solo ciclo). Los intrones del grupo I y del IT pose en la ca. acidad de segmentarse a sf mismos fuera del pre- )TAm que los contiene. La intervenci6n de los in.: ones del grupo I ha permitido generar moleculas :.e RNA con otras actividades catalfticas relaciona..:.-as con la original. La enzima ribonucleasa Pes una ribonucleopro:dna que contiene una sola molecula de RNA unida .: una protefna. El RNA posee la capacidad de ca.alizar Ia escisi6n en un sustrato RNAt, en tanto el : mponente protefnico tal vez participe de manera ::1directa para mantener Ia estructura del RNA ca:..alftico. El tema comun de esas reacciones es que, in :·rro, el RNA puede presentar una reacci6n intra~10l ecular o intermolecular que implica escisi6n o .:nion de enlaces fosfodiester. Aunque la especifici.:ad de la reacci6n y la actividad catalftica basica son roporcionadas par el RNA, las protefnas relaciona :Jas con este pueden ser necesarias para Ia reaccion -:ficaz in vivo . El corte y empalme del R1\l'A no constituyen el _oico media por el que pueden introducirse cam-ios en su contenido informacional; en el proceso de edici6n del RNA se introducen cambios en bases .:J.dividuales o se agregan bases en posiciones espei ficas de un RNAm; dicha inserci6n de bases (muy = menudo moleculas de uridina) ocurre en varios jenes de las mitocondrias de ciertas eucariotas in:eriores; a semejanza del corte y empalme, implica

la rotura y reunion de enlaces entre nucle6tidos, pero tambien requiere de un molde para codificar la informacion de Ia nueva secuencia.

Los intrones del grupo I realizan autocorte y empalme por transesterificaci6n -

Conceptos principales • Los unicos factores necesarios para el autocorte y empalme de los intrones del grupo I in vitro son un cation monovalente, un cation bivalente y un nucleotido de guanina. • El corte y empalme ocurren por dos transesterificaciones, sin necesidad de ingreso de energ\a. • El extrema 3'-0H del cofactor de guanina ataca al extrema 5' del intron en la primera transesterificacion. • El extrema 3' -O H generado al fina l del primer ex on ataca la union entre el intr6n y el segundo ex6n en La segunda transesterificaci6n. • El intr6n es liberado como molecula lineal que se convierte en ci rcular cuando su extrema 3'- OH ataca un enlace en una de las dos posiciones internas . • El enlace interno G414-A16 del intr6n puede tam bien ser atacado por otros nucle6tidos en una reacci6n de corte y empalme en configuracion trans.

Los intrones del grupo I se encuentran en diversas localizaciones, ademas de presentarse en genes que codifican el RNAr en los nucleos de los eucariotas inferiores Tetrahymena thermophila (un ciliado) y Physarum polycephalum (un moho de lama). Son comunes en los genes de mitocondrias mic6ticas, estan presentes en tres genes del fago T4 y tam bien se encuentran en bacterias. Los intrones del grupo I tienen una capacidad intrfnseca de autocorte y empalme (propiedad que tambien poseen los intrones del grupo II analizados en Ia seccion 26.11 , Los intrones del grupo II presentan autocorte y empalme a naves de la formacion de lazos) . El autocorte y empalme como propiedad de los productos de transcripcion de los genes de RNAr se descubri6 en T. thermophila . Los genes de los dos principales RNAr siguen Ia organizaci6n usual, en Ia cual ambos se expresan como parte de una unidad de transcripcion comun. El producto es un RNA precursor 35S con la secuencia del RNAr pequefio en la parte 5' y Ia del mas grande (26S) hacia el extrema 3'. En algunas cepas de T. thermophila Ia secuencia que codifica el RNAr de 26S se interrumpe par un intr6n corto unico. Cuando el RNA precursor de 35S se incuba in vitro, el corte y empalme ocurre

27 .2 Los intrones del grupo I realiza n auto corte y empa lme por transesterificaci6n

707

Transcripci6n

Corte y

empalme

l

Electroforesis en gel RNA

de 358

!

=-=-== ==== +===Formaci6n de un ciclo lntr6n circular - lntr6n lineal - -

En el genera Tetrahymena, el corte y empalme del precursor del RNAr de 355 puede seguirse por electroforesis en gel. La eliminaci6n del intr6n se revela por la aparici6n de una banda pequeiia de movimiento rapido, y al tornarse circular, se desplaza mas lentamente en la electroforesis, como se observa por una banda mas alta.

como reacci6n aut6noma. El intr6n es escindido del precursor y se acumula como fragmento lineal de 400 bases, que posteriormente se convierte en un RNA circular. En Ia se resumen esos sucesos.

La reaccion requiere solo de un cation monovalente, un cation bivalente y un cofactor nucleotidico de guanina. Nose puede sustituir ninguna base con G, pero noes necesario un trifosfato, pueden utilizarse todos, GTP, GDP, GMP y la guanosina misma, de manera que no hay un requerimiento neto de energia. El nucle6tido de guanina debe tener un grupo 3'-0H. La trayectoria del nucle6tido de guanina Puede seguirse con una marca radioactiva. La radioactividad empieza por penetrar el fragmento lineal escindido del intr6n y la mol<~cula de G se conecta con el extrema 5' del intr6n por un enlace fosfodiester normal. En la se muestra que ocurren tres reacciones de transfe rencia. En Ia primera, el nucleotido de guanina se comporta como cofactor que proporciona el grupo libre 3' -OH, que ataca el extrema 5' del intron. Esta reaccion crea el enlace G-intron y genera un grupo 3'-0H en el extrema del exon. La segunda transferencia implica una reaccion quimica similar, don de ese 3' -OH ataca despues al segundo ex6n. Los dos productos de transferenda se conectan, no se han observado exones libres, de manera que su union puede ocurrir como parte de Ia misma reaccion que Iibera el intron. El 708

CAPITULO 27 RNA catal\tico

intron se Iibera como molecu la lineal, pero er. tercera reaccion de transferencia se convierte _~ circular. Cada etapa de la reaccion de autocorte y em_' ; me ocurre por una transesterificaci6n, en Ia cual _ ester fosfato se convierte directamente en otro. ~ .. hidr6lisis intermedia. Los enlaces se intercamb:.::. · d e manera directa y se conserva la energia, o ~ que la reaccion no requiere de entrada de ene:c ni hidrolisis de ATP o GTP. Si ninguna de las rei:~ ciones consecutivas d e transesterificacion imp:. un cambia neto de energia, .:,por que la reacc · de corte y empalme avanza basta terminarse ~- se equilibra entre el producto con corte y empa::::. y el precursor, que no ha sufrido esos cambios? :.... concentracion de GTP es alta en relacion con la . RNA y, por tanto, hace avanzar Ia reaccion; un ca::bio en Ia estructura secundaria del RNA impi dl" reaccion inversa. El sistema in vitro no incluye proteinas, de n L

ra que Ia capacidad de corte y empalme es intrinseca RNA. Este ultimo forma una estructura secund a::-~

terciaria especffica en Ia cuallos grupos imp on- te se yuxtaponen, de manera que el nucleotide- : guanina puede unirse en el sitio especifico y a pues ocurren las reacciones de rotura de enlac:: reunion que se muestran en Ia Figura 27.2. A:...· que es una propiedad del RNA mismo, Ia reac c~ es asistida in vivo por protefnas, que estabiliza:-: estructura del RNA. La capacidad de participar en esas reacci ~ = de transferencia reside en Ia secuencia del in tr _que sigue siendo reactivo despues de ser escinG.: _ como molecula lineal. En Ia se resu n:: sus actividades. El intron puede hacerse circular cuando Ia ( terminal ataca alguna de las dos posiciones cerca;- al extrema 5'; el enlace interno se rompe y em ces el nuevo extrema 5' se transfiere al extr 3'-0H del intron. La formaci6n primaria de un c~ suele involucrar una reacci6n entre la G414 termi.< : y la A 16 , que es la reacci6n mas frecuente (apa . e-. como tercera transferencia en la Figura 27.2) . C menos frecuencia, Ia G4 14 reacciona con U 20 ; cc. · reaccion genera un intr6n circular y un fragm =lineal que representa a Ia region 5' original (d e . · bases de longitud para atacar A 16 y de 19 para ate.:U20}. El fragmento 5' liberado contiene el nucle6· ~ original de guanina agregado. Cualquiera de los ciclos puede regenerar ~ molecula lineal in vitro mediante hidrolisis espc.::: fica del enlace (G 414 -A 16 o G4 14 -U 20 } que lo he ._ cerrado, fen6meno que se conoce como formac in versa de un ciclo . La molecula lineal generada ~ reversion de Ia formaci6n primaria de un ciclo en A··

- -miene activa y puede dar Iugar a una formaci on : .:undaria de ciclo por ataque de U20 . El producto final de las reacciones espontaneas -reriores a liberaci6n del intron es el RNA L-19, - lecula lineal generada por reversion de la forma - ular mas corta. Dicha molecula tiene una activi'd enzimatica que le permite catalizar Ia extension -: ribonucleotidos cortos (nose muestran en la fi- ·ra, pero vease Ia Fig. 27.8). La reactividad del intr6n liberado va mas alia :: revertir Ia reacci6n de formaci6n de un ciclo; la · .:iici6n del oligonucle6tido UUU reabre el ciclo priario por reacci6n con el enlace G414-A 16 . El UUU ~ e simula el extrema 3' del 15-mer liberado por .: formaci6n primaria de un ciclo) se convierte en . extrema 5' de la molecula lineal formada. Esta es ..:la reaccion intermolecular y, por tanto, demues"::" 3 Ia capacidad de conectar dos moleculas de RNA ...Jerentes. Esta serie de reacciones muestra vfvidamente ·e Ia actividad autocatalftica refleja la capacidad =-:>neralizada de la molecula de RNA de for mar un _;:ntro activo que pueda unirse a cofactores de gua- - a, reconocer oligonucleotidos y conjuntar grupos ·::activos en una conformacion que perrnita romper _ volver a un.ir los enlaces. Otros intrones del grupo I -_ han sido investigados con tanto detalle como el del ;enero Tetrahymena, pero en generaL sus propiedades n sirnilares. La reacci6n de autocorte y empalme constitu~ una propiedad intrfnseca del RNA in vitro, pero _~asta que punto participan las protefnas in vivo? _ s sistemas mitocondriales proporcionan ciertos dicios de Ia participaci6n de las protefnas, en los .-uales, el corte y empalme de los intrones del grupo I _·:-quieren de los productos que actuan en configu·acion trans de otros genes. El gen mutado cytlB de ·eurospora crasa constituye un ejemplo notable de .:efectos en el corte y empalme de varios intrones ::1itocondriales del grupo I. jEl producto de ese gen arece ser Ia sintetasa de tirosil-RNAt mitocondrial!, cual se explica por el hecho de que el intron puee adoptar una estructura terciaria similar a Ia del ..NAt estabilizada por la sintetasa y que fomenta la ~eacci6n catalitica. Esta relaci6n entre la sintetasa y el corte y em:)alme es compatible con la idea de que este ultimo se rigin6 como una reacdon mediada por RNA, poste:iormente auxiliada por proteinas de union de RNA _ue originalmente tenfan otras funciones. La capacii ad de autocorte y empalme in vitro puede ser la inte~acci6n bioqufrnica basica. La estructura del RNA crea -"[ sitio activo, pero solo puede funcionar eficazmente :nvivo cuando lo asiste un complejo proteinico.

Primera transferencia El extremo 3' -0H de G ataca a\ 5' del intr6n 5'

-P === Ex;:6:;:n:::;:B~ 3,

5'

3'

pG-OH

y

pNpNpNpNpNpNpXpXpXpXpXpX

pNpNpNpNpNpN-OH + I

pGpXpXpXpXpXpX

= = =·<:;H

+

Segunda transferencia El extremo 3'-0H del ex6n A ataca a\ 5' del B

:'

·.........· ~

I

-P

+

.

G-P

- OH

~ G-P

_; -OH

+

Tercera transferencia El extremo 3'-0H del intr6n ataca el enlace a 15 bases del extremo 5'

0

El autocorte y empalme se debe a reacciones de transesterificaci6n en las cuales hay un intercambio directo de enlaces. Los en la ces generados en cada etapa se indican mediante recuadros sombreados.

1111

Los i ntrones del grupo I forman una estructura secundaria caracter1stica

Conceptos pri nci pales • Los intrones del grupo I forman una estructura secundaria con nueve regiones dobles . • Las porciones medulares de las regiones P3, P4, P6 y P7 tienen actividad catal\tica. • Las regiones P4 y P7 se forman por apareamiento entre secuencias de consenso conservadas. • Una secuencia adyacente a P7 aparea sus bases con la secuencia que contiene la G reactiva.

Todos los intrones del grupo I pueden organizarse en una estructura secundaria caracterfstica de nueve helices (Pl-P9). En Ia se muestra un modelo de Ia estructura secundaria del intr6n del genero Tetrahymena. Dos de las regiones de bases apareadas se generan por apareamiento entre los elementos de secuencias conservados que son comunes a los intrones del grupo I. La P4 se estructura

27. 3 Los intrones del grupo I forman una estructura secundaria caracteristica

709

5'G. UUUpA 16 CCUpU 20 UG

/

t

p Ex6n 1 rG-OH 5' CUCUCU Primera 5' UGCGGG 3' 3' GGGAGG transferencia 3' ACGCCC 5' IGS 0

Formaci6n de un ciclo

P6 Ex6n 1 Ex6n 2 PS

s Inversion de Ia formaci6n de un ciclo

Prcductos del cambio a estructura lineal RNA L-15

414

GOH

"'IIII::""""_,~

5' UAGUC 3' 3' AUCAG 5'

R

Se forma 2 bp en el extremo 3' del intr6n

Los intrones del grupo I tienen una estructu; :cundaria comun formada por nueve regiones de pares de :: :.=.. Las secuencias de las regiones P4 y P7 se conservan, de - ~ _ que identifican a cada uno de los elementos de secuencic: : R y S. Entre el extrema del ex6n izquierdo y la IGS del i n:-: se crea P1 por apareamiento; la region intermedia entre ~ pg se aparea con el extrema 3' del intr6n.

RNA L-19

Reacci6n en configuraci6n trans G

414

16

pA CCUpU

20

UUUpA 16CCUpU 20 UG

UG

..... uuu

El intr6n escindido puede formar c1rculos mediante uno de los dos sitios internos para la reacci6n con el extrema 5' y reabrirlos por reacci6n con agua u oligonucle6tidos.

a partir de las secuencias P y Q, y la P7, de R y S. La secuencia de otras regiones de bases apareadas varia en funcion de los intrones individuales. El analisis de mutaciones identifica un "nucleo" de intron que contiene P3, P4, P6 y P7 que constituye Ia region mfnima susceptible de llevar a cabo una reaccion catalftica. La longitud de los intrones del grupo I varia ampliamente, de modo que las secuencias de consenso se localizan a distancia considerable respecto de las uniones de corte y empalme reales. Algunas de las reacciones de apareamiento serelacionan directamente con el cambia de las uniones de corte y empalme a una conformacion que sopone Ia reaccion enzimarica. La Pl incluye el extrema 3' del exon izquierdo. La secuencia del intron que se aparea con el exon se denomina IGS, o secuencia gufa interna (nombre que refl.eja el hecho de que originalmente se pensaba que la region 3' inmediata 710

CAPITULO 27 RNA catal1tico

ala secuencia IGS, mostrada en la figura, se ap a.~ ~ _ bacon la union de corte y empalme 3', uniend o ' los dos enlaces. La interaccion es posible, per('parece indispensable). Una secuencia muy cona ocasiones de apenas dos bases, entre P7 y P9, api.:': sus bases con la secuencia inmediatamente ante:.a Ia G reactiva (posicion 414 en el genera Tetr ;_ mena) del extrema 3' del intron. Las propiedades de las mutaciones que aa - ~ en configuracion cis y que impiden el corte y eiL::me de intrones del grupo I, destacan la impona.:::. del apareamiento de las bases para crear Ia est:tura central necesaria del RNA . Dichas mutaci :.han sido aisladas en los intrones mitocondria:-: traves de mutantes que no pueden eliminar t c tron in vivo, y se han aislado para el intron de: ~ nero Tetrahymena par transferencia de Ia rea c -de corte y empalme a un ambiente bacterian estructura que se muestra en Ia 7.5 per::· seguir la reacci6n de corte y empalme en E. C('._-: .:_ intr6n de autocorte y empalme se localiza en u-= tio que interrumpe el ctecimo codon de Ia secue-:. de codificaci6n de Ia galactosidasa ~, de modo : Ia proteina puede ser traducida con exito a par.:.; un RNA solo despues de eliminado el intron. La sfntesis de Ia galactosidasa ~ en este : :~ rna indica que el corte y empalme puede dar ~~ : condiciones bastante distantes de las prevalecie:- en el genera Tetrahymena o incluso in vitro, re

El RNA catalitico tiene un sitio de uni6n de guanosina y uno de uni6n de sustrato

Sitio de union de guanosina

JTranscripci6n

5'

cucucu

UUUACCU

Sitio de uni6n de GGGAGG sustrato

I u2o

lncluye A16 y

JCorte y empalme

t

Traducci6n

Galactosidasa Pacas azules generadas por tinci6n de galactosidasa ~

La primera transferencia de G-OH ocupa el sitio de union de G; el exon 5' ocupa el sitio de union de sustrato

- - =3'

~414

~

J

G-OH

0 :>0 0 ;:>

3'

~414

5'

() 0

cucuc?.

GGGAGG

5'

0

R La colocaci6n del intr6n de Tetrahymena en la o: tJencia de la galactosidasa ~ da lugar a un analisis para - 3Utocorte y empalme en la Escherichia coli. La sintesis de :: ..;ctosidasa ~ se analiza por la adici6n de un compuesto que = :orna azul por acci6n de la enzima. La secuencia es llevada :.abo por un bacteri6fago, de manera que las placas azules -.e contienen bacterias infectadas) indican que el corte y - Jalme fue exitoso.

La segunda transferencia de G414 ocurre en el sitio de union de G; el exon 5' esta en el sitio de union del sustrato

5'

S'

G

CUCUCU G.

G

GGGAGG

GGGAGG

+

' o que podria interpretarse en el sentido de que : autocorte y empalme puede ocurrir. en la celula ~ teriana. Otra posibilidad es que haya proteinas .:cterianas que ayuden a la reacci6n. Aplicando este analisis se pueden producir mu.: ·iones en el intr6n para ver si impiden la reacci6n. _.Js mutaciones de las secuencias de consenso del .::-upo I que alteran el apareamiento de sus bases deenen el corte y empalme, pero pueden revertirse .ediante cam bios compensatorios que restablezcan _ ho apareamiento. Las mutaciones de las se61encias de consenso rrespondientes en los intrones mitocondriales del __ po I producen efectos similares. La mutaci6n de _na secuencia de consenso puede ser revertida por ~ de una secuencia de consenso complementaria _ modo de restablecer el apareamiento; por ejem:o, las mutaciones de Ia secuencia de consenso R . · eden compensarse mediante mutaciones de la .cuencia de consenso S. Juntos, esos resultados sugieren que la reacci6n .:e corte y empalme del grupo I depende de Ia for::Iaci6n de una estructura secundaria entre pares _ secuencias de consenso en el intr6n . El princi·io establecido en esta obra es que las funciones de .1s secuencias distantes del sitio del corte y empalme son :ccesarias para formar el sitio activo que hace posible el ·.ttocorte y empalme.

cucucu -===3'

5'

La tercera transferencia de G414 ocurre en el sitio de union de G; el extrema 5' del intron esta en el sitio de union del sustrato

G~ G

UUUACCU

GGGAGG

G GGGAGG

G

UUUACCU

La escision del intron del grupo I del RNAr del genera Tetrahymena ocurre por reacciones sucesivas entre los ocupantes del sitio de union de guanosina y el de union de sustrato. El exon izquierdo es rosado, y el derecho, purpura.

Ill

Las ribozimas tienen varias actividades cata l1ticas

Conceptos principales • Cambiando el sitio de union del sustrato de un intron del grupo I es posible introducir secuencias alternas que interactuan con la G reactiva. • Las reacciones siguen la cinetica enzimatica usual de baja velocidad catalltica. • Las reacciones que utilizan enlaces 2' -OH podrian haber sido la base de la evolucion de las actividades catallticas origi nales del RNA.

27.4 Las ribozimas tienen varias actividades catallticas

711

. .. os encontrados antes de Ia uni6n del sustrato

......... IGS

3' G-OH

5' RCCCCC-OH 3' <;3GGAGG= 5

C5 se aparea c<: el sitio IGS cercc. del extrema 5' C'= RNA

3' G-OH

l

os encontrados despues de Ia uni6n del sustrato

5' rpCCCC9-0H 3' GGGAGG= 5

t

3' G

6-oH GGGAGG-

5'

3' G tC-OH

, La posicion de la IGS de la estructura terciaria cambia cuando se fo rma Pl por la union del sustrato.

5' RCCCCC-OH 3' GGGAGG= 5'

La actividad catalitica de los intrones del grupo I fue descubierta por su capacidad de autocorte y empalme, p ero estos pueden presentar otras reacciones catalfticas in vitro; todas estas reacciones se basan en transesterificaciones y se analizan de acuerdo con su relacion con la reaccion de corte y empalme en sf. La actividad catalitica de un intron del grupo I es conferida por su capacidad de generar una estructura secundaria y una terciaria en particular, las cuales dan lugar a sitios activos equivalentes a los sitios activos de una enzima convencional (proteinacea) . En la se ilustra la reaccion de corte y empalme de conformidad con dichos sitios (es la misma serie de reacciones mostrada antes, en la Fig. 27.2). El sitio de union del sustrato se forma a partir de la helice Pl, en la cual, el extremo 3' del primer intron aparea sus bases con la IGS en una reaccion intermolecular. Las secuencias de P7 forman un sitio de enlace de guanosina que podrfa ser ocupado por un nucleotido de guanosina libre o por la molecula de G en la posicion 414. En la primera reacci6n de transferencia es utilizado por el nucleotido de guanosina libre, pero posteriormente lo ocupa G414 • Mediante la segunda transferencia se liberan los exones unidos, en tanto que la tercera crea el intron circular. La union con el sustrato implica un cambio de conformacion; antes, el extremo 5' de IGS esta cerca de P2 y P8, y despues, cuando se forma la helice P l , se acerca a bases conservadas que yacen 712

CAPITULO 27 RNA cataliti co

G-OH ataca el enlace C

Transferencia de C a 3'-G; liberac·:de C4

Se une otro C5; IE. reacci6n de transferencia se invierte

HO-CCCC_.; C,.: C,s p =~

t

3'G-OH

: •••••• GGGAGG=

Se Iibera C6 con generaci6n de RNA L-19 5'

Gl El RNA lineal L-19 puede unirse a C en el s':-: union de sustrato; el extrema G-OH 3' reactivo esta loca:.:::. en el sitio de uni on G y cataliza reacciones de tran sfe renc'~ convierten dos oligon ucleoti des ( 5 en un C4 y un ( 6 •

entre P4 y P5, reaccion representada en la • . por os que se detectan en la estruc: secundaria. En la estructura terciaria, los dos • ~ con tactados alternativamente por Pl tienen j entre sf, lo cual implica un movimiento susta::..:_ en !a posicion de Pl. El RNA L-19 se genera por la apertura de. _ tron circular (mostrado en la ultima etapa cit reestructuraciones intramoleculares incluidas .:Fig. 27.3) ; aun conserva capacidades enzim.i· _ que simulan las implicadas en la reacci6n or( de corte y empalme. La funcion de la ribozima -: de ser analizada en cuanto a su capacidad de u con una secuencia intramolecular complemer:· ' de IGS en el sitio de union de sustrato, en taL: enlaza con el G4 14 terminal o un nucleotido G · en el sitio de union de G. En la se ilustra el m ecanism el cual el oligonucleotido C5 se extiende haste. ·

Endorribonucleasa especffica de secuencia Sustrato

3'

Enzima

.. ··..

RNA de 24 Virusoide de 19 bases bases lntr6n L-19 CCC CCC RNA de ribonucleasa P pre-RNA! pre-RNA! Ribonucleasa P completa

G-OH

5'=cu!u-

3'

...,. 5'=CUCU-OH

GGGAGG5'

+

5'G = 3' Ligasa de RNA

3'

...

Gp

5'=="=Y-OH

xxxxxx

..... 5'

'~~===::!Y

5'=Y --=3' + G

KM (mM)

Recambio (/minuto)

0.0006

0.5

0.04 0.00003 0.00003

1.7 0.4 29

Ribonucleasa T1

GpA

0.05

5 700

Galactosidasa ~

lactosa

4.0

12 500

1 Las reacciones catalizadas por RNA tienen las mismas caracter\sticas que las catalizadas por prote\nas, aunque su velocidad es menor. La K 1~ senala la concentracion de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad maxima, que es una medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato. El numero de recambio aporta la cifra de molecu las de sustrato transfo rmadas por un solo sitio catal\tico en la unidad de tiempo.

Fosfatasa

.

G-OH

l:

5' UCUp 3' GGGAGG 5'

..... 5' UCU-OH 3'

GURA 7 Las reacciones catal\ticas de la ribozima impli:::=1 transesterificaciones entre un grupo del sitio de union del . • strata y otro del sitio de union de G. ~ ar

una cadena C6 a! adosarse a! sitio de union del strato, en tanto G414 ocupa el sitio de union de G. ~ r reacciones de transesterificacion, se transfieren _"C de C5 a Ia G 3' terminal, y despues, de regre- a una nueva molecula de C5 . Las reacciones de - ansferencia adicionales llevan a la acumulacion _f' oligonucleotidos de citosina mas prolongados, ·::accion que constituye una catalisis reaL pues el ~ \fA L-19 se mantiene sin cambios y esta disponible ·'ilra catalizar a varios sitios. La ribozima se compor~ como transferasa de nucleotidos. En Ia .L 7 se definen otras reacciones -::-tzimaticas. La ribozima puede comportarse como :_ dorribonucleasa especifica de secuencia aprove. ando la capacidad de IGS para unir secuencias - mplementarias. En este ejemplo une un sustrato :·.;terno que contiene Ia secuencia CUCU y no Ia ::cuencia analoga contenida generalmente en el . :tremo del exon izquierdo. En el sitio de union G :..Jy un nucleotido que contiene guanina y que ata, a Ia secuencia CUCU precisamente de la misma rma que el exon suele ser atacado en Ia primera ·=accion de transferencia, de modo que escinde Ia =cuencia diana en una molecula 5', y que simu-'- el exon izquierdo, y una molecula 3' que porta

una G terminal. La especificidad de Ia ribozima puede modificarse por mutacion del elemento IGS, de manera que reconozca secuencias complementarias de la nueva secuencia de la region IGS. La modificacion de IGS puede usarse para cambiar Ia especificidad del sitio de union de sustrato y permitir que otras dianas de RNA ingresen, de modo de generar una actividad de ligasa. Un RNA que termina en un 3'-0H se une a! sitio sustrato y otro, terminado en Ia molecula 5'-G, se acopla a! sitio de union G. Un ataque por el hidroxilo en el enlace fosfato conecta las dos moleculas de RNA con perdida de una molecula de G. La reaccion de fosfatasa no tiene relacion directa con las reacciones de transferencia de corte y empalme. Una secuencia oligonucleotfdica complementaria de IGS, terminada en un 3' fosfato, puede ser atacada por G4 14, que se adjudica el fosfato; a continuaci6n se Iibera un oligonucle6tido con un extrema 3'-0H. El fosfato puede entonces trans ferirse a un oligonucle6tido que termina en 3'-0H (revirtiendo eficazmente Ia reaccion) o, de hecho, a agua (con liberacion de fosfato inorganico y conclusion de una reaccion autentica de fosfatasa). Las reacciones catalizadas por el RNA pueden ser descritas en la misma forma que las reacciones enzimaticas usuales segun la cinetica de MichaelisMenten. En la 1 se analizan las reacciones catalizadas por el RNA. Los valores de KM para dichas reacciones son bajos, de modo que implican que el RNA se una con su sustrato con alta especificidad. El numero de recambio es bajo, lo cual refleja baja velocidad catalitica. De hecho, las moleculas de RNA se comportan en la misma forma general definida para las enzimas, aunque son relativamente 2 7. ~ Las ribozimas tienen varias actividades cata l\ticas

713

0

2 O -o-t~~O-~H OH OH

OH NH 2

La union de glucosamina 6 fosfato provoca el autocorte y empalme del RNA

fl A G ft.

C

A A C A GCGG GC

p

Au AU

G C C G U G A G U ~

u

II

;

gG

lf3

2; G

Region ~ C G medular de A U A ~ Ia ribozima G C

uA

~-..----.-.......-

uu

AU AU

c"'G""'CC_c& GACGAGI

Codon de inicio ... N85 . . . AUG .... 3'

GC GC CG

UA AGCA

G

El rojo indica las bases en que Ia mutaci6n disminuye Ia actividad

u

C

u

G A UGcAG

En la region 5' no traducida del RNAm hay una ribozima que codifica la enzima productora de la glucosamina-6-fosfato. Cuando Glc-6-P se une a la ribozima, escinde el extrema 5' del RNAm, lo desactiva, e impide que siga produciendo la enzima.

lentas respecto de los catalizadores proteinicos (en los cuales las cifras de recambio normales van de 10 3 a 10 6 ) . Con el descubrimiento de que las ribozimas pueden ser reguladas por ligandos, se ha logrado ampliar de manera importante sus actividades (vease Ia seccion 13.7, Las moleculas de RNA pequefias pueden regular la traduccion). En la se resume la regulaci6n de un ribointerruptor. El metabolito pequefio G l cN6P se une a una ribozima y la activa para escindir el RNA en una reaccion intramolecular con el fin de regular Ia produccion de G l cN6P; la ribozima se localiza en la region 5' no traducida del RNAm, que codifica la en zima involucrada en la producci6n de G lcN6P, y la escisi6n impide la traducci6n. LComo proporciona el RNA un centro catalftico? Esta capacidad parece razonable si se piensa en un centro activo en cuya superficie se eA.'POne una serie de grupos a ctivos en una relaci6n fija. En una protefna, los grupos activos son proporcionados por las cadenas laterales de los aminoacidos, notablemente variadas, que incluyen grupos ionicos positivos y negativos, asf como hidr6fobos. En un RNA las moleculas disponibles estan mas restringidas, constituidas sobre todo por los grupos expuestos de las bases nitrogenadas. La conformaci6n secundaria/terciaria de la molecula, que pro714

APiruLO 2

RNA catalitico

porciona una superficie de grupos activos ca .:. de mantener un ambiente en el que se romper_ = laces que se forman en otra molecula, da lu_gar " conservaci6n de regiones cortas en una estruc especffica. Parece inevitable que la interacci6n e -:el RNA catalftico y el sustrato de RNA dependa ~ del apareamiento de bases para crear el ambieLos cationes divalentes (por lo general Mg 2 +). importantes en la estructura, y sue len estar pre~ : tes en el sitio activo, donde coordinan las posid c . de los diversos grupos; participan de manera di:-:-_ en la actividad endonucleolitica de la ribozima.:; virusoides (vease se cci6n 27 .9, Los virioides tie:a ctividad catalftica ). Las implicaciones evolutivas de esos descL~ mientos son intrigantes. La capacidad de frag ..: -'" taci6n del aparato genetico, en el cual hay Rl\.~_ todos los componentes, pe ro las protefnas re~ reacciones catalfticas, siempre ha sido un enig-Parece p oco probable que los primerisimos siste:de replicaci6n tuvieran tanto acidos nucleicos c proteinas. Supongase, entonces, qu e los primeros sist :contenian s6lo un acido nucleico con replica;:: propia y actividades cataliticas primitivas, ju_ mente las necesarias para formar y romper e ,o.fosfodiester. Si se supone que !a pa rticipaci6n de enlaces 2'-0H en las reacciones de escisi6n actu:...

roviene de esas actividades catalfticas primitivas, : podrfa argumentar que el acido nucleico original :-ra RNA, porque el DNA carece del grupo 2 '-0H :-. por tanto, no podrfa dar Iugar a tales reaccio-"es. Las protefnas podrfan haberse agregado por _ capacidad para estabilizar la estructura del RNA. _a mayor versatilidad de las protefnas, que pudo ..aberles permitido presentar reacdones catalfticas, : ndujo en un momenta dado al complejo aparato j e la expresion genica moderna.

Sitio diana

.

•••..•........•...•

RNA

La endonucleasa

Algunos intrones del grupo I codifican endonucleasas que fomentan la movilidad

~

El intr6n se replica y despues se inserta

Ccnceptos principales • Los intrones m6viles pueden insertarse en nuevas sitios. • Los intrones m6viles del grupo I codifican una endonucleasa que produce rotura de la doble cadena en un sitio diana. • El intr6n se transpone al sitio de la rotura de la doble cadena por un mecanisme de replicaci6n mediado por DNA.

:iertos intrones de los grupos I y II contienen mars de lectura abiertos que se traducen en protefnas. _a expresion de las protefnas permite al intron ser ·i6vil (ya sea en su forma original de DNA o como : pia DNA del RNA), e insertarse en un nuevo sitio ~enomico. Los intrones de los grupos I y II estan : my dispersos, se encuentran tanto en procariotas : moen eucariotas. Los del grupo I migran por me:anismos mediados par DNA, en tanto que los del ~ upo II hacen lo propio por mecanismos mectiados _or el RNA. La movilidad del intron fue detectada por pri::lera vez por cruces, en los cuales los alelos del gen . portante difieren en cuanto a su posicion en el :ur6n . Los polimorfismos de la presencia o ausencia .:_ intrones son comunes en mitocondrias micoti:as, lo cual es compatible con el punto de vista de ;ue esos intrones se originaron por insercion en el ~en. Un analisis de recombinacion en cruces que : nplican un gran gen de RNAr de la mitocondria :e levadura arroja un poco de luz en el proceso ::nplicado. Este gen tiene un intron del grupo I con una se-c.Iencia de coctificadon, el cual esta presente en algu.as cepas de levaduras (llamadas w+) , pero ausente ~n otras (or). Las cruzas geneticas entre organismos ..:l- y w- son polares, su progenie suele ser w•. Si se piensa en la cepa w+ como donadora y la :r como receptora, se llega a Ia idea de que en las ~

escinde el sitio diana

. Un intr6n codifica una endonucleasa que provoca una rotura de doble cadena en el DNA. La secuencia del intr6n se duplica y despues se inserta en el sitio de rotura.

cruzas w• con w- se genera una nueva copia del intr6n en el genoma w-, de modo que la progenie es totalmente w•. Para abolir la polaridad pueden ocurrir niutaciones en cualquier progenitor, y los mutantes muestran segregaci6n normal con, un n(tmero equivalente w• y w-en Ia progenie. Estas mutaciones indican la naturaleza del proceso. Las mutaciones en la cepa w- ocurren cerca del sitio en que se insertarfa el intron, en tanto que las de la cepa w•, yacen en el marco de lectura del intron e impiden la producci6n de la protefna. Esto sugiere el modelo de la , donde la protefna coctificada por el intr6n en una cepa w• reconoce el sitio don de deberfa insertarse el intron en una cepa w-, y hace que se herede de manera preferencial. (.Como actu a la protefna? El producto del intron w es una endonucleasa que reconoce a! gen w- como diana para una rotura de doble cadena. La endonucleasa reconoce una secuencia diana de 18 bp que contiene el sitio en que se inserta el intron, de modo que esta se escinde en cada cadena del DNA, a una distancia de dos bases del extrema 3' del si tio de insercion. Asf, los sitios de escision estan separados por 4 bp y generan cadenas unicas que sobresalen. Este tipo de escision se relaciona con la caracterfstica de los transposones cuando migran a nuevas sitios (vease Cap. 21 , Transposones) . La rotura de la doble cadena probablemente inicie un proceso de conversion genica, en Ia cual Ia secuencia del gen w• se copia para sustituir a Ia del gen w-. La reaccion implica transposicion por un mecanismo de duplicacion, y tiene Iugar solo en el ambito del

27.5 Alg unos intrones del grupo I codifican endonucleasas que fomentan la movilidad

715

DNA. La inserci6n del intr6n interrumpe la secuencia reconocida por !a endonucleasa, de modo que se garantiza !a estabilidad. Muchos intrones del grupo I codifican endonucleasas que les confieren movilidad. Hay varias familias de endonucleasas cuya caracterfstica comun es la secuencia de aminoacidos LAGLIDADG, cerca del sitio activo. Los intrones similares su elen portar endonucleasas bastante diferentes en cuanto a los detalles de Ia insercion; por ejemplo, Ia endonucleasa codificada por el intron tb del fago T4 escinde un sitio diana situado a 24 bp en flujo ascendente respecto del sitio en que se inserta el intron mismo. La disociacion entre las secuencias del intron y !a endonucleasa destaca por el hecho de que las mismas secuencias de endonucleasas se encuentran en las intefnas (secuencias que codifican para proteinas de autocorte y empalme; vease la secci6n 27 .12, El corte y empalme de las protefnas es autocatalftico). La variacion en las endonucleasas significa que no ha y homologla entre las secuencias de los sitios diana, que son de los mas largos y, por tanto, de los mas especfficos que se conocen para cualquier

endonucleasa (con un rango de 14 a 40 bp) . La pecificidad garantiza que el intron se perpetue ~ por insercion en un sitio diana {mico, y no en ~ punto del genoma, lo que se llama alojamie~ del intron. Los intrones que portan secu encias que :: difican endonucleasas se encuentran en div :-. bacterias y eucariotas inferiores. Estos resulta refuerzan el punto de vista de que los intrones .::_ portan secuencias de codificacion surgieron c elementos independientes.

ED Los intrones del grupo II pueden codificar protefnas multifuncio nales Conceptos principales • Los i ntrones del grupo II pueden ser sujetos de autocorte y empalme in vitro, pero suelen ser auxiliados por actividades protelnicas codificadas e- ~ intr6n. • Un solo marco de codificaci6n especifica a una prote1na con actividad de transcriptasa inversa

y

madurasa, un segmento de union de DNA y una endonucleasa de DNA. Ex6n

lntr6n

Ex6n

/.)~~9l

l

Sitio diana

~~

//V/YIV~"-

•

La transcriptasa inversa genera una copia de DNA c. partir de la secuencia del RNA, que se transpone pc- _ mecanismo similar al del retropos6n.

/ /'Vl· ~ JVF\.

•

RNA

La endonucleasa esci nde el DNA diana para permit- ~ i nserci 6n del transpos6n en un nuevo sitio.

l

~3'

~

La rotura de Ia doble cadena proporciona un extrema de cebaci6n ~

b

Endonucleasa/ transcriptasa inversa

r,.n..-~

DNAc sintetizado _ _ J

' El intr6n del RNA es el molde

l

h VI ~(Yf'-

/

l

/fVrl/Yl~ El DNA sustituye al RNA

7 !

~~ El intr6n se recombina ~ La transcriptasa inversa codificada por un intr6n permite insertar una copia del RNA como si t io diana generado par una rotura dicatenaria.

716

CAPITULO 27 RNA catalltico

Los intrones moviles del grupo II mejor cara c:~ zados codifican una sola protefna en una regi6::. intron mas alla de su centro catalftico. La pr :tfpica contiene actividad de transcriptasa im .,. terminal N, que es un dominio central vino :_: con actividad au xiliar de plegamiento del in:: en su estructura activa (se llama madurasa; - se Ia secci6n 27 .7, Algunos intrones de auto = y empalme requieren de madurasas), undo_~ de union al DNA y un dominio de endonuc e: terminal C. La endonucleasa inicia la reaccion de tr~ sicion y tiene la misma participaci6n en el ret a casa que su contraparte en un intron del gru La transcriptasa inversa genera una copia de D_- partir del intron insertado en el sitio de alojam.ic:La end on ucleasa tam bien escinde sitios diana ;:- ~ cidos a! sitio de alojamiento, pero no identico> _ mucho menos frecuencia, lo cuallleva a !a inse:: - del intron en nuevas localizaciones. En la 7 se ilustra Ia reaccion de c ' posicion de un intron del grupo II tfpico. La ___ nucleasa efectua una rotura de la doble cade~

-:1 sitio diana; para su actividad, requiere tanto del jominio de la protefna como del RNA del intr6n. :::1dominio de la protefna escinde la cadena n o coiificadora del DNA, y el intr6n del RNA en realidad :::scinde Ia cadena en sentido normal; mediante esta ~e acci6n, el intr6n se inserta directamente en un ::rio diana del DNA. El intr6n del RNA proporciona un molde para la ~tltesis de DNAc. Casi todos los intrones del grupo II : enen actividad de transcriptasa inversa especffica de :u r6n, la cual genera una copia del intr6n del DNA resulta en Ia inserci6n del intr6n en un sitio diana, ~omo DNA de doble cadena. El mecanismo simula 3 transposici6n de retrovirus, en la cual el RNA es _.n intermediario obligatorio (vease Ia secci6n 22.2, .:1 ciclo vital de los retrovirus implica sucesos simi.ares a Ia transposici6n ). El tipo de retrotransposii 6n implicado en este caso simula el de un grupo je retroposones que carecen de LTR y generan el : xtremo 3' -OR, necesario para la cebaci6n, hacienda .;,na hendidura en Ia diana (vease Ia Fig. 22.20 de Ia - cci6n 22.12, Las LINES utilizan una endonucleasa ara generar un extremo de cebaci6n).

Alg unos intrones de autocorte y empalme requieren de madurasas Concepto principal • Los intrones de autocorte y empalme pueden necesitar actividades de madurasa codificadas en su interior para ayudar al plegamiento en La estructura catalitica activa.

--.. unque los intrones de los grupos I y II tienen Ia :-pacidad de autocorte y empalme in vitro, en conj ciones fisiol6gicas suelen n ecesitar Ia ayuda de roteinas. Ambos tipos de intr6n pueden codificar .: tividades de madurasa, las cuales se requieren -ara ayudar a Ia reacci6n de corte y empalme. La actividad de madurasa es parte del marco .:. e lectura abierto unico, codificado por el intr6n. ::n el ejemplo de los intrones que codifican endo-:ucleasas de alojamiento, el producto protefnico ..:nico tiene actividad tanto de endonucleasa como :e madurasa. El analisis de las mutaciones muestra :ue ambas actividades son independientes. El analisis estructural muestra que las activida- s de endonucleasa y madurasa son proporciona::as por diferentes sitios activos de la protefna, cada _no codificado por un dominio independiente. El ..io de endonucleasa se une con el DNA, a difep;oncia del de madurasa, que hace Jo propio con el -~tr6n del RNA. En Ia se muestra la es-

tructura de una de esas protefnas unida al DNA. Un rasgo caracterfstico de Ia endonucleasa es la presencia de helices a. paralelas que contienen secuencias LAGLIDADG, marcas de referencia que conducen a los dos amino
.

;

Sitios actives r=> Sitio activo ..... de aminoacidoslr"'\) de Ia madurasa~

Un intr6n de alojamiento codifica a una endonucleasa de la familia LAGLIDADG que tam bien tiene actividad de madurasa. Las secuencias LAGLIDADG son parte de las dos helices a. que terminan en los aminoacidos catallticos, cerca del DNA dicatenario. El sitio activo de la madurasa se identifica mediante una molecula de arginina en otra parte de la superficie de la protelna.

27.7 Algunos intrones de autocorte y empalme requieren de madurasas

717

!

lntr6n

Endonucleasa El gen de endonucleas se inserta en el intr6n

!

El intr6n ~U' ~ transporta ~ Ia endonucleasa ~

El gen de madurasa se inserta en el intr6n

fj~.·~~...~=

El intr6n porta Ia endonucleasa y Ia madurasa

r

.

!n

••

~

~ _) ~

p

-

El intr6n se origin6 como una secuencia de codificaci6n independiente para un RNA de autocorte y empalme. La inserci6n de la secuencia de endonucleasa cre6 un intr6n m6vil de alojamiento. La inserci6n de la secuencia de madurasa incremento entonces la capacidad de las secuencias del intr6n para plegarse en la estructura activa para corte y empalme. J

del intr6n en el genoma del hospedador y entonces evolucion6 para actuar en una gama de sustratos mas amplia que Ia secuencia del intr6n original. El gen catalftico del intr6n podria haber evolucionado hacia un RNAsn.

&II

La actividad catalftica de la ribonucleasa P se debe al RNA

Concepto principal • La ribonucleasa P es una ribonucleoproteina en la cual el RNA tiene actividad catalitica.

Una de las primeras demostraciones de las capacidades del RNA provino de Ia diseccion de Ia ribonucleasa P, endonucleasa de procesamiento del RNAt de E. coli, que puede ser disociada en sus dos componentes, el RNA de 375 bases y el polipeptido de 20 kD. En las condiciones originalmente utiliza718

CAPITULO 27 RNA catalitico

das para caracterizar !a actividad de las enzimG.!> vitro, ambos componentes fueron necesarios "t: escindir el sustrato RNAt. Sin embargo, un cambia en las condicion : nicas (aumento de la concentraci6n de Mg 2•) b que el componente proteinico sea superfluo , _ iel RNA solo puede catalizar la reacci6n! Analizand · resultados como si el RNA fuese una enzima, (~ "enzima" cataliza Ia escision de multiples sustr.:: y si bien la actividad catalftica reside en el RK-. componente proteinico aumenta mucho Ia ve: dad de la reacci6n, como se observa en el increrr: =to del numero de recambio (vease Ia Fig. 27.1 ( Las mutaciones del gen del RNA ode la p r ~ · na suelen desactivar a la ribonucleasa P in vil·..· modo que se ha llegado a saber que ambos co .. ~ nentes son necesarios para la actividad natura.:: la enzima. La hip6tesis original fue que Ia pre na proporcionaba Ia actividad catalftica, en tc..::: el RNA tenia alguna participaci6n ria . ~ ejemplo, facilitar el plegamiento del sustrato ( : algunas secuencias cortas complementarias de regiones expuestas del RNAt) , jpero esas funcil:: se revierten!

Ell

Los virioides tienen activida catalftica

Conceptos principales • Virioides y virusoides forman una estructura en cabe:::: de martillo con actividad de autoescisi6n. • Se pueden generar estructuras similares para el apareamiento de una cadena de sustrato fragmenta ~ por una cade na de enzimas. • Cuando una cadena enzimatica se introduce en una celula, puede aparearse con una cadena sustrato dia -:. que despues es escindida.

Otro ejemplo de Ia capacidad del RNA para a . como endonucleasa proviene de RNA (-350 b ~ de plantas pequefias que presentan una reacc de escisi6n propia. No obstante, como en el ·..:. del intron del grupo I del genero Tetrahymena,= diante ingenieria es posible obtener estructuras ~ _ incidan en sustratos externos. Estos RNA de plantas pequefias forman ·de dos grupos generales, virioides y virusoides. :... virioides son moleculas de RNA infecciosas : _ actuan de manera independiente, sin ser enca:;:- -_ lados por alguna cubierta proteinica, a difer ;::._ de los virusoides, similares en cuanto a orgac ·ci6n, pero son encapsulados por virus de plan-empacados con un genoma vfrico. Los virus ::: no pueden replicarse de man era independiente -

~ uieren

de Ia asistencia del virus; en ocasiones se les j enomina RNA satelite. Virioides y virusoides se replican a traves de :frculos giratorios (vease Ia Fig. 16.6). La cadena de ~NA empaquetado en el virus se denomina cadena )ositiva, y la complementaria, generada durante la ~eplicacion del RNA, se llama cadena negativa. Se ::-ncuentran multfmeros tanto de cadenas positivas como de negativas. Ambos tipos de monomero se generan por escision de Ia cola de un cfrculo gira:orio; los monomeros circulares de cadena positiva ;.e generan por ligadura de los extremos del mono. ero lineal. Ambas cadenas de virioides y virusoides, po·itiva y negativa, presentan autocorte y empalme n vitro, reaccion fomentada por cationes meta!icos :livalentes, que genera extremos 5'-0H y 2'-3' fos: diester cfclico. Algunos de los RNA se escinden .· ·z vitro en condiciones fisiologicas, otros hacen lo ;n opio solo despues de un ciclo de calentamiento ~- enfriamiento, lo cual sugiere que el RNA aislado ~: ene una conformacion inapropiada, pero puede ~enerar una conformacion activa cuando se desna:uraliza y renaturaliza. Los virioides y los virusoides que presentan esj sion propia, forman una estructura secundaria "en ::nartilllo" en el sitio de escision, como se mue stra ~ n la parte superior de Ia Frt~UR ..7 1 . La secuencia :le dicha estructura es suficiente para la escision. -:: uando las secuencias circundantes presentan de: cion, se obvia Ia necesidad de un ciclo de calentaliento-enfriamiento y el RNA pequeiio se corta y -:mpalma espontaneamente a sf mismo, fenomeno ~ ue sugiere que las secuencias mas alia del martillo :uelen interferir con su formacion. El sitio activo es una secuencia de solo 58 nu:leotidos. La cabeza del martillo contiene tres regio':les de tallo-asa, cuya posicion y tamaiio son cons:antes, y 13 nucleotidos conservados, casi todos en :egiones que se conectan con el centro de la estruc:ura. Las bases y los tallos dobles conservados gene~an un RNA con capacidad intrfnseca de escision. Tambien puede generarse un martillo activo !)Or apareamiento de un RNA que representara un .ado de Ia estructura y otro que representara al otro . :::n Ia parte inferior de Ia Figura 27.16 se muestra un ejemplo de un martillo generado por hibridacion de .: na molecula de 19 bases con una de 24. El hfbrido ;;;imula la estructura del martillo, con omision de las ~ sas I y III. Cuando se agrega el RNA de 19 bases ~ RNA de 24, se produce Ia escision en Ia posicion ~ p ropiada del martillo. Se puede considerar que Ia cadena superior (24 : ases) de ese hfbrido incluye el "sustrato", y Ia in:.=rfor ( 19 bases), Ia "enzima". Cuando se mezcla el . NA de 19 bases con un excedente del RNA de 24,

•

••

•

I

•

I

.

•

•

~

I •

Las cabezas de martillo de consenso tienen tres asas de tallo y bases conservadas Tallo 3

3'

5' Escisi6n

CG AU / GNCGAA NNNNNN C N GA

cNl\J N N N

GNAG

Tallo 2

u\

Tallo 1

Sitio catalftico Por interacci6n entre dos moleculas de RNA complementarias se pueden crear cabezas de martillo i Cadena sustrato

ppp c HOC G C G GA

I

G

Cadena enzimatica

UAG

G C\OH CA G C U C G G PPP U ·

'7 • Los sitios de auto corte y empalme de virioides virusoides tienen una secuencia de consenso y forman una estructura secundaria en cabeza de martillo, la cual tambien puede generarse por apareamiento entre una cadena de sustrato y una de "enzima".

y

se esdnden capias multiples de este ultimo, lo cual sugiere que hay un ciclo de apareamiento de 19 y 24 bases, escision, disociacion de los fragmentos eliminados del RNA de 19 bases y apareamiento de este ultimo con el nuevo sustrato de 24 bases. El RNA de 19 bases es, por tanto, una ribozima con actividad de endonucleasa. Los parametros de Ia reaccion son similares a los de otras catalizadas por el RNA (vease Fig. Ia 27.10). La estructura cristalina de una cabeza de martillo muestra que forma una estructura en V compacta, donde a su vez yace el centro catalitico, segun se ilustra esquematicamente en la " c J '~ 1. La participacion de un ion Mg 2 + localizado en el sitio catalitico es crucial en Ia reaccion; lo ubica la citidina diana y la citidina de Ia base del tallo I; tambien puede estar conectado con Ia uridina adyacente . Extrae un proton del extrema 2'-0H de Ia citidina diana y despues ataca directamente el labil enlace fosfocliester. Las mutaciones en la secuencia de cabeza de martillo que afectan el estado de transicion de Ia reaccion de escision ocurren tanto en el sitio activo como en otras localizaciones, lo cual sugiere que puede haber cambios estructurales sustanciales antes de Ia escision. Es posible diseiiar combinaciones enzima-sustrato que formen estructuras en cabeza de martillo, 27. 9 Los virioides tienen actividad catalltica

719

5' 3' G C Tallo2

G C

8 g ACG3' 5' G A C U ~ S CA C8 G Tallo 1 A

U

~ ~GUC

Tallo 3 ~ ~ G

A

U A

c A

Mg

c G

u

Sitio catalftico

Una ribozima en cabeza de martillo da lugar a una estructura terciaria con forma de V, en la cual, el tallo 2 se inserta sobre el 3; entre los tallos 2, 3 y 1 yace el centro catal\tico que contiene un ion magnesio que inicia la reacci6n hidrolltica.

que se hayan sido usadas para demostrar que Ia introduccion de las moleculas apropiadas de Ri\TA en una celula permite que la reaccion enzimatica ocurra in vivo. Una ribozima disefiada en esa forma, proporciona esencialmente una actividad similar a la de restriccion, altamente especffica, dirigida contra un RNA diana. Al poner Ia ribozima bajo el control de un promotor regulado, se puede usar en la misma forma que las cadenas no codificantes (por ejemplo), especfficamente para eliminar Ia expresion de un gen diana en circunstancias definidas.

(exones) del DNA de ben ser reconectadas er:. RNA, proceso que sigue siendo de transferencic. ~ informacion, en el cualla secuencia de codificac · real del DNA se mantiene sin cambios. Los cam bios en la informacion codificada pc ~ DNA ocurren en circunstancias excepcionales. bre todo en Ia genera cion de nuevas secuencias ~- _ · codifican inmunoglobulinas en mamfferos y a· ._ Dichos cambios tienen Iugar especffi.camente er celulas somaticas (linfocitos B), donde se sintet:..:::.. las inmunoglobulinas (vease Cap . 23, Diversidad munitaria). Durante el proceso de reconstruc - · de un gen de inmunoglobulina, en el DNA de _· individuo se genera nueva informacion, y la ir_:' :macion codificada en el DNA es cambiada por · mutacion somatica. La informacion del DNA si ~ . siendo transcrita fielmente en el RNA. La edicion del RNA es un proceso en que Ia. fo rmaci6n cambia en el ambito del RNAm; es reve:.:. por circunstancias en que Ia secuencia de cocii.=.::.. cion de un RNA difiere de la del DNA a parti:cual fue transcrito. La edicion del RNA ocurre ~ dos circunstancias diferentes, cada una por clife:tes causas. En celulas de mamffero se dan caso: _ sustitucion de una base individual del RNAm : _ produce un cambio en Ia secuencia de la prme:codificada. En las mitocondrias de tripanos or- · los cambios son mas extensos en los productos _ transcripcion de varios genes, en cuyo caso se a;.· _ gan o eliminan bases sistematicamente.

El gen de apolipoprotefna B tiene 29 exones - Ill j j ! lll I ll I I I ~ -~ . ; -

fJ1rQ La edici6n de RNA ocurre en bases individuales Concepto principal • Los receptores de apolipoprotelna By glutamato presentan desaminaciones especlficas de sitio catalizadas por desaminasas de citidina y adenosina, que cambian la secuencia de codificaci6n.

Un axioma primordial de la biologfa molecular es que la secuencia de un RNAm solo puede representar lo que esta codificado en el DNA. El dogma central contemplaba una relacion lineal en la cual una secuencia continua de DNA se transcribia en una de RNAm, que a su vez, se traducfa directamente en una proteina . La presencia de genes interrumpidos y la eliminacion de intrones por corte y empalme del RNA introduce un paso adicional en el proceso de expresion genica, las secuencias de codificacion 720

CAPITULO 27 RNA catalltico

CAA El codon 2153 codifica Ia glutamina

CAA

_,.. - . . . -;;,;,==-

Edicion

El RNAm escindido y empalmado en el hfgado codifica para una protefna de 4563 aminoacidos

UAA

El RNAm intestinal tiene un codon UAA que termina Ia sfntesis en el aminoacido 2153

La secuencia del gen de la apo-B es La _ en el intestino y el hlgado, pero la del RNAm se modafic: ~ un cambia de base que crea un codon de terminaci6 A ~ intestino.

En la se resumen las secuencias del de Ia apolipoproteina B y el RNAm en el intes::no y el higado de los mamiferos. El genoma tiene n solo gen (interrumpido), cuya secuencia es iden..:ca en todos los tejidos, con una region de coclificaion de 4 563 codones. Este gen se transcribe en un _ NAm, el cual se traduce en una protefna de 518 kD, _ue representa !a secuencia completa de codificacion 7n el hfgado. Una forma mas corta de la protefna de -250 kD :e sintetiza en el intestino, !a cual consta de !a mitad :errninal N de !a protefna completa y se traduce a artir de un RNAm cuya secuencia es identica a Ia ~epatica, excepcion hecha de un cambia de C por U ::n el codon 2 15 3. Dicha sustitucion pas a el codon :AA para glutamina hacia el codon ocre UAA para ~en

~erminacion.

<..A que se debe esta sustitucion? No hay un gen J exon alterno en el genoma para codificar !a nueva ; cuencia, y nose ha descubierto ningun cambia en l patron de corte y empalme. La conclusion obli;ada es que ha habido un cambia directamente en .a secuencia del transcrito. Otro ejemplo son los receptores de glutamato del :erebro de rata. La edicion en una posicion cambia Jn codon de glutamina del DNA por un codon dear~inina del RNA, cambio que afecta Ia conductividad Jel conducto y, por tanto, tiene un efecto importante =n el control del flujo ionico a traves del neurotrans~isor. En otra posicion del receptor, un codon de 3roinina se convierte en un codon de lisina. 0 El suceso de edicion en la apo-B hace que C2 153 ;e cambie por U; ambos cambios en el receptor de :~lutamato son de A a I (inosina) . Estos sucesos son ::o_esaminaciones en las cuales se elimina el grupo ami- o del anillo nucleotfdico, sucesos catalizados por =nzimas llamadas desaminasas de citidina y adeno·iua, respectivamente. Este tipo de edicion parece :ener Iugar principalmente en el sistema nervioso. :fay 16 dianas (potenciales) para la desaminasa de ~itosin a en Drosophila melanogaster, y todas corresonden a genes implicados en la neurotransmision. in muchos casos el suceso de edicion cambia un ::minoacido de una posicion funcionalmente impor~nte de Ia proteina. <..Que cQntrola la especificidad de una reaccion je edicion? Las enzimas que !levan a cabo la desaminacion como tal, a menudo son muy espedficas; _or ejemplo, Ia desaminasa de adenosina mejor ca~acterizada act(Ja en cualquier molecula A, en una :egion dicatenaria del RNA. Las enzimas de edicion se relacionan con las desaminasas generales, pero resentan otras regiones o subunidades adiciona:es que controlan su especificidad. En el caso de .a edicion de apo -B, la subunidad catalftica de un :omplejo de edicion se relaciona con Ia desaminasa

Adenosina

lnosina

NH 2

0

I

II

N_...C,c-N, ~

II

GH

HN...-C'c-N,

--+-

HC<::- _...C - N/ N I

I

II

CH

HC<::- _...C -N/ N I

~ lntr6n Ex6n

La edici6n del RNAm se produce cuando una desaminasa actua sobre una adenina en una region dicatenaria de RNA apareada de manera imperfecta.

de citidina bacteriana, pero presenta una region de union al RNA adicional que ayuda a reconocer el sitio diana especifico para Ia edicion. Una enzima especiaL Ia desaminasa de adenosina, reconoce los sitios diana del receptor de glutamato del RNA y se presentan sucesos similares en un receptor de serotonina del RNA. El complejo puede reconocer una region particular de Ia estructura secundaria de manera analo0oa a las enzimas de modificacion del RNAt, o bien reconocer directamente una secuencia nucleotfdica. El perfeccionamiento de un sistema in vitro para el suceso de edicion de apo-B sugiere que una secuencia relativamente pequena (- 26 bases) que rodea al sitio de edicion constituye una diana suficiente. En !a se muestra que en el caso del RNA de GluR-B, se forma una region de pares de bases necesaria para el reconocimiento de la diana entre la region editada en el exon y una secuencia complementaria del intron de flujo descendente. Se necesita un patron de apareamiento erroneo dentro de Ia region doble para el reconocimiento especffico. Asf, diferentes sistemas de edicion pueden tener diferentes requisitos de especificidad de secuencias en sus sustratos.

La edici6n del RNA puede dirigirse por RNA guias Conceptos principales • La intensa edici6n de RNA en mitocondrias de tripanosomas se debe a inserciones o deleciones de uridina. • El sustrato de RNA aparea sus bases con un RNA guia en ambos lados de La region por editar. • El RNA guia proporciona el molde para la adici6n (o, con menos frecuencia, La deleci6n) de uridinas. • La edici6n es catalizada por un complejo de endonucleasa, actividad de transferasa de uridilo terminal y ligasa de RNA.

27 .11 La edici6n del RNA puede dirigirse por RNA gu\as

721

Otro tipo de edicion se revela por cambios secuenciales notables en los productos de varios genes de mitocondrias de los tripanosomas. En el primer caso por descubrir, la secuencia de la subunidad II de la protefna oxidasa de citocromo experimenta un cambio de marco respecto de la secuencia del gen coxll. Las secuencias del gen y la protefna, incluidas en la J 1 0, se conservan en varias especies de tripanosomas. 2. Como actua ese gen? El RNAm de coxll tiene un inserto de cuatro nucleotidos adicionales (todos uridinas) en torno al sitio de cambio del marco de lectura; con la escision se restablece el marco de lectura apropiado, se inserta un aminoacido adicional y cambian los aminoacidos a uno y otro !ado. Con esa secuencia noes posible descubrir un segundo gen, y debe concluirse que las bases adicionales se insertan durante o despues de la transcripcion. En los genes de SV5 y los paramixovirus causantes del sarampion seencuentra una discrepancia similar entre el RNAm y las secuencias genomicas, en cuyo caso implica la adicion de moleculas de G en el RNAm. En otros genes, la edicion de secuencias de RNA es similar, e incluye deleciones, asf como adiciones de uridina. El caso extraordinario del gen coxlll del Trypanosoma brucei se resume en la

entre el DNA genomico y el RNAm muestra que- hay segmento mayor de siete nucleotidos rept e~.:- tado en el RNAm que no haya sido modificado. ~ insertan series de uridinas de hasta siete bases. ·.::. donde proviene la informacion para !a inse rc especffica de uridina? Un RNA guia contiene secuencia complementaria de la del RNAm co.• tamente editado. En la FIGURA J.7 .22 se obsen·<: _ modelo de su accion en el gen del citocromo ~ especies de Leishmania. La secuencia de la parte alta de la figura m:... :tra el transcripto original, o RNA preeditado. :.. espacios indican el sitio de insercion de las b.: · en el proceso de edicion, que para crear la se ru::cia valiacr·ae-RNAm en esa region, deben ser ' · uridinas. El RNA gufa es complementario del RN."L lo largo de una distancia significativa que inc: _ la region editada y la rodea. Por lo general, !a c plementariedad es mas extensa en ellado 3' d.z region editada y bastante corta en ella do 5'. El c.~ reamiento entre el RNA gufa y el preeditado .::_ espacios donde las moleculas de A del RNA gui'a.apareadas, no encuentran complemento en el L preeditado; el RNA guia proporciona un molde · . permite a las moleculas faltantes de u insertars e dichas posiciones. Cuando concluye la reacci6:-. RNA guia se separa del RNAm, que queda disJX. ble para la traduccion. c_

Ll

Mas de la mitad de las moleculas del RNAm consta de uridinas no codificadas por el gen La comparacion

I

S

S

L

K

G

•

•

V

E

N

L

V

G

t

•

•

M

V

AUA UCA AGU UUA GGU AUA AAA GUA GAG A AC :QU GUA GGU GUA AU

Codificado en Ia secuencia de DNA del genoma

Cambia de marco de lectura

AUA UCA AGU UUA GGU AUA AAA GUA GAU UGU AUA CCU GGU AGG UGU AAU Secuencia del RNA I

S

S

L

G

I

K

V

D

C

I

P

G

R

C

N

Secuencia de Ia protefna

r , PA '> 1 .,0 El RNAm para el gen coxii de los tripanosomas tiene un cambio de marco respecto del DNA; el marco de lectura correcto se crea por la inserci6n de cuatro uridinas. El RNAm de Coxlll es ampliamente edltado, tanto por mserci6n como por delecion de undina

1

UAUAUGUUUU GUUGUUUAUUAUGUGAUUAUGG UUUUGUUUU UUAUUG! UAUUUUUUAGAUUUAUUUAAUUUGUUGAU

QJ

A

iiiii

QJ

AAUACAUUUUAUUUG UUUG UUAA UUUUUUUGUUUUGUGUUUUGG UUUAGGUUUUUUUGUU GUUG UUGUUUUGUAUUA

uiiiii 21 Parte de la secuencia coxiii del RNAm de T. DNA (rojas) o eliminadas del RNA (marcadas con T).

FTGL R

722


brucei muestra

much as uridinas no codificadas en el

. . Genoma

AAAGCGGAGAGAAAAGAAA

RNA preeditado AAAGCGGAGAGAAAAGAAA

RNA preeditado AAAGCGGAGAGAAAAGAAA

RNA gufa

A G

l

A G

l

A G

G C TTIAACTICAGGTIGTTIATIACGAGTATATGG

Transcripci6n G C UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG

Apareamiento con el RNA gufa

G C UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG

Ill

l

AUAUUCAAUAAUAAAUUUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGUUCAGUAUACACUAUAAUAAUAAU

llnserci6n de uridl11 as

RNAm

RNA gufa

l RNAm

Liberaci6n de RNAm

AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG

FIGUR

l. El RNA preeditado aparea sus bases con un RNA gu\a a ambos lados de la region par editar. El RNA gu\a proporciona un molde para la inserci6n de uridinas. El RNAm producido par las inserciones es complementario del RNA gu\a.

La especificaci6n de Ia secuencia final editada : uede ser bastante compleja. En este ejemplo se evi_a una porci6n larga del producto de transcripci6n : or inserci6n de un total de 39 moleculas de U, ~u e parece necesitar dos RNA guias que actuan en :rios adyacentes; el primero se aparea en el sitio - · y la secuencia editada se convierte entonces en .:.n sustrato para edici6n adicional por el siguiente .S.NA guia. Los RNA gufas se codifican como unidades de :canscripci6n independientes. En Ia FIGURA 27 . ., . ~ muestra un mapa de la region importante del J NA mitocondrial del genero Leishmania que in:.uye el "gen" del citocromo b que codifica la se:CJencia preeditada y dos regiones que especifican .?..NA gufas. Los genes para las principales regiones ~e codificaci6n y otros RNA y sus RNA guias e.stan .ilt.ercalados. En principia, una mutaci6n en el "gen" o uno ~e sus RNA gufas podrfa cambiar la secuencia pri.::naria del RNAm y, por tanto, tambien la secuen:::a primaria de la protefna. Por criterios geneticos, :ilda una de esas unidades podrfa considerarse como ~o nstitutiva de parte del "gen". Las unidades se ex; resan de manera independiente, de modo que de:-erfan complementarse en configuraci6n trans. Si -:ubiera mutaciones, se necesitarian tres grupos de

Genes 12S

9S

MURF3 Coiii CyS MURF4 MURF1 ND1CoiiMURF2Col ND4

ND5

1 ~ 1J El genoma de especies de Leishmania contiene genes que codifican RNA preeditados intercalados con unidades que codifican los RNA gu\as necesarios para generar las secuencias RNAm correctas. Algunos genes tienen varios RNA gu\as. El CyB es el gen para el citocromo b preeditado, y CyB-1 y CyB-2 son genes para los RNA gu\as implicados en su edici6n.

complementaci6n para codificar la secuencia primaria de una sola protefna. La caracterizaci6n de intermediarios editados en parte sugiere que la reacci6n procede a lo largo del RNA preeditado en direcci6n 3' -5'. El RNA guia determina la especificidad de las inserciones de uridina por su apareamiento con RNA preeditado. La edici6n de uridinas es catalizada por un complemento enzimatico de 20S que contiene una endonucleasa, una transferasa de uridilo nuclear 27 .11 La edici6n del RNA puede dirigirse por RNA gu\as

723

lnteina

Exteina

~

~ Endonucleasa RNA

5' ======

====== 3'

~

Transferasa de uridilo terminal/ TUTasa)

Proteina

5' = = = = ==U ====== 3'

y

r---.

~ Ligasa de RNA 5' ======u=======3' La adici6n o deleci6n de moleculas de U se debe a escisi6n del RNA, eliminaci6n o adici6n de U, y ligadura de los extremos. Las reacciones son catalizadas por un complejo de enzima s dirigido po r un RNA gu1a.

(TUTasa) y una ligasa de RNA, como se ilustra en la ; se une al RNA guia y lo utiliza para aparearse con el RNAm preeditado. El susnato RNA es escindido en un sitio que (supuestamente) se identifica por ausencia de apareamiento con el RNA gufa, se inserta o elimina una uridina para el apareamiento de bases con el RNA gufa, y despu es, se liga el sustrato RNA. El trifosfato de uracilo (UTP) constituye la fuente del fragmento uridilo que se agrega por actividad de la TUTasa; no se sabe si esa actividad o la de una exonucleasa independiente se encarga de la deleci6n. (En algun momenta se pens6 que el segmento de moleculas de U en el extrema del RNA guia podrfa proporcionar la fuente de U ana dido o un vertedero para los eliminados, pero la transferencia de moleculas de U al RNA gufa parece ser una reacci6n aberrante que no se encarga de la edici6n.)

El corte y empalme de prote1nas son autocatal1ticos Conceptos principales • Una inte1na tiene la capacidad de catalizar su propia eliminaci6n de una prote1na, de manera que las exte1nas de los flancos se conecten. • Corte y empalme de prote1nas se catalizan por la inte1na. • Casi todas las inte1nas tienen dos actividades independientes, corte y empalme de prote1nas y una endonucleasa que vuelve a casa.

724


I

Proteina

t inteina

escindida

~ ~ U ' " En el corte y empalme de prote1nas, laser ~ nas se conectan por eliminaci6n de la inte1na de la prate'- :

El corte y empalme d e proteinas tienen el mis:~ efecto que el correspondiente del RNA, una secu e:: cia representada en el gen no esta representada :: la protefna, cuyas partes se nombran por anal! : con el corte y empalme del RNA: las exteinas ~ las secuencias representadas en la protefna madu;.:.. y las inteinas, las secuencias que se eliminan. :::. mecanismo de eliminaci6n de la intefna es com . ~ tamente diferente del de corte y empalme del K -En la 1 • _ se muestra que el gen se tradhen un precursor protefnico que contiene la intei::-: de modo que esta sera posteriormente escindida la protefna. Se conocen casi l 00 ejemplos de c ::-y empalme de protefnas, difundidos en todas · ~ clases de organismos. El gen tipico cuyo produresenta corte y empalme de protefnas tiene ·-sola intefna. La primera intefna se descubri6 en un gen ~ caico de polimerasa de DNA en forma de una '' cuencia intercalada en el gen que no cumple con ' reglas de los intrones. Se demostr6 entonces que protefna purificada puede cortar su secuencia hafuera, en una reacci6n autocatalftica que no req .-_ re de ingreso de energfa y que ocurre a trave _ . una serie de reestructuraciones de enlaces, co_ se muestra en la , 7 . La reacci6n es cfunci6n de la intefna, si bien su eficacia podrfa _ :pender de las exteinas. La primera reacci6n es un ataque por un -c-o una cadena lateral -SH del primer aminoacid o _ . la intefna en el enlace peptfdico que la conecta c. la primera extefna, con lo cualla extefna se tra._fiere del grupo amino terminal de Ia intefna a u.::....

:onexion N-0 o N-S acilo. Despues, ese enlace es .u acado porIa cadena lateral -OH o -SH del primer ~m inoacido de la segunda extefna, el resultado sera ~a transferencia de Ia extefna I a Ia cadena lateral del aminoacido terminal de la extefna II. Por ultimo, Ia asparagina terminal C de Ia intefna forma un ciclo y ~I NH terminal de la extefna II ataca el enlace acilo . ara sustituirlo con un enlace peptfdico convencio::-tal. Cada una de esas reacciones puede ocurrir de :nanera espontanea a velocidades muy bajas, pero ·u aparicion en forma coordinada, suficientemente :apida como para lograr el corte y empalme de Ia roteina, requiere de catalisis porIa inteina. Las inteinas tienen rasgos caracterfsticos. Seen-uentran como inserdones en el marco de lectura de las secuencias de codificacion, y se reconocen .::omo tales por Ia presencia de genes homologos gue carecen de Ia insercion. Tienen una serina o jsteina terminal N (para proporcionar Ia cadena .ateral-XH) y una asparagina terminal C. La intefna i pica porta una secuencia de -150 aminoacidos en d extremo terminal N y casi 50 en el terminal C, :os cuales participan en Ia catalizacion de Ia reaccion e corte y empalme de protefnas. La secuencia del :entro de Ia inteina puede tener otras funciones. Una caracterfstica extraordinaria de muchas 1tefnas es su actividad de endonucleasa de aloja:niento, Ia cual escinde un DNA diana para crear un >itio donde pueda insertarse Ia secuencia de codi, cacion de Ia intefna del DNA (vease la Fig. 27.12 j e Ia seccion 27.5, Algunos intrones del grupo I co :iifican endonucleasas que fomentan la movilidad). ~as actividades de corte y empalme de las protefnas :· de Ia endonucleasa de alojamiento de una intefna on independientes. En realidad se desconoce Ia conexion entre esas :ios actividades en una intefna, pero se h an sugeri:io dos tipos de modelo. Uno supone que original- ente habia cierta conexion entre las actividades, . ero desde entonces se tornaron independientes y algunas intefnas han perdido Ia capacidad de enonucleasa de alojamiento. En el otro, las inteinas ueden haberse originado como unidades de corte .· empalme de protefnas, que en su mayor parte . eron invadidas despues por endonucleasas de alo'amiento (se desconoce Ia razon), lo cual es com;:>atible con el hecho de que las endonucleasas de :;Jojamiento parecen haber invadido tambien otros .ipos de unidades, incluidos, sobre todo, los intrones Jel grupo I.

Resumen :::1 autocorte y empalme constituye una propiedad 1e dos grupos de intrones muy difundidos entre las

XH I CH 2 I -2HN'-C' lntelna H

Los enlaces se reestructuran mediante una serie de transesterificaciones que involucran a los grupos - OH de serina o treoni na, o al grupo -SH de la cistelna, hasta que las extelnas se conectan mediante un enlace peptldico y La inteina con un extrema ( -circular es liberada.

eucariotas inferiores, los sistemas procarioticos y las mitocondrias. La informacion necesaria para Ia reaccion reside en Ia secuencia del intron (aunque en realidad, protefnas in vivo facilitan la reaccion). Para los intrones de los grupos I y II, Ia reaccion requiere de Ia formacion de una estructura secundaria/terciaria especifica que implica secuencias de consenso cortas. El RNA del intron del grupo I crea una estructura en que Ia secuencia del sustrato es mantenida por la region IGS del intron, en tanto qu e otras secuencias conservadas generan un sitio de union del nucleotido guanina, todo ello, por transesterificacion, que implica una molecula de guanosina como cofactor. Nose requiere ingreso de energia. La guanosina rompe el enlace en Ia union 5' exon-intron y se enlaza con el intron; el hidroxilo del extremo libre del exon ataca entonces Ia union 3' exon-intron. El intron se torna cfclico y pierde Ia guanosina y las 15 bases terminales . Una serie 27.13 Resumen

725

de reacciones relacionadas puede catalizarse a traves de ataques por el fragmento terminal G-OH del intr6n en enlaces fosfodiester internos. Proporcionando sustratos apropiados ha sido posible obtener ribozimas por ingenierfa, las cuales realizan diversas reacciones cataliticas, incluidas actividades de transferasa de nucleotidilos. Algunos intrones mitocondriales de los grupos I y II tienen marcos de lectura abiertos. Las protefnas codificadas por los intrones del grupo I son endonucleasas, que producen escisiones dicatenarias en sitios diana del DNA; Ia escisi6n inicia un proceso de conversion del gen, en el cual, Ia secuencia del intr6n mismo se copia en el sitio diana. Las protefnas codificadas por intrones del grupo II incluyen una actividad de endonucleasa que inicia el proceso de transposici6n y una de transcriptasa inversa que permite obtener una copia del intr6n mismo en el sitio diana. Dichos intrones posiblemente se originaron por procesos de inserci6n. Las protefnas codificadas por ambos grupos de intrones pueden incluir actividades de madurasa, que facilitan el corte y empalme del intr6n por estabilizaci6n de la formaci6n de la estructura secundaria/terciaria en sitio activo. El componente RNA de Ia ribonucleoprotefna ribonucleasa P lleva a cabo reacciones catalfticas. Los RNA virusoides son susceptibles de autocorte y empalme en una estructura "en cabeza de martillo", estructura que puede formarse entre un RNA sustrato y un RNA ribozima, lo cual permite dirigir Ia escisi6n en secuencias muy especfficas. Dichas reacciones sustentan el punto de vista de que el RNA puede formar sitios activos especfficos con actividad catalftica. La edici6n del RNA cambia Ia secuencia de un RNA durante su transcripci6n o despues de esta, que son cambios necesarios para crear una secuencia de codificaci6n significativa . En sistemas de mamfferos se presentan sustituciones de bases individuales que asumen la forma de desaminaciones, donde C se convierte en U, o A en I. Una subunidad catalftica relacionada con la desaminasa de citidina o adenosina actua como parte de un complejo mas grande con especificidad para una secuencia diana en particular. Las adiciones y deleciones (casi siempre de uridina) se presentan en las mitocondrias de tripanosomas y en paramixovirus. Las reacciones extensas de edici6n ocurren en los tripanosomas, en los cuales, hasta Ia mitad de las bases de un RNAm provienen de la edici6n. En Ia reacci6n de edici6n se usa un molde constituido por un RNA gufa complementario de Ia secuencia del RNAm. La reacci6n es catalizada por un complejo enzimatico que incluye una 726


endonucleasa, una transferasa de uridina ter::::._ y una ligasa de RNA, que utili zan nucle6tidos =- · como fuente de adici6n o liberan nucle6tidos e-5..: didos despues de Ia deleci6n. El corte y empalme de proteinas constituye- _ reacci6n catalftica derivada de reacciones de ::= ferenda de enlaces que no requiere de ingre: energia. La entefna cataliza su autocorte y em = fuera de las extefnas de los flancos. Muchas ime tienen una actividad de endonucleasa de aloj arr to independiente de la actividad de corte y em de las protefnas.

Referencias

fliJ

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~

Ill

Los virioides tienen actividad catal1tica

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m

La edicion de RNA ocurre en bases individuates

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fJIII

La edicion del RNA puede dirigirse por RNA gu1as

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728

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CAPITULO 27 RNA catalitico

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Cromosomas ESQUEMA DEL CAPITULO

j

Introducci6n Los genomas viricos estan empaquetados en sus cubiertas

• Las bandas tienen un menor contenido de G-C que los espacios intermedios (interbandas). • Los genes se concentran en las interbandas, ricas en G-C.

• La longitud del DNA que se puede incorporar a un virus depende de la estructura de su casco. • El acido nucleico del casco esta muy condensado. • Los virus de RNA filamentosos condensan el genoma de RNA conforme ensamblan el casco a su alrededor. • Los virus de DNA esferico insertan el DNA en una cubierta proteinica preensamblada.

• Los sitios de expresion genica de los cromosomas en escobillon muestran asas que se extienden a partir de su eje.

El genoma bacteriano es un nucleoide • El nucleoide bacteria no es -80% DNA en cuanto a masa, y puede ser desplegado por agentes que actuan en el RNA o las proteinas. • Las proteinas que condensan el DNA no han sido identificadas.

El genoma bacteriano esta superenrollado • El nucleoide tiene -100 dominios independientes superenrollados negativamente. • La densidad promedio del superenrollamiento es -1 superhelice/100 bp.

El DNA eucari6tico tiene asas y dominios unidos a un bastidor

Los cromosomas politenicos se expanden en sitios de expresi6n genica • Las bandas son sitios de expresion genica en cromosomas politenicos que se expanden para dar Lug ar a "a bultamientos".

El cromosoma eucari6tico es un dispositivo de segregaci6n • Un cromosoma de eucariota se mantiene en el huso mitotico por union de microtubulos al cinetocoro, que se forma en su region centromerica. • Los centromeros a menudo tienen heterocromatina rica en secuencias de DNA satelite.

Los centr6meros pueden contener DNA repetitivo

• El DNA de la cromatina de interfase esta superenrollada en forma negativa en dominios independientes de -85 kb. • Los cromosomas en metafase tienen un bastidor de proteinas al que se unen las asas del DNA.

Secuencias especificas unen el DNA a una matriz de interfase

S. cerevisiae son cortas

La cromatina se divide en eucromatina y heterocromatina • Los cromosomas individuates se observan solo durante la mitosis. • En la interfase, la masa general de la cromatina esta en forma de eucromatina, con empaquetamiento menos compacta que los cromosomas en mitosis. • Las regiones de heterocromatinas se mantienen densamente empaquetadas durante la interfase. ~

Los cromosomas politenicos fo rman bandas • Los cromosomas politenicos de los dipteros tienen una serie de bandas que se pueden usar como mapa citologico.

• Los centromeros de los cromosomas de eucariotas superiores contienen grandes cantidades de DNA repetitivo. • Se desconoce la funcion del DNA repetitivo.

• El DNA esta unido a la matriz nuclear en secuencias especificas llamadas MAR o SAR. • Las MAR son ricas en A-T, pero no tienen una secuencia de consenso especifica.

&r.r..

Los cromosomas en escobill6n se extienden

Las secuencias de DNA de los centr6meros de • En 5. cerevisiae, los elementos CEN se identifican por la capacidad de permitir que un plasmido se segregue de manera precisa en la mitosis. • Los elementos CEN consisten en las secuencias cortas conservadas CDE-I y CDE-III, las cuales flanquean una region CDE-III rica en A-T.

El centr6mero se une a un complejo proteinico • En CDE-II se forma un complejo proteinico especializado alterno a la estructura usual de la cromatina. • El complejo proteinico CBF3 que se une a CDE-III es indispensable para la funcion del centromero. • Las proteinas que conectan esos dos complejos podrian proporcionar la conexion para los microtubulos.

Los cromosomas tienen patrones de banda

Los tel6meros tienen secuencias de repetici6n simples

• Ciertas tecnicas de tincion hacen que los cromoso mas parezcan una serie de estrias llamadas bandas G.

• Para la estabilidad del extrema cromos6mico, se requiere el telomero.


729

• Un tel6mero es una repetici6n sencilla en la que una cadena rica en C +A tiene la secuencia c,,(A/T),_,.

• El componente RNA de la telomerasa tiene una secuencia que se aparea co n repeticiones ricas en C +A. • Una de las subunidades proteinicas es una transcriptasa inversa que utiliza al RNA como moldE para la sintesis de la secuencia rica en G + T.

Los tel6meros sellan los extremos de los cromosomas • La proteina TRF2 cataliza una reacci6n en que la unidad repetida 3' de la cadena rica en G + T forma un asa por desplazamiento de su hom6loga en una region de flujo ascendente respecto del tel6mero.

Dm

Los tel6meros son sintetizados par una enzima ribonucleoprotefnica

6i6)

Los tel6meros son indispensables para la supervivencia Resumen

• La telomerasa hace uso del 3'- OH de La cadena telomerica G + T para cebar La sintesis de repeticiones seriadas de tipo TIGGGG.

Ill

en el espacio disponible. Este fen6meno contrasta .:...·

Introducci6n

En Ia organizaci6n de todo material genetico celular es evidente un principia general, se trata de una masa compacta confinada en un volumen limitado, y sus diversas actividades, como replicacion y transcripcion, deben tener Iugar en ese espacio. Por otra parte, Ia organizaci6n del material debe ajustarse a transiciones entre un estado de inactividad y otro de actividad . El estado condensado del acido nucleico resulta de su union con proteinas basicas, cuyas cargas positivas neutralizan las cargas negativas del acido nucleico. La estructura del complejo nucleoproteinico depende de las interacciones de las proteinas con el DNA (o RNA) . El empaquetado del DNA, en fagos, virus, celulas bacterianas y nucleos de eucariotas, resulta en un problema comun. La longitud del DNA (o en el caso de algunos virus, el RNA) como molecula extendida rebasarfa con mucho las dimensiones del compartimiento que la contiene, de modo que tendrfa que comprimirse exageradamente para caber

loiTt~-

.. , ... •

Compartimiento

Forma

Dimensiones

TMV

filamento

0.008 x 0.3

Fagofd

filamento

0.006 x 0.85 ~m

Adenovirus

icosaedro

0.07 [.lm de diametro Un DNA dicatenario

11

Fago T4

icosaedro

0.065 x 0.10 ~m

Un DNA dicatenario

55 .um = 170.0 kb

E. coli

cilindro

1.7 x 0.65

Un DNA dicatenario

1.3 mm = 4.2 x 103 kb

Mitocondria (humana)

esferoide en oblea

3.0 x 0.5 [.Lm

-10 DNA dicatenarios identicos

50

Nucleo (humano)

esferoide

6 11m de diametro

46 cromosomas de DNA dicatenario

FICU 28 circundante.

730

...

~·~· ~

la imagen tipica del DNA de una doble helice extendi,· pero su deformaci6n estructural a! plegarse en una Jon mas compacta es la regia, mas que la excepci6n. La magnitud de la discrepancia entre la lon 500 mg/ml. Tal concentracion en soluci , -

~m

~m

Tipo de acido nucleico

Longitud

Un RNA monocatenario

2

Un DNA monocatenario

2 [.Lm = 6.0 kb

~m =

~m

2.64 kb

= 35.0 kb

~m =

16.0 kb

1.8 m = 6 x 1os kb

La longitud del acido nucleico es mucho mayor que las dimensiones del compartimiento

CAPITULO 28 Cromosomas

serfa equivalente a un gel de gran viscosidad. Se desconocen las implicaciones fisiologicas, como su efecto en Ia capacidad de las protefnas para hallar sus sitios de union en el DNA. El empaquetamiento de Ia cromatina es flexible y cambia durante el ciclo celular eucariotico. En el momento de la division (mitosis o meiosis), el material genetico se empaqueta todavfa mas densamente, de modo que los cromosomas son identificables. La compresion global del DNA suele describirse mediante la raz6n de empaque, que corresponde a la longitud del DNA dividida entre Ia longitud de Ia unidad que Ia contiene. Por ejemplo, el cromosoma humano mas pequeiio contiene -4.6x 107 bp de DNA (-10 veces el tamaiio del genoma de Ia bacteria E. coli), lo cual equivale a 14 000 micras (= 1.4 em de DNA extendido). En el momento de Ia mayor condensadon de la mitosis, el cromosoma tiene -2 p de longitud, asf que la razon de empaque del DNA en el cromosoma puede llegar hasta 7 000. Las razones de empaque de las estructuras globales mas amorfas del nucleoide bacteriano o la cromatina eucariotica no pueden ser tan exactas, pero el resultado puntual usual suele ser que los cromosomas en mitosis tengan un empaquetado cinco o diez veces mas denso que la cromatina de interfase, lo cual indica una razon de empaque tfpico de l 000 a 2000. Una cuestion importante aun sin respuesta se refiere a Ia especificidad del empaquetado. (.El DNA se pliega en un patron particular o es diferente para cada copia del genoma? (.Como cambia el patron del empaque cuando se replica o transcribe un segmento del DNA?

Los genomas v1ricos estan empaquetados en sus cubiertas Conceptos principales • La longitud del DNA que se puede incorporar a un virus depende de la estructura de su casco. • El acido nucleico del casco esta muy condensado. • Los virus de RNA filamentosos condensan el genoma de RNA conforme ensamblan el casco a su alrededor. • Los virus de DNA esferico insertan el DNA en una cubierta proteinica preensamblada.

Desde la perspectiva del empaquetado de cada secuencia, hay una diferencia importante entre un genoma celular y un virus. El tamaiio del genoma celular es esencialmente indefinido, pues el numero y localizacion de las secuencias individuales puede cambiar por duplicacion, delecion y reestructura -

cion, o sea que se requiere de un metodo generalizado de empaquetamiento del DNA insensible a! contenido o Ia distribucion total de Ia secuencia. Por el contrario, dos instrucciones definen las necesidades de un virus. La cantidad de acido nucleico por empaquetar depende del tamaiio del genoma y debe adaptarse a una de cubierta ensamblada por una o varias protefnas codificadas por los genes vfricos. El aspecto superficial de una partfcula vfrica es falazmente simple; el genoma de acido nucleico esta contenido en una capside, o estructura simetrica, o casi simetrica, ensamblada a partir de una o unas cuantas protefnas. A la capside se unen (o se incorporan a ella) otras estructuras, las cuales se ensamblan a partir de protefnas diferentes y que son necesarias para la infeccion de Ia celula hospedadora. La estructura de Ia partfcula vfrica es muy compacta, ya que rara vez el volumen interno de Ia capside es mucho mayor que el del acido nucleico que contendra; !a diferencia suele ser menor del doble y a menudo, el volumen interno es apenas mayor que el del acido nucleico. En su forma mas extrema, Ia restriccion de que la capside se ensamble con protefnas codificadas por el virus, indica que toda la cubierta se construye a partir de un solo tipo de subunidad. Las reglas de ensamblaje de subunidades identicas en estructuras cerradas restringe la capside a uno o dos tipos. En el primer caso, las subunidades de protefna se apilan secuencialmente en forma helicoidal para constituir una estructurafilamentosa o cilindrica, mientras que en el segundo, forman una cubierta seudoesferica, una estructura similar a un poliedro con silnetria icosaedrica. Algunas capsides vfricas se ensamblan a partir de mas de un tipo de subunidad protefnica, y si bien esto amplfa los tipos exactos de estructuras que se pueden formar, las capsides vfricas aun se apegan a las clases generales de filamentos cuasicristalinos o icosaedros. Hay dos tipos de soluciones a! problema de como construir una capside que contenga un acido nucleico: • La cubierta protefnica se puede ensamblar en torno al acido nucleico, de modo de condensar el DNA o el RNA por interacciones protefna-acido nucleico durante el proceso de ensamblaje. • La capside se puede construir a partir de esos componentes en forma de cascaron vado, en el cual se insertara el acido nucleico, que se condensa conforme entra. En los virus de RNA monocatenario, !a capside se ensambla en torno a! genoma segun el principia de que la posicion del RNA dentro de la capside es de28.2 Los genomas viricos estan empaquetados en sus cubiertas

731

El RNA se enrolla en una helice

La procabeza I tiene un centro de proteina

0

La procabeza II esta vacia

Se inicia el empaquetamiento del DNA

G)

El casco se expande conforme au menta el DNA

J Mediante apilado de subunidades prote\nicas en el virion se crea una via helicoidal para el RNA del TMV.

terminada directamente por su union con las proteinas de !a cubierta. El ejemplo mejor caracterizado es el de TMV (virus del m osaico del tab a co ), en el cuaL el ensamblaje se inicia con una horquilla doble que yace en Ia secuencia del R.!'JA. A partir de ese centro de nucleaci6n, procede de manera bidireccional en el RNA hasta llegar a los extremos. La unidad de Ia capside es un disco de dos capas, cada una de las cuales contiene 17 subunidades proteinicas identicas. El disco es una estructura circular que, al interactuar con el RNA, forma una helice. En el centro de nucleaci6n, la horquilla de RNA se inserta en el orificio central del disco y este cambia de conformaci6n, a una estructura helicoidal que rodea al RNA. Se agregan discos adicionales, cada uno de los cuales !leva una nueva cadena de RNA hacia su orificio central. El RNA se enrolla de forma helicoidal dentro de Ia cubierta de proteina como se ilustra en la r Las capsides esfericas de los virus de DNA se ensamblan de forma diferente, siendo el ejemplo caracterfstico los fagos lambda y T4, en cuyo caso, una cubierta vacia se ensambla a partir de un pequeno conjunto de proteinas. A continuaci6n, elgmoma doble se inserta en Ia cabeza, proceso que se acompafi.a de un cambia estructural en Ia capside. En Ia se resume el ensamblaj e del virus lambda, el cual empieza con un pequefi.o casco que contiene una proteina "medular" y que se transforma en un casco vado de forma caracterfstica. En ese pun to se inicia el empaquetado del DNA el casco aumenta de tamafio, aunque conserva Ia misma forma, hasta que toda Ia cabeza se sella por Ia adici6n de Ia cola. 732


~

Partfcula de fago madura

El casco alcanza su tamafio oomploto ~

La madu raci6n del fa go lambda pasa par var:: eta pas. La cabeza vac\a cambia de forma y se expande cuan:: se llena de DNA. Las micrograftas electr6nicas muestran .E.: particulas al inicio y al termi no de la via de maduraci6n. Foe grana superior reproducida de Cue, D. y Feiss, M. 1993, Pre Nat/. Acad. Sci. USA, 90:9290-9294. Copyright 1993, Natior. :_ Academy of Sciences U.S.A. Imagen cortesia de Michael :: Feiss, University of Iowa. La imagen inferior es cortesia -= Robert Duda, University of Pittsburgh.

Un DNA dicatenario que cubre distancias conG.; es un cilindro bastante rfgido que de todas fo rma. debe comprimirse en una estructura compacta pa.:-~ ajustarse al interior de Ia capside. Seria bueno sa be~ si el empaquetado impli ca un enrollado ligero d(:' DNA dentro de Ia cabeza o si necesita flexiona r ::abruptamente . La inserci6n del DNA en una cabeza de fag implica dos tipos de reacci6n, translocaci6n y cor. densaci6n, ambas desfavorables desde el punto G.vista energetico. La translocaci6n es un proceso activo en el qt; el DNA es llevado al interior de Ia cabeza por li:mecanismo dependiente de ATP; el mecanismo u .:lizado es comun para muchos virus que se replica::. mediante enrollamiento circular para generar largo.., colas que contienen multfmeros del genoma vfr' ·

co. El ejemplo mejor caracterizado es el del fago lambda, cuyo genoma es empaquetado en Ia capside vacfa porIa enzima terminasa, proceso que se resume en Ia La terminasa fue detectada por primera vez merced a su participacion en Ia generacion de extremos del fago lineal de DNA por escision en sitios cos (nombre que refleja el hecho de que genera extremos cohesivos con colas complementarias de una sola cadena). El genoma del fa go codifica dos subunidades que constituyen Ia terminasa, una de las cuales se une a un sitio cos, punta en que se une a Ia otra subunidad, la cual corta el DNA. La terminasa se ensambla en un heterooligomero dentro de un complejo que tambien incluye IHF (factor de integracion del hospedador, dfmero codificado por el genoma bacteriano). Despues se une a una capside vacfa y aprovecha Ia hidr6lisis de ATP para impulsar Ia translocacion a lo largo del DNA, hasta llevarlo al interior de la capside vacfa. Otro metoda de empaquetado utiliza un componente estructural del fago. En el fago
La terminasa se une al sitio cos en el DNA

Se escinde el DNA

La terminasa recluta Ia capside

La terminasa transloca al DNA en el interior de Ia capside

La proteina terminasa se une a sitios especificos en un multimero de genomas viricos generales par replicaci6n de un circulo rodante. Carta el DNA y se une a una capside virica vacia, para despues utilizar la energia de la hidr6lisis de ATP con elfin de insertar el DNA en la capside.

memos de modo de garantizar que el proceso de ensamblaje elija una copia de cada molecula diferente para formar un conjunto completo de informacion genetica . En el caso mas sencillo del fago
733

difiere del empaquetado de un segmento unico de acido nucleico en una cipside de forma fijas. La via de ensamblaje de los virus cuyas capsides tienen solo una forma autentica puede ser desviada por mutaciones que dan Iugar a Ia formacion de particulas m o nstruo sas aberrantes, en las cuales, Ia cabeza es mayor de lo usual. Esas mutaciones muestran que una proteina de Ia capside, tiene capacidades intrinsecas para ensamblarse en un tipo particular de estructura, pero el tamafio y Ia forma exactos pueden variar. Algunas de esas mutaciones ocurren en genes que codifican fa ctore s de ensamblaje necesarios para la formaci on de Ia cabeza, pero que no son parte del casco. Tales proteinas auxiliares limitan las opciones de Ia protefna de Ia capside, de manera que se ensambla solo a lo largo de Ia vfa deseada. En el ensamblaje de Ia cromatina celular se emplean proteinas comparables (vease Cap. 29, Nucleosomas).

Si bien las bacterias no muestran estructuras con las caracteristicas morfologicas definidas de los cromosomas eucarioticos, de todas formas los genomas

estan organizados en cuerpos definidos. El mater! · genetico se ve como un conjunto bastante m ::....pacto (o una serie de conjuntos), que ocupa cas: 3 3% del volumen de las celula. En Ia u A2 muestra el corte delgado de una bacteria en el c;,..:. es evidente dicho nucleoide. Cuando se lisa E. coli, se liberan fibras en fo r ~ de asas unidas a Ia envoltura rota de Ia celula. Cm:: puede observarse en Ia , el DNA de eS"' · asas no muestra una forma extendida dicatena:-- · sino compacta, por su vinculo con proteinas. De E. coli se han aislado varias proteina s :. union con el DNA que superficialmente se aseme'_;_,; a las protefnas de cromosomas eucarioticos. c: ~ ~ criterios deberian aplicarse para decidir si una pc- tefna que se une al DNA tiene participacion estL tural en los nucleoides? Deberfa haber cantid a c.~ suficientes como para que se una a to do el genof!"; · y las mutaciones de su gen deberfan modifica r c alguna forma Ia estructura o las funciones vin n:~ das con Ia supervivencia del genoma (por ejem _ segregacion a celulas hijas). Ninguna de las pos itL proteinas cumple a{m las condiciones geneticas. La protefna HU es un dimero que tal vez cu:densa el DNA al envolverlo en una estructura sic Jar a una burbuja y que tiene relacion con IHF, li.presenta actividad estructural para Ia formacion : un complejo proteinico en reacciones especializa .: de recombinacion. Las mutaciones nulas en ct:..:.. quiera de los genes que codifican las subunidade5 : HU (hupA y -B) tienen poco efecto, pero !a pe nU~ de ambas funciones da Iugar a un fenotipo sensi: al frio y cierta perdida de Ia estructura helicoidal e el DNA. Esos resultados dan Iugar a Ia posibilido:

Un corte delgado muestra el nucleoide bacteriano como masa compacta en el centro de la celula. Imagen cortesia de Molecular and Cell Biology Instructional Laboratory Program, University of California, Berkeley.

El nucleoide se vierte fuera de una f. coli lis~:.: en forma de asas de una fibra. Fotografia © G. Murti/P il ~:..;, Researchers, Inc.

Ill

El ge no ma bacteriano es un nucleoide

Conceptos principales • El nucleoide bacteria no es ~80% DNA en cuanto a masa, y puede ser desplegado par agentes que actuan en el RNA o las proteinas. • Las proteinas que condensan el DNA no han sido identificadas.

734


de que intervenga de forma general en la conde nsaci6n del nucleoide. La protefna HI (tambien conocida como H-NS) se une a! DNA interactuando preferentemente con secuencias plegadas. Las mutaciones en su gen han resultado en diversas formas (osmZ, bglY, pilG), cada una identificada como regulador aparente de u n sis tema diferente. Dichos resultados tal vez reflejen el efecto que HI produce en la topologfa local del DNA que incide en Ia expresi6n genica dependiente de un promotor en particula r. Serfa de esperar que Ia ausencia de una protefna necesaria para la estructura del nucle oide tuviera graves efectos a Ia viabilidad, (.par que entonces los efectos en las deleciones de los genes para las proteinas HU y HI son relativamente restringidos? Una explicaci6n es que dichas proteinas son redundan tes, y una sola puede sustituir a las otras, de manera que se necesitarian deleciones en todas ell as para modifi car notoriamente la estru ctura del nucleoide. Otra posibilidad es que aun no se han identificado la s protefnas encargadas de las principales caracterfsticas de la integridad del nucleoide, el cual se puede aislar directamente en forma de complejo de sedim entaci6n muy rapida constituido por -80 % DNA por masa. (Los complejos analogos en eucariotas tienen -50% DNA por masa; vease la secci6n 28.4, El genoma bacteriano esta supere nrollado); puede ser desplegado por tratamiento con reactivos que actua n sobre el RNA o las protefna s, cuya posible participaci6n en Ia estabilizaci6n de esta estructura es evidente; el papel del RNA ha sido bastante re fractario al analisis.

En un DNA cerrado natural cuyo superenro llamiento es negativo, el intercalado de bromuro de etidio elimina primero la s sup erhelices negativas y despues introduce supe rhelices pasitivas. La cantidad de bromuro de etidio necesari a para llegar a un superenrollamiento de cera es un parametro de la densidad original de las superhelices negativas . El nucleoide compacto presenta algunas hendiduras durante su aislamiento, las cuales tambien pu eden generarse por tratamientos limitados con deso xirribonucleasa, con lo cuaL sin embargo, el bromuro de etidio no pierde su capacidad de introducir superhelices positivas. Esta capacidad del genoma de conservar su respuesta al bromuro de etidio ante las hendiduras significa que debe tener muchos domini os cromos6mico s independientes, y que en cada dominio, el superenrollamiento no resulta afectado por lo que sucede en los otros. Esta autonomfa su giere que la estructura del cromosoma bacteriano tiene Ia orga nizaci6n general que se muestra esquematicamente en la Cada dominio consta de un asa de DNA cuyo s extre mos se aseguran de alguna forma (desconocida) que no permite que se propaguen los sucesos rotativos de un dominio a otro. En los primeros informes se sugerfa que los do minios constan de -40 kb de DNA, pero en analisis mas recientes se sugiere que pueden ser mas pequefios, de - 10 kb cada uno, o -400 dominios en el genoma de E. coli. Los extremos de los dominios parecen distribuidos de manera aleatoria, y no localizados en sitios predeterminados del cromosoma.

El genoma bacteriano esta superenro llado Conceptos principales • El nucleoide tie ne -100 dominies independientes superenrellades negativamente. • La densidad promedie del superenrellamiente es - 1 superhelice/100 bp .

El DNA del nucleoide bacteriano aislado in vitro se com porta como una estructura doble cerrada, a juzgar por su respu esta al bromuro de etidio. Esa pequefia molecula se intercala entre pares de bases para generar giros superhelicoidales positivos en moleculas de DNA circular "cerradas", esto es, en moleculas donde ambas cadenas tienen integridad covalente . (En las moleculas circulares "abiertas" que incluyen una hendidura en una cadena o en moleculas linea les, el DNA puede rotar libremente en respuesta ala intercalaci6n, aliviando asf la tension.)

un mecanisme desconocido El asa consta de DNA dicatenario condensado por protefnas basicas

El genoma bacteriane consta de un gran numero de asas de DNA dicatenario (en forma de fibra); cada una de las cade nas se ancla en la base para formar un dominio estructural independiente.

28.4 El genema bacteriano esta superenrollado

735

No comprimida, Ia via esta superenrollada en el espacio y crea tension La via comprimida esta superenrollada en torno a las proteinas, pero no crea tension Una superhelice sin restriccion en la via del DNA crea tension, pero esta no se transmite a lo largo del DNA cuando una superhelice se restringe por union con proteinas.

La existencia de dominios independientes podria permitir que se mantuvieran diferentes grados de superenrollamiento en regiones diferentes del genoma, que tal vez sea importante a! considerar las diferentes susceptibilidades de ciertos promotores bacterianos ante el superenrollamiento (vease seccion 11.15, El superenrollamiento es una caracteristica importante de la transcripcion). Como se muestra en la r, , en el genoma, el superenrollamiento puede, en principio, asumir una de dos formas: • Si un DNA superenrollado esta libre, su via no tiene restricciones y las superhelices negativas generan un estado de tension por torsion que se trasmite libremente a lo largo del DNA en un dominio, tension que se alivia por el desenrollamiento de la doble helice, como se describe en Ia seccion 19 .12, El superenrollamiento afecta Ia estructura del DNA. El DNA se encuentra en equilibria dinamico entre el estado de tension y el de desenrollado. • El superenrollamiento puede constrefiirse si las proteinas se unen al DNA para mantenerlo en una configuracion tridimensional particular, en cuyo caso, las superhelices estaran representadas por !a via que sigue el DNA en su vfnculo fijo con las protefnas. La energfa de la interaccion entre las protefnas y el DNA superenrollado estabiliza el acido nucleico, de manera que no se transmita tension por la molecula. ;Jn vivo las superhelices del DNA de E. coli estan comprimidas o la doble helice esta sujeta ala tension por torsion caracterfstica del DNA libre? Las mediciones del superenrollamiento in vitro se enfrentan al problema de que las protefnas que comprimen podrfan haberse perdido durante el aislamiento. En

736


varios enfoques se sugiere que, in vivo, el DNA estc sometido a estres por torsion. Uno de los enfoques es determinar el efect de las hendiduras en el DNA. Las superhelices n comprimidas se liberan por medio de hendidura" en tanto que las comprimidas no resultan afecta · das. Las hendiduras liberan -50% del superenrollamiento general, lo cual sugiere que casi Ia mitac del superenrollamiento se transmite como tensi6.· a lo largo del DNA, y la otra mitad es absorbida po: Ia union con proteinas. En otro enfoque se utiliza el psoraleno, reactiY de enlace cruzado, que se une mas facilment e ;;. DNA cuando se encuentra bajo tension por torsio 1~ La reaccion del psoraleno con el DNA de E. coli :· vivo cm·responde a una densidad promedio de u:giro superhelicoidal negativo/200 bp (a= -0.05 ). Tambien es posible analizar la capacidad de Ia. . celulas de formar estructuras alternas de DNA, p ejemplo, para generar estructuras cruciformes esecuencias palindromicas. A partir del cambia dt numero de enlaces que se requiere para llevar : cabo tales reacciones, es posible calcular la dens:. dad del superenrollamiento original, abordaje qu :sugiere una densidad promedio de G = -0.025 o u:giro super helicoidal negativo/1 00 pares de bases. Por tanto, las super helices crean tension por to:- · sion in vivo; podrfa haber variaciones acerca de u:nivel promeclio, y es dificil medir la variedad preci.s..: de densidades. No obstante, es obvio que el nivel b
El DNA eucari6tico tiene asas dominios unidos a un bastidorConceptos principales • El DNA de la cromatina de interfase esta superenrollado eforma negativa en dominios independientes de ~85 kb. • Los cromosomas en metafase tienen un bastidor de proteinas al que se unen las asas del DNA.

La cromatina de interfase es una masa enmarafiada de DNA que ocupa gran parte del volumen nuclear, a diferencia de Ia otra estructura tan organizada y reproducible de los cromosomas mit6ticos. (.Que controla la distribucion de la cromatina de interfase en el nucleo? El aislamiento del genoma como cuerpo com pacta unico proporciona ciertas pruebas indirectas de su naturaleza. Aplicando la misma tecnica perfeccionada para el aislamiento del nucleoide bacteriano (vease Ia seccion 28.4, El genoma bacteriano esta supe renrollado) , es posible lisar los nucleos sobre un gradiente de sacarosa, de modo de liberar el genoma de forma que pueda conectarse por centrifugaci6n. Despues de aislarlo de Drosophila melanogaster, es posible visualizarlo como una fibra de pliegues compactos (de l 0 nm de diametro) constituida de DNA unida a proteinas. El superenrollamiento medido por su respuesta a! bromuro de etidio corresponde casi a una superhelice negativa/200 bp. Esas superhelices pueden eliminarse mediante hendiduras de desoxirribonucleasa, si bien el DNA conserva la forma de Ia fibra de l 0 nm, lo cual sugiere que el superenrollamiento se debe a la disposici6n de Ia fibra en el espacio, y que representa la torsion presente. La relajacion completa de las super helices implica una hendidura/85 kb, de modo de identificar Ia longitud promedio del DNA "cerrado". Dicha region podrfa constituir un asa o dominio de caracterfsticas similares a los identificados en el genoma bacteriano. Las asas se observan directamente cuando Ia mayor parte de las protefnas es extrafda de los cromosomas mit6ticos. El complejo resultante consta de DNA vinculado con -8% del contenido de protefna original. Como se observa en la , los cromosomas sin proteinas adoptan Ia forma de un · bastidor central rodeado de un halo de DNA. El bastidor en metafase consta de una red densa de fibras, del cual emana DNA, aparentemente en forma de asas de 10 a 30 pm (30 a 90 kb) de longitud promedio. El DNA puede ser digerido sin afectar Ia integridad del bastidor, que consta de un conjunto de protelnas espedficas, lo cual sugiere una forma de organizacion en Ia cual asas de DNA de -60 kb se anclan en un bastidor proteinaceo central. El aspecto del bastidor simula un par de cromatides hermanas mitoticas, el cual suele tener una conexion muy estrecha (aunqu e en ocasiones las hermanas estan separadas) y estar unido solo por unas cuantas fibras. (.Podria ser esta Ia estructura encargada de mantener Ia forma de los cromosomas durante la mitosis? (.Podria generarse por union de los componentes proteinicos que suelen asegurar las bases de las asas en la cromatina de interfase?

Los cromosomas sin histonas constan de un bastidor prote1nico al que se anclan las asas de DNA. Reproducida de Cell, vol. 12, Paulson , J. R., y Laemmli , U.K ., The structure of histone ..... , pp. 817-828. Copyright 1977, con autorizaci6n de Elsevier. Imagen cortes1a de Ulrich K. Laemmli, University of Geneva, Switzerland.

Secuencias especificas unen el DNA a una matriz de interfase Conceptos principales • El DNA ·esta unido a la matriz nuclear en secuencias espec1ficas llamadas MAR o SAR. • Las MAR son ricas' en A-T, pero no tienen una secuencia de consenso espec1fica.

(.Se une el DNA al bastidor mediante secuencias especificas? Los sitios de DNA unidos a estructuras proteinaceas en nucleos de interfase se llaman MAR S (regiones de urti6n con la matriz), o bien SAR (reg iones de union con el bastidor). Se desconoce Ia naturaleza de la estructura celular en interfase a Ia que se conectan. La cromatina a menudo parece unida a una mattiz y se ha sugerido mucho que esa union es necesaria para Ia transcripcion o replicaci6n. Cuando los nucleos carecen de protefnas, el DNA se expulsa como as as des de una estructura proteinacea residuaL pero los intentos por relacionar las protefnas que se encuentran en esa preparaci6n con elementos estructurales de celulas fntegras no han tenido exito. (.Region es espedficas del DNA estan relacionadas con esa matriz?

28.6 Secuencias espec1ficas unen el DNA a una matriz de interfase

73 7

Se prepara el nucleo

I

•

Extracci6n de histonas

c'-100 Escisi6n con nucleasas de restricci6n

Fragmentaci6n de todo el DNA con desoxirribonucleasa

)

'» ~V

Y-MAR -Matriz 1'1/\f\~

_ _,...

......

,' \...'

I Adici6n

~ de

DNA

Extracci6n y analisis de DNA

Las regiones vinculadas con la matri z se pueden identifica r par caracterizaci6n del DNA rete nido por la matriz aislada in vivo o par identificaci6n de los fragmentos que pueden unirse a la matriz de la que se ha eliminado todo el DNA.

Los abordajes in vivo e in vitro se resumen en la • . Amb os se inician por aislamiento de Ia matriz como preparado nuclear crudo que contiene proteinas nucleares y cromatina, de modo que entonces se pueden usar diferentes tratamiento s para caracterizar el DNA de Ia matriz o identificar el que puede unirse a ella. Para analizar el MAR existente, es posible descondensar las asas cromosomicas por extraccion de las protefnas, y al eliminar aquellas mediante un tratamiento con nucleasas de restriccion, quedan solo secu encias MAR in vivo (supuestas) unidas a la matriz. El abordaje complementario consiste en elirninar todo el DNA de la matriz por tratamiento con una desoxirribonucleasa, momenta en que se puede estudiar la capacidad de los fragmentos aislados del DNA para unirs e a la matriz in vitro. Las mismas secuencias deberian vincularse con la matriz in vivo o in vitro. Una vez que se ha identificado un MAR potenciaL se puede determinar el tamano de Ia region mfnima necesaria para elvinculo in vitro mediante de leci ones, lo cual permitira identificar protefnas que se unen a las secuencias MAR.

738

CAPITULO 28 Cromoso mas

Una caracterfstica sorprendente es Ia falta de conservacion de secuencia en fragmentos MAR: suelen ser -70% ricas en A-T, pero carecen de secuencias de consenso desde otros puntas de vista. Sin embargo, otras secuencias interesantes se encuentran a menudo en la cadena de DNA qu e contiene laMAR. Los sitios de accion en configuraci6n cis que regulan la transcripci6n son frecuentes, y suele haber un sitio de reconocirniento de la topoisomerasa II en MAR. Por ello es posible qu e esta ultima desempene mas de una funcion, pue;; proporciona un sitio de union con Ia matriz y con tiene otro donde se efectuan cambios topologicos del DNA. (. Cual es la relaci6n entre el bastidor de cromosomas de las celulas en division y la matriz de las celulas de interfase? e,Las mismas secuencias de DNA estan unidas a ambas estructuras? En varios casos. los mismos fragmentos de DNA que se encuentrar. en la matriz nuclear in vivo pueden recuperarse de: bastidor en metafase, y los fragmentos que contienen secuencias MAR pueden unirse a un bastidor en metafase, de manera que parece probable qu e el DNA contenga un solo tipo de sitio de union. Er. celulas de interfase, el sitio de union Se COnecta COI:. la matriz nuclear, en tanto que en celulas mitotica ~ hace lo propio con el bastidor del cromosoma. La matriz nuclear y el bastidor cromosomico constan de diferentes proteinas, si bien hay algunos: componentes comunes. La topoisomerasa II es UJ: destacado componente del bastidor cromosomico y constituyente de la matriz nuclear, lo cual sugiere que el control de la topologia es importante en ambos casos.

Ell

La cromatin a se divide en eucromatina y heterocro matina

Conceptos principales • Los cromosomas individuales se observan s6lo dtuante la mitosis. • En la interfase, la masa general de la cromatina esta en forma de eucromatina, con empaquetamiento menos compacta que los cromosomas en mitosis. • Las regiones de heterocromatinas se mantienen densamente empaquetadas durante la interfase.

Cada cromosoma tiene un solo DNA dicatenari o muy largo, lo cual explica porque la replicaci6n cromosomica es semiconservadora, como la molecula de DNA individual. (Esto no necesariamente serfa el caso si un cromosoma porta muchas molecula ind epend ientes de DNA.) El DNA dicatenario unic se pliega en una fibra que recorre continuamente e:

.....

I

f

t

•

Un corte delgado a traves de un nucleo teiiido con el colorante de Feulgen muestra la heterocromatina como regiones compactas agrupadas cerca del nucleolo y la membrana nuclear. Imagen cortes\a de Edmund Puvion , Centre National de la Recherche Scientifique.

Las cromatides hermanas de un par mit6tico constan cada una de una fibra (~30 nm de diametro plegada compactamente dentro del cromosoma). Imagen cortes\a de Daniel L. Hartl, Harvard University.

cromosoma, de modo que en lo que se refiere ala cromatina de interfase y Ia estructura del cromosoma mit6tico, se tiene que explicar el empaquetado de una sola molecula de DNA extremadamente larga en una fo rma en que pueda transcribirse y replicarse, as[ como adoptar dclicamente la forma mas y menos comprimida. Los cromosomas eucarioticos individuales ennan a escena brevemente durante el acto de la division celular, solo entonces pueden verse como unidades compactas. La es una microoraffa 0 electronica de un par de cromatides hermanas captadas en m etafase. (Las cromatides hermanas son cromosomas producidos por el suceso de replica cion previo, aun unidos en esa etapa de Ia mitosis.) Cada una consta de una fibra de -30 run de diametro y tiene aspecto nudoso. El DNA esta de cinco a diez veces mas condensado en los cromosomas que en Ia cromatina de interfase. Sin embargo, durante Ia mayor parte del ciclo vital de Ia celula eucariotica, su material genetico ocupa una zona del nucleo donde no se pueden distinguir cromosomas individuales. La estructura de la cromatina de interfase no cambia visiblemente entre divisiones, no hay una rotura evidente durante el periodo de replicacion, cuando la cantidad se duplica. La cromatina es fibrilar, si bien es diffcil discernir en detalle su configuracion general en el espacio, pero es similar, o identica, a Ia de los cromosomas rnitoticos. Como puede observarse en el corte nuclear de Ia , Ia cromatina se divide en dos tipos de material:

• En casi todas las regione s, las fibras estan menos densamente empacadas que en los cromosomas mitoticos, material denominado eucromatina, que parece relativamente disperso en el nucleo y que ocupa Ia mayor parte de este en Ia Figura 28.12. • Algunas regiones de la cromatina estan muy densamente empaquetadas con fibras, lo cualles confiere un estado comparable a! de los cromosomas durante Ia mitosis, material denominado heterocromatina, que por lo general esta en los centromeros, pero tambien en otras localizaciones. Experimenta el ciclo celular con relativamente pocos cambios en cuando a condensacion. En la Figura 28.12 forma una serie de cL1mulos bien definidos, pero a menudo las diversas reoioo nes de heterocromatina se acumulan en un cromoceritro, densam ente tenido. (Esta descripcion se aplica a regiones que siempre son heterocromaticas y constituyen la denominada heterocromatina constitutiva· ademas, hay otro tipo de heterocromatina: la heterocromatina facultativa, en la cual, algunas regiones de la eucromatina se convierten a un estado heterocromarico.) Las mismas fibras transcurren de manera continua entre eucromatina y heterocromatina, lo cual implica que esos estados repres entan diferentes grados de condensacion del material genetico; de la misma forma, las regiones eucromaticas se encuentran en diferentes estados de condensacion durante la interfase y la mitosis. Asf, el material genetico se organi za de modo que permita mantener estados alternativos en la cromatina y cam bios cfclicos en el empaquetado de la eucromatina entre la interfase y Ia division. En el Capitulo 30, Control de la estructura de la cromatina, se describe Ia base molecular de esos estados. 28 .7 La cromatina se divide en eucromatina y heterocromatina

739

La condicion estructural del material genetico se correlaciona con su actividad. Las caracteristicas comunes de Ia heterocromatina constitutiva son: • Esta permanentemente condensada. • A menudo consta de multiples repeticion es de unas cuantas secuencias de DNA que no se transcriben . • La densidad de los genes en esa region ha disminuido mucho respecto de Ia eucromatina, y los genes se traslocan a ella o cerca de ella, a menudo desactivados. • Se replica tardiamente en la fase S y su recombinacion genetica es menos frecuente, lo cual tal vez resulte de su estado condensado. Hay algunos marcadores moleculares de los cambios de propiedades del DNA y sus componentes proteinicos (vease Ia seccion 31.3, La heterocromatina depende de interacciones con histonas), entre otros, acetilacion reducida de proteinas histonas, aumento de la metilacion de una protefna histona e hipermetilacion de bases citidina en el DNA cambios moleculares que dan Iugar ala condensacion del materiaL de lo que depende su inactividad. Aunque los genes activos estan contenidos en Ia eucromatina, solo una pequei1a parte de sus se cuencias se transcribe en cualqu ier momenta, de modo que la localizaci6n en la eucromatina es necesaria para Ia expresion genetica, pero insuficiente.

IB


Hasta que no se perfecciono esta tecnica, los cromosomas solo se distinguian por sus dimensiones generales y Ia localizacion relativa de su centro mero, pero las bandas G permiten identificar a cada cromosoma por su patron de bandas caracterfstico, que permite identificar Ia translocacion de un cromosoma a otro por comparacion con el conj unt diploide original. En Ia se muestra ur: esquema de las bandas del cromosoma X humano: estas bandas son estructuras grandes, cada una de -l 0 7 bp de DNA, posiblemente con muchos ciento_ de genes. La tecnica de bandas es de una utilidad practica enorme, pero el mecanismo sigue siendo u r: misterio. Todos lo que se sabe es que el colorante tine los cromosomas n o tratados de manera mas menos uniforme. Por tanto, Ia generacion de banda' depende de una diversidad de tratamientos que m odifica la respuesta del cromosoma (supuestamente por extraccion del componente que se une al colorante desde las regiones sin bandas). Se puede: generar bandas similares mediante tratamiento;: variados. La (mica caracteristica conocida que distingue a las bandas de las interbandas es que las primera" tienen un menor contenido de G-C, que es un resultado peculiar. Si hay -10 bandas en un crom soma grande, con un contenido total de - l 00 M el cromosoma se divide en regiones de -5 Mb de longitud que alternan con las del contenido baj (bandas) y elevado (inte rbandas) de G-C. Los gene-5 (identificados por hibridaci6n con RNAm) tienen !c. tendencia a localizarse en las regiones interbanda

Conceptos principales • Ciertas tecnicas de tinci6n hacen que los cromosomas parezcan una serie de estrias llamadas bandas G. • Las bandas tienen un menor contenido de G-C que los espacios intermedios (interbandas).

~·

• Los genes se concentran en las interbandas, ricas en G-C.

B-11r . -. 3

2

Como resultado del estado difuso de Ia cromatina, no se puede determinar directamente Ia especifi cidad de su organizaci6n, pero si in vestigar si la estructura del cromosoma (mitotica ) es ordenada. (,Siempre yacen secuencias particulates en sitios particulares o el plegamiento de Ia fibra de Ia estructura global es algo mas aleatorio? En el ambito del cromosoma, cada miembro del conjunto tiene una ultraestructura diferente y reproducible. Cuando son sometidos a ciertos tratamientos y despues se tifien con el colora me quimico Giemsa, los cromosomas generan una serie de bandas G. En Ia se presenta un ejemplo de los cromosomas humanos. 740

CAPiTULO 28 Cromosomas

c.

-1·-ls-; -

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7

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X

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Las bandas Ggeneran una serie lateral carac~ ristica de bandas en cada miembro del conjunto cromos6micc Imagen cortes\a de Lisa Shaffer, Washington State Universi_Spokane.

. .. Banda 2

2

3 2 1

p 4 3 2 1

I 1

p22.3 p22.2 p22.1

p21 p11.4 p11.3 . p11.2

Centr6mero ' q12

3

q13 q21

q 2

2 3 4 5 6 7 8

q22 q23 q24 q25 q26 q27 q28

El cromosoma X humano puede dividirse en regiones distintas segun su patron de bandas. El brazo corto es p, y ellargo, q; cada brazo se divide en regiones mas pequeiias, subdivididas. En este mapa se observa una estructura de baja resoluci6n; a mayor resoluci6n, algunas bandas se subdividen adicionalmente en bandas mas pequeiias e interbandas (p. ej., p21 se divide en p21.1, p21.2 y p21.3).

fenomeno que respalda a una organizacion dependiente de secuencias largas. La secuencia del genoma humano confirma la observacion basica. En la 'j se muestran claras fluctuaciones del contenido de G-C cuando el genoma se divide en ramas pequeiias (segmentos o tramos de DNA). El promedio de 41% de G-C es comun en los genomas de marniferos, pero hay regiones con apenas 30% o hasta con 65%. Cuando se revisan tramos mas largos, hay menos variaciones. La longitud promedio de las regiones que contienen >43% de G-C es de 200 a 250 kb, lo cual aclara que la estructura de bandas o interbandas no representa segmentos homogeneos que alternen en cuanto a contenido de G-C, si bien las bandas contienen una mayor cantidad de segmentos con contenido bajo de G-C. Los genes se concentran en regiones con un contenido mas alto de G-C. Todavia se desconoce como afecta el contenido de G-C a la estructura cromosomica.

Los cromosomas en escobill6n se extienden Concepto principal

• Los sitios de expresi6n genica de los cromosomas en escobill6n muestran asas que se extienden a partir de su eje.

8%

6% 4% 2%

30

40

50

60%

Contenido de G-C En distancias cortas hay grandes fluctuaciones en cuanto a contenido de G-C. Cada barra muestra el porcentaje de fragmentos de 20 kb con el contenido determinado de G-C.

Seria extremadamente utillocalizar la expresion genica en su estado natural para observar que cambios estructurales se relacionan con la transcripcion. La compresion del DNA en la cromatina, aunada ala dificultad de identificar genes particulares en su interior, hace imposible visualizar la transcripcion de los genes activos individuales. La expresion genica se observa directamente en ciertas circunstancias desusadas, en las cuales, los cromosomas se encuentran muy extendidos, de modo que se facilita distinguir loci individuales (o grupos). La diferenciaci6n lateral de la estructura es evidente en muchos cromosomas cuando apenas llegan para la meiosis, etapa en la que simulan una serie de cuentas ensartadas en un hilo; las cuentas son granulos intensamente teiiidos que apropiadamente se nombran crom6meros. Sin embargo, en general hay poca expresion genica durante la meiosis, y no es practico utilizar ese material para identificar las actividades de cada uno de los genes. Una circunstancia excepcional que permite estudiar el material es la constituida por los cromosomas en escobill6n, mejor caracterizados en ciertos anfibios. Los cromosomas en escobillon se forman durante una meiosis inusualmente larga que puede durar jincluso varios meses! Durante ese periodo, los cromosomas se mantienen en una forma no distendida, visible con el microscopio de luz; en un momento posterior de la meiosis, recuperaran su tamaiio compacta normal. Asi, el estado de extension brinda esencialmente una version no plegada del estado normal del cromosoma. Los cromosomas en escobillon son bivalentes meioticos, cada uno constituido por dos pares de cromatides hermanas. En la ! se muestra un ejemplo en que dichos pares casi se han separa28.9 Los cromosomas en escobill6n se extienden

741

Un cromosoma en escobill6n es un divalente mei6tico en el que dos pares de cromatides hermanas se mantienen juntas en el quiasma (indicado con flechas). Imagen cortesia de Joseph G. Gall, Carnegie Institution.

que sugiere que representan material cromosomi.: expulsado de esa organizacion mas compacta · _ cromomero. Las asas estan rodeadas por una matriz de _ bonucleoprotefnas que contienen cadenas recieformadas de RNA, y a menudo es posible defir_una unidad de transcripci6n por el aumento en :..: longitud de la RNP que se mueve en torno al a<' vease el ejemplo de la Por tanto, el asa es un segmento expulsado Gc: DNA en proceso de transcripcion activa. En cien casas se han identificado las asas que corresponde:a genes en particular; la estructura del gen trans cr..: y la naturaleza de su producto pueden analizaE= in situ.

f!m Los cromosomas politenicos forman bandas Concepto principal

• Los cromosomas politenicos de los dipteros tienen una serie de bandas que se pueden usar como mapa citol6gico.

Un asa del cromosoma en escobill6n es rodeada por una matriz de ribonucleoproteina. Reproducida de Gall, J G. et al. Mol. Bioi. Cell. Diciembre 1999, 10:4385-4402. Imagen cortesia de Joseph G. Gall, Carnegie Institution.

do, de manera que se mantienen juntos solo por los quiasmas. Cada par de cromatides hermanas forma una serie de crom6meros elipsoidales, de -l a 2 pm de cliametro, conectados por una cadena muy fina que contiene dos cadenas hermanas dobles de DNA y transcurre en forma continua por el cromosoma, a traves de los crom6meros. La longitud de los cromosomas en escobillon en la lagartija acuatica Notophtha!mus viridescens va de 400 a 800 pm, frente ala variacion de 15 a 20 pm que se observa mas tarde en la meiosis, de modo que su empaquetamiento es - 30 veces menos estrecho. La longitud total del conjunto total de cromosoma en escobillon es de 5 a 6 mm y se organiza en -5 000 cromomeros. Los cromosomas en escobillon roman su nombre de las asas laterales que abandonan los cromomeros en ciertas posiciones (simulan un escobill6n, que es un objeto extinto). Las as as se extienden por pares, una a partir de cada cromatide h ermana. Las asas forman un continuo con la cadena axil, lo 742


Los cromosomas de los nucleos de interfase de alg-- nos tejidos de la larva de mosca dfptera son mud: may ores respecto de su estado normal, tanto en di-metro como en longitud. En Ia se mu __ tra un ejemplo de un conjunto cromosomico de- '" glandula saliva! de D. me!anogaster, cuyos miembr _ se denominan cromosomas politenicos. Cada miembro del conjunto politenico consta dt> una serie visible de bandas (mas apropiadamen- c llamadas crom6meros, aunque es un termino po usado) que van de -0.5 pm de ancho lamas grande a -0.05 pm Ia mas pequeii.a (esta es distinguib c solo por microscopia eiectr6nica) y que contiene-. la mayor parte de Ia masa del DNA; se tiii.en inte .samente con los reactivos apropiados. Las regione: intermeclias son menos susceptibles a la tinci6n y Sf' denominan interbandas. El conjunto de D. melt:nogaster tiene -5 000 bandas. Los centr6meros de los cuatro cromosomas rie D. melanogaster se suman para formar un cromoce rro constituido sobre todo por heterocromatina (e _ el macho incluye el cromosoma Y completo). A esc respecto, - 75% del conjunto de DNA haploide se organiza en bandas e interbandas alternadas, co : una longitud de -2 000 pm. Extendido, el DNA llegarfa a los -40 000 pm, de manera que la raz6n de empaquetado serfa de -20, con lo que se demue tra vfvidamente la extension del material genetic respecto de los estados normales de la cromatina de interfase o cromosomas mit6ticos.

/

• • • • • • •

Los cromosomas politenicos de D. me/anogaster forman una serie alternante de bandas e interbandas. Imagen cortesla de Jose Bonner, Indiana University.

(_Que estructura tienen esos cromosomas gigan tes? Cada uno es producido por replicaciones sucesivas de un par diploide en sinapsis, pero las replicas nose separan, se mantienen unidas en estado extendido. Al inicio del proceso, el contenido de DNA de cada par de sinapsis es de 2C (donde C representa el contenido de DNA del cromosoma individual) , que entonces se duplica hasta nueve veces, para llegar a un maximo de l 024C. El numero de duplicaciones es diferente en los diversos tejidos de las larvas de D. melanogaster. Cada cromosoma se ve como un gran numero de fibras paralelas longitudinales, muy condensadas en las bandas y menos en las interbandas. Es posible que cada fibra represente un solo cromosoma haploide (C) , lo cual da lugar a! nombre de politenico, el grado de politenia c01-responde al mimero de cromosomas haploides contenidos en el cromosoma gigante. El patron de bandas es caracterfstico de cada cepa de especies de Drosophila. EI numero constante y la disposici6n lineal de las bandas se observ6 por primera vez en el decenio de 1930, cuando se detect6 que forman un mapa citol6gico de los cromosomas. Las reestructuraciones, como deleciones, inversiones y duplicaciones, resultan en modificaciones en el orden de las bandas. El arreglo lineal de las bandas es equiparable al correspondiente de los genes, de modo que las reestructuraciones geneticas, segun se observa en un mapa de enlace, pueden correlacionarse con las estructurales de los mapas citol6gicos. En ultima instancia, se puede localizar una mutaci6n determinada en una banda en particular. El numero total de genes de D. melanogaster supera a! numero de bandas, de manera que probablemente hay genes mtiltiples en casi todas las bandas. La posicion de genes especfficos en el mapa citologico suele determinarse directamente por Ia

·-·-~las

- ·-· .. ··- ··---·diana aplastadas Congelaci6n en hielo seco en Ia laminilla Lavado con etanol lnmersi6n en soluci6n de agar Desnaturalizaci6n del DNA Adici6n de sonda radioactiva Lavado de Ia sonda sin reacci6n Autorradiograffa

Celul~

~

Las zonas negras corresponden a granos de plata e identifican los sitios en que hubo hibridaci6n de Ia sonda

Mediante hibridaci6n in situ es posible identificar bandas individuates que contienen genes particulares .

tecnica de hibridaci6n in situ, cuyo protocolo seresume en la . Una sonda radioactiva que representa a un gen (con mucha frecuencia un don de DNAc marcado, derivado del RNAm) da Iugar a la hibridaci6n con el DNA desnaturalizado de los cromosomas politenicos in situ. Mediante autorradiograffa se identifican las posiciones de los genes correspondientes por Ia superposici6n de granos en una o varias bandas especificas; veanse los ejemplos de Ia . Recientemente las sondas fluorescentes han sustituido a las radioactivas, que facilitan Ia determinacion directa de la banda en Ia que yace una secuencia en particular.

fD11

Los cromosomas politenicos se expanden en sitios de expresi6n genica

Concepto principal • La s bandas son sitios de expresi6n genica en cromosomas politenicos que se expanden para dar lugar a "abultamientos".

Una de las caracterfsticas intrigantes de los cromo somas politenicos es que los sitios reactivos son vi sibles. Algunas de las bandas pasan transitoriamente por un estado de expansion en el cual simulan un abultantiento en el cromosoma, cuando material

28.11 Los cromosomas politenicos se expanden en sitios de expresi6n genica

743

... . .. '·

·El cromosoma IV del insecto C. tentans tie-~ tres anillos Balbiani en la glandula salival. Reproducido de Ce .. vol. 4, Daneholt, B., et al., Transcrip tion in polytene chromos-:mes .. ., pp. 1-9. Copyright 1975, con autorizaci6 n de Elsevie· Imagen cortesia de Bertil Daneholt, Medical Nobel Institute. ~ Vista amplificada de las bandas 87 A y 87C en que se observa la hibridaci6n in situ con DNA marcado, extraido de celulas con choque termico. Imagen cortesia de Jose Bonner, Indiana University.

cromosomico es expulsado desde el eje . En la se observan abultamientos muy grandes (llamados aniUos de Balbiani). .:_Cual es la naturaleza del abultamiento? Consta de una region en que las fibras cromosomicas se des enrollan respecto de su estado usual de empaquetamiento en las bandas, aunque mantienen su continuidad con el eje cromosomico. Los abultamientos suelen emanar de bandas unicas, si bien, cuando son muy grandes, como los anillos de Balbiani, el aumento de volumen puede ser de tal magnitud, que oculta la disposicion de las bandas subyacentes. El patron de abultantientos se relaciona con la expresion genica. Durante el desarrollo de las larvas, los abultamientos aparecen y remiten con un patron definido, especffico de tejido, de manera que, en un momento dado, se observa un patron caracterfstico en cada tejido. Los abultamientos son inducidos por Ia hormona ecdisoma, que controla el desarrollo en el genero Drosophila e induce algunos clirectamente, mientras que otros, son inducidos de manera indirecta por los productos de los primeros. Los abultamientos son sitios en que se esta si11tetizando RNA. El concepto aceptado ha sido que la expansion de la banda es consecuencia de Ia necesidad de relajacion de Ia estructura para sintetizar RNA. Por tanto, es posible considerar a los abultamientos como consecuencia de Ia transcripcion, un gen activo unico puede generar un abultamiento. 744


Los sitios de abultamiento difieren de las banda: normales en Ia acumulacion de protefnas adicicnales, por ejemplo, Ia polimerasa II de RNA y otra_ vinculadas con Ia transcripcion. Las caracterfsticas de los cromosomas en escob:· llon y politenicos sugieren una conclusion genera: Para ser transcrito, el material genetico se disper a respecto de su estado usual de empaquetado dens Ia dud a es si esa dispersion en el ambito macrosc · pico del cromosoma emula los sucesos que ocurre:: en el ambito molecular de Ia masa de eucromatin.: de interfase ordinaria. .:,Las bandas de un cromosoma politenico tiener. un significado funcional? Es decir, .:,corresponde .a cada banda a un tipo de unidad genetica? Se podrfc. pensar que Ia respuesta es inmediatamente evidemea partir de Ia secue ncia del genoma de Ia mosca porque mediante el mapeo de interbandas con Ia secuencia serfa posible determinar si en alguna . tipo de identidad es fijo, pero hasta ahora no se he: encontrado un patron que apunte a un significad funcional de las bandas.

El cromosoma eucari6tico es un dispositivo de segregaci6n Conceptos principales • Un cromosoma de eucariota se mantiene en el huso mit6tico por union de microtubulos al cinet6coro, que se forma en su region centromerica. • Los centr6meros a menudo tienen heterocromatina rica en secuencias de DNA satelite.

Metalase

Anatase

Telofase

·. - v- -~ ~VCohesinas

·

Microtubulos

~Centr6mero

Los cromosomas sufren tracci6n hacia los palos a traves de microtubulos que se unen a los centr6meros. Las cromatides hermanas se mantienen juntas hasta la anafase, mediante proteinas (cohesinas). El centr6mero se muestra aqui a la mitad del cromosoma (metacentrico), pero puede localizarse en cua lquier sitio, a todo lo largo, incluso cerca del extremo (acrocentrico) y en el extrema (telocentrico).

Durante la mitosis, las cromatides hermanas se dirigen a polos opuestos de la celula, movimiento que depende de la union de los cromosomas a los microtubulos, conectados a los polos en el otro extrema. (Los microtubulos constituyen un sistema filamentoso celular que se reorganiza durante la mitosis, de manera que conecte los cromosomas con los palos de la celula. ) Los sitios de las dos regiones en que se organizan los extremos de los microtubulos, cerca de los centriolos, en polos y cromosomas, se Haman MTOC (centros de organizacion de microtubulos). En Ia G 2t se ilustra Ia separacion de las cromatides hermanas conforme avanza la mitosis de metafase a telofase. La region del cromosoma encargada de su segregacion en Ia mitosis y Ia meiosis se llama centr6mero. La region centromerica de cada cromatide h ermana esta sujeta a traccion por los microtubulos bacia el polo opuesto, y para opon erse a esa fuerza motriz, las protefnas "goma", llamadas cohesinas, manti en en juntas a las cromatides hermanas. Inicialmente, las cromatides hermanas se separan en sus centromeros y despues se sueltan completamente una de otra durante Ia anatase, cuando las cohesinas se fragmentan . El centromero es sometido a traccion bacia el polo durante la mitosis y el cromosoma adherido a el es "arrastrado", de modo que este constituye el dispositivo de union de gran numero de genes con el aparato para Ia division. Dicho aparato contiene el sitio en que las cromatides hermanas se mantienen juntas antes de la separacion de cromosomas individuales, que en Ia fotografia de Ia Figura 28.11 se muestra como una region comprimida que conecta los cuatro brazos del cromosoma; las cromatides hermanas seencuentran en Ia etapa de metafase de Ia mitosis. El centromero es indispensable para la segregacion, segun se observa por el comportamiento de los cromosomas que se han roto. Una sola rotura

genera un sitio que retiene el centromero y un fragmento acentrico, que carece de el. Este ultimo no se une con el huso mitotico y, como resultado, no puede incluirse en ninguno de los nucleos de celulas hijas. (Cuando el movimiento cromosomico depende de centromeros bien definidos, solo puede haber un centromero por cromosoma, pero si las translocaciones generan cromosomas con mas de un centromero, en Ia mitosis se forman estructuras aberrantes debido a que los dos centromeros de Ia misma cromatide hermana han sido arrastrados bacia diferentes polos, rompiendo as! el cromosoma. No obstante, en algunas especies los centromeros son "difusos", y Ia situacion, diferente. En el ambito molecular solo se han analizado centromeros bien definidos.) Las regiones que flanquean a! centromero suelen ser ricas en secuencias DNA satelite y presentan una cantidad considerable de heterocromatina, pero todo el cromosoma esta condensado, de manera que Ia heterocromatina centromerica no es de inmediato evidente en los cromosomas mitoticos, pero puede observarse mediante una tecnica que genera bandas C. En el ejemplo de la , , todos los centromeros se muestran como regiones de tincion intensa. Aunque esto es coml'm, Ia heterocromatina no es identificable en torno a todos los centromeros conocidos, lo cual sugiere que probablemente es indispensable para el mecanismo de division. La region del cromosoma en que se forma el centromero se define por secuencias de DNA (si bien se han definido en muy pocos casos). El DNA centromerico se une a proteinas especfficas encargadas de establecer Ia estructura que une el cromosoma con los microtubulos, estructura Hamada cinet6coro, que es un objeto fibrosa de tinci6n intensa con diametro o longitud de -400 nm. El cinetocoro proporciona el MTOC de un cromosoma.

28.12 El cromosoma eucari6tico es un dispositive de segregaci6n

745

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Las bandas C generan una tinci6n intensa en los centr6meros de todos los cromosomas. Imagen cortes1a de Lisa Shaffer, Washington State University-Spokane.

n

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con el microtubulo

Protefnas de union con el centr6mer6

El centr6mero se identifica por una secuencia de DNA que se une a prote1nas espec1ficas. Dichas prote1nas no se unen a los microtubulos, sino que establecen el sitio en que las prote1nas de union de microtlibulos, a su vez, se unen.

La muestra Ia jerarqufa de organizacion que conecta el DNA centromerico con los microtu bulos. Las protefnas unidas al DNA centromerico se adhieren a otras que, a su vez, se unen con los microtubulos (vease la seccion 28.15, El centromero se une a un complej o protefnico ).

fZD


Conceptos principales • Los centr6meros de los cromosomas de eucariotas superiores contienen gra ndes cantidades de DNA repetitivo. • Se desconoce la fun ci6n del DNA repetitive .

746


Para que el centromero funcione, el DNA debe sebastante largo. (Los elementos cortos bien definid de Saccharomyces cerevisiae pueden ser una exce cion a Ia regia general.) Los casos en que es po s~ ble comparar secuencias especfficas del DNA c Ia region centromerica, suelen incluir secuencic. repetitivas. Hasta ahora, S. cerevisiae es el unico caso en qt,; el DNA centromerico puede identificarse por su cc.pacidad de conferir estabilidad en plasmidos . s:.:embargo, con Ia leva dura Schizosaccharomyces pam ~- . de solo tres cromosomas, se ha utilizado un enfoqt: _ relacionado, y Ia region en que se encuentra ca ·" centromero se identifico por delecion de la may parte de Ia secuencia de cada cromosoma para ere::_ un minicromosoma estable. Mediante ese a borda' : se localiza a los centromeros en regiones de 40 a 1(kb, que consisten en DNA parcial o completamen: repetitivo. Nose sabe bien a bien que tanto de ca-' · una de esas regiones mas bien largas se ne ces::~ para Ia segregacion de cromosomas en la mito si~ Ia meiosis. Los intentos para localizar fu nciones centron~e ricas en cromosomas del genero Drosophila sugiere:: que se dispersan en una gran region constituida 200 a 600 kb . El gran tamaiio de ese tipo de cer: tromero sugiere que es posible que conten ga Yc. rias funciones especializadas, incluidas secuenc; necesarias para el ensamblaj e del cinetocoro y ::apareamiento de cromatides hermanas. En el genero Arabidopsis, el tamaiio del ce:-_tromero es comparable; cada uno de los cinco cr mosomas tiene una region centromerica en Ia cu.=. practicam ente se ha suprimido Ia recombinaci6que ocupa > 500 kb. Obviamente incluye al centr mero, pero no se cuenta con informacion direc-...:. respecto de cuanto se necesita de el. En esas re,; nes hay genes expresados, lo cual hace dudar r ~ pecto de si toda Ia region es parte del centromer En el centro de la misma se encuentra una serie "180 bp repetidos, el tipo de estructura que suele r lacionarse con los centromeros. Es muy pronto par.;: decir como se relacionan dicbas estructuras con ...:. funcion del centromero. En los primates, el segmento primario que j - cluye la heterocromatina de los centromeros e DNA a satelite, que consta de arreglos seriados unidades de repeticion de 170 bp . Hay variam csignificativas entre las repeticiones, si bien las .:. : cualquier centromero tienden a relacionarse me' entre sf que con de Ia familia de orr localizaciones. No hay duda de que las secuenc:> necesarias para la funcion del centromero reside= en bloques de DNA satelite a, pero no se sabe esas mismas secuencias satelite a !levan a cabo ...:. fun cion o llevan incrustadas otras secuencias.

TCACATGATGATATTTGATTTTATTATATTTTTAAAAAAAGTAAAAAATAAAAAGTAGTTTATTTTTAAAAAATAAAATTTAAAATATTTCACAAAATGATTTCCGAA AGTGTACTACTATAAACTAAAATAATATAAAAATTTTTTTCATTTTTTATTTTTCATCAAATAAAAATTTTTTATTTTAAATTTTATAAAGTGTTTTACTAAAGGCTT CDE-11 80-90 bp, >90% A + T

CDE-1

CDE-111

U Por las homolog\as de secuencia entre elementos CEN de levaduras es posible identificar tres regiones conservadas.

fBI

La s secuencias de DNA de los centr6m eros de S. cerevisiae so n cortas

Conceptos principales • En 5. cerevisiae, los elementos CEN se identifican por la capacidad de permitir que un plasmido se segregue de manera precisa en la mitosis. • Los elementos CEN consisten en las secuencias cortas conservadas CDE-I y CDE-III, las cuales flanquean una region CDE-III rica en A-T.

Si una secuencia centromerica del DNA se encarga de la segregacion, cualquier molecula que porte esa secuencia deberfa trasladarse apropiadamente en la division celular, en tanto que cualquiera que careciera de ella, deberfa fracasar en la segregacion. Este pronostico se ha usado para aislar el DNA centromerico en la levadura S. cerevisiae. Los cromosomas de las levaduras no muestran cinetocoros visibles comparables con los de eucariotas superiores, pero de todas formas se dividen en la mitosis y se segregan en la meiosis por los mismos mecanismos. La ingenierfa genetica ha permitido producir plasmidos de levaduras que se replican como las secuencias cromosomicas (vease la seccion 15 .8, Los orfgenes de la replicacion pueden aislarse en las levaduras), pero son inestables en la mitosis y la meiosis y desaparecen de gran parte de las celulas porque se segregan de manera erratica. Los fragmentos de DNA cromosomico que contienen centromeros se han aislado por su capacidad de conferir estabilidad mitotica a esos plasmidos. Un fragmento de regiones de DNA centromerico (CEN) se identifica como la secuencia minima susceptible de conferir estabilidad a tal plasmido. Otra forma de caracterizar la funcion de esas secuencias es modificarlas in vitro y despues reintroducirlas en la celula de la levadura, donde, en el cromosoma, sustituyen al centromero correspondiente, lo cual permite que las secuencias necesarias para la funcion del CEN se definan directamente en el contexto del cromosoma.

Un fragmento del CNE derivado de un cromosoma puede sustituir al centromero de otro cromosoma sin consecuencias aparentes, lo cual sugiere que los centromeros son intercambiables, se utilizan sencillamente para unir el cromosoma al huso y nose relacionan con la distinci6n entre un cromosoma y otro. Las secuencias requeridas para la funcion centromerica entran en una banda de -120 bp; la region centromerica esta empaquetada en una estructura resistente a la nucleasa y se une a un solo microtubulo, de modo que la region centromerica de S. cerevisiae se puede aprovechar para identificar a las protefnas que se unen al DNA del centromero y a las que conectan al cromosoma con el huso. Como se resume en la , en la region CEN se pueden distinguir tres tipos de elementos de secuencia: • El elemento dependiente del ciclo celular (CED)-I es una secuencia de 9 bp que se conserva con variaciones menores en ellfmite izquierdo de todos los centromeros. • El CDE~II corresponde a una secuencia >90% rica en A-T, de 80 a 90 bp, que se encuentra en todos los centromeros, cuya funcion podrfa depender de su longitud, mas que de la exactitud de la secuencia. Su constitucion recuerda algunos DNA repetidos, cortos y seriados (satelites) (vease la seccion 6.12, Los satelites de los artropodos tienen repeticiones identicas muy cortas) en los que la composicion de las bases podrfa causar algunas distorsiones caracterfsticas de la estructura doble helicoidal del DNA. • El CDE-III es una secuencia de 11 bp muy conservada en ellfmite derecho de todos los centromeros. Las secuencias a uno y otro lado del elemento estan menos conservadas, y probablemente tambien sean necesarias para la funcion del centromero. (El CDE-III podrfa tener mas de 11 bp si resulta que las secuencias de los flancos son esenciales.) Las mutaciones en CDE-I o CDE-II reducen, pero no desactivan, la funcion del centromero, a diferencia de las mutaciones puntuales del CCG central de CDE-III que desactivan por completo al centromero.

28.14 Las secuencias de DNA de los centr6meros de S. cerevisiae son cortas

74 7

SIB El centr6mero se une a un complejo prote1nico Conceptos principales • En CDE-II se forma un complejo proteinico especializado alterno a La estructura usual de La cromatina. • El complejo proteinico CBF3 que se une a CDE-III es indispensable para la funci6n del centr6mero. • Las prote\nas que conectan esos dos complejos podrian proporcionar La conexi6n para los microtubulos.

e,Es posible identificar las proteinas necesarias para Ia funcion de secuencias CNE? Hay varios genes en que las mutaciones afectan Ia segregacion cromosomica y cuyas proteinas se localizan en los centromeros. La contribucion de dichas proteinas a Ia estructura centromerica se resume en Ia Una estructura especializada de cromatina se sintetiza en Ia region CDE-II por su union con una proteina llamada Cse4 que simula una de las histonas que constituyen las subunidades basicas de Ia cromatina (vease la seccion 31.3, La heterocromatina depende de las interacciones con las histonas). Una proteina llamada Mi£2 puede tam bien ser parte de ese complejo, o cuando menos, conectarse con el. Las Cse4 y Mi£2 tienen contrapartes localizadas en centromeros eucarioticos superiores, CENP-A y CENP-C, lo cual sugiere que esa interaccion puede ser un aspecto universal de Ia estructura del centromero. La interaccion basica consiste en el plegamiento del DNA en Ia region CDE-II en torno a un agregado proteinico; la reaccion probablemente se facilita con Ia aparicion de un plegamiento intrinseco en Ia secuencia CDE-II. El CDE-I se une por medio del homodimero CBFI, interaccion no esencial para el funcionamiento del centromero, pero si no ocurre, disminuye Ia

Microtubulos Mcm21 Okp1 CBF3

.!L.:."""""'...-r..'""' CDE-111

~~!j~· ~

El DNA en CD E-II se enrolla en torno a un agregado proteinico que incluye Cse4p. El CDE-III esta unido a CBF3, y el CDE-1, a CBF1. Esas proteinas se conectan a traves del grupo de Ctf19, Mcm21 y Okp1.

7 48


fidelidad de Ia segregacion cromosomica -1 Ox. l"complejo de 240 kD de cuatro protefnas llamad CBF3 se une a CDEIII, interaccion, esta si, indisper-sable para Ia funcion del centromero. Las proteinas unidas en CDE-I y CDE-III est
f!D


Conceptos principales • Para La estabilidad del extrema cromos6mico, se requiere el tel6mero. • Un tel6mero consiste en una repetici6n sencilla en La que una cadena rica en C + A tiene La secuencia c,,(A/ T) ,.•.

Otra caracteristica esencial de todos los cromosomas es el tel6mero, que "sella" su extrema. Se sabe q -= debe ser una estructura especial porque los extre· mos cromosomicos generados por rotura son "pega· josos" y tienden a reaccionar con otros cromosoma~ en tanto los extremos naturales son estables. Para identificar una secuencia telomerica s ~ pueden aplicar dos criterios: • Debe yacer en el extrema de un cromos rna (o cuando menos en el extremo dew~= molecula de DNA lineal autentica). • Debe conferir estabilidad a una molecuL:. lineal. El problema de encontrar un sistema que ofre=ca un analisis de la funcion ha llevado nuevamen al ambito molecular utilizando levaduras. Todos I~ plasmidos que sobreviven en las levaduras (porqu:: poseen elementos ARS y CEN) son moleculas ri"" DNA circulares, los lineales son inestables (porque se han degradado). (.Una secuencia telomerica ajj-

tentica de DNA podrfa conferir estabilidad a un plas mido lineal? Es posible identificar los fragmentos de DNA de levaduras que demostradamente se localizan en los extremes cromosomicos mediante dicho analisis, ademas de que una region del extreme de una mo lecula conocida de DNA lineal natural, el DNAr extracromosomico del genero Tetrahymena, puede tornar estable un plasmido lineal de leva dura. Las secuencias telomericas se han caracteriza do a partir de una amplia variedad de eucariotas inferiores y superiores. El mismo tipo de secuencia se encuentra en plantas y seres humanos, de modo que Ia construccion del telomere parece seguir un principia casi universaL consta de una larga serie de secuencias repetidas, seriadas y cortas; depen diendo del organismo, pueden ser de l 00 a 1 000 repeticiones . Todas las secuencias telomericas se pueden ex presar con Ia formula general C"(A IT) '" don den> 1 y m, de 1 a 4. En Ia se muestra un ejemplo generico. Una propiedad in usual de Ia secuencia telomerica es Ia extension de la cadena rica en G-T, para la cual, de 14 a 16 bases suelen constituir una sola cadena. La cola G se genera, quiza, debido a una fragmentacion limitada especffica de la cadena rica en C-A. Algunos indicios respecto de la forma de actuar de un telomere dependen de algunas ciertas propie dades inusuales de los extremes de las moleculas de ·DNA lineales . En una poblacion de tripanosomas, varia la longitud de los extremes. Cuan do se hace seguimiento a una celu la don, el tel6mero crece de siete a 10 bp (una a dos repeticiones) por generacion . Todavfa mas revelador es el destine de los tel6meros ciliados introducidos en las levaduras . Despues de Ia replicaci6n en estas, se agregan repe ticiones telomiricas de levaduras en los extremos de las repeticiones, de especies de Tetrahymena. La adici6n de repeticiones telomericas en el extreme del cromosoma en cada ciclo de replicaci6n podrfa resolver el problema de la replicacion de las moleculas de DNA lineal descrito en Ia secci6n 16.2, Los extremes del DNA lineal son un problema para Ia replicaci6n. La adicion de repeticiones por sfnte sis nueva contravendrfa Ia perdida de repeticiones resultante de Ia falta de replicacion hasta el extreme del cromosoma. La extension y el acortamiento es tarfan en equilibria dinamico. Silos tel6meros se prolongan (y acortan) conti nuamente, su secuencia exacta puede no ser de importancia. Todo lo que se requiere es que el extreme sea reconocido como un sustrato adecuado para la adici6n, lo cual explica c6mo funciona el tel6mero ciliado en las levaduras.

CCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAA GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT

CCCCAACCCCAACCCCAA 5' GGGGTTGGGGTTGGGGTIGGGGTTGGGGTTGGGGTT 3'

Un tel6mero comCrn tiene una estructu ra de repetici6n simple en la que una cadena rica en G-T va mas alla de la cadena rica en C-A. La cola G es generada por una fragmentaci6n limitada de la cadena rica en C-A.

AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG

·.·..( .)) .... ·. . · ......... 0).... 2

.

La estructura cristalina de una secuencia corta de repetici6n del tel6mero humano forma tres cuartetos G apilados; el superior contiene la primera G de cada unidad de repetici6n y se api la sabre cuartetos que contienen la segunda G (G3, G9, G15, G21) y la tercera G (G4, GlO, G16, G22).

SIB

Los tel6meros sellan los extremos de los cromosomas

Concepto principal • La proteina TRF2 cataliza una reacci6n en que la unidad repetida 3' de la cadena rica en G + T forma un asa por desplazamiento de su hom6loga en una region de flujo ascendente respecto del tel6mero.

Los fragmentos telomericos aislados no se comportan como si tuvieran DNA monocatenario, mas bien muestran movilidad electroforetica aberrante y otras propiedades. Las bases de guanina tienen una capacidad inusual para relacionarse entre sf. La cola monocate na.ria rica en G del telomere puede formar "cuartetos " de moleculas de G, cada uno de los cuales contiene cuatro guaninas que forman enlaces de hidr6geno para formar una estructura plana. Cada 28.17 Los tel6meros sellan los extremes de los cromosomas

749

En el extrema del DNA cromos6mico se forma un asa . Imagen cortes1a de Jack Griffith, University of North Carolina at Chapel Hill.

~

TRF2

li1iliii

I

.IA.IiVi\fl\IJ\.,~ .(i\0_q

~ 7··0\ JI

Extremo 5'

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Extremo 3'

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• La telomerasa hace uso del 3' -OH de la cadena telomerica G+ T para cebar la s1ntesis de repeticiones seriadas de tipo TIGGGG.

~

\r>

El extrema 3' del tel6mero de una sola cadena (TIAGGG). desplaza a las repeticiones hom6logas del DNA dicatenario para formar el asa. La reacci6n es catalizada por TRF2.

guanina proviene de la posicion correspondiente de una union de repeticion sucesiva TTAGGG. En la se muestra una organ izacion basada en una estructura cristalina reciente. El cuarteto ilustrado representa un vinculo entre las primeras guaninas de cada unidad de repeticion y se apila sobre otro cuarteto que tiene Ia misma organiza cion, pero se forma a partir de Ia segu nda guanina de cada unidad de repeticion. Una serie de cuartetos como este podrfa apilarse en forma helicoidal. y si bien Ia formacion de esa estructura da fe de las


Los tel6meros son sintetizados por una enzima ri bon ucleoprotei nica

-

- ~'VF'ViYJ~'""'

750

propiedades desusadas de la secuencia rica en G : vitro, no demuestra, por supuesto, si el cuarteto : : forma in vivo. (.Que caracterfsticas del tel6mero se encarg-de Ia estabilidad del extremo cromosomico? En : ~ se observa que en el telomero se fo rrr ~ un asa de DNA. La ausencia de cualquier extren: libre podrfa ser Ia caracterfstica clave para la estabL:: zacion del extremo del cromosoma. La longitud pr medio del a sa es de 5 a 10 kb en celulas animale~ En Ia se muestra que e l asa se fo~ ma cuando el extremo 3' del telomero de una s -= cadena (TTAGGG) 11 desplaza a Ia misma secuen -en una region del telomero de fluj o ascenden::: Esto convierte a Ia region doble en una estruct · del tipo del asa D, en la cual, una serie de repetid nes de TT AGGG se des plaza para formar una regi · de una sola cadena y la cola del tel6mero se apare.: con la cadena h om6loga. La reaccion es catalizada por la p rotefna union del telomero TRF2, que con otras protefnc.: crea un complejo que estabiliza los extremos cr mosomicos. Su importancia en la protecci6n de I extremos depende de que la delecion de TRF2 = Iugar a reestructuraciones cromosomicas.

• El componente RNA de la telomerasa tiene una secuencia que se aparea con repeticiones ricas en C +A. • Una de las subunidades prote\nicas es una transcriptas:: inversa que utiliza al RNA como molde para la s1ntesis de la secuencia rica en G + T.

El tel6mero tiene dos funciones: • La primera es proteger el extremo crom somico; cualquier otro extremo del DK.-_ por ejemplo, el generado por una ro tu-~ dicate naria, se convierte en bla nco de : sistemas de reparacion. Las celulas tiene QL _ ser capaces de distinguir al telomero. • La segunda es permitir que el telomero _, extienda, de lo contrario, se hara mas cor:. con cada ciclo de replicacion (porq ue la r- plicacion no puede iniciarse en el extre :mismo).

Las protefnas que se unen al telomero constituyen la solucion para ambos problemas. En }as levaduras, diferentes conjuntos de protefnas resuelven cada problema, pero ambos se unen con el telomero mediante la misma protefna, Cdc1 3: • La protefna Stn1 protege contra la fragm entacion (especfficamente contra cualquier extension de la fragmentacion de Ia cadena C-A que genera Ia cola G. • Una enzima telomerasa extiende la cadena rica en C-A. Esta actividad depende de dos protefnas con actividades auxiliares, como el control de Ia longitud de extension. La telomerasa utiliza el extremo 3'-0H de la cadena telomerica G + T como cebador de Ia sfntesis de repeticiones seriadas TTGGGG, actividad que solo necesita GTPd y TTPd. La t elomerasa es una gran ribonucleoprotefna que consta de un molde de RNA (codificado por TLCI) y una protefna con actividad catalftica (EST2). El componente de RNA corto ( 159 bases de longitud en el genero Tetrahymena y 192 en el Euplotes) incluye una secuencia de 15 a 22 bases, Ia cual es ictentica a dos repeticiones de la secuencia de repeticion rica en C. Este RNA proporciona el molde para la sintesis de la secuencia de repeticion rica en G. El componente protefnico de la telomerasa es una subunidad catalftica que solo pu ede actuar en el molde de RNA provisto por el componente de acido nucleico . En Ia se muestra la accion de la telomerasa, enzima que avanza de manera discontinua; el molde de RNA es ubicado en el cebador de DNA, se agregan varios nucleotidos al cebador y despues, Ia enzima se transloca pa ra volver a em pezar. La telomerasa es un ejemplo especializado de una transcriptasa inversa, enzima que sintetiza Ia secuencia de DNA en un molde de RNA (vease Ia seccion 22.4, El DNA vfrico es generado por transcripci6n inversa). No se sa be como se en sambla la cadena complementaria del telomero (rica en C-A), pero se especula que podrfa sintetizarse mediante el extremo 3'-0H de una horquilla terminal G-T como cebador de la sintesis de DNA. La telomerasa sintetiza las repeticiones individuates que se agregan a los extremos cromosomicos, pero, en sf, no controla el numero de repeticiones. Otras protefnas participan en la determinacion de la longitud del telom ero y pueden ser identificadas por los mutantes ESTl y EST3 de levaduras, en los cuales, la longitud del telomero ha sido modificada . Estas protefnas pueden unir telomerasas, e influyen en la longitud del telomero controlando el de la telomerasa a su sustrato. Se han encontrado protefnas que se unen a los tel6me ros en celulas de m amfferos, pero poco se sabe sobre su funcion.

Uni6n: el molde de RNA se aparea con el cebador de DNA

Polimerizaci6n: El molde de RNA dirige Ia adici6n de nucie6tidos al extrema 3' del DNA

.

3'(dGTP

5 ' ... UGGGGII_BG.GGTTG.G

3'

~~CC

CC~~CCCCAAG .

3' La polimerizaci6n continua hasta el final de Ia region molde

5'

I

't

3' 5' ...TI.GBGGU..GG:G.GTTGGGG.UG

3' ...AACCCCa:GCCCAACCCCt\AI

[:, '5'

3.'

Translocaci6n: Ia enzima se traslada al extrema 3' del molde

3'

5'

~ .. T.

GGG.GITGGGGTTG G.GG

3' ~>' ACC_G_C

G.

C!:.CCMCC:C.G

5'

3'

..

5'

~ La telomerasa se ubica a si misma por apareamiento de bases ent~e el molde de DNA y el cebador de DNA unicatenario, que sobresale; agrega bases Gy Tal cebador, una a la vez, segun el molde. El ciclo se inicia nuevamente cuando se ha agregado una unidad de repetici6n.

Cada organismo presenta un rango caracterfstico de longitudes telomericas; son largos en los mamfferos (en generaL de 5 a 15 kb en el ser humano) y cortos en las levaduras (unos - 300 bp en S. cerevisiae) . El mecanismo de control basico es que la probabilidad de que un telomero sea un sustrato de la telom erasa aumenta conforme se abrevia su longitud; no se sabe si esto es un efecto continu o o si depende de que la longitud se reduzca respecto de alguna cifra cr.ltica. Cuando !a telomerasa actua en un tel6mero, puede agregar varias unidades de repetici6n. La forma intrfnseca de accion de la enzima es disociar, despues de agrega r una repeticion; la adici6n de varias unidades de repeticion depende de otras protefnas que hacen que la telomerasa lleve a cabo mas de un ciclo de extension. Elnumero de repeticiones agregadas no influye en la longitud del tel6mero mismo, mas bien es controlado con protein as auxiliares que se vinculan con la telomera sa. Las caracteristicas mfnimas requeridas para que exista como cromosoma son:

28.18 Los tel6meros son sintetizados por una enzima ribonucleoproteinica

751

• Telomeros para asegurar la supervivencia. • Un centromero para mantener la segregadon. • Un origen para iniciar la replicacion. Todos esos elementos se han conjuntado para estructurar un cromosoma artificial de Jevaduras (YAC), metodo que permite perpetuar secuencias ajenas, de ahf que el cromosoma sintetico sea estable solo si tiene mas de 20 a 50 kb de Jongitud. Se desconoce el fundamento de dicho efecto, pero Ia capacidad de construir un cromosoma sintetico permite investigar Ia naturaleza del dispositivo de segregacion en un ambiente controlado.

fDm

Los tel6meros son indispensables para la supervivencia

En todas las celulas en proceso de division se observa actividad de telomerasa, la cual suele interrumpirse en aquellas con diferenciacion terminal qu e no se se muestra que si la te dividen. En Ia Jomerasa presenta mutacion en u na celula en esas condiciones, los telomeros se acortan gradualmente en cada mitosis. Un ejemplo de los efectos de tal mutacion en las levaduras se ilustra en Ia en la cual, el telomero se acorta de 400 a 0 bp en - 120 generaciones. La perdida de telomeros produce efectos nocivos. Cuando Ia longitud del telomero llega a 0, a las celulas se les dificulta dividirse con exito. Los intentos de division por lo general causan roturas y translocaciones de cromosomas, proceso que re sulta en una mayor tasa de mutaciones, que en las

Tel6mero

Tel6mero

La mutaci6n en la telomerasa hace que los tel6meros se acorten en cada divisio n celular. En un memento dado, la perdida del tel6mero da lugar a rotura y reestructuraci6n de los cromosomas. 752


tr/1 de tipo silvestre trt1-deficiente

600 500 400

300

200

100

Divisiones 40

80

120

40

80

120

La longitud del tel6mero se mantiene en -35 bp en la levadura de ti po Silvestre, pero por una mutaci6n er el gen trtl, que codifica el componente de RNA de la telomerasa, rapidamente acorta sus tel6meros a una longitud de 0. Reproducida con autorizaci6n de Nakamura, T. M., et al. 1997. Science. 277:955-959. © 1997 AAAS. Imagen cortesla de Thomas R. Cech and Toru Nakamura, University of Colorado.

Jevaduras se vincula con perdida de Ia viabilidad _· ocupacion del cultivo predominantemente por celuJas senescentes (alargadas, que nose dividen y que . en ultima instancia, mueren). Algunas celulas brotan del cultivo senescente porque han adquirido la capacidad de extender sus telomeros por una alternativa a la actividad de lc. telomerasa. Las supervivientes entran en dos grupos, en uno de los cuales, los cromosomas se ha tornado circulares, carecen de tel omeros y, com resultado, son independientes de la telomerasa. E. otro grupo utiliza un entrecruzamiento inequitativo para extender sus telomeros ( ) . El te · lomero es una estructura de repeticion, de manera que es posible que dos de ellos se alineen de manera erronea cuando los cromosomas se aparean. La recombinacion entre regi ones desiguales genera un entrecruzamiento inequita tivo, como se muestra antes en Ia Figura 6. L en cuyo caso, Ia longitud de un cromosoma recombinante aumenta, mientras que Ia del otro disminuye. Las celulas suelen suprimir el entrecruzamien to inequirativo por sus consecuencias potencialmente nocivas mediante dos sistemas, uno de ellos, proporcionado por las protefnas de union con telomeros. En las levaduras, Ia frecuencia de recombinacion entre telomeros aumenta por delecion del gen tazl. qu e codifica una protefna regu ladora de la actividad

de telomerasa. El segundo es un sistema general que repara el apareamiento erroneo. Ademas de corregir pares de bases apareadas erroneamente que podrian surgir en el DNA, este sistema suprime Ia recombinacion entre regiones erroneamente apareadas, como se muestra en la Figura 28 .34, incluidos los telomeros. En caso de mutacion, un mayor porcentaje de las levaduras con deficiencias de telomerasa sobrevive a Ia perdida de los telomeros porque la recombinacion entre ellos genera algunos cromosomas con telomeros mas largos. Cuando se cultivan celulas eucarioticas, suelen dividirse un numero fijo de generaciones y despues, entran en senescencia, tal vez por una declinacion de Ia longitud del telomero por Ia falta de expresion de la telomerasa. La celula entra en una crisis que algunas superan, pero por lo general estas liltimas presentan reestructuraciones cromosomicas resultado de Ia falta de proteccion de los extremos cromosomicos. Dichas reestructuraciones pueden dar Iugar a mutaciones que contribuyen a! estado tumorigenico. La ausencia de expresion de la telomerasa en esas circunstancias se debe a una falta de expresion del gen, y Ia reactivacion de !a enzima es uno de los mecanismos por lo que dichas celulas pueden sobrevivir de manera continua en cultivo (que obviamente no era una opcion en los experimentos con levaduras en los cuales habia antecedentes de delecion del gen).

EJ:D

Resumen

El material genetico de todos los organismos y virus adopta la forma de nucleoprotefnas estrechamente empaquetadas. Algunos genomas viricos se insertan en viriones preforma dos, en tanto que otros ensamblan una cubierta protefnica en torno al acido nucleico. El genoma bacteriano forma un denso nucleoide de -20 % de protefna por masa, pero se desconocen los detalles de Ia interaccion de la s protefnas con el DNA. El DNA esta organizado en -I 00 dominios que mantienen un superenrollamiento independiente, con una densidad de superhelices no restringidas correspondiente a -1 I I 00 a 200 bp. En eucariotas, la cromatina de interfase y los cromosomas de metafase parecen organizados en grandes asas, cada una de las cuales puede ser un dominio superenrollado de manera independiente. Las bases de las asas se conectan a un bastidor de metafase o a la matriz nuclear mediante sitios especfficos del DNA. La s secuencias con transcripcion activa residen en la eucromatina, que constituye Ia mayor parte de la cromatina de interfase. Las regiones de he-

Se produce entrecruzamiento cuando nose repara el apareamiento err6neo

X

El entrecruzamiento en las regiones telomericas suele ser suprimido por los sistemas de reparaci6n de apareamiento err6neo, pero puede ocurrir cuando se presenta una mutaci6n. El suceso de entrecruzamiento inequitativo extiende el tel6mero de uno de los productos, permitiendo que el cromosoma sobreviva en ausencia de la telomerasa.

terocromatina estan empaquetadas -5 a I Ox, mas compactadas, y son inertes en cuanto a Ia transcripcion. Toda Ia cromatina se empaqueta densamente durante la division celular, cuando es posible distinguir cada uno de los cromosomas. La produccion de bandas G mediante tratamiento con el colorante Giemsa es indicia de Ia existencia en los cromosomas de una infraestructura reproducible. Las bandas son r egiones muy grandes (-107 bp) que pueden utilizarse para localizar translocaciones cromosomicas u otros cambios considerables en Ia estructura. Los cromosomas en escobillon de los anfibios y los politenicos de los insectos tienen estructuras inusualmente amplias, con razones de empaque tamiento <100. Los cromosomas politenicos de D. melanogaster se dividen en casi 5 000 bandas, cuyo tamaii.o varia en magnitud con un promedio de -25 kb. Tambi en se observan regiones con actividad transcripcional en estructuras a lin mas desplegadas (con "abultamientos") donde se expulsa material del eje del cromosoma, proceso que podrfa simular los cambios que ocurren en menor escala cuando se transcribe una secuencia en la e ucromatina. La region centromerica contiene el cinetocoro, encargado de unir el cromosoma con el huso mitotico. El centromero suele estar rodeado de heterocromatina. Las secuencias centromericas se han identificado solo en la levadura S. cerevisiae, donde constan de elementos conservados conos, CDE-I y CDE-IIL que se unen a CBFI y al complejo CBF3, respectivamente, a sf como una region larga, rica en A-T, Hamada CDE-II, que se une a Cse4 para formar una estructura especializada en la cromatina. Otro grupo de protefnas que se une a ese ensamblaje proporciona la conexion con los microtlibulos. 28.20 Resumen

753

Los tel6meros proporcionan estabilidad a los extremos de los cromosomas, y casi todos los conocidos constan de multiples repeticiones, en las cuales una cadena tiene Ia secuencia general C"(A/T)m, donde n> 1 y m = 1 a 4. La otra cadena Gn (T I A),, tiene un extremo unico que sobresale y aporta un molde para Ia adici6n de bases individuales en un orden definido. La enzima telomerasa es una ribonucleoproteina cuyo componente RNA proporciona el molde para Ia sintesis para Ia cadena rica en G, con lo cual se resuelve el problema de la imposibilidad de replicaci6n en el extremo de una cadena doble. El tel6mero estabiliza el extremo del cromosoma porque Ia cadena unica colgante G (T/A),desplaza del tel6mero a su hom6loga en unidades de repetici6n previas hasta formar un asa, de manera que no haya extremos libres.

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fZlll

Las secuencias de DNA de los centr6meros de 5. cerevisiae son cortas

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a:D

El centr6mero se une a un complejo prote\nico

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f!ll

Los tel6meros sellan los extremos de los cromosomas

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E

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Nucleosomas ESQUEMA DEL CAPITULO

&D

j

Introducci6n EL nucleosoma es la subunidad de la cromatina

m:.J La v\a de los nucleosomas en la fibra de cromatina

• La nucleasa de micrococos Libera los nucleosomas de La cromatina como part1culas de 115. • Un nucleosoma contiene -200 bp de DNA y dos copias de cada histona medular (H2A, H2B, H3 y H4). • El DNA envuelve La superficie externa del octamero de proteinas.

BJI El DNA esta enrollado en la estructura de los nucleosomas

• Las fibras de cromatina de 10 nm se despliegan a partir de fibras de 30 nm y constan de una cadena de nucleosomas. • Las fib ras de 30 nm tienen seis nucleosomas por giro organizados en un solenoide. • La histona H1 es necesaria para la formacion de la fibra de 30 nm.

mil La replicaci6n de la cromatina requiere del ensamblaje de los nucleosomas

• >95% del DNA se recupera en nucleosomas o multimeros cuando La nucleasa de micrococos escinde el DNA de La cromatina. • La longitud del DNA por nucleosoma varia de tejido a tejido en un rango de 154 a 260 bp.

6D

Los nucleosomas tienen una estructura comun • El DNA de los nucleosomas se divide en DNA medular y DNA de enlace, dependiendo de su susceptibilidad a la nucleasa de micrococos. • El DNA medular tiene una longitud de 146 bp y se encuentra en las partlculas centrales producidas por digestion prolongada con la nucleasa de micrococos. • El DNA de enlace es la region de 8 a 114 bp susceptible de escision temprana por la enzima. • Los cam bios en la longitud del DNA de enlace explican las variaciones de la longitud total del DNA nucleosomico. • La H1 se vincula con el DNA de enlace y podria encontrarse en el punto en que el DNA entra y sale del nucleosoma.

6B

• Los octameros de las histonas no se conservan durante la replicacion, a diferencia de los dimeros H2A-H2B y los tetrameros H3 2-H4,. • Hay diferentes vias para el ensamblaje de los nucleosomas durante la replicacion e independientemente de esta. • Para eliminar al ensamblaje de los nucleosomas, se requieren proteinas rias. • El CAF-1 es una proteina de ensamblaje que se vincula con La subunidad PCNA del replicosoma; es necesaria para el deposito de los tetrameros H3 2-H42 despues de La replicaci6n . • Para el ensamblaje independiente de la replicaci6n se puede usar una proteina de ensamblaje diferente y una variable de la histona H3.

Ul!J (LOS nucleosomas yacen en posiciones espec\ficas? Los nucleosomas pueden formarse en posiciones especificas como resultado de La estructura local del DNA o de las proteinas que i nteractuan con secuencias especificas. • La causa mas frecuente de la posicion del nucleosoma es el limite impuesto por las proteinas que se unen al DNA. o El posicionamiento influye en que regiones del DNA quedan en el enlace y que cara del DNA se expone a la superficie del nucleosoma.

o

La estructura del DNA varfa en la superficie del nucleosoma • El DNA le da 1.65 vueltas al octamero de histonas. o La estructura del DNA se modifica de manera que tiene un numero mayor de pares de bases por giro en la parte media, pero menor en los extremos.

6111

La periodicidad del DNA cambia en el nucleosoma • Con el cambio en bp por giro se absorben -0.6 giros negativos del DNA, de 10.5 en solucion a un promedio de 10.2 en la superficie del nucleosoma, lo cual explica la paradoja del numero de enlaces.

~

~

• Los nucleosomas se encuentran a la misma frecuencia cuando los genes transcritos o no transcritos son digeridos con nucleasa de micrococos. • Algunos genes intensamente transcritos parecen casos excepcionales desprovistos de nucleosomas.

Organizaci6n del octamero de histonas • El meollo del octamero de histonas esta constituido por un tetramero, H3 2-H4, vinculado co n dos dimeros H2A-H2B. o Cada histona presenta interdigitacion intensa con su contraparte. o Todas las histonas medulares tienen el segmento estructural de pliegue. Las colas terminales N salen del nucleosoma.

(Los genes transcritos se organizan en nucleosomas?

fD6

Los octameros de histonas son desplazados por la transcripci6n • En un sistema modelo, la polimerasa de RNA desplaza a los octameros de histonas durante la transcripci6n, pero estos


757

se unen nuevamente con el DNA tan pronto como ha pasado la po limerasa. • Los nucleosomas se reorganizan cuando la transcripci6n pasa a traves de un gen.

BB

El desplazamiento del nucleosoma y su reensamblado requieren factores especiales

fBD ~

• Se necesitan factores auxiliares para que la polimerasa de RNA desplace a los octameros durante la transcripci6n y para que despues, las histonas se reensamblen en nucleosomas.

lf.I.B

Los aislantes impiden la acci6n de los potenciadores y de la heterocromatina • Los aislantes pueden impedir el paso de cualquier efecto activador o inactivador desde los potenciadores, silenciadores y LCR. • Los aislantes suele n constituir barreras para evitar que la heterocromatina se expanda.

gg

Los aislantes pueden definir un dominic • Los aislantes son estructuras especializadas de la cromatina con sitios hipersensibles. Dos aislantes pueden proteger de t odo efecto externo la region que los separa.

~

Ill

iir. : ~

Los sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa reflejan cambios en la estructura de La cromatina • En los promotores de los genes expresados hay sit' : . hi persensi bLes. • Estos sitios son generados por La union de facto re.o de transcripci6n que desplazan a los octameros d;, histonas.

Bli)

Los dominios definen regiones que contie n=genes activos • Un domi nio que contiene un gen transcrito se d e "' -~ por su mayor sensibilidad a la fragmentaci6n por ·' desoxirribonucleasa I.

~

Una LCR puede controlar a un dominic • Una LCR se localiza en el extrema 5' del dominio consta de varios sitios hiperse nsibles.

~

(Que constituye un dominio regulador? • Un dominio puede tener aislante, LCR y sitio de a La matriz, asi como unidades de transcripci6n.

Los aislantes pueden actuar en una direcci6n

L - -: ·

• Algunos aislantes tiene direccionalidad, de modo que pueden detener el paso de los efectos en una direcci 6n, pero no en la otra.

~

Introducci6n

tro de la cromatina de interfase y los cromos o--mit6ticos (vease Fig. 28.11) . En Ia cromatina, Ia :c z6n de empaque del DNA es de - 40. La estruc_ de esa fibra requiere de proteinas adicionales, p-.:c no ha sido bien definida. La proporci6n final del empaquetado depc_ del tercer nivel de organizaci6n, el empaque t ~ de !a propia fibra de 30 nm, lo cua l resulta en -~ raz6n general de empaq uetado de -1 000 en la ~ _ cromatina, intercambiable dclicamente con e: _ los cromosomas mit6ticos, que alcanza una ra:: ge neral de -1 0 000. En general, Ia heterocroma tiene una raz6n de empaque de -10 000, tam -Ia interfase como durante la mitosis. Para caracterizar los sucesos involucrados eempaque, Ia replicaci6n y la transcripci6n d elise necesita dilucidar estos niveles de organizac:;:- : Se supone que el vinculo con proteinas adicion- o Ia modificaci6n de las proteinas cromosom: existentes se relacionan con el cambio de la est:tura de la cromatina, pero nose conocen las diaespecificas para el control del empaquetado cic:.; Tanto replicaci6n como transcripci6n implicar.. desenrollado del DNA y, por tanto, deben inc:_ un despliegu e de la estructura que permita a -'enzimas importantes actuar sobre eJ, lo cual blemente implicaria cambios en todos los niw .=de organizaci6n . Cuando se replica la cromatina, los nude . mas deben replicarse en ambas moleculas hij as. =-

La cromatina tiene una organizaci6n compacta en que casi todas las secuencias de l DNA son estructuralmente inaccesibl es y estan inactivas desde el punto de vista funcional. En esta masa se encuentra la parte mas pequeiia de las secuencias activas . ( Cual es Ia estructura genera l de la cromatina y cual Ia diferencia entre secuencias activas e inactivas? La elevada proporci6n general del empaquetado del material genetico sugiere de inmediato que el DNA no puede empacarse directamente en Ia estructura general de Ia cromatina, debe haber jerarquias de organizaci6n.

El disefio de la subunidad fundamental de la croma tina es el mismo en todas las eucariotas; el nucleosoma consta de -200 bp de DNA organizados en un octamero de proteinas basicas, pequeiias, cuya estru ctura simula cuentas. Los componentes proteinicos son las histonas, que forman una porci6n medular, y el DNA se encuentra en la superficie de la particula. Los nucleosoma s son un componente invariable de la eucromatina y Ia heterocromatina en el nucleo de interfase, asi como de los cromosomas mit6ticos. El nucleosoma constituye el primer nivel de orga n izaci6n, con una raz6n de -6 de empaque . Sus componentes y estructuras estan bien definidos. El segundo nivel de organizaci6n es el enrollado de la serie de nucleosomas en una disposici6n helicoidal para constituir Ia fibra de -30 nm de diame758

Los aislantes pueden variar en potencia • Los aislantes difieren en cuanto a eficacia para el paso de una seiial de activaci6n .

CAPiTULO 29 Nucleosomas

Resumen

=

.:_ue ademas de preguntarse como se ensambla el .. ucleosoma rnismo, se debe inquirir que pasa con _-'I s otras protefnas de la cromatina. La replicaci6n ~ mpe su estructura, indicio de que representa un . roblema para las regiones de mantenimiento de ::structura especffica y ofrece Ia oportunidad demojjficarla. La masa de cromatina contiene basta el doble de _roteinas que el DNA. y casi Ia rnitad de esa masa pro: fnica se encuentra en los nucleosomas; Ia masa del ?-NA representa < 10% respecto de Ia masa de aque!, - ientras que gran parte de este consta de produc: s de transcripci6n recientes, aun vinculados con el 110lde del DNA. Las no histonas incluyen todas las protefnas i e Ia cromatina, excepci6n hecha de las histonas, ·: arfan mas entre tejidos y especies, y constituyen Jn porcentaje menor de masa que las histonas. Por tra parte, tambien incluyen un nttmero mucho .. ayor de protefnas, de manera que cualquiera de ~stas esta presente en cantidades mas pequeiias que as de cualquier histona. Las funciones de las protefnas no histonas in:luyen el control de la expresi6n genica y de las =structuras de orden superior. de modo que Ia polierasa de RNA puede considerarse como una histo:--~a prorninente. Las proteinas del HMG (grupo de alta . 1ovilidad) constituyen una subclase bien definida de no histonas (cuando menos algunas son facto~es de transcripci6n). Un problema importante resecto de otras no histonas, es que tienden a contam.i:--~arse con otras proteinas nude ares, y basta ahora ha >ido diffcil obtener las protefnas no h.istonas respon;-ables de las estructu ras de orden superior.

El nucleosoma es la subunidad de la cromatina Conceptos principales • La nucleasa de micrococos Iibera los nucleosomas de la cromati na como particulas de 115. • Un nucleosoma contiene -200 bp de DNA y dos copias de cada histona medular (H2A, H2B, H3 y H4). • El DNA envuelve la superficie externa del octamero de proteinas.

=uando se suspenden en una soluci6n de poca poi6nica, los nucleos de interfase se hinchan y ~om pen para liberar fibras de cromatina. En la 9 1 se muestra un nucleo lisado con fibras dirigidas a! exterior. En algunas regiones, las fibras constan e material muy compacta, pero en las que se han : " Xtendido, se observa que estan constituidas de pari culas bien definidas,.. los nucleosomas. En regiones ~encia

La cromatina que se derrama de los nucleos lisados consta de una serie de part1culas muy compactas. La barra mide 10 nm. Reproducida de Cell, vol. 4 Oudet. P., et al., Electron microscopic ... pp. 281-300. Copyright 1975, con autorizaci6n de Elsevier. Imagen cortesia de Pierre Chambon .

La digestion de la cromatina con nucleasa de micrococos Iibera nucleosomas individuates. La barra mide 100 nm. Reproducida de Cell, vol. 4 Oudet. P., et al., Electron microscopic ... pp. 281-300. Copyright 1975, con autorizaci6n de Elsevier. Imagen cortesla de Pierre Chambon.

especialmente extendidas, los nucleosomas estan conectados por una cadena fina que corresponde a una cadena doble de DNA libre. Una cadena doble continua de DNA transcurre por la serie de partfculas. Si se trata Ia cromatina con la endonucleasa conocida como nucleasa d e micrococos, que corta Ia cadena de DNA en la union entre nucleosomas, se pueden obtener nucleosomas individuales; primero Iibera grupos de partfculas y despues nucleosomas independientes, que en la se ven como partfculas compactas que se sedimentan a-ll S. El nucleosoma contiene -200 bp de DNA vinculadas con un octdmero de histonas que consta de dos capias de cada una de las histonas medulares conocidas como 29.2 El nucleosoma es la subunidad de la cromatina

759

Eje de simetrfa Protefna = 3.12 nm" Radio de giro

200 bp de DNA = 130 kD Protefna total Longitud = 67 nm

Octamero de histonas

= 108 kD

.

DNA= 5.2 n~

H1

=24 kD

11 nm

Los dos giros del DNA del nucleosoma e.:= EL nucleoso ma consta de masas casi equivalentes de DNA e histonas (incluida H1). La masa pronosticada del nucleosoma es de 242 kD.

-

muy juntos.

El DNA "sale"

El DNA "entra"

Los sitios de 80 bp de separaci6n en el DNA lineal se encuentran cerca del nucleosoma

Las secuencias de DNA que yacen en dife-:;-giros, rodea ndo al nucleosoma, pueden quedar muy jun-=EL nucleosoma puede ser un cilindro con el DNA organizado en dos giros en torno a su superficie. H2A, H2B, HJ y H4, cuyo vinculo se ilustra esque -

maticamente en la . . Con este modelo se explica Ia estequiometria de las histonas medulares deJa cromatina: H2A, H2B, H3 y H4 estan presentes en cantidades equimolares, con dos moleculas de cada una por cada -200 bp de DNA. Las histonas H3 y H4 son de las proteinas mas conservadas que se conocen, lo cual sugiere que sus funciones son identicas en todas las eucariotas. Los tipos H2A y H2B pueden reconocerse en todas las eucariotas, pero muestran variaciones de secuencia apreciables, espedficas de cada especie . La histona Hl es un conjunto de protefnas estrechamente relacionadas con variantes apreciables entre tejidos y especies, y su participacion es diferente de Ia de las histonas medulares; por otra parte, !a cantidad equivale a la mitad de la cantidad de una histona medular, ademas de que se puede extraer mas facilmente de la cromatina (en general con una solucion salina diluida [0.5 M]). La HI se puede eliminar sin afectar La estructura del nucleosoma, lo cual sugiere que su localizaci6n en !a particula es extema. 760

CAPITULO 29 Nucleosomas

La forma del nucleosoma corresponde a u r: co o cilindro plano de ll nm de diametro y ~ altura. La longitud del DNA es de -3 4 nm, c _ doble de Ja circunferencia de la partfcula y sigue _ vfa simetrica que rodea al octamero. En la se muestra un esquema de la vfa del DNA c asa helicoidal que da dos giros en torno al oct
Porci6n Sedimentaci6n Porci6n superior---------• inferior

Mon6meros Dfmeros

I~ Extracci6n de DNA y electroforesis

G La nucleasa de micrococos digiere la cromatina on los nCtcleos y produce una serie multi merica de bandas de )NA que pueden ser separadas mediante electroforesis en gel. :magen cortesia de Markus Noll, Universitat ZUrich.

0..

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El DNA esta enrollado en la estructura de los nucleosomas

c

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-o -o

3


·~ 1 000

• >95% del DNA se recupera en nucleosomas o multlmeros cuando la nucleasa de micrococos escinde el DNA de la cromatina. • La longitud del DNA por nucleosoma varia de tejido a tejido en un rango de 154 a 260 bp.

_J

: uando se digiere la cromatina con Ia enzima . ucleasa de micrococos, el DNA es escindido en :nultiplos integrates de una unidad de longitud. El :Taccionamiento por electroforesis en gel revela Ia escalera" que se representa en la . Tales :scaleras tienen - 1 0 escalones y Ia unidad de longi''.Jd determinada por los incrementos entre pelda":os sucesivos, es de -200 bp. En la se muestra que Ia escalera es =enerada por grupos de nucleosomas, que cuando e fraccionan sobre un gradiente de sacarosa, arro"ll una serie de picos bien definidos que correspon~en a mon6meros, dfmeros, trimeros y asf sucesiamente. Cuando se extrae DNA de las fracciones y e somete a electroforesis, cada fra cci6n resulta en _ a banda de DNA cuyo tamafio corresponde a un ~ldafio de Ia escalera de Ia nuc!easa de microco- s. El nucleosoma monomerico contiene DNA de _:l.a unidad de longitud, el dfmero de nucleosomas

800 600 400 200

Cada multi mero de nucleosomas contiene el nCtmero apropiado de unidades de longitud de DNA. En la fotografta, las bandas artificiales simulan una escalera de DNA. La imagen se estructur6 utilizando fragmentos de PCR cuyo tamaiio corresponde al de las bandas reales. Imagen cortesia de Jan Kieleczawa, Wyeth Reserch.

contiene el doble de Ia unidad de longitud de DNA, y asi sucesivamente. Cada peldano en Ia escalera representa a! DNA derivado de un numero definido de nucleosomas, de modo que se considera que !a escalera de 200 bp de cualquier cromatina indica que el DNA esta organizado en nucleosomas. La escalera microc6cica se genera cuando Ia enzima to rna soluble en acido (degradado hasta pequefios fragmentos) a solo - 2 % del DNA del nucleo. Asf, un pequeiio porcentaje del DNA atacado espedficamente, quiza represente regiones especialmente susceptibles. 29.3 El DNA esta enrollado en la estructura de los nucleosomas

761

Cuando la cromatina se escurre del nucleo, a menudo se observa una serie de nucleosomas conectados por una cadena de DNA libre (cuentas ensartadas en un hilo), no obstante, Ia necesidad de compactacion del DNA in vivo su giere que probablemente haya poco DNA libre (si acaso). Este punto de vista es confirmado por el h echo de que puede recuperarse >95 % del DNA de Ia cromatina en forma de escalera de 200 bp. Asf pues, casi to do e 1 DNA debe estar organizado en nucleosomas. Es muy probable que en su estado natural, los nucleosomas esten empaquetados estrechamente, con paso directo del DNA de uno al siguiente. Quiza la genera cion de DNA libre se deba a Ia perdida de algunos octa meros de histonas durante su aislamiento. La longitud del DNA del nucleosoma varfa, en cierta forma, de la cifra "usual" de 200 bp. La cromatina de cualquier tipo celular tiene un valor promedio caracterfstico (± 5 bp) . Normalmente, el promedio es de entre 180 y 200, pero hay ex tremos, apenas 154 bp (en un bongo) o basta 260 bp (en espermatozoides del erizo de mar). El valor promedio puede ser diferente en cada tejido del organismo adulto, y tal vez baya diferencias entre diferentes partes del genoma en un solo tipo de celula. Las variaciones del genoma promedio incluyen secuencias repetidas seriadas, como los grupos de genes de RNA de 55.

E1J

Los nucleosom as tienen una estructura com un

Conceptos principa les • El DNA de los nucleosomas se divide en DNA medular y DNA de enlace, dependiendo de su susceptibilidad a la nucleasa de micrococos. • El DNA medular tiene una longitud de 146 bp y se encuentra en las particulas centrales producidas par digestion prolongada con la nucleasa de micrococos. • El DNA de en lace es la region de 8 a 114 bp susceptible de escisi6n temprana por la enzima. • Los cambios en la longitud del DNA de enlace explican las variaciones de la longitud total del DNA nucleos6mico . • La H1 se vincula con el DNA de enlace y podria encontrarse en el punta en que el DNA entra y sale del nucleosoma.

Una estructura comun subraya Ia cantidad variable de DNA contenida en los nucleosomas de diferen tes fuentes . El vinculo del DNA con el octamero de histonas forma una panicula medular que contiene 146 bp de DNA, independientemente de Ia longitud del DNA del nucleosoma. La diferencia de 762


Tiempo de digestion

La nucleasa de micrococos disminuye la l - ; de los mon6meros de nucleosomas en pasos bien de"'- · Imagen cortesia de Roger Kornberg, Stanford Universit_' ~ -: of Medicine.

longitud total del DNA por nucleosoma se su p _ ~ ne a esta estructura medular basica. La particula medular es definida por lose: _de Ia nucleasa de micrococos en el nucleosom.;nomerico. La reaccion inicial de Ia enzima es entre nucleosomas, pero si se le permite com :.:despues de que se han generado m on omero: giere algo del DNA del nucleosoma individua: una reaccion en que el DNA es "recortado" c extremos del nucleosoma. La longitud del DNA disminuye en etapa~ ~ definidas, como se muestra en Ia 29.:1 . E::nucleos del hfgado de rata, los nucleosomas r:. mericos tienen inicialmente 205 bp de DNA ~ despues del primer paso, en algunos monome longitud del DNA ha disminuido a - 165 bp ~ acaban por disminuir a Ia longitud del DNA particula medular, 146 bp. (EI centro es razor_.:__: mente estable, pero Ia digestion continua gene:-.o "producto limitrofe de digestion", en el cuaL lo _ mentos mas largos del DNA central son de 14 6 _ los mas pequenos, apenas 20 bp.) Este analisis sugiere que el DNA de los n~; somas puede clividirse en dos regiones: • DNA medular, con una longitud inva:....o de 140 bp, y relativamente resistenre digestion por nucleasas. • DNA de enlace, qu e constituye el re ~ : Ia unidad de repetici6n. Su longitud · ~ de apenas 8 bp a tantos como 11 4 bnucleosoma.

El tamafio bien definido de Ia banda de DNA generada por la escision inicial con la nucleasa de micrococos sugiere que Ia region inmediatamente disponible para la enzima esta restringida y representa solo parte de cada DNA de enlace. (Si la totalidad de este fuese susceptible, la banda fluctuarfa entre 146 y >200 bp.) Sin embargo, una vez que se ha hecho un corte en el DNA de enlace, el resto de Ia region se torna susceptible y puede eliminarse relativamente rapido por accion enzimatica adicional. En la 1 se representa la conexion entre los nucleosomas . Las partfculas medulares tienen propiedades parecidas a las de los nucleosomas mismos, si bien, son mas pequefias. Su forma y tamaiio son similares a los de los nucleosomas, lo cual sugiere que la geometrfa esencial de la particula depende de las interacciones entre el DNA y el octamero de protefnas. Las partfculas medulares se obtienen mas facilmente como grupo homogeneo, de modo que para estudios estructurales, a menudo se prefieren a los preparados de nucleosomas (que tienden a variar, pues es diffcil obtener una preparacion en que no haya habido un recorte terminal del DNA). ;__ Cuales son las caracterfsticas ffsicas de Ia region medular y lade enlace? Estos terminos se introdujeron como definiciones operativas para describir las regiones en cuanto a su susceptibilidad relativa al tratamiento con nucleasas, pero dicha descripcion no tiene implicaciones acerca de su estructura real, de ahi que Ia mayor parte del DNA medular se encorva sobre el nucleosoma, en tanto que las regiones terminales de la porcion medular y lade enlace estan mas extendidas (vease la seccion 29.5, La estructura del DNA varia en la superficie del nucleosoma). La existencia del DNA de enlace depende de factores diferentes a las cuatro histonas medulares . Los experimentos de reconstitucion in vitro muestran que estas ultimas tienen una capacidad intrinseca para organizar el DNA en partfculas medulares, pero no forman nucleosomas con la unidad de longitud apropiada. El grado de superenrollamiento del DNA es un factor importante. La histona H1 y las protefnas no histonas, o ambas, influyen en Ia longitud del DNA de enlace vinculado con el octamero de histonas -en una serie natural de nucleosomas. Las "protefnas de ensamblaje" que no forman parte de la estructura del nucleosoma, participan in vivo en la estructuracion de los nucleosomas a partir de histonas y DNA (vease la seccion 29.9, La replicacion de la cromatina implica el ensamblaje de los nucleosomas) . ;__Donde esta Ia histona Hl? Se perdio durante Ia fragmentacion de nucleosomas monomericos, y si bien se puede retener en monomeros que aun tienen 165 de bp de DNA, siempre se pierde con la

.....

-

146bp

Mononucleosomas Nucleosomas Partfculas recortados medulares La nucleasa de micrococos corta inicialmente entre los nucleosomas. Los mononucleosomas suelen tener ~200 bp de DNA. Los cortes terminates disminuyen la longitud del DNA primero a ~16 5 bp y posteriormente generan particulas medulares de 146 bp.

reduccion final ala partfcula medular de 146 bp, lo cual sugiere que la H l podrfa localizarse en Ia region del DNA de enlace, adyacente al DNA medular. Si Ia Hl esta localizada en el DNA de enlace, podria "sellarlo" dentro del nucleosoma por union con el punto en que el acido nucleico entra y sale (vease Ia Fig. 2 9.4). La idea de que H 1 yace en la re gion de union de nucleosomas adyacentes es compatible con los antiguos resultados de que es la que mas facilmente se elimina de Ia cromatina, y que la cromatina, sin H1 , es mas facilmente "solubilizada ". Ademas, es mas facil obtener una fibra estirada a manera de cuentas ensartadas en un hilo cuando se ha eliminado Ia Hl.

B1J

La estructura del DNA varia en la superficie del nucleosoma

Conceptos principales • El DNA le da 1.65 vueltas al octamero de histonas. • La estructura de l DNA se modifica de manera que tiene un numero mayor de pares de bases par giro en la parte media, pero menor en los extremos.

La exposicion del DNA en Ia superficie del nucleosoma explica porque es accesible a la escision por ciertas nucleasas. La reacci6n con las nucleasas que atacan a cadenas {micas ha sido especialmente informativa. Las enzimas desoxirribonucleasas I y II hacen hendiduras de una sola cadena en el DNA; fragmentan un enlace en una cadena, pero Ia otra se mantiene intacta en ese punto, de modo que los efectos no son visible en el DNA de doble cadena. Sin embargo, con Ia desnaturalizacion se liberan fragmentos cortos y no cadenas unicas de longitud total. Si el DNA ha sido marcado en sus extremos, se pueden identificar los fr agmento s terminales por autorradiograffa, segun se resume en la . Cuando el DNA esta libre en solucion, pre 29 .5 La estructura del DNA varia en la superficie del nucleosoma

763

Electroforesis

Marca 5'

Marca 5'

~ Fragmento marcado

•

Cuando se desnaturaliza el DNA para dar cadenas Cmicas, se revelan hendiduras en el DNA de doble cadena por la presencia de fragmentos. Si el DNA se marca (digamos en los extremos 5', solo los fragmentos 5' seran visibles mediante autorradiografia). El tamaiio del fragmento identifica la distancia de la hendidura al extrema marcado.

S12 S11 S10 S9

S8 S7

S6 S5 S4

S3

Los sitios para las hendiduras yacen a intervalos regulares a lo largo del DNA medular, como se observa en el producto de digestion de nucleos por la desoxirribonucleasa I. Imagen cortesia de Leonard C. Lutter, Henry Ford Hospital, Detroit, MI.

senta hendiduras (relativamente aleatorias). El DNA de los nucleosomas tambien puede ser modificado por las enzimas que le hacen hendiduras, pero solo a intervalos regulares . Cuando los puntas de corte se determinan mediante DNA con marca radioactiva en los extremos, y despues el DNA se desnaturaliza y somete a electroforesis, se obtiene una escalera del tipo que se muestra en Ia r 764


El intervalo entre peldanos sucesivos de la escalera es de 0 a 11 bases, y Ia escalera abarca tod;: Ia distancia del DNA medular. Los sitios de escisior. se numeran de Sl a Sl3 (Sl esta a -10 bases de: extrema 5' marcado, S2, a -20 bases, y asf sucesivamente); las posiciones respecto de la helice de~ DNA se ilustran en la No todos los sitios se cortan con igual frecuencia en algunos casos el corte es bastante eficaz, mientra~ que en otros, es· apenas perceptible. Las enzima> desoxirribonucleasas I y II generan Ia misma escalera, si bien con algunas diferencias en cuanto a la intensidad de las bandas, lo cual demuestra que e: patron de corte representa una serie unica de diana~ en el DNA, determinada por su organizacion, cor_ solo una ligera preferencia por sitios particulares impuesta por cada enzima. El mismo patron de corte se: obtiene por escision con un radical hidroxilo, lo cua: apunta a que el patron refleja la estructura del -pNA mismo, mas que preferencia de secuencias. La sensibilidad del DNA nucleosomico a las nu cleasas es analoga a un experimento de rastreo, a s~ que Ia falta de reaccion en sitios diana especificos e5 atribuible a Ia estructura del nucleosoma, en el cuaJ ciertas posiciones del DNA se hacen inaccesibles. Hay dos cadenas de DNA en la partfcula medu lar. de modo que en un experimento de marcado de extremos se incluyen los dos 5' (o 3'), uno en cada cadena. AsL el patron de corte incluye fragmento5 derivados de varias cadenas, lo cual se ilustra er_ Ia Figura 29.11, en que cada fragmento etiquetado proviene de una cadena diferente. El corolario e5 que en un experimento, cada banda marcada puede representar de hecho dos fragmentos generado5 por corte a la misma distancia de cualquiera de lo5 extremos marcados.

LComo, entonces, deberfan interpretarse las preferencias definidas en sitios especfficos? Un punto de vista es que la vfa del DNA en la partfcula es simetrica (casi un eje horizontal a traves del nucleosoma, como se ilustra en la Figura 29.4); por ejemplo, si la desoxirribonucleasa I no generara un fragmento de 80 bases, ello significarfa que la posicion a 80 bases de distancia respecto del extremo 5' de cualquiera de las cadenas noes suscep tible ala enzima. El segundo esquema de liberacion utilizado en la Figura 29 .13 refleja ese punto de vista e identifica a 57 como sitio 0, o centro de simetrfa. Cuando el DNA se inmoviliza sobre una superficie plana, los cortes resultan en sitios con separacion regular. La sugiere que dicho fen6meno refleja la recurrencia del sitio expuesto con Ia periodicidad helicoidal de Ia forma B del DNA. La periodicidad del corte (espaciado entre puntos de escision) coincide con la periodicidad estructural, de hecho es reflejo de ella (el numero de pares de bases por giro de la doble helice) , es decir, la distancia entre sitios corresponde al numero de pares de bases por giro. Las mediciones de ese tipo sugieren que un valor promedio para el DNA helicoidal de tipo B doble es de 10.5 bp /giro. (.Cual es la naturaleza de los sitios diana del nucleosoma? En Ia se muestra que cada sitio tiene de tres a cuatro posiciones en que ocurre el corte, esto es, el sitio de corte se define ±2 bp, por lo cual representa una cadena corta de enlaces, en ambas cadenas, que esta expuesta ala accion de Ia nudeasa en tres a cuatro pares de bases. Las intensidades relativas indican que se prefieren ciertos sitios a otros. A partir de ese patron, se puede calcular el punto "promedio " que se corta. En los extremos del DNA, los pares de sitios de 51 a 54 ode 510 a 513, distan entre sf 10.0 bases cada uno, mientras que en el centro de la partfcula, Ia separaci6n de los sitios entre S4 y S10 es de 10.7 bases (este analisis trata con posiciones promedio, de manera que los sitios no necesariamente estan separados por un numero entero de bases). La variaci6n en Ia periodicidad del corte en el DNA medular (10.0 en los extremos, 10.7 a la mitad) significa que su periodicidad estructural difiere. El DNA tiene mas bp /giro que Ia cifra correspon diente en solucion en la parte media, pero menos bp/giro en los extremos. La periodicidad promedio sobre el nudeosoma es de solo 10.17 bp /giro, sig nificativamente menor que lade 10.5 bp/giro del DNA en solucion. La estructura cristalina de la particula medular sugiere que el DNA se organiza en una superhelice plana de 1.65 giros en torno al octamero de histonas. El grado de inclinacion de la superhelice varfa,

Vista lateral

Vista superior

0

Dos esquemas de numeraci6n dividen el DNA de la partlcula medular en segmentos de 10 bp. Los sitios pueden numerarse de 51 a 513 a partir de un extrema, o tomando 57 para identificar la coordenada 0 de la simetr\a doble, que puede numerarse de -7 a +7.

Las posiciones mas expuestas del DNA se presentan con una periodicidad que refleja la estructura de la doble helice. (Para mayor claridad se muestran los sitios de s6lo una cadena .)

S9

S7

ss S4

El analisis de alta resoluci6n muestra que cada sitio de la desoxirribonucleasa I consta de varios enlaces fosfodiester adyacentes, susceptibles, segun se observa en este ejemplo de sitios 54 y 55 analizados en part\culas medulares con marca en los extremes. Imagen cortesla de Leonard C. Lutter, Henry Ford Hospital, Detroit MI. 29.S. La estructura del DNA varia en la superficie del nucleosoma

765

yen Ia parte media es discontinuo. Las regiones de gran curvatura se disponen de manera simetrica en las posiciones ±1 y ±4, que corresponden a S6 y S8, 53 y S 11 respectivamente, y son los sitios menos sensibles a Ia desoxirribonucleasa I. Una estruct ura de alta resoluci6n del centro del nucleosoma muestra en detalle como se distorsiona Ia estructura del DNA. Gran parte del superenrollado ocurre en los 129 bp centrales, que hacen 1.59 giros superhelicoidales izquierdos con un diametro de 80 A (so lo cuatro veces el diametro de Ia cadena dicatenaria del DNA). Las secuencias terminales de cualquier extremo hacen solo una pequefi.a contribuci6n a Ia curvatura general. Estos 129 bp centrales se encuentran en forma de DNA-B, pero con una curvatura sustancial, necesaria para formar la superhelice. El surco mayor se dobla suavemente, pero el menor tiene ensortijados abruptos, cambios de conformacion que explican porque Ia parte central del DNA del nucleosoma no suele ser diana para la union de proteinas reguladoras, que sue len unirse a las partes terminales del DNA central o a las secuencias de enlace.

ED

La periodicidad del DNA cambia en el nucleosoma

El grado de superenrollamiento de los nuc:e-.somas individuales del minicromosoma se pue medir como se ilustra en la . En prir :: termino, las super helices libres del minicromosomismo estan relajadas, de manera que los nude ~ mas forman una cuerda circular con una densi ·' _ superhelicoidal de 0. A continuacion se extraen _ octameros de histonas, con lo cual se Iibera alD. ·para que siga una vfa libre . Las superhelices c;: . estaban comprimidas en el minicromosoma ape_; ceran en el DNA desproteinado como -1 giro, y · se puede medir el numero total de superhelice>. :el DNA de SV40. La cifra observada se aproxima al numero .:. nucleosomas; el resultado sera inverso cuac los nucleosomas se ensamblan in vitro en un D.· de SV40 superenrollado, pues la formacion de cc. .:_ nucleosoma elimina -1 superhelice negativa . Asf pues, el DNA sigue una vfa en Ia superf del nucleosoma que genera -1 giro de superhe: : negativo cuando se elimina la protefna de rest.. _ cion, si bien Ia via que sigue el DNA correspor..a -1. 67 giros de superhelice (vease Ia Fig. 29.discrepancia que a veces se denomina paradoj a :numero de enlace. La discrepancia se explica porIa diferencia er::las 10.17 bp /giro promedio del DNA nucleos6n· -~

Concepto principal • Con el cambio en bp por giro se absorben -0.6 giros negativos del DNA, de 10.5 en soluci6n a un promedio de 10.2 en la superficie del nucleosoma, lo cual explica la paradoja del numero de enlaces.

La comprension de Ia estructura del DNA nucleosomico tiene Iugar cuando se comparan los pronosticos para el superenrollado de Ia vfa que sigue el DNA con las mediciones reales del superenrollado del DNA nucleosomico. Gran parte de los trabajos sobre la estructura de los conjuntos de nucleosomas se ha hecho en el virus SV40, cuyo DNA es una molecula circular de 5 200 bp con una longitud de contorno de - 1 500 nm. Tanto en el virion como en el nucleo infectado se empaqueta una serie de nucleosomas, que juntos se denominan minicromosoma. Como se afsla normalmente, Ia longitud del contorno del minicromosoma es de -210 nm, que corresponde a una razon de empaquetado de -7 (esencialmente la misma que Ia de -6 del nucleosoma mismo). Los cambios en Ia concentracion de sales pueden convertirlo en un hilo de cuentas flexible, con una proporcion mucho menor de empaquetado general, lo cual subraya el punto de que, in vitro, las tiras de nucleosomas pueden asumir mas de una forma, dependiendo de las condiciones. 766


Minicromosoma superenrollado

I Tratamiento con

~ topo1somerasa

Minicromosoma relajado

!

Eliminaci6n de protefnas

DNA superenrollado

La s superhelices del minicromosoma de SV4: : pueden relajar para generar una estructura circular cuya per-·:: de histonas genera entonces superhelices en el DNA libre.

:: las I 0.5 bp/giro del DNA libre. En un nucleoso~a de 200 bp se tienen 200/l 0.17 = 19.67 giros. Cuando el DNA se libere del nucleosoma, tendra 200/l0.5 = 19.0 giros. La vfa del DNA en que el enrollado es menos compacto, sobre el nucleosoma, absorbe -0. 67 giros, lo cual explica !a discrepancia entre la via fisica de -1.67 y la medicion de -1.0 giros superhelicoidales. De hecho, algo de la tension por torsion en el DNA de los nucleosomas depende del aumento del numero de bp/giro; solo queda el resto para medirse como superhelice.

Organizaci6n del octamero de histonas Conceptos principales • El meollo del octamero de histonas esta constituido por un tetramero, H3 2-H42 vinculado con dos dimeros H2A-H2B. • Cada histona presenta interdigitaci6n intensa con su contra parte. • Todas las histonas medu lares tienen el segmento estructural de pliegue. Las colas terminates N salen del nucleosoma.

Basta ahora se ha analizado la estructura del nucleosoma desde la perspectiva de su organizacion en el DNA de la superficie, pero desde la perspectiva de las protefnas, se necesita saber como interactuan las histonas entre si y con el DNA. (.Reaccionan apro piadamente solo en presencia de DNA o poseen una capacidad independiente para formar octameros? La mayor parte de las pruebas ace rca de las interacciones histona-histona provienen de su capacidad para formar complejos estables y de experimentos de enlace cruzado con el nucleosoma. Las histonas medulares forman dos tipos de complejos; H3 y H4 forman un tetramero (H\-H4zl, H2A y H2B forman varios complejos, en particular un dimero (H2A-H2B). Se puede obtener octameros de histonas fntegros por extraccion de la cromatina o (mas clificilmente), al permitir que las histonas se vinculen in vitro, en condiciones de concentracion alta de sales y protefnas. El octamero suele disociarse para generar un hexamero de histonas que ha perdido un dimero H2A-H2B, en tanto que el otro se pierde separadamente en ese punto, con lo que queda un tetramero H3 2 -H4 2 , fenomeno que apunta a una forma de organizacion en que el nucleosoma tiene l'ln "meollo" central constituido por el tetramero H\-H4 2; in vitro, este tetramero puede organizar al DNA en partfculas que muestran algunas de las propiedades de !a partfcula medular.

En un modelo simetrico del nucleosoma, el tetramero H3 2-H4 2 constituye el centro de la estructura. En la parte superior se observa un d1mero H2A-H2B; el otro esta debajo.

Los estuclios m ecliante enlaces cruzados amplian esas relacion es para mostrar que pares de histonas estan cerca uno del otro en el nucleosoma. (Un problema con clicha informacion suele ser que solo un pequefio porcentaje de las protefnas tiene enlaces cruzados, de modo que es necesario ser cauto al decidir silos resultados tipifican a las principales interacciones. ) A partir de esos datos, se ha construido un modelo de la organizacion del nucleosoma, esqu ematizado en la Mediante estudios estructurales se ha mostrado que la forma global del octamero de histonas es similar a la de !a partfcula medular, lo cual sugiere que las interacciones histona -histona establecen la estructura general. Las posiciones de cada una de elias han sido asignadas a regiones de estructura octamerica con base en su comportamiento al interactuar y en respuesta a enlaces cruzados. La estructura cristalina (con una resolucion de 3.1 A) sugiere el modelo que se muestra en !a para el octamero de histonas. El rastreo de las vias de las columnas polipeptfdicas individuates de la estructura cristalina sugiere que las histonas no solo se organizan como proteinas globulares individuales, sino que cada una se interdigita con su contraparte, H3 con H4 y H2A con H2B. Asf, en el modelo se distingue el tetramero H3 2 -H4 2 (blanco) de los dfmeros H2A-H2B (azules) , pero no se muestran las histonas aisladamente. En la parte superior se representa la misma perspectiva esquematica de la Figura 29.1 7. El tetramero H\ -H4 2 contribuye al diametro del octamero y asume la forma de una herradura. Los pares H2A-H2B se acoplan como dos dfmeros, pero en esa imagen solo se observar uno. La vista lateral representa Ia misma perspectiva de la Figura 29.4, en la cual se distingue la participacion del tetrame 29.7 Organizaci6n del octamero de histo nas

767

Los pares de histonas forman una "mitad de nucleosoma"

La superposici6n de los pares de histonas muestra organizaci6n simetrica

Modelo tridimensional de la estructura cristalina del octamero de histonas, con el tetramero H3 2-H4 2 en blanco y los dimeros H2A-H2B en azul. Solo uno de los d\meros HsA-H2B es visible en la imagen superior, el otro esta escondido debajo. La via potencial del DNA se muestra en la parte superior como un tubo estrecho (de una cuarta parte del diametro del DNA); en lavista lateral son las lineas paralelas de un haz de 20 Ade ancho. Image n cortes\a de E. N. Moudrianakis, Johns Hopkins University.

ro H \ -H4 2 y de los dimeros H2A-H2B separados. La protefna forma un tipo de carrete, con una vfa superh elicoidal que podrfa corresponder al sitio de union del DNA, enrollado casi 2 giros completos en un nucleosoma. El modelo muestra una doble simetrfa en torno a un eje qu e correrfa en forma perpendicular en Ia vista lateral. En la se resume una vista mas detallada de las posici ones de las histon as (con base en una estructura cristalina a 2.8 A ) . La imagen superior m uestra la posicion de una histona de cada tipo respecto de un giro en to rno a un nucleosoma (nume radas de 0 a + 7). Las cuatro histonas medulares muestran un tipo similar de estructura, en que 3 ex helices se conectan con dos asas, a lo que se le llama pliegue de histonas. Las regiones interactuan para formar h eterodfmeros con for m a de lunula; cada uno se une a 2 .5 giros de la h eli ce doble 768

CAPiTULO 29 Nucleosomas

H2A H2B H3

H4

Las posiciones de las histonas en una __ desde arriba muestran los pares H3-H4 y H2A-H28 en una m':= : de nucleosoma; en la imagen inferior se percibe la organizac' : · simetrica por la superposici6n de ambas mitades.

de DNA (H2A-H2B se une a +3.5- +6; H3-H4 ~= une a +0.5- +3 en la circunferencia que se ilustr::. La union ocurre en gran parte de la columna .:. enlaces fosfodiester (compatible con Ia necesid~ _ de compactar cualquier DNA, independientemente .:. su secue ncia ). El tetramero H3 2 -H4 2 se forma interacciones entre las dos subunidades H3, co:::-. puede observarse en la parte inferior de la figure. Cada una de las histonas medulares tiene ·..:..;::. cuerpo globular que contribu ye a lamas a proteir:central del nucleosoma, ademas de una cola ter:::: . nal N flexible con sitios para modificacion, que p · den ser importantes para la funcion de la cromat ~--" La posicion de las colas, que contribuyen con ca_·

N

N

IG Los cuerpos globulares de las histonas se localizan en el octamero de la particula medular. No obstante, se desconoce la localizaci6n de las colas terminales N, que portan los sitios para modificaci6n, que podrian ser mas flexibles.

La fibra de 10 nm esta parcialmente desenrollada; se observa que esta constituida por una cadena de nucleosomas. Imagen cortes\a de Barbara Ham kalo, University of California, Irvine.

B1J

La via de Los nucleosomas en la fibra de cromatina

Conceptos principales • Las fibras de cromatina de 10 nm se despliegan a partir de fibras de 30 nm y constan de una cadena de nucleosomas. • Las fibras de 30 nm tienen seis nucleosomas por giro organizados en un solenoide. • La histona Hl es necesaria para la fo rmaci6n de la fibra de 30 nm.

Las colas terminales N de las histonas estan desordenadas y salen del nucleosoma entre giros del DNA.

25% de Ia masa protefnica, no esta tan bien definida, como se indica en Ia . No obstante, Las colas de H3 y H2B se pueden observar pasando entre giros de Ia superhelice de DNA y extendiendose fuera del nucleosoma, como se muestra en Ia . Cuando las colas de histonas se entrecruzan con el DNA por irradiaci6n UV, se obtienen mas productos con nucleosomas que con partfculas medulares, lo cual podrfa significar que las colas entran en o con el DNA de enlace. La cola de H4 parece hacer o con un dfmero H2A-H2B de un nucleosoma adyacente, que podrfa ser una caracterfstica importante en Ia estructura global.

Cuando se revisa Ia cromatina bajo el microscopio electr6nico, se observan dos tipos de fibras, de 10 y 30 nm, descritas por su diametro aproxima do (que en Ia fibra de 30 nm en realidad flucttia entre -2 5 y30nm). La fibra de 10 nm es esencialmente una cuerda continua de nucleosomas que, de hecho, en oca siones transcurre de forma continua por una region mas di stendida en que se observan los nucleoso mas como un hilo de cuentas, segun se indica en el ejemplo de Ia . La estructura fibrilar de l 0 nm se obtiene en condiciones de escasa fortaleza i6nica y no requiere de la presencia de la histona Hl, lo cual significa que. estrictamente, es una funcion de los nucleosomas mismos. que en esencia puede ser observada como una serie continua de nucleosomas, como se muestra en la Nose sa be si tal estructura existe in vivo o es simplemente una consecuencia de su despliegue durante la extracci6n in vitro. Cuando se visualiza la cromatina en condiciones de mayor fortaleza i6nica, se obtiene Ia fibra de 29.8 La via de los nucleosomas en la fibra de cromati na

769

..

- -

La fibra de 10 nm es una cadena conti nua de nucleoso mas. La fibra de 30 nm es un list6n helicoidal constituido por dos hileras paralelas de nucleosomas enrollados .eun solenoide.

La estructu ra de la fi bra de 30 nm esta enrollada. Imagen cortes1a de Barbara Hamkalo, University California, Irvine.

30 nm,. como en Ia , en Ia cual se m uestra que Ia fibra tien e una estructura enrollada subyacente; presenta - 6 nucleosomas por giro, es decir, una razon de empaquetado de 40 (esto es, en cada pm del eje de la fibra estan contenidos 40 pm de DNA); en este caso sf se requiere Ia presencia de Hl. Esta fibra es el constituyente fundamental de Ia cromatina de interfase y los cromosomas en mitosis. La disposicion mas probable para el empaquetado de los nu cleosomas en Ia fibra es Ia de un solenoide, en el que los nucleosomas giran con una trayectoria h elicoidal y se enrollan en torno a una cavidad 770


central. Las dos formas pri.ncipales de un solenoide son un solo inicio, que forma un arreglo lineal unico. y dos inicios, en que efectivamente hay una doble hilera de nucleosomas. La muestra un modelo de dos inicios, sugerido por datos recientede enlaces cruzados mediante los cuales se identific6 una doble pila de nucleosomas en la fibra de 30 nm: esto es sustentado por Ia estructura cristalina de un complejo tetranucleosornico. Las fibra s de 30 y l 0 nm pueden convertirse de manera reversible merced a cambios en la fortaleza ionica, lo cual sugiere que la disposicion lineal de los nucleosomas de Ia fibra de l 0 nm desaparec a! enrollarse dentro de Ia estructura de 30 nm en condiciones de mayor fo rtaleza ionica y en presencia de Hl. Si bien Ia presencia de esta ultima es n ecesaria para Ia formacion de Ia fibra de 30 nm, la informacion acerca de su localizaci6n es controvertida. La relativa facilidad con que se extrae la cromatina parece apuntar en el sentido de que se encuentra en Ia parte externa del eje de Ia fibra superhelicoidal. No obstante, m edian te datos de difraccion y por el h ech o de qu e es mas diffcil encontrarla en fibras de 30 nm que en las de l 0 nm que Ia retienen, se argumenta respecto de una localizacion interna. (Como se pasa de Ia fibra de 30 nm a las estructuras especfficas que se muestran en los cromosomas mitoticos? (_Hay alguna especificidad adicion a: en Ia disposicion de Ia cromatina de interfase? (,Tien en las regiones particulares de fibras de 30 nm una relacion fija entre sf o su disposicion es aleatoria?

La replicaci6n de La cromatina requiere del ensamblaje de los nucleosomas

No replicado

No replicado ~ Replicado

C:>nceptos principales

• Los octameros de las histonas no se conservan durante la replicaci6n, a diferencia de los d1meros H2A-H2B y los tetrameros H3 2-H4 2 • • Hay diferentes v1as para el ensamblaje de los nucleosomas durante la replicaci6n e independientemente de esta. • Para eliminar al ensamblaje de los nucleosomas, se requieren prote1nas rias. .. El CAF-1 es una prote1na de ensamblaje que se vincula con la subunidad PCNA del replicosoma; es necesaria para el deposito de los tetrameros H3 2-H4 2 despues de la replicaci6n. • Para el ensamblaje independiente de la replicaci6n se puede usar una prote1na de ensamblaje diferente y una variable de la histona H3.

En la replicacion del DNA se separan sus cadenas y, por tanto, debe alterarse inevitablemente Ia estructura del nucleosoma. La transitoriedad del suceso de replicacion constituye un problema importante para el analisis de una estructura en particular durante dicho proceso. La estructura del triplete de replicacion es caracteristica; es mas resistente ala nucleasa de micrococos y es digerida en bandas que difieren de tamafio respecto del DNA del nucleosoma. La region que muestra esa estructura alterada se confina a la vecindad inmediata del triplete de replicacion, lo cual sugiere Ia participacion de un gran complejo proteinico, pero los nucleosomas se vuelven a formar mas 0 menos inmediatamente detras de el, conforme se traslada. La replicacion de Ia cromatina no implica ningun periodo prolongado durante el cual el DNA carezca de histonas, una vez que se ha replicado, los nucleosomas se regeneran rapidamente en ambos productos de Ia replicacion. Este punto se ilustra mediante la micrografia electronica de la , que muestra una cadena de DNA con replicacion reciente, ya empaquetada en los nucleosomas de ambos segmentos de las cadenas dobles hijas. Asi pues, tanto el analisis bioquimico como Ia visualizacion del triplete de replicacion sugieren que Ia alteracion de Ia estructura del nucleosoma se limita a una region corta, inmediata a! triplete, el cual, a! avanzar, desintegra los nucleosomas, pero estos se forman otra vez rapidamente en las cadenas dobles hijas, conforme el triplete avanza. De hecho, el ensamblaje de los nucleosomas tiene enlace directo con el replisoma, que esta replicando el DNA.

El DNA replicado se incorpora de inmediato a los nucleosomas. Imagen cortes1a de Steven L. McKnight, UT Southwestern Medical Center at Dallas.

(Como se relacionan las histonas con el DNA para generar nucleosomas? ('Las histonas forman previamente un octamero de proteinas alrededor del cual el DNA forma despues una cubierta, o se ensambla el octamero de histonas sobre el DNA a partir de histonas libres? La muestra que para el ensamblaje de los nucleosomas se pueden usar dos vias in vitro, dependiendo de las condiciones. En una de elias, un octamero preformado se une al DNA, y en la otra, primero se une un tetramero de H\-H4 2 y despues se unen dos dimeros H2A-H2B. Ambas vias tienen relacion con reacciones in vivo. La primera refleja Ia capacidad de la cromatina de remodelarse por movimientos de los octameros de histonas a lo largo del DNA (vease Ia seccion 30.3, El remodelado de Ia cromatina es un proceso activo). La segunda representa la vfa utilizada en la replicacion. Las protefnas rias ayudan a las histonas en su vinculacion con el DNA. Los candidatos para esa funcion se pueden identificar mediante extractos que ensamblan histonas y DNA exogeno en los nucleosomas. Las protefnas rias pueden actuar como "chaperones moleculares", que se unen a las histonas para liberar controladamente histonas o complejos de histonas (H3 2 -H4 2 o H2A-H2B) hacia el DNA; esto podrfa ser necesario porque las histonas, como protefnas basicas, tienen una elevada afinidad general por el DNA. Las interacciones mencionadas permiten a las histonas formar nucleosomas sin ser atrapadas en otros intermediaries cineticos (esto es, otros complejos que resultan de la union homogenea de las histonas a! DNA). Los intentos de producir nucleosomas in vitro empiezan con el analisis de un proceso de ensamblaje entre el DNA libre y las histonas, si bien in vivo, los nucleosomas se forman solo cuando el DNA se

29 .9 La replicaci6n de la cromatina requiere del ensamblaje de los nucleosomas

771

El octamero se El octamero ensambla sabre e\ DNA preformado se une

La conservacion del octamero pronostica que los nucleosomas contienen exclusivamente histonas antiguas o nuevas

( ' H4

Octamero antiguo conservado

Octamero nuevo

Enlaces cruzados de histonas, extraccion de octameros y analisis de Ia densidad

~ H2A-H2B (debajo) H2A-H2B

In vitro, el DNA puede interactuar directamente en un octamero de histona lntegro (en enlace cruzado), o bien ensamblarse con el tetramero H3 2-H4 2, despues de lo cual se agregan dos dlmeros H2A-H2B.

replica. Se ha perfeccionado un sistema que simula ese requisito con extractos de celulas humanas que replican el DNA de SV40 y ensamblan los productos en Ia cromatina. La reaccion de ensamblaje ocurre preferentemente en el DNA en proceso de replicacion, para lo cual se requiere un factor auxiliar, el factor de ensamblaje de Ia cromatina (CAF)-1, que consta de >5 subunidades con una masa total de 238 kD. El antfgeno nuclear de celulas en proliferacion (PCNA), factor de progreso de Ia polimerasa de DNA, recluta al CAF-1 para el triplete de replicacion; con esto se logra el enlace entre Ia replicacion y el ensamblaje de nucleosomas, de modo de asegurar que los nucleosomas se ensamblen tan pronto como el DNA se haya replicado. El CAF-1 actua de manera estequiometrica y por union con H3 y H4 recien sintetizadas, lo cual sugiere que se forman nuevos nucleosomas, primero por ensamblaje del tetramero H\-H4 2 y por Ia adicion posteri or de los dimeros H2A- H2B. Los nucleosomas que se forman in vitro tienen una longitud de repeticion de 200 bp, pero carecen de his772


Si se conservaran los octameros de histo- :..: los octameros antiguos y nuevas tendrian bandas de difere-:__ densidades al ocurrir la replicaci6n de los octameros pes2: -en los aminoacidos ligeros.

ton as H l, lo cual sugiere que sinH l se puede lo ll~ .:. el espaciamiento apropiado. Cuando se replica la cromatina, se replica ucadena de DNA ya vinculada con nucleosomas, Io ru.:. da origen ados cadenas hijas dobles. (.Que pasa c los nucleo somas preexistentes en ese punto? cL octameros se disocian de histonas en histonas ~ bres para ser utilizadas de nuevo, o se mantier: e ensamblados? La integridad del octamero se pu ~:: estudiar por los enlaces cruzados de las histonas. ::: las siguientes dos figuras se comparan los posib::: resultados de un experimento en que se culti,-,:_ eel ulas en presencia de aminoacidos pesados -:identificar las histonas antes de Ia replicacion; de-pues se permite que ocurra la replicacion en pre ecia de aminoacidos ligeros. En ese punto, los oc.: meros de histo na presentan enlaces cruzados y centrifugan en un gradiente de densidad. La ~ muestra que si se han conservado los octiL_ ros originales, se encontrara.n en una posicior: :: alta densidad, de modo que los nuevos ocupa;.:Ia posicion de baja densidad. Pero esto no lleg=. ocurrir. En la posicion de alta densidad se encuei:.::_ poco materiaL lo cual sugiere que los octameros .:.

Histonas antiguas

Histonas recien sintetizadas

1 . El triplete de

replicaci6n avanza hacia el nucleosoma

2. El tetramero de histonas es desplazado y se desensambla

las histonas recien sintetizadas se ensamblan

Tetrameres H3-H4

Siguiente nucleosoma

t

Desensamblado y reensamblado pronostican que los nucleosomas contienen tanto histonas antiguas como nuevas, ya sea preensambladas de manera sistematica o aleatoriamente

y

Dimeros H2A-H2B

t

Sintesis durante Ia laseS

3.

H3 y H4 antiguas, H2A y H2B nuevas

Disposici6n aleatoria

Enlaces cruzados de histonas, extracci6n de octameros y analisis de Ia densidad

Pesado

-------l~

Ligero

Cuando los octameros pesados se replican con aminoacidos ligeros, los nuevas octameros presentan bandas difusas entre densidades pesadas y ligeras, lo cual sugiere que ha habido desensamblado y reensamblado.

histonas nose conservan. Los octameros tienen una densidad intermedia, y en Ia se muestra lo que serfa el resultado esperado si se hubieran liberado las histonas antiguas y despues reensamblado con histonas recien sintetizadas. El patron de desensamblado y reensamblado ha sido dificil de caracterizar en detalle, pero en la · · se muestra un modelo funcional. El triplete de replicaci6n desplaza a los octameros de histonas, que despues se disocian en tetrameros H3 2 -H4 2 y dfmeros H2A-H2B. Esos tetrameros y dfmeros "antiguos" entran a un fondo de reserva que tambien incluye "nuevos" tetrameros y dfmeros que se ensamblan a partir de histonas de recien-

Los tetrameros H3-H4 se unen a cadenas dobles hijas

4.

Los dimeros H2A-H2B se unen

CAF

El paso del triplete de replicaci6n desplaza los octameros de histonas del DNA, que se desensamblan en tetrameros H3H4 y dimeros H2A-H2B. Las histonas recien sintetizadas se ensamblan en tetrameros H3-H4 y dimeros H2A-H2B. Los tetrameros y dimeros antiguos y nuevas se ensamblan de manera aleatoria con ayuda de CAF-1 en nuevas nucleosomas, inmediatamente detras del triplete de replicaci6n.

te sintesis. Los nucleosomas se ensamblan a -600 bp detras del triplete de replicaci6n, proceso que se inicia cuando los tetrameros H\-H4 2 se unen a cada una de las cadenas dobles hijas, ayudados por CAF-l. Dos dfmeros H2A-H2B se unen entonces a cada tetramero H3 2 -H4 2 para completar el octamero de histonas. El ensamblaje de tetrameros y dfmeros es aleatorio respecto de subunidades "antiguas" y "nuevas", lo cual explica los resultados de la Figura 29.29. El tetramero H\-H4 2 "antiguo" podrfa ser un vinculo transitorio con una cadena simple de DNA durante la replicaci6n; de hecho, tal vez tendrfa mas probabilidades de mantenerse dentro de la cadena lfder para su reutilizaci6n. Es posible que los nucleosomas se escindan y vuelvan a ensamblar de forma similar durante Ia transcripci6n (vease la

29,9 La replicaci6n de la cromatina requiere del ensamblaje de los nucleosomas

773

secci6n 2 9.11, (.LOs genes transcritos se organizan en nucleosomas?) . Durante Ia fase S (periodo de replicaci6n del DNA) en un ciclo celular eucariotico, la replicaci6n de la cromatina implica la sfntesis de suficientes protefnas histonas como para empaquetar todo el genoma, basicamente debe sintetizarse la misma cantidad de histonas que las ya contenidas en los nucleosomas. La sfntesis de RJ.\JAm de histonas es controlada como parte del ciclo celular y aumenta enormemente en la fase S. La via para el ensamblaje de la cromatina a partir de esa mezcla equivalente de histonas antiguas y nuevas durante la fase S se le denomina vfa de replica cion acoplada (RC). En otra vfa, Hamada via independiente de las replicaciones (RI), se ensamblan nucleosomas durante otras fases del ciclo celular, cuando no se esta sintetizando DNA. Esto resultarfa necesario como resultado de daiios en el DNA o porque los nucleosomas se desplazan durante la transcripci6n. El proceso de ensamblaje debe tener necesariamente algunas diferencias respecto de la via acoplada a la replicaci6n porque no puede vincularse con el aparato respective. Una de las caracteristicas mas interesantes de la via independiente de Ia replicacion es que utiliza variantes de algunas de las histonas diferentes de las utilizadas durante Ia replicaci6n. La variante de histona H3. 3 difiere de la hisrona H3 altamente conservada en cuatro aminoacidos; la primera sustituye lentamente a la H3 en celulas en proceso de diferenciacion que no tienen ciclos de replicaci6n. Esto sucede como resultado del ensamblaje de nuevos octameros de histonas para sustituir a los que han sido desplazados con el DNA por cualquier motivo. El mecanismo que se utiliza para asegurar el uso de H3.3 en la via independiente de Ia replicacion es diferente en dos casos investigados. En los protozoarios del genero Tetrahymena el uso de histonas depende exclusivamente de su disponibilidad. La histona H3 se sintetiza solo durante el cido celular, en tanto que Ia variante de reposicion se sintetiza solo en celulas sin replicaci6n. En el genera Drosophila, sin embargo, hay una vfa activa que asegura Ia utilizaci6n de H3.3 por la vfa independiente de la replica cion. Nuevas nucleosomas que contienen H3 .3 se ensamblan en los sitios de transcripci6n, supuestamente sustituyendo a nucleosomas desplazados por la polimerasa de RNA. El proceso de ensamblaje discrimina entre H3 y H3.3 con base en sus secuencias, excluyendo especfficamente la utilizacion de H3. Por el contrario, el ensamblaje acoplado ala replicacion hace uso de ambos tipos de H (aunque H3.3 esta disponible en concentraciones mucho menores que H3, y, por tanto, entra solo a un pequefio porcentaje de los nucleosomas). 77 4


Probablemente el CAFl no participa en el e-samblaje independiente de la replicaci6n. (Tamb:e · hay organismos como las levaduras y los del gene: Arabidopsis, para los males el gen no es indispe L ble, lo cual implica el uso de procesos alternati· en el ensamblaje acoplado a la replicaci6n.) roteina que puede participar en el ensamblaj e _dependiente de la replicaci6n se denomina HJF cuyo agotamiento en sistemas in vitro para el :-- samblaje de nucleosomas inhibe la formaci6 r. nucleosomas en el DNA no replicado, pero no :: el que esta en proceso de replica cion, lo cual in d.....:. que, de hecho, las vias utilizan diferentes mecamos de ensamblaje. La HIRA actua como chape: para facilitar Ia incorporacion de histonas en nucleosomas, vfa que supuestamente se enca ~: en general, del ensamblaj e independiente de la :- .plicaci6n; por ejemplo, es necesaria para la desc -_densaci6n del nucleo del espermatozoide, cua r:. :__ las protaminas son sustituidas por las histonas p - _ generar cromatina competente en la replicac: despues de la fecundaci6n . El ensamblaje de los nucleosomas que con~ ·: nen una alternativa de H3 tambit~n ocurre en centr6meros (vease la seccion 31.3, La heteroc marina depende de las interacciones con histone.: El DNA centromerico se replica tempraname:: durante Ia fase de replicaci6n del ciclo celula r _:_ diferencia de las secuencias heterocromaticas r-cundantes, que se replican despues; vease la c-:cion 15.7, Cada cromosoma eucari6tico contie:::. muchos replicones). Se inhibe la incorporaci6n :_H en los centr6meros y en su Iugar, en las cehk:: eucariotas superiores, se incorpora una prote ~ .:: llamada CENP-A (en el genero Drosophila sell~ Cid y en las levaduras Cse4). Esto ocurre en la -.-___::_ de ensamblaje independiente de la replicaci6n. : parecer porque la vfa acoplada a la replicacion : inhibe durante un lapso breve, mientras se repL_ el DNA centromerico.

tlos nucleosomas yacen en posiciones espedficas? Conceptos principales • Los nucleosomas pueden formarse en posiciones especificas como resultado de la estructura local del DNA o de las prote\nas que interactuan con secuencias espec1ficas. • La causa mas frecuente de la posicion del nucleosoma es ell\mite impuesto por las prote\nas que se unen al DNA. • El posicionamiento influye en que regiones del DNA quedan en el enlace y que cara del DNA se expone a la superficie del nucleosoma.

Se sabe que los nucleosomas pueden reconstituire in vitro, independientemente de Ia secuencia del DNA, pero esto no significa que su formac ion in vivo sea asf. (.Yace siempre una secuencia de DNA en particular en cierta posicion in vivo respecto de Ia topograffa del nucleosoma, o estan los nucleosomas dispuestos en forma aleatoria en el DNA, de manera que una secuencia especffica pueda presentarse en cualquier localizacion, por ejemplo, en Ia region medular en una copia del genoma y en Ia region de enlace en otra? Para responder a esta interrogante es necesario usar una frecuencia definida de DNA, mas precisamente, se tiene que determinar Ia posicion de un punto definido del DNA respecto del nucleosoma. En Ia se ilustra el principia de un procedimiento para lograrlo. Supongase que Ia secuencia de DNA se organiza en nucleosomas solo con cierta configuracion, de manera que cada sitio del DNA siempre se localice en una posicion particular del nucleosoma. Ese tipo de organizacion se llama posicionamiento del nucleosoma (o, a veces, fases del nucleosoma). En una serie de nucleosomas en posicion, las regiones del DNA de enlace constituyen sitios unicos. Considerese Ia secuencia nada mas para un nucleosoma. La escision con nucleasa de micrococos genera un fragmento monomerico que constituye una secuencia espedfica. Si el DNA se afsla y escinde con una enzima de restriccion que tiene solo un sitio diana en ese fragmento, podrfa cortarse en un punto unico, lo cual resultarfa en dos fragmentos, cada uno de tamaii.o unico. Los productos de Ia doble digestion, por enzimas de restriccion y micrococica, se separan por electroforesis en gel. Para identificar el fragmento correspondiente en el producto de Ia doble digestion, se usa una sonda que representa la secuencia de un !ado del sitio de restriccion, tecnica llamada de marcado terminal indirecto. Revirtiendo el argumento, Ia identificacion de una sola banda demuestra que Ia posicion del sitio de restriccion tiene definicion exclusiva respecto del extremo del DNA del nucleosoma (seg(m se define por el corte de Ia nucleasa micrococica). Asf, el nucleosoma tiene una secuencia de DNA (mica. (.Que pasa silos nucleosomas no yacen en una sola posicion? Ahora, los DNA de enlace constan de diferentes secuencias en cada copia del genoma, de modo que el sitio de restriccion yace en una posicion diferente cada vez; de hecho, se encuentra en todas las localizaciones posibles respecto de los extremos del DNA nudeosomico monomerico. La muestra que Ia doble escision genera entonces una amplia extension, del fragmento mas

El posicionamiento ubica Ia secuencia diana (raja) en una ubicaci6n exclusiva

La nucleasa de micrococos Iibera mon6meros

La enzima de restricci6n cotta en Ia secuencia diana

! El fragmento tiene un corte de restricci6n en un extreme, un corte microc6cico en el otro extreme; Ia electroforesis resulta en una banda unica

El posicionamiento del nucleosoma coloca sitios de restricci6n en ubicaciones unicas respecto de los sitios de enlace escindidos por la nucleasa de micrococos.

pequeii.o detectable (casi 20 bases) a Ia longitud del DNA monomerico. AI describir esos experimentos se ha tratado a Ia nucleasa de micrococos como una enzima que escinde el DNA en las regiones de enlace expuestas sin ning(m tipo de especificidad de secuencia. En realidad, Ia enzima tiene Ia misma especificidad de secuencia, no obstante que se desvfa hacia Ia seleccion de secuencias ricas en A-T. Por tanto, no es posible suponer que Ia existencia de una banda especffica en la tecnica de marcado indirecto del extremo represente la distancia a partir de un corte 29.10 ,:Los nucleosomas yacen en posiciones especificas?

775

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1 En ausencia del posicionamiento de un nucleosoma, en todas las localizaciones posibles de diferentes capias del genoma yace un sitio de restricci6n. Se producen fragmentos de todos los tamaiios posibles cuando una enzima de restricci6n corta en un sitio diana (rojo) y La nucleasa de micrococos corta en las uniones entre nucleosomas (verde).

por Ia enzima de restriccion a Ia region de enlace. jMas bien podrfa representar Ia distancia del corte por Ia enzima de restriccion a un sitio de escision preferido por Ia nucleasa de micrococos! Esta posibilidad se con trola mediante el tratamiento del DNA desnudo exactamente en Ia misma forma que la cromatina. Si hay sitios preferidos por la nucleasa de micrococos en Ia region especffica, ha bra bandas especificas, patron que entonces se compararia con el generado a partir de Ia cromatina. Una diferencia entre el patron de bandas del DNA de control y el de la cromatina proporciona pruebas del posicionamiento de los nucleosomas. Algunas bandas presentes en el producto de digestion del DNA de control pueden desaparecer del correspondiente del nucleosoma, lo cual indica que nose dispone de posiciones para escision preferencial. Por otra parte, pueden aparecer nuevas bandas en el produ cto de digestion de los nucleosomas, cuando porIa organizacion de estos, se hacen accesibles de manera preferencial nuevas sitios. El posicionamiento de los nucleosomas podrfa lograrse por cualquiera de dos formas: • Intrfnseca: cada nucleosoma se deposita especfficamente en una secu encia particular del DNA. Esto modifica el punto de vista 776


del nucleosoma como unidad susceptib::o ~ formarse entre cualquier secuencia del ~- y un octamero de histona. • Ex trfnseca: el primer nucleosoma de ·_region se ensambla preferentemente e.: _ sitio particular. Un punto de inicio prefe:-cial para el posicionamiento del nucleos...es resultado de Ia presencia de una re,: de Ia que se excluyen los nucleosoma ~ :__ region excluida proporciona un lfmite .:: restringe las posiciones disponibles pa:~ nucleosoma adyacente, de modo que -:tonces se ensamblarfa secuencialmente --serie de nucleosomas con una longitt -= _ repeticion definida . Ahora queda clara que el deposito de octamero: ~ histonas en el DNA no es aleatorio respecto c:: secuencia. El patron es intrfnseco en algunos cc.s. en los cuales depende de caracterfsticas estrua"-:.. les del DNA, yes extrfnseco en casos en que pro(:ode las interacciones de otras protefnas con el las histonas, o ambos. Ciertas caracterfsticas estructurales del r- _ afectan Ia ubicacion de los octameros de histo:-' dadas las tendencias intrinsecas de aquel para : garse en una direccion mas que en otra; as!, !c...: giones ricas en A-T se localizan de manera _·-= surco menor vea hacia el octamero, en tanto q:__~ regiones ricas en G-C se disponen de maner.o : el surco me nor sefi.ale hacia fue ra. Los segm · largos de dA-dT (>8 bp) evitan el posicionan~ : en el giro superhelicoidal central del meollo. ___ no es posible sumar todos los efectos estruac~ importantes y asf pronosticar completamente > calizacion de la secuencia especffica del DNA re:-::- .,to del nucleosoma. Las secuencias que hacen q;_:_ DNA adopte estructuras mas extremas pueden te:-efectos, como Ia exclusion de nucleosomas, · :o forma que podrfan incidir en los limites. Es frecuente que los n ucleosomas se posi · =-cerca de los lfmites. Si hay alguna variante e:. construccion de los nucleosomas, por ejempl Ia longitud del DNA de enlace varfa unos 10 b:;: especificidad de Ia localizacion se reduciria, a!( : dose del primer nucleosoma definido en ellf En ese caso podrfa esperarse que el posicionarn:e:: se mantuviera rigurosamente solo con una rel;:.cercania allfmite. La localizacion del DNA en los nucleosopuede describirse de dos formas. En Ia ,u se muestra que el posiciomuniento traducd describe la posicion del DNA respecto de los!'-:del nucleosoma. En particular, determina q e _ cuencias se encuentran en las regiones de ere : Un cambia de l 0 bp en el DNA !leva el siguieme oa una region de enlace. Asf, en el posicionam.;,::.

Giros 3-4 en Ia region de enlace

rl., 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

/JVJVJVJVA..'A/Ai}VA..IJVIVA Giros 2-3 en Ia region de enlace

rl., 1 2 3 4 5 6 7

8

9 10 1112

/NlV!VAPVJ\.fl\.-Q\.1/\.~./J\ F" El posicionam iento traduccional describe la posicion lineal de l DNA respecto del octamero de histonas. E ~ desplazamiento del DNA par cambios de 10 bp cambia las secuencias de las regio nes de enlace mas expuestas, pero no altera la cara del DNA protegida par la superficie de las histonas ni la que esta expuesta al exterior. El DNA ya esta enrollado sabre los nucleosomas; para mayor comodidad se muestra en forma lineal.

Superficie del octamero

12 345

I

Las bases 1-5 estan dentro Facto res

G El posicionamiento rotativo describe la exJosici6n del DNA en la superficie del nucleosom a. Cualquier 11ovimiento que se aleje de la re petici6n helicoidal (-10.2 bp/ 3iro) desplaza al DNA respecto de la superficie de la histona. .as nucle6tidos del interior estan mas protegidos contra las 1ucleasas que los del exterio r.

:raduccional se determina que regiones son mas ac~esibl es (cuando me nos, a juzgar por Ia sensibilidad ~ Ia n ucleasa de micrococos). El DNA yace en el exterior del octamero de his:onas, de modo que uno de los lados de cualquier

secuencia especffica es ocultado por las histonas, en tanto que el otro es accesible. Depencliendo de su posicionamiento respecto del nucleosoma, un sitio en el DNA que debe reconocer a una protefna reguladora podria ser inaccesible, o estar clisponible; por tanto, Ia posicion exacta del octamero de histonas en relacion con la secuencia del DNA puede ser importante. En la se muestra el efecto del posicionarniento rotativo de Ia doble helice en cuanto a Ia superficie del octamero. Si se mueve el DNA un numero parcial de giros (imaginese el DNA rotando respecto de Ia superficie de Ia protefna) , habra un cambia en Ia exposicion de secuencias al exterior. El posicionamiento traduccional y rotativo puede ser importante para co ntrolar el a! DNA. Los casas de posicionamiento mejor caracterizados involucran la limitaci6n espedfica de los nucleosomas en los promotores. El posicionamiento traduccional, la exclusion de los nucleosomas de una secuencia en particular, o ambos procesos, pueden ser necesarios para permitir que se forme un com plejo de transcripcion. Algunos factores reguladores pueden unirse con el DNA solo si se excluye un nucleosoma para dejar libre a! DNA, y ello crea un limite para el posicionamiento traduccional. En otros casas, los factores reguladores pueden volver a unirse con el DNA en la superficie del nucleosoma, pero el posicionamiento rotativo es importante para garantizar que se exponga !a cara del DNA con los puntas de o apropiados . En la seccion 30.4, La organizacion de los nucleosomas puede cambiarse en el promotor, se analiza Ia conexi on entre organizacion de nucleosomas y transcripcion, pero par ahora notese que los promotores (y algunas otras estructuras), a menudo tienen regiones cortas que excluyen a los nucleosomas. Dichas regiones par lo general forman un limite, cerca del cual se restringen las posiciones de los nucleosomas. Mediante un rastreo de una region extensa del ge noma de Saccharomyces cerevisiae (con mapeo de 2 278 nucleosomas en mas de 482 kb de DNA) se demostro que, de hecho, el 60 % de los nucleosomas tiene una posicion especifica como resultado de efectos limitrofes, casi siempre por los promotores.

fDII

~Los

genes transcritos se organizan en nucleosomas?

Conceptos principales • Los nucleosomas se encuentran a la misma frecuencia cuando los genes transcritos o no transcritos son digeridos con nucleasa de micrococos. • Algunos genes intensamente transcritos parecen casas excepcionales desprovistos de nucleosomas.

29.11 ;.Los genes transcritos se organizan en nucleosomas?

777

..L::.; Las unidades de transcripci6n del DNAr de genes nucleolares aislados alternan con segmentos de DNA no transcritos. Reproducida de Miller 0. L. y Beatty, B. R. 1969. Science. 164: 955-957. Imagen cortesla de Oscar Miller.

Un minicromosoma de SV40 puede ser transcrito. Reprod ucida de J. Mol. Bio. Vol. 131, Gariglio, P. et al., The template of the isolated ... p. 131. Copyrig ht 1979, con autorizaci6n de Elsevier. Imagen cortesla de Pierre Chambon.

Los intentos por observar a los genes durante Ia transcripci6n han dado resultados controvertidos. Las siguientes dos figura s ejemplifican cada extremo. La cromatina con trans cripci6n intensa se ve bastante extendida (demasiado como para ser cubierta por nucleosomas). En los genes con transcripci6n intensa qu e codifican RNAr, ilustrados en la , el empaquetamiento extremo de las polimerasas de RNA dificulta la observaci6n del DNA, y no es posible medir directamente las longitudes de los productos de transcripci6n del RNAr, dado que el RNA es compactado por proteinas, pero se sabe (por la secuencia del RNAr) que tan largo debe ser el producto de transcripci6n. La longitud 778


del segmento de DNA transcrito que se mide por :; longitud del eje del "arbol de navidad" es de -85 de Ia longitud del RNAr, lo cual significa que el D_-esta casi totalmente extendido. Por otra parte, los complejos de transcripci6n L los minicromosomas de SV40 se pueden ex traer _celulas infectadas; contienen el complemento us .:. de histonas y presentan una estructura tipo cue=tas ensartadas. Se puede observar que las cader.c.. de RNA se extienden a partir del minicromos01~:..:. como en el ejemplo de la , lo cual ap , .. ta a Ia transcripci6n puede continuar mientras = DNA de SV40 se organiza en nucleosomas. Ob\~ mente, el minicromosoma SV40 se transcribe cmenor intensidad que los genes de RNAr. La transcripci6n implica el desenrollamie:: del DNA, y puede implicar el despliegue de Ia fi b:-: en regiones restringidas de Ia cromatina. Un pur · de vista simplista sugiere que se necesitani cie::"espacio" para el proceso. Las caracteristicas de _ cromosomas politenicos yen escobill6n descritas ~ el Capitulo 28, Cromosomas, dan indicios de que expresi6n genica se relaciona con una organizac.: estructural mas expansiva. Al reflexiona r ace rca de la transcripci6n. _deben tener en mente el tamafi.o relativo de la limerasa de RNA y del nucleosoma . Las enzi1:·: eucari6ticas son proteinas grandes con multip __ subunidades, por lo general >500 kD que se co:- pararan con los -40 kD del nucleosoma. E. se ilustra el enfoque de Ia polimerasa _DNA respecto del DNA de los nucleosomas. In so sin un conocirniento profundo de la interac ·c es evidente que implica abordar dos organisrr_ comparables. Considerense los dos giros del DNA en tome nucleosoma. c.Tendria suficiente la poliii: rasa del RNA al DNA si el acido nucleico se co!:-nara a esa vfa? Durante Ia transcripci6n, confo _ Ia polimerasa de RNA se mueve sobre el mold une estrechamente con una region de -50 bp ~ incluye un segmento locaL no enrollado, de - 12 ::-La necesidad de desenrollar el DNA hace pare :poco probable que el segmento involucrado e:-_ reacci6n de la polimerasa de RNA podrfa mante~:: se en Ia superficie del octamero de histonas. Por tanto, parece inevitable que la transcrip implique un cambio estructural, de modo que primera pregunta acerca de Ia estructura de un ~ = activo sera si el DNA en proceso de transcripC' se mantiene organizado en nucleosomas. Si se C.~ plazan los octameros de histonas c.se mantiene,- _ alguna manera aunados a! DNA transcrito? Un abordaje experimental es el de digerir la -- matina con nucleasa de micrococos y, despues, uzar una sonda de alguno o algunos genes esped ~

Promotor

Terminador

Nucleosoma ensamblado en una localizaci6n especffica

La polimerasa de RNA transcribe hasta el terminador

El nucleosoma se,tncuentra en una nueva posicion

La polimerasa de RNA es comparable en tamafio al nucleosoma, y podr1a tener dificultades para seguir al DNA en torno al octamero de histonas. Imagen superior, cortes\a de E. N. Moudr1anakis, Johns Hopkins University. Imagen inferior, cortes\a de Roger Kornberg, Stanford University School of Medicine.

para determinar si los fragmentos correspondientes estan presentes en la escalera usual de 200 bp a la concentracion esperada. Las conclusiones de esos experimentos son limitadas pero importantes. Los genes que estan en proceso de transcripci6n contienen nucleosomas con la misma frecuencia que las secuencias no transcritas. Por tanto, los genes no necesariamente adoptan una forma alternativa de organizacion para ser transcritos. No obstante, tal vez el gen transcrito promedia tenga solo una polimerasa de RNA en un momenta dado, por lo cual no revela que esta pasando en los sitios realmente afectados por la enzima. Quiza conservan sus nucleosomas; es mas probable que los nucleosomas se desplacen de manera temporal, conforme la polimerasa de RNA pasa a traves de ellos, pero se forman de nuevo inmediatamente despues.

BE

Los octameros de histonas son desplazados por la transcripci6n


• En un sistema modelo, la polimerasa de RNA desplaza a los octameros de histonas durante la transcripci6n, pero estos se unen nuevamente con el DNA tan pronto como ha pasado la polimerasa. • Los nucleosomas se reorganizan cuando la transcripci6n pasa a traves de un gen.

Un protocolo para estudiar el efecto de la transcripci6n en los nucleosomas muestra que el octamero de histonas es desplazado del DNA y se vuelve a unir en una nueva posicion.

Los experimentos para comprobar si una polimerasa de RNA puede transcribir directamente a traves de un nucleosoma sugieren que el octamero de histonas es desplazado por el hecho de la transcripcion. En la se muestra lo que sucede cuando la polimerasa de RNA del fago T7 transcribe un fragmento corto de DNA que contiene un solo nucleo octamerico in vitro, el cual se mantiene vinculado con el DNA pero en una localizacion diferente; es muy probable que se vuelva a unir con la misma molecula de DNA de la que fue desplazado. En la se muestra un modelo para el avance de la polimerasa. El DNA se desplaza conforme la polimerasa entra al nucleosoma, pero la enzima llega a un punto en que el DNA hace retroceder sus asas y se vuelve a unir, formando una region cerrada. Conforme la polimerasa avanza mas, crea superhelices positivas desenrollando el DNA; el efecto puede ser muy notorio, pues el asa cerrada es de solo -80 bp, de manera que cada par de bases a traves del cual avanza la polimerasa hace una adicion significativa al superenrollamiento. De hecho, la polimerasa avanza facilmente los primeros 30 bp hacia el nucleosoma, pero despues lo hace en forma mas lenta, como si su avance fuera cada vez mas diffcil. Cada 10 bp hay pausas, lo cual sugiere que la estructura del asa impone pausas relacionadas con la rotacion en cada giro del DNA. Cuando la polimerasa Uega el punto medio del nucleosoma (las bases por afiadir a continuacion se encuentran sobre todo en el eje de la simetria doble), se reanuda

29.12 Los octameros de histonas son desplazados por la transcripci6n

779

•

•

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La polimerasa de RNA avanza

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El DNA es desplazado del octamero y forma un asa cerrada

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La torsion delante de Ia polimerasa de RNA desplaza al octamero que se reinserta detras de Ia polimerasa

Reprimido

780

Expresado

Reprimido

La polimerasa de RNA desplaza al DNA del octamero de histonas conforme avanza. El DNA se enrolla nueva mente y se une (ala polimerasa o al octamero), para formar un asa cerrada. Conforme la polimerasa avanza, genera un sobreenrollado positivo adelante, desplazando al octamero que mantiene o con el DNA, la polimerasa o ambos, y se inserta detras de la polimerasa de RNA .

Las secuencias genicas URA3 se fusionan c-: un promotor GALl regulado y una secuencia de DNA ribos6 1lilic: El URA3 tiene nucleosomas posicionados en forma transicion::. antes de la transcripci6n . Cuando se induce la transcripcic controlada por un promotor inducible, las posiciones de I : nucleosomas son aleatorias. Cuando se rep rime La transcripcic los nucleosomas recuperan su posicion especifica. Reproducic: de Suter, B., et al. 1997, EMBO J. 16: 2150-2160. Copyrif; -: © Oxford University Press. Imagen cortesia de Fritz Thome: ETH Zurich.

el movimiento y Ia polimerasa avanza rapidamente, lo cual sugiere que el punto medio del nucleosoma marca el sitio en que el octamero es desplazado (tal vez porque el superenrollado positivo ha llegado a un nivel crftico en el cual se expulsa a! octamero del DNA). De esta forma se Iibera Ia tension delante de Ia polimerasa y se permite que avance. El octamero se une despues al DNA, detra s de la polimerasa, y ya no constituye un obstaculo para su avance. Es posible que el octamero cambie de posicion, incluso sin haber perdido o con el DNA. (.El octamero se Iibera como unidad Integra? El entrecruzamiento de las protefnas del octamero no crea un obstaculo para Ia transcripci6n, Ia cual puede continuar incluso si los enlaces cruzados son lo suficientemente extensos como para asegurar que se hayan enlazado las regiones centrales de las histonas medulares, de ahf que la transcripcion no implique disociaci6n del octamero en las histonas que lo componen, y noes probable que necesite un mayor despliegue de Ia estructura central. La adici6n de la histona Hl a ese sistema, sin embargo, causa una rapida declinaci6n en Ia transcripci6n, lo cual

sugiere dos conclusiones. El octamero de histon G.:~ (ya sea que se conserve o se desplace) actua cow unidad Integra, y puede ser necesario eliminar Ia E~ de Ia cromatina activa o modificar de alguna fonE . su s interacciones. Por tanto, una polimerasa de RNA pequef:..:. puede desplazar a un solo nucleosoma, que vue h·~ a formarse detras de ella durante Ia transcripcion. Po: supuesto, la situacion es mas compleja en un nude. eucari6tico. La polirnerasa de RNA es mucho mayor·. el obstaculo ala vance es una cadena de nucleosom.:c conectados, y para superarlo se necesita que factor adicionales actuen en Ia cromatina (ver Capitulo 3( Control de Ia estructura de Ia cromatina). La organizacion de los nucleosomas puede s~ modificada por la transcripcion. En Ia 9 · 1 _ :observa lo que le sucede a! gen URA3 de las levadt:ras cuando se transcribe estando controlado por u:::. promotor inducible. El posicionamiento se analik con Ia nucleasa de micrococos para revisar los siti : de escision respecto de un sitio de restricci6n en c extremo 5' del gen. Inicialmente, el gen muestra u.:.:.. patron de nucleosomas organizadas desde el promo-


tor a una distancia significativa a traves del gen; el posicionamiento se pierde en las regiones 3 '. Cuando el gen se expresa, un extendido general sustituye al patron de posicionamiento de los nucleosomas, lo cual indica Ia concentracion de nucleosomas en Ia misma, pero ya no estan organizados en fase, lo cual, a su vez, sugiere qu e Ia transcripcion destruye el posicionamiento nucleosomico. Cuando se restablece Ia represion, el posicionamiento aparece en un lapso de 10 minutos (aunque no completo). El resultado !leva al interesante punto de que se pueden ajustar las posiciones de los nucleosomas sin replica cion. En el modelo de unificacio n se supone que Ia polimerasa de RNA desplaza a los octameros de histonas conforme avanza. Si el DNA que viene detras de Ia polimerasa esta disponible, el octamero se vuelve a unir ahf. (Es posible, o tal vez probable, que el octamero nunca pierda totalmente el o con el DNA, pero sigue siendo un enigma como un octamero podrfa mantener el o con el DNA sin desplegarse o perder componentes, cuando un objeto incluso de mayor tamafio que el avanza a traves del DNA. Tal vez el octamero sea "enviado atras" hacienda o con Ia polimerasa de RNA.) Si el DNA no esta disponible tal vez porque otra polimerasa continua inmediatamente despues de Ia primera, el octamero podrfa desplazarse permanentemente y el DNA mantenerse extendido.

m

El desplazamiento del nudeosoma y su reensamblado requieren fa ctores especiales

Concepto principal • Se necesitan factores auxiliares para que La polimerasa de RNA desplace a los octameros du ra nte la transcripci6n y para que despues, las histonas se reensamblen en nucleosomas.

El desplazamiento de los nucleosomas respecto del DNA es clave para todas las etapas de la transcripci6n. El inicio del proceso es lo que se ha caracterizado mejor. Los promotores activos estan marcados por sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa porque los octameros de histonas se han desplazado del DNA (vease Ia secci6n 29.18, Los sitios hipersensibles de la desoxirribonucleasa refl ejan cambios en Ia estructura de Ia cromatina) . La eliminaci6n de los octameros requiere de complejos de remodelado reclutados por factores de transcripci6n que utilicen Ia energfa generada por Ia hidr6lisis de ATP para modificar Ia estructura de Ia cromatina (vease Ia secci6n 30.4, La organizaci6n de los nucleosomas

puede cambiar en el promotor). Esto significa que Ia polimerasa de RNA inicia la sfntesis de esta en una cadena corta de DNA no obstaculizada por los nucleosomas. Para que siga avanzando durante la elongaci6n, deben desplazarse los octameros de h istonas delante de ella, pero para evitar que el DNA quede desnudo tras los octameros, deben formarse nuevamente despu es de la transcripci6n. La transcripci6n in vitro por la polimerasa II de RNA se n ecesita Ia Ilamada protefna facilitadora de Ia transcripci6n de la cromatina (FACT), que se comporta como factor de elongaci6n durante Ia transcripci6n. (Noes parte de Ia polimerasa de RNA, pero se vincula con ella especfficamente durante la fase de elongaci6n de Ia transcripci6n.) La FACT consta de dos subunidades bien conservadas en toda s las eucariotas y se vincula con la cromatina de los genes activos. Cuando se agrega FACT a nucleosomas aislados, conduce a Ia perdida de los dimeros H2A-H2B, raz6n de que durante Ia transcripci6n in vitro, los nucleosomas se conviertan en "hexasomas" . Esto sugiere que Ia FACT es parte de un mecanismo pa ra el desplazamiento de octameros durante Ia transcripci6n, a parte de que podrfa participar en el reensamblado de los nucleosomas despues de la transcripci6n, ya que ayuda a Ia formacion de nucleosomas a partir de histonas medulares. Esto sugiere el modelo de la , en la cual, la FACT saca de un nu cleosoma el complejo H2A-H2B frente ala polimerasa de RNA y facilita su inserci6n en un n ucleosoma que se esta reensamblando detras de la enzima. Seguramente se necesitan otros factores para llevar a cabo el proceso. Dicha protefna faciitadora tambien es necesaria para otras reacciones en que los n ucleo somas pueden desplazarse, in cluidas replicaci6n y reparaci6n del DNA. Para mantener Ia integridad de Ia cromatina en regiones en proceso de trans cripci6n, se requiere de otros factores, tal vez porque tambien participan en el des ensamblado y reensamblado de los nucleosomas, pero no h ay todavfa inform acion detallada acerca de sus funciones.

fD1

Los aislantes impiden la acci6n de los potenciadores y la heterocromatina

Conceptos principales • Los aislantes pueden im pedir el paso de cualquier efecto activador o desactivado r desde los potenciadores, silenciadores y LCR. • Los aislantes suelen constituir barreras para evitar la dis persion de la heterocromatina.

29.14 Los aislantes impiden La acci6n de los potenciadores y la heterocromatina

781

Transcripci6n ---..

]~f?J]~] H2B H2A

y

} FACT Iibera el dfmero H2A-H2B

~~"--"/

J]

Otros factores liberan H3-H4

Un potenciador activa a un promotor Potenciador Promotor

Transcripci6n Un aislante bloquea Ia acci6n del potenciador Potenciador Aislante Promotor

Un potenciador activa a un promotor en ; _ alrededores, pero un aislante localizado entre ambos p u ~ :-= imped\rselo.

j La polimerasa de RNA se mueve a lo largo del DNA libre ]

Un aislante activo es una barrera para Ia heterocromatina

J Transcripci6n El nucleosoma se reensambla

Los octameros de histonas se desensamblan antes de la transcripci6n en proceso para eliminar nucleosomas y se forman nuevamente despues de la transcripci6n. La liberaci6n de d\meros H2A-H2B probablemente inicie el proceso de desensamblado.

Los elementos que evitan el paso de los efectos activadores o desactivadores se llaman aislantes, y tienen una de dos propiedades clave, o ambas: • Cuando un aislante se coloca entre un promotor y un potenciador, impide que el potenciador adive al promotor. El efecto del bloqueo se muestra en la , lo cual podrfa explicar como la accion de un potenciador se limita a un promotor en particular. 782


La heterocromati na puede dispersarse a JE -:de un centro y despues bloquear a cualquier promotor que :__bra. Un aislante puede ser una barrera para la propagaci6n c ~ ...o heterocromatina, que permite al promotor mantenerse act' ~

• Cuando un aislante se coloca entre un ~ :- activo y la heterocromatina constituye :, barrera que protege al gen contra el efecrc · desactivaci6n que se propaga desde la hetercc -:matina. (La heterocromatina es una regiede la cromatina inactiva, resultado de su ~ tructura de or den superior; vease la seccic ~ 31.2, La heterocromatina se propaga a pa:-...=de un suceso de nucleacion.) El efecto :..:: barrera se muestra en la 43 . Algunos aislantes poseen ambas propiedac ::y otros solo una, 0 bien, funciones de bloqueo . barrera pueden estan separadas. Aunque ambas c.:tividades posiblemente sean mediadas por camb:::en la estructura de la cromatina, tal vez impliqL.c.;:_ efectos diferentes; en cualquier caso, el aislante c:" · fine el limite para los efectos a largo plazo. (Cual es el objetivo de un aislante? Una fG::. cion importante podria ser contrarrestar las accio::-: :indiscriminadas de los potenciadores sobre los p~ :-

motores. Casi todos los potenciadores actuan cerca de algun promotor, y un aislante puede restringirlo impidiendo que los efectos rebasen cierto punto, de modo que solo pueda actuar en un promotor especffico. Asimismo, cuando un gen esta cerca de Ia heterocromatina, un aislante puede impedir que sea desactivado inadvertidamente par la clispersion de Ia heterocromatina. Los aislantes, por tanto, actuan como elementos que hacen mas precisa Ia regulacion genica.

fDB

Los ais lantes pueden definir un dominio

Concepto principal • Los aislantes son estructuras especializadas de La cromatina con sitios hipersensibles. Dos aislantes pueden proteger de todo efecto externo La region que los separa.

Los aislantes se descubrieron durante el analisis de Ia region del genoma de Drosophila melanogaster que se resume en la . Dos genes para Ia proteina Hsp70 (proteina de choque termico) yacen en una region de 18 kb que constituye Ia banda 87A7, en cuyos extremos se encuentran las estructuras especiales scs y scs' (estructuras especializadas de cromatina) . Ambas constan de una region muy resistente ala fragmentacion por desoxirribonucleasa I y a uno y otro !ado hay sitios hipersensibles espaciados casi cada l 00 bp. El patron de escisi6n de dichos sitios se altera cuando los genes son activados por un choque termico. Los elementos scs aislan a los genes hsp70 de los efectos de las regiones circundantes . Si se toman unidades scs y se colocan a cada !ado de un gen blanco, este funcionara en cualquier punto del genoma en que se coloque, incluso en sitios en que, por con-

texto, normalmente seria reprimido, por ejemplo, en regiones heterocromaticas. Las unidades scs y scs' no parecen participar ni positiva ni negativamente en el control de la expresion genica, sino que apenas restringen los efectos del paso de una region a Ia siguiente. No obstante, si regiones adyacentes ejercen efectos represivos, estos elementos scs podrian ser necesarios para bloquear la dispersion de tales efectos y, por tanto, tal vez serian esenciales para Ia expresion genica. En ese caso, la deleci6n de tales elementos podria eliminar la expresi6n de los genes adyacentes. Los elementos scs y scs' tienen diferentes estructuras y no parecen apoyarse en Ia misma base para su actividad aislante. La secuencia clave de estos elementos scs es una tira de 24 bp que se une a! producto del gen zw5. La propiedad aislante de scs' reside en una serie de repeticiones CGATA, que se unen a un grupo de proteinas relacionadas llamado BEAF- 32. La proteina muestra una localizaci6n

2

4

6

87A6

8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28kb

87A7 --hsp70 hsp70

scs

350 bp

resistente

• • _L_ •• sensible

sensible

87A8

scs'

200 bp

resistente

• • _L • • • sensible

sensible

Estructuras especializadas de cromati na, que incluyen sitios de hipersensibilidad, marcan los extremos de un dominio del genoma de D. melanogaster y aislan a los genes intermedios de los efectos de las secuencias circundantes.

Una proteina que se une al aislante scs' se localiza en interbandas de cromosomas politenicos del genera Drosophila. La tinci6n roja identifica el DNA (las bandas) en ambas muestras, superior e inferior; la tinci6n verde identifica a BEAF32 (a menudo en interbandas) en La muestra superior. La coincidencia de las dos marcas se seiiala con amarillo (es decir, BEAF32 esta en una banda). Reproducida de Cell, vol. 81, Zhao, K., Hart, C. M., y Laemmli, U. K., Visualization of chromosomal ... pp. 879-889. Copyright 1995, con autorizaci6n de Elsevier. Imagen cortesia de Ulrich K. Laemmli, University of Geneva, Switzerland.

29. 15 Los aislantes pueden definir un dominic

7 -

definida en el nucleo, pero los datos mas notorios provienen de su localizacion en cromosomas politenicos. En Ia se muestra que el anticuerpo contra BEAF-32 tifi.e -50% de las interbandas de los cromosomas politenicos, lo cual sugiere que hay muchos aislantes en el genoma, y que BEAF32 es una parte comun del aparato aislante . Esto implicaria que Ia banda es una unidad funcional y que las interbandas a menudo tienen aislantes que impiden Ia propagacion de puntas de activacion o desactivacion. Otro ejemplo de un aislante que define a un dominio es Ia LCR de Ia ~-globina de polio (grupo de sitios hipersensibles que controlan Ia expresion de todos los genes de la ~- gl obina; vease Ia secci6n 29.20, Una LCR puede controlar a un dominio) . El sitio hipersensible mas alejado hacia Ia izquierda de Ia LCR de Ia ~-globina de polio (HS4) es un aislante que marca el extrema 5' del dominio funcional y restringe Ia actividad de la LCR a los genes de globina del dominio. Un gen rodeado de aislantes suele estar protegido contra Ia propagacion de efectos de desactivacion desde las regiones circundantes. La prueba consiste en insertar DNA por transfeccion en un genoma en localizaciones aleatorias. La expresion de un gen de Ia secuencia insertada a menudo es erratica, y si bien en algunos casos se expresa apropiadamente, en otros se extingue. No obstante, cuando los aislantes con funcion de barrera se colocan a ambos !ados del gen, en el DNA insertado, por lo general su expresion es uniforme en todos los casos.

I&

Los aislantes pueden actuar en una direcci6n

Concepto principal • Algunos aislantes tiene direccionalidad , de modo que pueden detener el paso de los efectos en una direcci6n, pero no en la otra.

Los aislantes pueden tener propiedades direccionales. Las inserciones del transpo son gypsy en ellocus yellow (y) de D. melanogaster provocan la perdida de Ia funcion del gen en algunos tejidos, no asi en otros. El motivo es que el locus y es regulado poi cuatro potenciadores, como se muestra en Ia . Donde quiera que se inserte gypsy, bloquea Ia expresi6n de todos los potenciadores que separa del promotor, pero no de aquellos ubicados del otro !ado. La secuencia encargada de ese efecto es un aislante que yace en un extrema del transposon, el cual actua independientemente de la orientacion de su insercion. 784


Posiciones de potenciadores para tejidos especfficos ala cuerpo cerdas garras hoja cutfcula tarsales

Ex6n 1

Ex6n 2

.til lnserci6n del aislante y patron de expresi6n

-

•

+

....

+

+

+

+

+

+

+

+

+A -

+

+

+

+ Ail.

., El aislante del transpos6n gypsy bloql!lec: _; acci6n de un potenciador cuando se coloca entre potencia:: : · y promotor.

Algunos de los potenciadores se encuentra.;:. en flujo ascendente respecto del promotor y otros e:::.. flujo descendente, de manera que el efecto no [pUc de depender de Ia posicion respecto del promot : tampoco es necesario que haya transcripcion a rr-ves del aislante. Esto es diffcil de explicar en funci 6= de modelos de asa para la interacci6n potenciado.-promotor, Ia cual pronostica esencialmente Ia r_ pertinencia del DNA interpu esto. El modelo ob,-: que viene a Ia mente es un mecanismo de rasn een que alguno de los componentes debe moverse e::::; forma unidireccional, del potenciador a! promo to: pero es diffcil hacer coincidir ese punto de vista colas caracterizaciones previas de la independencia C::: los potenciadores respecto de tales efectos. Las protefnas que actuan sobre el aislante ha.= sido identificadas por Ia existencia de otros dos loc:: que afectan Ia funcion del aislante en forma trm:: Las mutaciones en su(Hw) suprimen el aislamiem de modo que y se expresa en todos los tej idos a pe:;a.: del aislante, lo cual sugiere que codifica una prote:na que reconoce al aislante y que es necesaria par:c su accion. El su (Hw) tiene un segmento de DNA code do de zinc; el mapeo de los cromosomas politerr cos muestra que esta unido a gran numero de sitio~ El aislante contiene doce copias de una secuenc~ ,:. de 26 bp que se une a Su(Hw). Las manipulaciones mue stran que Ia potencia del aislante depende cic~ numero de copias de Ia secuencia de union. El segundo locus es mod(mdg4), en el cuallas mutaciones producen el efecto contrario, come en Ia perdida de direccionalidad. Tales mutaci ones aumentan Ia eficacia del aislante por extensi6::-_ de sus efectos, de manera que impida Ia utilizacion d= los potenciadores a ambos !ados. El su(Hw) es epistatico respecto de mod(mdg4), es decir, que en UL.c. doble mutante se observa solo el efecto de su(HH·

Fab-7 iab-7

Control iab-5 iab-6 transcripcional

~

A5

Abd-8,

~ A7~

A6

Deleci6n de Fab-7

I Periferia nuclear

I Control iab-5 iab -6 iab-7 transcripcional ~

En la periferia del nucleo se encuentran complejos Su(Hw)/mod(mdg4) que pueden organizar el DNA en asas que limitan las interacciones potenciador-promotor.

lo cual implica que mod(mdg4) actue a traves de su(Hw). La participacion basica de !a proteina de tipo silvestre del locus mod(mdg4) es, por tanto, imponer direccionalidad a !a capacidad de su(Hw) de aislar promotores dentro de esos lfmites. Por tanto, !a union de su(Hw) con el DNA, seguida de !a union de mod(mdg4) con su(Hw), da lugar a un bloqueo unidireccional de la activacion de un promotor, lo cual sugiere que el aislante unido por su(Hw) puede extender la inactividad en ambas direcciones, pero mod(mdg4) detiene el efecto de dispersion en una direccion. Tal vez haya una direccionalidad intrfnseca en la cromatina que finalmente resulte en la incorporacion de su(Hw), mod(mdg4) o algun otro componente, en una orientaci6n, supuestamente en virtud de !a interaccion con algun componente de la cromatina que, en sf, tenga orientaci6n preferencial. Serfa necesario revertir cualquier direccionalidad de esas caracteristicas en el promotor. Es posible que los aislantes actuen haciendo cambios en la estructura de !a cromatina. Un modelo proviene de !a observacion de que los sitios de union de Su(Hw) y mod(mdg4) estan presentes en >500 localizaciones de un genoma del genero Drosophila. Sin embargo, !a visualizaci6n de los sitios en que las protefnas se unen a! nticleo muestra que se localizan a -25 sitios definidos en torno a !a periferia del nucleo, lo cual sugiere el modelo de la ' , en el cual, las protefnas Su(Hw) unidas en diferentes sitios del DNA se conjuntan por enlace con mod(mdg4). El complejo Su(Hw)/mod(mdg4) se localiza en la periferia nuclear. El DNA unido a el se organiza en as as, de las cuales pod ria haber -20 en un complejo promeclio. Las interacciones potenciador-promotor deben ocurrir solo dentro de un asa y no pueden propagarse entre ellas.

A5

~

-~

A7

A7

Abd-B

A5A6A7

I

A6 simula A7 El Fab-7 es un elemento lim\trofe necesario para la independencia de los elementos reguladores iab-6 e iab-7.

fD&

Los aisla ntes pueden variar en potencia

Concepto principal • Los aislantes difieren en cuanto a eficacia para impedir el paso de una senal de activaci6n.

En ocasiones, los elementos con cliferentes propiedades de accion en configuraci6n cis se combinan para generar regiones con efectos reguladores complejos. La region Fab-7 es definida por deleciones en el locus bithorax del genero Drosophila, que contiene una serie de elementos reguladores en configuracion cis que controlan las actividades de tres unidades de transcripcion. La parte importante del locus se ilustra en !a . Los elementos reguladores iab-6 e iab-7 controlan la expresion del gen adyacente Abd-B en regiones sucesivas del embrion (segmentos A6 y A 7). Una delecion de Fab-7 hace que A6 se desarrolle como A7 y no en la forma acostumbrada; este efecto dominante sugiere que iab-7 ha tornado el control sobre iab-6, lo cual se puede interpretar en funcion de las moleculas por el supuesto de que Fab-7 proporciona un lfmite que impide que iab-7 actue cuando iab-6 suele estar activo. Como otros elementos limftrofes (aislantes), el Fab-7 contiene una estructura distintiva de cro29. 17 Los aislantes pueden variar en potencia

785

matina marcada por una serie de sitios hipersensibles. En cuanto a su capacidad para proporcionar un lfmite, la region puede dividirse en dos tipos de elementos por deleciones mas pequefi.as y por ana !isis de fragmento s. Una secuencia de -3.3 kb se conduce como aislante cuando se coloca dentro de otras estructuras, una secuencia de -0.8 kb se conduce como represor que actua sobre iab-7. La presencia de esos dos elementos explica la compleja conducta genetica de Fab -7 (que no ha sido descrito con detalle). Los efectos de sustituir otros aislantes con Fab-7 perrniten profundizar en la accion del elemento limite. El efecto de Fab-7 no es mas que evitar interacciones entre iab-6 e iab-7. No obstante, cuando se cambia Fab-7par un aislante cliferente [de hecho, un sitio de union para la proteina Su(Hw)], se observa un efecto mas fuerte: iab-5 toma el control de iab-7. Cuando se usa un elemento scs, el efecto se extiende basta iab4, lo cual sugiere un esquema en que los elementos mas fuertes pueden bloquear la accion de secuencias reguladaras que yacen mas lejos. Esta conclusion introduce una dificultad para explicar Ia accion de los elementos limite, los cuales no pueden actuar en esa forma simplemente impidiendo la transmision de los efectos mas alla del limite, lo cual a punta en contra de modelos basados en el simple rastreo o en la inhibicion de la propagacion lineal de efectos estructurales, ademas de sugerir que puede haber algun tipo de efecto competitivo en que la fortaleza del elemento determine que tan lejos puede llegar su efecto. La situacion se complica aun mas par la exis tencia de elementos antiaislante que permiten a un potenciador superar los efectos del bloqueo de un aislante, lo cual nuevamente sugiere que aquellos efectos son mediados por algun tipo de control sobre Ia estructura local de la cromatina.

Los sitios hiperse nsibles a La desoxirribonucleasa reflejan ca mbios en la estructura de La cromatina Conceptos principales • En los promotores de los genes expresados hay sitios hi persensi bles. • Estes sitios son generados por la union de factores de transcripci6n que desplazan a los octameros de histonas.

Ademas de los cambios genera les que ocurren en regiones activas, o potencialmente activas, se presentan modificaciones estructurales en sitios espe786


cificos vinculados con el inicio de la transcripcion o con ciertas caracteristicas estructurales del DNA. Esos cambios se detectaron por primera vez merced a los efectos de la digestion con concentracione muy bajas de la enzima desoxirribonucleasa I. Cuando digiere a la cromatina, como primer efecto introduce roturas en sitios hipersensibles especificos de la cadena doble. La susceptibilidac a la desoxirribonucleasa I refleja la disponibilidad del DNA en la cromatina, por lo cual se toman eso_ sitios como representativos de regiones cromatica_ en que el DNA esta particularmente expuesto parque no se encuentra organizado en la estructmc. usual de nucleosomas. Un sitio hipersensible tipic es 100 veces mas sensible al ataque de las enzima~ que la mayor parte de la cromatina. Esos sitios tarr.bien son hipersensibles a otras nucleasas y agent : quimicos. Los sitios hipersensibles se crean debido alae~ tructura de la cromatina (especifica de tejido). SL localizacion puede determinarse por la tecnica citmarcado terminal indirecto, presentada antes en e. contexto del posicionamiento de los nucleosoma; Esa aplicacion de la tecnica se recapitula en la . En este caso se utiliza la escision po ~ desoxirribonucleasa I en el sitio hipersensible pa::-:: generar un extrema del fragmento y su distancia ~E mide desde el otro extrema, generado par la escsion con una enzima de restriccion. Muchos de los sitios hipersensibles tienen relc.cion con la expresion genica. Todo gen activo tier:;: un sitio, o mas de uno, en la region del promoto::Casi todos los sitios hipersensibles se encuentran solo !a cromatina de las celulas en que esta expresandose :. gen vinculado, no cuando el gen esta inactivo. L :: sitios hipersensibles 5' aparecen antes de que se irO.: cie la transcripcion, y para la expresion genica ~= requieren las secuencias de DNA contenidas en I _ sitios hipersensibles, como se observa por ana]js:..: de mutaciones. Una region sensible a nucleasas, particularme .. te bien caracterizada, yace en el minicromosor::~ SV40. Un segmento corto cercano al origen de :=. replicacion, apenas en flujo ascendente respecto c promotor de la unidad de transcripcion tardfa . · ~ escindido preferencialmente por la desoxirribon-.:cleasa I, la nucleasa de micrococos y otras nucleas= (incluidas las enzimas de restriccion). El estado del minicromosoma SV 40 puede c~ servarse al microscopio electronico. Basta en 2 c de las muestras se observa un "espacio" en la org=.nizacion del nucleosoma. el cual es evidente er: = . Ese espacio es una region de -20 de longitud (casi 350 bp), con nucleosomas a u n· _ otro !ado. El espacio visible corresponde a la reg:: c=

Extraccion del DNA

Escisi6n con enzima de restriccion

Electroforesis y mancha con sonda para una region adyacente al sitio de restriccion

! !

El minicromosoma de SV40 tiene una brecha de nucleosoma. Imagen cortes\a de Moshe Yaniv, Pasteur Institute.

-50 Region tardfa de SV40

-300

La banda consta de un fragmento cortado en un extremo porIa desoxirribonucleasa I y en el otro por una enzima de restriccion

Sitios de escision

Punto de inicio

I Geo d•

~:lobioo

HGl El marcado terminal indirecto permite medir la distancia entre un sitio hipersensible y la desoxirribonucleasa desde un sitio de corte por restriccion. La existencia de un sitio de corte en particular para la desoxirribonucleasa I genera un fragmento bien definido, cuyo tamaiio identifica la distancia del sitio hi persensible a la desoxirribonucleasa I, desde el sitio de restricci6n.

El segmento de SV40 incluye sitios hipersensibles, regiones sensibles y una region protegida del DNA. El sitio hipersensible de un gen de la ~-globina de pollo incluye una region susceptible a varias nucleasas.

sensible a nucleasas, lo cual muestra directamente que Ia mayor sensibilidad a las nucleasas se relaciona con la exclusion de nucleosomas. Un sitio hipersensible a las nucleasas no necesariamente lo es de manera uniforme. En la 2 se muestran dos mapas que ilustran este fenomeno. Dentro del espacio de -300 bp del SV40 hay dos sitios hipersensibles a la desoxirribonucleasa I y una region "protegida"; esta ultima posiblemente refleje la relacion de las protefnas (no histonas) con el DNA. El espacio se relaciona con elementos de Ia secuencia del DNA necesarios para la funcion del promotor. El sitio de hipersensibilidad del promotor de la B-globina es digerido preferentemente por varias enzimas, entre otras, desoxirribonucleasas I y II y nucleasa de micrococos. Las enzimas tienen sitios

preferidos de escision que yacen en puntas ligeramente diferentes de la misma region general. Asf, a una region que vade -70 a -270 de preferencia acceden las nucleasas cuando el gen es susceptible de transcripcion. ;_, CuaJ es Ia estructura del sitio hipersensible? Su accesibilidad preferencial a las nucleasas indica que no esta protegido por octameros de histona, pero eso no necesariamente implica que este libre de protefnas. Una region de DNA libre puede ser vulnerable al dafio y, en todo caso, (.COmo podrfa excluir a los nucleosomas? Se supone que el sitio hipersensible es resultado de la union de proteinas reguladoras especfficas que excluyen a los nucleosomas. De hecho, la union de tales protefnas tal vez constituya Ia base para la existencia de la region protegida dentro del sitio hipersensible.

-300

-200

-100 0 Posicion respecto del punto de inicio

29.18 Los sitios hipersensibles ala desoxirribonucleasa reflejan cambios en la estructura de la cromatina

100

787

Es posible que las proteinas que generan sitios hipersensibles sean factores reguladores de varios tipos, pues dichos sitios se relacionan con los promotores, otro tipo de elementos que regulan Ia transcripci6n, los orfgenes de Ia replicaci6n, los centr6meros y los sitios con otro significado estructural. En algunos casas se vinculan con una organizaci6n mas amplia de Ia estructura de Ia cromatina. Un sitio hipersensible puede constituir un lfmite para una serie de nucleosomas en posicion. Los sitios hipersensibles vinculados con Ia transcripcion pueden ser generados por factores de transcripcion cuando se unen al promotor como parte del proceso que los hace accesible a la polimerasa de RNA (vease la seccion 30.4, La organizacion del nucleosoma puede cambiarse en el promotor). La estabilidad de los sitios hipersensibles se revela por las propiedades de los fibroblastos de polio transformados con virus de tumor sensibles a la temperatura. En esos experimentos se aprovecha una propiedad in usual, pues aunque los fibroblastos no pertenecen a Ia lfnea eritroide, la transformacion de las celulas a temperatura normal !leva ala activacion de los genes de globina, que asi activados, son sitios hipersensibles. Si Ia transformaci6n se hace a una temperature. mayor (no permitida), los genes de globina no se activan, y los sitios hipersensibles no aparecen. Cuando los genes de globina se han activado por transformaci6n a baja temperatura, pueden desactivarse por elevaci6n de esta, aunque se mantienen cuando menos durante las siguientes 20 replicaciones celulares. Este resultado demuestra que Ia adquisici6n de un sitio hipersensible es solo una de las caracterfsticas necesarias para iniciar Ia transcripci6n, e implica que los sucesos involucra dos en el establecimiento de un sitio hipersensible sean diferentes de los encargados de perpetuarlo. Una vez que se ha establecido el sitio, se perpetua por replicacion sino se presen tan las condiciones necesarias para la inducci6n. (.Podrfa ser necesaria alguna intervencion especffica para suprimir un sitio hipersensible?

Los dominios definen regiones que contienen genes activos Concepto principal • Un dominio que contiene un gen transcrito se define por su mayor sensibilidad a la fragmentaci6n por la desoxirribonucleasa I.

La estructura de una region del genoma que contiene un gen activo, puede estar alterada. El cambia de estructura precede a la ruptura de !a estructura 788


del nucleosoma y es diferente de esta, que po d..::~ ser secundaria al verdadero paso de !a polimer·sa de RNA. Un fndice del cambia de Ia cromat~ transcrita depende de esa mayor susceptibilidaci c. __c fragmentacion par desoxirribonucleasa I, que defi: _ a un dominio cromosomico, region de estrucn.::-.:. alterada que incluye cuando menos una unidad -: transcripcion activa y que llega a extenderse n c. (Notese que el uso del termino "dominio" no im ca necesariamente una conexion con los domin ~ estructurales identificados por las asas de croma ~..,~ o los cromosomas.) Cuando Ia cromatina es digerida con desox i::bonucleasa I, podrfa degradarse a un material so> ble en acido (fragmentos muy pequeiios de D1-.-. y la reaccion general avanzarfa en funcion del centaje de DNA modificado de esa forma . Cua·: solo el 10% del DNA total se ha vuelto soluble en a.:se pierde mas del 50% del DNA de w1 gen activo, lo _- · sugiere que los genes activos se fragmentan de mm: ~ preferencial. El destino de los genes individuales se rast::c= con una sonda especifica por cuantificaci6n de : cantidad de DNA que sobrevive para la reacci :: protocolo incluido en Ia r . El princir es que Ia perdida de una banda en particular in ca que Ia region correspondiente del DNA ha : ~ fragmentada porIa enzima. En Ia se muestra lo que sucede - _los genes de !a ~-globina y con un gen de ov ~ bumina en Ia cromatina extrafda de los eritroci·. de pollo (los genes de globina se expresan y el geL ::. ovoalbumina esta inactivo) . Los fragmentos de !': tricci6n que representan genes de ~-globina se pi=-den rapidamente, en tanto los que representar. gen de ovoalbumina muestran poca fragmenta · (de hecho, el gen de ovoalbumina, es digerido a . misma velocidad que la mayor parte del DNA . Por tanto, Ia mayor parte de Ia cromatin.< :: relativamente resistente a Ia desoxirribonucle:: I y contiene genes no expresados (asf como o:~ secuencias). Un gen se torna relativamente suscer::_ a Ia enzima de manera espec(fica en el tejido en q:.,· expresa. (.ES Ia susceptibilidad preferencial una carac =ristica solo de los genes de e),.,lJiesion mas bien ad como el de Ia globina, o de todos los genes acti· Los experimentos mediante sondas que repr _ tan a todo el grupo de RNAm celulares sugie-- ~ que todos los genes activos, ya sea que codifiG· =· RNAm abundantes o raros, son preferiblemc:: susceptibles a Ia desoxirribonucleasa I (aunque ~- _ variaciones en el grado de susceptibilidad). Lo_ _; nes que rara vez se expresan posiblemente tee _- muy pocas moleculas de polimerasa de RNA -::

Digestion de Ia cromatina con desoxirribonucleasa I

~

~

~

~ a

. ·.-·.."t=}---J3-globina embrionaria· .·....... ···~~-·. .~·.· :>~.: · ·~ . ·.·.· digerida a 1.0 IJg/ml .

< ....' ·.s~J3-globina del adulto:

· .. .··: . ~ ../ ;~··..: :·-· ·.:~· · · ·.·...:.

digerida a 0.5 ~g/ml

··.

Ovoalbumina de control Electroforesis de los fragmentos y desnaturalizaci6n del DNA; sonda para genes expresados y no expresados

b

Sanda 1 0 -

-·

.01 .05 .1 0 .50 1.0 1.5 IJg/ml

Sonda2 Desoxirribonuc/easa En celulas eritroides del adulto, el gen de la

Comparaci6n de intensidades de bandas en preparados en que Ia cromatina fue digerida con concentraciones crecientes de desoxirribonuc/easa

Desoxirribonuc/easa La sonda 1 de DNA se digiere de manera preferencial

Desoxirribonuc/easa La sonda 2 de DNA no se digiere de manera preferencial

S La desoxirribonucleasa I se puede medir mediante una sonda espec\fica, por determi naci6n de la tasa de desaparici6n del material con hibridaci6n.

~ -g lobina del adulto es muy sensible a la digestion por desoxirribonucleasa I, en tanto que el gen de la ~-globina

embrionaria es parcialmente sensible (quiza par efectos de dispersion) , no asi la ovoalbumina. Imagenes cortesia de Harold Weintraub, Fred Hutchinson Cancer Research Center. Con autorizaci6n de Mark T. Groudine.

Ia desoxirribonucleasa I cubre una distancia considerable. A menudo se piensa en Ia regulacion como dependiente de sucesos que ocurren en un sitio definido del DNA, por ejemplo, de Ia capacidad de iniciar Ia transcripcion en el promotor, pero incluso si esto fuera valido, tal regu lacion deberfa determinar un cambio de mayor envergadura en la estructura, o bien ir acompafiada de el. Esta es una diferencia entre eucariotas y procariotas.

E realmente se involucren en la transcripcion en un momenta dado; ello implica que Ia sensibilidad a Ia desoxirribonucleasa I no proviene del acto de Ia transcripcion, mas bien es una caracterfstica de los genes que pueden ser transcritos. (.Cual es Ia extension de Ia region preferentemente sensible? Esto puede determinarse mediante una serie de sondas que representan las regiones de los flancos, asi como Ia unidad de transcripcion misma. La region sensible siempre abarca toda Ia region transcrita; una region adicional de varios kb a cada !ado mostrarfa un nivel intermedio de sensibilidad (tal vez como resultado de efectos de dispersion). El concepto crftico implicito en Ia descripcion del dominio es que la region de alta sensibilidad a

Una LCR puede controlar a un dominio

Concepto principal • Una LCR se localiza en el extrema 5' del dominio y consta de varios sitios hipersensibles.

Todo gen es controlado por su promotor, y algunos genes tambien responden a los potenciadores (qu e contienen elementos de control similares, pero mas alejados), segun se describio en el Capitulo 24, Promotores y potenciadores, pero esos controles locales n o son suficientes para todos los genes. En algunos casas, un gen yace en un dominio de varios genes, todos bajo Ia influencia de elementos reguladores que actuan en el dominio completo. Esos elementos 29.20 Una LCR puede controlar a un dominio

789

. . ... . .

HS4

kb

. .

Genes de globina

HS1

20

40

60

80

I • Un dominio de globina es marcado por sus sitios hipersensibles en ambos extremos. El conjunto de sitios dellado 5' constituye a la LCR y es indispensable para la funcion de todos los genes del grupo .

se identificaron por la incapacidad de una region de DNA, que incluye un gen y todos sus elementos reguladores conocidos, para expresarse apropiadamente cuando son introducidos a un animal a manera de transgen. El ejemplo mejor caracterizado de un grupo de genes regulados es el de los genes de Ia ~-globina de mamifero. Recuerdese de la Figura 6.3, que los genes de a y ~-globina en mamiferos se encuentran como grupos de genes relacionados que se expresan en diferentes momentos durante el desarrollo embrionario y el adulto. Esos genes estan provistos de un gran numero de elementos reguladores analizados en detalle. En el caso del gen de la ~-globina humana del adulto, las secuencias reguladoras se encuentran en los extremos 5' y 3' del gen, e incluyen elementos positivos y negativos en Ia region del promotor, asi como elementos positivos adicionales en el gen y en flujo descendente respecto del mismo. Sin embargo, un gen de la ~-globina humana que contenga todas esas regiones de control, nunca se expresara en un raton transgenico en un arden de magnitud del ambito de tipo Silvestre, pues se requiere de alguna secuencia reveladora adicional. Las reservas que proporcionan una funcion reguladora adicional son identificadas por los sitios hipersensibles a !a desoxirribonucleasa I que se encuentran en los extremos del conjunto. El mapa de !a I muestra que los 20 kb en flujo ascendente respecto del gen epsilon contienen un grupo de cinco sitios, y que hay un sitio a 30 kb en flujo descendente del gen ~ - Con !a transfeccion de varias estructuras en celulas de la eritroleucernia del raton, se muestra que las secuencias entre los sitios hipersensibles inclividuales de la region 5' se pueden eliminar sin mucho efecto, pero que Ia elirninacion de cualquiera de los sitios reduce el nivel general de expresion. Los sitios 5' son los principales reguladores, y el grupo de sitios hipersensibles se llama region de control del locus (LCR); no se sabe si el sitio 3' 790


tiene alguna funci6n. La LCR es absolutamente ::::.:- · cesaria para la expresion de cada uno de los ge;:_::de globina del grupo, aparte de que cada ger regulado adicionalmente par sus propios contn •_::.. especificos, algunos de los cuales son autonoc = La expresi6n de los genes £ y yen conjuncion ,:: -LCR parece intrinseca a esos loci, en tanto que o:::controles parecen depender de !a posicion en el c- _po, lo cual sugiere que el arden genico en un gr:· :es importante para la regulacion. Toda la region que contiene los genes de glot·y que se extiende aun mas, constituye un domii:... cromosomico, que muestra mayor sensibilidaci .: digestion par la desoxirribonucleasa I (vease la? = 29.52). La delecion de !a LCR 5' restablece la r~ tencia normal a la desoxirribonucleasa en to o~ region. Dos modelos de funcionamiento de una _:_ ::proponen que su participacion es necesaria pare. : tivar al promotor, o bien, se necesita para aume :::.-su velocidad de transcripcion. La naturaleza exc..:de las interacciones entre la LCR y los promm..: , -= individuales no es todavia muy clara. (,Este modelo es aplicable a otros grupos de ;-nes? El locus de globina a tiene una organiza similar de genes que se expresan en diferentes ::-mentos, con un conjunto de sitios hipersensf:- en un extrema del grupo y mayor sensibilidc. ~ la desoxirribonucleasa I en toda la region. S6!: conoce un pequefio numero de casas en que ·.:..:: LCR controla a un grupo de genes. Uno de esos casas implica que una LCR con~ genes en mas de un cromosoma. La TH2LCR reE coordinadamente a un grupo de genes disperso; :: 120 kb del cromosoma 11 por interaccion cor:. _ promotores; tam bien interactua con el promoto:- : : gen de IFNy en el cromosoma l 0. Los dos tip a' : interaccion constituyen alternativas que comp :- ~ den dos destinos celulares diferentes, esto es, e::: _ grupo de celulas la LCR causa expresi6n de los ge- en el cromosoma 11, mientras que en el otro, 1- = _ que se exprese el gen del cromosoma 10.

2_0ue constituye un dominio regulador? Concepto principal • Un dominio puede tener aislante, LCR y sitio de uni o· a la matriz, as\ como unidades de transcripci6n.

Si se conjuntan los diversos tipos de estructuras ~~ contrados en diferentes sistemas, se puede pe~- ~ ace rca de la posible naturaleza de un domini a - -mos6mico. La caracterfstica basica de un dam:.:.. regulador es que los elementos reguladores pue.:.:- -

actuar solo en unidades de transcripci6n del mismo dominio, el cual podrfa contener mas de una unidad de transcripci6n, un potenciador, o ambos. En Ia se resumen las estructuras que podrfan participar en Ia definicion de un dominio. Un aislante detiene el paso de los efectos activadores o represores. En su forma mas simple, un aislante bloquea cualquier tipo de efecto de paso, pero puede haber relaciones mas complejas en que el aislante bloquee solo un tipo de efecto, actue de manera direccional, o ambos. Se supone que la accion de los aislantes afecta Ia estructura de la cromatina de arden superior, pero no se conocen los detalles ni Ia variedad de tales efectos. Un sitio de union a Ia matriz (MAR) puede encargarse de unir Ia cromatina con un sitio de la periferia del nucleo (vease la secci6n 28.6, Secuencias especfficas unen el DNA a una matriz de interfase). Dichas secuendas posiblemente se encargan de crear dominios ffsicos del DNA que adoptan Ia forma de asas que salen de los sitios de union, de manera muy parecida a un modelo de acci6n de aislante. De hecho, algunos elementos de MARse comportan como aislantes en experimentos in vitro, pero parece que su capacidad de unir el DNA con la matriz se puede separar de su funcion de aislante, de manera que no es una simple acci6n de causa y efecto. No serfa sorprendente que el aislante y los elementos de un MAR se vincularan para mantener una relacion entre efectos reguladores y estructura fisica . Una LCR actua a distancia y cualquiera de los genes puede necesitarla en un dominio por expresar (vease la seccion 29.20, Una LCR puede controlar un dominio). Cuando un dominio tiene una LCR, su funcion es esencial para todos los genes del mismo, pero las LCR no parecen ser comunes. Para su funcionamiento podrfan necesitarse varios tipos de estructuras en configuracion de accion cis. Como se definio originalmente, la propiedad de la LCR yace en el sitio hipersensible similar a un potenciador, necesaria para la actividad completa de los promotares del dominio. La organizaci6n de dominios puede llegar a explicar el gran tamaii.o del genoma. Para que tal estructura funcionara, se requeriria cierta cantidad de espacio, por ejemplo, para permitir que Ia cromatina se descondensara y se hiciera accesible. Aunque las secuencias exactas de gran parte de la unidad podrian no tener importancia, tal vez entraria en accion la seleccion en cuanto a cantidad global de DNA en su interior, o cuando menos para evitar que diversas unidades de transcripcion estuvieran demasiado cerca.

. ..

... ''

:.

Aislante

;

.. . ~

. . .

.

.

Potenciador

MAR LCR

Unidades de transcripci6n Los dominios pueden poseer tres tipos de sitios: aislantes para evitar los efectos de la dispersion entre dominios; MAR para unir el dominio con la matriz nuclear, y LCR, los cuales son necesarios para el inicio de la transcripci6n . Un potenciador puede actuar en mas de un promotor dentro del dominio.

fDD

Resumen

Toda la cromatina eucariotica consta de nucleosomas. Un nucleosoma contiene una longitud caracteristica de DNA, por lo general -200 bp, que se ubican en torno a un octamero que contiene dos capias de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4. Una proteina Hl aislada se vincula con cada nucleosoma. Virtualmente todo el DNA genomico se organiza en nucleosomas. El tratamiento con nucleasa de rnicrococos muestra que el DNA empaquetado en los nucleosomas puede dividirse en dos regiones desde el punta operative. La nucleasa digiere rapidamente la region de enlace, si bien la region medular de 146 bp es resistente a esa digestion. Las histonas H3 y H4 son las mas conservadas y un tetramero H3 2 -H4 2 contribuye al diametro de la partfcula. Las histonas H2A y H2B se organizan como dos dimeros H2A-H2B . Los octameros seensamblan por adicion sucesiva de dos dfrneros H2AH2B al nucleo H\ -H42 • La via del DNA que rodea al octamero de histonas crea -1.65 superhelices. El DNA "entra" y "sale" del nudeosoma en la rnisma zona, y podrfa ser sellado por una histona Hl. La eliminacion de las histonas medulares Iibera -1.0 superhelices. La diferencia puede explicarse en gran parte por un cambia en Ia pendiente helicoidal del DNA, de un promedio de l 0.2 bp/giro, en forma de nucleosoma, a l 0.5 bp/giro, cuando esta libre en soluci6n. Hay variaciones en la estructura del DNA de una periodicidad de l 0.0 bp/giro en los extremos del nucleosoma a 10.7 bp/giro en su parte central, asi como enroscamientos en la via del DNA sobre el nucleosoma . Los nucleosomas estan organizados en una fibra de 30 run de diametro, con seis por giro, y una raz6n de empaquetamiento de 40. La elirninacion de Hl permite a esta fibra desplegarse en una de l 0 nm que consta de una cadena lineal de nucleosomas. La fibra de 30 nm probablemente conste de la fibra de 10 nm enrollada en un solenoide con dos inicios. 29.22 Resumen

791

La fibra de 30 nm es el constituyente basico de la eucromatina y la heterocromatina; las protefnas no histonas se encargan de la organizaci6n adicional de la fibra en la cromatina o la ultraestructura del cromosoma. Hay dos vfas para el ensamblaje de los nucleosomas. En Ia vfa acoplada ala replica cion, la subunidad de avance de PCNA del replisoma recluta a CAF-1, que es un factor de ensamblaje del nucleosoma, el cual facilita el deposito de tetrameros H\-H4 2 en las cadenas hijas dobles resultantes de la replicaci6n. Los tetrameros pueden producirse por rotura de los nucleosomas existentes por el triplete de replica cion o como resultado del ensamblado de histonas recien sintetizadas. Fuentes similares proporcionan los dfmeros H2A-H2B, que despues se ensamblan con el tetramero H3 2 -H4 2 para completar el nucleosoma. Dicho tetra.mero y los dfmeros H2A-H2B se ensamblan en forma aleatoria, de modo que los nuevos nucleosomas pueden incluir tanto las histonas previas como las de reciente sfntesis. La polimerasa de RNA desplaza a los octameros de histonas durante la transcripci6n. Los nucleosomas vuelven a formarse sobre el DNA despues de que ha pasado Ia polimerasa, a menos que la transcripci6n sea muy intensiva (como en el DNAr), en cuyo caso, pueden desplazarse por completo. La via independiente de Ia replicaci6n para el ensamblaje del nucleosoma se encarga de sustituir los octameros de histonas desplazados por la transcripci6n. Utiliza Ia variante de histona H3.3 y no H3. Para el ensamblaje de nucleosomas en secuencias de DNA centromericas despues de Ia replicaci6n, se usa una vfa similar, con otra alternativa de H3. Un aislante bloquea Ia transmisi6n de efectos de activaci6n y desactivaci6n en la cromatina. Un aislante localizado entre un potenciador y un promotor imp ide que el primero active al segundo. Dos aislantes definen la region intermedia como u n dominio regulador; las interacciones regulatorias dentro del dominio se limitan a el, de modo que queda aislado de los efectos externos. La mayor parte de los aislantes bloquea el paso de los efectos reguladores, en cualquier sentido, pero algunos son direccionales. Los aislantes suelen bloquear tanto los efectos activadores (interacciones potenciador-promotor) como los desactivadores (mediados por dispersion de Ia heterocromatina), pero algunos se limitan a uno u otro. Se cree que los aislantes actuan por modificaci6n de Ia estructura de la cromatina de orden mayor, pero se desconocen los detalles. La actividad genica se vincula con dos tipos de cambios de sensibilidad a las nucleasas. La cromatina su sceptible de transcribirse tiene generalmente mayor sensibilidad a Ia desoxirribonucleasa I, lo cual refleja un cambio en la estructura en una region 792


amplia, que puede definirse como dominio, y c_ _contiene genes activos o potencialmente activos. ::.. sitios hipersensibles del DNA ocurren en local.:.=ciones bien definidas y se identifican por una s ..=.sibilidad mucho mayor a Ia desoxirribonuclea _£ : Un sitio h ipersensible consta de una secuencio. • -200 bp a partir de la cual se excluyen los nuc> somas, por Ia presencia de otras protefnas, ade- ' de que forma un lfmite que puede hacer que . nucleosomas adyacentes tengan restricciones :.cuanto a posicion. El posicionamiento de los nuc-:somas puede ser importante para controlar el acc.:-de protefnas reguladoras al DNA. Hay sitios hipersensibles en varios tipos de> guladores; los que regulan la transcripcion inclu~ promotores, potenciadores y LCR, a diferencio. · otros, que incluyen orfgenes para la replicaci6;: centromeros. Un promotor o potenciador actua - bre un solo gen, pero una LCR contiene un gn:: de sitios hipersensibles y puede regular un donli.:::_ que contenga varios genes.

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Los aislantes pueden variar en potencia

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am

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fJD

Una LCR puede controlar a un dominio

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56, 969-977.

Referencias

795

Control de La estructura de La cromatina ESQUEMA DEL CAPITULO ~

llB

Introducci6n La cromatina puede tener estados alternativos • La estructura de la cromatina es estable y no puede modificarse con la alteraci6n del equilibria de los factores de transcripci6n y las histonas.

~

EL remodelado de la cromatina es un proceso activo • Hay varies complejos de remodelado de la cromatina que utili zan la energia provista par la hidr6lisis del ATP. • Los complejos SWI/SNF, RSC y NURF son muy grandes todos y comparten algunas subu nidades relacionadas. • Un modelo de remodelado no tiene en si especificidad pa ra algun sitio diana particular, sino que debe ser reclutado par un componente del aparato de transcripci6n.

II.i.D

La modificaci6n de las histonas es un episodio clave

La desacetilaci6n se vincula con la represi6n de la actividad genica. • Hay desacetilasas presentes en complejos con actividad represora.

lliJ!I

Ocurre acetilaci6n de histonas en dos circunstancias

~

0

~

796

La acetilaci6n de histonas se relaciona con la actividad genica. La metilaci6n de DNA y de histonas se relaciona con la heterocromatina.

La activaci6n del promotor comprende una serie ordenada de episodios • El complejo de remodelado puede reclutar al complejo de acetilaci6n. • La acetilaci6n de histonas puede ser el suceso que mantenga al complejo en estado activado.

~

La fosforilaci6n de las histonas afecta la estructura de la cromatina • Al menos dos histonas son dianas de la fosforilaci6n, tal vez con efectos contraries.

~

Se encuentran algunos segmentos comunes en las prote\nas que modifican la cromatina El dominic cromo se encuentra en varias proteinas de la cromatina que tienen efectos de activaci6n o represi6n sabre la expresi6n de los genes. • El dominio SET es parte del sitio ca talftico de las transferasas de metilos de proteinas. • El dominic bromo se encuentra en una variedad de proteinas que interactua n con la cromatina y sirve para reconocer sitios aceti lados en las histonas. 0

Las acetilasas se relacionan con activadores • La cromatina desacetilada puede tener una estructu ra mas condensada. • Los activadores de la tran scripci6n se relacionan con actividades de acetilasa de histonas en grandes complejos. • Las acetilasas de histonas varia n en su especificidad diana. • La acetilaci6n podria afecta r la transcripci6n en una forma cuantitativa o cua litativa.

Los estados de la cromatina se interconvierten par modificaci6n 0

• Ocurre acetilaci6n de histonas de manera transitoria durante la replicaci6n. • La acetilaci6n de histonas se vi ncula con la activaci6n de la impresi6n gen ica .

linD

Las metilaciones de histonas y de DNA estan relacionadas • La metilaci6n de DNA y de histonas es una caracteristica de la cromatina inacti va. • Los dos ti pas de episodios de metilaci6n pueden estar relacionados.

• Las histonas se modifican por metilaci6n, acetilaci6n y fosforilaci6n

mil

Las desacetilasas se relacionan con los represores o

La organizaci6n de los nucleosomas puede cambiar en el promotor • Los activadores especificos de secuencia reclutan complejos de remodelado a los promotores. • El factor puede liberarse una vez que se ha unido el complejo de remodelado. • El promotor MMTV requiere un cambia del posicionamiento rotative de un nucleosoma que permita que un activador se una al DNA sabre el nucleosoma.

IIiD

m;J

~

Resumen

Ill

Introducci6n

Cuando se aborda !a transcripci6n en terminos de interacciones del DNA, factores de transcripci6n individuales y polimerasas de RNA, se llega a !a descripci6n precisa de los sucesos que tienen Iugar in vitro, pero carece de una caracterfstica importante de Ia transcripci6n in vivo. El genoma celular esta organizado en nucleosomas, pero en general se impide Ia iniciaci6n de !a transcripci6n si !a region del promotor esta empacada dentro de los nucleosomas. En este sentido, las histonas actuan como represores generalizados de transcripcion (una idea bastante antigua), si bien se ve en este capftulo que tambien participan en interacciones mas especfficas. La activacion de un gen requiere cambios en el estado de !a cromatina: el tema esencial es como tienen al DNA promotor los factores de transcripci6n. La estructura local de !a cromatina es parte integral del control de !a expresion genica . Los genes pueden estar presentes en una de dos condiciones estructurales. Se han encontrado genes en estado "activo" solo en las celulas donde se expresan . El cambio de estructura antecede al acto de !a transcripcion e indica que el genes "transcribible". Esto hace pensar que la adquisicion de una estructura "activa" debe de ser el primer paso en la expresi6n genica. Los genes activos se encuentran en dominios de !a eucromatina con susceptibilidad preferencial a las nucleasas (vease !a seccion 29 .19, Los dominios definen regiones que contienen genes activos) . Se crean sitios hipersensibles en los promotores antes de que se active un gen (vease la secci6n 29.18, Los sitios hipersensibles a !a desoxirribonudeasa cambian Ia estructura de la cromatina). En fecha mas reciente se ha visto que hay una conexion cercana y continua entre Ia iniciacion de Ia transcripcion y Ia estructura de Ia cromatina. Algunos activadores de !a transcripcion genica modifican de manera directa las histonas; en particular, Ia acetilacion de histonas se relaciona con !a activacion genica. Por el contrario, algunos represores de !a transcripcion actuan por desacetilaci6n de histonas.

El sitio diana esta libre cuando Ia concentraci6n de proteinas es baja

De este modo, un cambio reversible en Ia estructura de las histonas en Ia vecindad del promotor participa en el control de Ia expresi6n genica, lo que tal vez sea parte del mecanismo por el que un gen se mantiene en estado activo o inactivo. Los mecanismos por los que se mantienen regiones locales de cromatina en estado inactivo (silente) tienen relacion con el medio por el que se reprime cada promotor. Las protefnas involucradas en Ia formaci6n de Ia heterocromatina actuan en la cromatina a traves de las histonas, y las modificaciones de las histonas pueden ser una caracterfstica importante de !a interaccion. Una vez establecidos, dichos cambios en Ia cromatina pueden persistir a traves de las divisiones celulares y crear un estado epigenetico donde las propiedades de un gen son determinadas por !a estructura autoperpetuante de !a cromatina. El nombre epigenetica refleja el hecho de que un gen pudiese tener una circunstancia heredada (puede ser activa o inactiva) que no depende de su secuencia. Sin embargo, se pueden conocer mejor las propiedades epigeneticas por las estructuras autoperpetuantes denominadas priones (agen tes infecciosos proteinaceos).

1B1J La cromatina puede tener estados alternativos Concepto principal • La estructura de, la cromatina es estable y no puede modificarse con la alteraci6n del equilibrio de los factores de transcripci6n e histonas.

Se han propuesto dos tipos de modelos para explicar como cambia el estado de expresion del DNA: en equilibria o en cambio discontinuo. se muestra el modelo en equiEn Ia libria . Aquf el unico factor pertinente es Ia concentracion de !a protefna represora o activadora, que produce un equ ilibria entre las formas libre y unida al DNA. Cuando la concentraci6n de Ia protefna es suficientemente alta, ocupa su sitio de union a! DNA

c100% 50% C2J

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"(:)

La concentraci6n alta de proteinas propicia Ia union al DNA diana

~

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0 Concentraci6n de proteinas

En un modelo en equilibrio el estado de un sitio de union en el DNA depende de la concentraci6n de la proteina que se le une.

30.2 La cromatina puede tener estados alternativos

797

y altera el estado de expresion del acido. (Es posible que Ia union reprima o active cualquier secuencia diana particular.) Este tipo de modelo explica Ia regulacion de la transcripcion en celulas bacterianas, donde la expresion genica depende de manera exclusiva de las acciones de cada una de las proteinas represoras y activadores (vease el Capitulo 12, El operon). Puede predecirse si se transcribe un gen bacteriano a partir de Ia suma de concentraciones de varios factores que activan o reprimen al gen individual. Los cambios de estas concentraciones en cualquier momenta modificaran el estado de expresion de manera acorde. En Ia mayor parte de los casos, la union a proteinas es colaboradora, de modo que una vez que Ia concentracion alcanza un nivello suficientemente alto, hay un rapido vinculo con el DNA que origina un cambio en Ia expresion del gen. Ocurre una situacion diferente con Ia cromatina eucariotica. Los primeros experimentos in vitro mostraron que se puede establecer un estado activo o inactivo, pero esto no se afecta porIa adicion posterior de otros componentes. El factor de transcripcion TF rnA, indispensable para que Ia polimerasa de RNA Til transcriba los genes del RNAm 5S, no puede activar sus genes diana in vitro si estan combinadas con histonas. Sin embargo, si el factor esta presente ante DNA libre, forma un complejo de transcripcion, y despues, Ia adicion de histonas no impide que el gen se mantenga activo. Una vez que el factor

~

La polimerasa de RNA y los factores no pueden tener al DNA

f

se ha unido, permanece en el sitio; esto permite que una sucesion de moleculas de la polimerasa de RNA inicie Ia transcripcion. El que el factor o las histonas lleguen al sitio de control en primer termino puede ser el punto determinante. En la se muestran los dos tipos de circunstancia que pueden encontrarse en un promotor eucariotico. En el estado inactivo, hay nucleosomas que impiden que se unan los factores basales y la polimerasa de RNA. En el estado activo, el aparato basal ocupa el promotor, al que los octameros de histonas no pueden unirse. Ambos tipos de estado son estables. Se observa una situacion similar con el complejo TF 1p en los promotores de la polimerasa II de RNA. Un plasmido que contiene un promotor de adenovirus se puede transcribir in vitro por la actividad de la polimerasa II de RNA en una reaccion que requiere TF IID y otros factores de transcripcion. El molde puede ensamblarse en nucleosomas si se adicionan histonas. Si se agregan las histonas antes del TF IID, no puede iniciarse la transcripcion. No obstante, si el TFIID se agrega primero, el molde puede aun ser transcrito en esa forma de cromatina. Por lo tanto, el TF IID puede reconocer el DNA libre pero no puede hacer lo mismo con el DNA de los nucleosomas o actuar sobre eL Solo el TFIID debe agregarse antes de las histonas; los otros factores de transcripcion " la polimerasa de RNA se pueden agregar despues, lo que permite suponer que Ia union del TF rrD al promotor crea una estructura a Ia que se pueden unir otros componentes del aparato de transcripcion. Es importante senalar que en estos sistemas in vitro se utilizan cantidades desproporcionadas de componentes, que pueden crear situaciones nonaturales. Por lo tanto, Ia mayor importancia de estos resultados noes que demuestren el mecanismo utilizado in vivo, sino que establecen el principia de que los facto res de transcripci6n o nucleosomas pueden forma r estructuras estables que no pueden cambiarse tan solo con la modificaci6n del equilibria con los componentes fibres.

B1J ~ Los octameros de histonas no pueden tener al DNA

"·f

')) ")) "] J)JJ Si los nucleosomas se forman en un promotor, los factores de transcripci6n (y la polimerasa de RNA) no pueden unirse. Si los factores de transcripci6n (y la polimerasa de RNA) se unen al promotor para establecer un complejo estable de inicio, se excluyen las histonas.

798

CAPITULO 30 Control de la estructura de la cromatina

El remodelado de la cromatina es un proceso activo

Conceptos princi pales • Hay varios complejos de remodelado de cromatina que utilizan energ1a provista por la hidr6lisis del ATP. • Los complejos SWI/SNF, RSC y NURF son todos muy grandes y comparten subunidades relacionadas. • Un complejo de remodelado no tiene en s1 especificidad para algun sitio diana particular, sino que debe ser reclutado por un componente del aparato de transcripci6n.

El proceso general de inducci6n de cambios en Ia estructura de Ia cromatina se denornina remodelado de cromatina, que consta de mecanismos para remplazar histonas y depende del aporte de energia. Muchos os proteina-proteina y proteina-DNA necesitan moctificarse para que se liberen histonas de Ia cromatina. No hay traslados sin costo; debe proveerse energia para alterar estos os. En Ia • se ilustra el principia de un modelo dinamico, por un factor que hidroliza el ATP. Cuando el octamero de histonas se Iibera del DNA, se pueden unir otras protefnas (en este caso, facto res de transcripci6n y polimerasa de RNA). En la se resumen los tipos de cambios de remodelado de Ia cromatina que pueden describirse in vitro: • Los octameros de histonas pueden desplazarse por el DNA y cambiar Ia relaci6n entre el acido nucleico y las proteinas, lo que modifica Ia posicion de una secuencia particular sobre Ia superficie del nucleosoma. • El espaciamiento entre octameros de histonas puede cambiar, de nuevo con el resultado de que se alteran las posiciones de cada secuencia con relacion a Ia protefna . • El cambia mas extenso es cuando un octamero puede desplazarse por completo del DNA para generar una brecha sin nucleosomas. El uso mas comun del remodelado de Ia cromatina es cambiar la organizacion de los nucleosomas en el promotor de un gen que se va a transcribir. Esto se requiere para permitir que el aparato de transcripci6n tenga al promotor. Sin embargo, tambien se necesita remodelado para permitir otras manipulaciones de Ia cromatina, incluidas las reacciones de reparacion del DNA daiiado. El remodelado adopta mas a menudo Ia forma de desplazamiento de uno 0 mas octameros de histonas . Esto puede detectarse por un cambia en Ia escalera de Ia nucleasa de micrococos, donde se ha perdido Ia protecci6n contra Ia escisi6n. A menu do, esto da origen a la creacion de un sitio que es hipersensible a Ia escisi6n porIa desoxirribonucleasa I (vease Ia secci6n 2 9 .18, Los sitios hipersensibles a Ia desoxirribonucleasa cambian Ia estructura de Ia cromatina). A veces hay cam bios menos notorios, por ejemplo, que incluyen una modificacion en Ia posicion rotativa de un solo nucleosoma; esto puede detectarse por Ia perctida de Ia escalera de l 0 bases de la desoxirribonucleasa I. Asi, los cambios en Ia estructura de Ia cromatina pueden ir desde alterar Ia posicion de los nucleosomas basta retirarlos. El remodelado de cromatina lo realizan grandes complejos que aprovechan Ia hidrolisis de ATP para proveer Ia energfa. El meollo del complejo de remodelado es su subunidad de fosfatasa del trifosfato

de adenosina. Los complejos de remodelado suelen clasificarse de acuerdo con el tipo de subunidad de fosfatasa del trifosfato de adenosina; aquellos con subunidades de fosfatasa del trifosfato de adenosina relacionadas se consideran pertenecientes a Ia misma familia (por lo general algunas otras subunidades son tambien comunes). En Ia se conservan los nombres. Los dos tipos principales

Complejo de remodelado - Se desplaza el octamero ~

]]]]]] ~ ATP _,.. ADP+P

Se unen los factores

]]'']~~ El modele dinamico para la transcripci6n de la cromatina depende de factores que pueden aprovechar la energia provista por la hidr6lisis del ATP para desplazar nucleosomas de secuencias especificas del DNA.

Los nucleosomas se deslizan

......

Se ajusta el espaciado

El nucleosoma se desplaza

1IDD

)lj)J) ]]])

")))])

]J)j) ]ill

!

t

Las secuencia cambia de posicion

l

v

El espaciamiento se hace uniforme

l

t

Brecha de DNA libre

Los complejos de remodelado pueden hacer que los nucleosomas se deslicen par el DNA, pueden desplazar a los nucleosomas del DNA o reorganizar el espaciado entre los nucleosomas.

30.3 El remodelado de La cromatina es un proceso activo

799

Tipo de complejo

SWI/SNF

IS WI

Otras

Levaduras

SWI/SNF RSC

ISWI ISW2

Complejo IN080 SWRI

Moscas

dSWI/SNF (brahma)

NURF CHRAC ACF

Seres humanos

hSWI/SNF

RSF hACF/WCFR hCHRAC WICH

NuRD Complejo IN080 SRCAP

WICH CHRAC ACF

Mi-2

Ran a

Los complejos de remodelado pueden clasificarse por sus subunidades de fosfatasa del trifosfato de adenosina.

de complejos son SWl/SNF e ISWI (las siglas ISWl se refieren a SWI de imitacion). Las levaduras tienen dos complejos SWl/SNF y tres complejos ISWl. Se encuentran tambien complejos de ambos tipos en Ia m osca y el ser humano. Cada tipo de complejo puede emprender una varie dad diferente de actividades de remodelado. El primer complejo de remodelado identificado fue SWIISNF, nombre que refleja el hecho de que muchas de sus subunidades son codificadas por genes identificados en un principia mediante mutacion es SWI o SNF en Saccharomyces cerevisiae. Las m utaciones de estos loci son pleiotropicas y Ia variacion de defectos es similar a la que muestran los mutantes que perdieron !a cola del dorninio carboxilo terminal {CTD ) de !a po limerasa de RNA II. Estas mutaciones tambien muestran interacciones geneticas con las mutaciones de genes que codifi · can los componentes de la cromatina, en particular SINl, que codifica una proteina no histona, y SIN2, que codifica la histona H3. Se requieren los genes SWI y SNF para la expresion de una variedad de loci individuales (se afectan -120, o 2%, de los genes de S. cerevisiae). La expresion de estos loci puede reque rir que el complejo SWl/SNF remodele la cromatina en sus promotores. El complejo SWI/SNF actua en forma catalftica in vitro y hay solo - 150 complejos por celula de levadura. Los genes que codifican las subunidades SWl/ SNF n o son esenciales, lo que indica que la levadura debe de tener tambien otras formas de remodelado de la cromatina. El complejo RSC (qu e remodela la estructura de la cromatina) es mas abundante y tambien indispensable. Actua en -700 loci diana. Los complejos SWI/SNF pueden remodelar la cromatina in vitro sin perdida global de histonas, o 800


pueden desplazar a los octameros de histona. Am· bos tipos de reaccion tal vez pasen por el mismo proceso intermedio donde se altera Ia estructura de un nucleosoma diana, lo que !leva a Ia reconstitucion de un nucleosoma (remodelado) sobre el DNA original, o al desplazamiento del octamero de histonas bacia una molecula diferente de DNA. El complejo SWI/ SNF altera la sensibilidad de los nucleosomas a la desoxirribonucleasa I en el sitio diana e induce cambios en los os protefnaDNA que persisten despues que se ha liberado de los nucleosomas. La subunidad Swi2 es la fosfatasa del trifosfato de adenosina, que aporta la energfa para el remodelado por SWl/SNF. Hay muchos os entre el DNA y un octamero de histonas; 14 identificados en la estructura cristalina. Todos estos os deben romperse para que pueda liberarse un octamero o moverse a una nueva posicion. <'.Como se logra esto? Se pueden descartar algunos mecanismos obvios, porque se sabe que no se genera DNA de cadena {mica durante el remodelado (y no hay actividades de helicasa vinculadas con los complejos). La creencia actual es que los complejos de remodelado en las clases SWI e ISWI aprovechan la hidrolisis del ATP para hacer girar el DNA en Ia superficie del nucleosoma. Las pruebas indirectas permiten suponer que esto crea una fuerza mecan ica que permite a una pequefia region del DNA liberarse de la superficie y despues volver a ubicarse. Una reaccion importante catalizada por complejos de remodelado incluye el deslizamiento de los nucleosomas. Se observo por primera vez que Ia familia ISWI afecta el posiciona miento de los nucleosomas sin desplazar a los octameros. Esto se logra por una reaccion de deslizamiento donde el oct<'imero se mueve a lo largo del DNA. El deslizamiento se impide si se retira !a cola N terminal de la histona H4, pero no se sabe con exactitud como actua dicha estructura a ese respecto. Los complejos SWl/SNF tienen Ia misma capacidad; se impide la reaccion con la introduccion de una barrera en el DNA. lo que hace pensar que hay una reaccion de deslizamiento, donde el octamero de histonas se traslada mas o menos en forma continua por el DNA sin perder o en ningun momento. Un enigma acerca de la accion del complejo SWI/SNF es su tamafio completo. Tiene 11 subunidades con un peso molecular combinado de -2 x 10 6 . Esto hace muy pequefia a la polimerasa de RNA y el nucleosoma, lo que dificulta comprender como todos estos componentes pudiesen interactuar con el DNA detenido en la superficie del cromosoma. Sin embargo, se puede encontrar un complejo de transcripcion con actividad completa, llamado holoe nzima polimerasa II de RNA, qu e contiene la

polimerasa de RNA misma, todos los facto res TFn excepto TBP y TF11A, y el complejo SW 1/SNF, que se vincula con la cola CTD de Ia polimerasa. De hecho, casi todo el complejo SWJ/SNF puede estar presente en los preparados holoenzimaticos, lo que sugiere que el remodelado de la cromatina y el reconocimiento de los promotores tienen lugar en forma coordinada por un solo complejo.

La organizaci6n de los nucleosomas puede cambiar en el promotor

1.

El factor especifico de secuencia se une al DNA

El complejo de remodelado se une al sitio a !raves de un factor Compl jo de r mo lado

2.

Conceptos principales • Los activadores espec\ficos de secuencia reclutan complejos de remodelado a los promotores. • El factor puede liberarse una vez que se ha unido el complejo de remodelado. • El promotor MMTV requiere un cambio del posicionamiento rotativo de un nucleosoma que permita que un activador se una al DNA sobre el nucleosoma.

i... Como se dirigen los complejos de remodelado a sitios especfficos de la cromatina? No contienen en sf subunidades que se unan a secuencias espedficas de DNA, lo que hace pensar en el modelo que se muestra en Ia , donde son reclutados por activadores o (a veces) por represores. La interaccion entre los factores de transoipcion y los complejos de remodelado da indicios clave de su forma de accion. El factor de transcripcion Swi5 activa el locus HO en levaduras (notese que Swi5 no es miembro del complejo SWIISNF). El Swi5 entra a los nucleos cerca del final de la mitosis y se une al promotor HO. Despues recluta SWI/SNF al promotor. A continuacion, se Iibera Swi5, que deja a SWI!SNF en el promotor, lo que significa que un factor de transcripcion puede activar un promotor por un mecanismo de "batear y correr", donde su fundon se cumple una vez que se ha unido el complejo de remodelado. Se descubrio Ia participacion de los complejos de remodelado en la activacion genica porque dichos complejos son indispensables para que ciertos factores de transcripcion puedan activar sus genes diana. Uno de los primeros ejemplos fue el factor GAGA, que activa al promotor de hsp70 de Drosophila in vitro. La union de GAGA a cuatro sitios ricos en ( CT), en el promotor altera los nucleosomas, crea una region hipersensible y hace que los nucleosomas adyacentes se reacomoden de manera que ocupen posiciones preferentes mas que aleatorias. La escision es un proceso que depende de Ia energfa y que requiere el complejo de remodelado NURF. La

Un complejo de remodelado se une a la emmatina gracias a un activador (o un represor) .

organizacion de los nucleosomas se modifica para crear un limite que determine las posiciones de los nucleosomas cercanos. Durante este proceso, GAGA se une a su sitio diana y al DNA; su presencia fija el estado remodelado. El sistema PHO fue uno de los primeros en los que se demostro que hay un cambio en Ia organizacion de los nucleosomas durante la activacion genica. En el promotor PH05 el regulador de bHLH, PH04, responde a Ia privacion de fosfatos con la induccion de la rotura de cuatro nucleosomas en una posicion precisa. Ese episoclio es independiente de la transcripcion (se presenta en un mutante TATA-) y de la replicacion. Hay dos sitios de union para PH04 en el promotor. Uno se localiza entre los nucleosomas, que se puede unir por el dominio de union a DNA aislado PH04, y el otro yace dentro del nudeosoma y no puede reconocerse. La rotura del nucleosoma para permitir la union del DNA en el segundo sitio es indispensable para Ia activacion genica. Dicha accion requiere Ia presencia del dominio de activacion de la transcripcion.

30.4 La organizaci6n de los nucleosomas puede cambiar en el promotor

801

La secuencia del activador de VP 16 puede sustituir a la correspondiente PH04 en la escision del nucleosoma. Esto hace pensar que la rotura tiene lugar gracias a interacciones proteina-proteina que involucran a la misma region que hace os protefna-protefna para activar la transcripcion. En este caso, no se sabe que complejo de remodelado participa en la ejecucion de los efectos. Una busqueda de posiciones de nucleosomas del genoma de levadura mostro que la mayor parte de los sitios donde se unen factores de transcripcion estan libres en el nucleosoma. Los promotores de la polimerasa II de RNA por lo general tienen una region sin nucleosomas -200 bp en sentido ascendente respecto del punto de inicio, que es flanqueado por los nucleosomas ubicados a cada lado. Sin embargo, no siempre tienen que excluirse los nucleosomas para permitir la iniciacion de la transcripcion. Algunos activadores pueden unirse al DNA en la superficie de un nucleosoma. Los nucleosomas parecen ubicados de manera precisa en algunos elementos de respuesta de hormonas esteroides, de manera que se puedan unir a los receptores. La union a receptores tal vez altere la interaccion del DNA con las histonas y pudiese incluso llevar a la exposicion de nuevos sitios de union. Podria requerirse el posicionamiento exacto de los nucleosomas, ya sea porque el nucleosoma "presenta" el DNA en una fase de rotacion particular, o porque hay interacciones protefna-proteina entre los activadores y las

v NF1

Receptor Receptor de hormona de hormona

Receptor de hormonaNF 1 Receptor de hormona ' Octamero ./ de histonas HS en el eje ~. Receptor de hormona

~

El receptor hormonal y NF1 no pueden unirse de manera simultanea al promotor MMTV en forma de DNA lineal, pero pueden hacerlo cuando el DNA se presenta sabre la superficie del nucleosoma.

802


histonas u otros componentes de la cromatina. De algun modo, se ha dejado de vera la cromatina solo como una estructura represiva y ahora se analizan cuales interacciones entre activadores y cromatina pueden necesitarse para la activacion. El promotor MMTV representa un ejemplo de la necesidad de una organizacion nucleosomica especffica. Contiene un conjunto de seis sitios palindromicos en parte, cada uno unido a un dfmero del receptor de la hormona (HR), que constituye el HRE. Tambien tienen un sitio de union aislado para el factor NF l, y dos sitios cercanos para el factor OTF. HR y NFl no pueden unirse de manera simultanea a otros sitios en el DNA libre. La muestra como la estructura del nucleosoma controla la union de los factores. El HR protege sus sitios de union en el promotor cuando se agrega hormona, pero no afecta a los sitios sensibles ala nucleasa de micrococos, que marcan ambos !ados del nucleosoma. Esto permite suponer que HR se une al DNA sobre la superficie del nucleosoma; sin embargo, el posicionamiento rotativo del DNA en el nucleosoma antes de la adicion de la hormona permite el a solo dos de cuatro sitios. La union a los otros dos sitios requiere un cambia en la posicion de rotacion sobre el nucleosoma, que puede detectarse por la aparicion de un sitio sensible en el eje de simetrfa par (que esta en el centro de los sitios de union que constituyen el HRE). Se puede bus car NFI en el nucleosoma despues de la induccion hormonal, de modo que dichos cambios estructurales tal vez sean necesarios para permitir la union de NFl, quizas porque exponen al DNA y eliminan el impedimenta esterico por el que el HR bloquea la union de NFl al DNA libre.

1111


Concepto principal

• Las histonas se modifican par metilaci6n, acetilaci6n y fosforilaci6n.

El que un gen se exprese depende de la estructura local de la cromatina (en el promotor) yen el dominio circundante. La estructura de la cromatina puede regularse de manera correspondiente gracias a episodios de activacion individuales o cambios que afectan una region cromosomica amplia. Los sucesos mas localizados implican a un gen diana individual donde se presentan cambios en la estructura de los nucleosomas y su organizacion en la vecindad inmediata del promotor. Cambios mas generales pueden afectar regiones tan grandes como todo un cromosoma.

Los cambios que afectan a regiones grandes controlan la posibilidad de expresarse de un gen. El termino silenciamiento se utiliza para referirse a la represi6n de la actividad de un gen en una region cromos6mica local. La denominacion heterocromatina se usa para describir regiones de los cromosomas que son lo bastante grandes como para observarse con una estructura ffsicamente mas compacta al microscopio. La base de ambos tipos de cambio es la misma: proteinas adicionales se unen a Ia cromatina e impiden de manera directa o indirecta Ia activaci6n de los promotores en Ia region por factores de transcripci6n o Ia polimerasa de RNA. Los cambios en cada promotor controlan que Ia transcripci6n se inicie en un gen particular y pueden ser de activacion o represion. Todos estos episodios dependen de interacciones con histonas. Los cambios en la estructura de la cromatina se inician cuando se modifican las colas terminales Nes de las histonas, en especial H3 y H4. Las colas de las histonas constan de 15-30 aminoacidos en el extremo N de las cuatro histonas centrales y el extremo C de H2A. Las colas de H2B y H3 pasan entre los giros del DNA (vease la Figura 29.21 en la secci6n 29 .7, Organizaci6n del octamero de histonas). La J muestra que se pueden modificar en varios sitos por metilacion, acetilaci6n o fosforilacion. Otras modificaciones, como una monoubicuitinacion o dimetilaci6n tambien ocurren, pero no estan bien descritos. La acetilacion y metilacion tienen lugar en el grupo amino libre (£) de la lisina. Como se observa en la la acetilaci6n retira Ia carga positiva que reside en Ia forma NH; del grupo. Tambien ocurre metilacion en la arginina. La fosforilacion se presenta en el grupo hidroxilo de Ia serina y tambien en la treonina, lo que introduce una carga negativa en forma de un grupo fosfato. La lisina puede ser mono, di o trimetilada (todas las formas con carga positiva) y la arginina puede ser mono o dimetilada (en forma simetrica o asimetrica). Estas modificaciones son transitorias. Pueden cambiar Ia carga de la molecula de Ia protefna y, en consecuencia, estan en posibilidades de modificar las propiedades funcionales de los octameros . Las modificaciones de las histonas se vinculan con los cambios estructurales que se presentan en Ia cromatina durante la replicacion y transcripci6n. Pueden requerirse fosforilaciones en posiciones especfficas y en diferentes histonas para procesos particulares, por ejemplo, la posicion Ser 10 de H3 se fosforila cuando los cromosomas se condensan durante la mitosis. En celulas en cultivo sincronizadas, tanto las histonas medulares preexistentes como las recien sintetizadas parecen ser acetiladas y metiladas durante la fase S (cuando se replica el DNA y tambien

se sintetizan las histonas). Durante el dclo celular, los grupos modificantes se retiran despues. La coincidencia de modificaci6n y replicacion hace suponer que Ia acetilaci6n (y metilaci6n) podrian vincularse con el ensamblaje del nucleosoma. Una especulacion ha sido que Ia disminuci6n de las cargas positivas en las histonas podrfa aminorar su afinidad por el DNA, lo qu e permite controlar mejor la reacci6n. La idea ha perdido sustento despu es de que se observo que los nucleosomas pueden reconstituirse, al menos in vitro, con histonas no modificadas. La acetilacion de histonas es indispensable para el ensamblaj e de nucleosomas en las levaduras y tal vez se requiera para algunas de

2

3

4

12 13 14

Sitios de modificaci6n en H4

2

3

4

5

6

7

14

Las colas terminates Nes de las histonas H3 y H4 pueden acetilarse, metilarse o fosforilarse en varias posiciones.

Acetilaci6n

-w0

CH 3

La acetilaci6n de la lisina o la fosforilaci6n de la serina reducen la carga positiva global de una prote1na. 30.5 La modificaci6n de las histonas es un episodio clave

803

las interacciones proteina-protefna que tienen Iugar durante etapas mas avanzadas de Ia reaccion (vease Ia seccion 30.6, Ocurre acetilacion de histonas en dos circunstancias). Ocurre un ciclo de fosforilacion y desfosfori lacion en Hl, pero su sincronizacion es diferente del ciclo de modificacion de las otras histonas. En celulas de mamifero en cultivo se introducen uno o dos grupos fosfato durante Ia fase S. No obstante, el principal episodio de Ia fosforilaci6n es la adici6n posterior de mas grupos en Ia mitosis, lo que !leva a! numero total de hasta seis . Todos los grupos fosfato se retiran al final del proceso de division. La fosforilacion de Hl es catalizada por una cinasa de fase M, que provee el desencad enamiento indispensable para la mitosis. De hecho, esta enzima ahora se estudia a menudo en terminos de su actividad de

Colas terminales Nes

H3

H4

Cromatina activa

H3

H4

Cromatina inactiva

La acetilaci6n de H3 y H4 se vincula con la cromatina activa, en tanto la metilaci6n se relaciona con la cromatina inactiva.

Histona Sitio H3 H3

H3 H3 H3 H4 H4 H4 H4

Modificaci6n

Funci6n

Lis-4 Lis-9 Lis-9

Metilaci6n Metilaci6n Metilaci6n

Lis-9 Ser-10 Lis-14 Lis-79

Acetilaci6n Fosforilacion Acetilaci6n Metilaci6n

Activaci6n Condensaci6n de Ia cromatina Se requiere para Ia metilaci6n del DNA Activaci6n Activaci6n lmpide Ia metilaci6n en Lis-9 Silenciamiento telomerico

Arg-3 Lis-5 Lis-12 Lis-16 Lis-16

Metilacl6n Acetilaci6n Acetilaci6n Acetilaci6n Acetilaci6n

Ensamblaje Ensamblaje Ensamblaje del nucleosoma Activaci6n de X en Ia mosca

La mayor parte de los sitios modificados en las histonas tiene un tipo unico especifico de modificaci6n, pero algunos sitios pueden tener mas de un tipo de modificaci6n. Cada una de las fun ciones se puede vincular con algunas de las modificaciones.

804


cinasa de Hl. No se sabe mucho acerca de la o las fosfatasas que retiran despues los grupos. La sincronizacion de la fosforilaci6n principai de HI ha llevado a especular que participa en la condensacion mitotica. Sin embargo, en el genero Tetrahymena (de protozoarios) es posible la delecion de todos los genes de Hl sin afectar de manera significativa las propiedades globales de Ia cromatina. Hay un efecto mas bien pequefio sobre Ia capacidad de la cromatina de condensarse durante Ia mitosis. Algunos genes se activan y otros se reprimen por ese cambia, lo que sugiere que hay alteraciones de la estructura local. Las mutaciones que eliminan sitios de fosforilacion en Hl no tienen efecto, pero aquellas que simulan los efectos de la fosforilaci6n producen un fenotipo que se parece al de la delecion. Esto permite suponer que el efecto de la fosforilacion de H 1 es eliminar sus acciones sabre la estructura de la cromatina local. (.Afectan las modificaciones de las histonas de manera directa la estructura del nucleosoma o su efecto sobre Ia cromatina es indirecto? No hay, de hecho, muchas pruebas de alguna diferencia en las propiedades de los nucleosomas conforme al estad de modificacion de las histonas. Sin embargo, hasta ahara se han descrito varios casos donde la modificacion de las histonas crea sitios de union para proteinas no hi stonas, que cambian las propiedades de la cromatina. Los nucleosomas sujetos a modificacion pueden ser muy diversos. La modificacion tal vez sea un episodio locaL por ejemplo, restringido a los nucleosomas en el promotor. Tambien puede ser un suceso general que se extiende, por ejemplo, hasta todo un cromosoma. La muestra que hay una correlaci6n general donde la acetilacion se vincula con la cromatina activa, en tanto Ia metilacion se relaciona con la cromatina inactiva. No obstante, esto no es una regia simple y los sitios particulares que se modifican (asi como las combinaciones de modificaciones espedficas) pueden ser importantes, de manera que hay, sin duda, excepciones donde (por ejemplo) las histonas metiladas en cierta posicion se encuentran en la cromatina activa. Las mutaciones en uno de los complejos de acetilasas de histonas de levaduras tienen el efecto contrario al habitual (impiden el silenciamiento de algunos genes); esto resalta la falta de un efecto uniforme de la acetilaci6n. La especificidad de las modificaciones la indica el hecho de que muchas de los enzimas modificantes tienen sitios diana individuales en histonas especificas. En la se resumen los efectos de algunas de las modificaciones. La mayor parte de los sitios modificados esta sujeta a un solo tipo de cambia. En algunos casas, la modificaci6n de un sitio

puede activar o inhibir la moclificaci6n en otro. La idea de que se pueden usar las combinaciones de seiiales para definir los tipos de cromatina a veces se ha llamado c6digo de histonas.

ED

Ocurre acetilaci6n de histonas en dos circunsta ncias

Conceptos principales • Ocurre acetilaci6n transitoria de histonas durante La replicaci6n. • La acetilaci6n de histonas se vincula con la activaci6n de la expresi6n genica.

Todas las histonas centrales pueden acetilarse. Las principales dianas para la acetilaci6n son las lisinas en las colas terminales Nes de las histonas H3 y H4. La acetilaci6n tiene Iugar en dos circunstancias diferentes: • Durante Ia replicaci6n del DNA y • Cuando se activan los genes. Cuando se replican los cromosomas, lo que ocurre durante la fase S del ciclo celular, las histonas se acetilan de manera transitoria. La muestra que esa acetilaci6n ocurre antes de que las histonas se incorporen a los nucleosomas. Se sabe que las histonas H3 y H4 se acetilan en Ia etapa en que se vinculan entre sf en el tetramero H\-H42 . El tetramero se incorpora entonces a los nucleosomas. Bastante poco despues, se retiran los grupos acetilo. La importancia de la acetilaci6n queda de manifiesto por el hecho de que impeclirla en las histonas H3 y H4 durante Ia replicaci6n causa perclida de viabilidad en las levaduras. Las dos histonas son abundantes como sustratos, porque la levadura puede mantenerse perfectamente bien en tanto pueda acetilar cualquiera de esas histonas durante la fase S. Hay dos posibles funciones de Ia acetilaci6n: podrfa necesitarse para que las histonas sean reconocidas par factores que las incorporan a los nucleosomas, o podrfa requerirse para el ensamblaje, Ia estructura, o ambos, del nuevo nucleosoma. Los factores que se sabe intervienen en el ensamblaje de la cromatina no distinguen entre histonas acetiladas y no acetiladas, lo que hace pensar que es mas probable que se requiera Ia moclificaci6n para interacciones posteriores. Se ha crefdo durante mucho tiempo que tal vez se requiera acetilaci6n para ayudar a controlar las interacciones protefnaprotefna que tienen Iugar a medida que las histonas se incorporan a los nucleosomas. Una prueba de tal participaci6n es que el complejo de acetilasa de histonas SAS en las levaduras se une a! complejo de ensamblaje de la cromatina en Ia horquilla de replicaci6n, donde acetila a la 16Lis de la histona 4. Esto

puede ser parte del sistema que establece los patrones de acetilaci6n de histonas despues de Ia replicaci6n. Fuera de Ia fase S, Ia acetilaci6n de histonas en Ia cromatina en general tiene correlaci6n con el estado de expresi6n genica. La correlaci6n se observ6 par primera vez porque Ia acetilaci6n de histonas aumenta en un dominio que contiene genes activos y Ia cromatina acetilada es mas sensible ala desoxiribonucleasa I y (tal vez) a Ia nucleasa de micrococos. La muestra que esto implica la acetilaci6n de colas de histonas en los nucleosomas. Ahara se sabe que esto ocurre en gran parte par la acetilaci6n de nucleosomas en Ia vecindad del promotor cuando se activa un gen.

La acetilaci6n durante La replicaci6n ocurre en las histonas antes de que se incorporen a los nucleosomas.

:

..

:

La acetilaci6n relacionada con la activaci6n genica ocurre por modificaci6n directa de las histonas en los nucleoso mas. 30.6 Ocurre acetilaci6n de histonas en dos ci rcunstancias

805

Ademas de los sucesos en cada promotor, ocurren cambios a gran escala en Ia acetilaci6n de los cromosomas sexuales . Esto es parte del mecanismo por el que las actividades en el cromosoma X se alteran para compensar Ia presencia de dos cromosomas X en una especie, pero solo uno (ademas del cromosoma Y) en otras (vease la secci6n 31.5, Los cromosomas X presentan cambios globales). El cromosoma X inactivo en mamiferos hembra tiene una H4 subacetilada. El cromosoma X superactivo en machos del genero Drosophila presenta mayor acetilaci6n de H4, lo que sugiere que Ia presencia del grupo acetilo puede ser un prerrequisito para una estructura activa menos condensada. En el macho del genera Drosophila, el cromosoma X esta acetilado de manera espedfica en la 16 Lis de Ia hisrona H4. La acetiltransferasa de las histonas (HAT) encargada es una enzima que se recluta al cromosoma como parte de un gran complejo protefnico. Este complejo de "compensaci6n de dosis " se encarga de introducir cambios generales en el cromosoma X que le permiten una mayor expresi6n. El aumento de la acetilaci6n es solo una de sus actividades.

IIIII

Las acetilasas se relacionan con activadores

Conceptos principales • La cromatina desacetilada puede tener una estructura mas condensada. • Los activadores de la transcripci6n se relacionan con· actividades de acetilasa de histonas en grandes complejos. • Las acetilasas de histonas varian en su especificidad · diana.

de que Ia acetilaci6n se vincula con la expresi6n genica; de hecho, la capacidad del acido butfrico de causar cambios en la cromatina semejantes a los observados en Ia activaci6n de genes constituye uno de los primeros indicios de la conexi6n entre acetilaci6n y actividad genica. El gran adelanto logrado al analizar Ia funci6n de Ia acetilaci6n de histonas fue la descripci6n de las enzimas acetilantes y desacetilantes y su vinculo con otras protdnas que intervienen en episodios espedficos de activaci6n y represi6n. Un cambia basico en la manera de ver la acetilaci6n de histonas lo propici6 el descubrimiento de que las HAT no so n necesariamente enzimas dedicadas vinculadas con la cromatina; mas bien resulta que los activadores de Ia transcripci6n conocidos tienen actividad de HAT. Se estableci6 la conexi6n cuando se identific6 la subunidad catalftica de un grupo A de HAT como hom6loga de la protefna reguladora GenS en levaduras. Despues se demostr6 que la GenS misma tiene actividad de HAT (con las histonas H3 y H4 como sustratos). La GenS es parte de un complejo adaptador necesario para la interacci6n entre 300 potenciadores y sus promotores diana . Su actividad de HAT se requiere para Ia activaci6n del gen diana. Esto permite cambiar la imagen de Ia acci6n de los coactivadores, como se muestra en la _t. . donde la polimerasa de RNA se une a un sitio hipersensible y los coactivadores son histonas acetilantes en los nucleosomas de la vecindad. Se sabe hoy de muchos ejemplos de interacciones de este tipo. El GenS conduce a uno de lo s complejos de acetilasas mas importantes. En las levaduras, GenS es parte del complejo de acetiltransferasa Spt-AdaGenS (SAGA) de 1.8 MDa qu e contiene varias pro-

• La acetilaci6n podria afectar la transcripci6n en una forma cuantitativa o cualitativa.

La acetilaci6n es reversible. Cada direcci6n de la reacci6n es catalizada por un tipo especifico de enzima. Las enzimas que pueden acetilar histonas se llaman acetiltransferasas de histonas o HAT; los grupos acetilo son retirados por las desacetilasas de histonas o HDAC. Hay dos grupos de enzimas HAT: aquellas en el grupo A actuan sobre las histonas de Ia cromatina y participan en el control de Ia transcripci6n. Las del grupo B actuan sobre histonas de reciente sfntesis en el citosol y participan en el ensamblado de los nucleosomas. Dos inhibidores han permitido analizar Ia acetilaci6n. La tricostatina y el acido butfrico inhiben las desacetilasas de histonas y hacen que se acumulen nucleosomas acetilados. El uso de estos inhibidores ha servido de sustento a Ia opinion generalizada 806


Coactivadores Aparato basal I Activadores ~ PCAF _,r--.

I

·~·]·)};]·~~] Colas de histonas

Los coactivadores pueden tener actividades de HAT que acetilan las colas de las histonas nucleos6micas.

teinas que participan en la transcripcion. Entre estas proteinas se encuentran varios TAFu- Ademas, Ia subunidad TAFrrl45 de TF1p es una acetilasa. (La TAFrrl45 de levaduras es homologa de Ia TAF 11 250 de los mamiferos; ambas conocidas como TAFI.) Hay algunas funciones que coinciden entre TAFrrD y SAGA, Ia mas notoria es que las levaduras pueden mantenerse con TAFrrl45 o GenS, pero se dana par la delecion de ambos. Esto permite suponer que una actividad de acetilasa es indispensable para Ia expresion genica, pero puede proporcionarla TFuD o SAGA. Como podria esperarse par el tamafi.o del complejo de SATA, Ia acetilacion es solo una de sus funciones, si bien sus de mas acciones en Ia activa cion genica no estan tan bien descritas. Uno de los primeros activadores generales en caracterizarse como HAT fue Ia proteina de union de p300/CREB (CBP). (En Ia actualidad, p300 y CBP son protefnas diferentes, pero tienen una relacion tan cercana que a menudo se consideran como un solo tipo de actividad). La p300/ CBP es un coactivadar que enlaza a un activador con el aparato basal (vease la Figura 25.7). La p300/CBP interactua con varios activadores, como los receptores hormonales, AP-1 (c-Jun y c-Fos) y MyoD. La interaccion es inhibida par las proteinas reguladoras viricas E I A de adenovirus y el antigeno T de SV40, que se unen a p300/CBP para impedir la interaccion con factores de transcripcion; esto explica como estas protefnas vfricas inhiben la transcripcion celular. (Esta iniciacion es importante para la capacidad de las protefnas viricas de contribuir al estado tumorigenico). La p300 /CBP acetila las colas terminales Nes de H4 en los nucleosomas . Otro coactivador, PCAF, acetila de manera preferente Ia H3 en los nucleosomas. La p300/CBP y TCAF forman un complejo que participa en Ia activacion de Ia transcripcion. En algunos casas interviene otro HAT: el coactivador ACTR, que actua con receptores de hormonas y es en si un HAT que actua sabre H3 y H4 y tambien recluta tanto p300/CBP como PCAF para formar un complejo coactivador. Una explicacion de Ia presencia de multiples actividades de HAT en un complejo de coactivacion es que cada HAT tiene especificidad diferente y que se requieren multiples episodios de acetilacion diversos para Ia activacion. Una caracterfstica general de Ia acetilacion es que un HAT del grupo A es parte de un gran complejo. En Ia > 1 se muestra un modelo simplificado de su comportamiento. Los complejos HAT pueden dirigirse al DNA gracias a interacciones con factores de union a! DNA. Esto determina Ia diana del HAT. El complejo tambien contiene subunidades detectoras que alteran Ia estructura de la cromatina o actuan de manera directa sobre Ia transcripcion. Es posible que al menos algunos de los efectores

requieran el episodio de acetilacion para actuar. La desacetilacion, catalizada por una HDAC, puede actuar en forma similar. Ocurre acetilacion tanto en la replicacion (cuando es transitoria) como en la transcripcion (cuando se mantiene mientras el gen esta activo). (.Desempefi.a el mismo papel en cada caso? Una posibiJidad es que el efecto importante tenga Iugar sobre la estructura del nucleosoma . La acetilacion puede ser indispensable para "hacer mas laxo" el meollo del nucleosoma. En la replicacion tal vez se requiera la acetilacion de histonas para permitirles su incorporacion a nuevas meollos con mas facilidad. Es posible que en la transcripcion se necesite un cambia similar para permitir una modificacion relativa de la estructura, tal vez incluso permitir el desplazamiento del meollo de la histona del DNA. Otra posibilidad es que Ia acetilacion genere sitios de union para otras proteinas que se requieren en la transcripcion. En cualquier caso, la desacetilacion revertiria el efecto. (.ES cuantitativo o cualitativo el efecto de Ia acetilacion? Es posible que se requiera cierto numero de grupos acetilo para ejercer un efecto y en gran medida carece de importancia Ia posicion exacta donde ocurre . Una alternativa es que cada episodio de acetilacion tenga efectos especfficos. Podria interpretarse que hay complejos que contienen multiples actividades de HAT en cualquier forma; si diferentes enzimas tienen diversas especificidades, tal vez se requieran multiples actividades ya sea para acetilar un numero suficiente de posiciones diversas 0 parque se necesitan sucesos individuales para diferentes efectos sabre la transcripcion. En Ia replicacion, parece (al menos con respecto a Ia histona H4) que Ia acetilacion en cualquiera de las dos de tres posiciones disponibles es adecuada, lo que favorece un modelo cuantitativo en este caso. Donde Ia estructura de Ia cromatina cambia para modificar la transcripcion, Ia

La subunidad diana se une al DNA

La desacetilasa actua sobre las colas de histonas

Los efectores actuan sobre Ia cromatina o el DNA

Los complejos que modifican la estructura o actividad de la cromatina tienen subunidades diana que determinan sus sitios de acci6n, las enzimas HAT o las HDAC que acetilan o desacetilan histonas y subunidades efectoras que tienen otras acciones sabre la cromatina o el DNA.

30.7 Las acetilasas se relacionan con activadores

807

acetilacion en posiciones especfficas es importante (vease Ia seccion 31.3, La heterocromatina depende de las interacciones con his ton as ).

Ill

Las desacetilasas se relacionan con los represores

Conceptos principales • La desacetilaci6n se vincula con la represi6n de la actividad genica. • Hay desacetilasas presentes en complejos con actividad represora.

En las levaduras, las mutaciones en SIN3 y RPD3 acn1an como si estos loci reprimieran una diversidad de genes. Las protefnas forman un complejo con Ia protefna de union a DNA Ume6, que se une al elemento URSI. El complejo reprime Ia transcripcion en los promotores que contienen URS I , como se ilustra en Ia . La Rpd3 tiene actividad de desacetilasa de histonas; no se sabe si Ia funcion de Sin3 consiste solo en llevar Rpd3 al promotor o si tiene alguna otra funcion en Ia represion. Las celulas de mamfferos tienen un sistema similar para Ia represion. La familia bHLH de regulad ores de Ia transcripcion incluye activadores que actuan como heterodfmeros, entre los que se encuentra MyoD (vease Ia seccion 25.15, Las protefnas helice-asa-helice interactuan por vinculo combinatorio). Tambien comprende represores, en particular el heterodimero Mad:Max, donde Mad puede pertenecer a un grupo de protefnas muy relacionadas. El heterodfmero Mad:Max (que se une a sitios especfficos del DNA) interactua con un homologo de Sin3 (llamado mSin3 en el raton y hSin3 en los seres humanos). El mSin3 forma par-

Un complejo represor tiene tres componentes: una subunidad de union a DNA, un correpresor y una desacetilasa de histonas.

808


te de un complejo represivo que incluye proteinas de union a histonas y las desacetilasas de histonas HDAC l y HDAC2. Se requiere Ia actividad de desacetilasa para Ia represion. La naturaleza modular de este sistema Ia recalcan otros medios de empleo: un correpresor (SRMT), que permite a los receptores de hormonas retinoides reprimir ciertos genes diana, que actua por union a mSin3, que a su vez lleva las actividades de HDAC al sitio. Otro meclio de llevar actividades de HDAC al sitio puede ser una conexion con Me2, una proteina que se une a citosinas metiladas (vease Ia seccion 24.19, Los islote G son dianas reguladoras). La falta de acetilacion de histonas tambien es una caracterfstica de Ia heterocromatina, lo que es cierto en el caso de Ia heterocromatina constitutiva (que, por lo general, incluye regiones de centromeros o telomeros) y la heterocromatina faculta tiva (regiones que son desactivadas en una celula aunque esten activas en otra). Por lo general, Ia colas terminates N de las histonas H3 y H4 no estan acetiladas en las regiones heterocromaticas.

Ill

Las metilaciones de histonas y de DNA estan relacionadas

Conceptos principales • La metilaci6n de DNA y de histonas es una caracteristica de la cromatina inactiva. • Los dos tipos de episodios de metilaci6n pueden estar relacionados.

La metilacion de histonas y de DNA se vincula co::: Ia inactividad. Los sitios metilados en las histona_ comprenden dos lisinas en Ia cola de H3 y una a.:-ginina en Ia cola de H4. La metilacion de la 9 Lis de H3 es una caracteristica de las regiones condensadas de cromatina que incluyen Ia heterocromatina como se observa en ·mayor parte y tambien regiones mas pequefias, ql:-: se sabe no tienen expresion. La enzima transfera _~ de metilos de histonas que actua en esta lisina <:.e llama SUV39Hl. (Se ofrece el origen de este pen :.liar nombre en la seccion 30.13, Algunos segment . comunes se encuentran en proteinas que modific-la cromatina.) Su sitio catalftico tiene una regi6:llamada dominio SET. Otras transferasas de metil de histonas actuan sobre Ia arginina. Ademas, pue de ocurrir metilacion en Ia 79 Lis de Ia region centre. globular de H3, que podrfa necesitarse para Ia fo:-· macion de heterocromatina en los telomeros. Basta fecha reciente se crefa que la metilaci ' :de histonas era irreversible. No obstante, ya se ide- tificaron desmetilasas de histonas, incluida una d ~ -

metilasa especffica de lis ina (LSD l) que actua sabre K4 de Ia histona H3 y una enzima que desmetila Ia arginina en las histonas H3 y H4. Aun no se sabe como se regula la desmetilacion . Gran parte de los sitios de metilacion en el DNA son islotes G (vease Ia seccion 24.19, Los islotes G son dianas reguladoras). Las secuencias G en Ia heterocromatina por lo general estan metiladas. Por el contrario, para que un gen se exprese es indispensable que los islotes G localizados en regiones promotoras sean desmetilados (vease Ia seccion 24.18, La expresion genica se vincula con Ia desmetilacion). La metilacion de DNA y de histonas esta conectada en un circuito de reforzamiento mutua. La metilacion de H3 es Ia sefi.al que recluta Ia metilasa del DNA bacia Ia cromatina. El arden de los episodios es que Ia 9Lis de H3 se desacetila para crear un sustrato para Ia metilacion. La H3 se convierte entonces al estado de Me 9Lis o Me/ Lis, que ofrece un sitio de union para Ia metilasa de DNA. Algunas enzimas transferasas de metilos de histonas contienen sitios posibles de union para el par G metilado, de manera que Ia metilacion del DNA refuerza el circuito con el fin de brindar una diana para que Ia transferasa de metilos de histonas se una. El punto importante es que un tipo de modificacion puede desencadenar el otro. Estos sistemas estan muy generalizados, como se observa por las pruebas de estas conexiones en bongos, plantas y celulas animates, y de Ia regulacion de Ia transcripcion en los promotores usados por las polimerasas I y II de RNA, asf como el mantenimiento de Ia heterocromatina en un estado inerte.

E

Los estados de La cromatina se interconvierten por modificaci6n

El tipo comrario de episodios tiene Iugar cuando se compara la activacion de un promotor con la generacion de heterocromatina. Las acciones de las enzimas que modifican Ia cromatina aseguran que los sucesos de activacion sean mutuamente excluyentes con respecto a los de desactivacion. La metilacion de 9Lis de H3 y Ia acetilacion de 14Lis de H3 son mutuamente antagonistas. Las acetilasas y desacetilasas pueden desencadenar los episodios iniciadores. La desacetilacion permite que ocurra Ia metilacion, lo que da Iugar a Ia formacion de un complejo heterocromatico (vease Ia secci6n 31.3, La heterocromatina depende de interacciones con las histonas). La acetilacion marca una region como activa (vease Ia secci6n 30.11, La activacion del promotor comprende una serie ordenada de episodios).

Dill La activaci6n del promotor co mprende una serie ordenada de episodios Conceptos principales • El complejo de remodelado puede reclutar al complejo de acetilaci6n. • La acetilaci6n de histonas puede ser el suceso que mantenga al complejo en estado activado.

(.Como se reclutan las acetilasas (o desacetilasas) en sus dianas especfficas? Como se ha observado con los complejos de remodelado, es posible que el proceso sea indirecto. Un activado r (o represor)

Estado inactivo

Estado activo

Acetilasa de histonas

Conceptos principales • La acetilaci6n de histonas se relaciona con la activaci6n genica. • La metilaci6n de DNA y de histonas se relaciona con la heterocromatina.

En la se resumen los tres tipos de diferencias observadas entre las cromatinas activa e inactiva. • La cromatina activa se acetila en las colas de las histonas H3 y H4. • La cromatina inactiva se metila en la 9 Lys de la histona H3. • La cromatina inactiva se metila en las citosinas de los pares G.

Desacetilasa de histonas Desmetilasa de histonas Metilasa de histonas

La acetilaci6n de las histonas activa la emmatina, y la metilaci6 n de DNA y las histonas la desactiva.

30.11 La activaci6n del promotor comprende una serie ordenada de episodios

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espedfico de secuencia puede interactuar con un componente del complejo de !a acetilasa (o desacetilasa) para reclutar un promotor. Puede haber tambien interacciones directas entre complejos de remodelado y complejos de modificacion de histonas. La union por el complejo de remodelado SWI/SNF puede llevar a su vez a !a union por el complejo de acetilasa SAGA. Luego, !a acetilacion de histonas puede, de hecho, estabilizar el vinculo con el complejo SWIISNF, lo que hace un reforzamiento mutuo de los cambios de los componentes en el promotor. Se pueden conectar todos los sucesos que tienen Iugar en el promotor a Ia serie resurnida en Ia . El episodio de iniciacion es !a union de

El factor de transcripci6n se une a una secuencia especifica

]] El factor se Iibera

El remodelado cambia Ia organizaci6n del nucleosoma

]]] El complejo de acetilasa se une por medio del complejo de remodelado

un componente especffico de secuencia (que puede hallar su secuencia diana en el DNA en el contexto de la cromatina), lo que recluta un complejo de remodelado. Los cambios ocurren en !a estructura del nucleosoma. Un complejo de acetilacion se une y !a acetilacion de las histonas diana provee una marca covalente de que el sitio se ha activado. Tambien ocurre modificacion del DNA en el promotor. La metilacion de Ia citosina en pares G se vincula con Ia inactividad genica (vease la seccion 24.18, La expresion genica se relaciona con Ia desmetilacion). La base para el reconocimiento del DNA como diana de Ia metilacion no esta muy bien esclarecida (vease seccion 31.8, La metilacion del DNA se encarga de Ia impresion) . Es clara que el remodelado de Ia cromatina en el promotor requiere una diversidad de cambios que afectan el nucleosoma, incluida Ia acetilacion, pero. (.que cambios se requieren dentro del gen para que una polimerasa de RNA lo atraviese? Se sabe que la polimerasa de RNA puede transcribir el DNA in vitro a velocidades parecidas a Ia velocidad in vivo (-25 nucleotidos por segundo), solo con un molde de DNA libre. Se han descrito varias protefnas por su capacidad para mejorar Ia velocidad con que Ia polimerasa de RNA transcribe Ia cromatina in vivo. La caracteristica comun es que actuan sabre !a cromatina. Un modelo actual de su accion es que se asocian a la polimerasa de RNA y viajan con ella a lo largo del molde, lo que modifica la estructura del nucleosoma por su accion sobre las histonas. Entre estos factores estan las acetilasas de histonas. Una posibilidad, es que Ia primera polimerasa de RNA en transcribir un gen sea la pionera de los factores de acarreo de la polimerasa que cambien la estructura de Ia unidad de transcripcion, para hacer mas faciJ Ia actuacion de las polimerasas posteriores.

B1E

La fosforilaci6n de las histonas afecta la estructura de la cromatina

Concepto principal Se modifican las histonas

JJ] La activaci6n del promotor comprende la union de un activador especifico de secuencia, el reclutamiento y la acci6n de un complejo de remodelado, y el reclutamiento y la acci6n de un complejo de acetilaci6n. El orden de los episodios puede diferir, o tal vez se presenten de manera simultanea, de acuerdo con el gen.

810

CAPITULO 30 Control de Ia estructura de Ia cromatina

• AI menos dos histonas son dianas para Ia fosforilaci6n, tal vez con efectos contraries.

Las histonas se fosforilan en dos circunstancias: • de manera repetida en el ciclo celular, y • en relacion con el remodelado de Ia cromatina. Se ha sabido durante mucho tiempo que la hisrona H1 es fosforilada durante la mitosis yen fecha mas reciente se descubrio que constituye un sustra-

to muy bueno para la cinasa Cdc2, que controla la division celular. Ello llevo a la especulacion de que la fosforilacion tal vez se relacione con la con densacion de la cromatina, pero hasta ahora no se ha demostrado un efecto directo de este episodio de fosforilacion y no se sabe si tiene participacion en la division celular. La perdida de una cinasa que fosforila la histona H3 en la 10 Ser tiene efectos devastadores sobre la estructura de la cromatina. En la se compara la estructura extendida usual del conjunto de cromosomas politenicos de la Drosophila me/anagaster (fotografia superior) con la estructura que se observa en una mutante nuclear que no tiene cinasa JIL- I (fotografia inferior). La au sen cia de JIL-I es leta!, pero los cromosomas pueden visualizarse en las larvas antes de su muerte. La causa de la perdida de la estructura es con toda probabilidad la falta de fosforilacion de la his-

tona H3 (por supuesto, JIL-l puede tener tambien otras dianas). Esto permite suponer que se requiere la fosforilacion de H3 para generar la estructura cromosomica mas extendida de las regiones eucromaticas. La prueba que sustenta la idea de que JIL-l actua de manera directa sobre la cromatina es que se relaciona con el complejo de proteinas que se une al cromosoma X para aumentar su expresion genica en machos (vease la seccion 31.5, Los cromosomas X sufren cam bios globales). Esto deja algunas impresiones contradictorias respecto de la funcion de la fosforilacion de las histonas. Si tiene importancia en el ciclo celular, es posible que sea una sefial para la condensacion. Su efecto sobre el remodelado de la cromatina parece ser el contrario. Por supuesto, es posible que la fosforilacion de diferentes histonas o incluso de diferentes aminoacidos en una de ellas, tenga efectos contrarios sobre la estructura de la cromatina.

B!11J Se encuentran algunos segmentos comunes en las proteinas que modifican la cromatina Conceptos principales

• El dominio cromo se encuentra en varias prote\nas de la cromatiQa que tienen efectos de activaci6n o represi6n sabre la expresi6n de los genes. • El dominio SET es parte del sitio catal\tico de las transferasas de metilos de prote\nas. • El dominio bromo se encuentra en una diversidad de prote\nas que interactuan con la cromatina y sirve para reconocer sitios acetilados en las histonas.

Las moscas que no tienen JIL-1 cinasa presentan cromosomas politenicos anormales que se condensan en lugar de extenderse. Las fotografias son cortes\ a de Jorgen Johansen y Kristen M. Johansen, Iowa State University.

Los conocimientos que se tienen sobre los mecanismos moleculares del control de la estructura de la cromatina se inician con mutantes que influyen en el efecto de la variegacion de la posicion. Se han identificado casi 30 genes en el genero Drosophila y se denominan de manera sistematica Su(var) aquellos cuyos productos actuan suprimiendo la variacion y E (var) aquellos cuyos productos la aumentan. Recuerdese que los genes se nombran por la conducta de los loci mutantes. Las mutaciones de Su (var) yacen en genes cuyos productos son necesarios para la formacion de la heterocromatina e incluyen enzimas que actuan sobre la cromatina, como las desacetilasas de histonas, y las proteinas que se localizan en la heterocromatina. Las mutaciones E (var) yacen en genes cuyos productos son indispensables para activar la expresion genica e in-

30.!3 Se encuentran algunos segmentos comunes en las prote\nas que modifican la cromatina

811

cluyen del complejo SWI/SNF. Por estas propiedades se infiere de inmediato que Ia modificacion de Ia estructura de Ia cromatina es importante para controlar la formacion de heterocromatina. La universalidad de estos mecanismos Ia indica el hecho de que muchos de estos loci tienen homologos en levaduras que muestran propiedades ana.logas. Algunos de los homologos en Schizosaccharomyces pombe son clr (genes reguladores de loci cripticos) donde las mutaciones afectan el silenciamiento. Muchas de las proteinas Su(var) y E(var) tienen un segmento comun de 60 aminoacidos llamado cromodominio o dominio cromo. El hecho de que este dominio se encuentre en proteinas de ambos grupos permite suponer que representa un segmento que participa en las interacciones proteina-proteina en la cromatina. Los cromodominios se encargan en gran parte de dirigir las proteinas bacia Ia heterocromatina. Actuan por reconocimiento de lisinas metiladas en colas de histonas (vease Ia seccion 31.3, La heterocromatina depende de interacciones con las histonas y Ia seccion 31.4, Polycomb y Trithorax son represores y activadores antagonistas). La Su(var) 3-9 tiene un cromodorninio y tam bien un Su(var)3-9, un dominio potenciador de gusto Trithorax (SET), segmento que se encuentra en varias proteinas Su(var). Sus homologos en mamiferos se localizan en Ia heterocromatina del centromero. Es Ia transferasa de metilos de histonas la que

Cinasa

actua sobre 9 Lis de la histona H3 (vease la seccion 30.9, La metilacion de histonas y de DNA estan relacionadas). El dominio SET es parte del sitio activo y, de hecho, es marcador de Ia actividad de metilasa. El bromodominio o dominio bromo se encuentra en una diversidad de proteinas que interactuan con Ia cromatina, como las acetilasas de histonas. La estructura cristalina muestra que tiene un sitio de union para Ia lisina acetilada. El bromodominio mismo reconoce solo una secuencia muy corta de cuan·o aminoacidos que incluye la lisina acetilada, por lo que Ia especificidad para el reconocimiento del sitio diana debe depender de interacciones que abarquen ambas regiones. Ademas de las acetilasas, el bromodominio se encuentra en una variedad de proteinas que interactuan con Ia cromatina, como los componentes del aparato de transcripcion. Esto indica que se utiliza para reconocer histonas acetiladas, lo que significa que tal vez se encuentre en proteinas que participan en Ia activacion genica. Aunque hay una correlacion general donde Ia cromatina activa se acetila, en tanto Ia inactiva es metilada en las histonas, hay algunas excepciones a Ia regia. La mejor definida es que Ia acetilacion de 12 Lis de H4 se vincula con Ia heterocromatina. Puede haber modificaciones multiples en Ia misma cola de histona y una puede influir en otra. La fosforilacion de una serina en una posicion puede ser necesaria para Ia acetilacion de una lisina en otra. La muestra Ia situacion en la cola de H3, que puede existir en uno de dos estados. El estado inactivo tiene una 9 Lis metilada. El estado activo tiene una 9 Lis acetilada y una 10 Ser fosfatada. Estos estados se pueden mantener sobre regiones amplias de Ia cromatina. La fosforilacion de 10 Ser y Ia metilacion de 9 Lis son mutuamente inhibitorias, lo que sugiere el orden de episodios que se muestra en Ia figura. Esta situacion puede hacer que Ia cola se mueva entre los estados activo e inactivo.

BID Desacetilaci6n Desfosforilaci6n Metilaci6n

Las multiples modificaciones en la cola H3 afectan la actividad de la cromatina.

812


Resumen

Los genes cuyas regiones de control se organizan en los nucleosomas por lo general no se expresan. En ausencia de proteinas reguladoras especificas, los promotores de otras regiones reguladoras se organizan por octameros de histonas en un estado en el que no pueden activarse. Esto puede explicar Ia necesidad de los nucleosomas de ubicarse de man era precisa en Ia vecindad de un promotor, de manera que los sitios reguladores indispensables se expongan en forma apropiada. Algunos factores de transcripcion tienen Ia capacidad de reconocer

el DNA en la superficie del nucleosoma y puede requerirse un posicionamiento particular del DNA para la iniciaci6n de la transcripci6n. Las cromatinas activa e inactiva no estan en equilibria. Se requieren episodios subitos de escisi6n para convertir una en Ia otra. Los complejos de remodelado de Ia cromatina tienen Ia capacidad de desplazar octameros de histonas por un mecanis mo que comprende Ia hidr61isis de ATP. Los complejos de remodelado son grandes y se clasifican de acuerdo con el tipo de subunidad de fosfatasa del trifosfato de adenosina. Dos tipos frecuentes son SWI/SNF e ISWI. Una forma caracterfstica de este remodelado de la cromatina es desplazar uno o mas de los octameros de histonas de secuencias especfficas del DNA, creando un limite que da como resultado el posicionamiento preciso o preferente de los nucleosomas cercanos. El remodelado de Ia cromatina puede tambien comprender cambios en las posiciones de los nucleosomas, que a veces implican el deslizamiento de los octameros de histonas por el DNA. La acetilaci6n de histonas tiene Iugar tanto en Ia replicaci6n como en Ia transcripci6n y en ocasiones es necesaria para formar una estructura de cromatina menos compacta. Algunos coactivadores que conectan factores de transcripci6n con el aparato basal tienen actividad de acetilasas de histonas. Por el contrario, los represores pueden vincularse con desacetilasas. Las enzimas modificantes pueden ser especfficas de aminoacidos particulares en histonas especfficas. Los sitios mas frecuentes de modificaci6n se localizan en las colas terminales N de las histonas H3 y H4 que protruyen desde los nucleosomas entre los giros del DNA. Los complejos de activaci6n (o represi6n) suelen ser grandes y a menudo contienen varias actividades que emprenden diferentes modificaciones de la cromatina. Algunos segmentos comunes que se encuentran en las protefnas que modifican la cromatina son el cromodominio (que se encarga de las interacciones protefna-protefna), el bromodominio (que se dirige a la lisina acetilada) y el dominio SET (que es parte de los sitios activos de las transferasa de metilos de las histonas). La modificaci6n de las colas de histonas constituye un desencadenante de Ia reorganizaci6n de Ia cromatina. La acetilaci6n en general se vincula con la activaci6n genica. Las acetilasas de histonas se encuentran en complejos de activaci6n, y las desacetilasas de histonas en complejos de inactivaci6n. La metilaci6n de las histonas se vincula con Ia inactivaci6n genica. Algunas de las modificaciones de las histonas pueden ser exclusivas o sinergicas con otras.

Referencias

IZ!IJ

La cromatina puede tener estados alternativos

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Em

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1m

Las acetilasas se vinculan con activadores

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1111

Las desacetilasas se relacionan con represores

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Ill

Las metilaciones de histonas y de DNA estan relacionadas

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1!111

La fosforilaci6n de las histonas afecta la estructura de la cromatina

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Bill


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Referencias

817

Los efectos epigeneticos son heredados ESQUEMA DEL CAPITULO

liD Introducci6n • Los efectos epigeneticos pueden ser consecuencia de La modificaci6 n de un acido nucleico despues de que se ha si ntetizado ode La perpetuaci6 n de estructuras proteinicas.

La heterocromatina se propaga a partir de un episodio de nucleaci6n • La heterocromatina es nucleada en una secuencia especifica y la estructura inactiva se propaga por La fibra de cromatina. • Los genes dentro de las regiones de heterocromatina estan inactivos. • La longitud de La region inactiva varia de una celula a otra; como res ultado, La desa ctivacion de genes en esta vecindad causa un efecto de posicion abigarrado. • Ocurren efectos de dispersion simi lares en los telomeros y los cartuchos silentes en el tipo de apaream iento de las levaduras.

La heterocromatina depende de interacciones co n las histonas • La HP1 es la proteina clave en la formac ion de la heterocromatina de mamifero y actOa por union a la histona H3 metilada. • La Rap1 inicia la formacion de la heterocromatina en levaduras par union a secuencias diana especificas en el DNA. • Las dianas de Rap1 incluyen repeticiones telomericas y silenciadores en HML y HMR. • La Rap1 recluta Sir3/Sir4 que inte ractuan con las colas terminates N de H3 y H4. ~

Polycomb y Trithorax son represores y activadores antagonistas • Las proteinas del grupo Polycomb (Pe-G) perpetu an un estado de represio n par media de las di visio nes celulares. • El PRE es una secuencia del DNA indispensable para la accion de Pe-G. • La PRE constituye un centro de nucleacion a partir del cual las proteinas Pe-G propagan una estructura inactiva. • Nose ha encontrado una proteina Pe-G individual que pueda unirse a PRE. • El grupo de proteinas Trith orax an tagoniza la acci6n de Pe-G.

Los cromosomas X experimentan cambios globales • Uno de los dos cromosomas Xse desa ctiva al azar en cada celula durante la embriogenesis de los mamiferos euterios. • En casas exce pcio nales do nde hay mas de dos cromoso mas X, todos, excepto uno, esta n desactivados.

818

• El Xic (centro de desactivacion de X) es una region de actuaci6n en co nfigura cio n cis en el cromosoma X, necesaria y suficiente para asegurar que solo un oro mosc- ; X permanezca acti vo. • El Xic incluye al gen Xist que codifica un RNA que se encuentra solo en cromosomas X inactivos. • Se desconoce el mecanisme encargado de prevenir que c. RNA Xist se acumule en el cromosoma activo .

liD Las condensinas producen la condensaci6n de lo: cro mosomas • Las proteinas S~\C son fosfata sas del trifosfato de adenosina que incluyen condensinas y cohesinas. • Un heterodimero de las proteinas SMC se vincula corn otrc: subunidades. • Las condensinas hace n que La cromatina de enrolle en forma mas estrecha par la introduccion de superhetices positivas al DN A. • Las condensinas se encargan de condensar los cromosom' : durante La mitosis. • Las condensinas especificas de cromosomas se enca rg an :~ condensar cromosomas X inactivos en C. elegans.

liD Una metilasa de mantenimiento perpetua la metilaci6n del DNA • Casi todos los grupos metilo del DNA se encuentran en La: ci to sinas de ambas cadenas del par G . • La rep licaci6n convierte un sitio par completo metilado cuno hemimetilado. • Una metilasa de manten imiento convierte los sitios hemimetilados en metilados par completo.

IUD La metilaci6n del DNA se encarga de la impresi6• Los alelos materna y paterna pueden tener diferentes patro nes de metilacion en la fecundaci6 n. • La meti laci6n suele vincularse co n La desactivaci6n del gen. • Cuando los genes tienen impresi6n diferencial, la supervivencia de los embriones puede requerir que el ale ..: funcional sea provisto por el progenitor con el alelo no metilado. • La supervivencia de heterocigotos para genes impresos e; diferente, de acuerdo con la direccion del cruce. • Los genes impresos se presentan en grupos y pueden depender de un sitio de control local, donde ocurre me ·cion nueva, a menos que se evite de manera especifica.

Un solo centro puede controlar los genes con impresi6n opuesta • Los ge nes im presos so n co ntro lados par la metilaci6n de sitios de acci6n en co nfiguraci6n cis.

• La metilacion pueden encargarse de desactivar o activar un gen.

Los efectos epigeneticos pueden heredarse • Los efectos epigeni>ticos pueden derivarse de una modificacion de un acido nucleico despues de que se ha sintetizado, o por la perpetuacion de estructuras proteinicas.

Los priones de levaduras muestran herencia desusada • • • • •

Ill

La proteina Sup35 en su forma soluble de tipo silvestre es un factor determinacion de la traduccion. Tambien puede existir en una forma alternativa de agregados oligomericos, donde no es activa para la sintesis de proteinas. La presencia de una forma oligomerica hace que la proteina recien sintetizada adquiera la estructura inactiva. La conversion entre las dos formas recibe la influencia de los chaperones. La forma de tipo silvestre tiene el estado genetico recesivo psi· y la forma mutante tiene el estado genetico dominante PSI•.

Introducci6n

Concepto principal

.

• Los efectos epigenEticos pueden ser consecuencia de La modificaci6n de un acido nucleico despues de que se ha sintetizado o de La perpetuaci6n de estructuras prote\nicas.

La herencia epigenetica describe Ia posibilidad de que diferentes estados, que pueden tener diferentes consecuencias fenotfpicas, se hereden sin ningun cambio en Ia secuencia del DNA. Esto significa que dos individuos con Ia misma secuencia de DNA en ellocus que controla el efecto pueden mostrar diferentes fenotipos. La causa basica de este fen6meno es Ia existencia de una estructura autoperpetuante en uno de los individuos, que no depende de Ia secuencia de DNA. Varios tipos diferentes de estructuras tienen Ia capacidad de presentar efectos epigeneticos: • Una modificaci6n covalente del DNA (metilaci6n de una base). • Una estructura proteinacea que se ensambla con el DNA. • Un agregado protefnico que controla Ia conformaci6n de las nuevas subunidades segun se sintetizan. En cada caso, el estado epigenetico es resultado de una diferencia en Ia funci6n (por lo general inactivaci6n) determinada porIa estructura. En el caso de la metilaci6n del DNA, una secuencia metilada puede no transcribirse, en tanto una no metilada se expresara. La muestra como se hereda esta circunstancia. Un alelo tiene

Los priones causan enfermedades en los mam\feros • La proteina que causa encefalopatia espongiforme ovina tiene dos formas de presentacion: la PrP' no infecciosa de tipo silvestre, susceptible a las proteasas, y la PrP 5' que causa enfermedad y es resistente a las proteasas. • La enfermedad neurologica se puede transmitir a los ratones mediante la inyeccion de la proteina PrP 5' purificada. • El raton receptor debe tener una copia del gen PrP que codifica la proteina de raton. • La proteina PrP 5' puede autoperpetuarse y hacer que la proteina PrP, recien sintetizada, adopte la forma de PrP 5' en lugar de la forma PrP'. • Multiples cepas de PrP 5' pueden tener diferentes conformaciones proteinicas.

Resumen

una secuencia metilada en ambas cadenas del DNA, en tanto el otro tiene una secuencia no metilada. La replicaci6n del alelo metilado crea cadenas hijas hemimetiladas que recuperan el estado metilado gracias a Ia intervenci6n de una enzima metilasa,

Alelo metilado

Alelo no metilado

Replicaci6n

! ~~ GC

+

Me

!

Metilaci6n

La replicaci6n de un sitio metilado produce DNA hemimetilado, donde s6lo una cadena progenitora esta metilada. Una metilasa de perpetuaci6n reconoce los sitios hemimetilados y afiade un grupo metilo a La base en La cadena hija, lo que restablece La situaci6n original donde el sitio esta metilado en ambas cadenas. Un sitio no metilado se mantiene sin metilar despues de La replicaci6n.

31.1 Introducci6n

819

constitutivamente activa. La replicacion no afecta el estado del alelo no metilado. Si el estado de metilacion afecta la transcripcion, los dos alelos difieren en su estado de expresion genica aunque sus secuencias sean identicas. Las estructuras autoperpetuantes que se ensamblan en el DNA suelen tener un efecto represor al formar regiones heterocromaticas que impiden la expresion de genes en su interior. Su perpetuacion depende de la capacidad de las proteinas en una region heterocromatica de mantenerse unidas a esas regiones despues de la replicacion y luego de reclutar mas subunidades proteinicas para sostener al complejo. Si cada una de las subunidades se distribuye al azar en cada par de cadenas hijas durante la replicacion, las dos seguiran marcadas por la proteina, aunque su densidad disminuya a la mitad de la concentracion previa ala replicacion. La muestra que la existencia de efectos epigeneticos obliga a pensar que una proteina encargada de tal circunstancia debe tener algun tipo de capacidad de automoldeado o autoensamblado capaz de restablecer el complejo original. Puede ser el estado de modificacion de la proteina mas que su presencia en sf, el encargado de un efecto epigenetico. Por lo general, las colas de las histonas H3 y H4 no estan acetiladas en la heterocromatina constitutiva. Sin embargo, si la heterocromatina del centromero esta acetilada, los genes silenciados

Eucromatina

Heterocromatina

Replicacion

~

]) ])])] ] +]]]]) Autoensamblado de protefnas

I

t

]) La heterocromatina esta formada por proteinas que se vinculan con histonas. La perpetuacion por media de la division requiere que la proteina se relacione con cada par de cadenas hijas y luego reclute nuevas subunidades para volver a ensamblar los complejos represivos. 820

CAPITULO 31 Los efectos epigeneticos son heredados

tal vez se tornen activos. El efecto tal vez se perpetue durante la mitosis y meiosis, lo que permite suponer que se ha creado un efecto epigenetico al cambiar del estado de acetilacion de las histonas. Los agregados de proteinas independientes que causan efectos epigeneticos (llamados priones), actuan por secuestro de la proteina en una forma en la que no puede mostrar su funcion normal. Una vez que se forma el agregado de proteinas, obliga a las nuevas subunidades de proteina a unirse en confonnaci6n inactiva.

1111

La heterocromatina se propaga a partir de un episodio de nudeacion

Conceptos principale> • La heterocromatina es nucleada en una secuencia espedfica y la estructura inactiva se propaga por la fibra de cromatina. • Los genes dentro de las regiones de heterocromatina se encuentran inactivos • La longitud de la region inactiva varia de una celula a otra; como resultado, la desactivacion de genes en esta vecindad causa un efecto de posicion abigarrado. • Ocurren efectos de dispersion similares en los telomeros y los cartuchos silentes en el tipo de apareamiento de las levaduras.

Un nucleo de interfase contiene eucromatina y heterocromatina. El estado de condensaci6n para la heterocromatina es similar al de los cromosomas en la mitosis. La heterocromatina es inerte. Permanece condensada en la interfase, tiene represi6n transcripcional, se replica de manera tardia en la fase S y puede localizarse en la periferia del nucleo. La heterocromatina centromerica consta, por lo general, de DNA satelite; sin embargo, la formacion de heterocromatina no se define en forma rigurosa por la secuencia. Cuando se transfiere un gen, ya sea por translocacion cromos6mica o por transfeccion e integraci6n, bacia una posicion cercana a la heterocromatina, puede tornarse inactivo como resultado de su nueva localizaci6n, lo que indica que se ha convertido en heterocromatico. Tal desactivaci6n es resultado de un efecto epigenetico (vease la seccion 31.1 0, Los efectos epigeneticos pueden ser heredados). Puede diferir entre celulas individuales en un animal y da como resultado el fen6meno del efecto de posicion abigarrado (PEV), donde celulas identicas en terminos geneticos tienen diferentes fenotipos, lo que se ha descrito bien en el genero Drosophila. La 1 muestra un ejemplo del efecto de posicion abigarra-

do en el ojo de Ia mosca. Algunas regiones del ojo carecen de color, en tanto otras son rojas debido a que el gen blanco en alguna region fue desactivado por la heterocromatina cerana en unas celulas, pero se mantuvo activo en otras. La explicacion de este efecto se muestra en Ia . La desactivacion se expande desde Ia heterocromatina hacia Ia region adyacente una distancia variable. En algunas celulas llega bastante lejos para desactivar un gen cercano, pero en otras no lo hace. Esto ocurre en un cierto momento del desarrollo embrionario, despues del cual todas las celulas de la progenie heredan ese estado del gen. Las celulas que provienen de un ancestro donde el gen estaba inactivo forman parches que corresponden al fenotipo con perdida de funcion (en el caso de blanco, ausencia de color). Cuanto mas cerca este un gen de la heterocromatina, mayor probabilidad habra que sea inactivo. Esto permite suponer que la formacion de Ia heterocromatina puede ser un proceso de dos etapas: ocurre un episodio de nucleaci6n en una secuencia especffica y despues Ia estructura inactiva se propaga por la fibra de cromatina. La distancia hasta la que se extiende Ia estructura inactiva no esta determinada de manera precisa y pudiese ser aleatoria, con Ia influencia de parametros como las cantidades de componentes de protefnas lirnitantes. Un factor que puede afectar el proceso de dispersion es Ia activacion de los promotores en ia region; un promotor activo puede inhibir Ia dispersion. Los genes que estan mas cerca de la heterocromatina tienen mayor probabilidad de ser desactivados y, por tanto, seran inactivos en un mayor porcentaje de celulas. En este modelo, es posible que los limites de una region heterocromatica terminen por el agotamiento del aporte de una de las protefnas que se requiere. El efecto de silenciamiento telomerico en levaduras es analogo del efecto de posicion abigarrado en el genero Drosophila; los genes translocados a una ubicacion telomerica muestran la misma clase de perdida variable de actividad. Esto se debe a un efecto de dispersion que se propaga desde los telomeros. Una segunda forma de silenciamiento tiene Iugar en las levaduras. El tipo de apareamiento de las levaduras lo determina la actividad de un solo locus activo (MAT), pero el genoma contiene otras dos copias de las secuencias de tipo de apareamiento (HML y HMR), que permanecen inactivas. Los loci HML y HMR comparten muchas propiedades con Ia heterocromatina y podrfan considerarse regiones constituyentes de la heterocromatina en miniatura (vease la seccion 19.22, Los cartuchos silentes en HML y HMR estan reprimidos).

Perdida de color en parches

Ocurre el efecto de posicion abigarrado en el color del ojo cuando el gen blanco se integra cerca de La heterocromatina. Las celulas donde ese gen es inactivo producen parches blancos en el ojo, en tanto las celulas donde es activo producen parches rojos. La gravedad del efecto depende de La cercan\a del gen integrado a la heterocromatina. Fotografta por cortesia de Steven Henikoff, Fred Hutchinson Cancer Research Center.

\

La extension de La heterocromatina desactiva los genes. La probabilidad de que un gen se desactive depende de la distancia que lo separa de la region de heterocromatina.

31.2 La heterocromatina se propaga a partir de un episodio de nucleaci6n

821

1111

guladores o proteinas que inhiben en forma directa la transcripci6n. Dos sistemas que se han descrito en terminos moleculares son HPl en los mamfferos y el complejo SIR en las levaduras. Aunque no hay similitudes detalladas entre las protefnas comprendidas en cada sistema, el mecanismo general de reacci6n es similar: los puntas de o en Ia cromatina son colas terminales N de histonas. La HP l (protefna 1 de Ia he terocromatina) es una de las proteinas Su(var) mas importantes, identificada en un principia como una proteina que se localiza en la heterocromatina mediante Ia tinci6n de cromosomas politenicos con un anticuerpo dirigido contra Ia protefna. Despues se demostr6 que puede ser producto del gen Su (var)2 -5. Su hom6loga en la levadura Schizosaccharomyces pombe es codificada por swi6. La protefna original identificada como HP l hoy se denomina HP l ex debido a que des de entonces se han encontrado dos protefnas relacio n adas, HP l ~ y HP l y. La HP l contiene un cromodominio cerca del extrema N y otro relacionado con el, llamado dominio de som bra cr6mica, en el extrema C (vease la Figura 31.6); la importancia del cromodominio queda de manifiesto por el hecbo de que es Ia localizaci6n de muchas de las mutaciones de HPl. La mutaci6n de una desacetilasa que actua sabre Ac- 14 Lis de H3 impide la metilaci6n en 9 Lis. La H3 que esta m etilada en 9 Lis se une a la protefna HPl gracias a un cromodominio. Esto sugiere elmodelo para iniciar la formaci6n de la heterocromatina que se muestra en la 1 . Primero, la desacetilasa act{la para retirar Ia modificaci6n en 14Lis y luego Ia metilasa SUV39Hl actua sobre la cola de la histona H3 para crear la senal metilada a Ia que se unira HPl. La amplfa la reacci6n para mostrar que la interacci6n tiene Iugar entre el cromodominio y Ia lisina metilada, que constituye un desencadenante para Ia formaci6n de cromatina

La heterocromatina depende de interacciones con las histonas

Conceptos pri nci pales • La HP1 es la proteina clave en la formacion de la heterocromatina de mamifero y actua par union a la histona H3 metilada. • La Rapl inicia la formacion de la heterocromatina en levaduras par union a secl!encias diana especlficas en el DNA. • Las dianas de Rapl incluyen repeticiones telomericas y silenciadores en HML y HMR. • La Rapl recluta a Sir3/Sir4, que interactuan con las colas termina tes N de H3 y H4.

La desactivaci6n de Ia cromatina tiene Iugar cuan do se agregan proteinas a la fib ra nucleos6mica. La desactivaci6n puede deberse a una diversidad de efectos que incluyen la condensaci6n de Ia cromatina para hacerla inaccesible al aparato necesario para Ia expresi6n genica, Ia adici6n de proteinas que bloquean de manera clirecta el a los sitios re-

Cromatina activa

Cromatina inactiva

La SUV39H 1 es una metiltransferasa de histonas que actua sabre la 9 Lis de la histona H3. La HPl se une a la histona metilada.

. ... HP1

Extremo N

Cromodominio

Bisagra

Dominio sombra

e Ala

flCiUR~

822

...................H3

31

La metilaci on de la histona H3 ere a un sitio de union para HPl.

CAPiTULO 31 Los efectos epigeneticos son heredados

inactiva. La muestra que Ia region inactiva puede entonces extenderse por la capacidad de otras moh~culas de HPl de interactuar entre sf. Se puede suponer la existencia de una base comun para el silenciamiento en las levaduras porque depende de un conjunto comun de loci geneticos. Las mutaciones de cualquiera de un numero de genes causan activacion de HML y HMR y tambien alivian la desactivacion de genes que se han integrado cerca de la heterocromatina telomerica. Por lo tanto, los productos de estos loci actl"tan para mantener un estado inactivo de ambos tipos de heterocromatina. En la se prop one un modelo para las acciones de estas protefnas. Solo una de ellas es una protefna de union a DNA especifica de secuencia. Se trata de RAP I, que se une a las repeticiones C 1_3A en los telomeros, y tambien a los elementos del silenciador de accion en con:figuracion cis que se requieren para la represion de HML/HMR. Las protefnas Sir3 y Sir4 interactuan con Rapl y tambien entre sf (pueden actuar como un heteromultimero). Las Sir3/Sir4 interactuan con las colas terminales N de las histonas H3 y H4. (De hecho, la primera prueba de la posibilidad de que las h.istonas tengan una funcion directa en Ia formacion de la heterocromatina provino del descubrimiento de que las mutaciones sup rim en el silenciarniento en el mapeo de los genes HML/HMR que codifican H3 y H4) . La Rap l tiene la participacion crucial de identificar las secuencias del DNA donde se forma la hetero cromatina. Recluta Sir3/Sir4 e interactua de manera directa con las histonas H3 /H4. Una vez que Sir3 / Sir4 se han unido a las histonas H3 /H4, el complejo puede polimerizarse aun mas y dispersarse a lo largo de la :fibra de cromatina. Esto puede desactivar la region, ya sea porque la cobertura rnisma con Sir3 / Sir4 tiene un efecto inhibitorio, o porque la union a las histonas H3/H4 induce algun otro cambia en la estructura. No se sabe que limita la dispersion del complejo. El extrema C de Sir3 tiene sirnilitud con las protefnas de Ia lamina nuclear (constituyentes de la matriz nuclear) y tal vez se encargue de apuntalar la heterocromatina en la periferia nuclear. Una serie similar de sucesos forma las regiones silenciadas en HML y HMR (vease tam bien Ia seccion 19.22, Los cartuchos silentes en HML y HMR estan reprimidos). Tres factores especificos de secuencia participan en el desencadenamiento de Ia formacion del complejo: Rap l , Abfl (un factor de transcripcion) ORC (el complejo de replicacion en el origen). En este caso, Sirl se une a un factor especifico de secuencia y reel uta a Sir2, -3 y -4, para formar Ia estructura represiva. La Sir2 es una desacetilasa de histonas. La reaccion de desacetilacion es indispensable para mantener Ia union del complejo Sir a Ia cromatina.

La HP1 se une a Ia H3 metilada

La HP1 se autoagregal

1 La union de HP1 a la histona H3 metilada forma un desencadenante del silenciamiento porqu e se agrega n mas moleculas de HPl a la cadena del nucleosoma.

Colas terminales N de H3/H4

l

Rap I se une al DNA

l

Sir3/Sir4 se une a H3/H4

l

Sir3/Sir4 se polimeriza

l

Sir3/Sir4 se une a Ia matriz

La fo rmaci6n de la heterocromatina se inicia cuando Rapl se une al DNA. Sir3/ 4 se une a Rapl y tambien a las histonas H3/H4. El complejo se polimeri za a lo largo de la cromatina y puede conect ar tel6meros a la matriz nuclear.

31.3 La heterocromatina depende de interacciones co n las histonas

823

La formacion de la heterocromatina en la levadura S. pombe depende de un complejo que contiene varias moh~culas de RNAi (vease la seccion 13.10, El RNA de interferencia tiene relacion con el silenciamiento de los genes). Estas moleculas de RNAi se producen por la transcripcion de repeticiones cen tromericas para dar RNA que son fragmentados en unidades mas pequeiias. El complejo tambien contiene protefnas que son homologas de las que intervienen en la formacion de Ia heterocromatina en otros organismos, como Argonaute, que contrib uye a dirigir los complejos de remodelado del complejo de silenciamiento inducido de RNA (RISC) hacia la cromatina. Los componentes RNAi se encargan de localizar el complejo en el centromero . A continuacion, el complejo facilita la climerilacion de Ia histona H3 por una metiltransferasa de histonas. (.Como reprime un complejo de silenciamiento Ia actividad de la cromatina? Es posible que condense la cromatina de manera que las protefnas reguladoras no puedan encontrar sus dianas . Lo mas sencillo serfa suponer que Ia presencia de u n complejo silenciador es mutuamente incompatible con la presencia de factores de transcripcion y polimerasa de RNA. La causa podria ser que los complejos de silenciarniento impidan el remodelado (y asi, impidan de manera indirecta que los factores se unan) o que oculten de forma directa los sitios de union a los factores de transcripcion en el DNA. Sin embargo, la situacion tal vez no sea tan simple puesto que se pueden encontrar factores de transcripcion y polimerasa de RNA en promotores en Ia cromatina silenciada. Es posible que esto signifique que el complejo silenciador impide que los factores actuen, no que se unan. De hecho, puede haber competencia entre activadores genicos y los efectos represores de Ia cromatina, de modo que Ia activacion de un promotor inhibe Ia dispersion de u n complejo silenciador. Otra estructura especializada de Ia cromatina se forma en el centromero. Su naturaleza se dedu ce por las propiedades de una m utacion en Saccharomyces cerevisiae, cse4, que altera la estructura del centromero. La Cse4 es una protefna relacionada con Ia histona H3. Una protefna centromerica de marnffero, Ia protefna A del centromero (CENP-A) , tiene una secuencia relacionada. Las interacciones geneticas entre cse4 y CDE-II y entre cse4 de una mutacion en el gen de Ia histona H4 perrniten suponer que se puede formar un octamero de histonas alrededor de un meollo de Cse4-H4 y despues, los complejos centromericos (factores de union medular) CBFl y CBF3 pueden unirse para formar el centromero . Entonces, el centromero puede vincularse con la formacion de heterocromatina en la region. En las celulas humanas se requiere Ia protefna especifi ca 824

CAPiTULO 31 Los efectos epigeneticos son heredados

del centromero, CENP-B, para iniciar m odificacion es de Ia histona H3 (desacetilacion de 9 Lis y 14 Lis, seguida de la metilacion de 9 Lis) que desen cadenan un vinculo con Ia protefna Swi6 que conduce a la forma cion de heterocromatina en Ia region .

lilt

Polycomb y Trithorax son represores y activadores antagonistas

Conceptos principales • Las prote1nas del grupo Polycomb (Pe-G) perpetuan un estado de represi6n gracias a las divisiones celulares. • El PRE es una secuencia del DNA que se requiere para la acci6n de Pe-G. • El PRE constituye un centro de nucleaci6n a partir del eual las prote1nas Pe-G propagan una estructura inactiva. • No se ha encontrado una prote1na Pe-G individual que pueda unirse a PRE. • Las prote1nas del grupo Trithorax antagonizan las acciones de Pe-G.

La heterocromatina ofrece un ejemplo de la represion especffica de la cromatina . Otro lo brinda la genetica de los genes homeoticos en el genero Drosophila, que conduj o a la identifi cacion de un com plejo protefnico que parece m antener ciertos genes en un estado reprimido. Las mutantes Pc muestran transformaciones de tipo celular que son equivalentes a las mutaciones de ganancia de funcion en los genes Antennapedia (Antp) o Ultrabithorax, debido a qu e estos genes se expresan en tejidos donde por lo gen eral esten reprimidos. Esto implica a Pc en Ia regu lacion de Ia transcripcion. Es m as, Pc es el prototipo de una clase de -1 5 loci llama do grupo Pc (Pe-G); las m utaciones en estos genes por lo general tienen el rnismo resultado de eliminar Ia represion de los genes h omeoticos, lo que sugiere la posibilidad de qu e el grupo de protefnas tenga alguna funcion reguladora comun. Las protefnas Pc actuan en grandes complejos. El PRCl (complejo represor Polycomb) contiene Ia Pc misma, varias otras protefnas Pe-G y cinco factores generales de transcripcion. El complejo Esc- E(z) contien e Esc, E(z), otras protefnas Pe-G, una protefna de union a histonas y una desacetilasa de h istonas. La Pc misma tiene un cromodominio que se une a Ia H3 metilada, y E(z) es una metiltransfe rasa que actua sobre H3. Estas propiedades sustentan de man era directa Ia conex:ion entre el remodelado de Ia cromatina y Ia represion, insinuada en u n principia por las propiedades de brahma, una contraparte de SWI2 en la m osca. El gen brahma coclifica un componente del complejo de rem odelado SWI/SNF,

y Ia perdida de Ia funcion de brahma suprime las mutaciones en Polyeomb. En concordancia con Ia pleiotropfa de las mutaciones de Pe, la Pc es una protefna nuclear que puede visualizarse en -80 sitios de cromosomas politenicos, que incluyen el gen Antp. Otro miembro del Pe-G, polihome6tieo se visualiza como un conjunto de bandas cromosomicas politenicas identicas a las que se une Pc. Las dos protefnas se coinmunoprecipitan de manera simultanea en un complejo de -2.5 x 106 D que contiene de 10 a 15 polipeptidos. Aun no se establece la relacion entre estas proteinas y los productos de los -30 genes Pe-G. Una posibilidad es que algunos de estos productos genicos formen un complejo represor general y despues algunas de las otras protefnas se vinculen para determinar su especificidad. Las protefnas Pe-G no son represores convencionales. No se encargan de determinar el patron inicial de expresion de los genes donde actuan. En ausencia de las proteinas Pe-G estos genes en un inicio estan reprimidos, como es lo habitual, pero mas tarde en el desarrollo se pierde la represion sin que el grupo Pe-G funcione. Esto permite suponer que las protefnas Pe-G de algun.a forma reeonoeen el estado de represi6n euan.do se estableee y despues aetuan para perpetuarlo durante la division de las celulas hzjas. La muestra un modelo donde las proteinas Pe-G se unen en conjuncion con un represor, pero las proteinas Pe-G se mantienen unidas despues de que ya no esta disponible el represor, algo que es necesario para mantener la represion, de manera que si las protefnas Pe-G estan ausentes, el gen se activa Una region de DNA que es suficiente para permitir Ia respuesta a los genes Pe-G se llama PRE (elemento de respuesta Polyeomb). Se puede definir en terminos de su funcionamiento por su propiedad de mantener Ia represion en su vecindad durante el desarrollo. El analisis de un PRE consiste en insertarlo cerca de un gen reportero controlado por un potenciador que esta reprimido en las prim eras etapas del desarrollo y despues determinar si el reportero se expresa subsecuentemente en la descendencia. Un PRE eficaz evitara tal reexpresion. El PRE es una estructura compleja que mide -10 kb. Se han identificado dos proteinas, Pho y Pho I , con actividad de union al DNA en sitios dentro del PRE, pero puede haber otras. No obstante, cuando un locus es reprimido por Pe-G, las proteinas Pe-G ocupan una longitud mucho mayor del DNA que el PRE mismo. La Pc se encuentra localmente sobre unas cuantas kilobases del DNA que rodea a una PRE. Esto hace pensar que el PRE puede ofrecer un centro de nucleacion a partir del cual se propague un estado estructural dependiente de las protefnas

]

"

Mutante Pe-G

Las proteinas Pe-G se unen

] El represor se pierde pero Ia represi6n continua

1

El represor se pierde y el gen se activa

1

Las prote\nas Pe-G no inician la represi6n, pero se encargan de mantenerla.

Pe-G. Este modelo se sustenta en la observacion de efectos relacionados con el efecto de posicion abigarrado (vease Ia Figura 31 .4), esto es, un gen cerca de un locu s cuya represion es mantenida por Pe-G puede desactivarse de manera hereditaria en algunas celulas, pero no en otras. En una circunstancia caracterfstica, los experimentos de enlace cruzado in vivo mostraron que Ia protefna Pe-G se encuentra sobre grandes regiones de l complejo bithorax que estan inactivas, pero se excluye Ia protefna de las regiones que contienen genes activos. La idea de que eso podrfa deberse a interacciones colaboradoras con un complejo multimerico es respaldada por la existencia de mutaciones en Pe que cambian su distribucion nuclear y suprimen la posibilidad de que otros de Pe-G se localicen en el nucleo. La funcion de las proteinas Pe-G en el mantenimiento de la represion, en contraposicion con su establecimiento, debe significar que la formacion del complejo en PRE tambien depende del estado local de Ia expresion genica. Las propiedades de las protefnas individuates hacen pensar en un modelo de actuacion para Ia union de Pe-G a un PRE. En primer termino, Pho y Pho 1 se unen a secuencias especfficas dentro del PRE. Se recluta Esc-E(z) a Pho /Pho1; despues, se utiliza su actividad de metiltransferasa para metilar la 27 Lis de la histona H3. Esto crea un sitio de union para PRC porque el cromodominio de Pc se une a la lisina metilada. El complejo Polycomb induce una estructura mas compacta en la cromatina; cada complejo PRC 1 ocasiona que unos tres nucleosomas se hagan menos accesibles.

31.4 Polycomb y Trithorax son represo res y activadores antagonistas

825

De hecho, el cromodominio se identifico primero como region de homologfa entre Pc y la protefna HPl encontrada en Ia heterocromatina . La union del cromodominio de Pc a 27 Lis en H3 es ana loga al uso de HPl de su cromodominio para unirse a 9 Lis. El abigarramiento se debe a Ia dispersion de Ia inactividad desde Ia heterocromatina constitutiva y, en consecuencia, es posible que el cromodominio sea usa do por Pc y HP 1 en una forma similar para inducir la formacion de estructuras heterocromaticas o inactivas (vease Ia seccion 30.13, Algunos segmentos comunes se encuentran en protemas que modifican Ia cromatina) . Este modelo indica que se usan mecanismos similares para reprimir loci individuates o crear heterocromatina. El grupo trithorax de protefnas (trxG) tiene el efecto contrario al de las proteinas Pe-G: actua para mantener los genes en estado activo. Puede haber algunas semejanzas en las acciones de los dos grupos de protefnas: las mutaciones en algunos loci impiden el funcionamiento de Pe-G y trx, lo que permite suponer que tal vez dependan de componentes comunes. El factor GAGA que es codificado por el gen similar a trithorax tiene sitios de union en PRE. De hecho, los sitios donde se unen las Pe-G al DNA coinciden con los sitios donde se une el factor GAGA. (.Que significa esto? Tal vez se requiera GAGA para que los factores de activacion, incluidos los de trxG, se unan al DNA. (.Se necesita tambien para que las protefnas Pe-G se unan y ejerzan represion? Todavfa nose ha aclarado esto, pero tal modelo exigirfa que, ademas de GAGA, algo mas determinara cual de los tipos alternativos de complejo se ensambla despues al sitio.

liB

Los cromosomas X experimentan cambios globales

Conceptos princi pales • Uno de los dos cromosomas X se desactiva al azar en cada celula durante La embriogenesis en mamiferos euterios. • En casos excepcionales donde hay mas de dos cromosomas X, todos, excepto uno, estan desactivados. • El Xic (centro de desactivacion de X) es una region de actuacion en configuracion cis en el cromosoma X, necesaria y suficiente para asegurar que solo un cromosoma X permanezca activo. • El Xic incluye al gen Xist que codifica un RNA que se encuentra solo en cromosomas Xinactives. • Se desconoce el mecanisme encargado de prevenir que el RNA Xist se acumule en el cromosoma activo.

826


Mamfferos Desactiva un X femenino

Moscas Doble expresi6nde X masculine

Gusanos La mitad de Ia expresi6n de dos X femeninos

X X

Se usan medias diferentes de compensacion de dosis para hacer equivalente La expresion del cromosoma X en machos y hem bras.

El sexo p lantea un problema interesante para Ia regulacion genica debido a la variacion en el numero de cromosomas X. Si se expresaran los genes ligados a X de manera equitativa en cada sexo, las hembras tendrfan el doble de cada producto que los machos. La importancia de evitar esta situacion la demuestra Ia presencia de una compensaci6n de dosis, que equilibra el grado de expresion de los genes ligados a X en los dos sexos. Los mecanismos u sados en diferentes especies se resumen en la . • En los mamfferos, uno de los dos cromosomas X femeninos se desactiva por completo. El resultado es que las mujeres tienen solo un cromosoma X activo, circunstancia que es igual a la observada en los machos. El cromosoma X activo de las hem bras y el cromosoma X unico de los machos se expresan en el rnismo grado . • En el genero Drosophila, la expresion del cromosoma X masculino unico se duplica con relacion a la expresion de cada cromosoma X femenino. • En el Caenorhabditis elegans, Ia expresion de cada cromosoma X femenino es de la mitad con relacion a Ia expresion del cromosoma X m asculino u nico . La caracterfstica comun de todos estos mecanismos de compensacion de dosis es que el cromosoma entero es diana de la regulaci6n . Ocurre un cambio global que afecta de manera cuantitativa a todos los promotores en el cromosoma. Se sa be mucho acerca de la desactivacion del cromosoma X en hembras de mamfferos, donde todo el cromosoma se torna heterocromatico. · Las propiedades dobles de la heterocromatina son su estado condensado y la inactividad vinculacia. Se pueden dividir en dos tipos. • La heterocromatina constitutiva contiene secuencias especfficas sin funcion de codificacion, que en general incluyen DNA satelite y a menudo se encuentran en los

centr6meros. Estas regiones son invariablemente heterocromaticas por su naturaleza intrfnseca. • La heterocromatina facultativa adopta la forma de cromosomas fntegros que son inactivos en un linaje celular aunque se pueden expresar en otros. El ejemplo par excelencia es el del cromosoma X de mamiferos. El cromosoma X inactivo se perpetua en un estado heterocromatico, en tanto el cromosoma X activo es parte de la eucromatina . Por tanto, participan secuencias de DNA identicas en ambos estados. Una vez que se ha establecido el estado de inactividad, lo heredan las celulas descendientes. Este es un ejemplo de herencia epigenetica, porque no depende de la secuencia del DNA. La manera basica de ver los cromosomas X de la hembra del mamffero proviene de la hipotesis del X unico planteada en 1961. Los ratones hembra heterocigotos para las mutaciones en el color de la piel ligadas al cromosoma X tienen un fenotipo abigarrado, donde algunas areas son de tipo silvestre pero otras son producto de mutaci6n. La muestra que esto puede explicarse si se desactiva uno de los dos cromosomas X a! azar en cada celula de una pequeiia poblaci6n de precursores. Las celulas donde se desactiva el cromosoma X portador del gen de tipo Silvestre dan origen a una progenie que expresa SOlo el alelo mutante en el cromosoma activo. Las celulas derivadas de un precursor donde se desactivo el otro cromosoma tienen un gen silvestre de tipo activo. En el caso del color de la piel, las celulas derivadas de un precursor particular se mantienen juntas en un parche del mismo color, que crea el patron de abigarramiento visible . En otros casos, cada una de las celulas en una poblacion expresara uno u otro de los alelos ligados al cromosoma X; por ejemplo, en heterocigotos para ellocus G6PD ligado a X, cualquier eritrocito particular expresa solo una de las dos formas alelicas. (Ocurre desactivacion aleatoria de un cromosoma X en mamiferos euterios. En los marsu piales, Ia seleccion es dirigida: siempre el cromosoma X heredado del padre es el que se desactiva.) La desactivacion del cromosoma X en hembras se rige por la regia n-1: no obstante, hay muchos cromosomas X y todos, excepto uno, se desactivan. En hembras normales hay, por supuesto, dos cromosomas X, pero en casos excepcionales donde la no disyuncion genero un genotipo 3X o mayor, solo un cromosoma se mantiene activo, lo que hace pensar en un modelo general donde un episodio especifico esta limitado a un cromosoma X y lo protege de un mecanismo de desactivacion que se aplica a todos los demas.

Ambos cromosomas X son activos en Ia celula precursora Color de cubierta de tipo Silvestre

!!

Color de cubierta de tipo mutado

I

Un cromosoma X \ desactivado en cada celula alelo

activo~

Color dela

Se produce abigarramiento ligado a X por la desacti vaci6 n aleatoria de un cromoso ma X en cada celula precursora. Las celulas don de el alelo + se encuentra en el cromosoma acti vo tienen un fenotipo silvestre; las celulas donde el alelo - esta en el cromosoma activo presentan el fenotipo mutante.

Un solo locus en el cromosoma X es suficiente para su desactivacion. Cuando ocurre una translocacion entre el cromosoma X y un autosoma, ese locus esta presente en solo uno de los productos reciprocos y es el unico que puede desactivarse. Cuando se comparan diferentes translocaciones es posible ubicar este locus denominado Xic (centro de desactivacion de X). Una region clonada de 450 kb contiene todas las propiedades del Xic. Cuando esta secuencia se inserta como transgen en un autosoma, este seve sujeto a desactivacion (en un sistema de cultivo celular). El Xic es un locus que actua en configuracion cis y contiene Ia informacion necesaria para contar los cromosomas X y desactivar todas sus copias excepto una. La desactivacion procede desde Xic por todo ei cromosoma X. Cuando Xic esta presente en una translocacion cromosoma X-autosoma, la desactivacion se extiende a las regiones autosomicas (aunque el efecto no siempre es completo) . El locus Xic contiene un gen llama do Xist que se expresa solo en el cromosoma X inactivo . La conducta de ese genes en efecto Ia opuesta a Ia de todos los demas loci en el cromosoma, que estan apagados. La delecion de Xist impide que se desactive un cromosoma X. Sin embargo, no interfiere con el mecanismo de recuento (porqu e otros cromosomas X

31.5 Los cromosomas X experi mentan cambios globales

82 -

Ambos cromosomas X expresan Xist: el RNA es inestable (

(

!}

El RNA se estabiliza y cubre a un cromosoma

(i

-(.__~_

El X activo cesa Ia sintesis de Xist de RNA (

X activo

X inactivo

()

0

La desactivaci6n de X comprende la estabilizaci6n del RNA de Xist, que cubre al cromosoma inactive.

pueden desactivarse). De es te modo, se pueden distinguir dos caracterfsticas de Xic: uno o varios elementos no identificados necesarios para el recuento y un gen Xist requerido para Ia desactivaci6n. En Ia se ilustra Ia funci6n del RNA y el gen Xist en la desactivaci6n del cromosoma X. El gen Xist codifica un RNA que carece de un marco de lectura abierto . El RNA Xist "cubre" al cromosoma X a partir del cual fue sintetizado, lo que permite suponer que tiene una actividad estructural. Antes de la desactivacion de X, es sintetizado por ambos cromosomas X femeninos . Despues de la desactivacion, el RNA se encuentra solo en el cromosoma X inactivo. La tasa de transcripcion se mantiene igual antes y despues de Ia desactivacion, por lo que Ia transicion depende de los episodios que tienen Iugar despues de Ia transcripci6n. Antes de la desactivacion de X, el RNA Xist de cae con una vida media de casi 2 h. La desactivacion de X es mediada por Ia estabilizacion del RNA Xist sobre el cromosoma X inactivo. El RNA Xist muestra una distribucion puntiforme a lo largo del cromosoma X, lo que permite suponer que el medio de estabilizacion puede ser el vfnculo con protefnas que forman estructuras particulares. No se sabe aun si otros factores pueden participar en esta reaccion y como el RNA Xist se limita a la dispersion en configuracion cis por el cromosoma. Las caracterfsticas especiales del cromosoma X inactivo, que incluyen una falta de acetilaci6n de una histona H4 y metilaci6n de las secuencias G (vease la secci6n 24.19, Los islotes G son dianas reguladoras), al parecer 828


surgen mas tarde como parte del mecanismo de desactivaci6n. La regia n-1 sugiere que Ia estabilizaci6n del RNA Xist esta "predeterminada" y que algun mecanismo de bloqueo impide Ia estabilizacion en un cromosoma X (que sera el X activo). Esto significa que, si bien Xic es necesario y suficiente para desactivar un cromosoma, los productos de otros loci pueden ser necesarios para el establecimiento de un cromosoma X activo. El silenciamiento de la expresion de Xist es indispensable para el X activo. La delecion del gen de la metiltransferasa del DNA impide el silenciamiento de Xist, tal vez porque es necesaria Ia metilaci6n en el promotor Xist para que cese Ia transcripcion.

Las condensi nas producen la condensaci6n de los cromosomas Conceptos principales • Las proteinas SMC son fosfatasa s del trifosfato de adenosina, que incluyen condensinas y cohesinas. • Un heterodimero de las proteinas SMC se vincula con otras subunidades. • Las condensinas hacen que la cromatina se enrolle en forma mas estrecha por la introducci6n de superhelices positivas al DNA. • Las condensinas se encargan de condensar los cromosomas en la mitosis. • Las condensinas especificas de cromosomas se encargan de condensar cromosomas X inactives en C. elegans.

Las estructuras de cromosomas enteros reciben la influencia de las interacciones con protefnas de Ia fam ilia de SMC (de mantenimiento estructural de cromosomas). Hay fosfatasas del trifosfato de adenosina que entran en dos grupos funcionales . Las condensinas participan en el control de Ia estructura global y se encargan de condensar cromosomas compactos durante la mitosis . Las cohesinas participan en las conexiones entre cromatides hermanas que de ben liberarse en la mitosis. Ambas constan de dfmeros formados por protefnas SMC. Las condensinas forman complejos que tienen un meollo del heterodimero SMC2-SMC4 vinculado con otras protefnas (no SMC). Las cohesinas tienen una organizacion similar basada en el meollo heterodimerico de SMCl-SMC3. En Ia se muestra que una protefna SMC tiene una estructura enrollada en el centro, que es interrumpida por una region de bisagra flexible . Tanto los extremos amino como carboxilo tienen segmentos de union a ATP y DNA. Se han

Las superhelices interactuan

Extrema N ~

Sitio de uni6n deATPyDNA ~

Las regiones terminales se unen --r. al DNA -,

Las prote\nas SMC forman dimeros gracias a interacciones antiparalelas entre las superhelices centrales. Ambas regiones terminates de cada subunidad tienen segmentos de union de ATP y DNA . Las cohesinas pueden for ma r una estructura extendida que permite a dos moleculas diferentes de DNA enlazarse .

Sitio de uni6n de ATP y DNA Extrema C .~ .13 Una prote\na SMP tiene un "modulo Walker" con un segmento de union a ATP y uno de union a DNA en sus extremos, que se conectan por media de superhelices enlazadas por una region de bisagra.

..

.

Condensina

Las dos mitades de una condensina se pliegan hacia atras en un angulo de 6°. Las cohesinas tienen una conformacion mas abierta, con un angulo de 86° entre las dos mitades.

•1 Las condensinas pueden formar una estruct ura compacta si se doblan en la bisagra, lo que hace que el DNA se torne compacta.

propuesto diferentes modelos para las acciones de estas protefnas, dependiendo de que se dimerizen por interacciones intra o intermoleculares. Los experimentos con homologas bacterianas de las protefnas SMC hacen pensar que se forma un dfmero por una interaccion antiparalela entre las superhelices, de manera que el extremo N de una subunidad se enlaza con el extremo C de Ia otra. Es posible que Ia existencia de una region de bisagra flexible permita a cohesinas y condensinas depender de un modo diferente de accion del dfmero. En !a G . 4 se muestra que las cohesinas tienen una estructura en V con los brazos separados en un angulo de 86°, en tanto las condensinas tienen una flexion posterior mas aguda, con solo 6° entre los brazos. Esto permite a las cohesinas mantener las cromatides hermanas juntas, en tanto las

condensinas, por otro lado, condensan un cromosoma individual. La muestra que una coh esina puede adquirir la forma de un dfmero extendido con enlace cruzado de dos moleculas de muestra que una condensiDNA. La na podrfa adoptar !a forma de un dfmero en V (en esencia, flexionado en !a bisagra), que hace traccion sabre sitios distantes en la misma molecula de DNA uniendolos y condensandola. Los experimentos h acen pensar en un modelo alternativo donde las proteinas de levaduras forman dfmeros por las interacciones intramoleculares. Esto es, se forma un homodimero solo por la interaccion entre dos subunidades identicas. Los centros de dos protefnas diferentes (en este caso, SMCl y SMC3) pueden entonces interactuar en sus regiones cefalica y de bisagra para formar un a estructura circular

3Ui Las condensinas producen la condensacion de los cromosomas

829

Las cohesinas pueden formar dimeros por medio de conexiones intramoleculares y despues multimeros, que se conectan en las cabezas y la bisagra. Es posible que talestructura mantenga dos moleculas de DNA juntas al rodea rlas.

Las condensinas se localizan a todo lo largo de un cromosoma mit6tico. El DNA es rojo; las condensinas, amarillas. Fotografta por cortesia de Ana Losada y Tatsuya Hirano .

como la que se muestra en la . En lugar de unirse de man era directa al DNA, una estructura de ese tipo podrfa manrener juntas sus moleculas al rodearlas. La visualizaci6n de los cromosomas mit6ticos muestra que las condensinas se localizan a todo lo largo del cromosoma, como puede observarse en la . (Por el contrario, las cohesinas se encuentran en localizaciones bien definidas. ) El complejo condensina recibi6 ese nombre por su capacidad de hacer que la cromatina se condensase in vitro . Tiene la capacidad de introducir superhelices positivas en el DNA en una acci6n que aprovecha la hidr6lisis de ATP y depende de la presencia de la

830


topoisomerasa I. Esta capacidad es controla da por la fosforilaci6n de las subu nidades no SMC que tiene Iugar en la mitosis. No se sabe aun de que manera se relaciona esto con otras modificaciones de la cromatina, por ejemplo, la fosforilaci6n de histonas. La activaci6n del complejo de con densina de manera especifica en la mitosis hace dudar de que tambien participe en la formaci6n de la heterocromarina de interfase. Ocurren cambios globales en otros tipos de compensaci6n de dosis. En el genero Drosophila se encuentra un complejo de protefnas en los machos, donde se loca liza en el cromosoma X. En C. elegans, un complejo protefnico se vincula con ambos cromosomas X en embriones XX, pero los componentes protefnicos se mantienen con distribuci6n difusa en los nucleos de embriones XO. El complejo protefnico contiene un meollo de SMC y es similar a los complejos de condensina que se vinculan con cromosomas mit6ticos en orras especies. Esto permite suponer que tiene una funci6n estrucrural que hace que el cromosoma adquiera una fo rma mas condensada, inactiva. Pueden necesitarse multiples sitios en el cromosoma X para que el complejo se distribuya por completo. El complejo se une a esos sitios y despues se dispersa por todo el cromosoma para cubrirlo de manera mas amplia. Los cambios que afectan a todos los genes en un cromosoma, ya sea de manera negariva (mamfferos y C. elegans), o positiva (genero Drosophila) son, por tanto, una caracteristica comun de la compensaci6n de dosis. No obstante, los componentes del aparato de compensaci6n de dosis pueden variar, asf como los medios por los que se localizan en el cromosoma y, por supuesto, ese mecanism o de acci6n es diferente en cada caso.

1111

Una metilasa de mantenimiento perpetua la metilaci6n del DNA


• Casi t odos los gwpos metilo del DNA se encuentran en las citosinas de ambas cadenas del par G. • La replicaci6n convierte un sitio por completo metilado en uno hemimetilado. • Una metilasa de mantenimiento convierte los sitios hemimetilados en metilados por completo.

Ocurre metilaci6n del DNA en sitios especificos. En las bacterias se vincula con la identificaci6n del sistema de merilaci6n de restricci6n bacreriana urilizado para la defensa de los fagos y tambien para distinguir el DNA replicado del no replicado (vease

Sitios metilados por completo

CG

Metilasa nueva

'

' Replicaci6n Sitios hemimetilados Metilasa de perpetuaci6n

+

Desmetilasa ' Metilaci6n

El estado de metilaci6n es regu lado por tres tipos de enzimas. Se conocen metilasas nuevas y de perpetuaci6n, pero no se han identificado desmetilasas.

' Replicaci6n Sitio no metilado

+ Sitios hemimetilados

~ ..........,.. ..._...,....._...,_

GC

~

Me

El estado de los sitios metilados podr\a perpetuarse gracias a la acci6n de una enzima que reconoce solo sitios hemimetilados como sustratos.

la seccion 20. 7, Control de la direccion de la reparacion de apareamientos erroneos). En las eucariotas, su principal funcion conocida tiene relacion con el control de la transcripcion; la metilaci6n se vincula con la desactivacion genica (vease Ia seccion 24.18, La expresion genica se vincula con la desmetilacion). De 2 a 7% de las citosinas del DNA de las celulas animales estan metiladas (la cifra varia de acuerdo con la especie). La mayor parte de los grupos metilo se encuentra en "pares" CG y, de hecho, Ia mayor parte de las secuencias CG esta metilada. Por logeneral, los segmentos C de ambas cadenas de esta secuencia palindromica corta estan metilados, lo que da Iugar a Ia estructura . Dicho sitio se describe como metilado por completo. Considerense, no obstante, las conse-

cuencias de la replicaci6n de este sitio. En la se muestra que cada par hijo tiene una cadena metilada y una no metilada. Dicho sitio se denomina hemimetilado. La perpetuacion del sitio metilado depende de lo que pase con el DNA hemimetilado. Si ocurre metilacion de una cadena no metilada, se restablece la condicion de metilacion completa del sitio. Sin embargo, si Ia replicaci6n ocurre antes, se perpetuara el estado hemimetilado en un par de cadenas hUas, pero el sitio no estara metilado en el otro par de cadenas hijas . En la se muestra que el estado de metilacion del DNA es controlado por metilasas, que agregan grupos metilo ala posicion 5 de Ia citosina, y desmetilasas, que retiran los grupos metilo (para describir estas enzimas de manera mas formal se les denomina metiltransferasas). Hay dos tipos de metilasa del DNA cuyas acciones se distinguen por el estado de metilacion del acido. Para modificar el DNA en una nueva posicion se requiere Ia accion de una metilasa nueva, que reconoce al DNA por virtud de una secuencia especffica y actua solo en el no metilado para agregar un grupo metilo a una cadena . Hay dos metilasas nuevas (Dnmt3a y Dnmt3B) en el raton; tienen diferentes sitios diana y ambas son indispensables para el desarrollo. Una metilasa de mantenimiento actua constitutivamente solo en sitios hemimetilados, para conver-

31.7 Una metilasa de mantenimiento perpetua la metilaci6n del DNA

831

tirlos en metilados completos. Su existencia indica que cualquier sitio metilado se perpetua despues de Ia replicacion. Hay una metilasa de mantenirniento (Dnmtl) en el raton yes indispensable: los embriones de raton donde se ha alterado un gen no sobreviven despues de Ia embriogenesis temprana. La metilacion de mantenirniento es casi 100% eficaz, lo que asegura que la situacion demostrada a la izquierda de Ia Figura 31 .19 prevalece in vivo. El resultado es que sf ocurre Ia metilacion nueva en un alelo pero no en el otro, esa diferencia se perpetuara a traves de las siguientes divisiones celulares, con lo que se mantiene una diferencia entre los alelos que no depende de sus secuencias. La metilacion tiene varios tipos de dianas. Los promotores genicos son la diana mas frecuente. Los promotores son metilados cuando el gen esta inactivo, pero no metilados cuando esta activo. La ausencia de Dmntl en el raton causa una desmetilacion amplia en los promotores y se asume que es letal por Ia expresi6n genica sin conrrol. El DNA satelite es otra diana. Las mutaciones en Dnmt3 irnpiden Ia metilacion del DNA satelite, lo que causa inestabilidad en el centromero dentro del ambito celular. Las mutaciones en el gen humano correspondiente causan una enfermedad llamada ICF (inmunodeficiencia/inestabilidad del centromero, anomalias faciales). La importancia de la metilacion se recalca en otra enfermedad humana, el sind rome de Rhett, causado por la mutacion del gen para Ia protef.na Me2 que se une a secuencias G metiladas. Las metilasas son enzirnas convencionales que actuan sobre un DNA diana. Sin embargo, p uede haber tambien un sistema de metilacion que utiliza una secuencia corta de RNA para h acer diana en una secuencia correspondiente de DNA para la metilacion (vease la seccion 13.6, Se puede usar RNA no codificante para desactivar Ia expresion genica). Nada se sabe del mecanismo de operacion de este sistema. (.Como se establecen y mantienen las regiones desmetiladas? Si un sitio del DNA no se ha metilado, es posible que una proteina que reconoce Ia secuencia no metilada la proteja contra la metilacion. Una vez que se ha metilado un sitio, hay dos posibles formas de generar sitios desmetilados. Una es bloquear la actuacion de Ia metilasa de mante nimiento sobre el sitio cuando este se replica. Despues de un segundo ciclo de replicacion uno de los pares de cadenas hijas estara no metilado (como se muestra en ellado derecho de la Figura 31. 19 ). El otro es desmetilar de manera activa el sitio, como se muestra en Ia , ya sea por retiro directo del grupo metilo de Ia citosina o por escision de la citosina o citidina metiladas del DNA para su sustitucion por un sistema de reparacion. Se sabe que puede ocurrir desmetila cion activa en el geno 83 2


3'

5'

I'~

Retire del grupe metile

s:

3'

Retire de Ia base 5-Me-C

Retire del nucleotide

s:

s

\)-0

b-o

3'

3'

Es posible que el DNA se desmetile si se retira el grupo metilo, la base o el nucle6tido. El retiro de la base o el nucle6tido requeriria su reposici6n por un sistema de reparaci6n.

rna paterna poco despues de Ia fecundacion, pero no se conoce el mecanismo usado. Una posibilidad interesante es que participase Ia AID desaminasa de histidina; puede desarninar fragmentos C-metilados y crear un apareamiento erroneo de bases que un sistema de reparacion pudiese entonces corregir a un par C-G estandar (no metilado ).

1111

La metilaci6n del DNA se encarga de la impresi6n

Concepto principal • Los alelos paternos y maternos pueden tener diferentes patrones de metilaci6n en la fecundaci6n. • La metilaci6n suele vincularse con la desactivaci6n del gen. • Cuando los genes tienen impresi6n diferencial, la supervivencia de los embriones puede requerir que el alelo funcional sea provisto por el progenitor con el alelo no metilado. • La supervivencia de heterocigotos para genes impresos es diferente, de acuerdo con la direcci6n del cruce. • Los genes impresos se presentan en grupos y pueden depender de un sitio de control local, donde ocurre metilaci6n nueva, a menos que se evite de manera especlfica.

El patron de metilaci6n de las celulas germinativas se establece para cada sexo durante Ia gametogenesis mediante un proceso de dos etapas: primero el patron existente es borrado por una desmetilaci6n de todo el genoma, y luego se impone el patron especifico de cada sexo. Todas las cliferencias de alelos se pierden cuando las celulas germinales primorcliaJes avanzan durante el desarrollo del embrion; sin importar el sexo, los patrones anteriores de metilacion se borran y un gen caracteristico es entonces no metilado. En los machos el patron se presenta en dos eta pas. La via de metilacion caracterfstica de los espermatozoides maduros se establece en el espermatocito, pero se hacen otros cambios en ese patron despues de Ia fecundacion. En las hembras, el patron materno se impone durante la oogenesis cuando los oocitos maduran a traves de la meiosis despues del nacimiento. Como es de esperarse por la inactividad de los genes en los gametos, su estado habitual es metilado. Sin embargo, hay casos de diferencias entre los dos sexos en los que un locus esta no metilado en un sexo. Una pregunta importan te es, (.COmo se determina la especificidad de metilaci6n en los gametos masculino y femenino? Ocurren cambios sistematicos en la embriogenesis temprana. Algunos sitios continuaran metilados, en tanto otros seran de manera especifica no metilados en las celulas donde se expresa un gen. Por el patron de cambios se puede inferir que cada uno de los episodios de metilacion especffica de secuencia tiene Iugar durante el desarrollo somatico del organismo, a medida que se activan genes particulares. El patron especffico de los grupos metilo en celulas germinativas se encarga del fenomeno de Ia impresion, que describe una diferencia de conducta entre los alelos heredados de cada padre. La expresion de ciertos genes en embriones de raton depende del sexo del progenitor del que se heredaron. Por ejemplo, el alelo que codifica IGL-II (factor II de crecimiento similar a insulina) que se hereda del padre se expresa, pero el heredado de la madre nose expresa. El gen del IGF-II de los oocitos esta metilado pero el gen IGF-II de espermatozoides no lo esta, de manera que los dos alelos tienen conducta diferente en el cigoto. Este es el patron mas frecuente, pero la dependencia del sexo se revierte en algunos genes. De hecho, se muestra el patron contrario (expresion de la copia materna) para IGFIIR, el receptor de IGF-II. Este modo de herencia especffico del sexo requiere que se establezca el patron de metilacion de manera especifica durante cada gametogenesis. El destino de un locus hipotetico en un raton se ilus. En el embrion temprano, el tra en Ia

alelo paterno no esta metilado y sf expresado, y el alelo materno esta metilado yes silente. (.Que sucede cuando ese raton forma sus gametos? Si es un macho, el alelo aportado al espermatozoide debera ser no metilado, sin importar sial principia lo estaba o no. AsL cuando un alelo materno se encuentra en un espermatozoide, debe ser desmetilado . Si el raton es una hembra, el alelo con que contribuye a! oocito debe ser metilado; si en un principia era el alelo paterno, deberan agregarse grupos metilo. La consecuencia de Ia impresi6n es que un embrion requiere un alelo paterno para este gen. Asf, en el caso de una cruza heterocigota donde el alelo de un progenitor tiene una m utacion de desactivaci6n, el embrion sobrevivira si el alelo de tipo silvestre proviene del padre, pero morira si proviene de Ia madre. Este tipo de dependencia en la direccionalidad de Ia cruza (a! contrario de Ia genetica mendeliana) es un ejemplo de herencia epigenetica, donde algun factor diferente a las secuencias de sus genes mismos influye en sus efectos (vease Ia secci6n 31.1 0, Los efectos epigeneticos pueden heredarse) . Si bien los ale los paterno y materno tienen secuencias ictenticas, muestran diferentes propiedades, dependiendo de que progenitor los aport6. Estas propiedades se heredan a traves de Ia meiosis y en las mitosis somaticas posteriores.

Embri6n

Gametos de Ia siguiente generaci6n Los machos aportan espermatozoides

o bien

El patron caracteristico de La impresion es que un locus metilado sea inactivo. Si se t rata del alelo materna, solo el alelo paterna estara activo y sera esencial para la via bilidad. El patron de metilacion se reajusta cuando se fo rma n los gametos, de manera que todos los espermatozoides tienen un tipo paterna y todos los oocitos tienen un tipo materna. 31.8 La metilacion del DNA se encarga de La impresion

833

Los genes impresos a veces se agrupan. Mas de Ia mi.tad de los 17 genes impresos conocidos en el raton estan contenidos en dos regiones particulares, cada una con genes de expresion materna y paterna . Esto hace pensar en la posibilidad de que los m eca nismos de i.mpresion funcionen por largas distanci.as. Se puede entender en parte esa posibilidad por las deleciones en la poblacion humana que causan las enfermedades de Prader-Willi y Angelman. Casi todos los casos se deben a la misma delecion de 4 Mb, pero los sfndromes son diferentes dependiendo de que progenitor contribuyo con Ia delecion . El motivo es que la region con delecion contien e al menos un gen impreso p or el padre y al menos uno impreso porIa madre. Sin embargo, hay algu nos casos excepcionales con deleciones mucho m as pequefi.as. Se puede causar el sfndrome de Prader Willi por una delecion de 20 kb que silencia genes distantes a ambos !ados. El efecto basico de Ia delecion es impedir que un padre restablezca e l m odo paterno a u n cromosoma heredado porIa m adre. El resultado es que los genes se m antienen en m odo materno, de manera que los alelos paternos, as! como los maternos, son silentes en la descendencia. Se encuentra el efecto inverso en algunas pequefi.a s deleciones que causan el sindrome de Angelman . La deduccion es que esa region comprende algu n tipo de "centro de impresi.on " que actua a cierta distancia para cambiar de un tipo de progenitor al otro. La metilacion tambien se encarga de efectos epigeneticos que regulan Ia expresion de gen es de RNAr. El fenomeno de dominancia nucleolar describe la transcripcion de solo un conjun to de genes del RNAr de los progenitores, resultado de la metilacion de citosinas en los promotores de los genes heredados de un progenitor y no del otro .

111J

Un solo centro puede controlar los genes con impresi6n opuesta

Conceptos principales • Los genes impresos son controlados por la metilaci6n de los sitios de acci6n en config uraci6n cis. • La metilaci6n puede encargarse de desactivar o activar un gen .

La impresion esta determinada por el estado de metilacion del sitio de accion en configuracion cis cerca de un gen diana o varios. Estos sitios regulado res se conocen como dominios con m etilacion diferen cial (DMD ) o regiones de control de Ia impresion (ICR).

834


El ICR esta metilado en el alelo paterna, donde Igf2 es activo y H19 es inactive . El ICR no esta metilado en el alelo materna, donde Igf2 es inactive y H19 es activo.

Ale/a materna El CTCF se une a/ ICR sin metilaci6n lgf2 INACTIVO Se bloquea el potenciador

El ICR es un aislante que im pide que un potenciado r active a Igf2. El aislante actua s6lo cuando une CTCF al DNA no metilado.

La delecion de esos sitios elim in a la im presion y los loci diana actuan enton ces igual en los genomas matern o y paterno. La condu cta de una region que contiene dos gen es, Igf2 y H19 , ilustra las formas en q ue la metilacion puede controlar la actividad genica. La muestra que estos dos genes reacciona n en forma opuesta al estado de m etila cion en el ICR lo calizado entre ellos. La ICR esta metilada en el alelo paterno. El H19 muestra la respuesta caracterfstica de desactivacion. Sin emba rgo, n otese que el Igf2 se expresa . La situacion inversa se encuen tra en el alelo m a terno, donde la ICR n o esta metilada . El Hl9 se expresa entonces, pero el Igf2 esta desactivado. El control de Igf2 lo ej erce u na fu n cion aislante de Ia ICR. La muestra que cuando Ia ICR no esta m etilada se une a Ia proteina CTCF, lo que crea un a funcio n de aislante que bloquea a un p otenciador y le impide Ia activacion del prom otor de Igf2. Este es un efecto muy poco comun, donde

la metilaci6n activa de manera indirecta a un genal bloquear a un aislante. La regulaci6n de H 19 muestra Ia direcci6n mas habitual del controL donde Ia metilaci6n crea un estado de impresion inactivo. Esto podrfa reflejar un efecto directo de la metilacion sobre la actividad del promotor.

EID

Los efectos epigeneticos pueden heredarse

Concepto principal • Los efectos epigeneticos pueden derivarse de una modificaci6n de un acido nucleico despues de que se ha sintetizado, o por la perpetuaci6n de estructuras proteinicas.

La herencia epigenetica describe la posibilidad de diferentes estados, que pueden tener diversas consecuencias fenotfpicas , de heredarse sin ning(m ca.mbio en Ia secuencia del DNA. ( Como puede ocurrir esto? Los mecanismos epigeneticos se dividen en dos clases generales: • El DNA puede modificarse por Ia union covalente de una molecula que despues es perpetuada. Dos alelos con la misma secuencia pueden tener diferentes estados de metilacion, que les confieren propiedades diversas. • Puede establecerse un estado de protefna de autoperpetuaci6n que tal vez comprenda el ensamblaje de un complejo protefnico, la modificacion de una o varias protefnas especfficas o el establecimiento de una conformaci6n protefnica alternativa. La metilacion establece Ia herencia epigenetica, en tanto la metilasa de mantenimiento actue de rnanera constitutiva para restabl ecer el estado metilado despues de cada ciclo de replicaci6n, como se muestra en la Figura 31.19. Se puede perpetuar un estado de metilaci6n por medio de una serie indefinida de mitosis somaticas, lo que tal vez sea una situaci6n "predeterminada". La metilacion tambien puede perpetuarse a traves de Ia meiosis: por ejemplo, en el hongo del genero Ascobolus hay efectos epigeneticos que pueden transmitirse tanto por medio de mitosis como de meiosis, por mantenimiento del estado de metilacion. En las celulas de los mamfferos se crean efectos epigeneticos porque la reestructuracion del estado de metilaci6n es diferente en la meiosis de machos y hembras. Las situaciones donde los efectos epigeneticos parecen mantenerse mediante estados protefnicos se conocen menos bien en terminos moleculares. El efecto de posicion abigarrado muestra que la hete-

rocromatina constitutiva puede extenderse a una distancia variable y despues se perpetua a traves de las divisiones somaticas. No hay metilaci6n del DNA en el genero Saccharomyces y una cantidad cada vez menor en el genero Drosophila y, como resultado, es probable que la herencia de estados epigeneticos del efecto de posicion abigarrado o el silenciamiento telomeri co en estos organismos se de ban a Ia perpetuacion de estructuras protefnicas. En la se consideran dos posibilidades extremas para el destino de un complejo proteinico en la replicaci6n. • Un complejo podrfa p erpetuarse a si rnismo si se escinde en forma simetrica, de manera que el complejo rnitad se vincule con cada cadena doble hija. Si los complejos mitad tienen Ia capacidad de nuclear Ia formaci6n de complejos totales, se restablecera el estado original. Esto es basicamente analogo al mantenimiento de Ia metilacion. El problema con este modelo es que no hay motivo evidente por el que los complejos proteinicos actuen de esa manera. • Un complejo podrfa mantenerse como unidad y segregarse a una de las dos cadenas hijas dobles. El problema con este modelo es que requiere el ensamblaje de un nuevo complejo en el otro par nuevo de cadenas hijas y no es evidente por que deberfa suceder.

~Que sucede con los complejos proteinicos en la cromatina durante la replicaci6n?

31.10 Los efectos epigeneticos pueden heredarse

835

Las colas de histonas se acetilan en Ia cromatina de los progenitores

Los meollos acetilados se distribuyen en forma aleatoria durante Ia replicaci6n Ac

Ac

Ac

AcAc Ac

Ac

Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac

(_Que se encarga de restablecer el estado acetilado?

Ac Ac AcAcAc Ac AcAc Ac Ac Ac Ac

Los meollos acetilados se conservan y distribuyen en forma ateatoria en las fib ras de cromatina hijas durante Ia replicaci6n. Cada fibra hija tiene una mezcla de meollos antiguos (acetilados) y nuevas (sin acetilar) .

Considerese ahara Ia necesidad de perpetuar una estructura h eterocromatica constituida por complejos protefnicos. Sup6ngase que una protefna se distribuye mas o menos de manera continua en una banda de heterocromatina, como se muestra en Ia Figura 31.4. Si se distribuyen subunidades individuates en forma aleatoria a cada cadena doble hija en Ia replicaci6n, los dos constituyentes continuaran marcados par Ia protefna, aunque su densidad disminuira a Ia mitad de su concentraci6n antes de Ia replicaci6n. Si Ia protefna tiene una propiedad de autoensamblaje que hace que las nuevas subunidades se asocien a ella, se restablecera Ia situaci6n original. En terminos basicos, Ia existencia de efectos epigeniticos obliga a considerar que una prote£na encargada de tal circunstancia debe tener algun tipo de capacidad de automoldeado o autoensamblaje. En algunos casas puede ser el estado de modificaci6n de Ia protdna, mas que la presencia de la proteina en sf lo que se encarga de un efecto epigenetico. Hay una correlacion general entre la actividad de la cromatina y el estado de metilacion de las histonas, en particular H3 y H4, qu e ocurre en sus colas terminates N. La activacion de la transcripci6n se vincula con Ia acetilacion en Ia vecindad del promotor; y la represi6n de Ia transcripci6n se vincula con la desacetilacion (vease la secci6n 30.7, Las ace836

CAPiTuLO 31 Los efectos epigeneticos son heredados

tilasas se vinculan con los activadores). La correlacion mas notoria es que el cromosoma X inactivo en celulas femeninas de mamffero esta subacetilado en Ia histona H4. La inactividad de Ia heterocromatina constitutiva puede requerir que las histonas no se acetilen. Si una acetiltransferasa de histonas se apuntala en una region de heterocromatina telomerica en las levaduras, los genes silenciados se tornan activos. Cuando la levadura se expone a la tricostatina (un inhibidor de la desacetilaci6n), Ia heterocromatina centromerica se acetila y los genes silenciados en regiones centromericas pueden tornarse activos. El efecto puede persistir incluso despues de que se ha retirado Ia tricostatina. De hecho, puede perpetuarse a traves de mitosis y meiosis, lo que permite suponer que se ha creado un efecto epigenetico al cambiar el estado de acetilacion de las histonas. (,Como podrfa perpetuarse el estado de acetilacion? Sup6ngase que el tetramero H\-H4 2 se distribuye en forma aleatoria a dos cadenas hijas. Esto crea la situacion que se muestra en Ia , donde cada par de cadenas hijas contiene algunos octameros de histonas acetilados por completo en las colas H3 y H4, en tanto otras estan par completo desacetiladas. Para contribuir a un efecto epigenetico, deberfa suponerse que Ia presencia de algunos octameros de h istonas por completo acetilados ofrece una sefial que hace que los octameros no acetilados se acetilen. (La situaci6n real es tal vez mas complicada que la mostrada en la figura, porque ocurren acetilaciones transitorias durante la replicacion. Si tan solo se revienen despues del deposito de histonas en los nucleosomas, esto tal vez sea irrelevante. Otra posibilidad es que se impida la desacetilacion usual en Iugar de, o ademas de, inducir la acetilacion.)

IIIII

Los priones de las levaduras muestran herencia desusada

Conceptos principales • La proteina Sup35 en su forma soluble de tipo silvestre es un factor de terminaci6n de la traducci6n . • Tambien puede existir en una forma alternativa de agregados otigomericos, donde no es activa en Ia sintesis de proteinas. • La presencia de la forma oligomerica hace que la proteina recien sintetizada adquiera Ia estructura inactiva. • La conversion entre las dos formas recibe la influencia de los chaperones. • La forma de tipo silvestre tiene el estado genetico recesivo psi- y la forma mutante tiene el estado genetico dominante PSJ+.

Estado [psr): ocurre Ia terminaci6n Sup35 [ps;-j

Estado [psr]: Ia protefna funciona de manera normal

=::::=======-=.,_. Estado [PSI+]: todas las proteinas entran a un estado mutante

Sup35

Estado [PSI+]: sin terminaci6n

~

=~============~

~

Sup35

[ps1~]

Sup35 [PSI+]

7 El estado de la prote1na Sup35 determina si ocurre terminaci6n de la traducci6n.

Uno de los casos mas claros de la dependencia de Ia herencia epigenetica del estado de la protefna lo constituye la conducta de los priones, que se han descrito en dos circunstancias: por efectos geneticos en Jevaduras y como agentes causales de enfermedades neurol6gicas en mamlferos, incluidos los seres humanos. Un efecto epigenetico notorio se encuentra en las levaduras, donde se pueden heredar dos estados diferentes que se ubican en un solo locus genetico, si bien !a secuencia del gen es !a misma en ambos estados. Los dos estados diferentes son (psi-] y [PSJ+] . Ocurre un cambio de condici6n con baja frecuencia como resultado de la transici6n espontanea entre los estados. El genotipo [psi] se ubica en ellocus Sup35, que codifica un factor de terminaci6n de Ia traducci6n. En la u se resumen los efectos de Ia protefna Sup35 en las levaduras. En las celulas de tipo silvestre, que se describen como [psi-], el gen esta activo y la protefna Sup35 termina la sfntesis de protefnas . En las celulas de tipo mutante [PSJ+] el factor no funciona, lo que hace que la sfntesis de protefnas no termine de manera apropiada. (Esto se detect6 en un principia por los efectos letales de la mayor eficacia de los supresores de codones ocre en las cepas [PSJ+].) Las cepas [PSJ+] tienen propiedades geneticas inusitadas. Cuando una cepa [psi-] se cruza con

La prote\na Sup35 recien sintetizada cambia al estado [PSI•] por la presencia de una prote\na preexistente [PS!+).

una [PSJ+], toda !a progenie resulta [PSJ+] . Este es un patron de herencia que se esperarfa de un agente extracromos6mico, pero el rasgo [PSJ+ ] no puede localizarse en ninguno de esos acidos nucleicos . El rasgo [PSJ+] es metaestable, lo que significa que aunque es heredado por casi toda Ia progenie, se pierde a un ritmo alto, compatible con la mutaci6n . Se muestra una conducta similar tam bien en el locus URE2, que codifica una protefna requerida para la represi6n de ciertas enzimas catab6licas mediadas por el nitr6geno. Cuando una cepa de levadura se convierte a un estado alternativo, llamado [URE3], Ia proteina Ure2 ya no es funcional. El estado [PSJ+] esta determinado porIa conformaci6n de la protefna Sup35. En una celula (psi-] de tipo silvestre, Ia proteina muestra su funci6n normal. En una celula [PSJ+], no obstante, Ia proteina esta presente en una conformaci6n alternativa, donde ha perdido su funci6n normal. Para explicar el predominio unilateral de [PSJ+] sobre [psi-] en cruzas gen eticas, se debe suponer que la presencia de la protefna en estado [PSJ+} hace que todas las protefnas en la celula entren a ese estado. Esto requiere una interacci6n entre la protefna [PSJ+] y la protefna recien 31.11 Los priones de las levaduras muestran herencia desusada

837

sintetizada, lo que tal vez refleja la generacion de un estado oligomerico, donde Ia protefna [PSJ+ ] tiene una funcion de nucleacion, como se ilustra en la Una caracterfstica comun a las protefnas Sup3 5 y Ure2 es que cada una consta de dos dominios que actuan de manera independiente. El dominio tern1i nal C es suficiente para Ia actividad de !a protefna. El dominio terminal N es suficiente para !a formacion de las estructuras que hacen inactiva a Ia proteina. De este modo, !a levadura donde el don1inio tenninal N de Sup35 tiene delecion no puede adquirir el estado [PSJ+] y Ia presencia de un dominio terminal N [PSJ+] es suficiente para mantener una proteina Sup3 5 en el estado de [PSJ+] . La caracterfstica crftica del dominio terminal N es que es rico en glutamina y asparagina. La perdida de fu ncion en el estado [PSJ+ ] se debe a! secuestro de Ia proteina en un complejo oligomerico. La protefna Sup35 en las celulas [PSJ+] se agrupa en loci bien definidos, en tanto Ia proteina en las celulas [psi-] se difunde en el citosol. La protefna Sup35 de las celulas [PSJ+ ] forma fibras amiloides in vitro, que tienen un caracteristico contenido alto de estructuras en hoja ~Se sugiere !a participacion de !a conformacion protefnica (mas que su modificacion covalente) por los efectos de los trastornos que afectan Ia estructura de las protefnas. Los tratamientos de desnaturalizacion causan perdida del estado [PSJ+] . En particular, el chaperon Hspl04 panicipa en Ia herencia de

Protefna [psr] Protefna [PSI+] Conversion in vitro _

--+lncorporaci6n alliposoma

l

~

Fusi6n delliposoma con Ia levadura [psi"]

~

l La levadura se mantiene [psi"]

~

~ l

La levadura se torna [PSi•]

00 La prote\na purificada puede convertir el estado [psi-] de las levaduras al [PSI•].

838


[PSJ+] . Sus efectos son paradojicos. La delecion de HSP I 04 impide el mantenimiento del estado [PSJ+ ] y

Ia sobreexpresion de Hspl04 tambien cau sa perdida del estado [PSJ+], lo que hace pensar que se requiere Hsp l 04 para algun cambia en Ia estructura de Sup35 necesario para adquirir el estado [PSJ+], que debe ser transitorio. Utilizando Ia capacidad de la Sup35 de formar Ia estructura inactiva in vitro, es posible ofrecer una prueba bioqufmica de Ia participacion de Ia proteina. En la L se ilustra un experimento notorio, donde !a protefna se convirtio a !a forma inactiva in vitro, se colo co dentro de liposomas (donde, en efecto, Ia protefna es rodeada por una membrana artificial) y despues se introdujo de manera directa a las celulas por fusion de los liposomas con [psi-] de levad uras. Las celulas de las levaduras se convirtieron a [PSJ+ ] . Ese experimento refuta todas las objeciones que surgieron a Ia conclu sion de que Ia proteina tiene !a capacidad de conferir el estado epigenetico. Los experimentos donde se aparean celulas o don de se taman extractos de una para tratar a otra, siempre son susceptibles a Ia posibilidad de que se baya transferido un acido nucleico. No obstante, cuando la protefna por sf m isma no convierte celulas diana (aunque la protefna convertida al estado inactivo lo puede hacer), la unica dife rencia es el tratamiento de Ia protefna, que debe, por tanto, encargarse de la conversion. La capacidad de Ia levadura de formar el estado de prion [PSJ+] depende de los antecedentes geneticos . La levadura debe ser [PIW] para que se forme el estado [PSJ+]. El propio estado [PIW ] es un estado epigenetico. Puede crearse por la fo rmacion de priones a partir de cualquiera de diferentes protefnas. Esas protefnas comparten Ia caracterfstica de Sup35 de tener dominios ricos en Gln/Asn. La sobreexpresion de esos dominios en las levaduras estimula la formacion del estado [PSJ+], lo que sugiere que hay un modelo comun para la formacion del estado de prion, que involucra la agregacion de los dominias Gln/ Asn a Ia estructura ami! aide de autopropagacion. (.Como influye la presen cia de una protefna Gln/ Asn sobre la formaci on de priones por otra? Se sabe que Ia formacion de los priones Sup35 es especffica de !a proteina Sup35, esto es, no ocurre por agregaci6n cruzada de otras protefnas. Esto permite suponer que las celu las de levadura pueden conte ner proteinas solubles que antagonizan !a formacion de priones . Estas protefnas no son especfficas de un prion. Como resultado, la introduccion de cualquier dominio protein.ico Gln/ Asn que interact lie con esas protefnas disminuira !a concentraci6n. Esto permite que otras protefnas Gln / Asn se agregu en mas con mas fa cilidad.

EJ1E

Los priones causan enferm edades en los mamiferos

Conceptos pri nci pales • La prote\na que causa encefalopatla espongiforme ovina tiene dos formas de presentaci6n: La PrPc no infecciosa de tipo silvestre susceptible a las proteasas, y La PrP5' que causa enfermedad y es resistente a las proteasas. • La enfermedad neurologica puede transmitirse a los ratones mediante la inyeccion de la prote\na PrP5' purificada. • El raton receptor debe tener una copia del gen PrP que codifica la protelna murina. • La prote\na PrP5' puede autoperpetuarse al hacer que la prote\na PrP, recien sintetizada, adopte la forma de PrP5' en Lugar de la forma PrPc. • Multiples cepas de PrP5' pueden tener diferentes conformaciones protelnicas.

Se han encontrado enfermedades por priones en ovejas, seres humanos, y en fecha mas reciente, en vacas. El fenotipo basico es una ataxia, trastorno neurodegenerativo que se manifiesta por una imposibilidad de mantenerse erecto. El nombre de esta enfermedad en ovejas, encefalopatia espongiforme ovina, refleja el fenotipo: el animal se talla contra las paredes para mantenerse erecto. La encefalomielitis ovina puede perpetuarse por la inoculacion de ovejas con extractos histicos de animales infectados. La enfermedad kuru se encontro en Nueva Guinea, donde parecio perpetuarse por el canibalismo, en particular por Ia ingestion de cerebros. Las enfermedades en poblaciones occidentales con un patron de transmision genetica incluyen el sfndrome de Gerstmann-Straussler y !a enfermedad relacionada, de Creutzfeldt-Jakob (CJD), que ocurre en forma esporadica. En fecha mas reciente, una enfermedad que simula CJD parece haber sido transmitida por el consumo de carne de vacas que sufre Ia enfermedad de "las vacas locas" . Cuando el tejido de ovejas infectadas por esta encefalitis se inocula a ratones, aparece la enfermedad en un periodo que vade 75 a 150 dfas. El componente activo es una protefna resistente a las proteasas codificada por un gen que normalmente se expresa en el cerebro. La forma de la protefna en el cerebra normal, Hamada PrPc es sensible a las proteasas. Su conversion a la forma resistente, Hamada PrP 5 c se vincula con la aparicion de Ia enfermedad. La preparacion infecciosa no tiene acidos nucleicos detectables, es

sensible a la irradiaci on UV a longitudes de onda que dafian a las proteinas y tiene una baja infe ctividad (una unidad infe cciosa/1 05 protefnas PrP 5c), que corresponde a una herencia epigenetica donde no h ay cambio en la informacion genetica (porque las celulas normales y enfermas tien en la misma secuencia genica PrP) , pero la forma PrP5c de la protefna es el agente infeccioso (mientras qu e PrPc es inocua). La forma PrP5c tiene un alto contenido de hojas ~, que forman una estructura fibrilar amiloide ausente en Ia forma PrPc. La base para la diferencia entre las formas PrP5 c y PrPc parece radicar en un cambio de conform a cion, mas que en alguna alteracion covalente. Ambas protefnas estan glucosiladas y unidas a Ia membrana por un enlace GPI. El analisis de la infectividad en ratones permite estudiar la dependencia de la secuencia protefnica. La muestra los resultados de algunos experimentos determinantes . En circunstancias normales, la proteina PrP5 c extraida de un raton infectado induce la enfermedad (y a la larga, la muerte) cuando se in yecta a un raton receptor. Si el gen PrP es "puesto fuera de combate", el raton se hace resistente a Ia infeccion. Este experimento demuestra dos cosas. Primero, !a protefna end6gena es necesaria para una infeccion, al parecer porque provee la materia prima natural que se convierte en el agente infeccioso . Segundo, la causa de la enfermedad no es el retiro de Ia forma PrPc de la proteina, porque un raton sin PrPc sobrevive de manera normal; la enfermedad es causada por una

RECEPTORES

a

Animales donadores

~

Rat6n infectado m-PrP

m-PrP

m-PrPSc

~

Raton Iuera de combate Sin gen PrP

RESULTADOS

m-PrP5c

~

Se requiere el gen PrP para lograr Ia infecci6n

m-PrP El h-PrPSc no puede infectar al rat6n con m-PrP

Criceto infectado de h-PrP

h-PrP

El h-PrPSc puede infectar al rat6n con h-PrP

Una protelna Prp 5' puede infectar solo a un animal que tiene el mismo ti po de protelna PrPc endogena.

31.12 Los prio nes causan enfermedades en los mam\feros

839

ganancia de funcion en PrP5 <. Si el gen PrP se altera para impedir que ocurra el enlace GPI, los ratones infectados por PrP5c no padecen Ia enfermedad, lo que hace pensar que Ia ganancia de funcion implica una funcion de seii.al alterada para la que se requiere el enlace GPI. La existencia de barreras de especie permite construir proteinas lubridas para definir las caracterfsticas requeridas para la infectividad. Las preparaciones Oliginales de la encefalopatfa espongiforme ovina fue ron perpetuadas en varios tipos de animates, pero no siempre se pueden transferir con facilidad. Por ejemplo, los ratones son resistentes a la infeccion por priones de criceto, lo que significa que PrP5c de criceto no puede convertir Ia PrPc de raton en PrP5<. La situacion cambia, no obstante, si el gen de raton PrP es sustituido por un gen PrP de criceto (esto puede hacerse mediante la introduccion de un gen PrP de criceto al raton con PrP puesto fuera de combate). Un raton con un gen PrP de criceto es sensible a Ia infeccion por un PrP5c de criceto. Esto permite suponer que Ia conversion de Ia proteina PrPc celular al estado Sc requiere que las proteinas PrP5< y PrPc tengan secuencias apareadas. Hay diferentes "cepas de PrP5<" que se distinguen por periodos de incubacion caracterfsticos despues de su inoculacion a ratones. Esto implica que la protefna nose restringe tan solo a estados alternativos de PrPc y PrP5c, sino mas bien que puede haber multiples estados de Sc. Estas diferencias deben de depender de alguna propiedad de autopropagacion de Ia protefna mas que de su secuencia. Si Ia conformacion es la caracterfstica que distingue a PrP5< de PrPc, debe haber multiples conformaciones, cada una con una propiedad de automoldeado cuando convierte PrPc. La probabilidad de conversion de PrPc a PrP5< se afecta por la secuencia de PrP. El sfndrome de Gerstmann-Straussler en seres humanos es causado por un cambio de un solo aminoacido en PrP, que se hereda como rasgo dominante. Si se hace el mismo cambio en el gen PrP del raton, el animal presenta Ia enfermedad. Esto sugiere que la protefna mutante tiene una mayor probabilidad de conversion espontanea a! estado Sc. De manera similar, la secuencia del gen PrP determina Ia susceptibilidad de las ovejas a presentar Ia enfermedad en forma espontanea; Ia combinacion de aminoacidos en tres posiciones (cod ones 136, 154 y 171) determina Ia susceptibilidad. El prion ofrece un caso extremo de herencia epigenetica, donde el agente infeccioso es una proteina que puede adoptar multiples conformaciones, cada una con propiedad de automoldeado. Es posible que esa propiedad participe en el estado de segregacion de Ia protefna. 840


IE

Resumen

La formacion de Ia heterocromatina ocurre por protefnas qu e se unen a regiones cromosomicas especfficas (como los telomeros ) y que interactuan con las histonas. La formacion de una estructura inactiva puede propagarse a lo largo de Ia hebra de cromatina desde un centro de iniciacion. Ocurren episodios similares en el silenciamiento de loci de tipo de apareamiento inactivos en levaduras. Las estructuras represivas que se requieren para mantener los estados inactivos de genes particulares son formadas por el complejo de protefna Pe-G en el genero Drosophila. Comparten con Ia heterocromatin a Ia propiedad de propagarse a partir de un centro de iniciacion. La formacion de heterocromatina puede iniciarse en ciertos sitios y despues propagarse por una distancia que no esta determin ada con precision. Cuando se ha establecido un estado heterocromatico, se hereda a traves de divisiones celulares posteriores, lo que da origen a un patron de herencia epigenetica, donde dos secuencias identicas de DNA pueden vincularse con diferentes estructuras protefnicas y, por tanto, tener capacidades diversas de expresion. Esto explica Ia aparicion del efecto de posicion abigarrado en el genero Drosophila. La modificacion de las colas de histonas es un desencadenante de la reorganizacion de la cromatina. La acetilacion se vincula en general con la activacion genica. Se encuentran acetilasas de histonas en complejos de activacion, en tanto las desacetilasas de histonas se encuentran en complejos de desactivacion . La metilacion de histonas se vincula con la desactivacion genica. Algunas modificaciones de histonas pueden ser exclusivas o sinergicas con otras. La cromatina inactiva en tel6meros de levaduras y loci de tipo de apareamiento silente parecen tener una causa comun, que comprende Ia interaccion de ciertas protefnas con las colas terminates N de las histonas H3 y H4. La formacion del complejo inactivo puede iniciarse por Ia union de una protefna a una secuencia especffica del DNA; los otros componentes pueden entonces polimerizarse en forma colaboradora a lo largo del cromosoma. La desactivacion de un cromosoma X en las hembras de mamfferos (euterias) ocurre en forma aleatoria. El locus Xic es necesario y suficiente para contar el numero de cromosomas X. La regia n -1 asegura que se desactiven todos los cromosomas X, excepto uno. Xic contiene el gen Xist que codifica un RNA que se expresa solo en el cromosoma X inactivo. La estabilizacion de Xist del RNA es el mecanismo por el que se distingue el cromosoma X inactivo.

La metilaci6n del DNA se hereda de manera epigenetica. La replicaci6n del DNA crea productos hemimetilados y una metilasa de mantenirniento restablece el estado de metilaci6n completo. Algunos episodios de metilaci6n dependen del origen parental. Espermatozoides y oocitos contienen patrones diferentes y especfficos de metilaci6n, con el resultado de que los alelos maternos y paternos se expresan de manera diferente en el embri6n, lo que causa la impresi6n donde un alelo no metilado heredado de un progenitor es esencial porque es el {mico alelo activo, el alelo heredado del otro progenitor es silente. Los patrones de metilaci6n se restablecen durante la formaci6n de gametos en cada generaci6n. Los priones son agentes infecciosos proteinaceos que ocasionan Ia enfermedad de encefalopatfa espongiforme ovina y padecimientos relacionados en los seres humanos. El agente infeccioso es una variante de una protefna celular normal. La forma Prrsc tiene una conformaci6n alterada de automoldeado: la forma normaL PrPc, no adopta por lo general esa conformaci6n, pero sf Io hace en presencia de PrP5<. Un efecto similar se encarga de Ia herencia del elemento [PSI] en las levaduras.

Referencias

EIIJ

La heterocromatina se propaga a partir de un episodio de nucleaci6n

Artkulo de investigaci6n Ahmad, K. and Henikoff, S. (2001). Modulation of a transcription factor counteracts heterochromatic gene silencing in Drosophila. Ce/1 104, 839- 847.

IIIJ

La heterocromatina depende de interacciones con las histonas

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