Marco Teorico Y Discuciones Informe 2 Lab Microbiologia 446u5h

MARCO TEORICO:

La coloración Gram cumple la función de la tinción simple y además, permite la diferenciación de las bacterias porque usan diferentes colorantes que se comportan distinto según el microorganismo en cuestión. La coloración Gram es la más usada en bacteriología. Son diferenciales, ya que se dividen en Gram positivas y gran negativas. Las primeras se tiñen de color azul violeta y las segundas adquieren un color rosado o rojo. Especiales o Negativa: se usan para objetivar distintas estructuras como la cápsula, el núcleo, los flagelos, los esporos, etc. Tipo de tinción diferencial Empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas, tinción GRAM Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884 este método Se utiliza para referirse a la morfología celular bacteriana como para realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana.

BACTERIA GRAM POSITIVA Y NEGATIVA

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de Peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es Peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las grampositivas como las gramnegativas, están teñidas de azul El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación se llevaran cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen;La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gramnegativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une Peptidoglicano). La delgada capa de Peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora.

Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más Peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras.

TÉCNICA DE TINCION GRAM Existen variaciones de esta técnica, pero en términos generales, la tinción Gram involucra estos pasos: 1. Tinción inicial: Las células se tiñen con cristal-violeta. En este paso todas las células se tiñen de morado. 2. Mordiente: Se adiciona yoduro lugol que reacciona con el cristal violeta y forma el complejo: cristal violeta-yoduro. Las células continúan moradas. 3. Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, que actúa lavando el complejo cristal violeta-yoduro de las células Gram negativas (estas quedan incoloras). Este es el paso crítico, pues si se exagera, decolora las Gram positivas o de lo contrario, no decolora a las Gram negativas. 4. Contratinción: Se vuelve a teñir con Safranina o fucsina, de manera que las bacterias Gram negativas, que habían quedado incoloras, se tiñen de rosado a fucsia, en tanto que las Gram positivas no se afectan con la contratinción. Basándonos en la reacción a esta tinción de las bacterias, éstas se han clasificado, taxonómicamente hablando, en Gram positivas y Gram negativas. Las Gram negativas son constantes en su reacción, mientras que las Gram positivas pueden presentar respuestas variables frente a determinadas condiciones. Para explicar el mecanismo de tinción se han propuesto varias hipótesis, fundadas en la naturaleza química de la pared.

Cuestionario: 2. Que efecto traería reemplazar el lugol con otro agente oxidante Ninguno ya que cumpliría la misma función de incrementar la afinidad del colorante primario cristal violeta en la pared celular de la bacteria formando complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta y Yodo (componente del lugol), sirve para intensificar el color del teñido. El lugol es un agente oxidante así que no se produciría un efecto si es remplazado, siempre y cuando cumpla con el efecto que tiene el lugol de tiene como componente el Yodo que es un acido débil. 3.- ¿Podría usted variar el colorante primario (cristal violeta) y el contraste (safranina) obteniendo los mismos resultados? Las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta, y manteniendo la coloración azulviolácea. El colorante de contraste (la safranina) solo puede teñir a las células vegetativas (decoloradas por el agua). Si cambiamos el orden del colorante con del contraste por ejemplo de la muestra de Streptococcus sp se obtendrían resultado la coloración del contraste ya que las bacterias del Streptococcus sp son gran positivas y retendrían la primera decoloración porque poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse la primera decoloración , y manteniendo la coloración primaria.

Discusiones

 Un factor que puede influir en que las bacterias Gram positivas se observen parcial o completamente rosadas, es la edad del cultivo; las células viejas tienden a perder su capacidad de retener el complejo cristal violeta-yoduro y por lo tanto las bacterias no se verán.  Otro factor de variabilidad podría ser las condiciones de estrés durante el cultivo que genera formas Gram negativas no viables, dentro de un cultivo de bacterias Gram positivas.  Debe prestarse atención a los lavados que se realizan agregando los diferentes reactivos, si se deja un exceso de agua en la lámina los reactivos se diluirán, especialmente el yoduro.

 Las células se tratan con alcohol por consiguiente las Gram positivas retienen el complejo cristal violeta – yodo y permanece azules mientras las células Gram negativas se decoloran. Esto puede ser debido a que el alcohol deshidrata la pared rica en peptidoglucano de la Gram positiva y cierra los poros y no permite la salida del complejo lugol-cristal violeta y en Gram negativas hay poco peptidoglucano y gran cantidad de lípidos y estos que son disueltos por la acetona lo que permite el escape del complejo lugol-cristal violeta. Luego se aplica una contra tinción (safranina) de tal manera que las células Gram negativas adquieren un color contraste y las Gram positivas de color violeta. 

Bibliografía

 Elba Rodríguez Pérez. 2006. Manual de microbiología oral. 2° edición. Editorial MacGraw- Hill  Gamazo, C.; Lopez-Goñi, I.; Díaz, R. 2005. Manual práctico de microbiología.3° edición. Editorial Masson  George A. Wistreich; Max D. Lechtman. 1989. Prácticas de laboratorio de microbiología. 2° edición. Editorial Limusa S.A. México.

 http://tumi.lamolina.edu.pe/bvbe/index.php/bases-de-datos-ban-unalm/Base de Datos Wiley. Identification and Classification of Microbes Prakash S. Bisen1, Mousumi Debnath2 and Godavarthi B. K. S. Prasad3 .Published Online: 11 JUL 2012. DOI: 10.1002/9781118311912.ch4.