Biotec Genomica 3o2o2b

BIOTECNOLOGIA

Jesus Eduardo DivisiónGala de Ciencias Moralesde 12-148314 la salud

16/Abril/2017 Francisco Figueroa May

Complemento de Calificación

Bibliotecas y bancos génicos Uno de los aspectos fundamentales para obtener mapas moleculares y poder realizar análisis físicos de grandes regiones cromosómicas, así como el aislamiento de genes de interés, se basa en la disponibilidad de bibliotecas genómicas. Una biblioteca genómica es una colección de fragmentos de DNA en la que se espera estén incluidas el mayor número de secuencias posibles de un genoma o las secuencias contenidas en un cromosoma. En una biblioteca genómica es posible seleccionar fragmentos de DNA entre millones de secuencias clonadas en cantidad suficiente para ser analizada. Los fragmentos clonados deben ser de tamaño suficiente para contener, en lo posible, genes con sus secuencias reguladoras, pero no tan grandes que dificulten su discriminación cuando se realice el mapa con las enzimas de restricción. Hoy día existen diferentes sistemas de clonación para la construcción de bibliotecas genómicas, desde vectores basados en el bacteriófago Lambda con un tamaño de inserto alrededor de 20 kb, los cromosomas artificiales de levaduras (YACs) cuya capacidad máxima es de 1 Mb y los cósmidos y bacteriófago P1 que cubren el rango medio de 40-100 kb, respectivamente. Una vez construida la biblioteca genómica se debe proseguir con la búsqueda e identificación de aquella secuencia de interés. La primera consideración en la construcción de una Genoteca es el número de clones necesarios. Esto depende de una variedad de factores, la más evidente es el tamaño del genoma. Por lo tanto, un genoma pequeño como la de E. coli se requieren menos clones de un proceso más complejo tales como el genoma humano. El tipo de vector que se utilizará También hay que considerar, que determinará el tamaño de los fragmentos que se pueden clonar. En la práctica, el tamaño de la biblioteca se puede calcular simplemente sobre la base de la probabilidad de que una secuencia particular de ser representados en la biblioteca Un gen en particular, sólo representa una muy pequeña parte del genoma de eucariotes. Si un gen es de aproximadamente 5000 pb en un genoma de alrededor de 109 pb, éste representaría un 0,0005% del DNA total. Para identificar estas pequeñas secuencias, el método a utilizar debe seleccionar sólo el clon o los clones que contienen el gen de interés y determinar si el clon contiene todo o parte del gen. Para lograr este objetivo, existen varios métodos: Southern blot, Western blot, ELISA o PCR. La elección del método depende de las circunstancias y la disponibilidad de la información de la secuencia de interés. De acuerdo con Glover y Hames (1996) el aislamiento del DNA es un paso crítico en la construcción de bibliotecas genómicas, ya que se constituye en el material de partida que garantiza el éxito de las reacciones en las cuales esté involucrado (digestión y ligación. Después de que la Bilioteca es creada, el genoma de un organismo puede ser secuenciado to aclarar como los genes afectan un organismo, se compara con otro organismo a nivel genómico en busca de similitudes o como interaccionan en otro organismo. Lo antes mencionado referente a los estudios de asociación del genoma, pueden identificar genes candidatos derivados de muchos rasgos funcionales El asunto de aislar genes específicos tiene un amplio uso hoy en dia en la rama de Biotecnología: un ejemplo seria el estudio de todo el genoma humano, el cual recalco, ya

se ha logrado clonar el genoma humano en un conjunto de vectores (genes); esto nos permite analizar, conocer, estudiar las alteraciones y funciones de genes de algún interés específico: mutaciones-evolución. Otras aplicaciones más específicas seria: -Detección de Alelos Mutantes -Búsqueda de Alelos mutantes (aún desconocidos) -Identificación de microorganismos patógenos (Identificación de cepa infecciosa de Influenza) -Secuenciación de ADN -Generación de mutantes puntuales -Estudiar la expresión génica. En opinión propia la más importante.

Referencias UNIVERSITAS SCIENTIARUM- Revista de la Facultad de Ciencias PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA. Principios de Ingeniería genética y aplicaciones en Biología Molecular. Articulo de Revision https://es.wikipedia.org/wiki/Biblioteca_gen%C3%B3mica Fuesler J, Nagahama Y, Szulewski J, Mundorff J, Bireley S, Coren JS (April 2012). "An arrayed human genomic library constructed in the PAC shuttle vector pJAC-Mam2 for genome-wide association studies and gene therapy".

Mutagénesis dirigida

Como introducción quiero aportar: el hombre desde el inicio de los tiempos ha estado en constante cambio el cual esa es la palabra clave en esta síntesis. Si nos referimos a la selección natural es aquella que evoluciona a su ritmo de manera espontánea en la cual intervienen tanto factores genéticos, fenotípicos y también ambientales; por otro lado está la selección artificial que puede ser descrita como la manipulación del desarrollo de una especie (animal, vegetal, microorganismo). Ahora bien el cambio en el desarrollo de una especie enfocado en el material genético que este posee se le denominara mutación: alteración o cambio en la información genética (genotipo) el cual provoca cambios característicos a la especie que si es para bien o es para mal; una mutación puede ser heredada. Ya mencione que si bien ocurre de manera natural puede ser llamado evolución pero en el caso de una mutación inducida existen factores externos que la provocan: ° Físicos (Radiación) ° Químicos (Sustancias xenobióticas) ° Biológicos (Virus-enfermedades) En la ingeniería genética la mutagénesis inducida se utiliza desde mediados del siglo XX con el fin de lograr ‘’cambios semejantes’’ a los que ocurren de manera natural e igual no solo se ocupa para alterar la secuencia de un gen, también pueden insertar o sustituir la pérdida de un gen determinado. La mutagénesis sitio-dirigida in vitro es una técnica invaluable para estudiar relaciones de la estructura-función de proteínas, la expresión del gen y la modificación del vector. En una proteína pequeños cambios específicos en la secuencia de aminoácidos dentro de un sitio crítico son en muchos casos responsables de las diferencias en el desempeño de una proteína y del fenotipo del organismo. Varios métodos de los métodos reportados requieren de DNA de una sola cadena como templado. La razón de esto es la necesidad de separar los filamentos complementarios para evitar el realineamiento. El uso de PCR en mutagénesis sitio-dirigida logra la separación de las hebras usando un paso de desnaturalización que separa las hebras complementarias y permitiendo la polimerización eficiente de las primers de PCR. Los métodos de PCR sitio-dirigidos permiten así que las mutaciones sitio-específicas sean incorporadas en cualquier plásmido de doble cadena. El gen de interés es amplificado con una ADN polimerasa en condiciones donde la fidelidad de transcripciones es baja y se introducen errores en las copias generadas. Dado que la mayoría de las mutaciones no son beneficiosas, dos mutaciones favorables se acumularán en el mismo gen, solamente con baja probabilidad y muchas mutaciones beneficiosas serán enmascaradas por las deletéreas.

Para combinar varias mutaciones deseables, se utiliza un segundo método, donde el conjunto de fragmentos de ADN generado por la PCR es digerido por DNasa I, una enzima que corta en forma inespecífica, y se re ensamblan los trozos por PCR. En principio, cada mutación puede ser recombinada y propagada individual e independientemente de otras mutaciones. Para introducir mutaciones solamente en una región particular de un gen, puede utilizarse la mutagénesis en cassette por PCR. El fragmento de ADN conteniendo el punto mutado es recortado en dos sitios de restricción flanqueantes. Luego, un producto de PCR, que puede ligarse exactamente en estos sitios de restricción, se genera con un primer degenerado. Este iniciador se sintetiza químicamente para llevar una mezcla al azar de nucleótidos en uno o más codones y la proteína codificada lleva, por lo tanto, un conjunto de aminoácidos al azar, en esta posición particular. Desafortunadamente, un codón completamente formado al azar exhibirá una fuerte desviación hacia algunos aminoácidos que son codificados por más de un codón, por ejemplo, el aminoácido serina es codificado por seis codones diferentes, mientras que triptofano está codificado por un solo codón), siendo también difícil evitar la incorporación de un codón de terminación. La solución a este problema es usar trinucleótidos presintetizados (codones) para todos los 20 aminoácidos como bloques de construcción para la síntesis de ADN de los oligonucleótidos, en lugar de utilizar los mononucleótidos convencionales. Estos bloques pueden ser mezclados en cualquier proporción y solamente se necesita agregar aquellos trinucleótidos que el investigador desea en esta posición en la secuencia proteica. Algunas de las funciones de esta técnica son: ° Cambiar la secuencia de aminoácidos de una proteína ° Suprimir la expresión de un gen ° Modificar la expresión de un gen/Así como aumentar la expresión genes benéficos ° Inhibir la expresión de genes no deseados ° Producir cambios en las proteínas para hacerla más eficientes y efectivas. Entre algunas de sus aplicaciones comerciales se mencionan el diseño de proteínas (suplementos alimenticios), la alteración de microorganismos como bacterias o levadoruas (producción de vacunas), en animales (ganadería y terapia génica) los cuales crecen descontroladamente, en la agricultura en el caso de los pesticidas regados en campos de maíz, trigo, arroz, frijol, etc. Incluso en las mismas plantas: plantas resistentes a la acción del herbicida.

Referencias Instituto de Biotecnología, UNAM 2004 –Métodos Fisicoquímicos en biotecnología-

Mutagenes Dirigida por Oligonucleotidos (ODM), Facultad de Ciencias Biologicas, UANL. Dvorak Montiel Condado, Ph. D

Terapia Génica Los genes pueden interpretarse como el mapa gnetico de la herencia. Pasan de padres a hijos y contienen las instrucciones para producir proteínas. Si los genes no producen las proteínas correctas o no lo hacen correctamente, el nuevo ser (organismo) puede tener un trastorno genético. La terapia genética es una técnica experimental que utiliza los genes para tratar o prevenir enfermedades. La forma más común de terapia genética incluye la inserción de un gen normal para sustituir a uno anormal. Otros tipos incluyen: -Intercambio de un gen anormal por uno normal. -Reparación de un gen anormal. -Alteración del grado en el que se active o se desactive un gen. -Incluso con el avance de la tecnología, aún es experimental. Aunque la terapia génica se define como el tratamiento que cambia la función génica, a menudo se considera como la inserción de genes normales en las células de una persona que carece de tales genes a causa de un trastorno genético específico (inserción). Los genes normales pueden producirse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADN donado por otra persona. Por ahora, la terapia génica por inserción es la que tiene mayor probabilidad de éxito en la prevención o curación de enfermedades causadas por un solo gen, tales como la fibrosis quística. El DNA y el RNA pueden ser amplificados y producir muchas copias de un gen o segmentos de éste mediante PCR. Las sondas génicas pueden utilizarse para localizar segmentos específicos de DNA normal o mutado. Diferentes tipos de sondas pueden investigar una amplia gama de tamaños de secuencia de DNA. Un segmento de DNA conocido puede ser clonado y luego marcado por fluorescencia. El DNA marcado se une a su segmento complementario de DNA y puede detectarse mediante la medición de la cantidad y tipo de fluorescencia. Las sondas pueden detectar varios trastornos antes y después del nacimiento. La variedad de sondas de oligonucleótidos son otro tipo de sondas utilizadas ahora en forma rutinaria para identificar regiones eliminadas o duplicadas de secuencia de DNA en cromosomas específicos sobre una base genómica. El DNA de un paciente se compara con un genoma de referencia usando muchas sondas de oligonucleótidos.

Los microchips son poderosas herramientas nuevas que pueden utilizarse para identificar las mutaciones de DNA, trozos de RNA o proteínas. Un único chip puede probar millones de cambios diferentes de DNA utilizando sólo una muestra. Los microchips proporcionan una resolución más fina sobre las consultas del genoma que las sondas de oligonucleótidos. Las tecnologías de secuencia de próxima generación proporcionan el más alto grado de resolución, pero tienen muchas cuestiones analíticas e informáticas aún sin resolver (Ej. la forma de interpretar los resultados, sobre todo para trastornos multigenéticos complejos). La secuenciación de próxima generación implica romper todo el genoma en pequeños segmentos y luego hacer un análisis de la secuencia base por base de todos o algunos de los segmentos dependiendo de dónde se pone el intérés: en un subconjunto de genes o en el genoma. Los resultados del segmento se analizar para proporcionar un resultado compuesto por la suma de todos los segmentos pequeños mapeadas. Las vaariantes de nucleótido singulares pueden ser identificadas, así como también segmentos muy cortos que han sido insertados o eliminados. Algunas de estas variantes pueden indicar trastornos genéticos. La transferencia de ADN normal al interior de células anormales puede conseguirse por métodos distintos. Uno de ellos consiste en utilizar un virus, ya que algunos virus tienen la habilidad de insertar su material genético en el ADN humano. El ADN normal se inserta en el virus, que luego infecta las células del paciente y de este modo transmite el ADN a su núcleo celular. Una de las preocupaciones sobre la inserción mediante virus es la posibilidad de reacción contra el virus, similar a la que se produce ante una infección. Otra cuestión preocupante es que el nuevo ADN normal puede perderse o puede no incorporarse a las nuevas células después de un cierto periodo de tiempo, derivando en la reaparición de la enfermedad genética. También pueden desarrollarse anticuerpos contra el virus que podrían causar una reacción similar al rechazo de un órgano trasplantado. Otro método para insertar genes consiste en utilizar liposomas, que son unas esférulas microscópicas de ADN las cuales son absorbidas por las células del paciente y liberan su ADN en el núcleo celular. A veces este método fracasa porque los liposomas no se absorben al interior de las células del paciente, porque el nuevo gen no actúa de la manera prevista o porque el nuevo gen desaparece. Otro método de terapia génica es el que usa la tecnología antisentido. En la tecnología antisentido, no se insertan genes normales. En lugar de ello, los genes anormales se inactivan. Con dicha tecnología, los fármacos se combinan con secuencias específicas del ADN evitando así la actuación de los genes afectados. Actualmente se está ensayando con la tecnología antisentido en el tratamiento del cáncer pero todavía está en una fase muy experimental. No obstante, parece tener mayor eficacia y seguridad que la terapia génica por inserción. Otro enfoque de la terapia génica se basa en aumentar o disminuir la actividad de ciertos genes mediante la modificación de las reacciones químicas celulares que controlan la expresión del gen. Por ejemplo, mediante el control de una reacción química llamada metilación

puede alterarse la función de un gen de modo que se aumenta o se disminuye la producción de ciertas proteínas o se producen distintos tipos de proteínas. Estos métodos se están ensayando experimentalmente para el tratamiento de ciertos tipos de cáncer. En el tratamiento de los cánceres que se realiza hoy día, una de las principales vías de investigación es la de marcar genéticamente a las células tumorales de un cáncer para que el organismo las reconozca como extrañas y pueda luchar contra ellas, estimulando la respuesta inmune. Otras estrategias que se siguen en la actualidad contra el cáncer son: -

Inactivar oncogenes. Introducir genes supresores de tumores. Introducir genes suicidas. Introducir genes que aumenten sensibilidad a fármacos.

La terapia génica también se está estudiando experimentalmente en la cirugía de trasplantes de organos. Esto, mediante la modificación de los genes de los órganos trasplantados para hacerlos más compatibles con los genes del receptor, la probabilidad de que el organismo receptor rechace el órgano trasplantado es menor. Con esta técnica, el receptor no necesitará ser tratado con fármacos que inhiben el sistema inmunitario, que pueden tener efectos secundarios graves. No obstante, este tipo de tratamiento generalmente no tiene éxito. Referncias: http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/genetica/contenido1 4.htm https://medlineplus.gov/spanish/genesandgenetherapy.html