Enzima Celulasa 4s2s15

1. Clasificación de la enzima celulasa.

Las celulasas son glicosil hidrolasas, y utilizan dos mecanismos de hidrólisis del enlace glucosídico que generan dos posibles configuraciones estereoquímicas finales. Un tipo de enzimas llevan a cabo una reacción en la que el carbono anomérico mantiene su posición (mecanismo de retención) y otro tipo en la que se pierde (mecanismo de inversión) (Withers, 2001). Las glicosil hidrolasas se clasifican en base a su secuencia de aminoácidos (www.cazy.org/fam/acc_GH.html). Este tipo de clasificación, por familias, permite identificar características estructurales de las enzimas, inferir su mecanismo de acción y determinar relaciones evolutivas entre ellas (Henrissat & Romeu, 1995). (3)

El sistema de celulasa típico incluye tres tipos de enzimas: la endo-β-1,4glucanasa (Cx) (1,4-β-D-glucan glucanohidrolasa E.C.3.2.1.4), la exo-β-1,4glucanasa (C1) (1,4-β-D-glucan celobiohidrolasa E.C.3.2.1.91) y la β-1,4glucosidasa (celobiasa) (Cb) (β-D-glucósido glucohidrolasa E.C.3.2.1.21) (Ladisch et al. 1983; Bataille & Toussaint 1985; Marsden & Gray 1986; Lee 1997; Hahn-Hägerdal & Palmqvist 2000). (1)

2. Estructura y función de la celulasa.

Muchas celulasas presentan una estructura modular. Típicamente, un péptido no catalítico comprende el módulo con la función de unión a carbohidratos (conocido como CBM). Éste se une mediante una bisagra flexible de aminoácidos hidroxilados (Ser y Tre) y altamente glicosilados, al siguiente módulo en donde se encuentra el sitio catalítico de la enzima, aproximándolo íntima y prolongadamente al sustrato y potenciando su acción (Linder & Teeri, 1996). También se conocen enzimas compuestas de varios CBM y módulos catalíticos. Los CBM se clasifican a su vez, en familias según su secuencia de aminoácidos, y los fúngicos mayoritariamente constituyen la

familia uno. Los CBM contienen desde 30 y hasta 200 aminoácidos, localizados hacia los extremos carboxilo o amino terminal, aunque ocasionalmente se encuentran posicionados en el centro de la cadena polipeptídica. A pesar de que cada familia de CBMs tiene características únicas se sabe que su afinidad por la celulosa se debe en parte a su superficie plana compuesta de aminoácidos aromáticos que le proporcionan cualidades hidrofóbicas (Hilden & Johansson, 2004). Se sabe también que mediante un mecanismo no catalítico el CBM de la endoglucanasa III de T. reesei altera la estructura de la celulosa cristalina (Xiao et al., 2001). Otra evidencia del papel del CBM en la modificación de la estructura de la celulosa, es que sus homólogos en plantas, las expansinas (involucradas en la expansión de la pared celular durante el crecimiento), tienen actividades no hidrolíticas sobre las interacciones entre la celulosa y la hemicelulosa (Cosgrove, 2000). (3)

3. Fuente de obtención de la celulasa.

Las enzimas celulolíticas son producidas por diferentes microorganismos, bacterias y hongos, incluyendo aerobios, anaerobios, mesófilos, termófilos y extra mesófilos (Immanuel et al., 2006). Las bacterias y hongos aeróbicos producen generalmente celulasas extracelulares. Dentro de los principales hongos mesófilos aeróbicos encontramos Trichoderma viride, T. reesei, T. koningii, Penicillium pinophilum, Sporotrichum pulverulentum, Fusarium solani, Talaromyces emersonii (Grigelmo & Belloso, 1998). Las bacterias anaeróbicas (Clostridium thermocellum, C. cellulovorans, Ruminococcus albus, R. flavsfaciens, Fibrobacter succinogenes y Acetivibrio cellulolyticus) y hongos anaeróbicos (Neocallimastic frontalis, N. patriciarum y Piromyces equi) producen celulasas en la forma de complejos multienzimaticos (Gilbert & Hazlewod, 1993; Begun & Lemaire, 1996; Bhat & Bhat, 1997). En las dos décadas pasadas, se ha evaluado que otros microorganismos tales como hongos termófilos (Sporotrichum thermophile, Thermoascus aurantiacus,

Chaetomium

thermophile

y

Humicola

insolens),

hongos

mesófilos

anaeróbicos (Neocallimastix frontalis, N. patriciarum, Piromonas communis, Sphaeromonas communis, Piromyces equi y Orpinomyces sp.), bacterias aeróbicas mesófilas y termófilas (Cellulomonas fimi, Pseudomanas fluorescens sub sp. Cellulosa, Cellvibrio sp., Microspora bispora, Clostridium cellulolyticum, C. cellulovorans y otras) y bacterias anaeróbicas mesofilas y termófilas

(Acidothermus

cellulolyticus,

Bacteroides

cellulosolvens,

Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus, R. flavefacions, Clostridium thermocellum

y

C.

stercorarium),

también

como

actinomicetes

(Thermomonospora fusca), producen sistemas enzimáticos celulíticos muy activos (Beguin & Lemaire, 1996, Claeyssens et al., 1998). (2)

4. Sustrato o grupo funcional sobre el cual trabaja.

Los microorganismos encargados de la degradación de sustratos celulósicos producen múltiples enzimas que actúan en sinergismo directamente sobre la celulosa (Murashima et al., 2003; Nidetzky et al., 1994). (3)

5. Mecanismo bajo el cual trabaja la celulasa.

La hidrólisis de la celulosa se realiza mediante un complejo enzimático llamado

celulasas,

constituido

principalmente

por

tres

enzimas:

endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasas, las cuales son producidas por algunos hongos y bacterias en condiciones normales; generando glucosa, principal producto que puede ser utilizado como fuente de carbono y energía por otros microorganismos fermentadores (Ponce y Pérez 2002). Estas enzimas se emplean actualmente como insumos para la industria textil, alimentaria y papelera entre otras (Vilchez 2002). (4)

El mecanismo propuesto en la literatura para la degradación de la celulosa puede resumirse en tres etapas: Primero la endo β-1,4-glucanasa actúa al

azar sobre los enlaces β-1,4 glucosídicos internos presentes entre las unidades de glucosa que forman la molécula de la celulosa, y convierte las cadenas largas a oligosacáridos, los cuales mantienen la configuración β de su estructura. La acción de esta enzima es sobre las regiones amorfas de la molécula de celulosa o sobre la superficie de las microfibrillas, y tiene como resultado la disminución de la longitud de la cadena de celulosa y la creación de nuevos extremos reactivos que sirven de sustrato para la posterior acción de C1 (Ryu & Mandels 1980; Chou et al. 1981; Philippidis & Smith 1995; Lee 1997). En la segunda etapa actúa la exo β-1,4- glucanasa, la cual es una enzima que corta la cadena 1,4 β-D-glucano a partir del extremo no reductor de la molécula de celulosa y de las celodextrinas, lo que provoca la remoción de unidades de celobiosa o glucosa (Ryu & Mandels1980; Marsden & Gray 1986; Philippidis & Smith 1995; Bhat & Bhat 1997; Lee 1997). Ambas enzimas endoglucanasa y exoglucanasa son inhibidas por uno de los productos de la hidrólisis enzimática, la celobiosa, lo que disminuye la eficiencia de la hidrólisis (Lee 1997; Hahn-Hägerdal & Palmqvist 2000). Una vez degradada las zonas amorfas de la celulosa, tiene lugar la tercera etapa de la hidrólisis, en donde la región cristalina comienza a ser hidrolizada, como resultado de la acción sinergística de la endoglucanasa y la exoglucanasa (Beldman et al. 1988). Finalmente, una etapa que limita la degradación de la celulosa es la hidrólisis de la celobiosa a glucosa mediante la acción de la β1,4- glucosidasa Cb, porque las glucanasas son inhibidas por la celobiosa (Ladisch et al. 1983; Ljungdahl & Eriksson 1985; Philippidis & Smith 1995; Lee 1997). (1)

6. Condiciones de trabajo de la celulasa

Las celulasas de T. reesei tienen la ventaja de que estas son resistentes a inhibidores químicos y estables en reactores agitados bajo condiciones de pH 4.8 a 50 ºC durante 48 h (Ryu & Mandels 1980). (1)

Los termofílicos son de interés por su capacidad para producir enzimas celulolíticas termoestables, las cuales son en general estables bajo condiciones severas, incluso en niveles de pH altamente ácidos o alcalinos así como temperaturas de hasta 90 °C (Lamed & Bayer 1988; Sugden & Bhat 1994). (1)

Referencias 1. Ovando – Chacón, SL; Waliszewki, KN. Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos. Universidad y ciencia. 2005; vol. 21, núm. 42: pp. 113 – 122 2. F. Palma Parodi et al. Enzimas fibrolíticas: una alternativa para incrementar la utilización de la pared ruminal en rumiantes. Revista FAVE – Ciencias Veterinarias. 2012. Vol. 11, Núm. 1 y 2: pp. 71 – 81 3. Martínez – Anaya C et al. Celulasas fúngicas: Aspectos biológicos y aplicaciones en la industria energética. Rev Latinoam Microbiol. 2008. Vol. 50, Núm. 3 y 4: pp. 1119 – 131 4. L. Gutiérrez et al. Evaluación in vitro de celulasas producidas por cepas nativas de Trichoderma reesei, Cladosporium herbarum y Aspergillus niger. Journal of agriculture and animal sciences. 2012. Vol. 1, Núm. 1: pp. 7 - 15