Fta 2u6g5o

CATEDRA: VIROLOGIA TEMA:EXTRACCION DE ADN Y PCR

CONTENIDO Generalidades sobre el ADN Muestras para extracción del ADN

Condiciones sobre la remisión de muestras. Métodos de extracción del ADN

EL MATERIAL GENÉTICO

CROMOSOMAS 46 CROMOSOMAS 23 PARES DIPLOIDES UN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE

EL MATERIAL GENÉTICO Es el responsable de transmitir caracteres heredados de una generación a otra.

los

Está conformado por millones de unidades de nucleótidos

Cada nucleótido esta a su vez formado por: Base nitrogenada, Azúcar y grupo fosfato

EL MATERIAL GENETICO BASES NITROGENADAS ADENINA

BN BN BN

BN

GUANINA

BN P A

BN

P

A

CITOSINA TIMINA

BN

P A

MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN

Sangre Semen Saliva Cabello Hueso Diente Tejido

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN 



PROTECCION DEL PERSONAL

Prevenir o directo Condiciones de asepsia Vacunación

PROTECCION DE LA MUESTR A CONTAMINACION POR

MATERIAL HUMANO.



MICROORGANISMOS

CONTAMINACION MICROBIOLOGICA

BIOLOGICO CAUSADA POR

LA TEMPERATURA LA HUMEDAD

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN  CONTAMINACIÒN QUÌMICA TECNICA

PRODUCTOS QUIMICOS QUE PUEDEN ALTERAL LA DEL PCR

 TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS

PUEDE OCUSACIONAR LA PERDIDA DE LA MUESTRA

METEOROLÓGICOS

FENÓMENOS

 DEGRADACION DE LAS MUESTRAS INSECTOS

HUMEDAD AMBIENTAL ACCIÓN DE

 Detección de mutaciones

Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

Secuenciación de ADNs fósiles

Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría están dañadas o degradadas)

Diagnóstico de enfermedades genéticas

Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de fecundación in vitro

Identificación de especies y control de cruces entre animales Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

Secuenciación de genomas

Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

Obtención de proteínas de interés médico, comercial, etc...

(insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulación antes se obtenían a partir de los tejidos que las producen o fluidos corporales)

Obtención de vacunas recombinantes

(aternativa al uso de organismos patógenos inactivos) Extracción del ADN del virus

Integración del plásmido híbrido en el núcleo de una célula de levadura

ADN plásmido bacteriano

La levadura fabrica las proteínas víricas con poder inmunológico

Inyección de proteínas víricas en un chimpancé

Diagnóstico de enfermedades de origen genético

Mediante ingeniería genética se construye una sonda de ADN, marcada (marcaje fluorescente), con la secuencia complementaria del ADN enfermo

ADN sano ADN enfermo Conocimiento previo de la secuencia de ADN enfermo

Biochip Microarray DNAchip

ADN complementario del ADN enfermo DIAGNÓSTICO

Si aparecen bandas fluorescentes demuestra que la persona presenta la anomalía ¿Hibridación? Renaturalización ¿No hibridación? del ADN con la sonda fluorescente

Desnatura lización del ADN

ADN de la persona que se quiere diagnosticar

EXTRACCION DE ADN • • • • •

ORGANICA CHELEX PAPEL FTA SALTING OUT Pueden depender en – Protocolos de LAB – Tipo de muestra

Preparación de Muestra • Extracción de ADN Orgánica

• Extracción por Chelex • Extracción de ADN utilizando papel FTA

EXTRACCION ORGANICA DE ADN • PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI) – PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR – CONSUME MUCHO TIEMPO – QUIMICOS PELIGROSOS – MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles errores)

EXTRACCION ORGANICA DE ADN • COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO • AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K – ROMPE LAS CELULAS (SDS) – ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)

• AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y lípidos – Particiona macromoléculas basado en propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas – Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol – Alcohol Isoamyl disminuye la espuma

– ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA

FENOL CLOROFORMO • • • •

-

VENTAJAS Técnica Orgánica (Solventes) ADN de muy buena calidad y cantidad. Peptidos y proteinas son extraidas en la fase organica (Fenol), después se realiza digestión con proteinasa K. El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado. DESVENTAJAS: Reactivos altamente tóxicos Perdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.

EXTRACCION POR CHELEX • RESINA QUELANTE

• REMUEVE MAGNESIO • (INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)

• ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA CELULA • UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)

EXTRACCION POR CHELEX • AÑADA MUESTRA AL TUBO • AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE CHELEX • 100°C PARA ROMPER CELULAS – DESTRUIR PROTEINAS

• ADN ES DESNATURALIZADO A CADENAS SENCILLAS • UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE EN PCR

CHELEX VENTAJAS • Técnica inorgánica • Previene la degradación del ADN por quelación de los iones metálicos durante la ebullición al 5%. • Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- inones iminodiacetato. • los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN. DESVENTAJAS: • El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no en RFLPS.

Podemos obtener diferentes muestras de ADN humano para su extracción, aislamiento y purificación, con el objetivo de ser empleado en diferentes estudios de carácter genético, biológico. y/o bioquímico.

EXTRACCION CON PAPEL FTA™  PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA  CONTIENE QUIMICOS  PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO

 ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS  UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS

Tecnología FTA®  Rompe células y membranas de organelos -Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN)

 Preserva y Proteje Acidos Nucleicos -Previene Daño por radicales libres/UV -Previene Daño Enzimático -Inhibe crecimiento de hongos y bacterias

 Provee Seguridad al -Inactiva Potenciales Viruses Peligrosos

CARACTERISTICAS Y VENTAJAS

EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™  CUANTIFICACIÓN NO es necesaria  Cantidad de muestra consistente  Resultados consistentes

 Posible AUTOMATIZACIÓN

SALTING-OUT • Técnica de tipo inorgánica • Utiliza reactivos bajos en toxicidad • Permite visualizar la malla del ADN.

Toma de muestra • Colectar 0,5 mL de sangre periférica en un tubo de 1,5 mL estéril conteniendo 20 μl de EDTA 5.6 %.Agitar bien por inversión fuerte para garantizar homogenización. • Conservar en refrigeración hasta su procesamiento, el cual deberá realizarse en un plazo no mayor de 48 horas después de haberse realizado la toma de muestra. No congelar en este estado, pues se produce la lisis de las células nucleadas.

SALTING OUT 1. Lisis Celular 2. Extracción 3. Precipitación 4. Resuspensión

LISIS CELULAR • •

Buffer de lisis I: (lisis glóbulos rojos). Sucrosa MgCl2 1M Triton x 100 Buffer de lisis II: (lisis glóbulos blancos) EDTA de Na NaCL.

EXTRACCION • Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinas • Perclorato de sodio 5M • NaCl 6M

PRECIPITACION • Isopropanol

• Etanol al 70% lava el exceso de sales.

RESUSPENSION • Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o también se puede realizar en agua.

CONCLUSIONES • El ADN es el material genético a través del cual se transmite la información contenida en los genes de generación en generación. • El ADN esta presente en los indicios biológicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc. • Es muy importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras. • El Salting-out es uno de los métodos de extracción de ADN mas utilizados por su fácil implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN.

TIPOS DE PCR

TIPOS DE PCR

Anidada

In situ

Transcriptasa inversa

Tiempo real

Multiplex

PCR anidada • Comprende dos rondas de amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad de detección. • Primero se realiza una reacción con los iniciadores externos para amplificar una región de ADN mas extensa, que contiene el segmento diana. Después, con este producto de amplificación, se ejecuta una segunda PCR con los iniciadores internos para amplificar la región específica. • Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La desventaja de ésta técnica es que no nos permite cuantificar la muestra.

PCR in situ • para la PCR in situ incluyen la fijación y la permeabilización durante la preparación de la muestra, un mecanismo para ciclación y el material celular en la solución o en laminillas de cristal • Antes de llevar a cabo la PCR in situ, las células o las muestras del tejido fino son fijadas y permeabilizadas para preservar la morfología y permitir el de los reactivos de PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. • La amplificación de PCR de las secuencias blanco se realiza después en las células intactas en tubos microEppendorf o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillas de cristal

RT-PCR • Es un método sensible para la detección de los niveles de expresión del ARNm. • Tradicionalmente la RT-PCR de dos pasos: la reacción de RT y la amplificación por PCR.

ARN es la primera transcripción inversa en cDNA utilizando una transcriptasa inversa El cDNA resultante se usa como plantillas para su posterior amplificación por PCR utilizando primers específicos para uno o más genes.

PCR en tiempo real

• Es una variante de (PCR) utilizada para amplificar y cuantificar el producto de la amplificación de ADN. • Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.

Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que también se le denomina PCR en tiempo real.

PCR multiplex • PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. • Consiste en combinar en una única reacción todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes.

• Se amplifica mas de una secuencia blanco, que se logra agregando en la reaacion mas de un par de primers. • Ahorra tiempo y esfuerzo