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CRISTAL VIOLETA El cristal violeta es un colorante orgánico, sintético y alcalino de triamino-trifenilmetano. Se encuentra como un polvo con brillo metálico verde oscuro. Recibe varios nombres, entre los cuales se puede mencionar cloruro de hexametil pararosanilina o violeta de metilo, violeta de anilina, violeta de genciana, etc. El nombre del colorante cristal violeta fue tomado por su parecido al color de los pétalos de las flores de violeta y genciana; su origen no tiene ninguna relación con los extractos de estas flores. El cristal violeta se obtiene mediante varias rutas, las cuales incluyen reacciones de condensación, adición, cloración, entre otras. Todas tienen como materia prima la N, N-dimetilanilina. Se emplea como componente de las tintas usadas para realizar impresiones y en la de los bolígrafos. Asimismo, se usa para teñir cuero, papel, detergentes, fertilizantes, entre otros productos. Fue muy utilizado como antiséptico. Tiene propiedades antimitóticas, antibacterianas, antiparasitarias y antimicóticas. Su mecanismo de acción es bacteriostático. Es empleado en histología para teñir los cortes de tejidos y en microbiología para colorear y clasificar las bacterias conforme a sus propiedades de tinción con la coloración de Gram.

EN LA COLORACIÓN DE GRAM El uso del cristal violeta se basa en la penetración de éste a través de la gruesa pared celular de las bacterias. Así, su estructura celular retiene el

CRISTAL VIOLETA

colorante, tiñendo a la bacteria de morado. Este es el caso de las bacterias

Cristal violeta (violeta de

Gram positivas. Mientras que si las bacterias tienen una pared celular

genciana)…………………………...………….0,5 g

delgada, se catalogan como bacterias Gram negativas. Posteriormente, en

Agua destilada……….………………………100 ml

el proceso de contra tinción que lleva este mismo método de Gram, las bacterias se colorean con fuscina fenicada, quedando de color rosado.

PREPARACION:

Cuando las bacterias no poseen pared celular, y no presentan ningún tipo de coloración, quedan clasificadas como bacterias que no se colorean con el Gram.

1. Disolver el colorante en el agua.

MÉTODO DE GOMORI PROTOCOLO TÉCNICO DEL MÉTODO DE GOMORI Partimos de muestras que que han sido fijadas en formol o Bouin e incluidas en parafina. Estas muestras se han cortado en secciones de unas 8 µm y adheridas a portaobjetos recubiertos con gelatina. PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

2x10 min en xileno para desparafinar. 2x10 min en etanol 100º 10 min en etanol 96º 10 min en etanol 80º 10 min en etanol 50º 5 min en agua destilada. 1h en líquido de Bouin a 56-60 ºC, o 24 h a temperatura ambiente. Varios lavados en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo. 9. 10 min en hematoxilina de Weigert. (Si la solución es vieja puede ser necesario incrementar el tiempo de tinción) 10. 5-10 min en agua corriente. (Si las muestras pierden su color o se tiñen débilmente, se puede volver a la Hematoxilina férrica de Weigert durante 5 minutos más. Se puede comprobar la tinción mirando por el microscopio) 11. 15 min en solución tricrómica. SOLUCIÓN TRICRÓMICA: 0.6 g cromo2R (CI 16570). 0.3 g verde luz (CI 42095). 0.8 g ácido fosfotúngstico. 1 ml ácido acético glacial. Hasta 100 ml de agua destilada. 12. 1 min en ácido acético al 1 %. (Este es un paso de diferenciación. Si las muestras no están bien teñidas o no hay suficiente coloración roja en la muestra, las secciones se pueden dejar más tiempo en la solución tricómica) 13. 30 s en agua destilada 14. 1 min en etanol 100º 15. 1 min en etanol 100º

16. 2 min en xileno 16. 3 min en xileno 17. Montado de las secciones NOTAS TÉCNICAS La hematoxilina férrica de Weigert como solución de trabajo no debe estar más de 10 días preparada, dado que pierde efectividad. También es recomendable filtrarla antes de ser utilizada, para evitar posibles artefactos. La solución tricómica debe tener un pH de 2, para una mejor tinción. La diferenciación con el ácido acético al 1% también se puede realizar en ácido acético al 0.5%, durante 1 min. La deshidratación final debe ser rápida para que no se pierda el colorante.