Fijacion De Tejidos. Bancroft 15255m

La fijación apropiada de los tejidos para el examen histológico es extremadamente importante. Sin prestar atención a este proceso, la gama de pruebas realizadas en un moderno laboratorio de histopatología se volverá ineficaz y prácticamente inútil. El concepto de fijación de los tejidos biológicos para comprender la función y estructura biológicas ha llevado al desarrollo de muchos tipos de fijadores durante el último siglo. Los mecanismos y principios por los cuales los fijadores específicos actúan para endurecer y preservar tejidos y prevenir la pérdida de moléculas específicas caen en categorías amplias. Estos incluyen la adición covalente de grupos reactivos y de enlaces cruzados, deshidratación y los efectos de ácidos, formación de sal y calor, junto con combinaciones de estas acciones. Los fijadores compuestos pueden funcionar a través de varios de estos mecanismos. Aunque cada fijador tiene ventajas, todos tienen muchas desventajas. Estos incluyen la pérdida molecular de los tejidos 'fijos', la hinchazón o retracción de los tejidos durante el proceso, las variaciones en la calidad de la tinción histoquímica e inmunohistoquímica, la capacidad de realizar análisis bioquímicos con precisión y capacidades variables para mantener las estructuras de organelos celulares. Uno de los principales problemas con la fijación con formaldehído ha sido la pérdida de la identificación inmunológica del antígeno debido a ese tipo de fijación combinado con el procesamiento del tejido a la cera de parafina (Eltoum et al., 2001a, 2001b). Sin embargo, desde una perspectiva clínica, el advenimiento de métodos de recuperación de epítopos inducidos por calor, instigados a principios de los 90, han superado muchas de estas limitaciones (Shi et al., 1991). Análogamente, el análisis de ARNm y ADN de tejido embebido en parafina fijado con formalina ha sido problemático (Grizzle et al., 2001, Jewell et al., 2002, Stek et al., 2006, Lykidis et al. Todos los fijadores ampliamente utilizados se seleccionan mediante compromiso; Sus buenos aspectos son equilibrados Contra características menos deseables. Este capítulo discute los fundamentos de la fijación, las ventajas y desventajas de los fijadores específicos, y proporciona algunas de las fórmulas para fijadores específicos actualmente utilizados en patología, histología y anatomía. El principal objetivo de la fijación en patología es mantener características morfológicas claras y consistentes (Eltoum et al., 2001a, 2001b, Grizzle et al., 2001). El desarrollo de fijadores específicos usualmente ha sido empírico y gran parte de la comprensión de los mecanismos de fijación se ha basado en la información obtenida del curtido de cuero y la producción de vacunas. Para visualizar la microanatomía de un tejido, sus secciones teñidas deben mantener las relaciones microscópicas originales entre las células, los componentes celulares (por ejemplo, el citoplasma y los núcleos) y el material extracelular con poca interrupción de la organización del tejido, y deben mantener el tejido Composición química local. Muchos componentes tisulares son solubles en ambientes acuosos ácidos u otros líquidos, y una visión fiable de la microanatomía y microambiente de estos tejidos requiere que los componentes solubles no se pierdan durante la fijación y el procesamiento de tejidos.

Minimizar la pérdida de componentes celulares, incluyendo proteínas, péptidos, ARNm, ADN y lípidos, previene la destrucción de estructuras macromoleculares tales como membranas citoplasmáticas, retículo endoplásmico liso, retículo endoplasmático rugoso, membranas nucleares, lisosomas y mitocondrias. Cada fijador, combinado con el protocolo de procesamiento de tejidos, mantiene algunos aspectos moleculares y macromoleculares del tejido mejor que otras combinaciones de fijación / procesamiento. Por ejemplo, si se pierden componentes solubles a partir del citoplasma de las células, se reducirá o modificará el color del citoplasma sobre la tinción de hematoxilina y eosina (H & E) y aspectos de la apariencia de la microanatomía del tejido, p. Mitocondrias, se perderán o dañarán. De forma similar, las evaluaciones inmunohistoquímicas de estructura y función pueden ser reducidas o perdidas. Casi cualquier método de fijación induce retracción / hinchamiento, endurecimiento de tejidos y variaciones de color en diversas manchas histoquímicas (Sheehan y Hrapchak 1980, Horobin 1982, Fox et al., 1985, Carson 1990, Kiernan 1999, O'Leary & Mason 2004). Varios métodos de fijación producen siempre algunos artefactos en la aparición del tejido en la tinción; Sin embargo, para la patología diagnóstica es importante que tales artefactos sean consistentes. El fijador actúa minimizando la pérdida o destrucción enzimática de moléculas celulares y extracelulares, manteniendo las estructuras macromoleculares y protegiendo los tejidos de la destrucción por microorganismos. Esto da como resultado una vista de un tejido viable dinámicamente cambiante (Grizzle et al., 2001). Un fijador también debe evitar la descomposición subsiguiente del tejido o características moleculares por actividad enzimática y / o por microorganismos durante el almacenamiento a largo plazo, porque los tejidos diagnósticos / terapéuticos retirados de los pacientes son recursos importantes que pueden ser re-analizados en el futuro. Un fijador no sólo interactúa inicialmente con el tejido en su entorno acuoso, sino también, posteriormente, el fijador sin reaccionar y las modificaciones químicas inducidas por el fijador continúan reaccionando. La fijación interactúa con todas las fases de procesamiento y tinción desde la deshidratación hasta la tinción de las secciones de tejido utilizando tinciones histoquímicas, enzimáticas o inmunohistoquímicas (Eltoum et al., 2001b, Rait et al., 2004). Una sección de tejido manchada producida después de la fijación específica combinada con el procesamiento de tejido produce un compromiso en la imagen que se forma de una o más características del tejido vivo original. Hasta la fecha, no se ha identificado un fijador universal o ideal. Por lo tanto, los fijadores se seleccionan basándose en su capacidad para producir un producto final necesario para demostrar una característica específica de un tejido específico (Grizzle et al., 2001). En patología diagnóstica, el fijador de elección para la mayoría de los patólogos ha sido 10% de formalina tamponada neutra (Grizzle et al., 2001).

La característica más importante de un fijador es apoyar la tinción de alta calidad y consistente con H & E, tanto inicialmente como después del almacenamiento de los bloques de parafina durante al menos una década. El fijador debe tener la capacidad de prevenir la destrucción a corto y largo plazo

De la microarquitectura del tejido interrumpiendo la actividad de las enzimas catabólicas y, por tanto, la autolisis, minimizando la difusión de moléculas solubles desde sus localizaciones originales. Otra característica importante de un buen fijador, que ayuda a mantener la integridad celular y tisular, es la inanimación de agentes infecciosos, que ayuda a mantener Tejido y integridad celular. También es importante contar con buenos perfiles toxicológicos y de inflamabilidad que permitan el uso seguro del fijador (Grizzle & Fredenburgh 2005). El advenimiento de nuevos métodos biológicos, la mayor comprensión del genoma humano y la necesidad de evaluar rápidamente la biología de los procesos de la enfermedad, significa que los fijadores también deben permitir la recuperación de macromoléculas incluyendo Proteínas, ARNm y ADN sin modificaciones bioquímicas extensivas a partir de tejidos fijos y embebidos en parafina.

Otras características importantes de un fijador ideal incluyen ser útiles para una amplia variedad de tejidos, incluyendo tejidos grasos, linfoides y neurales. Debe conservar ejemplares pequeños y grandes y apoyar la producción histoquímica, inmunohistoquímica, Hibridación in situ y otros procedimientos especializados. Debe penetrar y fijar los tejidos rápidamente, tener una vida útil de al menos un año y ser compatible con los procesadores automatizados de tejidos modernos. El fijador debe ser fácilmente desechable o reciclable y apoyar el almacenamiento de tejidos a largo plazo dando excelente microtomía de bloques de parafina, y debe ser rentable Tipos de fijadores:

Fijadores coagulantes Tanto las soluciones orgánicas como las no orgánicas pueden coagular las proteínas, haciéndolas insolubles. La arquitectura celular se mantiene principalmente por las lipoproteínas y por las proteínas fibrosas tales como el colágeno; La coagulación de tales proteínas mantiene histomorfología de tejido a nivel microscópico de luz. Desgraciadamente, debido a que los fijadores coagulantes dan como resultado una floculación citoplásmica así como una pobre preservación de las mitocondrias y de los gránulos secretores, tales fijadores no son útiles en el análisis ultraestructural. Fijadores coagulantes deshidratados Los fijadores coagulantes más comúnmente usados son alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol) y acetona. El metanol está más cerca de la estructura del agua que el etanol. Por lo tanto, el etanol compite más fuertemente que el metanol en la interacción con las moléculas de las áreas hidrofóbicas; Por lo tanto, la fijación del coagulante comienza en una concentración del 50-60% para el etanol pero requiere una concentración de 80% o más para el metanol (Lillie y Fullmer 1976). La eliminación y el reemplazo de agua libre de tejido por cualquiera de estos agentes tiene varios efectos potenciales sobre las proteínas dentro del tejido. Las moléculas de agua rodean las

áreas hidrofóbicas de las proteínas y, por repulsión, forzan a los grupos químicos hidrófobos a un o más estrecho entre sí y, por lo tanto, estabilizan la unión hidrofóbica. Al eliminar el agua, el principio opuesto debilita la unión hidrófoba. De manera similar, las moléculas de agua participan en el enlace de hidrógeno en áreas hidrofílicas de proteínas; Por lo que la eliminación del agua desestabiliza esta unión de hidrógeno. Juntos, estos cambios actúan para alterar la estructura terciaria de las proteínas. Además, con el agua eliminada, la estructura de la proteína puede volverse parcialmente invertida, con grupos hidrófobos moviéndose hacia la superficie exterior de la proteína. Una vez que se ha modificado la estructura terciaria de una proteína soluble, la velocidad de inversión a un estado soluble más ordenado es lenta y la mayoría de las proteínas después de la coagulación permanecen insolubles incluso si se devuelven a un medio acuoso. La interrupción de la estructura terciaria de las proteínas, es decir, la desnaturalización, cambia sus propiedades físicas, causando potencialmente insolubilidad y pérdida de función. Aunque la mayoría de las proteínas se vuelven menos solubles en ambientes orgánicos, se puede perder hasta un 13% de proteína, por ejemplo con fijación de acetona (Horobin 1982). Los factores que influyen en la solubilidad de las macromoléculas incluyen: 1. Temperatura, presión y pH. 2. Fuerza iónica del soluto. 3. La constante de salazón, que expresa la contribución de la electrostática Interacciones. 4. Las interacciones de salazón y salazón. 5. El (los) tipo (s) de reactivo (s) desnaturalizantes (Herskovits et al., 1970, Horobin, 1982, Papanikolau & Kokkinidis 1997, Bhakuni 1998). El alcohol desnaturaliza la proteína de forma diferente, dependiendo de la elección y concentración de alcohol, la presencia de sustancias orgánicas y no orgánicas, y el pH y la temperatura de fijación. Por ejemplo, el etanol desnaturaliza proteínas> fenoles> agua y alcoholes polihídricos> ácidos monocarboxílicos> ácidos dicarboxílicos (Bhakuni 1998). Otros tipos de fijador coagulante Los coagulantes ácidos tales como ácido picrico y ácido tricloroaceti cambian las cargas sobre las cadenas laterales ionizables, p. gramo. (-NH2 → NH3 +) y (COO- → COOH), de las proteínas y rompen las conexiones electrostáticas y de hidrógeno. Estos ácidos también pueden insertar un anión lipofílico en una región hidrófila y por lo tanto interrumpir las estructuras terciarias de las proteínas (Horobin 1982). El ácido acético coagula ácidos nucleicos pero no fija o precipita proteínas; Por lo tanto se añade a otros fijadores para evitar la pérdida de ácidos nucleicos. El ácido tricloroacético (Cl3CCOOH) puede penetrar en dominios hidrófobos de proteínas y el anión producido (-C-COO-) reacciona con grupos amina cargada. Esta interacción precipita proteínas y extrae ácidos nucleicos. El ácido pícrico o trinitrofenol se disuelve ligeramente en agua para formar una solución de ácido débil (pH 2,0). En las reacciones, forma sales con grupos básicos de proteínas, haciendo que las proteínas coagulen. Si la solución se neutraliza, la proteína precipitada puede redisolverse. La fijación de ácido pícrico produce una tinción más brillante, pero las soluciones de bajo pH del ácido pícrico pueden causar hidrólisis y pérdida de ácidos nucleicos.

Fijadores de reticulación no coagulantes Se seleccionaron varios productos químicos como fijadores secundarios a sus acciones potenciales de formación de enlaces cruzados dentro y entre proteínas y ácidos nucleicos, así como entre ácidos nucleicos y proteínas. La reticulación puede no ser un mecanismo importante en los tiempos cortos actuales de fijación, y por lo tanto "fijadores aditivos covalentes" puede ser un mejor nombre para este grupo. Los ejemplos incluyen formaldehído, glutaraldehído y otros aldehídos, p. Hidrato de cloral y glioxal, sales metálicas tales como mercurio y cloruro de zinc, y otros compuestos metálicos tales como tetróxido de osmio. Los grupos aldehído son reactivos químicamente y biológicamente y son responsables de muchas reacciones histoquímicas, p. Los grupos aldehído libres pueden ser responsables de las reacciones de argentafina (Papanikolau & Kokkinidis 1997). La fijación del formaldehído El formaldehído en su forma amortiguada neutra al 10% (NBF) es el fijador más común utilizado en la patología diagnóstica. El formaldehído puro es un vapor que, cuando está completamente disuelto en agua, forma una solución que contiene 37-40% de formaldehído; Esta solución acuosa se conoce como "formalina". El habitual "10% formalina" utilizado en la fijación de los tejidos es una solución al 10% de formalina; Es decir, contiene aproximadamente un 4% en peso a volumen de formaldehído. Las reacciones del formaldehído con las macromoléculas son numerosas y complejas. Fraenkel-Conrat y sus colegas, utilizando la química simple, identificaron meticulosamente la mayoría de las reacciones del formaldehído con aminoácidos y proteínas (Fraenkel-Conrat & Olcott 1948a, Fraenkel-Conrat y Mecham 1949). En una solución acuosa, el formaldehído forma hidrato de metileno, un metilenglicol como primer paso en la fijación (Singer 1962). H2C = O+H2O  HOCH2OH El hidrato de metileno reacciona con varias cadenas laterales de proteínas para formar grupos laterales hidroximetilo reactivos (-CH2-OH). Si se utilizan tiempos de fijación relativamente cortos con formalina tamponada neutra al 10% (horas a días), la formación de cadenas laterales de hidroximetilo es probablemente la reacción primaria y característica. La formación de enlaces cruzados reales puede ser relativamente rara en los tiempos de fijación relativamente cortos utilizados actualmente. El formaldehído también reacciona con proteínas nucleares y ácidos nucleicos (Kok & Boon 2003; Leong 2005). Penetra entre los ácidos nucleicos y las proteínas y estabiliza la capa ácido nucleicoproteína, y también modifica los nucleótidos reaccionando con grupos amino libres, como lo hace con las proteínas. En el ADN desnudo y libre, se cree que las reacciones de entrecruzamiento comienzan en regiones ricas en adenina-timidina (AT) y aumenta la reticulación con el aumento de la temperatura (McGhee y von Hippel 1975a, 1975b, 1977a, 1977b). El formaldehído reacciona con los enlaces C = C y -SH en los lípidos no saturados, pero no interactúa con los carbohidratos (French & Edsall 1945, Hayat 1981).

Las cadenas laterales de los péptidos o proteínas que son más reactivos con el hidrato de metileno y, por tanto, tienen la afinidad más alta para el formaldehído, incluyen lisina, cisteína, histidina, arginina, tirosina y grupos hidroxilo reactivos de serina y treonina (véase Tabla 4.1) & Feeney 1995). Gustavson (1956) informó que uno de los enlaces cruzados más importantes en la "sobre fijación", es decir, en curtido, es el que existe entre la lisina y el grupo amida del esqueleto proteico. Debido a los tiempos de fijación más cortos de las aplicaciones patológicas y biológicas actuales de diagnóstico, es improbable que se produzcan reacciones de reticulación con la cadena principal de la proteína Reversibilidad de las reacciones formaldehidemacromoleculares Los grupos reactivos pueden combinarse con grupos hidrógeno o entre sí, formando puentes metilénicos. Si el formalina se elimina, los grupos reactivos pueden volver rápidamente a sus estados originales, pero cualquier puente que ya ha ocurrido puede permanecer. El lavado durante 24 horas elimina aproximadamente la mitad de los grupos reactivos, y 4 semanas de lavado elimina hasta 90% (Helander 1994). Esto sugiere que la reticulación real es un proceso relativamente lento, por lo que, en la fijación rápida utilizada en la patología diagnóstica, la mayoría de la "fijación" con formaldehído antes del procesamiento de tejidos se detiene con la formación de grupos hidroximetilo reactivos. Para el almacenamiento a largo plazo en formalina, los grupos reactivos pueden oxidarse a los grupos más estables (por ejemplo, ácidos -NH-COOH) que no se eliminan fácilmente lavando en agua o alcohol. Por lo tanto, después de la fijación, el retorno de la muestra a agua o alcohol reduce aún más la fijación de la muestra, porque los grupos reactivos producidos por la reacción inicial con formalina pueden revertirse y ser eliminados. Aunque inicialmente se pensó que la reticulación era más importante en la fijación de tejido para usos biológicos (basado en el número limitado de reticulaciones durante cortos periodos de fijación), es probable que la formación de estos grupos hidroximetilo desnaturaliza y macula las macromoléculas insoluble. Como estos experimentos de lavado no han sido reproducidos, los mecanismos reales y su importancia para la fijación por formaldehído son inciertos. Además del simple lavado bajo agua corriente, la sobrefixación del tejido se puede corregir parcialmente remojando el tejido en amoníaco concentrado más 20% de hidrato de cloral (Lhotka & Ferreira 1949). Fraenkel-Conrat y sus colegas observaron frecuentemente que las reacciones de adición y condensación del formaldehído con aminoácidos y proteínas eran inestables y podían revertirse fácilmente por dilución o diálisis (Fraenkel-Conrat et al., 1945, 1947, Fraenkel-Conrat y Olcott 1948a, 1948b, Fraenkel-Conrat y Mecham 1949). Se cree que el tipo principal de reticulación en la fijación a corto plazo está entre el grupo hidroximetilo en una cadena lateral de lisina y arginina (a través de grupos amino secundarios), asparagina, glutamina (a través de grupos amida secundarios) o tirosina (A través del grupo hidroxilo) (Tome et al., 1990). Por ejemplo, un grupo lisina metil hidroxil amina puede reaccionar con un grupo arginina para formar una reticulación lisina-CH2-arginina; De manera similar, un grupo tirosina metil hidroxil amina puede unirse con un grupo cisteína para formar un enlace cruzado tirosina-CH2-cisteína. Cada una de estas reticulaciones entre macromoléculas tiene un grado de estabilidad diferente, que puede ser modificado por la

temperatura, el pH y el tipo de ambiente que rodea y permea el tejido (Eltoum et al., 2001b). El tiempo de saturación de tejidos humanos y animales con grupos activos por formalina es de aproximadamente 24 horas, pero la reticulación puede continuar durante muchas semanas (Helander 1994). Cuando el formaldehıdo se disuelve en una solución acuosa no tamponada, forma una solución ácida (pH 5,0-5,5) porque 5-10% del formaldehıdo comercialmente disponible es ácido fórmico. La formalina ácida puede reaccionar más lentamente con proteínas que la NBF, ya que la amina (Por ejemplo, -N + H _ {3}). En solución, esto requiere un pH mucho más bajo que 5,5. Sin embargo, el requisito de un pH más bajo para producir grupos -N + H3 puede no ser equivalente al requerido en péptidos. La formalina ácida también preserva la inmunorecognición Mucho mejor que el NBF (Arnold et al., 1996) y, de hecho, el éxito de Taylor en los primeros días de inmunocitoquímica para demostrar inmunoglobulinas en secciones de tejidos procesados con parafina, probablemente se basó en la fijación de los tejidos en formalina ácida , 1974). La desventaja de usar formalina ácida para la fijación es la formación de un pigmento negro-marrón con hemoglobulina degradada. Este pigmento relacionado con heme, que No suele ser un gran problema a menos que los pacientes tengan una anormalidad en la sangre (por ejemplo, enfermedad de células falciformes, malaria). El formaldehído preserva principalmente los enlaces peptídicos proteínicos y la estructura general de los organelos celulares. Puede interactuar con ácidos nucleicos pero tiene poco efecto sobre los carbohidratos y conserva los lípidos si las soluciones contienen calcio (Bayliss High & Lake 1996).

Fijación de glutaraldehído Se sabe menos sobre las reacciones y efectos biológicos del glutaraldehído en comparación con el formaldehído, ya que no se ha utilizado tan ampliamente en aplicaciones biológicas. El glutaraldehído es un aldehído bifuncional que probablemente se combina con los mismos grupos reactivos que el formaldehído. En soluciones acuosas el glutaraldehído se polimeriza, formando compuestos cíclicos y oligoméricos (Hopwood 1985), y también se oxida a ácido glutárico. Para ayudar en la estabilidad, se requiere almacenamiento a 4 ° C ya un pH de alrededor de 5 (Hopwood 1969). A diferencia del formaldehído, el glutaraldehído tiene un grupo aldehído en ambos extremos de la molécula. Con cada reacción del primer grupo, se puede introducir un grupo aldehído que no ha reaccionado en la proteína y estos grupos aldehído pueden actuar para reticular más la proteína. Alternativamente, los grupos aldehído pueden reaccionar con una amplia gama de otros objetivos histoquímicos, incluyendo anticuerpos, enzimas o proteínas. La reacción del glutaraldehído con una proteína aislada, tal como la albúmina de suero bovino, es más rápida a pH 6-7, y es más rápida (Habeeb 1966), y resulta en más reticulación que el formaldehído (Habeeb 1966, Hopwood 1969). La reticulación es irreversible y soporta ácidos, urea, semicarbazida y calor (Hayat 1981). Al igual que el formaldehído, las reacciones con la lisina son las más importantes para formar enlaces cruzados.

El reticulado extensivo por el glutaraldehído da lugar a una mejor preservación de la ultraestructura, pero este método de fijación afecta negativamente a los métodos inmunohistoquímicos y retarda la penetración por el fijador. Por lo tanto, cualquier tejido fijado en glutaraldehído debe ser pequeño (0,5 mm como máximo) y, a menos que los grupos aldehídos estén bloqueados, se producirá una tinción de fondo mayor si se utilizan varios métodos histoquímicos (Grizzle 1996a). El glutaraldehído no reacciona con carbohidratos o lípidos a menos que contengan grupos amino libres como se encuentran en algunos fosfolípidos (Hayat 1981). A temperatura ambiente El glutaraldehído no reticula los ácidos nucleicos en ausencia de nucleohistonas, pero puede reaccionar con ácidos nucleicos igual o superior a 45 ° C (Hayat 1981).

Fijación de tetróxido de osmio El tetróxido de osmio (OsO4), un sólido tóxico, es soluble en agua así como disolventes no polares y puede reaccionar con sitios hidrófilos e hidrófobos que incluyen las cadenas laterales de las proteínas, pudiendo causar reticulación (Hopwood et al., 1990). Los sitios reactivos Incluyen grupos sulfidrilo, disulfuro, fenólico, hidroxilo, carboxilo, amida y heterocíclicos. Se sabe que el tetróxido de osmio interacciona con ácidos nucleicos, específicamente con el resto 2,3glicol en los grupos ribosa terminales y los 5,6 enlaces dobles de los residuos timina. Los núcleos fijados en OsO4 y deshidratados con alcohol pueden mostrar un agrupamiento prominente de ADN. Este artefacto inaceptable puede evitarse prefijando el permanganato de potasio (KMnO4), postfijación con acetato de uranilo o añadiendo iones de calcio y triptófano durante la fijación (Hayat 1981). La reacción de OsO4 con los carbohidratos es incierta (Hayat 1981). Grandes proporciones de proteínas y carbohidratos se pierden de los tejidos durante la fijación de osmio; Algo de esto puede deberse a la penetración superficial limitada de OsO4 (es decir, <1 mm) en los tejidos oa sus lentas tasas de reacción. En electrones Microscopía, esta pérdida se minimiza mediante la fijación inicial del tejido en el glutaraldehído. La reacción mejor caracterizada del ósmio es su reacción con enlaces insaturados dentro de lípidos y fosfolípidos. En esta reacción, el osmio en su estado de valencia +8 se convierte en un estado de valencia +6, que es incoloro. Si dos enlaces insaturados están próximos entre sí puede haber reticulación por OsO4. Aunque el complejo es incoloro en este punto, la tinción negra típica de membranas que se espera de la fijación con osmio requiere la producción de dióxido de osmio (OsO2 · 2H2O). El dióxido de osmio es negro, denso en electrones e insoluble en solución acuosa; Precipita cuando los compuestos inestables anteriores se descomponen y se depositan sobre las membranas celulares. La descomposición de los complejos de valencia ósmio +6 a dióxido de osmio (estado de valencia +4) se facilita mediante una reacción con disoluciones de etanol. Además de su uso como un fijador secundario para los exámenes de microscopio electrónico, OsO4 también se puede utilizar para teñir los lípidos en las secciones congeladas. La fijación del tetróxido de osmio causa hinchamiento del tejido que se invierte durante las etapas de deshidratación. La hinchazón también se puede minimizar añadiendo cloruro de calcio o sodio a fijadores que contienen osmio (Hayat 1981).

Fijadores de reticulación para microscopía electrónica Los organelos celulares tales como las membranas citoplasmáticas y nucleares, las mitocondrias, los gránulos secretores ligados a la membrana y el retículo endoplásmico liso y rugoso necesitan conservarse cuidadosamente para la microscopía electrónica. Los lípidos en estas estructuras son extraídos por muchos fijadores con deshidratantes (por ejemplo, alcoholes). Por lo tanto, para el examen ultraestructural es importante utilizar un fijador que no solubilice los lípidos. Los fijadores preferidos son un fijador de reticulación fuerte, tal como glutaraldehído, una combinación de glutaraldehído y formaldehído, o Millonig modificado de Carson, seguido de fijación posterior en un agente que estabiliza adicionalmente, así como enfatiza las membranas tales como OsO4.

Cloruro de mercurio Históricamente, el cloruro mercúrico era muy favorecido por sus cualidades de mejorar las propiedades de tinción de los tejidos, particularmente para las manchas tricrómicas. Sin embargo, actualmente se utiliza poco en el laboratorio clínico debido a las cuestiones de salud y seguridad relacionadas con el uso de un fijador que contiene mercurio, y también debido a la dependencia reducida de las "manchas especiales". Otro inconveniente mayor de la fijación del cloruro mercúrico es la inevitable formación de depósitos de precipitados intensamente negros de pigmento mercúrico en los tejidos. Esto posteriormente les da un valor inferior para estudios inmunohistoquímicos y moleculares. En los tejidos recientemente fijados, estos precipitados se pueden eliminar fácilmente mediante un paso de yodo de Lugol en el procedimiento de tinción, seguido por el blanqueo de la sección en solución de hipoclorito de sodio (Hypo). Sin embargo, esto no es efectivo en tejidos fijados con cloruro de mercurio que han sido almacenados durante varios años como bloques de parafina. En estos tejidos, el análisis retrospectivo por inmunohistoquímica y técnicas moleculares se vuelve poco fiable debido a la formación de agregados mucho más grandes de pigmento mercúrico que no pueden ser eliminados posteriormente por el yodo de Lugol. La química de la fijación con cloruro mercúrico no se conoce bien. Sin embargo, se sabe que el cloruro mercúrico reacciona con sales de amonio, aminas, amidas, aminoácidos y grupos sulfidrilo, y endurece los tejidos. Es especialmente reactivo con cisteína, Formando un dimercaptido (Hopwood 2002) y acidificando la solución:

Si sólo está presente una cisteína, es probable un grupo reactivo de R-S-Hg-Cl. Los fijadores basados en mercurio son tóxicos y deben manejarse con cuidado. No se debe permitir que entren en o con el metal y se disuelvan en agua destilada para evitar la precipitación de sales de mercurio. Los productos químicos que contienen mercurio son un problema de eliminación ambiental. Estos fijadores penetran lentamente, por lo que los especímenes deben ser delgados, y el mercurio y los pigmentos de hemateína de formaldehído ácido pueden depositarse en el tejido después de la fijación. Los fijadores de mercurio (Hopwood 1973) ya no se utilizan rutinariamente excepto por algunos laboratorios para fijar tejidos

hematopoyéticos (especialmente B5). Un sustituto potencial del cloruro mercúrico es el sulfato de zinc. Formulaciones especiales de sulfato de zinc en formaldehído que reemplazan el cloruro mercúrico en B5 pueden dar un mejor detalle nuclear que el formaldehído solo y mejorar la penetración del tejido (Carson 1990).

Fijadores especiales Dichromato y fijación de ácido crómico El trióxido de cromo se disuelve en agua para producir una solución ácida de ácido crómico, con un pH de 0,85. El ácido crómico es un poderoso agente oxidante que produce aldehído a partir de los residuos de 1, 2-diglicol de los polisacáridos. Estos aldehídos pueden reaccionar en manchas histoquímicas (PAS y argentafina / argítrofila) y aumentar el fondo de tinción inmunohistoquímica (Grizzle 1996a). Las sales crónicas reales (es decir, iones de cromo en estado de valencia +3) pueden destruir tejidos animales (Kiernan 1999), pero los iones de cromo en sus proteínas coaguladas de estado +6 y ácidos nucleicos. Las reacciones de fijación y endurecimiento no se entienden completamente, pero probablemente implican la oxidación de proteínas, que varía en intensidad dependiendo del pH del Fijador, más la interacción de los iones de cromato reducidos directamente en las proteínas de entrecruzamiento (Pearse & Stoward 1980). Los iones de cromo interactúan específicamente con las cadenas laterales carboxilo e hidroxilo de las proteínas. El ácido crómico también interactúa con los puentes disulfuro y ataca a los residuos lipófilos como la tirosina y la metionina (Horobin 1982). Los fijadores que contienen cromato a un pH de 3,5-5,0 hacen que las proteínas sean insolubles sin coagulación. Se ha informado que el cromato produce lípidos insaturados pero no saturados insolubles tras una fijación prolongada (> 48 horas) y, por lo tanto, las mitocondrias están bien conservadas por fijadores dicromatos. Los fijadores que contienen dicromato se han utilizado principalmente para preparar tejidos neuroendocrinos para la tinción, especialmente médula suprarrenal normal y tumores relacionados (por ejemplo, feocromocitomas). Sin embargo, la dependencia de la reacción cromafina utilizada para identificar los gránulos de cromafina después de la fijación de dicromato ha disminuido considerablemente, siendo reemplazada por inmunohistoquímica a una gama de marcadores neuroendocrinos, incluyendo enolasa específica de neurona, cromagranina A y sinaptofisina (Grizzle 1996a, 1996b). Fijadores para análisis de ADN, ARN y proteínas Lykidis et al. (2007) realizaron un análisis exhaustivo de 25 compuestos fijadores, muchos de ellos reputados para proporcionar preservación mejorada de ADN y ARN y proteínas en tejidos para el análisis inmunocitoquímico, mientras que al mismo tiempo asegurar una preservación morfológica óptima. Los compuestos incluyeron los compuestos comercialmente disponibles

HOPE (fijador de HEPES-Ácido glutámico mediado por el Efecto de Protección de Solvente Orgánico) y el reticulante reversible ditio- bis [succinimidil propionato] (DSP) para inmunocitoquímica y perfiles de expresión, además de fijadores a base de cinc. Concluyeron que una nueva formación de zinc (Z7) que contenía trifluoroacetato de zinc, cloruro de zinc y acetato de calcio era significativamente mejor que el fijador estándar basado en zinc (Z2) y NBF para la perseveración de ADN, ARN y antígeno. Se detectaron fragmentos de ADN y ARN de hasta 2,4 kb y 361 pb de longitud, respectivamente, mediante PCR, PCR de transcriptasa inversa y PCR en tiempo real en los tejidos fijados Z7, además de permitir el análisis de proteínas mediante electroforesis 2D. Se encontró que los ácidos nucleicos y las proteínas eran estables durante un período de 6-14 meses. Además, el fijador es menos tóxico que las formulaciones de formaldehído. Si bien este fijador parece ser muy prometedor, debe tenerse en cuenta que la fijación en NBF también permitirá la extracción de fragmentos de tamaño similar de ADN y ARN para su análisis mediante tecnologías basadas en PCR, dentro de este marco de tiempo.

Iones metálicos como un suplemento de fijación Varios iones metálicos se han utilizado como ayudas en la fijación, incluyendo Hg2 +, Pb2 +, Co2 +, Cu2 +, Cd2 +, [UO2] 2+, [PtCl6] 2+ y Zn2 +. Mercurio, plomo y zinc se usan más comúnmente en fijadores actuales, p. Se sugiere que el formaldehído que contiene cinc es un mejor fijador para la inmunohistoquímica que el formaldehído solo. Sin embargo, esto depende del pH del formaldehıdo, ası como del formaldehıdo de cinc (Arnold et al., 1996, Eltoum et al., 2001a).

Fijadores compuestos Los patólogos usan fijadores basados en formaldehído para asegurar patrones histomorfométricos reproducibles. Se pueden añadir otros agentes al formaldehído para producir efectos específicos que no son posibles con el formaldehído solo. El etanol deshidratado, por ejemplo, se puede añadir al formaldehído para producir formalina alcohólica. Esta combinación conserva moléculas como el glicógeno y da como resultado menos contracción y endurecimiento que los deshidratados puros. Los fijadores compuestos son útiles para tejidos específicos, p. Formalina alcohólica para la fijación de algunos tejidos grasos, como el pecho, en los que la preservación del lípido no es importante. Además, la fijación de especímenes brutos en formalina alcohólica puede ayudar a identificar los ganglios linfáticos incrustados en la grasa. Algunos fijadores combinados que incluyen formalina alcohólica son buenos para preservar la detección de antígenos, pero se puede aumentar la tinción no específica o la tinción de fondo en procedimientos inmunohistoquímicos. Los grupos aldehído no reaccionados en la fijación de glutaraldehidoformaldehído por ejemplo pueden aumentar la tinción de fondo, y la formalina alcohólica puede causar tinción no específica de los nervios mielinizados (Grizzle et al., 1996, 1996).